DE69910411T2

DE69910411T2 - Medikament zur behandlung von infektionen

Info

Publication number: DE69910411T2
Application number: DE69910411T
Authority: DE
Inventors: John Robert Mill Hill WILSON; William Conrad Barnet MULLINEAUX; Elizabeth Anna Margate LAW
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1998-09-22
Filing date: 1999-09-22
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2019-09-23
Also published as: WO2000016758A2; GB9820658D0; ATE246921T1; AU6212999A; WO2000016758A3; EP1115386A2; EP1115386B1; DE69910411D1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Inhibitoren der Expression und Aktivität eines Genproduktes und Screeningmethoden für die Identifizierung solcher Inhibitoren. Sie betrifft des Weiteren die Verwendung des Inhibitors für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer Infektion durch einen Organismus, wie beispielsweise einen Malariaparasiten.
Allgemeiner Stand der Technik
Der Malariaparasit und verwandte Apicomplexae sind insofern ungewöhnlich unter Organismen, die keine Fotosynthese betreiben, weil sie zwei Formen von Organellen-DNA besitzen, was normalerweise eine Eigenschaft von Pflanzen ist. Eine Form der Organellen-DNA ist mitochondriale DNA und die andere ist eine in einem Plastid vorhandene, zirkuläre DNA mit 35 kb. Es wird angenommen, dass das Plastid prokaryontischer Herkunft ist. Das Gen ycf24^1,2, das auf der DNA in diesem Plasmid vorhanden ist, entspricht einem gut konservierten Gen, das auch in Plastiden von Rotalgen³, verschiedenen Bakterien einschließlich E. coli¹⁶ und dem Cyanobakterium Synechocystis sp., Stamm PCC6803¹⁷, vorkommt. Das Plastid ist eine Zielstruktur zur Entwicklung von Arzneimitteln^18,19.
Das Plastidgenom der Apicomplexae unterscheidet sich zwar von dem der parasitischen, höheren Pflanze Epifagus virginiana⁵, weist aber dennoch allgemeine Ähnlichkeiten auf. Es wurde postuliert, dass der Grund für die Erhaltung von Plasmidgenomresten die kleine Anzahl von darin vorhandenen, offenen Leserastern sowie der stark selektierte Satz von genau auf das Expressionssystem der jeweiligen Organelle abgestimmten Genen ist⁶. Im Gegensatz zu Apicomplexae trägt Epifagus das ycf24-Gen nicht in seinem Plastidgenom, was vermuten lässt, dass entweder die Organellenreste eine unterschiedliche Funktion haben oder ein stochastischer Prozess den Verlust von Genen oder deren Transfer in den Zellkern bestimmt.
Der hohe Konservierungsgrad von ycf24 (~50%ige Aminosäureübereinstimmung des putativen, kodierten Peptidproduktes mit anderen Orthologen) lässt vermuten, dass es unter starken Selektionsdruck steht und wahrscheinlich eine allgemeine Funktion besitzt. Bei Apicomplexae ist eine Transfektion von Organellen nicht möglich. „Knockouts" können daher nur in Ersatzorganismen getestet werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfinder haben das ycf24-Gen sowohl in Synechocystis sp., Stamm pCC6803, als auch in E. coli deletiert⁷. Eine Deletion aller Kopien des ycf24-Gens in diesen Organismen erwies sich als letal. Es wurde gefunden, dass die Deletion einiger Kopien von Synechocystis ergibt und eine Verzögerung oder Beeinflussung des Vorgangs der Septenbildung bei der Zellteilung zu verursachen schien. Bei ycf24 handelt es sich daher um ein essenzielles Gen, das eine Rolle bei der Replikation zu spielen scheint. Die vorliegende Erfindung beruht auf der Inhibition der Expression oder Aktivität des ycf24-Produktes zur Inhibition des Wachstums eines Organismus in vivo bzw. ex vivo.
Die Erfindung sieht daher einen Antikörper gegen das ycf24-Genprodukt oder einen Antisense-Inhibitor vor, der zur Hybridisierung mit der ycf24-RNA in der Lage ist, zur Verwendung bei der Behandlung einer Infektion des Körpers von Menschen oder Tieren durch einen Organismus, der das Gen umfasst. Solch ein Antikörper oder Antisense-Inhibitor ist besonders bei der Behandlung einer Infektion durch einen Malariaparasiten nützlich. Die Erfindung sieht außerdem ein Verfahren zum Hemmen des Wachstums eines das Gen umfassenden Organismus vor, wobei das Verfahren das In-Berührung-Bringen des Organismus ex vivo mit einem Antikörper gegen das ycf24-Produkt oder einen Antisense-Inhibitor umfasst, der in der Lage ist, mit ycf24-RNA zu hybridisieren.
Es können Screeninguntersuchungen durchgeführt werden, um einen Inhibitor der Expression und/oder Aktivität des ycf24-Produktes zu identifizieren. Die Erfindung sieht ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung vor, die das Wachstum eines das ycf24-Gen umfassenden Organismus hemmt, wobei das Verfahren umfasst

(i) In-Berührung-Bringen einer Testverbindung mit dem ycf24-Genprodukt, und
(ii) Bestimmen, ob die Testverbindung die Aktivität des Produktes hemmt oder an das Produkt bindet, wobei jede Bindung oder Hemmung anzeigt, dass die Verbindung das Wachstum des Organismus hemmt.

Die Erfindung sieht außerdem ein Verfahren für das Identifizieren einer Verbindung vor, die das Wachstum eines Organismus umfassend das ycf24-Gen hemmt, wobei das Verfahren umfasst:

(i) In-Berührung-Bringen einer Testverbindung mit einem Testkonstrukt umfassend einen ycf24-Promotor, der funktional mit einer kodierenden Sequenz verbunden ist,
(ii) Bestimmen, ob die Testverbindung die von dem Promotor angetriebene Expression hemmt, wobei jede Hemmung anzeigt, dass die Verbindung das Wachstum des Organismus hemmt.

Die Erfindung sieht außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen Antikörper gegen das ycf24-Gen oder einen Antisense-Inhibitor vor, der in der Lage ist, mit ycf24-RNA zu hybridisieren und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel.
Die Erfindung sieht außerdem die Verwendung eines Antikörpers gegen das ycf24-Genprodukt bzw. einen Antisense-Inhibitor, der in der Lage ist, mit der ycf24-RNA zu hybridisieren, zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Verhindern einer Infektion durch einen einzelligen Organismus umfassend das ycf24-Gen bei einem Patienten, vor.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung ist veranschaulicht durch die begleitenden Zeichnungen, in denen Folgendes gezeigt ist:
1 zeigt Phänotypeigenschaften von Wildtyp (WT), von Transformanden mit dem ungleichmäßigen („ragged") Phänotyp (R) und von Formen mit glatten Mutanten (S) von Synechocystis sp.: a) Kolonieform und -größe; eine Vergrößerung ist in R eingefügt; b) mikroskopische Rasterelektronenaufnahmen ganzer Zellen – Balken = 10 μm, c) Querschnitte, die Plaques zeigen – Pfeil, d) ganze Zellen mit und ohne DAPI-Färbung. Die Pfeile zeigen auf nicht stattfindende Segregation.
2 zeigt einen Southern-Blot von DNA aus Synechocystis sp. nach Restriktion mit Hind III und Hybridisierung mit dem Wildtyp (WT)-ycf24. Die für die Restriktionsfragmente des WT (Spur 4) und die Klone von heteroplastischen Transformanden (Spur 1–3) erwarteten Größen sind in dem nachfolgenden Diagramm gegeben.
3 zeigt einen Effekt der Überexpression von ycf24 in E. coli. 3a zeigt mit DAPI angefärbte Nukleoide in einer nicht induzierten Kultur von E. coli und 3b zeigt mit DAPI angefärbte Nukleoide nach Induktion einer Überexpression.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Der Antikörper bzw. der Antisense-Inhibitor der Erfindung kann verwendet werden, um das Wachstum eines einzelligen oder mehrzelligen Organismus in vivo oder ex vivo zu hemmen. Der Organismus kann ein Prokaryont oder ein Eukaryont sein. Der Organismus umfasst das ycf24-Gen. Im Falle eines Eukaryonten kann das nukleäre Genom des Organismus das ycf24-Gen enthalten oder der Organismus kann eine Organelle enthalten, die DNA mit dem ycf24-Gen enthält. Eine solche Organelle ist im Allgemeinen prokaryontischen Ursprungs, beispielsweise stammt sie aus Algen, und kann ein Plastid sein.
Der Organismus kann ein Protozoon, wie beispielsweise ein Angehöriger der Apicomplexae sein, beispielsweise aus dem Stamm der Plasmodien, Piroplasmen, Sarkozysten oder Kokzidien. Der Organismus kann Plasmodium falciparum sein. Der Organismus kann eine Alge sein. Der Organismus kann ein Bakterium, beispielsweise Cyanobakterium, Mykobakterium oder E. coli sein. Der Organismus kann frei lebend oder ein menschliches und/oder tierisches Pathogen sein. Er kann ein intrazelluläres oder extrazelluläres Pathogen sein.
Das ycf24-Genprodukt ist im Allgemeinen eines, das aus der kodierenden Region der/des Folgenden exprimiert werden kann:

(a) der Polynukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 oder einem Fragment davon; oder
(b) Polynukleotiden, die selektiv an die kodierende Region von (a) oder einem Fragment davon hybridisieren können; oder
(c) Polynukleotide, die außer bei Degenerierung des genetischen Codes, an (a) oder (b) hybridisieren würden.

Die Polynukleotide von (b) können unter Bedingungen eines Mediums mit hoher Stringenz hybridisieren, beispielsweise bei 0,03 M NaCl und 0,03 M Natriumcitrat und zwischen 50 und 60 Grad Celsius.
Das Polynukleotid, aus dem das ycf24-Produkt exprimiert wird, hat über eine Region von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30, beispielsweise mindestens 46, 60 oder 100 oder mehr kontige Nukleotiden im Allgemeinen mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 95, 97 oder 99% Sequenzidentität zu der kodierenden Sequenz von SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3.
Das ycf24-Produkt hat über eine Region von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30, beispielsweise mindestens 46, 60 oder 100 oder mehr kontigen Aminosäuren im Allgemeinen mindestens 50% Sequenzidentität zu den in SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 gezeigten Aminosäuresequenzen, vorzugsweise mindestens 80 oder 90% und besonders bevorzugt 95, 97 oder 99%. Der Begriff ycf24-Produkt umfasst Fragmente der Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 oder von den oben erörterten homologen Sequenzen. Geeignete Fragmente haben eine Größe von mindestens 5, 10, 20 oder 40 Aminosäuren, beispielsweise eine Größe von mindestens 60 oder 100 Aminosäuren. Im Allgemeinen hat das ycf24-Produkt ycf24-Produktaktivität und wäre im Allgemeinen in der Lage, die Aktivität eines natürlich vorkommenden ycf24-Produktes zu ergänzen.
In der vorliegenden Erfindung kann ein Antikörper gegen das ycf24-Genprodukt oder ein Antisense-Inhibitor, der in der Lage ist, mit der ycf24-mRNA zu hybridisieren, verwendet werden.
Die Erfindung sieht ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung vor, die die Aktivität des ycf24-Produktes hemmt. ycf24-Produkt zur Verwendung in diesem Verfahren kann beispielsweise durch jedes aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren rekombinant erhalten werden. Die Nukleotidsequenzen der ycf24-Gene von Plasmodium falciparum, Synechocystis Sp., Stamm pCC6803, und E. coli sind hierin respektive als SEQ ID Nr. 1, 2 bzw. 3 angegeben. Die ycf24-Gene anderer Arten können durch Suchen in Datenbanken nach Genen, die zu SEQ ID Nr. 1, 2 bzw. 3 homolog sind, identifiziert werden. Nukleotide mit derselben Sequenz wie in einer Datenbank identifizierte Gene können unter Verwendung von Routineverfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, hergestellt und exprimiert werden. Alternativ können ycf24-Gene identifiziert werden, indem genomische Bibliotheken oder cDNA-Bibliotheken mit Nukleotidsonden umfassend das ycf24-Gen oder Fragmente des ycf24-Gens durchsucht werden, und dann die von der Sonde identifizierten Nukleotide isoliert und sequenziert werden.
Für das Identifizieren des Inhibitors der Aktivität kann jedes geeignete Format verwendet werden. In dem Verfahren liegt das ycf24-Gen im Allgemeinen in einem geeigneten Puffer vor, welcher jeden geeigneten biologischen Puffer umfasst, der bei einem pH-Wert puffern kann, der für die Reaktionsvoraussetzungen des ycf24-Produktes förderlich ist. Das ycf24-Produkt kann in Bedingungen vorliegen, die den physiologischen Bedingungen gleichen, in denen es natürlicherweise vorkommt.
In dem Verfahren kann das ycf24-Produkt in einer Zelle oder außerhalb einer Zelle vorliegen. Die Zelle kann die Zelle sein, in der das ycf24-Produkt natürlicherweise vorkommt oder eine Zelle, in der das ycf24-Produkt rekombinant exprimiert wird. Die Zelle kann mit Mitteln behandelt sein, die die Zelloberfläche durchlässig machen, damit Testsubstanzen schneller in die Zelle gelangen. Das in dem Verfahren verwendete ycf24-Produkt kann in Form eines Extraktes aus solchen Zellen vorliegen.
Das Verfahren kann bestimmen, ob eine Testverbindung in der Lage ist, das ycf24-Produkt zu binden, wie beispielsweise auf eine spezifische Weise. Dieses Verfahren kann umfassen, dem ycf24-Produkt zu erlauben, an eine Testverbindung zu binden, und den Grad der auftretenden Bindung zu messen, wie beispielsweise durch Messen der Menge an ycf24, die an die Verbindung gebunden ist. Der Grad der Bindung kann durch Messen eines Kennzeichens des ycf24-Produkts bestimmt werden, das sich bei einer Bindung verändert, wie beispielsweise spektroskopische Veränderungen.
Das Testformat kann ein „Bandenverschiebungs"-System sein. Dabei wird bestimmt, ob eine Testverbindung das ycf24-Produkt in der Gelelektrophorese relativ zu dem ycf24-Produkt in Abwesenheit der Verbindung nach vorne verschiebt oder zurückhält.
Das Verfahren kann ein kompetitiver Bindungstest sein. Dieser bestimmt, ob die Testverbindung in der Lage ist, die Bindung des ycf24-Produktes an eine Substanz zu hemmen, die bekannterweise an das ycf24-Produkt bindet, wie beispielsweise ein für das Produkt spezifischer Antikörper. Dieses Verfahren ermöglicht, dass Testverbindungen identifiziert werden, die „Analoge" des ycf24-Produktes sind.
Das kompetitive Bindungssystem kann umfassen

(i) Inkubieren des ycf24-Produktes mit einer Testverbindung und einer markierten Referenzverbindung, die bekannterweise das Produkt bindet;
(ii) Bestimmen der Menge der markierten Referenzverbindung, die an das Produkt gebunden ist; und
(iii) Vergleichen der in Schritt (II) bestimmten Menge der gebundenen, markierten Referenzverbindung mit der Menge der Verbindung, die in Abwesenheit der Testverbindung an das Produkt bindet;

Die Menge der an das ycf24-Produkt gebundenen, markierten Referenzverbindung kann direkt oder indirekt gemessen werden. Eine direkte Messung kann durchgeführt werden, indem die Testmischung, welche die ungebundene, markierte Testverbindung enthält, entfernt und die Menge an Marker, die in der Proteinfraktion enthalten ist, gemessen wird. Alternativ könnte die Menge der an das Produkt gebundenen, markierten Referenzverbindung indirekt bestimmt werden, indem die Menge an Marker, die in der Testlösung nach Entfernen der Produktfraktion verbleibt, gemessen wird, welche zur Menge, die an das Produkt gebunden ist, in umgekehrtem Verhältnis stehen wird.
In einem kompetitiven Bindungstestsystem kann das ycf24-Produkt auf einem festen Träger immobilisiert sein oder in Lösung vorliegen. Die Verwendung von immobilisiertem Produkt hat den Vorteil, dass der Komplex aus Produkt und markierter Referenzverbindung nach Abschluss der Bindungsreaktion von der markierten Referenzverbindung, die in Lösung bleibt, getrennt werden kann, indem die Lösung einfach vom festen Träger entfernt wird. Ist das Produkt andererseits während des Tests nicht immobilisiert, sondern in Lösung, ist es im Allgemeinen erforderlich, ein Mittel zum Trennen des Komplexes aus Produkt und markierter Referenzverbindung von der nicht als Komplex vorliegenden Referenzverbindung vor dem Messen der Menge an Marker festzulegen. Eine solche Trennung könnte beispielsweise durch Ausfällen des Produktes mithilfe eines gegen das Produkt gerichteten Antikörpers erreicht werden oder indem eine unspezifische Ausfällungstechnik verwendet wird.
Geeignete Marker zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Testsystemen sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Die Referenzverbindung, die bekannterweise an das ycf24-Produkt bindet, kann ein Antikörper sein.
Ein Antikörper gegen das ycf24-Produkt kann hergestellt werden, indem in einem Wirtstier Antikörper gegen das ganze ycf24-Produkt oder ein antigenes Epitop davon (hiernach das „Immunogen") induziert werden. Verfahren der Herstellung von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern sind gut bekannt. Ein Verfahren zum Herstellen eines polyklonalen Antikörpers umfasst das Immunisieren eines geeigneten Wirtstiers, beispielsweise eines Versuchstiers, mit dem Immunogen und Isolieren von Immunglobulinen aus dem Serum. Das Tier kann daher mit dem Immunogen inokuliert werden, danach wird dem Tier Blut abgenommen und die IgG-Fraktion gereinigt. Ein Verfahren zum Herstellen eines monoklonalen Antikörpers umfasst das Immortalisieren von Zellen, die den gewünschten Antikörper herstellen. Es können Hybridomzellen hergestellt werden, indem Milzzellen aus einem inokulierten Versuchstier mit Tumorzellen fusioniert werden (Koehler and Milstein, Nature 256, 495–497, 1975).
Eine immortalisierte Zelle, die den gewünschten Antikörper herstellt, kann durch ein übliches Verfahren ausgewählt werden. Die Hybridome können in Kultur gezüchtet oder zur Bildung von Aszitesflüssigkeit intraperitoneal oder ins Blut eines allogenen Wirts oder eines immungeschwächten Wirts injiziert werden. Menschlicher Antikörper kann durch in vitro-Immunisierung von menschlichen Lymphozyten, gefolgt von Transformation der Lymphozyten mit dem Epstein-Barr-Virus hergestellt werden.
Für die Herstellung sowohl von monoklonalen als auch von polyklonalen Antikörpern ist das Versuchstier geeigneterweise eine Ziege, ein Kaninchen, eine Ratte oder eine Maus. Falls gewünscht, kann das Immunogen als ein Konjugat verabreicht werden, in dem das Immunogen beispielsweise über eine Seitenkette einer der Aminosäurereste an einen geeigneten Träger gekoppelt ist. Das Trägermolekül ist typischerweise ein physiologisch akzeptabler Träger. Der erhaltene Antikörper kann isoliert und falls gewünscht gereinigt werden.
Für das Identifizieren eines Inhibitors der ycf24-Expression kann jedes geeignete Testformat verwendet werden. Wie oben erwähnt, sieht die Erfindung ein Verfahren für das Identifizieren einer Verbindung vor, die das Wachstum eines Organismus umfassend das ycf24-Gen hemmt, wobei das Verfahren umfasst

(i) In-Berührung-Bringen einer Testverbindung mit einem Testkonstrukt umfassend einen ycf24-Promotor in funktioneller Verbindung mit einer kodierenden Sequenz, und
(ii) Bestimmen, ob die Testverbindung die von dem Promotor angetriebene Expression hemmt, wo jede solche Hemmung anzeigt, dass die Verbindung das Wachstum des Organismus hemmt.

Dieses Verfahren wird im Allgemeinen unter Bedingungen durchgeführt, welche in Abwesenheit der Testverbindung zur Expression der kodierenden Sequenz des Testkonstrukts führen. Das Testkonstrukt kann auch andere, nicht transkribierte oder nicht translatierte Regionen des ycf24-Gens umfassen. Die kodierende Sequenz kodiert typischerweise ein Protein, das in der Lage ist, als ein Reporter der Expression zu wirken. Der Test kann in einer Zelle, die die Nukleinsäure birgt, durchgeführt werden. Die Substanz kann mit jedem anderen, bekannten Promotor getestet werden, um die Möglichkeit zu untersuchen, dass die Testsubstanz ein allgemeiner Inhibitor der Genexpression ist.
Es kann jedes Reporterpolypeptid verwendet werden, beispielsweise GUS oder GFP. GUS wird getestet, indem die Hydrolyse eines geeigneten Substrates, beispielsweise 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-⎕-D-Glucuronsäure (X-Gluc) oder 4-Methylumbelliferyl-⎕-Glukuronid (MUG), gemessen wird. Die Hydrolyse von MUG ergibt ein Produkt, das fluorometrisch gemessen werden kann. GFP wird durch Messen der Fluoreszenz bei 590 nm nach Anregung bei 494 nm quantifiziert. Diese Verfahren sind Experten gut bekannt.
Alternativ kann die kodierende Sequenz die kodierende Sequenz von ycf24 selbst sein oder ein Fragment dieser Sequenz. Die Expression des ycf24-Produktes kann beispielsweise durch Northern/RNA-Blotting, Western/Antikörper-Blotting, RNA-in-situ-Hybridisierung oder Immunlokalisierung gemessen werden. Das Verfahren zum Identifizieren eines Inhibitors der Expression des ycf24-Produktes kann daher mit einer Zelle durchgeführt werden, die das ycf24-Produkt natürlicherweise birgt, oder mit einem Extrakt einer solchen Zelle.
Geeignete Kandidatensubstanzen, die Inhibitoren sein könnten und die in den oben erörterten Verfahren getestet werden können, umfassen Antikörperprodukte (beispielsweise monoklonale und polyklonale Antikörper, Einzelkettenantikörper, chimäre Antikörper und humanisierte (CDR-graftet) Antikörper), die spezifisch für das ycf24-Produkt sind. Des Weiteren können auch kombinatorische Bibliotheken, definierte chemische Einheiten, Peptide und Peptidmimetika, Oligonukleotide und Bibliotheken von Naturprodukten, beispielsweise Display-Bibliotheken (z. B. Phagendisplay-Bibliotheken) getestet werden. Die Kandidatensubstanzen können chemische Verbindungen sein. Chargen der Kandidatensubstanzen können in einer Ausgangsuntersuchung von beispielsweise zehn Substanzen pro Reaktion verwendet und die Substanzen der Chargen, die eine Inhibition zeigen, einzeln getestet werden.
Antisenseinhibitoren
Wie oben erwähnt, kann die Expression von ycf24 in einer Zelle reduziert werden, indem in dieser Zelle eine Verbindung vorhanden ist, die an die ycf24-RNA binden kann. Ein Polynukleotid, das in der Lage ist, an ycf24-RNA zu binden, kann daher einen geeigneten Inhibitor der ycf24-Expression darstellen.
Das Polynukleotid kann Antisense zu der ycf24-RNA sein. Solch ein Polynukleotid kann in der Lage sein, mit der ycf24-RNA zu hybridisieren und kann daher die Expression des ycf24-Produktes hemmen, indem es mit einem oder mehreren Aspekten des ycf24-RNA-Metabolismus, einschließlich Prozessierung, Translation und Stoffwechselumsatz, in Wechselwirkung tritt.
Das Antisense-Polynukleotid kann RNA sein. Diese kann mit der ycf24-RNA hybridisieren, um einen RNA-RNA-Duplex zu bilden, der eine direkte Hemmung der Translation und/oder die Destabilisierung der Zielbotschaft verursacht, beispielsweise eine Anfälligkeit gegenüber Nukleasen auslöst.
Solch ein Polynukleotid kann mit der gesamten oder einem Teil der ycf24-RNA hybridisieren. Typischerweise hybridisiert das Antisense-Polynukleotid mit der Ribosomenbindungsregion oder der kodierenden Region der ycf24-RNA. Das Polynukleotid kann zur gesamten oder einem Teil der ycf24-RNA komplementär sein. Beispielsweise kann das Polynukleotid das exakte Gegenstück der gesamten oder eines Teils der ycf24-RNA sein. Eine absolute Komplementarität ist allerdings nicht erforderlich und Polynukleotide, die eine ausreichende Komplementarität besitzen, um einen Duplex zu bilden und unter physiologischen Bedingungen eine Schmelztemperatur von über 20°C, 30°C oder 40°C haben, sind für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung besonders geeignet. Das Polynukleotid kann ein Polynukleotid sein, das mit der ycf24-RNA unter Bedingungen eines Mediums mit hoher Stringenz hybridisiert, beispielsweise 0,03 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei 50 bis 60 Grad Celsius.
Es ist bevorzugt, dass das Polynukleotid an die gesamte oder an einen Bereich der ycf24-RNA hybridisiert, welcher der kodierenden Sequenz definiert durch Nukleotide 26 bis 1435 von SEQ ID Nr. 1 entspricht. Das Polynukleotid kann an die gesamte oder an einen Teil der 5'-3'-untranslatierten Region der mRNA hybridisieren. Das Polynukleotid hat typischerweise eine Länge von 6 bis 40 Nukleotiden. Vorzugsweise hat es eine Länge von 12 bis 20 Nukleotiden. Die Polynukleotide können eine Länge von mindestens 40, beispielsweise mindestens 60 oder mindestens 80 Nukleotiden und bis zu 100, 200, 300, 400, 500, 600 oder 700 Nukleotiden haben und sogar nur einige wenige Nukleotide haben, wie beispielsweise fünf oder zehn Nukleotide, und damit kürzer als SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 sein.
Wenn das Polynukleotid eine Antisense-RNA ist, kann es in einer Zelle von einem rekombinanten, replizierbaren Vektor exprimiert werden. Solch ein replizierbarer Vektor umfasst ein Polynukleotid, aus dem, wenn es transkribiert wird, Antisense-RNA hervorgeht.
Das Antisense-Polynukleotid kann daher vorgesehen werden, indem ein solcher Vektor in eine Zelle verbracht wird und eine Transkription des Vektors erfolgen kann. Es versteht sich auch, dass ein solcher Vektor ein Inhibitor der ycf24-Expression in dieser Spezifizierung ist. Auf dem Vektor ist das Polynukleotid, aus dem die Antisense-RNA hervorgeht, im Allgemeinen funktionell mit einer Kontrollsequenz verknüpft, die in der Lage ist, die Transkription des Polynukleotids, aus dem die Antisense-RNA hervorgeht, zu ermöglichen. Der Begriff „funktionell verknüpft" bezieht sich auf eine gegenüberliegende Position, wobei die beschriebenen Komponenten in einer Beziehung zueinander sind, die es ihnen erlaubt, in ihrer vorgesehenen Weise zu funktionieren. Eine Kontrollsequenz, die „funktionell verknüpft" ist mit einer Sequenz, aus der eine Antisense-RNA hervorgeht, ist so ligiert, dass die Transkription der Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die kompatibel mit der Kontrollsequenz sind.
Der Vektor kann beispielsweise ein Plasmid oder Virusvektor sein, der mit einem Replikationsausgangspunkt (Origin of Replication), optional mit einem Promotor, damit die Transkription stattfinden kann, und optional mit einem Regulator des Promotors, ausgestattet ist. Der Vektor kann ein selektierbares Markergen oder mehrere selektierbare Markergene umfassen, beispielsweise ein Gen für Ampicillinresistenz im Falle eines bakteriellen Plasmids oder ein Gen für Neomycinresistenz bei einem Säugetiervektor. Vektoren können in vitro verwendet werden, beispielsweise für die Produktion von Antisense-RNA, oder verwendet werden, um eine Wirtszelle zu transfizieren oder zu transformieren.
Der Begriff „Wirtszelle" bezieht sich entweder auf den Organismus, dessen Wachstum gehemmt werden soll, oder eine menschliche oder tierische Zelle, die durch den Organismus infiziert werden kann. Die Wirtszelle kann daher eine infizierte Zelle sein. Der Vektor kann auch angepasst werden, um in vivo verwendet zu werden, beispielsweise in einem Verfahren der Gentherapie.
Promotoren/Enhancer und andere Regulationssignale der Expression können so ausgewählt sein, dass sie mit der Wirtszelle, für die der Expressionsvektor konzipiert ist, kompatibel sind. Beispielsweise können Säugetierpromotoren, beispielsweise ⎕-Aktin-Promotoren, verwendet werden. Gewebespezifische Promotoren, besonders Promotoren, die spezifisch sind für neuronale Zellen (beispielsweise der Promotor der Tyrosinhydroxylase (TH), L7 oder der neuronenspezifischen Enolase), sind besonders bevorzugt. Es können auch virale Promotoren verwendet werden, beispielsweise der Promotor des Long Terminal Repeat des Mausleukämievirus MMLV LTR), der Rous-Sarkom-Virus (RSV)-LRT-Promotor, der SV40-Promotor, der IE-Promotor des menschlichen Zytomegalie-Virus (ZMV), Promotoren von Herpes simplex-Virus oder Adenoviruspromotoren. Alle diese Promotoren sind im Stand der Technik unmittelbar verfügbar. Bevorzugte Promotoren können gewebespezifische Promotoren, wie beispielsweise der Promotor des Caseingens, sein.
Der Vektor kann des Weiteren Sequenzen enthalten, die das Polynukleotid, aus dem die Antisense-RNA hervorgeht, flankieren, was Sequenzen, die zu eukaryontischen, genomischen Sequenzen, vorzugsweise genomischen Sequenzen von Säugetieren, homolog sind, oder virale, genomische Sequenzen umfasst. Dies erlaubt die Einführung der Polynukleotide der Erfindung in das Genom von eukaryontischen Zellen oder Viren durch homologe Rekombination. Insbesondere kann ein Plasmidvektor, bei dem die Expressionskassette von viralen Sequenzen, beispielsweise HSV1- oder HSV2-Sequenzen, flankiert ist, verwendet werden, um einen viralen Vektor, beispielsweise einen HSV-Vektor, herzustellen, der für den Transport der Polynukleotide der Erfindung in eine Säugetierzelle geeignet ist. Andere Beispiele geeigneter viraler Vektoren umfassen Retroviren, einschließlich Lentiviren, Adenoviren und adenoassoziierte Viren. Gentransfertechniken unter Verwendung dieser Viren sind Fachleuten gut bekannt. Retrovirusvektoren können beispielsweise verwendet werden, um das Polynukleotid, aus dem die Antisense-RNA hervorgeht, stabil in das Wirtsgenom zu integrieren.
Replikationsdefekte Adenovirusvektoren bleiben dagegen episomal und erlauben daher eine vorübergehende Expression.
Antisense-Polynukleotide können chemisch modifiziert werden. Dies kann ihre Widerstandsfähigkeit gegenüber Nukleasen erhöhen und ihre Fähigkeit, in Zellen zu gelangen, verstärken. Es können beispielsweise Phosphothioat-Oligonukleotide verwendet werden. Andere Desoxynukleotidanaloga umfassen Methylphosphonate, Phorphoamidate, Phosphodithioate, N3'P5'-Phosphoamidate und Oligoribonukleotidphosphothioate und ihre 2'-O-Alkyl-Analoga und 2'-O-Methylribonukleotid-Methylphosphonate.
Alternativ können Oligonukleotide mit gemischtem Gerüst (MBOs) verwendet werden. MBOs enthalten Abschnitte von Phosphothioat-Oligodesoxynukleotiden und geeignet platzierte Abschnitte von modifizierten Oligodesoxy- oder Oligoribonukleotiden. MBOs haben Abschnitte mit Phosphothioat-Bindungen und andere Abschnitte mit anderen modifizierten Oligonukleotiden wie beispielsweise Methylphosphonat, welches nicht-ionisch und sehr widerstandsfähig gegenüber Nukleasen ist, oder 2'-O-Alkyloligoribonukleotide.
Ein Inhibitor der ycf24-Expression und/oder -Aktivität ist Einer, der eine messbare Verringerung der ycf24-Expression und/oder -Aktivität in den oben beschriebenen Verfahren bewirkt. Bevorzugte Substanzen sind die, die die ycf24-Expression und/oder -Aktivität um mindestens 10%, mindestens 20%, mindestens 30%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95% oder mindestens 99% hemmen und zwar bei einer Inhibitorkonzentration von 1 μg ml^–1, 10 μg ml^–1, 100 μg ml^–1, 500 μg ml^–1, 1 mg ml^–1, 10 mg ml^–1 oder 100 mg ml^–1. Die prozentuale Hemmung gibt die prozentuale Abnahme der Expression/Aktivität in einem Vergleich von Tests in Gegenwart oder Abwesenheit der Testsubstanz wieder. Alle Kombinationen der oben erwähnten Stufen der prozentualen Hemmung und der oben erwähnten Inhibitorkonzentrationen können verwendet werden, um einen Inhibitor der Erfindung zu definieren, wobei stärkere Hemmung bei geringeren Konzentrationen bevorzugt ist.
Der Inhibitor hemmt das Wachstum des Organismus. Im Allgemeinen reduziert der Inhibitor die Rate der Zellteilung des Organismus. Im Allgemeinen verringert der Inhibitor die Anzahl von Teilungen, die pro Zeiteinheit ablaufen, um mindestens 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, oder 100% bei einer Inhibitorkonzentration von 1 μg ml^–1, 10 μg ml^–1, 100 μg ml^–1, 500 μg ml^–1, 1 mg ml^–1, 10 mg ml^–1 oder 100 mg ml^–1.
Handelt es sich bei dem Organismus um einen Organismus, in dem das ycf24-Gen in einer Organelle vorliegt, so verringert der Inhibitor im Allgemeinen die Teilungsrate dieser Organelle. Der Inhibitor kann die Teilung der Zelle oder Organelle auch auf andere Weise unterbrechen, beispielsweise durch Verursachen einer anomalen Septierung oder fehlerhaften Segregation der DNA. Der Inhibitor kann auch die Struktur der Organismus stören, beispielsweise indem er dem Organismus ein ungleichmäßiges („ragged"-) Aussehen verleiht. Der Inhibitor kann den Tod des Organismus bewirken.
Kandidatensubstanzen, die in Tests wie den hierin beschriebenen Aktivität zeigen, können dann in dem fraglichen Organismus getestet werden. Die Inhibitoren können, müssen aber nicht, toxisch für Mensch oder Tier sein. Der Inhibitor kann somit als ein Antibiotikum verwendet werden.
Die oben beschriebenen Antikörper oder Antisenseinhibitoren können für die Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln von Infektionen durch einen Organismus und insbesondere Malaria verwendet werden. Der Zustand eines Patienten, der an einer Infektion leidet, kann daher durch Verabreichung eines solchen Antikörpers oder Inhibitors verbessert werden. Einem menschlichen Patienten, der dies benötigt, kann eine therapeutisch effektive Menge eines solchen Antikörpers oder Inhibitors gegeben werden.
Die Formulierung eines Antikörpers oder Antisense-Inhibitors für die Verwendung für das Verhindern oder Behandeln einer Infektion durch einen Organismus hängt von Faktoren ab, wie beispielsweise ob eine pharmazeutische oder veterinärmedizinische Anwendung beabsichtigt ist. Um einem Patienten verabreicht werden zu können, wird der Antikörper oder der Antisense-Inhibitor in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereit gestellt, die den Antikörper bzw. den Inhibitor und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel enthält. Geeignete Träger und Verdünnungsmittel umfassen isotone Salzlösungen, beispielsweise phosphatgepufferte Salzlösung. Typische orale Dosierungszusammensetzungen umfassen Tabletten, Kapseln, flüssige Lösungen und flüssige Suspensionen. Es kann beispielsweise für die parenterale, intravenöse, intramuskuläre, subkutane, transdermale oder orale Verabreichung formuliert sein.
Die Dosis von Antikörper oder Antisense-Inhibitor kann entsprechend unterschiedlichen Parametern bestimmt werden, besonders entsprechend dem verwendeten Antikörper oder Inhibitor; dem Alter, dem Körpergewicht und dem Zustand des zu behandelnden Patienten; dem Verabreichungsweg und dem erforderlichen Behandlungsschema. Ein Arzt kann den erforderlichen Verabreichungsweg und die Dosis für jeden bestimmten Patienten festlegen.
Der Antikörper oder Antisense-Inhibitor kann entweder zur Behandlung einer vorhandenen Infektion durch den Organismus verwendet werden, oder dazu, das Auftreten einer solchen Infektion von vornherein zu verhindern.
Vektoren, aus denen Antisense-RNA der Erfindung hervorgeht, können direkt als nacktes Nukleinsäurekonstrukt verabreicht werden. Die Aufnahme nackter Nukleinsäurekonstrukte durch Säugetierzellen wird durch mehrere bekannte Transfektionstechniken verstärkt, beispielsweise durch die, welche die Verwendung von Transfektionsmitteln umfassen. Beispiele dieser Mittel umfassen kationische Mittel (beispielsweise Kalziumphosphat und DEAE-Dextran) und Mittel zur Lipofektion (beispielsweise Lipofectam^TM und Transfectam^TM). Diese Mittel können auch die Aufnahme der Konstrukte durch den Organismus verstärken.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann formuliert sein, um den Transport des Antikörpers bzw. des Antisense-Inhibitors in den Organismus, dessen Wachstum gehemmt werden soll, zu unterstützen. Sie kann insbesondere formuliert sein, um den Antikörper bzw. den Inhibitor in den infizierten Zelltyp oder in das Kompartiment der menschlichen oder tierischen Zelle, die von dem Organismus infiziert sind, zu transportieren. Sie kann formuliert sein, um den Antikörper bzw. den Inhibitor in die Organelle in dem Organismus zu transportieren, in der das ycf24-Produkt bzw. die ycf24-RNA vorhanden sind.
Wenn die pharmazeutische Zusammensetzung einen viralen Vektor für die Gentherapie umfasst, kann sie so verabreicht werden, dass der Vektor in einem geeigneten Bereich in Zellen eingebaut wird. Die Menge an verabreichtem Virus liegt bei Herpesvirusvektoren im Bereich zwischen 10⁴ und 10⁸ pfu, vorzugsweise zwischen 10⁵ und 10⁷ pfu, besonders bevorzugt bei etwa 10⁶ pfu und bei Adenovirusvektoren im Bereich zwischen 10⁶ und 10¹⁰ pfu, vorzugsweise zwischen 10⁷ und 10⁹ pfu, besonders bevorzugt bei etwa 10⁸ pfu. Bei einer Injektion werden typischerweise 1–2 ml Virus in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht. Wenn das Polynukleotid als eine nackte Nukleinsäure verabreicht wird, liegt die Menge der verabreichten Nukleinsäure typischerweise im Bereich zwischen 1 μg und 10 mg.
Wo das Polynukleotid, aus dem die Antisense-RNA hervorgeht, unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht, muss die Genexpression unter Umständen nur für die Dauer der Behandlung induziert werden. Ist der Zustand einmal behandelt, wird der Induzierer entfernt und die Expression des Polypeptids der Erfindung hört auf. Dies hat eindeutig klinische Vorteile. Ein solches System kann beispielsweise das Verabreichen des Antibiotikums Tetracyclin beinhalten, um die Genexpression über seine Wirkung auf das tet-Repressor/VP16-Fusionsprotein zu aktivieren.
Die Verwendung von gewebespezifischen Promotoren hilft bei der Behandlung einer Erkrankung mithilfe der Vektoren der Erfindung. Es ist vorteilhaft, in der Lage zu sein, Inhibitoren von ycf24 nur in den relevanten, betroffenen Zellarten zu exprimieren, besonders, wenn solche Inhibitoren toxisch sind, wenn sie in anderen Zellarten exprimiert werden.
Wenn der Inhibitor verwendet wird, um das Wachstum eines Organismus ex vivo zu hemmen, kann der Organismus ein Pathogen von Menschen oder Tieren sein oder nicht. Der Inhibitor kann verwendet werden, um Land, Wasser oder Nahrungsmittel zu behandeln, die den Organismus enthalten.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung:
Beispiel 1
Gendeletion von ycf24, Transformation und Selektion Ein zentraler Abschnitt des Wildtypgens (slr0074) von Synechocystis sp., Stamm pCC6803 (gekennzeichnet durch zwei HindIII-Schnittstellen mit einem Abstand von –1,0 kb) wurde mithilfe von zwei Oligonukleotidprimern ausgehend von der bekannten Sequenz aus genomischer DNA durch PCR amplifiziert (Zugangs-Nr. S76598): 5' CTC CGC CCC TAA GCA AAG TAA GAA A und 5' TGA TCC TCG CCA ATT TTG GAA GTG GA. Das amplifizierte Fragment wurde mit HindIII restringiert und in pUC9 kloniert, um pUC9/slr zu erhalten. Die Sequenz beider Enden des Inserts wurde in Rekombinanten bestätigt, die in Epicurian SURE-Zellen gezüchtet wurden. Um das Gen zu unterbrechen, wurde ein Kanamycinresistenzgen (k^⎕), isoliert aus einem modifizieren Bluescript-Vektor (pBSHdSp1), mit dem Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen und in eine einmalig vorhandene XbaI-Stelle in dem ycf24-Insert kloniert, um pUC9/slr/k^⎕ zu erhalten. Rekombinanten in XL1-blauen MRF'-Zellen wurden mithilfe von Kanamycin ausgewählt. Die Deletion des ycf24-Inserts wurde durch Sequenzieren der Verbindungsregionen bestätigt.
Wildtyp (WT)-Zellen von Synechocystis sp., Stamm PCC 6803, wurden durch Inkubation mit Vektor DNA, die das unterbrochene ycf24-Gen trägt (1–5 μg in 10 μl Wasser), bei 30° für 4 Stunden unter Licht transfiziert. Selektion und Wachstum wurden auf BG11-Platten unter fotoautotrophen Bedingungen bei 30°C durchgeführt. Für die Dauer von 3 Tagen konnten mehrere Replikationsrunden stattfinden, bevor Rekombinanten durch Überschichten mit Kanamycin (50 μg/ml) ausgewählt wurden. Dies tötete die meisten Zellen ab, aber nach einer Verzögerung waren Transformanden zu erkennen. Danach wurden alle 10–14 Tage Transformanden ausgewählt und neu ausgestrichen, um eine Segregation mutanter Zellen zu ermöglichen. Für Wachstumsvergleiche ohne Selektion wurden die WT-Zellen zur gleichen Zeit auf BG11 ausgestrichen (ihr Wachstum wurde durch 50 μg/ml vollkommen gehemmt).
Beispiel 2
Gendeletion in E. coli
Deletion von ycf24 in E. coli wurde in ähnlicher Weise durchgeführt, allerdings erfolgte die Deletion in diesem Fall mit dem aadA-Gen für Streptomycinresistenz (S^⌈). ycf24 aus E. coli wurde mithilfe von Primern auf der Basis der Zugangs-Nr. D90811 mit hinzugefügten terminalen Restriktionsschnittstellen amplifiziert: 5' GAG CTC GGA ATT CGC ATG TGG CTG TGG CTG TGG CGA AAG und 3' GAG CTC GGG ATC CTT ATC CGA CGC TGT GTT CAA G. Das aadA-Gen von E. coli wurde an einer Bsg1-Restriktionsschnittstelle in der Nähe der Mitte von ycf24 eingeführt und in den Bluescript-Vektor pBSKS⁺ kloniert. Das Konstrukt wurde für die Transformation und die Möglichkeit der homologen Rekombination in E. coli LE392-Zellen linearisiert. Das linearisierte, rekombinante Plasmid pBSKS⁺/ycf24/S^⌈ wurde durch Hitzeschock in E. coli transformiert, aber es wurden in den primären Kolonien mit normaler Größe keine Rekombinanten gefunden; es wurden einige Antibiotikum-resistente Kolonien gewonnen, die zirkuläre Episome trugen, die wahrscheinlich aus der Neuligation des Konstruktes hervorgegangen waren. Nach einer 2-tägigen Inkubation bei 37°C wurden kleine Kolonien beobachtet. Zellen aus diesen Kolonien erwiesen sich als gestreckt (wenigstens dreimal länger als die Wirtszellen), überlebten allerdings nur über wenige Generationen. PCR mit diesen Kolonien, um zu bestimmen, ob ein „Knock-out" erfolgt war, blieb erfolglos.
Beispiel 3
Charakterisierung der Synechocystis-Transformanden
WT-Synechocystis und Transfektanden, die eine von einem Kanamycinresistenzgen (S^⌈) unterbrochene, homologe Form von ycf24 trugen, wurden auf BG11-Agar ausgestrichen. Die WT-Zellen bildeten innerhalb von 4 Tagen Kolonien, die mit bloßem Auge erkennbar waren, wohingegen es 2 Wochen dauerte, bis unter Selektion mit Kanamycin (50 μg ml^–1) Transformanden erschienen. Kolonien von Transformanden waren klein und im Umriss ungleichmäßig („ragged") gegenüber den größeren WT-Kolonien mit glattem Umriss (1a). Aus klonierten Transformanden extrahierte DNA wurde in Southern Blots mit WT-ycf24 hybridisiert und erwies sich als heteroplastisch, wobei die Kopienzahl der deletierten Form und der WT-Form von ycf24 etwa so war, wie sie aus der Intensität der Hybridisierungssignale beurteilt wurde (2). Eine Relaxierung der Kanamycinselektion von heteroplasmischen Transformanden resultierte in stark wachsenden Kolonien mit glattem Umriss – „Revertanden"-, was bestätigt, dass der heteroplasmische Zustand wachstumsbegrenzend war. Diese Beobachtungen wurden durch zusätzliche Transformationen bestätigt, einschließlich eine, bei der Deletion mit einem Spectinomycinresistenzgen anstatt mit Kanamycin erfolgte. Es wurden niemals Transformanden erhalten, die hinsichtlich der deletierten Form von ycf24 homoplasmisch waren, selbst nach einer verlängerten Selektion mit Kanamycin bei 50 oder 100 μg ml^–1 nicht, und Homoplasmie gilt als letal.
Aus längerfristiger Selektion von ungleichmäßig geformten („ragged"-) Transformanden mit Kanamycin entstanden auch schnell wachsende Kolonien mit glatten Konturen. Hybridisierung auf Southern Blots zeigte allerdings, dass diese in Bezug auf das deletierte Gen heteroplasmisch waren und wir nennen diese Zellen „glatte" Suppressoren. DNA aus klonierten, „glatten" Suppressoren wurde verwendet, um sowohl WT-Zellen aus auch heteroplasmische Zellen mit ungleichmäßigem („ragged") Aussehen zu transformieren. In beiden Fällen ergab die Selektion mit Kanamycin meistens Kolonien mit ungleichmäßigem („ragged") Aussehen, aber es wurde im Gegensatz zu den ursprünglichen Transfektionen auch eine kleine Anzahl (< 1%) glatter, schnell wachsender Kolonien gefunden.
Die Zellen wurden durch Elektronenmikroskopie untersucht. Pelletierte Zellen wurden in 0,5% neutralem Glutaraldehyd in 100 mM Cacodylatpuffer, pH 7,0, 30 Minuten lang bei Raumtemperatur vorfixiert. Nach vorsichtiger Zentrifugation wurden die pelletierten Zellen in 2–3% Glutaraldehydpuffer fixiert und es wurden mithilfe von Standardverfahren Dünnschnitte angefertigt. Für die Rasterelektronenmikroskopie (REM) wurden die Zellen auf mit Poly-L-Lysin (100 μg ml^–1) beschichteten Glasobjektträgern ausgestrichen und in 2 Glutaraldehyd fixiert. Nach der Fixierung wurden in Proben in Ethanol gewaschen und durch Immersion in Hexamethyldisilazan rehydriert. Nach Trocknung über Nacht wurden die Proben mit 20 nm Gold übersprüht (für Probenleitfähigkeit) und durch REM untersucht.
Die Elektronenmikrografieschnitte (< 100 Zellen) zeigten, dass bei ~80% der Zellen aus Kolonien mit ungleichmäßigem („ragged") Aussehen die Phykobilisomen in den Thylakoidmembranen von elektronendurchlässigen Plaques umgeben waren (1c). Die Anzahl der Zellen mit Plaques fiel nach Relaxierung des Kanamycinselektrionsdrucks auf ~45% ab, was mit einer Rückkehr zur normalen Koloniemorphologie einherging. Da in ~4% der WT-Zellen ähnliche Plaques gefunden wurden, sind wir der Ansicht, dass sie „kranke" Zellen sind und keine direkten Phänotypveränderungen nach Deletion des ycf24-Gens anzeigen.
Im Gegensatz dazu zeigte die Untersuchung der groben Morphologie von Zellen aus Kolonien mit ungleichmäßigem („ragged") Aussehen im Rasterelektronenmikroskop eine signifikante Ansammlung von Zellen (~35%) in den letzten Stadien der Zellteilung (p =< 0,001), was auf einen Defekt der Zytokinese schließen lässt (Tabelle 1 und 1b). Wieder erfolgte auf Relaxierung der Kanamycinselektion hin eine Rückkehr des Anteils sich teilender Zellen in der transformierten Zellpopulation zu einem WT-ähnlichen Stadium. Es sammelte sich auch ein hoher Anteil (~60%) der „glatten" Suppressorzellen in einem späten Zytokinesestadium an, wobei gelegentlich kleine Ketten von unvollständig getrennten Zellen auftraten. Glatte Suppressoren enthielten noch immer elektronendichte Plaques und Elektronenmikrografieschnitte bestätigten, dass die Suppression die Häufigkeit fehlerhafter Septierung in teilenden Zellen erhöhte.
Tabelle 1 % Teilung
DNA wurde mit 0,01 μg ml^–1 4',6-Diaminindo-2-Phenylindol (DAPI) nach einem Protokoll angefärbt, das dem Beschriebenen¹⁵ gleicht. Nach Färbung mit DAPI waren die Nukleoide der WT-Zellen vom Aussehen her sehr einheitlich ( 1d). Die meisten WT-Zellen (~82%) befanden sich nicht im Teilungsstadium und es waren nur ein paar tote Zellen (ungefärbt) vorhanden. DAPI-Färbung von Zellen aus ungleichmäßigen („ragged") Kolonien waren viel unterschiedlicher und umfassten Zellen, die wie WT-Zellen aussahen, sowie eine große Anzahl (~50%) toter oder sterbender Zellen, die sich weniger stark anfärbten. Letztere umfassten > 50% der sich im Teilungsstadium befindenden Zellen. Obgleich in vielen dieser Zellen eine Kernsegregation stattgefunden hatte, war die Segregation der DNA in ~40% fehlerhaft (d. h. eine Tochterzelle war ohne DNA oder trug weniger DNA als es die Intensität der Anfärbung vermuten ließ); veränderte Autofluoreszenz unter UV-Licht wies darauf hin, dass es sich dabei um sterbende Zellen handelte. Auch mit DAPI angefärbte „glatte" Suppressoren waren unterschiedlich. Etwa die Hälfte der Zellen (sowohl im Teilungsstadium als auch nicht im Teilungsstadium) trug eine normale Menge DNA, gelegentlich hatten Zellen jedoch entweder keine DNA (~1% tote Zellen), hatten eine asymmetrische DNA-Segregation durchlaufen (~1%) oder hatten etwa doppelt so viel DNA (~1%) wie WT-Zellen. Die Zellen in dieser letzten Gruppe waren größer als der Rest (1d). Analyse der Größenverteilung der unterschiedlichen Populationen im Coulter Counter (Daten nicht gezeigt) bestätigte, dass sich die Anzahl der kleinen und großen Zellen sowohl in dem Isolat mit ungleichmäßigem („ragged") Aussehen als auch in dem mit glattem Aussehen im Vergleich zum WT wesentlich erhöht hatte. Die Menge an DNA pro Zelle korrespondierte im Allgemeinen mit der Zellgröße, außer bei toten Zellen.
Beispiel 4
Überexpression von ycf24 in E. coli
Der Effekt einer Überexpression von ycf24 in E. coli wurde anhand des Expressionsvektors pMAL-c2 untersucht.
Genamplifizierung wurde mit Primern ausgeführt, die so konzipiert waren, dass sie eine 5'-EcoRI-Schnittstelle und eine 3'-PstI-Schnittstelle ergaben, und das Produkt wurde in den pMAL-c2-Expressionsvektor (New England Biolabs) kloniert. Kulturen von in Terrific-Broth mit Ampicillin (50 μg ml^–1) exponential wachsenden Transfektanden wurden mit 0,3–0,5 mM IPTG induziert. Fusionsproteine exprimierende Transformanden wurden nach der Induktion bei 37°C durch Western Blotting und durch Immunfluoreszenz mithilfe eines Antikörpers gegen den Maltose-Bindungsprotein-Marker des Fusionsproteins nachgewiesen.
In diesen Transformanden war die Filamentierung ausgeprägt.
Immunfluoreszenz zeigte ein beeindruckendes „Zebra"-Muster des Fusionsproteins, das vorwiegend jeweils seitlich der Nukleoide der Bakterien vorhanden war.
Nach einer verlängerten Überexpression erschienen die Fusionsproteinbanden entlang der Länge der gestreckten Zellen an anderen Stellen, an denen keine Nukleoide vorhanden waren. Dies korrelierte mit einer fehlerhaften Trennung der Nukleoide. Wir beobachteten, dass sich die Nukleoide teilten, jedoch nicht trennten und dabei einen Klumpen bildeten, der die Zelle deformierte (siehe 3). Wir bemerkten außerdem, dass die erste Teilung des Nukleoids parallel und nicht quer zu der Länge der Zelle ablief, so dass die Nukleoide seitlich nebeneinander und nicht wie gewöhnlich der Länge nach angeordnet waren. Deletionsanalyse des ycf24-Gens zeigte, dass das durch die Anlagerung des Fusionsproteins zu Stande gekommene „Zebra"-Muster von einer Sequenz zwischen Aminosäure 81 und 161 am N-Terminus des Proteins abhängt. Analyse der Sekundärstruktur von ycf24 zeigte, dass es wahrscheinlich mehrere Domänen aufweist, von denen zwei in der hoch konservierten C-terminalen Hälfte liegen. Eine Domäne gleicht einer Serinprotease jedoch ohne die katalytische Stelle. Eine andere, am C-Terminus selbst liegende Domäne ist wie Komplementfaktor 5a gefaltet.
Untersuchung der ycf24 überexprimierenden Zellen zeigte, dass sie nur leicht erniedrigte Mengen des essenziellen Zellteilungsproteins FtsZ enthielten, sich jedoch trotzdem keine Septenringe bildeten (im Gegensatz zu einigen anderen Nukleoid-Teilungsmutanten von E. coli). Überexpression von ycf24 scheint daher die Bildung des für die Zellteilung wichtigen Septenringkomplexes zu stören.
Unsere Studien mit E. coli und Synechocystis zeigen übereinstimmend, dass das Modulieren der Menge an ycf24 die Zellteilung beeinflusst. Derzeit wird in weiteren Untersuchungen die Funktion des Proteins durch Bestimmung seiner Wechselwirkungen mit anderen Zellbestandteilen näher bestimmt. Dazu gehört eine ausführliche Analyse der für die zelluläre Lokalisierung erforderlichen Sequenz, die für eine Störung mittels eines Antisense-Ansatzes anfällig sein könnte.
Referenzen

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SEQUENZLISTE

Claims

Antikörper gegen das ycf24-Genprodukt bzw. ein Antisense-Inhibitor, der in der Lage ist, mit der ycf24-RNA zu hybridisieren, zur Verwendung bei der Behandlung einer Infektion des Körpers von Menschen oder Tieren durch einen Organismus, der das Gen umfasst.
Antikörper bzw. ein Antisense-Inhibitor nach Anspruch 1 zur Verwendung in der Behandlung von Malaria.
Verfahren zum Hemmen des Wachstums eines Organismus umfassend das ycf24-Gen, wobei das Verfahren das In-Berührung-Bringen des Organismus ex vivo mit einem Antikörper gegen das ycf24-Genprodukt bzw. einem Antisense-Inhibitor umfasst, der in der Lage ist, mit der ycf24-RNA zu hybridisieren.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die das Wachstum eines Organismus umfassend das ycf24-Gen hemmt, wobei das Verfahren umfasst (i) In-Berührung-Bringen einer Testverbindung mit dem ycf24-Genprodukt, und (ii) Bestimmen, ob die Testverbindung die Aktivität des Produktes hemmt oder an das Produkt bindet, wobei jede Bindung oder Hemmung anzeigt, dass die Verbindung das Wachstum des Organismus hemmt.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die das Wachstum eines Organismus umfassend das ycf24-Gen hemmt, wobei das Verfahren umfasst (i) In-Berührung-Bringen einer Testverbindung mit einem Testkonstrukt umfassend einen ycf24-Promotor, der funktional mit einer kodierenden Sequenz verbunden ist, und (ii) Bestimmen, ob die Testverbindung die von dem Promotor angetriebene Expression hemmt, wobei jede Hemmung anzeigt, dass die Verbindung das Wachstum des Organismus hemmt.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, in dem der Organismus ein Malariaparasit ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper gegen das ycf24-Genprodukt bzw. einen Antisense-Inhibitor, der in der Lage ist, mit der ycf24-RNA zu hybridisieren, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger bzw. ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel.
Verwendung eines Antikörpers gegen das ycf24-Genprodukt bzw. einen Antisense-Inhibitor, der in der Lage ist, mit der ycf24-RNA zu hybridisieren, zur Herstellung eines Medikaments zum Verhindern oder Behandlung einer Infektion durch einen einzelligen Organismus umfassend das ycf24-Gen bei einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 8, in dem der Organismus ein Malariaparasit ist.