DE69434614T2

DE69434614T2 - Cdn apoptosis modulierende proteine, sie kodierende dns und verfahren zu ihrer verwendung

Info

Publication number: DE69434614T2
Application number: DE69434614T
Authority: DE
Inventors: C. Michael Clayton KIEFER; J. Philip Berkeley BARR
Original assignee: Tanox Inc
Current assignee: Tanox Inc
Priority date: 1993-11-30
Filing date: 1994-11-30
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2014-12-01
Also published as: NZ277946A; US7108989B2; EP0731636A1; HUT74276A; US20030008837A1; DE69434614D1; JP2009189377A; EP0731636A4; US7754418B2; CA2177827A1; JP2007252391A; WO1995015084A1; US6015687A; FI962247A0; NO962188L; HU9601448D0; ATE315643T1; US6903195B1; JP2006061159A; FI962247A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neue Proteine mit Apotose regulierender Aktivität, rekombinante DNA, welche die Proteine kodiert, Zusammensetzungen, welche die Proteine enthalten, und Verfahren zu deren Verwendung.
Hintergrund der Erfindung
Die Apoptose ist ein normaler physiologischer Prozess, der zu dem Tod individueller Zellen führt. Dieser Prozess des programmierten Zelltods ist an einer Vielzahl von normalen und pathogenen biologischen Ereignissen beteiligt und kann durch eine Anzahl nicht verwandter Reize hervorgerufen werden. Änderungen bei der biologischen Regulation der Apoptose treten ebenfalls während des Alterns auf und sind für viele der Krankheitszustände und Krankheiten verantwortlich, die mit dem Altern zusammenhängen. Neuere Untersuchungen der Apoptose haben darauf schließen lassen, dass ein gemeinsamer metabolischer Weg, der zu dem Zelltod führt, durch eine große Vielzahl von Signalen, einschließlich Hormonen, Serumwachstumsfaktorentzug, chemotherapeutische Mittel, ionisierende Strahlung und Infektion durch das Humanimmundefizienzvirus (HIV) eingeleitet werden kann. Wyllie (1980) Nature 284: 555-556; Kanter et al. (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 118: 392-399; Duke und Cohen (1986) Lymphokine Res. 5: 289-299; Tomei et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 155: 324-331; Kruman et al. (1991) J. Cell. Physiol. 148: 267-273; Ameisen und Capron (1991) Immunology Today 12: 102; und Sheppard und Ascher (1992) J. AIDS 5: 143. Mittel, welche die biologische Kontrolle der Apoptose regulieren, weisen somit bei einer großen Vielzahl von Krankheitszuständen einen therapeutischen Nutzen auf.
Der apoptotische Zelltod ist gekennzeichnet durch Zellschrumpfung, Chromatinkondensation, cytoplasmatische Bläschenbildung, erhöhte Membranpermeabilität und internucleosomale DNA-Spaltung. Kerr et al. (1992) FASEB J. 6: 2450; und Cohen und Duke (1992) Ann. Rev. Immunol. 10: 267. Die Bläschen, kleine, von Membran eingekapselte Kügelchen, die sich von der Oberfläche apoptotischer Zellen abschnüren, können damit fortfah ren, Superoxidradikale zu erzeugen, welche das umgebende Zellgewebe schädigen und an entzündlichen Prozessen beteiligt sein können.
Bcl-2 wurde an der üblichen chromosomalen Translokationsstelle t(14:18) in Follikellymphomen entdeckt, was zu einer abweichenden Überexpression von bcl-2 führt. Tsujimoto et al. (1984) Science 226: 1097-1099; und Cleary et al. (1986) Cell 47: 19-28. Die normale Funktion von bcl-2 ist die Verhinderung der Apoptose; von der nicht regulierten Expression von bcl-2 in B-Zellen wird angenommen, dass diese zu erhöhten Zahlen von proliferierenden B-Zellen führt, was ein kritischer Faktor bei der Entwicklung von Lymphomen sein könnte. McDonnell und Korsmeyer (1991) Nature 349: 254-256; und zur Übersicht siehe Edgington (1993) Bio/Tech. 11: 787-792. Bcl-2 ist ebenfalls in der Lage, den durch γ-Bestrahlung hervorgerufenen Zelltod zu blockieren. Sentman et al. (1991) Cell 67: 879-888; und Strasser (1991) Cell 67: 889-899. Es ist nun bekannt, dass bcl-2 die meisten Typen des apoptotischen Zelltods hemmt, und es wird angenommen, dass es durch die Regulation eines Antioxidans-Stoffwechselwegs an Stellen der Erzeugung freier Radikale und des Ca⁺⁺-Flusses durch das endoplasmatische Retikulum wirkt. Lan et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 6569-6573; Hockenbery et al. (1993) Cell 75: 241-251.
Während die Apoptose ein normales zelluläres Ereignis ist, kann sie ebenfalls durch pathologische Zustände und eine Vielzahl von Verletzungen hervorgerufen werden. Die Apoptose ist an einer großen Vielzahl von Krankheitszuständen beteiligt, welche Herzkreislauferkrankungen; Krebsrückbildung; Immunregulation; Viruserkrankungen; Anämie; neurologische Störungen; gastrointestinale Störungen, einschließlich Diarrhö und Dysenterie, aber nicht darauf beschränkt; Diabetes; Haarverlust; Abstoßung von Organtransplantaten; Prostatavergrößerung; Fettsucht; Augenerkrankungen; Stress; und Altern einschließen, aber nicht auf diese beschränkt sind.
Bcl-2 gehört zu einer Familie von Proteinen, von denen einige kloniert und sequenziert wurden. Williams und Smith (1993) Cell 74: 777-779.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein isoliertes Cdn-Protein bereit, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus:

a) der in 3 dargestellten Aminosäuresequenz (Cdn-1), der in 5 dargestellten Aminosäuresequenz (Cdn-2), der Aminosäuresequenz, die von den Nucleotiden 365-820 der in 3 dargestellten Nucleinsäure kodiert wird (Cdn-1Δ1), und der Aminosäuresequenz, die von den Nucleotiden 398-820 der in 3 dargestellten Nucleinsäuresequenz kodiert wird (Cdn-1Δ2);
b) einem Fragment der Aminosäuresequenz von (a), wobei das Fragment die Apoptose regulierende Aktivität der Aminosäuresequenz von (a) hat; und
c) einer Aminosäuresequenz, die sich von der Aminosäuresequenz von (a) durch eine oder einige wenige konservative Substitutionen unterscheidet, wobei die Sequenz die Apoptose regulierende Aktivität der Aminosäuresequenz von (a) hat.

Die Erfindung stellt ebenfalls ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, welches eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die ein Cdn-Protein der Erfindung kodiert, und eine isolierte Zelle, die mit einem Vektor oder einer Nucleinsäure gemäß der Erfindung transfiziert ist, bereit.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine Zusammensetzung, welche ein Protein, eine Nucleinsäure, einen Vektor und/oder eine Zelle gemäß der Erfindung umfasst, einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper, welcher ein Cdn-Protein gemäß der Erfindung erkennt, der aber mit anderen Mitgliedern der Bcl-Familie nicht reaktiv ist, und eine Zusammensetzung, welche einen solchen Antikörper umfasst, bereit.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren bereit zum Nachweisen der Anwesenheit eines Cdn-Proteins der Erfindung in einer biologischen Probe durch:

a) Bereitstellen einer Zellprobe;
b) Lysieren oder durchlässig machen der Zellen für Antikörper;
c) Zugeben eines monoklonalen Antikörpers gemäß der Erfindung zu der Zellprobe;
d) Halten der Zellprobe unter Bedingungen, die dem Antikörper erlauben, mit einem Cdn-Protein zu komplexieren; und
e) Nachweisen gebildeter Antikörper-Cdn-Protein-Komplexe, wodurch Cdn-Protein nachgewiesen wird.

Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Nachweisen der Expression eines Cdn-Gens bereit, welches das Identifizieren der Anwesenheit von RNA, welche das Protein der Erfindung kodiert, in der Probe umfasst.
Verfahren zum Screenen auf pharmazeutische Mittel, die stimulieren, wie auch pharmazeutische Mittel, die die Cdn-1- und Cdn-2-Expression und die Proteinaktivität und Wechselwirkungen regulieren, werden ebenfalls bereitgestellt. Verfahren zum Screenen auf Proteine, die mit Cdns wechselwirken, werden ebenfalls bereitgestellt.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine Zusammensetzung, welche ein Protein, eine Nucleinsäure, einen Vektor und/oder eine Zelle gemäß der Erfindung umfasst, einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper, welcher ein Cdn-Protein gemäß der Erfindung erkennt, der aber mit anderen Mitgliedern der Bcl-Familie im Wesentlichen nicht reaktiv ist, und Zusammensetzungen, welche einen solchen Antikörper umfassen, bereit.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Nachweisen der Expression eines Cdn-Gens in einer biologischen Probe bereit, wobei das Verfahren das Identifizieren der Anwesenheit von RNA, welche das Protein der Erfindung kodiert, in der Probe umfasst.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren der Regulierung des von Apoptose ausgelösten Zelltods bereit, welches das Regulieren des endogenen Spiegels eines Cdn-Proteins der Erfindung umfasst.
Die Erfindung stellte ebenfalls ein Protein, ein Nucleinsäuremolekül, einen Vektor oder eine Zelle gemäß der Erfindung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie bereit.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Prüfen auf Wechselwirkungen zwischen Cdns und Proteinen, welche spezifisch an Cdns binden, bereit, wobei das Verfahren das in Berührung bringen von gereinigtem Cdn der Erfindung mit einem Zelllysat, das ein mutmaßliches Cdn-bindendes Protein enthält, unter Bedingungen, die eine Bindung des mutmaßlichen Cdn-bindenden Proteins an das Cdn erlauben;
das Isolieren des Cdn;
das in Berührung bringen des isolierten Cdns mit einem Bindungspartner, der für das mutmaßliche Cdn-bindende Protein spezifisch ist, unter Bedingungen, die eine Bindung des Bindungspartners und des mutmaßlichen Cdn-bindenden Proteins erlauben; und
das Messen der Menge des Bindungspartners, der an das mutmaßliche Cdn-bindende Protein gebunden ist, um zu bestimmen, ob das mutmaßliche Cdn-bindende Protein an das isolierte Cdn gebunden ist, umfasst.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein in vitro-Verfahren zur Regulierung des Spiegels eines Apoptose regulierenden Proteins in einer Zelle bereit, welches die folgenden Schritte umfasst:
Bereitstellen einer Zelle;
Einführen eines Polynucleotids, das ein Cdn-Protein der Erfindung kodiert, in die Zelle; und
Exprimieren des Cdn-Proteins von dem Polynucleotid.
Die Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls der Erfindung oder einer Zelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül der Erfindung transfiziert ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Regulierung des Spiegels eines Apoptose regulierenden Proteins in einem Patienten bereit.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt die PCR-Primer der Bcl-2-Familie dar, die verwendet werden, um die Cdn-1-Sonden zu isolieren.
2 stellt die Cdn-1-Klone dar, die durch die in Beispiel 1 beschriebenen Methoden erhalten wurden.
3 stellt die Nucleotidsequenz der Cdn-1-cDNA und die kodierte Aminosäuresequenz des Cdn-1-Proteins dar.
4 stellt die Ergebnisse einer Northern Blot-Analyse von mehreren Geweben mit Sonden, die sowohl für Bcl-2 als auch Cdn-1 spezifisch sind, dar.
5 zeigt die Sequenz des Cdn-2-Gens und flankierende Sequenzen und die entsprechende vorhergesagte Aminosäuresequenz des Cdn-2-Proteins.
6 zeigt einen Vergleich der N-terminalen Aminosäuresequenzen von Cdn-1, Cdn-2 und bekannten Mitgliedern der Bcl-2-Familie.
7 zeigt die anti-apoptotischen Wirkungen von Cdn-1 und einigen seiner Derivate bei der durch Serumentzug hervorgerufenen Apoptose von WI-L2-Transformanten in 0,1% FBS.
8 (Reaktion von WIL-2-Transformanten auf eine von anti-FAS hervorgerufene Apoptose (50 ng/ml anti-FAS)) zeigt anti-apoptotische Wirkungen von Cdn-1 und einigen seiner Derivate bei der von FAS hervorgerufenen Apoptose von WI-L2-Zellen.
9 zeigt die Regulation der Apoptose durch Cdn-1 und Cdn-2 in FL5.12-Zellen.
10 stellt die Cdn-1-Derivatproteine Δ1, Δ2 und Δ3 dar. Die N-terminalen Reste werden durch die Pfeile angezeigt. Der Rest der Derivatproteine ist dasselbe wie bei Cdn-1 in voller Länge.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst im Wesentlichen gereinigte Nucleotidsequenzen, welche die neuen Bcl-2-Homologen, Cdn-1 und Cdn-2, kodieren; und die Proteine, die dadurch kodiert werden; Zusammensetzungen, die Cdn-1- und Cdn-2-Nucleotide umfassen, und Proteine und Verfahren der Verwendung von diesen. Man beachte, dass in der parallelen U.S.-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 08/160,067 cdn-1 als cdi-1 bezeichnet wurde und dass in der parallelen U.S.-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 08/320,157 Cdn als cdn bezeichnet wurde und cdn als CDN bezeichnet wurde; auch wenn die Namen geändert wurden, bleiben die Nucleotid- und Aminosäuresequen zen identisch. Die Erfindung umfasst weiterhin rekombinante Zellen und nichtmenschliche transgene Tiere, welche die klonierten Cdn-1- oder Cdn-2-Gene exprimieren. Die Nucleotid- und die vorhergesagte Aminosäurerestsequenz, die von Cdn-1 kodiert werden, sind in 3 gezeigt; und jene von Cdn-2 sind in 5 gezeigt. Es wurde nun gefunden, dass die Proteine, die von den Cdn-Genen kodiert werden, in der Lage sind, die Apoptose zu regulieren. Es wurde gezeigt, dass Cdn-1 in einer Epstein-Barr-Virus (EBV)-Transformanten-Lymphoblastoid-Zelllinie die Fas-vermittelte Apoptose vermindert. In einer Mausvorläufer-B-Zelllinie, FL5.12, verringern die Expression von Cdn-2 und eines Derivats von Cdn-1 die durch IL-3 hervorgerufene Apoptose, während die Expression von Cdn-1 die Apoptose leicht verstärkte. Somit kann abhängig von dem Zelltyp, dem Derivat oder Typ des exprimierten Cdn und der Methode der Induktion der Apoptose die Apoptose in einer hochspezifischen Weise durch die Steuerung der Expression der Cdns und Konzentration der Cdns reguliert werden.
Wie hierin verwendet beziehen sich „Cdns" oder „Cdn" auf die hierin beschriebenen Nucleinsäuremoleküle (Nucleotide) (Cdn-1, Cdn-2 und Derivate von diesen), „die Cdns" oder „Cdn" beziehen sich auf die Proteine, welche dadurch kodiert werden (Cdn-1, Cdn-2 und Derivate von diesen). Die vorliegende Erfindung umfasst Cdn-1- und Cdn-2-Nucleotidsequenzen. Die Nucleotide beinhalten die Cdn-1-cDNA, aus dem Genom stammende DNA und synthetische oder halbsynthetische Nucleotide wie z.B. DNA, und RNA, sowohl kodierend als auch komplementär zu dem Kodierungsbereich, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die Nucleotide können zu der mRNA für wenigstens ein Fragment der Cdns und anderen Nucleotiden, welche an entweder die DNA oder die mRNA binden können, die die Cdns kodiert, komplementär sein. Diese komplementären Nucleotide umfassen Nucleotide, die in der Lage sind, Tripelhelices und Gegensinn-Nucleotide zu bilden, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die komplementären Nucleotide können endogen durch einen der hierin beschriebenen Vektoren exprimiert werden oder können exogen durch Methoden, die auf dem Gebiet der Oligonucleotid-Therapie bekannt sind, angefügt werden. Reed et al. (1990) Cancer Res. 50: 6565-6570. Die Nucleotidsequenz der Cdn-1-cDNA mit der Lage der Restriktionsendonukleasestellen ist in 3 gezeigt. Wie in den Beispielen hierin beschrieben wird, wurde Cdn-1-RNA in einer Vielzahl von menschlichen Organen und Geweben durch Northern Blot-Analyse nachgewiesen. Diese Organe beinhalten, wie in 4 gezeigt ist, Leber, Herz, Skelettmuskel, Lunge, Niere und Pankreas.
In ähnlicher Weise sind Cdn-2-cDNA, genomische DNA und synthetische oder halbsynthetische Nucleotide zusätzliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Die Nucleotidsequenz des Cdn-2-Gens, zusammen mit der vorhergesagten Aminosäuresequenz des Cdn-2-Proteins, und die Lage der Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen sind in 5 angegeben.
Die hierin angegebenen Beispiele zeigen, dass Cdn-1 auf dem menschlichen Chromosom 6 liegt und dass Cdn-2 auf dem menschlichen Chromosom 20 liegt. Es gibt ebenfalls ein Mitglied der Familie, Cdn-3, welches auf dem menschlichen Chromosom 11 liegt. Eine Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) zeigte eine ungefähre Lage von Cdn-1 bei 6p21-23. Es ist möglich, dass Cdn-2 ein Pseudogen ist. Während diese nicht endogen exprimiert werden können, sind sie in der Lage, von einem rekombinanten Vektor, der die geeigneten Promotersequenzen bereitstellt, exprimiert zu werden. Somit ist die Cdn-2-Nucleotidsequenz von der vorliegenden Erfindung umfasst, wie auch rekombinante Konstrukte von dieser und Proteine, die durch diese kodiert werden.
Derivate der Gene und Proteine beinhalten jeglichen Teil des Proteins oder der Nucleotidsequenz, welche das Protein kodiert, die eine Apoptose regulierende Aktivität beibehalten. 10 stellt drei solcher Derivate von Cdn-1 dar, von welchen gezeigt wurde, dass sie eine die Apoptose regulierende Aktivität beibehalten. Die Derivate, Cdn1-Δ1 und Cdn1-Δ2, und die Proteine, die durch diese kodiert werden, sind von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die Erfindung beinhaltet Modifikationen an Cdn-DNA-Sequenzen wie z.B. Deletionen, Substitutionen und Additionen, insbesondere in den nichtkodierenden Bereichen der genomischen DNA. Solche Änderungen sind nützlich, um die Klonierung zu erleichtern und die Genexpression zu modifizieren.
Die Erfindung umfasst weiterhin verschiedene substituierte Nucleotide. Substitutionen können innerhalb des kodierenden Bereichs gemacht werden, die entweder die kodierten Aminosäurereste nicht verändern oder zu konservativ substituierten Aminosäureresten führen. Nucleotidsubstitutionen, welche die kodierten Aminosäurereste nicht verändern, sind nützlich, um die Genexpression in unterschiedlichen Systemen zu optimieren. Geeignete Substitutionen sind den Fachleuten bekannt und werden beispielsweise gemacht, um eine bevorzugte Codonverwendung in den bestimmten Expressionssystemen widerzuspiegeln.
Die Erfindung umfasst funktional äquivalente Varianten und Derivate von Cdns, welche die Eigenschaften der Cdns verstärken, verringern oder nicht signifikant beeinflussen können. Beispielsweise sind Änderungen bei der DNA-Sequenz, welche die kodierte Aminosäuresequenz nicht verändern, wie auch jene, die zu konservativen Substitutionen von Aminosäureresten führen, oder Deletionen oder Additionen von einer oder wenigen Aminosäuren und Substitutionen von Aminosäureresten durch Aminosäureanaloga solche, die ihre Eigenschaften nicht signifikant beeinflussen werden.
Aminosäurereste, die konservativ füreinander substituiert werden können, umfassen: Glycin/Alanin; Valin/Isoleucin/Leucin; Asparagin/Glutamin; Asparaginsäure/Glutaminsäure; Serin/Threonin; Lysin/Arginin; und Phenylalanin/Tyrosin, sind aber nicht auf diese beschränkt. Jede konservative Aminosäuresubstitution, welche die Eigenschaften der Cdns nicht signifikant beeinflusst, ist von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die Erfindung umfasst weiterhin Mutanten von Cdns, welche, wenn sie exprimiert werden, die Aktivität von endogen exprimierten Cdns stören. Solche Mutanten können durch jedes Verfahren, das im Stand der Technik bekannt ist, gemacht werden und durch ihre Fähigkeit, die Aktivität der nativen Cdns zu beeinflussen, auf Aktivität hin gescreent werden.
Techniken zur Manipulation von Nucleinsäuren, die zur Praktizierung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind im Stand der Technik bekannt und werden in einer Vielzahl von Literaturstellen, einschließlich Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Bd. 1-3, Herausg. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); und Current Protocols in Molecular Biology, Herausg. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience: New York (1987) und regelmäßige Updates beschrieben, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Die Erfindung umfasst weiterhin eine Vielzahl von DNA-Vektoren, die darin kloniert die Cdn-Nucleotidsequenzen aufweisen. Geeignete Vektoren umfassen jegliche, die im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich jenen zur Verwendung in bakteriellen, Säugertier-, Hefe- und Insekten-Expressionssystemen, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Spezifische Vektoren sind im Stand der Technik bekannt und müssen hierin nicht im Detail beschrieben werden.
Die Vektoren können ebenfalls induzierbare Promotoren zur Expression der Cdn-Nucleotidsequenzen bereitstellen. Induzierbare Promotoren sind jene, die keine wesentliche konstitutive Expression des Gens sondern eher eine Expression nur unter gewissen Umständen erlauben. Solche Promotoren können durch eine Vielzahl von Reizen induziert werden, welche die Exposition einer Zelle, die den Vektor enthält, an einen Liganden, ein Metallion, eine andere Chemikalie oder eine Veränderung bei der Temperatur einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. Die Promotoren können ebenfalls zellspezifisch, d.h., nur in einem bestimmten Zelltyp und oft nur während eines spezifischen Zeitraums, induzierbar sein. Der Promotor kann weiterhin im Hinblick auf den Zellzyklus spezifisch sein, d.h., nur während eines bestimmten Stadiums in dem Zellzyklus induziert werden oder induzierbar sein. Der Promotor kann sowohl im Hinblick auf den Zelltyp spezifisch als auch im Hinblick auf den Zellzyklus spezifisch sein. Jeder induzierbare oder nichtinduzierbare Promotor, der im Stand der Technik bekannt ist, ist zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Vorzugsweise ist der verwendete Promotor induzierbar.
Die Erfindung umfasst weiterhin eine Vielzahl von Expressionssystemen, die mit den Vektoren transfiziert sind. Geeignete Expressionssysteme umfassen bakterielle, solche aus Säugetieren, Hefe und Insekten, sind aber nicht auf diese beschränkt. Spezielle Expressionssysteme und die Verwendung von diesen sind im Stand der Technik bekannt und werden hierin nicht im Detail beschrieben.
Die Erfindung umfasst die ex vivo-Transfektion mit Cdn-Nucleotidsequenzen, bei welcher Zellen, die aus Tieren einschließlich Menschen entnommen wurden, mit Vektoren transfiziert werden, die Cdn-Nucleotide enthalten, und wieder in Tiere eingeführt werden. Geeignete transfizierte Zellen umfassen einzelne Zellen oder Zellen, die innerhalb von ganzen Geweben enthalten sind. Zusätzlich kann eine ex vivo-Transfektion die Transfektion von Zellen, die aus einem Tier stammen, das von dem Tier oder Menschen verschieden ist, in welches die Zellen letztendlich eingeführt werden, beinhalten. Solche Transplantate beinhalten allogene Transplantate, xenogene Transplantate und Transplantationen von fötalem Gewebe, sind aber nicht auf diese beschränkt. Zusätzlich wird eine in vivo-Transfektion, wie z.B. durch pulmonale Verabreichung geeigneter Vektoren, beschrieben.
Im Wesentlichen kann jeder Zell- oder Gewebetyp auf diese Weise behandelt werden. Geeignete Zellen umfassen Cardiomyozyten und Lymphozyten, sind aber nicht auf diese beschränkt. Beispielsweise können Lymphozyten, die entnommen, mit der rekombinanten DNA transfiziert und wieder in einen HIV-positiven Patienten eingeführt wurden, die Halbwertszeit der wieder eingeführten T-Zellen erhöhen.
Als ein Beispiel werden bei der Behandlung von HIV-infizierten Patienten durch das oben beschriebene Verfahren die weißen Blutzellen aus dem Patienten entnommen und sortiert, um die CD4⁺-Zellen zu ergeben. Die CD4⁺-Zellen werden dann mit einem Vektor transfiziert, der ein Cdn-Nucleotid enthält, und wieder in den Patienten eingeführt. Alternativ können die nicht sortierten Lymphozyten mit einem rekombinanten Vektor transfiziert werden, der wenigstens ein Cdn-Nucleotid unter der Kontrolle eines zellspezifischen Promoters aufweist, so dass nur CD4⁺-Zellen die Nucleotide exprimieren. In diesem Fall wäre der CD4-Promoter ein idealer Promoter; es kann jedoch jeder geeignete CD4⁺-T-Zellenspezifische Promoter verwendet werden.
Weiterhin beschreibt die Erfindung Zellen, welche in vivo durch die Vektoren transfiziert wurden. Geeignete Methoden der in vivo-Transfektion sind im Stand der Technik bekannt und umfassen die von Zhu et al. (1993) Science 261: 209-211 beschriebene, sind aber nicht darauf beschränkt. Eine in vivo-Transfektion kann besonders nützlich sein als eine prophylaktische Behandlung für Patienten, die an Atherosklerose leiden. Eine Regulation der Spiegel von Cdn könnte als eine Prophylaxe für den mit der Apoptose verbundenen Reperfusionsschaden sein, der aus Hirn- und Herzinfarkten resultiert. Bei diesen Patienten mit einem hohen Risiko für Schlaganfall und Herzanfall könnten die Apoptose und der mit einer Arterienverstopfung verbundene Reperfusionsschaden verhindert oder wenigstens gelindert werden.
Infarkte werden durch eine plötzliche Insuffizienz bei der Versorgung mit arteriellem oder venösem Blut aufgrund von Embolien, Thrombosen oder Druck erzeugt, der einen makroskopischen Bereich einer Nekrose erzeugt; Herz, Gehirn, Milz, Niere, Darm, Lunge und Testes werden wahrscheinlich beeinträchtigt. Die Apoptose tritt bei den Geweben, welche den Infarkt umgeben, bei der Reperfusion von Blut in den Bereich auf; somit könnte eine Regulation der Cdn-Spiegel, welche durch eine von einem biologischen Modifikator hervorgerufene Änderung bei der endogenen Produktion durch in vivo-Transfektion oder durch anti-sense-Therapie erreicht wird, wirksam sein, um die Schwere des durch Herzanfälle und Schlaganfall verursachten Schadens zu verringern.
Nichtmenschliche transgene Tiere, welche die rekombinanten DNA-Vektoren enthalten, die Cdn-Nucleotidsequenzen enthalten, sind ebenfalls von der Erfindung umfasst. Methoden zur Erzeugung transgener Tiere sind im Stand der Technik bekannt und müssen hierin nicht im Detail beschrieben werden. Für eine Übersicht über die Methoden, die verwendet werden, um nichtmenschliche transgene Tiere zu erzeugen, siehe z.B. die PCT-Schrift Nr. WO 93/04169. Vorzugsweise exprimieren solche Tiere rekombinante Cdns unter der Kontrolle eines zellspezifischen und noch bevorzugter eines zellzyklusspezifischen Promoters.
In einer anderen Ausführungsform werden diagnostische Methoden bereitgestellt, um die Expression von Cdns entweder auf dem Proteinniveau oder dem mRNA-Niveau nachzuweisen. Jeder Antikörper, der Cdns spezifisch erkennt, ist zur Verwendung in der Cdn-Diagnostik geeignet. Anomale Spiegel von Cdns findet man voraussichtlich in den Geweben von Patienten mit Krankheiten, die mit einer unangemessenen Apoptose zusammenhängen; diagnostische Methoden sind daher nützlich, um biologische Zustände nachzuweisen und zu überwachen, die mit solchen Apoptosefehlern zusammenhängen. Nachweismethoden sind ebenfalls nützlich, um den Erfolg von Therapien, die mit Cdn zusammenhängen, zu überwachen.
Die Reinigung oder Isolation von Cdns, die entweder durch die rekombinante DNA oder aus biologischen Quellen wie z.B. Geweben exprimiert wurden, kann durch jedes Verfahren, das im Stand der Technik bekannt ist, erreicht werden. Proteinreinigungsverfahren sind im Stand der Technik bekannt. Im Allgemeinen sind im Wesentlichen gereinigte Proteine jene, die frei von anderen kontaminierenden zellulären Substanzen, insbesondere Proteinen sind. Vorzugsweise sind die gereinigten Cdns zu mehr als 80 Prozent rein und am meisten bevorzugt zu mehr als 95 Prozent rein. Zur klinischen Anwendung, wie sie unten beschrieben wird, sind die Cdns vorzugsweise in hohem Maße gereinigt, wenigstens zu ca. 99 Prozent rein, und frei von Pyrogenen und anderen Kontaminationen.
Geeignete Methoden der Proteinreinigung sind im Stand der Technik bekannt und beinhalten Affinitätschromatographie, Immunaffinitätschromatographie, Größenausschlusschromatographie, HPLC und FPLC, sind aber nicht auf diese beschränkt. Jedes Reinigungsschema, das nicht zu einem wesentlichen Abbau des Proteins führt, ist zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet.
Die Erfindung beinhaltet ebenfalls die im Wesentlichen gereinigten Cdns, welche die in 3 bzw. 5 dargestellten Aminosäurerest-Sequenzen aufweisen. Die Erfindung umfasst funktional äquivalente Varianten der Cdns, weiche deren Eigenschaften nicht signifikant beeinträchtigen, und Varianten, welche dieselbe Gesamtaminosäuresequenz beibehalten, welche aber eine verstärkte oder verringerte Aktivität haben. Beispielsweise liegen konservative Substitutionen von Aminosäureresten oder Deletionen oder Additionen von einer oder wenigen Aminosäuren und Substitutionen von Aminosäureresten durch Aminosäureanaloga innerhalb des Umfangs der Erfindung. Jede konservative Aminosäuresubstitution, welche die Eigenschaften der Cdns nicht signifikant beeinträchtigt, ist von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Geeignete Antikörper werden erzeugt, indem die Cdns oder vorzugsweise Peptide, welche die Cdn-Regionen umfassen, denen eine wesentliche Homologie zu anderen Genprodukten der Bcl-2-Familie fehlt, als ein Antigen verwendet werden. Verfahren zum Nachweisen von Proteinen unter Verwendung von Antikörpern und zum Erzeugen von Antikörpern unter Verwendung von Proteinen oder synthetischen Peptiden sind im Stand der Technik bekannt und werden hierin nicht im Detail beschrieben.
Die Expression von Cdn-Protein kann ebenfalls überwacht werden, indem der Spiegel der Cdn-mRNA gemessen wird. Jedes Verfahren zum Nachweisen spezifischer mRNA-Spezies ist zur Verwendung in diesem Verfahren geeignet. Dieses wird leicht erreicht, indem die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet wird. Vorzugsweise entsprechen die Primer, die zur PCR ausgewählt werden, den Bereichen der Cdn-Gene, denen eine wesentlichen Homologie zu anderen Mitgliedern der Bcl-Genfamilie fehlt. Alternativ können Northern Blots benutzt werden, um Cdn-mRNA nachzuweisen, indem Sonden verwendet werden, die für Cdns spezifisch sind. Verfahren der Benutzung von PCR und Northern Blots sind im Stand der Technik bekannt und werden hierin nicht im Detail beschrieben.
Verfahren der Behandlung mit Cdns beinhalten ebenfalls das Regulieren der zellulären Expression von Cdns durch steigende oder sinkende Spiegel von mRNA oder Protein. Geeignete Verfahren des Regulierens der zellulären Expression von Cdn umfassen ein Steigern der endogenen Expression mit biologischen Modifikatoren; ein Transfizieren der Zellen mit Vektoren, die Cdn-Nucleotide kodieren, so dass entweder ein Cdn-Gen überexprimiert wird oder ein Gegensinn-Nucleotid exprimiert wird; und ein Exprimieren von Mutanten-Cdns, welche die Wechselwirkung des endogenen Cdn mit anderen Proteinen wie z.B. anderen Mitgliedern der Bcl-2-Familie stören, sind aber nicht darauf beschränkt. Eine zelluläre Transfektion wird oben diskutiert und ist im Stand der Technik bekannt. Geeignete Indikationen zum Regulieren endogener Cdn-Spiegel beinhalten Malignome und eine herzspezifische Expression, sind aber nicht darauf beschränkt. Eine herzspezifische Expression ist besonders geeignet zur Verwendung bei Indikationen, welche Patienten einschließen, die anfällig für eine Herzerkrankung sind, ist aber nicht auf diese beschränkt, und vor kardiotoxischen Therapien einschließlich Chemotherapien, wie z.B. mit Adriamycin, ist aber nicht darauf beschränkt, um so einen Schutz des Herzens zu bieten.
Das Regulieren der endogenen Expression von Cdns kann erreicht werden, indem die Zellen an biologische Modifikatoren exponiert werden, welche direkt oder indirekt die Spiegel der Cdns verändern, entweder indem die Expression der Cdns reguliert wird oder indem der Abbau der Cdn-mRNA reguliert wird. Geeignete biologische Modifikatoren beinhalten Moleküle und andere Zellen, sind aber nicht darauf beschränkt. Geeignete Moleküle beinhalten Arzneimittel, Cytokine, kleine Moleküle, Hormone, Kombinationen von Interleukinen, Lektine und andere Stimulationsmittel, z.B. PMA, LPS, bispezifische Antikörper und andere Mittel, welche die zellulären Funktionen oder die Proteinexpression modifizieren, sind aber nicht darauf beschränkt. Ein geeigneter biologischer Modifikator ist vorzugsweise γIFN, welches die Cdn-Expressionsspiegel in HT-29-Zellen erhöht. Weiterhin beinhalten biologische Modifikatoren Cdn-Nucleotide, welche die Expression von endogenem Cdn modifizieren, und Mutanten-Cdns, weiche die Aktivität der endogenen Cdns stören. Die Zellen werden solchen biologischen Modifikatoren in physiologisch wirksamen Konzentrationen ausgesetzt, und die Expression der Cdns wird relativ zu einer Kontrolle gemessen, die den biologischen Modifikatoren nicht ausgesetzt wurde. Jene biologischen Modifikatoren, welche die Expression der Cdns relativ zu der Kontrolle verändern, werden für eine weitere Untersuchung ausgewählt.
Die Verfahren des Verringerns der endogenen Spiegel der Cdns beinhalten eine Therapie mit Gegensinn-Nucleotiden und Methoden, um das Sinn- oder Gegensinn-Konstrukt zu befördern, und die Regulation nach unten der Expression durch biologische Modifikatoren, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Gegensinn-Therapie ist im Stand der Technik bekannt und deren Anwendung wird einem Fachmann klar sein.
Das Screenen auf therapeutisch wirksame biologische Modifikatoren wird durchgeführt, indem entweder die Zellen an biologische Modifikatoren exponiert werden, welche direkt oder indirekt die Spiegel der Cdns regulieren können, indem sie entweder die Expression verändern oder die Halbwertszeit der Cdn-mRNA oder der Cdns verändern. Die biologischen Modifikatoren können ebenfalls Cdn-1-Wechselwirkungen mit den beiden anderen Mitgliedern der Bcl-2-Familie und anderen Genprodukten, z.B. Proteasen, stören. Geeignete biologische Modifikatoren beinhalten Moleküle und andere Zellen, sind aber nicht darauf beschränkt. Geeignete Moleküle beinhalten Arzneimittel, Cytokine, kleine Moleküle, Hormone, Kombinationen von Interleukinen, Lektine und andere Stimulationsmittel, z.B. PMA, LPS, bispezifische Antikörper, Cdn-Nucleotide, Cdn-Mutanten und andere Mittel, welche die zellulären Funktionen oder die Proteinexpression modifizieren, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Zellen werden unter Bedingungen kultiviert, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von wenigstens einem Cdn (vorzugsweise Cdn-1) hervorrufen, wobei sie an solche biologischen Modifikatoren in physiologisch wirksamen Konzentrationen ausgesetzt werden, und die Expression der Cdns wird relativ zu einer Kontrolle gemessen, welche nicht an biologische Modifikatoren ausgesetzt wurde. Jene biologischen Modifikatoren, welche die Expression der Cdns relativ zu der Kontrolle regulieren, werden für eine weitere Untersuchung ausgewählt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird ebenfalls überwacht, um sicher zu stellen, dass eine veränderte Cdn-Expression nicht auf einem Zelltod beruht.
Beim Feststellen der Fähigkeit von biologischen Modifikatoren, die Cdn-Expression zu regulieren (zu erhöhen oder zu verringern), können die Spiegel der endogenen Expression gemessen werden oder es können die Spiegel von rekombinanten Fusionsproteinen unter der Kontrolle von Cdn-spezifischen Promotersequenzen gemessen werden. Die Fusionsproteine werden durch Reportergene kodiert.
Reportergene sind im Stand der Technik bekannt und beinhalten Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) und β-Galactosidase, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Expres sion von Cdn-1 und Cdn-2 kann wie oben beschrieben entweder durch die Protein- oder mRNA-Spiegel überwacht werden. Die Expression der Reportergene kann durch enzymatische Tests oder auf Antikörpern basierende Tests wie z.B. ELISAs und RIAs überwacht werden, welche ebenfalls im Stand der Technik bekannt sind. Potentielle pharmazeutische Mittel können irgendein therapeutisches Mittel oder eine Chemikalie sein, die im Stand der Technik bekannt sind, oder irgendwelche nicht charakterisierten Verbindungen, die aus natürlichen Quellen wie beispielsweise Pilzkulturlösungen und Pflanzenextrakten stammen. Vorzugsweise sind geeignete pharmazeutische Mittel jene, denen eine wesentliche Zytotoxizität und Karzinogenität fehlt.
Geeignete Indikationen zum Regulieren endogener Spiegel von Cdns sind all solche, an welchen eine Cdn-vermittelte Apoptose beteiligt ist. Diese beinhalten verschiedene Typen von Malignomen und andere Störungen, die zu unkontrolliertem Zellwachstum führen, wie z.B. Ekzeme, oder Fehler beim normalen programmierten Zelltod wie z.B. Malignome, einschließlich, aber nicht beschränkt auf B-Zell-Lymphome, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die Erfindung umfasst ebenfalls therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen, welche eine Behandlung von Patienten mit biologischen Modifikatoren, um die Expression von Cdns zu regulieren, beinhalten. Wirksame Konzentrationen und Dosierungsregime können empirisch abgeleitet werden. Solche Ableitungen liegen innerhalb des Fachwissens der Fachleute und hängen beispielsweise von Alter, Gewicht und Geschlecht des Patienten und Typ und Schwere der Krankheit ab. Alternativ können Patienten direkt mit entweder nativen oder rekombinanten Cdns behandelt werden. Die Cdns sollten im Wesentlichen rein und frei von Pyrogenen sein. Es ist bevorzugt, dass die rekombinanten Cdns in einer Säugetierzelllinie erzeugt werden, um eine richtige Glykosylierung sicher zu stellen. Die Cdns können ebenfalls in einer Insektenzelllinie erzeugt werden.
Für therapeutische Zusammensetzungen wird eine therapeutisch wirksame Menge eines im Wesentlichen reinen Cdn oder eines biologischen Modifikators oder Oligonucleotids, welches die Expression oder Aktivität von diesem reguliert, in einem physiologisch verträglichen Puffer suspendiert, welcher Salzlösung und phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) einschließt, aber nicht darauf beschränkt ist, und dem Patienten verabreicht. Vorzugsweise ist die Verabreichung intravenös. Andere Methoden der Verabreichung beinhalten beispielsweise subkutan, intraperitoneal, gastrointestinal und direkt an ein spezifi sches Organ wie z.B. intrakardial, um den Zelltod, der mit einem Herzinfarkt zusammenhängt, zu behandeln, sind aber nicht darauf beschränkt.
Geeignete Puffer und Verabreichungsmethoden sind im Stand der Technik bekannt. Die wirksame Konzentration eines Cdn oder eines biologischen Modifikators für dieses muss empirisch bestimmt werden und wird von dem Typ und der Schwere der Krankheit, dem Krankheitsverlauf und der Gesundheit des Patienten abhängen. Solche Bestimmungen gehören zum Fachwissen eines Fachmanns.
Man nimmt an, dass Bcl-2 in einem Antioxidans-Stoffwechselweg wirkt. Veis et al. (1993) Cell 75: 229-240. Daher ist eine Therapie, welche Cdns beinhaltet, zur Verwendung bei Zuständen geeignet, an denen Superoxid beteiligt ist. Die Verabreichung von Modulatoren der Cdn-Expression führt zu einer erhöhten extrazellulären Konzentration der Cdns, von der angenommen wird, dass diese eine Methode bereit stellt, um die Ansammlung von Superoxid, welches von den Bläschen erzeugt werden kann, die mit der Apoptose zusammenhängen, direkt zu hemmen. Das therapeutische Verfahren beinhaltet somit ein Hemmen der von Superoxid vermittelten Zellschädigung, ist aber nicht darauf beschränkt.
Geeignete Indikationen für die therapeutische Verwendung von Cdns oder eines biologischen Modifikators für diese sind jene, die einen von freien Radikalen vermittelten Zelltod beinhalten, und umfassen Zustände, von denen früher angenommen wurde, dass diese durch Superoxiddismutase behandelt werden können, sind aber nicht darauf beschränkt. Solche Indikationen beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf eine HIV-Infektion, Autoimmunerkrankungen, Kardiomyopathien, neuronale Störungen, Hepatitis und andere Lebererkrankungen, Osteoporose und Schocksyndrome, einschließlich Sepsis, aber nicht darauf beschränkt.
Die Hybridisierung von klonierter Cdn-DNA mit Boten-mRNA aus verschiedenen Bereichen des Gehirns zeigte hohe Spiegel der Expression von Cdn-1 in jedem der untersuchten Bereiche. Daher sind neurologische Störungen ein anderes Gebiet, bei dem therapeutische Anwendungen der Cdns indiziert sind.
Die Erfindung umfasst weiterhin Verfahren des Testens auf Wechselwirkungen zwischen Cdns und Proteinen, die spezifisch an Cdns binden. Die Tests erfordern das in Berührung bringen gereinigter Cdns mit Zelllysaten, die ein Protein enthalten, welches unter Bedin gungen an Cdns binden kann, die ausreichend sind, damit das Protein binden kann, und das Testen auf das Vorliegen des Proteins.
Typischerweise beinhaltet der Testschritt das in Berührung bringen des Proteins mit einem spezifischen Bindungspartner wie beispielsweise einem Antikörper, der direkt oder indirekt markiert sein kann. Geeignete Tests umfassen einen ELISA, der Antikörper, die gegen das Protein gerichtet sind, in vitro translatiertes Cdn und Zelllysate, die das Protein enthalten, bereitstellt. Genetische Systeme aus Hefe wie z.B. Matchmaker (Clontech) sind ebenfalls zur Verwendung in dem Test geeignet.
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen, nicht aber zu beschränken. Wenn nichts anderes angegeben ist, waren alle Klonierungstechniken im Wesentlichen so wie von Sambrook et al. (1989) beschrieben und alle Reagenzien wurden entsprechend den Anleitungen des Herstellers verwendet.
Beispiel 1
Identifikation und Klonierung von Cdn-1-cDNA
Ein Aminosäuresequenzvergleich der sechs bekannten Mitglieder der Bcl-2-Familie (6) zeigte zwei Bereiche mit beträchtlicher Sequenzidentität, nämlich die Aminosäuren 144-150 und 191-199. Bei einem Versuch, neue Mitglieder der Bcl-2-Familie zu identifizieren, wurden degenerierte PCR-Primer, die auf Sequenzen in diesen Bereichen basierten, entworfen (1), und eine PCR wurde unter Verwendung von cDNA aus dem menschlichen Herz und cDNA einer menschlichen B-Lymphoblastoid-Zelllinie (WI-L2) durchgeführt. Die PCR wurde durchgeführt, indem die Hot Start/Ampliwax-Technik (Perkin Elmer Cetus) verwendet wurde. Die endgültige Konzentration der PCR-Primer und der Matrizen-cDNA betrug 4 μM bzw. 0,1-0,2 ng/ml. Die Bedingungen für die cDNA-Synthese waren identisch mit jenen für die Synthese des ersten Stranges der cDNA der cDNA-Bibliothek, wie sie nachstehend beschrieben wird. Die PCR wurde in einem Perkin Elmer Cetus DNA-Thermocycler gemäß dem von Kiefer et al. (1991), Biochem. Biophys. Res. Commun. 176: 219-225, beschriebenen Verfahren durchgeführt, außer dass die Annealing- und Verlängerungstemperaturen während der ersten 10 Zyklen 36°C betrugen. Nach der PCR wurden Proben mit 5 Einheiten DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment, für 30 min bei 37°C behandelt und dann durch Elektrophorese auf einem 7% Polyacrylamid, 1 X TBE (Tris/Borat/EDTA)-Gel fraktioniert. DNA, die zwischen 170-210 Basenpaaren wanderte, wurde aus dem Gel ausgeschnitten, passiv für 16 Stunden unter leichtem Schütteln in 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA (TE) eluiert, durch eine Passage über eine Elutip-D-Säule (Schleicher und Schuell) gereinigt, in den pCR-Script-Vektor (Stratagene) ligiert und in den Escherichia coli-Stamm XL1-Blue MRF (Stratagene) transformiert. Plasmid-DNA aus Transformanten (weiße Kolonien), welche sowohl die Herz- als auch die WI-L2-PCR-Produkte enthielten, wurde unter Verwendung des Magic Miniprep DNA-Reinigungssystems (Promega) isoliert, und die DNA-Inserts wurden durch das Dideoxy-Kettenabbruchverfahren gemäß Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (USB, Sequenase Version 2.0), sequenziert. Die DNA-Sequenzanalyse der elf Herz-PCR-Produkte zeigte zwei Sequenzen, die mit Bcl-x (Boise et al. (1993) Cell 74: 597-608) identisch waren, und zehn andere Sequenzen, die mit der Bcl-2-Familie nicht verwandt waren.
DNA-Sequenzanalysen der elf WI-L2-PCR-Produkte ergaben eine Bcl-x-Sequenz, fünf Sequenzen, die mit einem anderen Mitglied der Bcl-2-Familie, bax (Oldvai et al. (1993) Cell 74: 609-619), identisch waren, vier nicht verwandte Sequenzen und eine neue mit Bcl-2 verwandte Sequenz, die Cdn-1 genannt wurde. Die eindeutige Cdn-1-Aminosäuresequenz, welche durch das PCR-Produkt kodiert wird, ist in 6 von Aminosäure 151-190 (obere Reihe) gezeigt.
Um die Cdn-1-cDNA zu isolieren, wurden eine cDNA-Bibliothek des menschlichen Herzens (Clontech) und eine WI-L2-cDNA-Bibliothek, die wie von Zapf et al. (1990), J. Biol. Chem. 265: 14892-14898, beschrieben konstruiert wurde, gescreent, wobei das Cdn-1-PCR-DNA-Insert als eine Sonde verwendet wurde. Die DNA wurde gemäß dem Verfahren, das von Feinberg und Vogelstein (1984), Anal. Biochem. 137: 266-267, beschrieben wird, mit ³²P markiert und verwendet, um 150.000 rekombinante Klone aus beiden Bibliotheken gemäß dem von Kiefer et al. (1991) beschriebenen Verfahren zu screenen. Acht positive Klone wurden aus der WI-L2-cDNA-Bibliothek erhalten. Vier Klone aus der WI-L2-cDNA-Bibliothek und zwei aus der Herz-cDNA-Bibliothek wurden weiter gereinigt, und Plasmid-DNA, welche die cDNA-Inserts enthielt, wurde aus dem Vektor λZAPII (Stratagene) ausgeschnitten (2). Die zwei längsten Klone, W7 (2,1 kb) und WS (2,0 kb), wurden sequenziert und es wurde gezeigt, dass sie die Cdn-1-Sondensequenz enthielten, womit ihre Authentizität bestätigt wurde. Zwei Klone aus der Herz-cDNA-Bibliothek wur den gereinigt. Die cDNA wurde in pBlsc subkloniert und sequenziert. Die Herz-cDNAs kodierten ebenfalls Cdn-1.
Die W7-DNA-Sequenz ist zusammen mit der abgeleiteten Aminosäurerestsequenz in 3 gezeigt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von Cdn-1 wurde ebenfalls mit den anderen Mitgliedern der Bcl-2-Familie im Hinblick auf maximale Sequenzidentität ausgerichtet (aligned) und ist in 6 gezeigt. Wie man sehen kann gibt es eine beträchtliche Sequenzidentität zwischen Cdn-1 und anderen Familienmitgliedern zwischen den Aminosäuren 100 und 200. Jenseits dieses zentralen Bereichs fällt die Konservierung der Sequenz schart ab. Wie Bcl-2 scheint Cdn-1 ein intrazelluläres Protein zu sein, da es weder ein hydrophobes Signalpeptid noch N-verknüpfte Glykosylierungsstellen enthält. Cdn-1 enthält aber einen hydrophoben C-Terminus, der ebenfalls bei allen Mitgliedern der Bcl-2-Familie, außer LMW5-HL, beobachtet wird, was nahe legt, dass seine Stelle der anti-apoptotischen Aktivität wie die von Bcl-2 auf einem membrangebundenen Organell wie z.B. der mitochondrialen Membran, dem endoplasmatischen Retikulum oder der Kernmembran lokalisiert ist. Hockenbery et al. (1990); Chen-Levy et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 701-710; Jacobsen et al. (1993) Nature 361: 365-369; und Monighan et al. (1992) J. Histochem. Cytochem. 40: 1819-1825.
Beispiel 2
Northern Blot-Analyse von cDNA-Klonen
Eine Northern Blot-Analyse wurde gemäß dem Verfahren durchgeführt, das von Lehrach et al. (1977), Biochem. 16: 4743-4651, und Thomas (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201-5205, beschrieben wird. Zusätzlich wurde ein Northern Blot mit mehreren menschlichen Geweben von Clontech gekauft. Die kodierenden Bereiche von Bcl-2- und Cdn-1-cDNAs wurden durch das Zufallsprimingverfahren markiert, welches von Feinberg und Vogelstein (1984), Anal. Biochem. 137: 266-267, beschrieben wird. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen wurden gemäß den Verfahren ausgeführt, die von Kiefer et al. (1991) beschrieben werden. Insbesondere wurden mit Klenow markierte Fragmente von Bcl-2- und Cdn-1-Klonen mit einem Northern Blot mit mehreren menschlichen Geweben (Clontech 7760-1) bei einer Endkonzentration von 1 × 10⁶ cpm/Milliliter für jede Sonde hybridisiert. Der Blot wurde bei hoher Stringenz gewaschen.
Die Ergebnisse, die in 4 dargestellt sind, zeigen, dass Cdn-1 in allen getesteten Organen (Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas) exprimiert wird, während Bcl-2 nicht exprimiert oder nur mit niedrigen Spiegeln in Herz, Gehirn, Lunge und Leber exprimiert wird. Somit scheint Cdn-1 in sämtlichen menschlichen Organen verbreiteter exprimiert zu werden als Bcl-2 und kann wichtiger beim Regulieren der Apoptose in diesen Geweben sein.
Beispiel 3
Expression von rekombinantem Cdn-1
Um rekombinantes Cdn-1 in dem Baculovirussystem zu epxrimieren, wurde die in Beispiel 1 erzeugte Cdn-1-cDNA verwendet, um durch eine PCR-Methodik, wie sie in Beispiel 1 beschrieben ist, einen neuen Cdn-1-Vektor zu erzeugen, wobei Primer aus den 3'- und 5'-flankierenden Bereichen des Gens verwendet wurden, welche Restriktionsstellen enthalten, um das Klonieren zu erleichtern. Die Plasmide wurden durch das Dideoxy-Terminationsverfahren (Sanger et al., 1977) sequenziert, wobei Sequenzierkits (USB, Sequenase Version 2.0) und interne Primer verwendet wurden. Dieses diente dazu, zu bestätigen, dass aus der PCR keine Mutationen resultierten.
Ein Klon wurde verwendet, um rekombinante Viren durch homologe Rekombination in vivo zwischen den überlappenden Sequenzen des Plasmids und AcNPV Wildtyp-Baculovirus zu erzeugen. Nach 48 Stunden nach der Transfektion in Spodoptera frugiperda Insektenklon 9 (SF9)-Zellen wurden die rekombinanten Viren gesammelt, durch PCR identifiziert und weiter gereinigt. Standardprozeduren für Selektion, Screening und Vermehrung des rekombinanten Baculovirus wurden durchgeführt (Invitrogen). Die Molekülmasse auf einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) des in dem Baculovirussystem erzeugten Proteins wurde mit der vorhergesagten Molekülmasse von Cdn-1 gemäß der Aminosäuresequenz verglichen.
Zusätzlich können ähnliche Klone vorzugsweise in einem intrazellulären Hefeexpressionssystem durch jedes Verfahren, das im Stand der Technik bekannt ist, einschließlich des Verfahrens, das von Barr et al. (1992), Transgenesis Herausg. JAH Murray, (Wiley and Sons) Seiten 55-79, beschrieben wird, exprimiert werden.
Beispiel 4
Expression von Cdn-1 in Säugetiersystemen
Die Cdn-1 kodierende Sequenz wurde aus dem in Beispiel 1 erzeugten Plasmid ausgeschnitten und an kompatiblen Restriktionsenzymstellen in die Plasmide pCEP7, pREP7 und pcDNA3 (Invitrogen) eingeführt. pCEP7 wurde erzeugt, indem das RSV 3'-LTR von pREP7 mit XbaI/Asp718 entfernt wurde und der CMV-Promoter aus pCEP4 (Invitrogen) ersetzt wurde. 25 μg jedes Cdn-1 enthaltenden Plasmids wurden durch Elektroporese in die B-Lymphoblastoid-Zelllinie WI-L2 eingeführt, und stabile Hygromycin-resistente Transformanten oder G418-resistente Transformanten (pcDNA3-Konstrukte, 7), die Cdn-1 exprimierten, wurden ausgewählt.
Der Kodierungsbereich der Cdns kann ebenfalls in Expressionsvektoren ligiert werden, die in der Lage sind, sich stabil in andere Zelltypen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Kardiomyozyten, Nervenzelllinien wie z.B. GTI-7 und TNF-sensitive Zellen wie z.B. die menschliche Darmadenokarzinom-Zelllinie HT29 zu integrieren, um so eine Vielzahl von Testsystemen bereit zu stellen, um die Regulation der Apoptose durch Cdn-1 zu überwachen.
Beispiel 5
Wirkung der anti-apoptotischen Aktivität von Cdn-1 und seinen Derivaten in der Wildtyp-B-Lymphoblastoid-Zelllinie WI-L2-729 HF2 und der transformierten Zelle, welche ein Übermaß an Cdn-1 exprimiert
2 × 10⁵ WI-L2- und WI-L2-Zellen, die mit einem Vektor transformiert waren, der Cdn-1 kodierte, wie in Beispiel 4 beschrieben ist, wurden in RPMI, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) für das anti-fas-Experiment oder 0,1% FBS für Serumentzugsexperimente ergänzt war, kultiviert. In dem Fall des anti-fas-Experiments wurden die Zellen nach Waschen mit frischem Medium in RPMI, das mit 10% FBS ergänzt war, suspendiert, an anti-fas-Antikörper exponiert, und die Kinetik des Zelltodes als Reaktion auf ein Apoptose hervorrufendes Mittel wurde durch Flusszytometrie mit einem FACScan analysiert. In dem Fall des Serumentzugsexperiments wurden die WI-L2-Zellen in RPMI, das mit 0,1% FBS ergänzt war, resuspendiert, und die Apoptose wurde gemäß dem von Henderson et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8479-8483, beschriebenen Verfahren überwacht. Andere Verfahren der Induktion einer Apoptose umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Sauerstoffentzug in primären Herzmyozyten, NGF-Entzug, Glutathionabreicherung bei der Nervenzelllinie GTI-7 oder TNF-Zugabe zu der HT29-Zelllinie. Die Apoptose wurde beurteilt, indem die Zellschrumpfung und die Permeabilität für Propidiumiodid (PI) während deren Tod gemessen wurden. Zusätzlich kann jedes andere Verfahren zur Beurteilung des apoptotischen Zelltodes verwendet werden.
8 zeigt die anti-apoptotische Reaktion verschiedener WI-L2-Transformanten auf eine anti-Fas-Behandlung. 7 zeigt die anti-apoptotische Reaktion verschiedener WI-L2-Transformanten auf einen Serumentzug. In 8 wurden doppelte Vertiefungen, die 3 × 10⁵ Zellen enthielten, für 24 Stunden mit 50 ng/ml zellabtötendem anti-Fas-Antikörper inkubiert. Der Zelltod wurde dann durch Flusszytometrie mit einem FACScan analysiert. Die Proteine, die von jedem Konstrukt exprimiert wurden, sind unterhalb der Säulen gezeigt. Da viele der Konstrukte Trunkierungs- oder Deletionsvarianten sind, sind die genau exprimierten Aminosäuren ebenfalls angegeben. Wie man sehen kann wiesen alle Transformanten eine gewisse Schutzwirkung auf, wenn sie mit der Kontrolltransformante, welche den pREP7-Vektor allein enthielt, verglichen wurden. Die am stärksten apoptoseresistente Transformante war die Cdn-1Δ2 exprimierende Zelllinie, bei welcher über 90% der Zellen eine anti-fas-Behandlung überlebten. Ein signifikanter Schutz wurde ebenfalls bei Transformanten beobachtet, die Cdn-1 in voller Länge (1-211) und Cdn-1Δ1 exprimierten, gefolgt von Bcl-2Δ und Bcl-2 exprimierenden Zelllinien.
Cdn-1Δ1 und Cdn-1Δ2 fehlen die Nucleotide, welche die N-terminalen 59 bzw. 70 Aminosäuren von Cdn-1 in voller Länge kodieren. Die Beobachtung, dass die Expression von Cdn-1Δ2 wirksamer ist, um die Apoptose zu blockieren, als Cdn-1 in voller Länge, legt nahe, dass kleinere, trunkierte Cdn-1-Moleküle potente Therapeutika sein könnten.
Beispiel 6
Bestimmung von anderen Cdn-Genen und Klonierung des Cdn-2-Gens
Southern Blot-Analysen menschlicher Genom-DNA und einer Gruppe somatischer menschlicher/Nager-Zell-DNAs zeigten wenigstens 3 Cdn-verwandte Gene und dass diese auf den Chromosomen 6, 11 und 20 lagen. PCR/Sequenzanalyse der zwei Hybrid-DNAs zeigte, dass Cdn-1 auf dem Chromosom 6 lag und dass eine eng verwandte Sequenz auf dem Chromosom 20 lag (bezeichnet als Cdn-2). Wir haben das Cdn-2-Gen kloniert und sequenziert. Interessanterweise enthält Cdn-2 keine Introns und weist all die Merkmale prozessierter Gene auf, die in das Genom zurückgekehrt sind. Cdn-2 weist Promoterelemente [CCAAT, TATAAA Boxen] auf, wird aber möglicherweise nicht transkribiert, wie durch Northern Blot-Analysen mit einer Cdn-2-spezifizierten Sonde bestimmt wurde.
900.000 Klone aus einer Genombibliothek menschlicher Plazenta in dem Cosmid-Vektor pWE15 (Stratagene, La Jolla, CA) wurden mit einer 950 bp BglII-HindIII-cDNA-Sonde, welche den gesamten Kodierungsbereich von Cdn-1 enthielt, gescreent. Die Sonde wurde gemäß dem Verfahren von Feinberg und Vogelstein (1984), Anal. Biochem. 137: 266-267, mit ³²P markiert. Die Bibliothek wurde unter hochstringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen bearbeitet und gescreent, wie von Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben wird. Zehn doppelt positive Klone wurden durch erneutes Plattieren und Screenen wie oben weiter gereinigt. Plasmid-DNA wurde gereinigt, indem das Wizard Maxiprep DNA-Reinigungssystem wie von dem Lieferanten (Promega Corp., Madison, WI) beschrieben verwendet wurde, und durch EcoRI-Restriktionsenzym-Kartierung und Southern Blotting analysiert. Die Sonde, die zum Southern Blotting verwendet wurde, und die Hybridierungsbedingungen waren dieselben wie oben.
Die Cosmid-Klone gehörten zu zwei Gruppen, wie durch EcoRI-Restriktionsanalyse und Southern Blotting beurteilt wurde. Die Cosmid-Klone (cos) 1-4 und 7 zeigten ein eigenes Muster von durch EcoRI erzeugten DNA-Fragmenten und enthielten ein einzelnes hybridisierendes EcoRI-DNA-Fragment mit 6,5 kb. Cos2 und Cos9 gehörten in die zweite Gruppe, welche durch ein hybridisierendes EcoRI-DNA-Fragment mit 5,5 kb gekenn zeichnet war. Das DNA-Fragment mit 6,5 kb aus cos2 und das DNA-Fragment mit 5,5 kb aus cos9 wurden in pBluescript SK^– (Stratagene, La Jolla, CA) subkloniert, wobei Standardtechniken der Molekularbiologie verwendet wurden (Sambrook et al. wie oben). Plasmid-DNA wurde isoliert, und die DNA-Inserts aus zwei Subklonen, A4 (aus cos2) und C5 (aus cos9) wurden mit BamHI, HindIII und EcoRI kartiert und durch Southern Blotting wie oben beschrieben analysiert. Kleinere Restriktionsfragmente aus beiden Klonen wurden in M13-Sequenzierungsvektoren subkloniert, und die DNA-Sequenz wurde bestimmt.
Die Sequenz von A4 enthält ein offenes Leseraster, das eine Aminosäuresequenzidentität von 97% mit Cdn-1 zeigt (5). Der hohe Grad der Sequenzidentität dieses Gens mit Cdn-1 zeigt, dass es ein neues mit Cdn-1 verwandtes Gen ist, und dieses wird daher Cdn-2 genannt. Ein Sequenzvergleich des kodierten Cdn-2-Proteins und der anderen Mitglieder der Bcl-2-Familie ist in 6 gezeigt. Cdn-2 enthält die konservierten Bereiche, BH1 und BH2, die Kennzeichen der Bcl-2-Familie sind, und zeigt eine niedrigere Identität der Gesamtsequenz (~20-30%) mit anderen Mitgliedern, was ebenfalls für die Bcl-2-Familie charakteristisch ist.
Beispiel 7
Chromosomale Lokalisierung der Cdn-1- und Cdn-2-Gene
Eine Southern Blot-Analyse einer Gruppe von menschlichen/Nager Hybrid-DNAs somatischer Zellen (Gruppe #2 DNA aus dem NIGMS, Camden, NJ) und eine Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) von Metaphase-Chromosomen wurden verwendet, um die Cdn-Gene auf menschlichen Chromosomen zu kartieren. Für das Southern Blotting wurden 5 μg Hybridgruppen-DNA mit EcoRI oder BamHI/HindIII verdaut, auf 0,8% oder 1 Agarosegelen fraktioniert, auf Nitrozellulose übertragen und mit der Cdn-1-Sonde hybridisiert. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen waren wie oben beschrieben. Für die FISH wurde der Cdn-2-Subklon, A4, biotinyliert, wobei das Bionick Labeling System (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) verwendet wurde, und mit Metaphase-Chromosomen aus normalen menschlichen Fibroblasten gemäß dem Verfahren, das von Viegas-Pequignot in In Situ Hybridization, A Practical Approach, 1992, Herausg. D. G. Wilkinson, Seiten 137-158, IRL Press, Oxford, beschrieben wird, hybridisiert. Der Nachweis der Son den unter Verwendung von FITC-konjugiertem Avidin und biotinyliertem Ziegen-anti-Avidin erfolgte gemäß dem Verfahren, das von Pinkel et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9138-9142, beschrieben wird.
Die Southern Blot-Analyse zeigte drei hybridisierende EcoRI-Banden in der menschlichen DNA-Kontrolle, welche eine ungefähre Länge von 12 kb und 11 kb aufwiesen. Die Analyse der somatischen Zellhybrid-DNA zeigte, dass die Bande mit 12 kb in zwei verschiedenen Proben, NA10629, welche nur das menschliche Chromosom 6 enthielt, und NA07299, welche sowohl das menschliche Chromosom 1 als auch X und was wichtig ist, einen Teil des Chromosoms 6, der zu p21 telomer war, enthielt, vorlag. Die Bande mit 11 kb befand sich in NA13140, welches das menschliche Chromosom 20 enthält. Eine PCR/DNA-Sequenzanalyse dieser Hybrid-DNA-Proben unter Verwendung von Primern für Cdn-1 und Cdn-2 zeigte Cdn-1-Sequenzen in NA10629 (der das Chromosom 6 enthaltenden Hybrid-DNA) und NA07299 (der das Chromosom 1, X und 6pter>21 enthaltenden Hybrid-DNA), was zeigt, dass das Cdn-1-Gen auf dem Chromosom 6, telomer zu p21 liegt. Cdn-2-Sequenzen wurden in NA13140 gefunden, was zeigt, dass das Cdn-2-Gen auf dem Chromosom 20 liegt.
Beispiel 8
Regulierung der Apoptose durch Cdn-1 und Cdn-2 in FL5.12-Zellen
FL5.12 ist eine IL-3-abhängige Lymphoidvorläufer-Zelllinie (McKearn et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82: 7414-7418), von der gezeigt wurde, dass diese nach Entzug von IL-3 eine Apoptose durchläuft, aber vor dem Zelltod durch Überexpression von Bcl-2 geschützt wird. Nunez et al. (1990) J. Immunol. 144: 3602-3610; und Hockenbery et al. (1990) Nature 348: 334-336. Um die Fähigkeit von Cdn-1 und Cdn-2 zu beurteilen, die Apoptose zu regulieren, wurden cDNAs, die Cdn-1, Cdn-2, zwei trunkierte Formen von Cdn-1 (nachstehend beschrieben) und Bcl-2 kodierten, in den Säugetier-Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) ligiert und stabil in die Mäusevorläufer-B-Lymphozyten-Zelllinie FL5.12 durch Elektroporation und Selektion in Medium, welches das Antibiotikum G418 enthielt, eingeführt. Tests wurden dann mit einem Großteil der Transformanten wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
Die Wirkungen der überexprimierten Gene auf die Lebensfähigkeit von FL5.12-Zellen wurden zu verschienen Zeiten nach Entzug von IL-3 untersucht und sind in 9 gezeigt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Propidiumiodid (PI)-Ausschluss auf einem Flusszytometer (Becton Dickinson FACScan) beurteilt. Eine Bcl-2-Expression schützte die Zellen signifikant vor dem Zelltod, während es schien, dass Cdn-1 den Zelltod verstärkte, wenn es mit der Vektorkontrolle verglichen wurde. Die Expression von Cdn-2 verlieh ein geringes Ausmaß an Schutz vor dem Zelltod zu früheren Zeitpunkten, war aber zu späteren Zeitpunkten ohne Bedeutung. Interessanterweise ergab Cdn-1d2 ein moderates Ausmaß an Schutz gegenüber dem Zelltod. Cdn-1-112, ein Molekül, welches die N-terminalen 112 Aminosäuren von Cdn-1 enthält, schien die FL5.12-Zellen ebenfalls teilweise zu schützen, wenn auch in geringerem Ausmaß als Bcl-2.
Wie in Beispiel 7 gezeigt ist, führte die Expression von Cdn-1 und Cdn-1d2 in WI-L2-Zellen zu einem verstärkten Überleben der Zellen als Reaktion auf eine anti-Fas-vermittelte Apoptose und Serumentzug. Zusammen genommen legen diese Daten nahe, dass verschiedene Cdn-Moleküle in der Lage sind, die Apoptose in einer positiven oder negativen Weise, abhängig von dem Zelltyp und apoptotischen Reizen, zu regulieren. Somit sind sie wirksam darin, den Zelltod, wie beispielsweise bei der postischämischen Reperfusionsgewebeschädigung im Herzen oder beim Induzieren des Zelltods in Zellen, die einer apoptotischen Kontrolle entgangen sind, wie in dem Fall verschiedener Krebsarten, zu verhindern.
Beispiel 9
IFN-γ induziert eine Expression von Cdn-1-mRNA in HT-29-Zellen
Es wurde gezeigt, dass die menschliche Darmkarzinom-Zelllinie HT-29 nur nach Behandlung mit IFN-γ gegenüber der zytotoxischen Wirkung von anti-Fas-Antikörpern oder TNF empfindlich ist. Yonehara et al. (1989) J. Exp. Med. 169: 1747-1756. Diese mit IFN-γ behandelten Zellen zeigen ebenfalls eine erhöhte Apoptose nach einem Serumentzug oder einer Behandlung mit Cycloheximid. Diese induzierte Empfindlichkeit von HT-29-Zellen gegenüber apoptotischen Reizen kann teilweise auf der gleichzeitigen Hochregulation des TNF-Rezeptors und des Fas-Antigens beruhen, welche nach Behandlung mit IFN-γ beobachtet wird. Yonehara et al. (1989). Jedoch legt der verstärkte Zelltod, der nach Serumentzug oder Behandlung mit Cycloheximid beobachtet wird, nahe, dass andere apoptotische Mechanismen durch IFN-γ induziert werden könnten.
Die Regulation der Spiegel von Mitgliedern der Bcl-2-Familie durch IFN-γ ist ein weiterer möglicher Mechanismus für die induzierte Empfindlichkeit von HT-29-Zellen gegenüber apoptotischen Reizen. Eine Steigung bei der Expression von Cdn-1, Bax oder Bcl-x_S und/oder eine Abnahme bei der Expression von Bcl-2 oder Bcl-x_L könnten zu einer erhöhten Empfindlichkeit der Zellen gegenüber zellabtötenden Mitteln führen. Um diese Möglichkeit zu testen, wurden die mRNA-Spiegel von Mitgliedern der Bcl-2-Familie bei unbehandelten und mit IFN-γ behandelten HT-29-Zellen durch Northern Blot-Analyse untersucht, wobei die in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren und Bedingungen verwendet wurden. Die Spiegel an Cdn-1-mRNA waren nach Induktion mit IFN-γ ungefähr 10x erhöht, während die Spiegel an Bax- und Bcl-x-mRNA unverändert blieben. Bcl-2-mRNA war sowohl bei unbehandelten als auch mit IFN-γ behandelten Zellen unterhalb nachweisbarer Spiegel. Es blieb möglich, dass das Verhältnis von Bcl-x_S- zu Bcl-x_L-Transkripten bei der Behandlung mit IFN-γ erhöht worden sein könnte, aber aufgrund des kleinen Unterschieds in der Größe zwischen den Transkripten durch Northern Blot-Analyse nicht nachgewiesen würde. Dieses war der Fall bei nichtstimulierten gegenüber mit PMA plus Ionomycin stimulierten Thymozyten, wie von Boise et al. (1993), Cell 74: 597-608, festgestellt wurde. Unter Verwendung einer semiquantitativen PCR zeigten sie, dass das Verhältnis von Bcl-x_S zu Bcl-x_L nach der Stimulation anstieg. Unter Verwendung ähnlicher PCR-Techniken wurde gezeigt, dass das Verhältnis von Bcl-x_S- zu Bcl-x_L-mRNA nach der Behandlung von HT-29-Zellen mit IFN-γ unverändert blieb und dass das vorherrschende Transkript Bcl-x_L war (>90%).
Somit gibt es eine positive Korrelation zwischen der Hochregulation von Cdn-1-Transkripten und der HT-29-Tumorzelllinie nach Behandlung mit IFN-γ und der erhöhten Anfälligkeit für den Zelltod. Diese Ergebnisse zeigen, dass es in Tumorzellen positive Modulatoren von Cdn-1 gibt und dass diese nützlich sein können beim Behandeln einiger Tumore, wenn sie zusammen mit geeigneten Apoptose-induzierenden Mitteln verabreicht werden.
Auch wenn die vorstehende Erfindung in gewissem Detail anhand von Veranschaulichungen und Beispielen zu Zwecken der Klarheit des Verständnisses beschrieben wurde, wird es den Fachleuten ersichtlich sein, dass gewisse Änderungen und Modifikationen durchgeführt werden können.

Claims

Isoliertes Cdn-Protein aufweisend eine Aminosäure-Sequenz, die ausgewählt ist aus: a) der in 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz (Cdn-1), der in 5 dargestellten Aminosäure-Sequenz (Cdn-2), der Aminosäure-Sequenz, die von den Nucleotiden 365-820 der in 3 dargestellten Nucleinsäure kodiert wird (Cdn-1 Δ1), und der Aminosäure-Sequenz, die von den Nucleotiden 398-820 der in 3 dargestellten Nucleinsäure-Sequenz kodiert wird (Cdn-1 Δ2); b) einem Fragment der Aminosäure-Sequenz von (a), wobei das Fragment die Apoptose regulierende Aktivität der Aminosäure-Sequenz von (a) hat; und c) einer Aminosäure-Sequenz, die sich von der Aminosäure-Sequenz von (a) durch eine oder einige wenige konservative Substitutionen unterscheidet, wobei die Sequenz die Apoptose regulierende Aktivität der Aminosäure-Sequenz von (a) hat.
Isoliertes Cdn-Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein die in 3 dargestellte Aminosäure-Sequenz aufweist.
Isoliertes Cdn-Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein die in 5 dargestellte Aminosäure-Sequenz aufweist.
Isoliertes Cdn-Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein die Aminosäure-Sequenz aufweist, die von den Nucleotiden 365-820 der in 3 dargestellten Nucleinsäure-Sequenz kodiert wird.
Isoliertes Cdn-Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein die Aminosäure-Sequenz aufweist, die von den Nucleotiden 398-820 der in 3 dargestellten Nucleinsäure-Sequenz kodiert wird.
Isoliertes Cdn-Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein eine das Protein exprimierende Zelle vor fas-vermittelter Apoptose schützt.
Isoliertes Nucleinsäure-Molekül aufweisend eine Nucleinsäure-Sequenz, die ein Cdn-Protein nach einem der Ansprüche 1-6 kodiert.
Isoliertes Nucleinsäure-Molekül, wobei die Nucleinsäure-Sequenz ausgewählt ist aus: a) der in 3 dargestellten Nucleinsäure-Sequenz, der in 5 dargestellten Nucleinsäure-Sequenz, den Nucleotiden 365-820 der in 3 dargestellten Nucleinsäure-Sequenz, den Nucleotiden 398-820 der in 3 dargestellten Nucleinsäure-Sequenz und den Nucleotiden 473-820 der in 3 dargestellten Nucleinsäure-Sequenz; b) Oligonucleotid-Fragmenten irgendeiner der Nucleinsäure-Sequenzen von (a), die als eine Sonde oder ein Primer für irgendeine der Nucleinsäure-Sequenzen von (a) brauchbar sind; und c) einer Nucleinsäure-Sequenz, die zu irgendeiner der Nucleinsäure-Sequenzen von (a) oder (b) komplementär ist.
Vektor aufweisend ein Nucleinsäure-Molekül nach einem der Ansprüche 7 oder 8.
Vektor nach Anspruch 9, wobei der Vektor ein rekombinanter DNA-Vektor ist.
Vektor aufweisend ein Nucleinsäure-Molekül nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei die Expression der Nucleinsäure-Sequenz, die das Cdn-Protein kodiert, unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors stattfindet.
Isolierte Zelle, die mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 9-11 oder einem Nucleinsäure-Molekül nach Anspruch 7 oder Anspruch 8 transfiziert ist.
Zusammensetzung aufweisend ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, ein Nucleinsäure-Molekül nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, einen Vektor nach einem der Ansprüche 9 bis 11 und/oder eine Zelle nach Anspruch 12.
Nicht-menschliches transgenes Tier, dessen Genom heterolog einen Vektor nach einem der Ansprüche 9 bis 11 oder ein Nucleinsäure-Molekül nach Anspruch 7 oder Anspruch 8 aufweist, oder dessen Zellen ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 exprimieren.
Pharmazeutische Zusammensetzung aufweisend einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer und ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, ein Nucleinsäure-Molekül nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, einen Vektor nach einem der Ansprüche 9 bis 11 und/oder eine Zelle nach Anspruch 12.
Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, der ein Cdn-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erkennt, der aber mit anderen Mitgliedern der Bcl-Familie nicht reaktiv ist.
Antikörper nach Anspruch 16, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Zusammensetzung aufweisend den Antikörper nach Anspruch 16 oder 17.
Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit eines Cdn-Proteins, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert ist, in einer biologischen Probe durch: a) Bereitstellen einer Zellprobe; b) Auflösen der Zellen oder durchlässig machen der Zellen für Antikörper; c) Zugeben eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 16 oder 17 zu der Zellprobe; d) Halten der Zellprobe unter Bedingungen, die es dem Antikörper erlauben, mit einem Cdn-Protein zu komplexieren, und e) Nachweisen gebildeter Antikörper-Cdn-Protein-Komplexe, wodurch Cdn-Protein nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Cdn-Protein Cdn-1 (die in 3 dargestellte Aminosäure-Sequenz) ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Cdn-Protein Cdn-2 (die in 5 dargestellte Aminosäure-Sequenz) ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Zellprobe T-Zellen aufweist.
Verfahren zum Nachweisen der Expression eines Cdn-Gens in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren das Identifizieren der Anwesenheit von RNA, die das Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert, in der Probe aufweist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Verfahren zur Identifizierung der RNA Northern blotting ist.
Verfahren zum Identifizieren von Cdn-mRNA durch: a) Bereitstellen einer Zellprobe; b) Erhalten von RNA aus der Zellprobe; c) Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion an der RNA unter Verwendung von Primern, die einzigartigen Bereichen einer Nucleinsäure-Sequenz, die ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert, entsprechen; und d) Nachweisen der Anwesenheit von Produkten der Polymerase-Kettenreaktion.
In vitro-Verfahren zur Regulierung von durch Apoptose ausgelöstem Zelltod, wobei das Verfahren das Regulieren des endogenen Gehalts eines Cdn-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 6 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Gehalt an Cdn-Protein erhöht wird durch Regulieren der Expression eines endogenen Cdn-Gens, das die in 3 dargestellte Nucleinsäure-Sequenz oder die in 5 dargestellte Nucleinsäure-Sequenz aufweist, oder wobei der Gehalt an Cdn-Protein erhöht wird durch Expression des Cdn-Proteins durch einen rekombinanten Vektor nach Anspruch 10, wobei die Expression des Cdn-Proteins gewünschtenfalls unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors stattfindet.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, Nucleinsäure-Molekül nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, Vektor nach den Ansprüchen 9 bis 11 oder Zelle nach Anspruch 12 zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Apoptose.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer HIV-Infektion, Arteriosklerose, mit Apoptose verbundener Schädigung durch erneute Durchblutung, die aus einem Hirninfarkt oder einem Herzmuskelinfarkt resultiert, oder für eine Indikation, für die Superoxiddismutase angezeigt war.
Verfahren zum Prüfen auf Wechselwirkungen zwischen einem Cdn und einem Protein, das spezifisch an Cdns bindet, wobei das Verfahren das in Berührung bringen von gereinigtem Cdn nach einem der Ansprüche 1 bis 6 mit einem Zell-Lysat, das ein mutmaßliches Cdn-bindendes Protein enthält, unter Bedingungen, die eine Bindung des mutmaßlichen Cdn-bindenden Proteins an das Cdn erlauben; Isolieren des Cdn; in Berührung bringen des isolierten Cdn mit einem Bindungspartner, der für das mutmaßliche Cdn-bindende Protein unter Bedingungen, die eine Bindung des Bindungspartners und des mutmaßlichen Cdn-bindenden Proteins erlauben, spezifisch ist; und Messen der Menge des Bindungspartners, die an das mutmaßliche Cdn-bindende Protein gebunden ist, um zu bestimmen, ob das mutmaßliche Cdn-bindende Protein an das isolierte Cdn gebunden ist, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Zell-Lysat ein Hefe-Lysat ist und/oder der Bindungspartner ein Antikörper ist.
In vitro-Verfahren zur Regulierung des Gehalts eines Apoptose regulierenden Proteins in einer Zelle, folgende Schritte aufweisend: Bereitstellen einer Zelle; Einführen eines Polynucleotids, das ein Cdn-Protein nach Anspruch 7 oder Anspruch 8 kodiert, in die Zelle; und Exprimieren des Cdn-Proteins von dem Polynucleotid.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei das Cdn-Protein eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus der in 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz (Cdn-1), der in 5 dargestellten Aminosäure-Sequenz (Cdn-2), den Positionen 60 bis 211 der in 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz (Cdn-1 Δ1), den Positionen 71-211 der in 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz (Cdn-1 Δ2) und den Positionen 96-211 der in 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz (Cdn-1 Δ3) besteht.
Verwendung eines Nucleinsäure-Moleküls nach Anspruch 7 oder Anspruch 8 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Regulierung des Spiegels eines Apoptose regulierenden Proteins bei einem Patienten.
Verwendung einer Zelle, die mit einem Nucleinsäure-Molekül nach Anspruch 7 oder Anspruch 8 transfiziert ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Regulierung des Spiegels eines Apoptose regulierenden Proteins bei einem Patienten.