DE69828876T2 - Zusammensetzung für die behandlung von erkrankungen, die mit apoptose einhergehen - Google Patents

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von Genen des programmierten Zelltods und ihre Produkte.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Einer der Faktoren, der den Proliferationszustand von Zellen bestimmt, ist das Gleichgewicht zwischen den Wachstums-fördernden Wirkungen von Protoonkogenen und den Wachstums-begrenzenden Wirkungen von Tumorsuppressorgenen.
  • Ein Mechanismus, über den diese Tumorsuppressorgene ihre Wachstums-begrenzende Wirkung ausüben, ist, in dem sie die Zelle veranlassen, eine physiologische Art des Todes zu erleiden. Ein solcher kontrollierter Zelltod ist in einer Vielzahl von physiologischen Bedingungen einschließlich Metamorphose, Synaptogenese von Neuronen, Tod von Lymphozyten während der Selektion des Rezeptorrepertoires, kontrollierter Homeostase im Knochenmark und anderen proliferativen Geweben und anderen erwiesen. Ein solcher Zelltod wird durch die Wechselwirkung der Zelle mit anderen Zellen oder mit Zellprodukten zum Beispiel durch die Aktivität von geeigneten Zytokinen reguliert.
  • Genetische Mutationen, die Suppressorgene inaktivieren, befreien die Zelle von normalen Wachstumsbegrenzungen, die durch andere Zellen oder durch Zytokine auferlegt sind, was in einem unkontrollierten Wachstum oder Lebensfähigkeit der Zellen ohne jede Beziehung zu externen Signalen resultiert. Dieses unkontrollierte Wachstum ist ein Schritt in die Tumorgenese.
  • Bisher wurden nur wenige Tumorsupressorgene vollständig charakterisiert einschließlich des Retinoblastoma (Rb)-Gens, p53, DCC, NM23 WT-1, NF-1, APC und der Ras Suppressor-Gene. Eine Mutation in jedem der oben genannten Gene, wahrscheinlich in beiden Allenen, welche entweder zur Hemmung der Expression oder der Produktion eines fehlerhaften Proteins führt, erschwert die normale Kontrolle von Wachstum und Lebensfähigkeit der Zellen und kann folglich Krebs zur Folge haben.
  • Eine Anzahl von Verbindungen zwischen programmiertem Zelltod und dem Mehrstufenprozess der Tumorgenese wurde entdeckt. Die erste Entdeckung war der Befund, dass das Bcl2-Gen, das durch die typische chromosomale Translokation in humanen Follikellymphomen aktiviert wird, ein Suppressor des Zelltods ist (Tsujimoto Y., et al., 1985, Nature 315: 340–343). Die zweite Verbindung war der Befund, dass p53, das am häufigsten mutierte Tumorsuppressorgen in verschiedenen humanen Tumoren, als ein positiver Mediator der Apoptose wirkt. p53 induziert den Zelltod als Antwort auf verschiedene Stressarten wie zum Beispiel genotoxische Schäden oder Hypoxie. Folglich gehört die Ausdehnung der Zelllebensfähigkeit als Folge der Akkumulation von genetischen Schäden oder von unkontrolliertem Zellwachstum zu den Mechanismen, durch die inaktivierende Mutationen von p53 die Tumorgenese fördern (Lowe, S. W., et al., 1993, Nature 362: 847–849). Kürzlich wurde berichtet, dass das familiäre adenomatöse Polypos-Tumorsuppressorgen (APC; Adenomatous Polyposis Coli), das häufig in frühen Phasen von kolorektalen Tumoren verloren oder inaktiviert wird, den Tod von Kolorektalzellen in Kultur induziert (Morin et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 7950–54), wodurch eine dritte Verknüpfung zur apoptotischen Kontrolle bereitgestellt wird. In einer weiteren Studie wurde von der Apoptose in Mikrometastasen gefunden, dass sie nach Induktion einer Angiogenese als Ergebnis eines Absinkens des Spiegels von zirkulierenden angiogenen Inhibitoren signifikant reduziert wird (Holmgren, L., et al., 1995, Nature Medicine 1: 149–153). Allerdings wurde in Hinblick auf früheren Metastase-Stadien wie zum Beispiel die Ablösung von dem primären Tumor, der Dissemination und von Invasionsprozessen nur wenig ausgesagt.
  • Wachstums-inhibierende Zytokine haben eine doppelte Wirkung auf die Zielzelle. Sie können entweder die Proliferation der Zelle inhibieren und/oder zum Zelltod führen. Bisher wurde gezeigt, dass die Blockierung oder Aktivierung der Expression von bekannten Tumorgenen der Inhibition des Wachstums der Zellen durch die Zytokine entgegenwirkt bzw. diese fördert (Übersichtsartikel von A. Kimchi, 1992, J. Cell Biochem., 50: 1–9), aber sie hatten keine Wirkung auf die todfördernde Wirkung der Zytokine. Beispielsweise war die Wachstums-inhibierende Antwort auf Zytokine, wie beispielsweise TGF-β durch die Inaktivierung des Rb-Gens merklich reduziert oder die Antwort auf IL-6 war durch Einführen von aktivierten p53-Genen erhöht (Pietenpol et al., 1990, Cell, 61: 777–785; Levy et al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13: 7942–7952).
  • Thioredoxin, ein kleines Wasserstoffcarrierprotein, wurde kürzlich mit dem IFN-γ-mediierten Wachstumsstopp von HeLa-Zellen in Verbindung gebracht (Deiss, L. P. und Kimchi, A. 1991, Science 234: 117–120).
  • WO 95/10630 betrifft mit dem Tod assoziierte Gene, ihre Verwendung in der Behandlung einer neoplastischen Krankheit und Verfahren zum Bestimmen der Prognose bei einer Krankheit, die mit unkontrolliertem, pathologischem Zellwachstum assoziiert ist.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In Folgendem wird der Ausdruck „programmierter Zelltod" verwendet, um einen physiologischen Typ eines Zelltods zu bezeichnen, der aus der Aktivierung einiger zellulärer Mechanismen resultiert, d.h. einen Tod, der von der Zellmaschinerie kontrolliert wird. Der programmierte Zelltod kann zum Beispiel das Ergebnis der Aktivierungen der Zellmaschinerie durch einen externen Auslöser, zum Beispiel ein Zytokin, sein, das zum Zelltod führt. Der Ausdruck „Apoptose" wird mit programmiertem Zelltod untereinander austauschbar verwendet.
  • Der Ausdruck „Tumor" in der folgenden Beschreibung beschreibt eine unkontrolliert wachsende Masse von abnormalen Zellen. Dieser Ausdruck schließt sowohl primäre Tumore, die gutartig oder bösartig sein können, wie auch sekundäre Tumore oder Metastasen ein, die an andere Stellen im Körper gestreut haben.
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf dem bahnbrechenden Befund, dass die Inhibition der Expression bestimmter Gene dem programmierten Zelltod entgegenwirkt. Und zwar wird der Zelltod induziert, solange diese Gene normal wirken; sobald die Expression dieser Gene inhibiert wird, wird der Zelltod inhibiert. Daraus folgt, dass die normalen Expressionsprodukte dieser Gene in den Zelltod, sowohl den Zytokin-induzierten als auch den nicht Zytokin-induzierten, einbezogen sind. In HeLa-Zellen induziert das Zytokin IFN-γ einen biphasischen Prozess, der eine anfängliche cytostatische Phase und eine anschließende cytotoxische Phase (programmierter Zelltod) umfasst. Von den neuen Genen, die gemäß der vorliegenden Erfindung entdeckt wurden, wurde gefunden, dass sie nur die spätere cytotoxische Phase beeinflussen. Diese Gene werden hierin als „DAP (death-associated protein; Tod-assoziiertes Protein) Gene" bezeichnet. DNA-Moleküle, die eine kodierende Sequenz umfassen, die die Expressionsprodukte der DAP-Gene oder Expressionsprodukte mit ähnlicher biologischer Aktivität kodieren, werden hierin zeitweise gemeinsam als „DAP-DNA-Moleküle" bezeichnet. Die Expressionsprodukte der DAP-DNA-Moleküle werden hierin zeitweise kollektiv als „DAP-Produkte" bezeichnet.
  • Die vorliegende Erfindung basiert weiterhin auf dem bahnbrechenden Befund, dass metastasierende Zellen einen fehlerhaften internen Apoptosemechanismus haben können. Folglich fahren die Zellen zu metastasieren fort, obwohl die Tumorzellen während der Metastase mit einigen neuen Arten von apoptotischen Stimuli in Berührung kommen.
  • Weiterhin wurde gefunden, dass durch Korrigieren des Defektes, der zu der Fehlfunktion des apoptotischen Mechanismus in der Zelle führt, der metastatische Charakter der Zelle unterdrückt wird.
  • Die vorliegende Anmeldung offenbart, dass sie nachstehend als „den Zelltod fördernden Aspekt" bezeichnet wird; die obigen DAP-DNA-Moleküle, Expressionsvektoren umfassend diese oder DAP-Produkte werden zur Förderung des Tods von normalen Zellen oder Tumorzellen und zur Unterdrückung der metastatischen Aktivität von Tumorzellen verwendet. Eine besondere Anwendung des Tod-fördernden Aspekts liegt in der Therapie von Krankheiten oder Störungen, die mit unkontrolliertem pathologischem Zellwachstum, z.B. Krebs (primäre Tumore und Metastasen), Psoriasis, Autoimmunkrankheiten oder anderen assoziiert sind. Die Verwendung von DAP-DNA-Molekülen in der Gentherapie oder DAP-Produkten, wenn sie extrazellulär hergestellt werden, gemäß dem offenbarten Tod-fördernden Aspekt, kann in Verbindung mit Zytokinen, z.B. IFN-γ, in der Behandlung von Zytokin-induziertem programmiertem Zelltod erfolgen.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Offenbarung, der hierin als „der Tod-verhindernde Aspekt" bezeichnet wird, werden Mittel, die die Expression dieser DAP-DNA-Moleküle verhindern, oder Mittel, die DAP-Produkte antagonisieren, inhibieren oder neutralisieren, zum Schutz von Zellen vor programmiertem Zelltod verwendet. Beispiele von möglichen Anwendungen des Tod-verhindernden Aspekts der Erfindung sind in der Verhinderung des Zelltods in verschiedenen degenerativen neurologischen Krankheiten wie zum Beispiel Alzheimer oder Parkinson, die mit vorzeitigem Tod von bestimmten Untergruppen von Neuronen assoziiert sind; in der Verhinderung des Tods von T-Zellen bei AIDS-Patienten, deren Tod dem programmierten Zelltod ähnelt; in der Verhinderung von abstoßungsassoziiertem Zelltod bei Transplantaten, von dem angenommen wird, dass er zumindest zum Teil aus programmiertem Zelltod resultiert; in dem Schutz von normalen Zellen vor cytotoxischen Wirkungen bestimmter Antikrebstherapien; etc..
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Offenbarung, der hierin zeitweise als „der prognostische Aspekt" bezeichnet wird, werden DAP-DNA-Moleküle verwendet, um Individuen zu untersuchen, die an einer Krankheit leiden, um zu bestimmen, ob die Krankheit mit einer fehlerhaften Aktivität der DAP-Gene verbunden ist und welche therapeutischen Modalitäten wirksam sein könnten. Zum Beispiel können DAP-positive Zellen empfänglicher gegenüber der Kontrolle durch chemotherapeutische Wirkstoffe sein, die über die Induktion der Apoptose arbeiten, so dass die Wahl der Behandlungsmodalitäten auf Basis des DAP-Zustands der Zellen getroffen werden können.
  • Gemäß diesem Aspekt wird die Untersuchung durch Vergleichen der Sequenz jedes der DAP-DNA-Moleküle mit jedem der entsprechenden DAP-Gene in dem Individuum oder durch Verfolgen der RNA- und/oder Proteinexpression durchgeführt.
  • Zum Beispiel kann das Vorhandensein und/oder die Zusammensetzung der DAP-DNA-Moleküle durch Southern-Blotanalyse und/oder PCR beurteilt werden. Die mRNA kann durch Northern-Blots und/oder durch reverse Transkription-PCR (RT-PCR) gefolgt von Sequenzanalysen und/oder durch In-situ-Hybridisierungen von Gewebeschnitten analysiert werden. Die Proteinexpression kann in Zellextrakten durch Westernanalyse oder durch In-situ-Immunfärben von Gewebeschnitten unter Verwendung von Antikörpern gegen DAP-Proteine beobachtet werden. Die Abwesenheit eines DAP-Gens, eine partielle Deletion oder jeder andere Unterschied in der Sequenz, der eine Mutation in einer wesentlichen Region anzeigt oder der Mangel an DAP-RNA und/oder -Protein, der in einem Verlust an Funktion resultiert, kann zu einer Prädisposition für Krebs und/oder Metastasenbildung führen. Vorzugsweise wird eine Batterie von verschiedenen DAP-Genen wie auch verschiedene Antikörper verwendet.
  • Die DAP-Gene scheinen eine wichtige Rolle beim programmierten Zelltod zu spielen und die Inhibition ihrer Expression oder Neutralisierung ihrer Expressionsprodukte schützt die Zelle vor Zytokin-geförderten Zelltod. Beispiele solcher Gene sind jene, deren Sequenzen in den 6, 8, 12, 15 und 16 dargestellt sind, oder jene, deren Teilsequenzen in 13 dargestellt sind. Das Gen für die bekannte Protease Cathepsin D, deren Sequenz in 14 dargestellt ist, ist hierin zum ersten Mal als ein DAP-Gen wirkend gezeigt.
  • DAP-DNA-Moleküle, die in dem Tod-fördernden Aspekt der Erfindung verwendbar sind, können die Nukleinsäuresequenzen der DAP-Gene oder anderer Sequenzen, die ein Produkt mit einer zu der des DAP-Produkts ähnlichen biologischen Aktivität kodieren, haben. Solche DAP-Moleküle schließen DAP-Moleküle mit einer Sequenz ein, die anders als die des DAP-Gens ist, aber die aufgrund der Degeneration des genetischen Kodes das gleiche Protein oder Polypeptid wie das von dem DAP-Gen kodierte kodiert.
  • Es ist gut bekannt, dass es manchmal möglich ist, ein Protein durch Ersetzen oder Deletieren bestimmter Aminosäuren, die nicht essentiell für eine bestimmte biologische Funktion sind, oder durch Addition von Aminosäuren in Regionen, die für die biologische Funktion des Proteins nicht essentiell sind, zu modifizieren, ohne dass solch eine Modifikation die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen beeinflusst. Daher kann ein DAP-DNA-Molekül, das in dem Tod-fördernden Aspekt der Erfindung verwendbar ist, auch eine modifizierte Sequenz besitzen, die ein modifiziertes Protein kodiert. Die modifizierte Sequenz hat eine Sequenz, die von dem DAP-Gen oder von der obigen degenerierte Sequenz abgeleitet ist, in welcher eine oder mehrere Nukleinsäure-Tripletts (in dem offenen Leserahmen der Sequenz) addiert, deletiert oder substituiert wurden, wobei das kodierte Proteinprodukt hierdurch die wesentlichen biologischen Eigenschaften des DAP-Produkts beibehält. Darüber hinaus ist bekannt, dass manchmal Fragmente von Proteinen die wesentlichen biologischen Eigenschaften des Vorgängers, dem unfragmentierten Protein, beibehalten und folglich kann ein DAP-DNA-Molekül, das in dem Tod-fördernden Aspekt der Erfindung verwendbar ist, auch eine Sequenz solcher Fragmente kodieren.
  • Zum Beispiel lässt die abgeleitete Aminosäurestruktur von DAP-2 (DAP-Kinase) vermuten, dass dieses Enzym eine Kinase vom Serin/Threonintyp ist. Von ihrer Kinasedomäne wurde gefunden, dass sie aus 11 Unterdomänen, die typisch für Serin/Threoninkinasen sind, zusammengesetzt ist und auf diese Domäne folgt eine Region, die signifikante Homologie mit den Calmodulin-regulatorischen Domänen anderer Kinasen teilt. Benachbart zu der letztgenannten wurden acht Ankyrin-Repeats, gefolgt von zwei P-Loop-Motiven gefunden. Weiterhin wurde ein typisches Toddomänemodul am 3' Ende des Proteins identifiziert, gefolgt von einem Aminosäureabschnitt, der reich an Serinen und Threoninen ist (Feinstein, et al., 1995, Trends Biochem. Sci. 20: 342–44). Der Fachmann wird wissen, wie aktive modifizierte Proteinmoleküle und Fragmente auf Basis einer solchen Information und der Beschreibung weiter unten herzustellen sind.
  • Ein DNA-Molekül, das in dem Tod-verhinderten Aspekt verwendbar ist und in der Anmeldung offenbart ist, kann eine Sequenz haben, die eine Antisensesequenz gegen die des DAP-Gens oder eine Antisensesequenz gegen einen Teil des DAP-Gens ist, die ausreichend viel blockiert, um die Expression des DAP-Gens zu inhibieren. Der Teil des Gens kann entweder der kodierende oder der nicht-kodierende Teil des DAP-Gens sein. Die mRNA-Transkripte der Antisensesequenz hybridisieren mit den mRNA-Transkripten des DAP-Gens und stören die endgültige Proteinexpression.
  • Nicht-begrenzende Beispiele von cDNA-Klonen, die spezifische Antisensesequenzen enthalten, sind unten in Tabelle 1 angegeben. Bevorzugte Antisensesequenzen sind jene Sequenzen, die bei Position 1000 beginnen und bei Position 1320 des DAP-1-Gens in 6 enden, von 3781–4148 des DAP-2-Gens in 8, von 108–360 des DAP-3-Gens in 12 und von 1203–1573 des Cathepsin D-Gens in 14.
  • Ein weiteres DNA-Molekül, das in dem Tod-verhindernden Aspekt verwendbar ist und das hierin offenbart ist, ist ein DNA-Molekül, das für ein modifiziertes DAP-Produkt kodiert, das in der Lage ist, die Aktivitäten des unmodifizierten DAP-Produkts in einer dominant negativen Weise zu inhibieren, wie zum Beispiel eine katalytisch inaktive Kinase (DAP-Kinase) oder jedes andere modifizierte Protein, dessen Anwesenheit in der Zelle die normale Aktivität des nativen Proteins stört, zum Beispiel durch Produzieren von fehlerhaften Heterodimeren, die modifizierte und unmodifizierte Proteine umfassen und die inaktiv sind, und ähnliche. Zum Beispiel wurde von einer katalytisch inaktiven DAP-Kinasemutante, die eine Lysin zu Alaninsubstitution in der Kinasedomäne (K42A) trägt, gefunden, dass sie nicht cytotoxisch ist und Zellen vor IFN-γ-induziertem Zelltod schützt.
  • DNA-Moleküle, die in dem Screeningaspekt der Erfindung verwendbar sind, umfassen die Sequenz eines DAP-Gens oder eine Sequenz oder ein Fragment hiervon oder spezifische Antikörper.
  • In einem ersten Aspekt beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Expressionsvektors umfassend eine DNA-Sequenz, die in der Lage ist, den programmierten Zelltod herbeizuführen, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit oder einer Störung, die mit metastasierendem pathologischem Zelltod verbunden ist, wobei die DNA-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
    • (a) einer DNA-Sequenz, die in Zellen exprimiert wird und deren Expressionsprodukt in den programmierten Zelltod einbezogen ist;
    • (b) einer DNA-Sequenz, die anders ist als die in (a) definierte DNA und die das gleiche Expressionsprodukt kodiert, das von der in (a) definierten DNA-Sequenz kodiert wird;
    • (c) eine modifizierte DNA-Sequenz von (a) oder (b), in der ein oder mehrere Nukleinsäure-Tripletts addiert, deletiert oder substituiert wurden, wobei das Protein oder Polypeptid, das von der modifizierten DNA-Sequenz kodiert wird, den programmierten Zelltod in ähnlicher Weise vermittelt, wie das Protein oder Polypeptid, das von dem in (a) oder (b) definierten Gen kodiert wird; und
    • (d) Fragmente jeder der DNA-Sequenzen von (a), (b) oder (c), die ein Protein oder ein Polypeptid mit dieser biologischen Aktivität kodieren.
  • Der Ausdruck „biologische Aktivität", wie er in dieser Beschreibung in Hinblick auf modifizierte DNA- oder Polypeptid-Moleküle verwendet wird, bezieht sich auf die Aktivität von unmodifizierten Molekülen in Hinblick auf Tod-fördernde, Tod-verhinderte und Screeningaspekte der Erfindung, wie sie oben definiert sind.
  • Insbesondere offenbart die vorliegende Erfindung eine wie oben beschriebene Verwendung, wobei diese DNA-Sequenz eine Nukleinsäuresequenz ist, die in Zellen exprimiert wird und deren Expressionsprodukt in dem programmierten Zelltod einbezogen ist, wobei sie eine der folgenden ist:
    • (i) eine DNA-Sequenz umfassend eine kodierende Sequenz, die bei dem Nukleinsäure-Triplett an Position 160–162 beginnt und an dem Triplett 466–468 der in 6 (SEQ ID NR. 1) dargestellten Sequenz endet;
    • (ii) eine DNA-Sequenz umfassend eine kodierende Sequenz, die bei dem Nukleinsäure-Triplett an Position 287–289 beginnt und an dem Triplett bei Position 816–818 der in 6 (SEQ ID NR. 2) dargestellten Sequenz endet;
    • (iii) eine DNA-Sequenz umfassend eine kodierende Sequenz, die bei dem Nukleinsäure-Triplett an Position 337–339 beginnt und an dem Triplett bei Position 4603–4605 der in 8 (SEQ ID NR. 3) dargestellten Sequenz endet;
    • (iv) eine DNA-Sequenz umfassend eine kodierende Sequenz, die bei dem Nukleinsäure-Triplett an Position 74–76 beginnt und an der Position 1268–1270 der in 12 (SEQ ID NR. 4) dargestellten Sequenz endet;
    • (v) eine DNA-Sequenz umfassend eine Sequenz, die in 13 (SEQ ID NR. 5) dargestellt ist;
    • (vi) eine Sequenz von Cathepsin, die in 14 (SEQ ID NR. 7) dargestellt ist; oder
    • (vii) eine DNA-Sequenz umfassend eine kodierende Sequenz, die bei dem Nukleinsäure-Triplett an Position 201–203 beginnt und an dem Triplett 3018–3020 der in 15 (SEQ ID NR. 8) dargestellten Sequenz endet.
  • Eine besondere Untersequenz von SEQ ID NR. 8 ist eine Nukleinsäuresequenz, die bei Position 1767 beginnt und bei Position 2529 der in 15 dargestellten Sequenz endet.
  • Die Erfindung betrifft im Rahmen der Offenbarung die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Expressionsvektors umfassend die DNA-Sequenz von SEQ ID NR. 3, die fähig ist, den programmierten Zelltod herbeizuführen, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung metastasierender Tumorzellen.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines solchen Expressionsvektors, wobei die DNA-Sequenz ein DNA-Molekül ist, das das gleiche Protein oder Polypeptid kodiert, das von der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR. 3 kodiert wird.
  • Alternativ ist gemäß der vorliegenden Erfindung die DNA-Sequenz ein Fragment einer Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR. 3, das ein Protein oder Polypeptid kodiert, das die Aktivität des Herbeiführens des programmierten Zelltods beibehält, die in dem Protein oder Polypeptid vorhanden ist, das von der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR. 3 kodiert wird.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird diese pharmazeutische Zusammensetzung zur Verabreichung mit einem Zytokin kombiniert.
  • Die Anmeldung beschreibt auch ein DNA-Molekül, das das gleiche Protein oder Polypeptid kodiert, das durch jede beliebige der oben definierten Nukleinsäuresequenzen kodiert wird, eine Nukleinsäuresequenz, in der ein oder mehrere Nukleinsäure-Tripletts addiert, deletiert oder ersetzt wurden, das Protein oder Polypeptid, das von der Sequenz kodiert wird und das im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität aufweist wie das, das durch jede beliebige der oben definierten DNA-Moleküle kodiert wird, und ein Fragment einer wie oben definierten Nukleinsäuresequenz, die ein Protein oder Polypeptid kodiert, das die biologische Aktivität beibehält, die in dem Protein oder Polypeptid, das von dieser wie oben definierten Nukleinsäuresequenz kodiert wird, vorhanden ist.
  • Die vorliegende Anmeldung offenbart Zusammensetzungen, die gemäß der obigen Verwendungen zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger hergestellt werden, und Verfahren zur Behandlung unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzungen.
  • Sie offenbart weiterhin ein Verfahren zur Auswahl einer chemotherapeutischen Behandlung für einen Krebspatienten umfassend: Bestimmen, ob die Tumorzellen des Patienten ein aktives DAP-Gen enthalten; und Auswählen eines chemotherapeutischen Wirkstoffs, dessen Art der Wirkung eine Apoptose herbeiführt. Die DAP-Genexpression in Tumorzellen kann die Sensitivität der Zellen gegenüber verschiedenen chemotherapeutischen Wirkstoffen, wie zum Beispiel Topoisomeraseinhibitoren (z.B. Adriamycin), mitotischen Inhibitoren (z.B. Vincristin), Glukocorticoiden (z.B. Dexamethason), Folsäureantagonisten (z.B. Methotrexat) und Breitbandproteinkinase(PKC, PKA, etc.)-Inhibitoren (z.B. Staurosporin) erhöhen.
  • Gemäß dem Prognoseaspekt, der in der Anmeldung offenbart wird, wird ein Verfahren zum Nachweis der Abwesenheit eines DAP-Gens, einer partiellen Deletion oder einer Mutation (d.h. Punktmutation, Deletion oder jeder anderen Mutation) in den DAP-Genen eines Individuums oder der Abwesenheit einer/s DAP-bezogenen RNA oder Proteins umfassend das Sondieren genomischer DNA, cDNA oder RNA eines Individuums mit einer DNA-Sonde oder einer Vielzahl von DNA-Sonden mit einer vollständigen oder einer Teilsequenz der DAP-Gene oder Sondieren von Proteinextrakten mit spezifischen Antikörpern bereitgestellt.
  • Die Erfindung betrifft daher ein In-vitro-Verfahren zur Bestimmung der Prognose einer von metastasierenden Tumorzellen verursachten Krankheit, umfassend:
    • (a) Zugeben einer Nukleinsäure-Sonde zu einer aus einem an der besagten Krankheit leidenden Individuum erhaltenen Probe, wobei die Probe ein Gewebeschnitt oder entweder aus Zellen erhaltene genomische DNA oder mRNA oder aus der mRNA hergestellte cDNA ist, wobei die Sonde eine Sequenz ist ausgewählt aus:
    • (i) der mit der SEQ ID NR. 3 bezeichneten DNA-Sequenz;
    • (ii) der mit Bezug auf (i) modifizierten DNA-Sequenz, wobei die Modifikation aus der Addition, Deletion oder dem Ersetzen eines oder mehrerer Nukleinsäure-Tripletts besteht, wobei die modifizierte DNA-Sequenz die Fähigkeit bewahrt, unter stringenten Bedingungen mit der Sequenz von (i) zu hybridisieren;
    • (iii) der Sequenz, die ein Antisense zu der gesamten oder einem Teil der DNA-Sequenz von (i) oder (ii) ist und fähig ist, die Expression der mit der SEQ ID NR. 3 bezeichneten DNA-Sequenz zu inhibieren; und
    • (iv) der RNA-Sequenz, die komplementär zu der DNA-Sequenz von (i), (ii) oder (iii) ist;
    • (b) Bereitstellen stringenter Bedingungen für die Hybridisierung zwischen der Sonde und der Probe; und
    • (c) Bestimmen auf der Basis der Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, ob ein an dem programmierten Zelltod beteiligtes Gen mit der durch metastasierende Tumorzellen verursachten Krankheit assoziiert ist, wobei eine Abwesenheit der Hybridisierung ein Fehlen des Gens anzeigt und eine nicht normale Hybridisierung eine mögliche Inaktivierung des Gens anzeigt.
  • Eine weitere Ausführungsform dieses obigen Aspekts umfasst die folgenden Schritte:
    • (a) Zugeben eines spezifischen Antikörpers, der fähig ist, ein von der mit der SEQ ID NR. 3 bezeichneten DNA-Sequenz kodiertes Protein zu binden, zu einer aus einem an der Krankheit leidenden Individuum erhaltenen Probe, wobei die Probe ein Zellextrakt oder ein Gewebeschnitt ist;
    • (b) Bereitstellen von Bedingungen für eine Bindung des Proteins in der Probe durch den Antikörper; und
    • (c) Bestimmen auf der Basis der Bindung des Proteins, ob ein an dem programmierten Zelltod beteiligtes Protein mit den metastasierenden Tumorzellen assoziiert ist, wobei ein Fehlen der Bindung eine Abwesenheit des Proteins anzeigt und eine nicht normale Bindung eine mögliche Modifikation des Proteins anzeigt.
  • Andere Beispiele des Prognoseaspekts der Erfindung sind dem Fachmann gut bekannt und schließen, ohne darauf begrenzt zu sein, Northern-Blots, RNase-Schutztests und verschiedene PCR-Verfahrensweisen ein.
  • Die Anmeldung beschreibt auch, dass die Mutation in dem DAP-Gen, die eine mögliche Prädisposition für Metastasen anzeigt, auch mittels geeigneter Antikörper nachgewiesen werden kann, die in der Lage sind, zwischen einem mutierten und einem nicht funktionierenden und einem normal funktionierenden DAP-Genprodukt zu unterscheiden. Zusätzlich können Mutationen, die die Proteintranslation oder den Verlust an RNA aufgrund von Promotorinaktivierung unterbinden, mit Hilfe von Antikörpern nachgewiesen werden, die mit Proteinzellextrakten zur Reaktion gebracht werden. Ein Beispiel ist unten in Hinblick auf den Verlust von DAP-Kinase-RNA und -Protein in B-Zelllymphom- und Blasenkarzinomzelllinien beschrieben.
  • Ein zweiter Aspekt der Offenbarung der Anmeldung betrifft Verfahren zur Behandlung und pharmazeutische Zusammensetzungen betreffend nicht Zytokin-induzierten programmierten Zelltod.
  • Folglich offenbart die Anmeldung die Verwendung einer therapeutischen wirksamen Menge eines Expressionsvektors umfassend eine DNA-Sequenz, die in fähig ist, den nicht Zytokin-induzierten programmierten Zelltod zu fördern, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei der Behandlung einer Krankheit oder Störung, die mit unkontrolliertem pathologischem Zellwachstum verbunden ist, verwendbar ist, wobei die DNA-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
    • (a) einer DNA-Sequenz, die in Zellen exprimiert wird und deren Expressionsprodukt in den programmierten Zelltod einbezogen ist;
    • (b) einer DNA-Sequenz, die anders ist als die unter (a) definierte DNA und die das gleiche Expressionsprodukt kodiert, das von der in (a) definierten DNA-Sequenz kodiert wird;
    • (c) eine modifizierte DNA-Sequenz von (a) oder (b), in der ein oder mehrere Nukleinsäure-Tripletts addiert, deletiert oder ersetzt wurden, wobei das Protein oder Polypeptid, das von der modifizierten DNA-Sequenz kodiert wird, den programmierten Zelltod in ähnlicher Weise vermittelt, wie das Protein oder Polypeptid, das von dem in (a) oder (b) definierten Gen kodiert wird; und
    • (d) Fragmente jeder der DNA-Sequenzen von (a), (b) oder (c), die ein Protein oder ein Polypeptid mit dieser biologischen Aktivität kodieren.
  • Gemäß einer spezifischen Ausführungsform beschreibt die vorliegende Anmeldung eine wie oben beschriebene Verwendung, wobei die DNA-Sequenz eine Nukleinsäuresequenz ist, die in Zellen exprimiert wird, deren Expressionsprodukt in den programmierten Zelltod einbezogen ist und die eine der folgenden ist:
    • (i) eine DNA-Sequenz umfassend eine kodierende Sequenz, die bei dem Nukleinsäure-Triplett an Position 160–162 beginnt und an dem Triplett 466–468 der in 6 (SEQ ID NR. 1) dargestellten Sequenz endet;
    • (ii) eine DNA-Sequenz umfassend eine kodierende Sequenz, die bei dem Nukleinsäure-Triplett an Position 287–289 beginnt und an dem Triplett bei Position 816–818 der in 6 (SEQ ID NR. 2) dargestellten Sequenz endet;
    • (iii) eine DNA-Sequenz umfassend eine kodierende Sequenz, die bei dem Nukleinsäure-Triplett an Position 337–339 beginnt und an dem Triplett bei Position 4603–4605 der in 8 (SEQ ID NR. 3) dargestellten Sequenz endet;
    • (iv) eine DNA-Sequenz umfassend eine kodierende Sequenz, die bei dem Nukleinsäure-Triplett an Position 74–76 beginnt und an der Position 1268–1270 der in 12 (SEQ ID NR. 4) dargestellten Sequenz endet;
    • (v) eine DNA-Sequenz umfassend eine Sequenz, die in 13 (SEQ ID NR. 5) dargestellt ist;
    • (vi) eine Sequenz von Cathepsin, die in 14 (SEQ ID NR. 7) dargestellt ist; oder
    • (vii) eine DNA-Sequenz umfassend eine kodierende Sequenz, die bei dem Nukleinsäure-Triplett an Position 201-203 beginnt und an dem Triplett 3018–3020 der in 15 (SEQ ID NR. 8) dargestellten Sequenz endet.
  • Gemäß der Anmeldung wird die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Expressionsvektors offenbart, der eine DNA-Sequenz umfasst, die fähig ist, den nicht Zytokin-induzierten programmierten Zelltod zu inhibieren, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei der Behandlung einer Krankheit oder Störung, die mit nicht Zytokin-induziertem programmiertem Zelltod assoziiert ist, verwendbar ist, wobei die DNA-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
    • (a) eine Sequenz, die ein Antisense zu dem gesamten oder einem Teil des in der Zelle exprimierten DNA-Moleküls ist, dessen Expressionsprodukt in den nicht Zytokin-induzierten programmierten Zelltod einbezogen ist, wobei das Antisense fähig ist, die Expression dieses DNA-Moleküls zu inhibieren; und
    • (b) eine modifizierte DNA-Sequenz eines wie in (i) definierten DNA-Moleküls, in welchem eine oder mehrere Nukleinsäure-Tripletts addiert, deletiert oder ersetzt wurden, wobei das Protein oder Polypeptid, das von der modifizierten Sequenz kodiert wird, eine dominant negative Wirkung aufweist, was durch die Fähigkeit dieses Protein oder Polypeptids manifestiert wird, diesen programmierten Zelltod zu inhibieren; und
    • (c) einen Inhibitor oder Antagonisten eines beliebigen Proteins oder Polypeptids, das von den oben definierten DNA-Sequenzen kodiert wird.
  • Der oben beschriebene Prognoseaspekt in Hinblick auf den ersten Aspekt der Offenbarung ist auch relevant für den zweiten Aspekt der Offenbarung.
  • Andere Aspekte der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung offenbar werden.
  • BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen im Zusammenhang mit den folgenden Zeichnungen besser verstanden werden, in welchen:
  • 1A–D zeigen RNA- und Proteinexpression des DAP-1-Gens, wobei:
  • 1(A) zeigt eine Northern-Blotanalyse von Sense- und Antisense-mRNA, die aus mit den Konstrukten 230, 255, 260, 259 transfizierten HeLa-Zellen oder Kontrollzellen (ursprüngliche Zellen; parental cells) erhalten wurden und mittels markierter cDNA-Fragmente aus Konstrukt 230 sondiert wurden. Die gesamte RNA wurde aus HeLa-Zellen entweder vor (ursprünglich) oder nach Transfektion nach pTKO1-Konstrukten #230 oder #255 (Gruppe 1), #260 (Gruppe 5) und #259 (Gruppe 3), die mit 230-t1, 250-t1, 260-t1 bzw. 259-t1 bezeichnet wurden, präpariert. 20 g RNA wurden auf Northern-Blots bearbeitet und DNA-Fragment #230 wurde als Sonde verwendet. Die Pfeile zeigen auf die Position der Sense- und Antisense-RNAs.
  • 1(B) zeigt eine Northern-Blotanalyse von Sense- und Antisense-mRNA, die aus mit Kontrollkonstrukt (DHFR-t2), mit 230 Konstrukt-transfizierten HeLa-Zellen oder Kontrollzellen (ursprüngliche Zellen), die mit (+) oder ohne (–) 750 U/ml IFN-γ für 24 Stunden behandelt wurden, erhalten war. Die RNA wurde aus den angegebenen HeLa-Zellen extrahiert, die für 4 Tage in Abwesenheit (–) oder Gegenwart (+) von IFN-γ (750 U/ml) wachsen gelassen wurden. Der Northern-Blot, der 20 μg RNA-Proben enthielt, wurde mit dem cDNA-Insert von λ1-Phagen hybridisiert. Die Ethidiumbromid-Färbung der mRNA-Proben ist gezeigt.
  • 1(C) zeigt ein SDS-Polyacrylamidelektrophoresegel des exprimierten Proteinprodukts der DAP-1-cDNA, die in vitro in einer Reticulozyten-Lysatpräparation translatiert wurde. Die In-vitro-Translation von RNA (0,5 g), die aus der 1 cDNA (Spur 2) und aus den Subklonen p6, p4, p5 und p8 transkribiert wurde, ist jeweils in den Spuren 3–6 gezeigt. Spur 1 entspricht dem Hintergrund, der ohne RNA-Verabreichung an das Reticulozytenlysat erhalten wurde. Die markierten Proteine wurden auf 12% SDS-Polyacrylamidgelen fraktioniert. Die Position der radioaktiven Molekulargewichtsmarker (Amersham) ist markiert. Zwei translatierte Proteine, das Hauptprotein 15 kDa und das Nebenprotein 22 kDa, sind durch Pfeile angezeigt.
  • 1(D) zeigt eine Immunoblotanalyse von rekombinantem und zellulärem 15 kDa DAP-1-Protein. Bakteriell hergestelltes DAP-1-Protein (300 ng) und die angegebenen HeLa-Zellextrakte (350 μg) wurden auf SDS-Polyacrylamidgelen (12%) fraktioniert, auf Nitrocellulose geblottet und mit affinitätsgereinigten Antikörpern, die gegen 15 kDa DAP-1 gebildet waren, gereinigt. Die Zellen wurden mit IFN-γ (750 U/ml) für 4 Tage vor ihrer Extraktion behandelt. Die beiden Pfeile zeigen die Position des zellulären DAP-1-Proteins. Die Antikörper erkennen auch zwei nicht-relevante Banden von 60 und 45 kDa, die durch die Antisense-RNA-Expression nicht verändert werden. Die Quantifizierung der Reduzierung des DAP-1-Proteins wurde durch densitometrische Analyse vorgenommen. Die Kalibrierung des Proteingehalts in jedem Auftrag wurde durch Bezugnahme auf die Signale der nicht-relevanten Bande vorgenommen. Die vorgefärbten Proteinmarker (Sigma) sind markiert.
  • 2A–D zeigen RNA- und Proteinexpression des DAP-2-Gens, wobei:
  • 2(A) zeigt eine Northern-Blotanalyse von Sense- und Antisense-mRNA, die aus zwei Klonen von mit Kontrollkonstrukten (DHFR-t1 und DHFR-t2) transfizierten HeLa-Zellen und zwei Klonen von mit dem 256 Konstrukt (t1 und t2) transfizierten Zellen erhalten wurden. Die gesamte RNA wurde aus den 256-t1- und 256-t2-HeLa-Zelltransfektanten entweder vor (0 Stunden) oder 3 und 24 Stunden nach der Behandlung mit IFN-γ (750 U/ml) hergestellt und 20 g der Proben wurden auf Northern-Blots bearbeitet. Das Fragment #256 wurde als Sonde verwendet. Die Position der Sense- und Antisense-mRNA ist angegeben. Die GAPDH-mRNA-Spiegeln wurden zur Kalibrierung der RNA-Mengen in jedem Blot verwendet.
  • In 2(B) besteht der Blot aus der gesamten RNA (20 μg) aus K562-Zellen, ursprünglichen HeLa-Zellen, den zwei DHFR-transfizierten HeLa-Zellpopulationen und zwei HeLa-Zellpopulationen, die mit pTKO1-256 transfiziert waren. Der Blot wurde mit dem cDNA-Insert von λ29 hybridisiert. Die Ethidiumbromidfärbung der RNA-Proben ist gezeigt.
  • 2(C) zeigt einen In-vitro-Phosphorylierungstest. Die Zelllysate wurden aus COS-7-Zellen entweder vor (Spur 1) oder nach Transfektion mit dem PECE-FLAG-Expressionsvektor hergestellt, der die kodierende Region der λ29 cDNA (Spur 2) trägt. Proben von 400 μg wurden mit monoklonen anti-FLAGTM-(M2)-Antikörper (IBI) immunpräzipitiert und Phosphorylierungstests unterzogen.
  • 2(D) zeigt die Immunoblotanalyse von rekombinantem und zellulärem DAP-2-Protein. Die COS-7-Zellen wurden transient mit dem PECE-FLAG-DAP-2-Expressionsvektor transfiziert. Proben von Zelllysaten, 100 μg aus COS-7-Zellen und 400 μg aus HeLa-Zellen, wurden auf SDS-Polyacrylamidgelen (7,5%) fraktioniert, immungeblottet und mit affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörpern, die gegen das N- terminale DAP-2-Peptid hergestellt waren, zur Reaktion gebracht. In dem unteren Teil des Bildes wurde der Blot mit monoklonalen Antikörpern gegen Vinculin (Sigma Immunochemicals) zur Reaktion gebracht. Spuren: 1, nicht-transfizierte COS-1-Zellen; 2, transfizierte COS-1-Zellen; 3, DHFR-t1-Zellen; 4, 256-t1-Zellen; 5, 256-t2-Zellen. In Spur 2 wurde das gleiche 160 kDa Protein auch mit monoklonalen anti-FLAGTM-(M2)-Antikörpern (IBI) nachgewiesen (nicht gezeigt).
  • 3A–C zeigen morphologische Merkmale der cytostatischen und cytotoxischen Antworten auf IFN-γ in HeLa-Zellen. Alle Kulturen wurden mit einer anfänglichen Dichte von 10.000 Zellen pro cm2 ausgesät.
  • 3(A) zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme von HeLa-Zellen, die mit pTKO-1-DHFR-Konstrukt (DHFR-t1-Zellen) transfiziert wurden, an den Tagen 3 und 8 der Kultivierung in Abwesenheit (a, c) oder Gegenwart (b, d) von IFN-γ (750 U/ml). (Vergrößerung × 400). Bemerken Sie die Abwesenheit von Licht-brechenden mitotischen Zellen während der cytostatischen Phase der Antwort auf IFN-γ (in b) und das Vorhandensein von runden Zellen, die während der Abtötungsphase vom Substrat abgelöst waren (in d).
  • 3(B) zeigt die Färbung von DNA mit DAPI; a. nicht-behandelte DHFR-t1-Zellen, die durch Trypsinisierung entfernt und auf Glasobjektträgern aufgebracht waren. b. Abgelöste DHFR-t1-Zellen, die 7 Tage nach IFN-γ-Behandlung gesammelt wurden. Nuklei mit kondensiertem oder fragmentiertem Chromatin sind durch Pfeile angezeigt. (Vergrößerung × 1000).
  • 3(C) zeigt raster- und transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von Zellen, die mit dem Kontrollkonstrukt DHFR-t1 und dem 230-t1-Konstrukt transfiziert waren. DHFR-t1-HeLa-Zellpopulationen (a–d) und die mit 230-t1-Antisense transfizierten Zellen (e und f) wurden entweder in Abwesenheit (a, c, e) oder in Gegenwart (b, d, f) von IFN-γ (750 U/ml) kultiviert. (a, b, e, f), rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen wurden nach 7 Tagen unter Verwendung von GSM 6400 SEM (Jeol.) gemacht. Balken = 10 mm (× 2200 Vergrößerung für alle vier Proben). (c und d), transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen wurden nach 7 Tagen unter Verwendung von TEM (Philips 410) bei einer Vergrößerung von × 2800 genommen. Die kondensierten Nuklei und die Oberflächenblasen sind durch Pfeile angezeigt.
  • 4A–C zeigen, dass die Antisense-RNA-Expression aus Plasmiden der Gruppe 1 und 2 die Empfänglichkeit der HeLa-Zellen für Abtötungseffekte von IFN-γ reduziert, aber keine Wirkung auf das frühere IFN-γ-Signalling hat.
  • 4(A–B) zeigen die Zahl der lebenden Zellen, die durch Lichtabsorption bei 540 nm bestimmt wurde, als Funktion der Zeit; die Zellen wurden entweder mit dem Kontrollkonstrukt DHFR-t1 (
    Figure 00170001
    – 1(A) und 1(B)); dem 255- oder 230-Konstrukt (
    Figure 00170002
    – oder mit den zwei Klonen t1 und t2 des 256-Konstrukts (
    Figure 00170003
    – 1(B)) transfiziert. Die Ergebnisse sind sowohl für das Zellwachstum mit (+) und ohne (–) Verabreichung von 750 U/ml IFN-γ gezeigt. Jeder Punkt ist der Mittelwert einer Vierfachbestimmung mit einem SD, der im Bereich zwischen 2–5% liegt.
  • 4(C) zeigt eine Northern-Blotanalyse von 2-5-A-Synthasegeninduktion. Die angegebenen HeLa-Zelltransfektanten wurden für 24 Stunden in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (–) von IFN-γ (750 U/ml) inkubiert. 20 mg der gesamten RNA wurden analysiert. Die cDNA der 2–5-A-Synthase wurde als Sonde verwendet.
  • 5 zeigt die Restriktionskarte des λ1-cDNA-Klons, der die DAP-1-cDNA trägt.
  • 6 zeigt die DNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz von DAP-1.
  • 7 zeigt die Restriktionskarte des λ29-cDNA-Klons, der die DAP-2-cDNA trägt.
  • 8 zeigt die DNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz von DAP-2.
  • 9A–C zeigen DAP-2-Sequenzhomologien zu anderen Serin/Threoninkinasen und ein Alignment der Ankyrin-Repeats von DAP-2, wobei:
  • In 9(A) sind die Proteinkinasedomänesequenzen von DAP-2 mit den entsprechenden Domänen der anderen Calmodulin-abhängigen Kinasen abgeglichen. Die Kinasesubdomänestruktur (nummeriert I–XI) und die in die Calmodulinerkennung und -bindung einbezogene Region (bezeichnet als Calmodulin-regulatorische Region) sind angegeben. Die obligatorischen konservierten Aminosäuren in der Kinasedomäne sind mit Sternen markiert. Die Zahlen auf der rechten Seite markieren die Positionen relativ zum N-Terminus des primären Translationsprodukts einer jeden Kinase. Ein ausgefüllter Hintergrund zeigt identische Aminosäuren in den verglichenen Kinasen an. Ein Hintergrund mit Punkten zeigt Positionen, an denen die Aminosäuren nicht identisch, aber ähnlich waren. nm-mlck – nicht Muskel Myosin leichte Kettenkinase (Huhn); sm-mlck – Myosin leichte Kettenkinase aus glattem Muskel (Huhn); skm-mlck – Myosin leichte Kettenkinase aus Skelettmuskel (Ratte); camdk-alph,-beta,-gamm – Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II -α-, β- bzw. γ-Untereinheiten; mlck-dicdi – Myosin leichte Kettenkinase aus Dictyostelium discoidium (Schleimpilz).
  • 9(B) zeigt ein Alignment von Kinasesubdomänen II und III von DAP-2 und die entsprechenden Domänen verschiedener Zellzyklus-abhängiger Kinasen. dm2 – Drosophila CDC2-Homolog; pssalre – humane Serin/Threoninkinase PSSALRE; kpt2 – humane Serin/Threoninproteinkinase PCTAIRE-2; kin28 – Hefe (S. cerevisiae) putative Proteinkinase; mol5 – Xenopusproteinkinsae verwandt mit cdc2, das ein negativer Regulator der meiotischen Reifung ist; kkialre – humane Serin/Threoninproteinkinase KKIALRE.
  • 9(C) zeigt ein Alignment von DAP-2-Ankyrin-Repeats. Ein ausgefüllter Hintergrund zeigt identische Aminosäuren. Eine Konsensussequenz der DAP-2-Ankyrin-Repeats ist unten gezeigt. Die Position der individuellen Repeats in der cDNA ist in 9(B) dargestellt. ar 1–8, Ankyrin-Repeats.
  • 10 zeigt eine Northern-Blotanalyse von mRNA, die aus verschiedenen hämatopoetischen Zellen erhalten wurde, die mit markierter DAP-1-cDNA sondiert wurden.
  • 11 zeigt eine Northern-Blotanalyse von mRNA, die aus Leber, Milz oder Hirn normaler Embryonen (2) oder Embryonen mit Down-Syndrom (1) erhalten wurde, die mit markierter cDNA oder DAP-1 oder DAP-2 sondiert wurde. Um die Spiegel an gesamter mRNA zu beurteilen, wurde GAPDH verwendet (unten).
  • 12 zeigt die DNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz von DAP-3.
  • 13 zeigt eine partielle DNA-Sequenz von DAP-4.
  • 14 zeigt die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz von Cathepsin D.
  • 15 zeigt die DNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz von DAP-5.
  • 16 zeigt eine Immunoblotanalyse der DAP-Kinaseexpression. Subkonfluente Kulturen von ursprünglichen D122-Zellen und von verschiedenen G-418-resistenten Derivatsklonen, die mit dem pcDNA-Kontrollvektor (-cont.) oder mit pcDNA-DAP-Kinase (-DAPk) transfiziert waren, wurden lysiert und wie ausführlich zuvor beschrieben verarbeitet (300 μg Protein pro Probe) (Deiss, L. P., et. al., 1995, Genes Dev. 9: 15). Die Immunoblots wurden mit monoklonalen anti-DAP-Kinase-Antikörpern (Sigma) und mit anti-Vinculinantikörpern (Sigma) zur Reaktion gebracht. Die endogenen Spiegel von DAP-Kinase in A9-F-Zellen wurden als eine positive Referenz verwendet.
  • 17 zeigt die In-vitro-Kinaseaktivität von ektopisch exprimiertem DAP-Kinasegen. Die Proben von 1000 μg Gesamtzellextrakten wurden durch anti-FLAG-Antikörper immunpräzipitiert und einem Kinasetest (oberer Teil) unter Verwendung von Myosin leichte Kette (myosin light chain; MLC) Protein (5 μg; Sigma) als exogenes Substrat unterzogen. Der untere Teil zeigt die DAP-Kinaseproteinspiegel nach Inkubation derselben Blots mit anti-DAP-Kinaseantikörpern.
  • 18A & B sind In-vitro-Wachstumskurven der transfizierten D122-Klonen. Die Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen mit einer anfänglichen Dichte von 1 × 104 Zellen pro Vertiefung kultiviert; die Zellen wurden entweder mit 10% (18A) oder 1% (18B) fötalem Kälberserum (FCS) (Gibco BRL) supplementiert. In 24 Stunden-Intervallen wurden die Zellen durch die Kristallviolettmethode quantifiziert (Kueng, W., et al., 1989, Anal Biochem. 182: 16) und die O. D. der lysierten Zellen bei λ = 540 nm gemessen. Die Daten sind Mittelwerte von Zweifachbestimmungen aus zwei Experimenten. Symbole: (O) D122; (♢) 1-cont.; (☐) 4-cont.; (X) 6-DAPk (♦) 28-DAPk; (
    Figure 00190001
    ) 42-DAPk; (•) 48-DAPk.
  • 19 zeigt lokales Tumorwachstum in Fußballen als eine Funktion der Anzahl der Tage nach Injektion. Die verschiedenen D122-transfizierten Klone wurden in die Fußballen von C57BL/6-Mäusen (10–12 Wochen alte Weibchen) injiziert. Der Durchmesser der Tumor-tragenden Füße wurden alle 1–3 Tagen gemessen. Die Werte stellen den mittleren Ballendurchmesser der Individuen einer Gruppe (8 pro Gruppe) dar. Die Symbole sind wie in 18.
  • Der SD war im Bereich zwischen 0% und 32% der Messungen. Ein ungepaarter einseitiger Student's T-Test, der für eine Anzahl von Zeitpunkten durchgeführt wurde, zeigte, dass Unterschiede zwischen den Größen des wachsenden Tumors, die durch den am langsamsten wachsenden Kontrollklon (1-cont.) gebildet wurden, und denen die durch die 28-DAPk- oder 42-DAPk-Klone gebildet wurden, mit P < 0,001 signifikant waren. Man kann sehen, dass die Transfektion mit DAP-Kinase das Wachstum von lokalen Tumoren verzögert.
  • 20 zeigt das mittlere Lungenvolumen und die mittlere Anzahl von Metastase-Läsionen von Mäusen mit intravenösen Injektionen. Mäusen, wie den obigen, wurden in die Schwanzvene Injektionen verabreicht, und 30–32 Tage später wurden sie getötet. Die Lungen wurden entfernt, gewogen und in Bouin-Lösung fixiert. Die Anzahl der Metastaseknoten wurde durch Zählen der oberflächlichen Knoten unter einem Binokular bestimmt. Die Werte sind Mittelwerte ± SD von 5 Individuen einer Gruppe, die entweder das Lungengewicht (in Balken) oder die Anzahl der Metastaseknoten pro Maus (in der Tabelle) darstellen. Die durchgezogene Linie in dem Balkendiagramm zeigt das mittlere Lungengewicht von Mäusen ohne Injektion an.
  • Die Unterschiede zwischen dem weniger aggressiven 1-cont.-Klon und jedem einzelnen der DAP-Kinasetransfektanten war signifikant mit P < 0,001 für 48-, 28- und 42-DAPk-Klone und mit 0,025 < P < 0,05 für den niederexprimierenden Klon 6-DAPk (der letztere Klon unterschied sich von dem 4-cont.-Klon und den ursprünglichen D122-Zellen mit P < 0,001). Folglich unterdrückt die Transfektion mit DAP-Kinase die experimentelle Metastasierung stark.
  • 21 sind Fotografien von drei repräsentativen Lungen einer jeden Gruppe von Mäusen wie in 20. Bemerken Sie die Unterschiede der Lungengröße und Oberflächenknoten im Vergleich zu den Lungen, die nach I.V.-Injektionen mit dem schwach metastasierenden A9-F-Klon (verwendet als eine Referenz) erhalten wurden. Skalierungsbalken, 1 cm.
  • 22 zeigt die Immunoblotanalyse für DAP-Kinaseproteinspiegel von Klon 28-DAPk wie in 16. Die Expression wurde sowohl in dem ursprünglichen Klon, der für die I. F. P.- und I. V.-Injektionen (Spuren 1 bzw. 3) verwendet wurde, als auch in Tumorzellen, die aus der Lunge von Mäusen mit Injektionen rekultiviert wurden, getestet. Die letzteren Zellkulturen wurden entweder von zahlreichen spontanen Lungenknoten, die 35 Tage nach der Operation (Spur 2) auftraten, oder aus sehr wenigen Knoten gewonnen, die in den experimentellen Metastasetests auftraten (Spur 4).
  • Die DAP-Kinasespiegel waren unter den Nachweisgrenzen in dem 4-cont.-transfizierten Klon sowohl vor den Injektionen als auch nach der Gewinnung von Tumorzellen aus den spontanen Lungenläsionen (Spuren 5 bzw. 6), was bestätigte, dass die Tumorzellen nicht mit umgebenden DAP-Kinase-positiven primären Lungenzellen kontaminiert waren. Spur 7 zeigt die Expressionsspiegel von endogener DAP-Kinase in dem schwach metastasierenden Klon A9-F.
  • 23 zeigt eine Immunoblotanalyse von Klon 42-DAPk, die vor und nach seiner Gewinnung in Kultur aus spontanen Lungenmetastasen, die 34 Tage nach den Fußamputationen (Spuren 1 bzw. 2) gebildet wurde, getestet wurde. Spur 3 zeigt die Expressionsspiegel von endogener DAP-Kinase in dem schwach metastasierenden Klon A9-F.
  • 24 zeigt eine Immunoblotanalyse von Zellkulturen, die aus spontanen Lungenmetastase-Läsionen freigesetzt wurden, die nach den I. F. P.-Injektionen von Klon 28-DAPk gebildet wurden. Die Kulturen wurden in vitro mit 10 μM 5-Aza-2'-desoxycytidin für 24 Stunden behandelt. Die nicht-behandelten und Wirkstoff-behandelten Kulturen wurden auf DAP-Kinaseproteinexpression entweder an Tag 3 (Spuren 1 bzw. 2) oder an Tag 14 nach der Behandlung (Spuren 3 bzw. 4) getestet.
  • 25 zeigt eine In-situ-TUNEL-Färbung von Fußballenschnitten, die an Tag 5 nach der lokalen Injektion von 2 × 105 4-cont.-Zellen (linke Fotografie) oder 42-DAPk-Zellen (rechte Fotografie) hergestellt wurden. Die Peroxidasefärbung von fragmentierter DNA und die Gegenfärbung der Schnitte mit Methylgrünfarbstoff wurden gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt (ApopTag® Plus Peroxidase Kit; Oncor, Gaithersburg). Skalierungsbalken, 100 μm.
  • 26 zeigt eine DAPI-Färbung von Nuklei vor und nach Behandlung mit TNF-α. Exponentiell wachsende Zellen entsprechend 18-cont.- und 42-DAPk-Transfektanten wurden mit einer Kombination von marinem TNF-α (100 ng/ml; R&D systems, Minneapolis) und Cycloheximid (5 μg/ml; Sigma) (rechte Bilder markiert mit +) oder mit Cycloheximid alleine (linke Bilder markiert mit –) behandelt. Die DAPI-Färbung wurde nach 6 Stunden durchgeführt. Die Pfeile zeigen auf die apoptotischen Nuklei.
  • 27 veranschaulicht Zeitkinetiken des Abtötens durch TNF-α. Die Bedingungen der Behandlung mit TNF-α und Cycloheximid und die Beurteilung der apoptotischen Nuklei durch DAPI-Färbung waren wie in 26. Die 42-DAPk-Transfektanten (X) wurden in diesem Test mit den ursprünglichen D122-Zellen (O), mit 4-cont. (☐) und mit 18-cont. (♢) verglichen. Die Werte sind Mittelwerte des Prozentsatz der intakten Nuklei ± SD, die durch Auswerten von 5 verschiedenen Feldern, 100 Nuklei insgesamt in jedem Feld, zu den angegebenen Zeitpunkten gezählt wurden.
  • Die Unterschiede zwischen 42-DAPk- und 4-cont.-Klonen waren mit P << 0,001 an den beiden Zeitpunkten von 4,5 und 6 Stunden und mit 0,005 < P < 0,001 in Hinblick auf den 7 Stunden-Zeitpunkt signifikant.
  • 28 zeigt das Ergebnis der Tests der Antwort auf TNF-α und Cycloheximid, wie in 26 und 27 beschrieben. Der originale 42-DAPk-Klon wurde mit den Kulturen verglichen, die aus spontanen Lungenmetastasen, wie in 23 beschrieben (hier bezeichnet als 42-DAPk*), gewonnen wurden. Die Werte sind Mittelwerte des Prozentsatzes apoptotischer Nuklei ± SD, die durch Auswertung von 5 verschiedenen Feldern, 100 Nuklei insgesamt in jedem Feld, 6 Stunden nach Exposition gegenüber der doppelten Behandlung, gezählt wurden.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die In-vivo-Selektion auf abgeschwächte DAP-Kinaseexpression der erhöhten Sensitivität von Klon 42-DAPk gegenüber TNF-α abträglich ist.
  • 29 zeigt das Wachstum der D122-Transfektanten in halbfestem Medium unter verankerungsunabhängigen Bedingungen. Verschiedene Klone wurden in 0,33% Weichagar (Bacto-agar; Difco) mit einer anfänglichen Zellzahl von 5 × 103 Zellen pro 6 cm Platte auf einer Schicht enthaltend 0,5% Agar kultiviert. Der Durchmesser der Klone, der an Tag 7 auftrat, wurde unter einem Lichtmikroskop gemessen. Die Werte sind der mittlere Durchmesser der Kolonie von 100 Kolonien für jede Gruppe ± SD.
  • Die Klone 1-DAPk und 21-DAPk exprimierten exogenes DAP-Kinaseprotein in Spiegeln, die mit Klon 28-DAPk vergleichbar waren (16). Der Unterschied zwischen den Kontrollen (z.B. 18-cont.) und den DAP-Kinasetransfektanten (z.B. 1-DAPk) war mit P << 0,001 signifikant.
  • 30 zeigt mikroskopische Aufnahme von Klonen, die in Weichagar für sieben Tage, wie in 29 kultiviert wurden, wobei die ursprünglichen D122-Zellen (links: a, c) mit DAPk-42-Zellen (rechts; b, d) verglichen wurden. Die Balken entsprechen 350 μm in den oberen Bildern, (a, b) und 80 μm in den unteren Bildern (c, d).
  • 31 ist eine schematische Darstellung von DAP-Kinase und ihren Mutanten, die in diesen Studien verwendet wurden. Die verschiedenen Motive und Domänen, die durch die abgeleitete Aminosäuresequenz und/oder experimentelle Arbeit vorhergesagt wurden, sind dargestellt. Die unten angegebenen Nummern zeigen die Aminosäurepositionen an. Die K42A-, CaM- und (1-1271) DD-Mutanten sind unten schematisch dargestellt.
  • 32 zeigt die In-vitro-Kinaseaktivität der DAP-Kinase. DAP-Kinase oder mutierte DAP-Kinaseproteine wurden in vitro auf ihre Kinaseaktivität in Gegenwart von Ca2+/CaM und MLC wie unten beschrieben getestet. Die Proteine wurden auf 11% SDS-PAGE laufen gelassen und auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Die unteren und mittleren Abbildungen zeigen die Autophosphorylierung der DAP-Kinase bzw. die MLC-Phosphorylierung, was nach Exposition eines Röntgenfilms zu sehen ist. Das untere Bild zeigt DAP-Kinaseproteine durch Inkubieren desselben Blots mit anti-FLAG-Antikörpern und ECL-Nachweis.
  • 33A–C zeigen, dass die DAP-Kinase Calmodulin bindet und ihre Aktivität durch Calcium/Calmodulin reguliert wird.
  • (33A). Calmodulinüberschichtung auf DAP-Kinase. Das obere Bild zeigt die Ergebnisse der Hybridisierung mit 35S-met markiertem rekombinantem CaM. Das untere Bild zeigt die Ergebnisse der Hybridisierung desselben Blots mit anti-FLAG-Antikörpern, um DAP-Kinaseproteine nachzuweisen.
  • (33B). Ca2+/CaM-Regulation der DAP-Kinaseaktivität. Die DAP-Kinase wurde einem Invitro-Kinasetest, wie unten beschrieben, in Gegenwart und Abwesenheit von Ca2+ und CaM (die Reaktion wurde nach 15 min zum Nachweis der Autophosphorylierung oder nach 2 min zum Messen der MLC-Phosphorylierung gestoppt) unterzogen. Die unteren Bilder zeigen die Ergebnisse der Inkubation mit Anti-FLAG-Antikörpern (in demselben Blot).
  • (33C). Die DAP-Kinase DCaM-Aktivität ist in Abwesenheit von Ca2+ CaM maximal. Die Details sind wie in (33B).
  • 34A & B zeigen, wie die ektopische Expression von DAP-Kinase den Zelltod hervorruft.
  • (34A). HeLa-Zellen (5 × 105 Zellen/Platte) wurden mit 20 μg DNA des pcDNA3-Vektors oder mit DAP-Kinasekonstrukten, die in den gleichen Vektor kloniert waren, transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellkulturen 1:5 aufgeteilt und einer Selektion mit G-418 unterzogen. Nach 2–3 Wochen wurden die Platten mit Kristallviolett gefärbt.
  • (34B). HeLa-Zellen (5 × 105 Zellen/Platte) wurden mit 20 μg DNA des leeren pSBC-bl-Plasmids oder mit dem Vektor, der die Wildtyp-DAP-Kinase trug, transfiziert. Die Zellen wurden für 48 Stunden in Abwesenheit von Tetracyclin wachsen gelassen und mit X-Gal-Lösung gefärbt. Der Anteil der blauen Zellen mit einer apoptotischen runden Morphologie wurde durch Zählen von insgesamt 600 blauen Zellen, die aus 6 verschiedenen Feldern und aus Duplikatstransfektionen kamen, beurteilt. Der Pfeil deutet auf eine transfizierte gefärbte Zelle.
  • 35A & B zeigen, wie eine DAP-Kinase K42A-Mutante HeLa-Zellen vor dem IFN-γ-induzierten Zelltod schützt.
  • (35A). HeLa-Zellen (5 × 105 Zellen/Platte) wurden mit 20 μg DNA des leeren pcDNA3-Vektors oder DAP-Kinase-K42A, die in den gleichen Vektor kloniert war, transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen 1:5 aufgeteilt und einer Selektion mit G-418 und 200 U/ml IFN-γ unterzogen. Nach 2–3 Wochen der Selektion wurden die Platten mit Kristallviolett gefärbt. Bilder wurden unter Lichtmikroskopie unter Verwendung eines Kodak TMXIOO-Films gemacht (Vergrößerung × 40).
  • (35B). Die Anzahl der überlebenden Kolonien pro 1 cm2 wurde gezählt und anhand der Anzahl der Kolonien, die in den G-418-Selektionen erscheinen, die in Abwesenheit von IFN-γ durchgeführt wurden, normalisiert. Die Werte stellen den Mittelwert von zehn repräsentativen Feldern dar.
  • 36A–D illustrieren die Analyse von DAP-Kinaseexpression in verschiedenen hämatopoetischen Zelllinien.
  • 36A und B: Northern-Blotanalyse von PolyA+-RNA aus verschiedenen Zelllinien unter Verwendung von Sonden für DAP-Kinase bzw. c-Abl.
  • 36C und D: Western-Blotanalyse von DAP-Kinaseprotein bzw. Vinculin (als eine nicht verwandte Proteinreferenz).
  • 37 zeigt die Western-Blotanalyse von DAP-Kinase in den Blasenkarzinomzelllinien T24 und HT1376, die mit 5-Azadesoxycytidin behandelt wurden. Proteinextrakte wurden wie folgt geladen: Spur 1 und 4 – T24- bzw. HT1376-Blasenkarzinomzellen nicht behandelt; Spuren 2 und 5 – T24- bzw. HT1376-Blasenkarzinomzellen, behandelt mit 5-Azadesoxycytidin und gesammelt nach 2 Passagen ohne Behandlung. Spur 3 – T24-Blasenkarzinomzellen, gesammelt nach 6 Passagen ohne Behandlung. Dieselben Blots wurden mit Antivinculin und anti-DAP3-Antikörpern zur Reaktion gebracht.
  • 38A–C zeigen, dass das DAP-5 763 bp-Fragment in HeLa-Zellen auf sehr niedrigen Spiegeln im Vergleich zum cDNA-Fragment der Untergruppe I exprimiert wird.
  • 38A. Northern-Blotanalysen von RNA aus pTKO1-260- oder pTKO1-DHFR-transfizierten Zellen. Die RNA wurde aus den angegebenen HeLa-Zellen extrahiert. Der Northern-Blot, der 20 μg Gesamt-RNA-Proben enthielt, wurde mit DAP-5 763 bp-Fragment (#260) hybridisiert. 1. DHFR-t1; 2. 260-t1; 3. 260-t2.
  • 38B. IFN-γ-resistenter Phänotyp von HeLa-Zellen, die mit pTKO1-260 transfiziert waren. HeLa-Zellen wurden entweder mit dem Kontrollvektor pTKO1-DHFR oder mit dem isolierten pTKO1-260 transfiziert. Pools von mehr als 104 unabhängigen Klonen wurden erst durch Hygromycin B selektioniert, um polyklonale Populationen von stabil transfizierten Zellen zu bilden. Diese Klone wurden dann in 9 cm Platten (100.000 Zellen pro Platte) ausplattiert und mit IFN-γ (1000 Einheiten/ml) und Hygromycin B (200 g/ml) doppelt selektioniert. Nach vierwöchiger Selektion wurden die Zellen mit Kristallviolett gefärbt. In Abwesenheit von IFN-γ erreichten diese Platten nach 4 Tagen Konfluenz.
  • 38C. Vergleich der Expressionsspiegel von RNAs aus Untergruppe I und II. 260-t1 und 260-t2 stellen die gleichen Extrakte dar, die in 38A verwendet wurden. Der Northern-Blot, der 20 μg der RNA-Proben enthielt, wurde mit dem BglII-BamHI-Fragment hybridisiert, das das SV-40-Splice- und -Polyadenylierungssignal (Deiss & Kimchi, 1991) enthielt, das Teil der SV-40-Promotor-getriebenen, #260 enthaltenen mRNA ist, die aus dem Episom exprimiert wird. D. Genauso wie in 5C, aber hybridisiert mit einer Sonde, die das Hygromycin B-Resistenzgen, das von dem TK-Promotor getrieben wird, erkennt.
  • 39 zeigt β-Galactosidaseaktivitätstests von HeLa-tTa-Zellen, die mit dem DAP-5 763 bp-Fragment oder seinen mutierten Versionen transfiziert wurden.
  • Stabile polyklonale Populationen, die mit pSBc-bl-Vektor (Kontrolle), mit dem pSBc-bl-260- (260) oder mit dem pSBc-bl-Vektor, die entweder die einfache oder die dreifache ATG #260 Mutante enthielten, transfiziert waren, wurden durch Selektion mit 10 μg/ml Bleomycin etabliert. Nach zwei Wochen wurde der Wirkstoff entfernt und die Kulturen weiter expandiert. Die wachsenden Zellen wurden mit 3% Paraformaldehyd für 5 Minuten fixiert, zweimal mit PBS gewaschen und auf ihre β-Galactosidaseaktivität unter Verwendung von X-Gal als ein Substrat überprüft. Fotografien wurden unter dem Phasenmikroskop unter Verwendung von Kodak Ectachrom 160T durchgeführt.
  • 40A & B zeigen die In-vitro-Translation von dem DAP-5 763 bp-Fragment und die Immunoblotanalyse des Miniproteins in Zellen, die das #260-Fragment exprimieren.
  • 40A. Die In-vitro-Translation von RNA, die von Bluescript-Vektor, der verschiedene DAP-5-Versionen enthielt, transkribiert wurde, wurde in Kaninchenreticulozytenlysaten durchgeführt. Die resultierenden 35S-markierten Proteine wurden auf 12,5% SDS-PAGE fraktioniert. Die Position der radioaktiven Molekulargewichtsmarker (Amersham) ist markiert. 1. Nicht-programmiertes Kaninchenreticulozytenlysat; 2. Volllängen DAP-5 3,8 kb-Klon; 3. DAP-5 763 bp-Fragment (#260); 4. Mutiertes #260-Fragment: ATG an Position 1785 umgewandelt in AAG (einfache ATG-Mutante); 5. Mutiertes #260-Fragment: ATG an Position 2010 wurde in TTC und ATG an Position 2040 in ATC umgewandelt; 6. Dreifache ATG-Mutante, die alle oben genannten Mutationen enthielt. Die Position der translatierten Miniproteine ist durch einen Pfeil markiert; die zusätzlichen höheren Banden sind nicht-spezifischer Hintergrund, der oft auch in nicht-programmierten Reticulozytenlysaten auftritt.
  • 40B. HeLa-tTa-Zellen, die entweder mit dem pSBc-bl-Vektor oder dem pSBc-bl-Vektor, der das #260-Fragment enthielt, transfiziert wurden, wurden lysiert und auf 10% SDS-PAGE fraktioniert, auf Nitrocellulose geblottet und mit affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörpern (1:20 Verdünnung), die gegen ein GST-fusioniertes rekombinantes Produkt hergestellt waren, zur Reaktion gebracht. Die Pfeile zeigen auf die Position der DAP-5-Miniprotein-spezifischen Dublette, die eine ungefähre Größe von 28 kDa hatte.
  • 41A, B, C & D zeigen die Einbeziehung von Cathepsin D-Protease in den IFN-γ-mediierten Zelltod.
  • (41A). Schutz vor IFN-γ-induziertem Zelltod durch Antisense-RNA-Expression. (a) Eine der DHFR-transfizierten polyklonalen Zellpopulationen (Quadrate) und eine der Anti- Cath-D-transfizierten polyklonalen Zellpopulationen (Kreise) wurden mit IFN-γ (1000 U/ml; ausgefüllte Symbole) behandelt oder unbehandelt belassen (offene Symbole). Überlebende Zellen wurden mit Neutralrot gefärbt und die Farbstoffaufnahme bei λ540nm gemessen. Jeder Punkt stellt einen Mittelwert einer Vierfachbestimmung dar. (b) Zwei unabhängige DHFR-transfizierte polyklonale Zellpopulationen (offene und ausgefüllte Quadrate) und zwei Anti-Cath-D-transfizierten polyklonalen Zellpopulationen (offene und ausgefüllte Kreise) wurden mit IFN-γ (1000 U/ml) behandelt oder unbehandelt belassen. Der Anteil der lebenden Zellen wurde durch Vergleich der Neutralrot-Farbstoffaufnahme von IFN-γ-behandelten Zellen mit nicht-behandelten Kulturen zu den angegebenen Zeitpunkten bestimmt. Jeder Punkt stellt einen Mittelwert einer Vierfachbestimmung ± S. E. dar.
  • (41B) Wiederhergestelltes Wachstum von lebensfähigen Zellen nach Entzug von IFN-γ (1000 U/ml) von DHFR- und Anti-Cath-D-Transfektanten. Die Zellen wurden auf eine anfängliche Dichte von 10.000 Zellen/cm2 ausgesät, mit einer Kombination von Hygromycin B und IFN-γ (1000 U/ml) für zwei Wochen behandelt, gewaschen und mit Kristallviolett 7 Tage später gefärbt.
  • (41C) Schutz vor IFN-γ-induziertem Zelltod durch Pepstatin A. Die HeLa-Zellen (DHFR- und Anti-Cath-D-Transfektanten) wurden für 8 Tage mit IFN-γ (1000 U/ml) entweder in Gegenwart von Pepstatin A (10–4 M in 0,2% DMSO) oder in seiner Abwesenheit (nur 0,2% DMSO) inkubiert. Die DHFR-transfizierten Zellen wurden auch auf ihre Antwort auf Pepstatin A in Abwesenheit von IFN-γ getestet. Die Daten sind als Mittelwert der Neutralrot-Farbstoffaufnahme von vier Proben ± S. E. angegeben.
  • (41D) Lichtmikroskopische Aufnahme von HeLa-Zellen an Tag 8 der IFN-γ-Behandlung: (a) DHFR-Transfektanten ohne Inhibitor; (b) Anti-Cath-D-Transfektanten, kultiviert in Gegenwart von Pepstatin A (Vergrößerung, 200 ×).
  • 42A, B, C & D zeigen die Regulation der Expression und das Prozessieren von Cathepsin D-Protease durch IFN-γ und TNF-α.
  • (42A & B) Immunoblotanalyse von Cathepsin D-Formen vor und nach Behandlung mit IFN-γ (1000 U/ml). Die Zelllysate wurden zu den angegebenen Zeitpunkten aus ursprünglichen HeLa-Zellen (A) und aus DHFR- und Anti-Cath-D-Transfektanten (B) hergestellt. Die Proben von 300 μg wurden auf SDS-Polyacrylamidgelen (12%) fraktioniert, auf Nitrocellulose geblottet und unter Verwendung des ECL-Systems (Amersham) nachgewiesen. Die Größe der Cathepsin D-Formen sind gezeigt. Die gleichen Blots wurden mit polyklonalen Antikörpern, die gegen die Kupferzinksuperoxiddismutase (SOD) hergestellt waren, zur Reaktion gebracht, um mögliche Unterschiede in den Proteinmengen in jedem Auftrag zu korrigieren.
  • (42C) Ein Schema, das die verschiedenen Schritte des Cathepsin D-Processings, wie bereits für Rattencathepsin D berichtet (Fujita et al., 1991, BBRC 179: 190–196), zeigt.
  • (42D) Immunoblotanalyse von Cathepsin D-Formen vor (Spur 1) und nach Behandlung von U937 mit TNF-α (Spuren 2 und 3; 24 bzw. 48 Stunden).
  • 43A & B zeigen die Einbeziehung der Cathepsin D-Protease in den Fas/APO-1- und TNF-α-mediierten Zelltod.
  • (43A) Unterdrückung des Fas/APO-1-mediierten Zelltods durch Anti-Cathepsin D-RNA oder durch Pepstatin A. Die HeLa-Zellen (DHFR- und Anti-Cath-D-Transfektanten; 20.000 Zellen pro Mikrotiterplattenvertiefung) wurden anti-APO-1-Antikörper für 40 Stunden, wie unten beschrieben, ausgesetzt. Pepstatin A (10–4 M in 0,2% DMSO) wurde, wo angegeben, zu den DHFR-Transfektanten 20 Stunden vor ihrer Exposition gegenüber anti-APO-1-Antikörpern zugegeben. Die Lebensfähigkeit wurde durch Neutralrot-Tests in vierfachen Proben beurteilt; die Resultate sind ausgedrückt als Prozent der Farbstoffaufnahme am Ende jeder Behandlung, bezogen auf die gesamte Aufnahme in der entsprechenden Kontrollvertiefung, die nicht den Antikörpern ausgesetzt war (100% Lebensfähigkeit).
  • (43B) Pepstatin A stört den TNF-α-induzierten apoptotischen Zelltod in U937-Zellen. Die Zellen wurden in einer Dichte von 2 × 105 Zellen/ml ausgesät, 24 Stunden nach ihrer Vorinkubation mit Pepstatin A (10–4 M in 1% DMSO) oder mit DMSO alleine, wo angegeben, wurde TNF-α (100 U/ml; 10 ng/ml) zugegeben und 6 Stunden später wurden die Proben auf Glasobjektträgern einer Cytozentrifugation unterzogen und mit DAPI (0,5 μg/ml, Sigma) gefärbt. Die Mikroskopie wurde unter Fluoreszenzlichtbedingungen durchgeführt (Vergrößerung 1000 ×). Die Nuklei mit fragmentiertem Chromatin sind durch Pfeile angezeigt; leere Pfeilspitzen deuten auf mitotische Nuklei. Die Daten sind als der Prozentsatz von Zellen mit einer fragmentierten Kernmorphologie ± S. E. dargestellt. Für jede Bedingung wurde ein Minimum von 400 Zellen in 14 getrennten Feldern ausgezählt.
  • 44A, B, C & D zeigen, dass die ektopische Expression von Cathepsin D die Zelllebensfähigkeit reduziert.
  • (44A & B) X-Galfärbung von HeLa-Zellen, die mit lacZ (getrieben von dem CMV-Promotor) und entweder mit der Cathepsin D-cDNA (getrieben durch den Tetracyclin-repremierbaren Promotor) oder mit dem Kontrollvektor co-transfiziert waren. In beiden Fällen wurden die Zellen in Abwesenheit von Tetracyclin kultiviert und 48 Stunden mit X-Gal-Lösung für 3 Stunden gefärbt. Die lichtmikroskopischen Aufnahmen sind gezeigt (Vergrößerung, 200 ×). Beispiele von normalen blaugefärbten Zellen (in A) und von apoptotischen blaugefärbten Zellen (in B) sind durch Pfeile angezeigt.
  • (44C) Der Anteil der blauen Zellen mit einer apoptotischen runden Morphologie wurde durch Zählen von insgesamt 800 blauen Zellen aus vier verschiedenen Feldern, die von Duplikationtransfektionen kamen, (beschrieben in A und B) beurteilt.
  • (44D) Beurteilung der sekretierten alkalischen Phosphatase (SEAP) im Wachstumsmedium von HeLa-Zellen, die mit SEAP und mit entweder dem Kontrollvektor oder dem obigen Cathepsin D-Vektor co-transfeziert waren; jede Transfektion wurde in zwei Platten geteilt, von denen eine sofort mit Tetracyclin (1,5 μg/ml) supplementiert wurde. Die SEAP-Aktivität, die in das Wachstumsmedium während der letzten 5 h der Inkubation sekretiert wurde, wurde 48 Stunden nach der Transfektion bestimmt. Die Daten der SEAP-Aktivität wurden in Duplikaten aus vier Experimenten erhalten. Die Werte geben den Prozentsatz der SEAP-Aktivität an, die in Abwesenheit von Tetracyclin gemessen wurde, bezogen auf die Gesamtaktivität, die in Gegenwart von Tetracyclin produziert wurde.
  • 45A & B zeigen, wie die DAP-Kinase an dem Cytoskelett lokalisiert ist.
  • (45A). SV-80-Zellen, die transient mit DAP-Kinase-K42A transfiziert waren, wurden bei 48 Stunden mit anti-FLAG-Antikörpern und Fluorescein-konjugiertem Phalloidin, wie unten beschrieben, gefärbt. Beide Bilder stellen dasselbe Feld dar (Vergrößerung × 400).
  • (45B). Detergenzextraktion von HeLa-Zellen. HeLa-Zellen wurden mit 0,5% Triton X-100 in eine flüssige Fraktion (Sol) und eine nichtflüssige Fraktion (InSol), wie unten beschrieben, extrahiert. Die Proteinextrakte wurden auf 10% SDS-PAGE getrennt und auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Die Membran wurde mit monoklonalen anti-DAP-Kinase-Antikörpern, anti-Tubulin-Antikörpern und anti-Actin-Antikörpern, wie angezeigt, zur Reaktion gebracht.
  • 46A & B zeigen das Mapping der Region, die für die Bindung an das Cytoskelett verantwortlich ist.
  • (46A). Immunfärbung von rekombinanter DAP-Kinase. COS-Zellen, die mit pECE-FLAG-DAP-Kinase transfiziert waren, wurden mit monoklonalen anti-FLAG-Antikörpern, wie unten beschrieben, immungefärbt (Vergrößerung × 400).
  • (46B). COS-Zellen wurden mit pECE- oder pCDNA3-Vektoren, die entweder DAP-Kinase oder DAP-Kinasedeletionsmutanten trugen, transfiziert. Die Zellen wurden mit 0,5% Triton X-100, wie in 45 beschrieben, extrahiert. Der Nachweis wurde mit anti-FLAG-Antikörpern durchgeführt. Sol – lösliche Fraktion, InSol – Detergenz-unlösliche Fraktion. Eine schematische Darstellung der DAP-Kinasedeletionsmutanten ist links gezeigt.
  • 47A & B zeigen Veränderungen in der Actinorganisation im Cytoskelett bei IFN-γ-induziertem Zelltod und nach ektopischer Expression von konstitutiver DAP-Kinase.
  • (47A). HeLa-Zellen, die auf Deckgläschen kultiviert waren, wurden mit IFN-γ (1000 U/ml) (b) behandelt oder unbehandelt gelassen (a). Nach 4 Tagen wurden die Zellen mit Fluorescein-konjugierten Phalloidin gefärbt (Vergrößerung × 1000).
  • (47B). REF-52-Zellen wurden transient mit DAP-Kinasemutanten wie angegeben transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen dreifach mit anti-FLAG-Antikörpern, Fluorescein-konjugiertem Phalloidin und DAPI, wie unten beschrieben, gefärbt (Vergrößerung × 100). Die Pfeile weisen auf die transfizierten Zellen.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • I. Isolierung von Antisense-cDNAs, die Zellen vor den cytotoxischen Wirkungen von IFN-γ schützen
  • (A) Experimentelle Verfahrensweise
  • (A1) Erhalten von cDNA-Klonen
  • Eine cDNA-Bibliothek (100 μg DNA) wurde aus einer Mischung von mRNAs gebildet, die vor bzw. 1, 2, 4, 12, 24 und 48 Stunden nach Behandlung der HeLa-Zellen mit IFN-γ (200 U/ml) geerntet waren. Sie wurde in Antisenseorientierung in den auf EBV-basierenden pTKO1-Expressionsvektor, der zuvor ausführlich beschrieben wurde (Deiss und Kimchi, supra), kloniert. Die resultierende Expressionsbibliothek von ungefähr 105 unabhängigen Klonen wurde in 8 × 106 HeLa-Zellen (106 Zellen pro 9 cm Platte) durch Calciumphosphattransfektionstechnik eingeführt. Um die Effizienz der Transfektion zu bestimmen, wurde eine Fraktion der Transfektanten mit Hygromycin B (200 μg/ml, Calbiochem) selektioniert. Die resultierende Wirksamkeit war um 5%. Parallel wurde eine Mehrheit der transfizierten Zellen in einer Dichte von 1500 Zellen pro cm2 ausplattiert und sowohl mit Hygromycin B (200 μg/ml) als auch IFN-γ (750 U/ml) selektioniert. Das Selektionsmedium wurde alle 3–4 Tage gewechselt. Nach 28 Tagen wurden die Zellen, die überlebten und/oder in Gegenwart von IFN-γ wuchsen, für 2 Wochen vermehrt und gepoolt. Die extrachromosale DNA wurde gemäß dem Verfahren von Hirt (Hirt, B. (1967) J. Mol. Biol., 26: 365) erhalten, mit dem Restriktionsenzym DpnI geschnitten und in Escherichia coli HB101-Wirtszellen eingeführt. Die Spaltung mit DpnI stellte sicher, dass nur episomale DNA, die sich in HeLa-Zellen repliziert hatte, in das Bakterium transfiziert wurde.
  • Wenige bakterielle Klone wurden nach dem oben dargestellten Verfahren erhalten, das DNA-Antisensesequenzen einschloss, von denen einige wenige in der Lage waren, die Zellen vor den Tod-fördernden Wirkungen von IFN-γ zu schützen.
  • (A2) Klassifizierung der Antisense-cDNA-Klone
  • Plasmid-DNAs wurden aus 10 individuellen Bakterienklonen hergestellt. PCR-amplifizierte cDNA-Inserts wurden aus jedem Plasmid unter Verwendung spezifischer Primer hergestellt, die der Sequenz entsprechen, die unmittelbar an die der cDNA-Insertionsstellen in dem pTKO1-Vektor angrenzt. Die Größe der cDNA-Inserts war im Bereich zwischen 300 und 800 bp. Die PCR-Fragmente wurden als markierte Sonden verwendet, um auf Southern-Blots nach möglicher Kreuzhybridisierung zwischen einigen der geretteten Antisense-cDNA-Klonen zu suchen.
  • (B) Ergebnisse
  • (B1) Klassifizierung von Klonen
  • Die oben genannten 10 cDNA-Klone wurden in sechs distinkte, nicht überlappende Gruppen klassifiziert, von denen einige mehrere Mitglieder (Klone) umfassten und einige nur ein Mitglied aufwiesen. Jene Klone, die für die vorliegende Erfindung relevant sind, sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt:
  • Tabelle 1: Anfängliche Charakterisierung von Antisense-cDNA-Klonen, die aus IFN-γ-behandelten HeLa-Zellen gerettet wurden
    Figure 00320001
  • Die Inserts 230, 254, 255, 264 und 258 der Gruppe 1 schienen komplett identisch miteinander zu sein. Die PCR-Fragmente wurden sequenziert und die Ergebnisse wurden mit Sequenzen verglichen, die in der EMBA-Nukleinsäuredatenbank vorhanden waren. Alle Inserts der Gruppen 1 bis 5 wurden für neu befunden.
  • (B2) Nachweis von mRNA
  • Die DNA-Fragmente, die so erhalten wurden, wurden verwendet, um den Expressionsspiegel von mRNA, die mit diesen Fragmenten hybridisierte, in HeLa-Zellen nachzuweisen und zu bestimmen. 20 μg der gesamten RNA aus den ursprünglichen HeLa-Zellen wurden auf Gelen fraktioniert, geblottet und mit den verschiedenen Sonden zur Reaktion gebracht. Jede Sonde erkannte ein einzelnes mRNA-Transkript einer unterschiedlichen Größe (Tabelle 1). Die Expressionsspiegel von mRNAs, die mit Gruppe 2 reagierten, war niedrig, wohingegen die, die mit Gruppe 1 reagierten, relativ hoch waren.
  • II. Zweite Transfektion durch isolierte Antisense-cDNA
  • Spiegel der Expression von Antisense-RNA in sekundären Transfektanten
  • (A) Experimentelle Vorgehensweise
  • Um sicherzustellen, dass die oben isolierten Antisense-cDNAs zum Schutz der Zellen vor Tod-fördernden Wirkungen von IFN-γ ausreichend waren, wurden subkonfluente Monolayer von HeLa-Zellen mit 40 μg DNA der individuellen geretteten pTKO1-Plasmide (in Duplikaten) transfiziert und einer Einzelselektion auf Hygromycin B unterzogen. Pools von ungefähr 104 Hygromcyin-resistenten Klonen wurden aus jeder Transfektion gebildet und als 6 Duplikate stabiler polyklonaler Populationen gehalten. Die Sensitivität der obigen Klone gegen eine Anwendung von IFN-γ wurde dann bestimmt.
  • Der Vektor pTKO1-DHFR (Deiss und Kimchi, supra), der ein nicht-relevantes Konstrukt trug, diente als Kontrolle. Der Kontrollvektor wurde parallel in HeLa-Zellen eingeführt und produzierte zwei unabhängige polyklonale Populationen stabiler Transfektanten, die mit DHFR-t1 und -t2 bezeichnet wurden.
  • Die doppelsträngigen cDNA-Fragmente aus Konstrukt 230 und 256 (aus Gruppe 1 bzw. 2) wurden als Sonden in Nothern-Blotanalyse verwendet, um mRNA-Transkripte sowohl in nicht-transfizierten als auch transfizierten HeLa-Zellen nachzuweisen. Diese zwei spezifischen cDNA-Inserts wurden durch allgemein übliche, kommerzielle Markierungskits markiert. Sie wurden in BluescriptTM-Vektoren (Stratagene, USA) subkloniert, um die Präparation von cDNA-Inserts und die Herstellung von einzelsträngigen RNA-Sonden hieraus zu erleichtern.
  • (B) Erebnisse
  • Konstrukte 230 (Gruppe 1)
  • Wie in 1A zu sehen ist, hybridisierte das cDNA-Insert in diesem Konstrukt an ein einzelnes endogenes 2,4 Kb mRNA-Transkript und zwar sowohl in nicht-transfizierten als auch transfizierten Zellen. In stabilen Transfektanten, die die Antisense-Konstrukte der Klone 230 und 255 enthielten, wurde ein zusätzliches zusammengesetztes Antisense-Transkript durch diese 230-Sonde nachgewiesen. Es bestand aus 320 Basen des originalen cDNA-Inserts und 800 zusätzlichen Basen der Sequenzen, die aus der Expressionskassette (SV40 early Promotor zusammen mit Sequenzen bis zum Polyadenylierungssignal) stammten. Einer der RNA-markierten Stränge, der von dem BluescriptTM-Vektor hergestellt wurde, hybridisierte ausschließlich mit der endogenen 2,4 Kb mRNA, wohingegen der komplementäre Strang nur mit der 1,1 Kb RNA hybridisierte, was bestätigte, dass die letztgenannte tatsächlich eine Antisense-niRNA ist (Daten nicht gezeigt).
  • Die Menge der Antisense-RNA in den Klonen 230 und 255 überstieg die Sense-mRNA-Spiegel um das 3- bis 6-fache (1A, 1B). Nach IFN-γ-Behandlung war der Spiegel der Antisenseexpression weiter aufgrund der Gegenwart von IFN-γ-stimulierten Responseelementen (ISRE) in dem pTKO1-Vektor (Deiss und Kimchi, supra) erhöht, was zu einem 15-fachen Überschuss des Antisense- über das Sensetranskript führt (1B). Der endogene 2,4 Kb mRNA-Spiegel war weder durch IFN-γ verändert, noch durch die hohe Antisenseexpression beeinflusst.
  • Konstrukt 256 (Gruppe 2)
  • Wie aus den 2A und 2B ersichtlich ist, hybridisierte das Konstrukt des 256 Klons (367 bp in der Größe) auf Northern-Blots mit einem einzelnen endogenen 6,3 Kb mRNA-Transkript, das in allen getesteten Zellen in relativ niedrigen Spiegeln exprimiert wurde. In den 256-t1- und -t2-transfizierten Zellen hybridisierte es auch an eine zusammengesetzte 1,2 Kb RNA, die aus 367 Basen des cDNA-Inserts und 800 Basen der Sequenzen, die aus der Expressionskassette in dem Vektor stammten, bestand (2). Die Antisenseorientierung von Fragment #256 in dem pTKO1-Vektor wurde durch Sequenzieren des SensecDNA-Klons bestätigt (7). Die Menge der Antisense-RNA, die aus dem pTKO1-Plasmid #256 in nicht-behandelten HeLa-Zellen exprimiert wurde, überstieg die Sense-mRNA-Spiegel um mehr als das 100-fache. Darüber hinaus waren die Spiegel der Antisense-mRNA-Expression nach IFN-γ-Behandlung aufgrund der Gegenwart des IFN-stimulierten Responseelements (ISRE) in dem pTKO1-Vektor nach IFN-γ-Behandlung weiter erhöht (3).
  • III. Antwort der mit Antisense-cDNAs transfizierten Zellen auf IFN-γ
  • (A) Experimentelle Vorgehensweise
  • Die polyklonalen HeLa-Populationen, die mit den einzelnen Antisense-cDNAs transfiziert waren, wurden in Gegenwart von sowohl Hygromycin B als auch IFN-γ (750 U/ml) kultiviert. Die Wachstums- und Lebensfähigkeitsparameter wurden bestimmt: (1) Unter dem Lichtmikroskop, (2) durch Elektronenmikroskopie und (3) durch DAPI-Färbung (0,5 μg/ml; Sigma). Für eine genaue Quantifizierung wurde ein Neutralrotaufnahmetest durchgeführt: Die verschiedenen polyklonalen HeLa-Zellpopulationen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen auf eine subkonfluente Zelldichte kultiviert und dann mit IFN-γ (750 U/ml) behandelt oder unbehandelt belassen. Alle Zellen wurden kontinuierlich in einem Hygromycin B-haltigem Medium gehalten, um transfizierte Zellen zu selektionieren. Die beiden DHFR-transfizierten HeLa-Zellpopulationen (t1, t2), die wie oben beschrieben hergestellt waren, dienten als Kontrollkulturen, die die typischen Wachstumssensitivitätskurven gegen IFN-γ zeigten. Die untersuchten Antisense-cDNA-transfizierten Zellen waren 230-t1, 255-t1 (Gruppe 1) und 256-t1, 256-t2 (Gruppe 2). Die lebensfähigen Zellen wurden mit Neutralrot gefärbt und die Farbstoffaufnahme wurde durch Messen der O. D. bei 540 nm in Vierfachbestimmungen während 14 Tagen des Experiments quantifiziert.
  • (B) Ergebnisse
  • Die mikroskopische Prüfung der ursprünglichen und Kontroll-DHFR-transfizierten HeLa-Zellen ergab, dass IFN-γ ein biphasisches Antwortmuster triggerte. Während der ersten vier Tage der IFN-γ-Behandlung stoppten die Zellen mit der Proliferation, aber blieben noch lebensfähig (Trypanblauausschlusstests) und zeigten eine abgeflachte morphologische Charakteristik der cytostatischen Antworten gegen IFN-γ (3A, b). Die Reduktion der Proliferationsgeschwindigkeit während dieser Phase wurde auch durch einen scharfen Abfall (um mehr als 90%) der Thymidinaufnahme in die DNA gemessen (nicht gezeigt). Auf diesen Typ des IFN-γ-induzierten Proliferationsstopps folgte dann ein massiver Zelltod, der in einer nicht-synchronisierten Weise über eine Dauer von zusätzlichen 10 Tagen erfolgte. Die Zellen reduzierten schrittweise ihre Größe, rundeten sich ab und lösten sich von den Platten (3A, d). Ein Färben der DNA mit DAPI nach dem Ablösen der Zellen von dem Substrat ergab massive Veränderungen in der nukleären Morphologieeigenschaft von programmiertem Zelltod. Dies schloss nukleäre Pyknose, Chromatinkondensation, manchmal nachgewiesen insbesondere in der nukleären Peripherie, und Chromatinsegmentierung ein (3B, b). Transmissionselektronsmikroskopische Aufnahmen von IFN-γ-behandelten Zellen vor ihrer Ablösung ergaben andere morphologische Veränderungen einschließlich dem Verschwinden von Oberflächenmikrovilli, Oberflächenblasenbildung, Ausknospung von cytoplasmatischen Vorsprüngen und cytoplasmatischer Disintegration zusätzlich zu nukleärer Pyknose und Chromatinkondensation (Details in 3C, d gezeigt). Die Antisense-RNA-Expression aus dem pTKO-1-Plasmid der Gruppe 1 reduzierte die Empfänglichkeit der Zellen gegenüber den abtötenden Wirkungen von IFN-γ: Es überlebten mehr Zellen auf den Platten und die oben genannten, mit dem Tod assoziierten morphologischen Veränderungen traten zu einem sehr viel geringeren Ausmaß ein (Vergleichen Sie die rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen der IFN-γ-behandelten DHFR-transfizierten Zellen in 3C, b mit den IFN-γ-behandelten 230-t1-Zellen in 3C, f). Ähnliche mikroskopische Beobachtungen, die den Schutz vor dem IFN-γ-induzierten Zelltod zeigen, wurden auch in Hinblick auf drei andere Klone aus den vorgenannten Gruppen von Antisense-cDNAs, nämlich 2–6, gemacht (siehe unten).
  • Ein Neutralrotaufnahmetest wurde dann durchgeführt, um auf einer quantitativen Basis sowohl die typischen biphasischen Antworten der Kontrollkulturen auf IFN-γ als auch die induzierte Empfänglichkeit der Antisense-exprimierenden Kulturen auf den IFN-γ-reduzierten Zelltod genauer zu bestimmen. Die zwei DHFR-transfizierten HeLa-Zellpopulationen (t1, t2) dienten in diesem Test als die Kontrollkulturen und die Antisense-cDNA-transfizierten Zellen, die untersucht wurden, waren die 230-t1, 255-t1 (Gruppe 1) (4A) und 256-t1, 256-t2 (Gruppe 2) (4B). In Abwesenheit von IFN-γ verhielten sich alle transfizierten HeLa-Zellen gleich und zeigten praktisch identische Wachstumskurven, was nahelegt, dass die Antisense-RNA-Expression keine Wirkungen auf das normale Wachstum der Zellen hatte. Ein weiteres Merkmal, das nicht durch die Antisense-RNA-Expression verändert war, war das Ausmaß der cytostatischen Antworten auf IFN-γ. Wie in 4A und 4B gezeigt, reduzierte IFN-γ die Proliferationsgeschwindigkeit aller transfizierten Kulturen in ähnlicher Weise und alle zeigten das gleiche Ausmaß der Reduktion der Neutralrotfarbstoffaufnahme während der ersten vier Tage (bevor der Zelltod beginnt, mikroskopisch beobachtbar zu werden). Nach 4 Tagen der Behandlung veränderte sich das Bild dramatisch. Während fast alle Kontrollzellen während den nachfolgenden Tagen der IFN-γ-Behandlung starben, was zu minimalen Werten der Neutralrotfarbstoffaufnahme am Tag 14 führte, überlebte ein signifikanter Anteil der Zellen, die Antisense-RNA exprimierten, in Gegenwart von IFN-γ, was durch die verbliebenen Werte der Farbstoffaufnahme widergespiegelt wird. Die Widerstandsfähigkeit gegen die IFN-γ-induzierte Zellabtötung war in allen vier getesteten Kulturen, die die zwei verschiedenen Antisense-RNAs exprimierten, sehr ähnlich (4A, 4B). Diese Daten zeigen, dass die Expression von Antisense-RNA aus den Gruppen 1 und 2 die HeLa-Zellen ausschließlich vor dem IFN–-induzierten Zelltod schützt und nicht vor seiner cytostatischen Wirkung. Bemerkenswerterweise beeinflusste die Antisense-RNA-Expression die frühen biochemischen Schritte der Signalweiterleitung von IFN-γ nicht, was aus der normalen RNA-Induktion durch IFN-γ des 2–5-A-Synthasegens in diesen transfizierten Zellen geschlossen werden konnte (4C). Zusammenfassend kann geschlossen werden, dass von allen getesteten Kriterien nur die Tod-induzierenden Wirkungen von IFN-γ durch die Antisense-RNA-Expression unterbrochen wurde.
  • IV. Antworten der mit Antisense-RNA-Konstrukten transfizierten Zellen auf nekrotischen Zelltod
  • In diesem Stadium wurde es interessant zu prüfen, ob die Antisense-RNA-Expression die HeLa-Zellen auch vor einem nekrotischen Typ des Zelltods schützt. Hierzu wurde die Wirkung von TNF-, das in Kombination mit Cycloheximid (CHX) zugegeben wurde, auf verschiedene HeLa-Zellpopulationen getestet. In Gegensatz zu der Wirkung von IFN-γ war der Zelltod, der durch TNF-α + CHX in HeLa-Zellen induziert wurde, sehr schnell (50% Abtötung nach 3 Stunden) und zeigte typische Eigenschaften von Nekrose wie zum Beispiel ein Anschwellen der Zellen vor ihrer Lyse. Wie in Tabelle 2 gezeigt, gab es keinen Schutz vor dem TNF-α-induzierten nekrotischen Zelltod, wohingegen die Antisense-RNA-Expression der Gruppen 1 und 2 die Zellen vor der IFN-γ-induzierten Zellabtötung schützte. Alle untersuchten HeLa-Zelltransfektanten wurden durch die Kombination von TNF + CHX mit einer ähnlichen Zeitkinetik und der gleichen Wirksamkeit abgetötet. Northern-Blotanalysen zeigten, dass die Spiegel der AntisensemRNA-Transkripte in 256-t1-Zellen durch die TNF + CHX-Behandlung nach 5 Stunden nicht reduziert waren (nicht gezeigt), was die Möglichkeit ausschließt, dass ein Verlust der Antisense-RNA-Expression, die durch die Behandlung verursacht wird, der Grund für den Mangel der Schutzwirkungen vor dem nekrotischen Zelltod sein kann. Dies legt weiterhin eine gewisse Spezifität des Schutzmechanismus im Hinblick auf den Typ der Zellabtötung nahe.
  • Tabelle 2: Die Expression von Antisense-RNA (der Gruppen 1 und 2) schützt vor dem IFN-γ-induzierten programmierten Zelltod, aber nicht vor dem TNF-induzierten nekrotischen Zelltod. (A = 540 nm).
    Figure 00370001
  • Jede Behandlung wurde in Vierfachbestimmungen durchgeführt und die Mittelwerte der Farbstoffaufnahme, die durch die OD bei 1 = 540 nm gemessen wurde, ist zu den angegebenen Zeitpunkten dargestellt. Die SD war zwischen 2–4%. N. D., nicht durchgeführt.
  • V. Klonieren der DAP-1-cDNA und Bestimmung der Aminosäuresequenz
  • Eine HL-60-cDNA-Bibliothek, die in dem λgt10-Vektor konstruiert wurde, wurde mit dem cDNA-Insert von pTKO1-230 gescreent. Zwei unabhängige Klone, λ1 und λ2, die fast vollständig überlappten und cDNA-Inserts von ungefähr 2,3 Kb trugen, wurden analysiert. Der λ1-cDNA-Klon umfasste die 5'-untranslatierte Region, (eine) kurze kodierende Regionen) und eine relativ lange 3'-untranslatierte Region, die mehr als 60% des cDNA-Klons bildete (5).
  • Die Nukleotidsequenz der cDNA, die von λ1 getragen wurde, und ihr vorhergesagtes Aminosäuremuster sind in 6 dargestellt. Diese cDNA ist 2232 bp lang und enthält ein potentielles Polyadenylierungssignal ATTAAA an ihrem 3'-Ende. Der offene Leserahmen (Open Reading Frame; ORF) ist sehr kurz und beginnt bei dem Startkodon an den Nukleotidpositionen 160–162 und endet bei dem Stoppkodon TGA an den Positionen 466–468. Dem ORF voraus geht eine extrem GC-reiche 5'-untranslatierte Region, die potentiell ein Protein kodiert, das aus 102 Aminosäuren mit einem berechneten MW von 11,2 kDa besteht. Die Aminosäurezusammensetzung sagt ein basisches Protein voraus (isoelektrischer Punkt = 10), welches Prolin-reich ist (15%) und das zwei Blöcke von geladenen Resten zeigt, einer in der Mitte und der andere an dem 3'-Ende des Proteins. Der hohe Prolingehalt mag eine gewisse Anomalie in der Migration des Proteins auf Gelen verursachen. Die Suche nach Motiven („Motifs"-Programm; GCG Softwarepaket) zeigte, dass das Protein zwei potentielle Stellen für den Fall einer Kinase II-Phosphorylierung an den Positionen 3 und 36, eine einzelne potentielle Proteinkinase C-Phosphorylierungsstelle am C-Terminus (Position 91) und eine Konsensusphosphorylierungsstelle der cdks an Position 51 enthält. Zusätzlich enthält das Protein die Konsensussequenz RGD an Position 65–67, ein Tripeptid, das in einigen Proteinen eine Rolle bei der Zelladhäsion spielt und ein potentielles SH3-Bindemotiv, SPSPP, an Position 49–53 (Cowburn (1994) Struc. Biol. 1, 489–491). Es wurden keine Anzeichen für die Anwesenheit eines Signalpeptids oder einer Transmembran-Domäne gefunden (SAPS-Vorhersage; Brendel et al., (1992) PNAS USA, 89: 2002–2006). Die Aminosäuresequenz zeigte keine signifikante Homologie mit bekannten Proteinen.
  • Fragment #230 wurde als eine Sonde für Southern-Blots verwendet, die humane genomische DNA enthielten, die mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut war, die sie nicht schnitten. Eine einzelne Bande wurde nach Hybridisierung mit DNA, die mit EcoR1, BamH1, Pst1 und Xba1 geschnitten war, sichtbar gemacht, was die Existenz eines Gens in einer einzigen Kopie nahelegt (nicht gezeigt). Dieses neue Gen wurde DAP-1 (Death Associated Protein-1; Tod-assoziiertes Protein-1) genannt.
  • In-vitro-Translationstests in Reticulozytenlysaten bestätigten, dass der vorhergesagte offene Leserahmen für das 15 kDa Hauptprotein, das von dem klonierten 2,4 Kb Transkript translatiert wurde, kodiert. Sowohl das Volllängen-cDNA-Insert als auch vier Subklone, die vier verschiedene Regionen des Moleküls überspannten (d.h. p6, p5, p8 und p4; siehe 5) wurden transkribiert und in vitro translatiert. Von allen getesteten Subklonen steuerte nur der 5' 1 Kb-Teil der DAP-1-cDNA (p6) die In-vitro-Synthese der Proteine (1C). Das translatierte Hauptprodukt wanderte auf Gelen als ein 15 kDa Protein. Eine Mutation am ATG-Kodon an Position 160-162 (ATG zu GGC) schaltete die Synthese des 15 kDa-Proteins vollständig aus, was bestätigte, dass die Position der Startpunkt dieses Proteins ist (Daten nicht gezeigt). Zusätzlich zu dem 15 kDa Proteinprodukt wurde auch ein zweites Protein von 22 kDa mit geringerer Effizienz aus λ1 und den p6-cDNAs translatiert (1C). Seine Translation wurde durch die Ausschaltung des ATG-Kodons bei Position 160 nicht beeinflusst, aber das Protein wurde auf eine Größe von 16 und 18 kDa nach Spaltung des p6-Subklons mit Dra1- bzw. BstY1-Restriktionsendonukleasen verkürzt (nicht gezeigt; zur Restriktionskarte siehe 5). Diese Kriterien passen zu einem anderen potentiellen offenen Leserahmen, der in der Nukleotidsequenz bezogen auf den ersten Leserahmen in einer anderen Phase nachgewiesen wurde (6). Er startet bei dem ATG-Kodon (Positionen 287–289) und endet bei dem Stoppkodon TGA (Positionen 816–818). Er kann ein Protein kodieren, das aus 176 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 19,9 kDa besteht und das keine signifikante Homologie mit einem bekannten Protein hat.
  • Um die Expression des DAP-1-Hauptproteins in Zellen zu analysieren, wurden polyklonale Kaninchenantikörper gegen das bakteriell produzierte 15 kDa Protein hergestellt. Die affinitätsgereinigten Antikörper erkannten auf Immunoblots zwei nahe beieinander wandernde Proteine in Extraken von HeLa-Zellen; die niedrigere Bande wanderte auf den Gelen zusammen mit dem bakteriell produzierten 15 kDa DAP-1-Protein. Die langsamer wandernde Form kann eine post-translational modifizierte Version des Proteins darstellen. In den HeLa-Zelltransfektanten 230-t1 und 255-t1, die erhöhte Spiegel von Antisense-RNA exprimieren, die sich in Gegenwart von IFN-γ entwickeln (Verhältnis 15 zu 1), waren die DAP-1-Proteinspiegel auf 75% bzw. 78% im Vergleich zu den DHFR-transfizierten Kulturen erniedrigt (1D). Die zwei oberen nicht-spezifischen Banden (die nicht mit einem Überschuss von bakteriell produzierten DAP-1 kompetetiert werden konnten) wurden von der Antisenseexpression nicht beeinflusst, was die Selektivität der Wirkung bestätigt.
  • VI. Klonierung von DAP-2 und Bestimmung der Aminosäuresequenz
  • Wie oben erwähnt, zeigten Expressionsstudien, dass das doppelsträngige cDNA-Fragment #256 (367 bp Größe) auf Northern-Blots an ein endogenes 6,3 Kb mRNA-Transkript hybridisierte. Das gleiche einzelne 6,3 Kb mRNA-Transkript wurde in HeLa-(ursprüngliche und Transfektanten) und in K562-Zellen nachgewiesen, wenn die Volllängen-cDNA (siehe unten) als eine Sonde auf Northern-Blots verwendet wurde (2B). Das cDNA-Insert aus pTKO1-256 wurde daher verwendet, um eine K562-cDNA-Bibliothek zu screenen.
  • Ungefähr 4 × 106 pfu wurden mit dem #256 cDNA-Insert gescreent und 40 positive Klone nach zwei Runden von aufeinander folgenden Walkingscreens isoliert. Das Sequenzieren wurde auf einem „Applied Bio-systems DNA sequencer 373 A" durchgeführt. Die Einzigartigkeit der Sequenz und ihre Verwandtschaft wurden unter Verwendung von FASTA (GCG Softwarepaket) auf Nukleotidniveau und FASTA-, BLASTP- und BLOCKS-Programmen auf Aminosäureniveau bestimmt (S. Henikoff und J. G. Henikoff, Nucleic Acids Res. 19, 6565 (1991).
  • Zwei Klone, λ29 und λ32, wurden zum Sequenzieren ausgewählt (7). Die resultierende zusammengesetzte Sequenz der beiden cDNAs bestand aus 5886 Nukleotiden und enthielt einen Poly-A-Schwanz, der bei Position 5872 begann, und ihm voran liegen zwei Polyadenylierungssignale AATAAA (8). Die 3'-untranslatierte Region enthält auch zwei ATTTA-Instabilitätsmotive, die in den 3'-nichtkodierenden Teilen von kurzlebigen mRNAs gefunden werden (G. Shaw und R. Kamen, Cell 46, 659 (1986)). Die mRNA enthält einen einzelnen langen offenen Leserahmen, der bei Position 337 beginnt, bei Position 4605 endet und potentiell ein Protein mit 1423 Aminosäuren kodiert (8). Das berechnete Molekulargewicht des Proteinprodukts beträgt ungefähr 160 kDa. affinitätsgereinigte polyklonale Antikörper wurde gegen das N-terminale 20 Aminosäureumfassende Peptid des Proteins hergestellt. Diese Antikörper erkannten ein 160 kDa umfassendes rekombinantes Protein auf Immunoblots, das in COS-1-Zellen nach Transfektion mit einem Vektor produziert wurde, der die gesamte kodierende Region der cDNA exprimierte (2D). Diese Antikörper reagierten in HeLa-Zellen mit einem endogenen Protein der gleichen Größe. In den Antisense-RNA-exprimierenden Zellen, 256-t1 und 256-t2, waren die Gleichgewichtsspiegel des 160 kDa-Proteins 10- und 5-fach niedriger als in den DHFR-Kontrollzellen, wohingegen ein nicht-verwandtes Protein, Vinculin, ähnliche Expressionsspiegel in allen HeLa-Zelltransfektanten zeigte (2D). Folglich resultierte die Expression von Antisense-RNA aus pTKO-1-Plasmid #256 in HeLa-Zellen in einer signifikanten Reduktion der Menge des entsprechenden Proteins.
  • Wir waren in der Lage, einige bekannte Domänen und Motive zu definieren, die in diesem Protein vorhanden sind. Sein äußerster N-Terminus ist aus einer Proteinkinasedomäne zusammengesetzt, die 255 Aminosäuren von Position 13–267 umfasste. Auf der Grundlage ihrer Struktur ist sie wahrscheinlich eine Proteinkinase vom Serin/Threonintyp mit einer klassischen Zusammensetzung von XI Subdomänen, wobei alle konservierten Motive vorhanden sind (8) (S. K. Hanks und A. M. Quinn, Methods Enzymol. 200, 38 (1991)). Diese neue Kinase wurde DAP-2 oder DAP-Kinase (Death Associated Proteinkinase; Tod-assoziierte Proteinkinase) genannt.
  • Die Kinasedomäne gehört zur Familie der Calmodulin-abhängigen Kinasen. Die Homologie zu bekannten Kinasedomänen, die diese Gruppe bilden, einschließlich der Myosin leichten Kettenkinasen, liegt im Bereich zwischen 34%–49% (9A). Drei Hauptunterschiede unterscheiden die Kinasedomäne der DAP-Kinase von anderen Mitgliedern der Calmodulin-abhängigen Kinasefamilie: 1) Subdomäne II ist relativ lang und hat einen Abschnitt basischer Aminosäuren (KKRRTKSSRR); 2) Subdomäne III ähnelt den der Zellzyklus-abhängigen Kinasen am meisten (9B). Interessanterweise sind die typischen Sequenzen der Zellzyklus-abhängigen Kinasen (PSTAIRE, PSSALRE, PCTAIRE, KKIALRE) in Subdomäne III lokalisiert; und 3) Subdomäne VII ist extrem kurz und besteht nur aus 7 Aminosäuren.
  • Unmittelbar stromabwärts der Kinasedomäne gibt es einen zusätzlichen Abschnitt der Homologie, der in fast allen Mitgliedern der Familie der Calmodulin-abhängigen Kinasen vorhanden ist und an der Calmodulin-Erkennung und -Bindung beteiligt ist; (B. P. Herring, J. T. Stull, P. J. Gallagher, J. Biol. Chem. 265, 1724 (1990); M. O. Shoemaker et al., J. Cell. Biol. 111, 1107 (1990); F. H. Cruzalegui et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 89, 12127 (1992)). Stromabwärts der Calmodulin-Erkennungsdomäne wurde eine Ankyrin-Repeatdomäne identifiziert, die 265 Aminosäuren von Position 365 bis 629 umfasste. Sie ist zusammengesetzt aus 8 Repeats von jeweils 33 Aminosäuren, die nicht durch Spacer getrennt sind, außer einem einzelnen Prolinrest, der drei N-terminate Repeats von fünf C- terminalen trennt (8 und 9C). Die Ankyrin-Repeats sind in die Protein-Protein-Wechselwirkungen bei einer Vielzahl von Proteinen einbezogen (P. Michaely und V. Bennett, Trends in Cell Biology 2, 127 (1992)), wurden aber bisher nicht im Zusammenhang mit Serin/Threoninkinasen beschrieben. Eine Tyrosinkinase, die Ankyrin-Repeats trägt, wurde bisher in Hydra vulgaris identifiziert (T. A. Chan et al., Oncogene 9, 1253 (1994)). In der DAP-Kinase könnten die 8 Ankyrin-Repeats die Wechselwirkung eines putativen Effektors oder eines regulatorischen Moleküls vermitteln oder die Substratselektivität und/oder Stabilität der Kinase-Substrat-Wechselwirkungen beeinflussen.
  • Unmittelbar stromabwärts der Ankyrin-Repeats sind zwei aufeinanderfolgende potentielle P-Loopmotive, ALTTDGKT und GHSGSGKT, die durch die Konsensussequenz, G[A]XXXXGKT[S], identifiziert wurden. Der Vergleich von möglichen P-Loopmotiven der DAP-Kinase mit entsprechenden Konsensussequenzen in sieben ATP- oder GTP-bindenden Proteinfamilien zeigt, dass nur der 3'-P-Loop eine gewisse Ähnlichkeit mit P-Loopkonsensussequenzen von Elongationsfaktoren, ATP-Synthase b-Untereinheiten und Thymidinkinase zeigt. Tatsächlich könnte ein Abschnitt von 33 Aminosäuren nach dem achten Ankyrin-Repeat, der den putativen 5'-P-Loop umfasst, einen neunten Ankyrin-Repeat darstellen, der weniger stark konserviert ist als andere. Die DAP-Kinase trägt auch viele potentielle Stellen für post-translationale Modifikationen und hat weder eine Transmembran-Domäne noch ein Signalpeptid. Die Suche in der Prosite-Bank unter Verwendung des Programmmotivs (GCG Softwarepaket) ergab, dass das DAP-Kinaseprotein eine Konsensussequenz für die C-terminale Amidierungsstelle an Position 1376 enthält (dies legt nahe, dass 47 C-terminale Aminosäuren von einem Körperprotein abgespalten werden können). Es enthält auch Konsensussequenzen für sechs N-Glykosylierungsstellen und potentielle Phosphoryrierungsstellen für cAMP-abhängige Kinase (sechs), Caseinkinase II (achtundzwanzig) und Proteinkinase C (zwanzig).
  • Zusammengefasst legt die abgeleitete Aminosäuresequenz der DAP-Kinasen nahe, dass ein sehr einzigartiger Typ einer Calmodulin-regulierten Serin/Threonin-Kinase gerettet wurde. Die Kombination von Serin/Threonin-Kinasedomäne, Ankyrin-Repeats und zusätzlichen möglichen ATP/GTP-Bindungsstellen außerhalb der Kinasedomäne in einem Protein (10) wurde zuvor noch nicht beschrieben. Eine Größe von 160 kDa ist bei Serin/Threonin-Kinasen selten und die DAP-Kinase ist tatsächlich die größte bisher bekannte Calmodulin-abhängige Kinase. Die Fähigkeit der DAP-Kinase zur Bindung von Calmodulin, die kürzlich in Hefe in einem Zwei-Hybridsystem bestätigt wurde (nicht gezeigt), ist mit der Vorstellung konsistent, dass in vielen Fällen der programmierte Zelltod Ca2+ abhängig ist (S. Sen, Biol. Rev. Camb. Philo. Soc. 67, 287 (1992); S. Lee, S. Christakos, M. B. Small, Curr. Opin. Cell. Biol. 5, 286 (1993)). Weiterhin wurde kürzlich berichtet, dass Calmodulinantagonisten die Glukocorticoid-induzierte Apoptose inhibieren (D. R. Dowd, D. P. Mac, B. S. Komm, M. R. Haussler, R. Miesfeld, J. Biol. Chem. 266, 18423 (1991)) und dass Inhibitoren der Myosin leichten Kettenkinasen den TNF-induzierten apoptotischen Zelltod blockieren (S. C. Wright, H. Zheng, J. Zhong, F. M. Torti, J. W. Larrick, J. Cell. Biochem. 53, 222 (1993)).
  • Um zu verifizieren, dass DAP-2 tatsächlich eine Kinase ist, wurden COS-Zellen transient mit einem Expressionsvektor (PECE-FLAG) transfiziert, der ein Fragment der λ29-cDNA trägt, die die gesamte kodierende Region (von dem vorgenannten Start ATG bis zu der ersten EcoR1-Stelle am 3'-Ende) umfasst. Zelllysate wurden durch monoklonale anti-FLAG-Antikörper immunpräzipitiert und die gewaschenen Immunpräzipitate wurden in Gegenwart von Calmodulin und Ca2+ auf In-vitro-Autophosphorylierung untersucht. Wie in 2C gezeigt, erschien eine einzelne phosphorylierte Bande von 160 kDa nach Fraktionierung der In-vitro-Reaktionsprodukte auf den Polyacrylamidgelen. Dieses Experiment stellt einen ersten direkten Beweis dar, dass das rekominante Protein intrinsische Kinaseaktivität besitzt, wie dies aufgrund der vorhergesagten Struktur vermutet wurde.
  • VII. Beurteilung der In-vitro-DAP-Kinaseaktivität
  • (A) Experimentelle Vorgehensweise
  • 1. Zellkultur
  • Die humanen epithelialen HeLa-Karzinomenzellen, COS-7-Affennierenzellen, SV-80-Zellen (humane Fibroblasten, die mit SV0-40 großem T-Antigen transformiert waren) und REF-52-Rattenembryofibroblasten wurden in DMEM (BioLab), das mit 10% FCS (Gibco), 4 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin supplementiert war, kultiviert. HeLa-tTA wurden in Gegenwart von 200 μg/ml G-418 wachsen gelassen (Gossen und Bujard, 1992). Die Transfektionen wurden durch Standardcalciumphosphattechnik durchgeführt. Rekombinantes humanes Interferon-γ (3 × 107 U/ml) wurde von PeproTech bezogen. Nocodazol wurde von Sigma bezogen, Latronculin A war eine Gabe von A. D. Bershadsky des Weizman Institutes, Rehovot, Israel.
  • 2. Plasmidkonstruktion
  • DAP-Kinaseexpressionskonstrukte für transiente Transfektionen in SV-80-, REF-52- oder COS-Zellen und für stabile Transfektionen in HeLa-Zellen wurden entweder in dem pECE-Vektor (Deng & Karin, 1993) oder dem pCDNA3-Vektor (In Vitrogen) hergestellt. In allen Konstrukten waren die DAP-Kinasesequenzen mit dem FLAG-Epitop an ihrem N-Terminus mit einem Tag versehen. In C-terminalen Deletionskonstrukten waren die DAP-Kinasesequenzen mit dem FLAG-Epitop über die Nde-I-Restriktionsstelle fusioniert, die am Startkodon ATG durch Oligonukleotid-spezifische Mutagenese eingeführt war. In anderen Konstrukten waren die DAP-Kinasesequenzen über die entsprechenden Restriktionsstellen an das FLAG-Epitop fusioniert. C-terminale Deletionskonstrukte: 1–1271, 1–835, 1–641 und 1–305, – wurden durch Verdau der DAP-Kinase-cDNA mit HindIII (nt 4146), XbaI (nt 2838), BglII (nt 2256) bzw. EcoRV (nt 1247) hergestellt. Das Volllängen-DAP-Kinase-cDNA-Konstrukt erreicht die EcoRI-Schnittstelle bei Position 4932 der 3'-UTR. Die DAP-Kinaseexpressionskonstrukte 305–641, 641–835 und 641–1423 enthalten cDNA-Fragmente, die durch doppelten Verdau mit EcoRV und BglII (nt 1247–2256), BglII und XbaI (nt 2256–2838) bzw. durch Verdau mit BglII (nt 2256–4827) erhalten wurden. Drei DAP-Kinasemutanten: K42A, CaM und Cyto wurden unter Verwendung von Nukleotid-spezifischer Mutagenese mit den 5'-GTATCCCGCCGCATTCATCAAGA-3', 5'-CAGCATCCCTGGATCAAGTCCAGAAGTAACATGAGT-3' bzw. 5'-AAGACGGCAGAAGATCTAGAAGAGCCCTAT-3' Oligonukleotiden hergestellt. Alle Nukleotidnummerierungen sind gemäß X76104 angegeben.
  • Die DAP-Kinase wurde in HeLa-Zellen aus dem mit Tetracyclin unterdrückbaren Promotor als bicistronische Message mit den LacZ-Sequenzen transient exprimiert. Die DAP-Kinasesequenz war mit dem HA-Epitop am N-Terminus über die NdeI-Schnittstelle, die am Startkodon ATG eingeführt war, mit einem Tag versehen. Der Vektor zur Expression der bicistronischen DAP-Kinase-LacZ-Message wurde durch Insertion des BH-LacZ-Fusionsgen aus pUT535-Vektor (Cayla) in die Not I-Schnittstelle des pSBC-Vektors (Korchhoff et al., 1995) hergestellt. Der resultierende Vektor wurde pSBC-bl genannt.
  • (B) Ergebnisse
  • Die abgeleitete Aminosäurestruktur des DAP-Kinaseproteins sagt wenige funktionale Motive und Domänen, wie in 31 dargestellt, voraus. Der Aminoterminus ist aus einer Proteinkinasedomäne des Serin/Threonintyps (Deiss et al., 1995) zusammengesetzt, der 255 Aminosäuren von Position 13 bis 267 umfasst. Um die Kinaseaktivität zu messen, wurde ein In-vitro-Immunkomplexkinasetest für DAP-Kinase entwickelt. Mit FLAG-Tag versehene Wildtyp-DAP-Kinase oder DAP-Kinasemutanten wurden transient in COS-Zellen exprimiert. Die DAP-Kinaseproteine wurden durch die anti-FLAG-Antikörper immunpräzipitiert und einem In-vitro-Kinasetest in Gegenwart von 0,5 mM Ca2+ und 1 mM rekombinantem Calmodulin (CaM) unterzogen. Zwei mutierte Versionen der DAP-Kinase wurden in diesem Experiment verwendet: eine C-terminal trunkierte DAP-Kinase, der die letzten 152 Aminosäuren – eine Region, die die Toddomäne und den Serin/Threonin-reichen Abschnitt der Aminosäuren (Feinstein et al., 1995) (genannt DAP-Kinase 1–1271 – DD; 31) enthält – fehlen, und eine Mutante, in welcher ein konserviertes Lysin in der Kinasesubdomäne II (an Position 42) durch Alanin ersetzt wurde (DAP-Kinase K42A). Von der letzteren Mutation wurde in anderen Kinasen gezeigt, dass sie die Phosphotransferreaktion beeinflusst, was zu einem katalytisch inaktiven Protein führt (Hanks & Quinn, 1991).
  • Wie aus 32 ersichtlich wird, wurde das rekombinante DAP-Kinaseprotein, das in dem Immunkomplex vorhanden war, in vitro phosphoryliert, was in einer bedeutenden 32P-markierten Bande bei der erwarteten Größe resultierte. Im Gegensatz dazu wurde die mutierte DAP-Kinase K42A nicht phosphoryliert, was nahelegt, dass die Mutation tatsächlich das Enzym inaktivierte und dass die Markierung der DAP-Kinase aus einer Autophosphorylierung resultierte. Die Homologie der Kinasedomäne der DAP-Kinase zu der Myosin leichten Kettenkinase (Myosin Light Chain Kinase; MLCK) (Deiss et al., 1995) veranlasste die Testung der Myosin leichten Kette (Myosin Light Chain; MLC) als ein potentielles exogenes Substrat für die In-vitro-DAP-Kinasetests. Aus 32 wird ersichtlich, dass die DAP-Kinase, aber nicht ihre katalytisch inaktive Mutante (DAP-Kinase K42A), die MLC unter den In-vitro-Kinasetestbedingungen phosphoryliert. Die trunkierte DD-Mutant, DAP-Kinase 1-1271, war sowohl zur Autophosphorylierung als auch zur Phosphorylierung der MLC in der Lage. Dies zeigt erstens, dass die Region des C-Terminus, insbesondere der am meisten terminal gelegene Aminosäureabschnitt, der Serin- und Threonin-reich ist (Feinstein et al., 1995), entweder nicht Gegenstand der Autophosphorylierung ist oder sehr wahrscheinlich nicht das einzige Ziel für diese Aktivität ist; und zweitens, dass die 152 C-terminalen Aminosäuren nicht an der Erkennung der MLC als ein Substrat beteiligt sind. Die Menge des rekombinanten DAP-Kinaseproteins, das in jedem Immunkomplex vorhanden war, wurde durch Reagieren der Blots mit anti-FLAG-Antikörper nach Sichtbarmachung der 32P-Signale bestimmt (32).
  • VIII. Die DAP-Kinase ist eine Calmodulin-regulierte Serin/Threoninkinase.
  • (A) Experimentelle Vorgehensweise
  • 1. Calmodulinüberschichtung
  • Die Transfektion in COS-Zellen, Herstellung von Zelllysaten, SDS-PAGE und der Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Deiss et al., 1995). Proteinextrakte (300 μg pro Spur) aus COS-Zellen, die nicht transfiziert oder mit FLAG-DAP-Kinase oder DAP-Kinasemutanten transfiziert waren, wurden auf 7,5% SDS-PAGE laufen gelassen und auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Die Membran wurde für 30 Minuten in Calmodulinbindepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2), enthaltend 1% fettfreies Trockenmilchpulver vorinkubiert. Rekombinantes 35S-markiertes Calmodulin (Baum et al., 1993) wurde supplementiert und die Membran für 16 h einem vorsichtigem Schütteln bei Raumtemperatur unterzogen, dreimal (jeweils 5 Minuten) in Calmodulinbindepuffer gewaschen, getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Der Nachweis der FLAG-DAP-Kinase wurde unter Verwendung von anti-FLAG-Antikörpern (1:500; IBI, Kodak) und dem ECL-Western-Blot-Nachweissystem wie beschrieben (Deiss et al., 1995) durchgeführt.
  • 2. In-vitro-Kinasetest
  • Zelllysate von transfizierten COS-Zellen wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (Deiss et al., 1995). Die Immunpräzipitation des rekombinanten DAP-Kinaseproteins aus 150 μg Gesamtextrakt wurde mit 20 1 anti-FLAG M2-Gel (IBI, Kodak) in 200 μl PLB, welches mit Protease und Phosphataseinhibitor supplementiert war, für 2 h bei 40°C durchgeführt. Nach drei Waschschritten mit PLB wurden die Immunpräzipitate einmal mit Reaktionspuffer (50 mM Hepes pH 7,5, 8 mM MgCl2, 2 mM MnCl2 und 0,1 mg/ml BSA) gewaschen. Die an die Kügelchen gebundenen Proteine wurden für 15 min bei 25°C in 50 1 Reaktionspuffer, der 15 Ci[γ-32P]-ATP (3 pmol), 50 mM ATP, 5 μg MLC (Sigma) und sofern angegeben, auch 1 mM bovines Calmodulin (Sigma), 0,5 mM CaCl2 oder 3 mM EGTA in Abwesenheit von CaCl2 enthielt, inkubiert. Proteinprobenpuffer wurde zugefügt, um die Reaktion zu beenden und nach einem Kochen wurden die Proteine auf 1% SDS-PAGE analysiert. Das Gel wurde auf eine Nitrocellulosemembran geblottet und die 32P-markierten Proteine durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
  • (B) Ergebnisse
  • Von einer Region, die stromabwärts der Kinasedomäne (Aminosäuren 280–312; 32) gelegen war, wurde auf Basis der Sequenzhomologie mit den CaM-regulatorischen Domänen einiger Mitglieder der CaM-abhängigen Kinasefamilie (Deiss et al., 1995) vorhergesagt, dass sie CaM bindet. Einige unterschiedliche Tests, die durchgeführt wurden und unten beschrieben sind, bestätigten sowohl die Bindung von CaM an das DAP-Kinaseprotein als auch die Regulation der Kinaseaktivität durch CaM.
  • Die Fähigkeit der DAP-Kinase CaM zu binden, wurde zuerst durch einen Überschichtungsbindungstest unter Verwendung von markierten CaM getestet. In diesem Test wurden verschiedene mit FLAG-Tag versehene rekombinante DAP-Kinasekonstrukte in COS-Zellen exprimiert und die Proteinextrakte auf SDS-PAGE einer Elektrophorese unterzogen, auf Nitrocellulosemembranen geblottet und mit 35S-Met markiertem rekombinantem CaM zur Reaktion gebracht (Baum et al., 1993). Sowohl die Wildtyp-DAP-Kinase als auch eine deletierte Version der DAP-Kinase, der die Calmodulin-Regulations- und -binderegion (d.h. Aminosäuren 266–312; bezeichnet mit DAP-Kinase-CaM) fehlt, und die zuvor genannte DD-Mutante wurden getestet. Dieselben Blots wurden auch mit anti-FLAG-Antikörpern zur Reaktion gebracht, um die Gegenwart des rekombinanten Proteins, das bei der vorhergesagten Größe in jedem Blot erschien, zu bestätigen. Sowohl die Wildtyp-DAP-Kinase als auch die trunkierte DD waren zur Bindung des markierten CaM in der Lage, wohingegen die DAP-Kinase-CaM dies nicht konnte (33A).
  • Die Fähigkeit der DAP-Kinase, CaM zu binden, wurde weiter durch die Verwendung eines Hefe-Zwei-Hybridselektionssystems bestätigt (Fields & Sterglanz, TIG 10: 286–292, 1994). In diesem Test wurde die Region, die das Ende der Kinasedomäne, die CaM-regulatorische Region, die Ankyrin-Repeatdomäne und den ersten P-Loop (siehe 31 für Einzelheiten) umfasst, als Köder verwendet, um die interagierenden Proteine aus der HeLa-cDNA-Expressionsbibliothek (Clontech) zu fischen. Ungefähr 90 positive Klone wurden erhalten, wobei alle von ihnen mit der humanen CaM-Volllängen-cDNA identisch waren. Die geretteten CaM-Klone reagierten in dem Hefesystem auch mit einem trunkierten Konstrukt der DAP-Kinase, das nur das Ende der Kinasedomäne und die CaM-regulatorische Domäne (Aminosäuren 251–364) umfasste. Zusammengenommen bestätigten die CaM-Überschichtungstests und die Wechselwirkungen zwischen den DAP-Kinasefragmenten und Calmodulin in dem Hefe-Zwei-Hybridsystem die Vorhersage, dass die DAP-Kinase CaM über die konservierte Region bindet, die stromabwärts von der Kinasedomäne liegt.
  • Die Ca2+/CaM-Regulation der Kinaseaktivität wurde weiter in den In-vitro-Kinasetests untersucht. In Abwesenheit von Ca2+/CaM waren sowohl die Autophosphorylierung als auch die MLC-Phosphorylierung durch die DAP-Kinase 8- bis 10-fach niedriger als die Phosphorylierung in Gegenwart von Ca2+/CaM (33B). Interessanterweise zeigte die Mutante mit Deletion der CaM-regulatorischen Domäne (DAP-Kinase-CaM) ein hohes Niveau an enzymatischer Aktivität in Abwesenheit von Ca2+/CaM, was eine negativ regulatorische Funktion dieser Region nahe legt, die durch die Wechselwirkungen mit Calmodulin abgebaut werden könnte (33C). Diese Ergebnisse waren mit den stimulatorischen Wirkungen konsistent, die durch die Deletion dieser Region in anderen CaM-abhängigen Kinasen auferlegt wurden (Shoemaker et al., 1990). Wir schließen daher aus den In-vitro-Kinasetests, dass die Kinaseaktivität der DAP-Kinase durch Ca2+/CaM reguliert wird und dass die Entfernung der CaM-regulatorischen Domäne eine deregulierte Kinase hervorruft, die konstitutiv aktiv ist.
  • Dieser Typ von Mutation ist ein Beispiel für eine „Gewinn an Funktion"-Mutation, d.h. eine Mutation, die in dem DAP-Genprodukt mit einer erhöhten Zelltod-fördernden Aktivität resultiert. Solch eine Mutation wäre zum Beispiel in dem Tod-fördernden Aspekt der Erfindung nützlich.
  • IX. Die ektopische Expression der DAP-Kinase induziert den Tod von HeLa-Zellen
  • (A) Experimentelle Vorgehensweise
  • 1. Detergenzextraktionstest
  • Subkonfluente Kulturen von transfizierten COS- oder HeLa-Zellen, die auf 9 cm Platten wachsen gelassen wurden, wurden einmal mit PBS und dann, soweit angegeben, mit MES-Puffer (50 mM MES pH 6,8, 2,5 mM EGTA, 2,5 mM MgCl2) gewaschen, die HeLa-Zellen wurden mit 1 mg/ml Nocodazol für 0,5 Stunden oder mit 5 mM Latrunculin A für 1 Stunde vor der Extraktion vorbehandelt. Die Zellen wurden für 3 min mit 0,5 ml 0,5% Triton X-100 in MES-Puffer, der mit Proteaseinhibitoren supplementiert war, extrahiert. Der Überstand (lösliche Fraktion – Sol) wurde gesammelt, für 2 min bei 16.000 × g bei 4°C zentrifugiert und der klare Überstand wurde dann in neue Röhrchen überführt. Zwei Volumina kaltes Ethanol wurden zugefügt und die Röhrchen wurden bei –20°C über Nacht inkubiert, für 10 min bei 16.000 × g bei 4°C zentrifugiert und in 200 l 2 × Proteinprobenpuffer ohne Farbstoff resuspendiert. Die im Detergenz unlösliche Matrix (InSol), die auf den Platten verblieb, wurde in 200 μl 2 × Proteinprobenpuffer extrahiert, mit einem Schaber von der Platte gekratzt und in Röhrchen gesammelt. Die Proben wurden auf 10% SDS-PAGE geladen, 100 μg Proteinextrakte aus der Sol-Fraktion wurden auf jede Spur geladen, äquivalente Volumina der InSol wurden geladen. Eine Analyse der Proteine wurde unter Verwendung von anti-FLAG-Antikörpern (Kodak), monoklonalen Antikörpern gegen DAP-Kinase (1:1000 Verdünnung; Sigma), anti-Tubulin-Antikörpern (1:2000 Verdünnung; Sigma) oder polyklonalen anti-Actin-Antikörpern (1:100 Verdünnung; Sigma) wie oben beschrieben durchgeführt.
  • 2. Immunfärbung der Zellen
  • Transfizierte Zellen (SV-80-, REF-52- oder COS-Zellen) wurden auf Glasdeckplättchen (13 mm Durchm.) plattiert, 20.000 Zellen/Vertiefung in 1 ml Medium in einer Platte mit 24 Vertiefungen. Nach 48 Stunden wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, fixiert und gleichzeitig permeabilisiert. Dies wurde durchgeführt, indem die Deckgläschen 5 Minuten in einer Mischung aus 3% Paraformaldehyd und 0,3% Triton X-100 in PBS inkubiert wurden und dann mit 3% Paraformaldehyd alleine für zusätzliche 20 Minuten inkubiert wurden. Die Zellen wurden dreimal in PBS gewaschen und dann in Blockierungslösung (5% normales Ziegenserum und 1% BSA in PBS) für 60 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden mit 30 ml des ersten Antikörpers (anti-FLAG 1:300) für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann dreimal in PBS gewaschen und für 30 Minuten mit 30 ml Rhodamin-konjugierten anti-Maus-Antikörpern aus Ziege (Verdünnung 1:200, Jakson Immuno Research Lab.) inkubiert. DAPI (0,5 μg/ml; Sigma) und Fluorescein-konjugiertes Phalloidin (1:100; Molecular Probes Inc.) wurden bei diesem Schritt zugefügt. Die Deckgläschen wurden dreimal in PBS gewaschen, getrocknet und in Mowiol fixiert. Die Mikroskopie wurde unter Fluoreszenzlichtbedingungen durchgeführt. Das Fotografieren wurde unter Verwendung eines Kodak TMX400-Films durchgeführt.
  • 3. X-Galfärbung
  • Um die LacZ-Expression nachzuweisen, wurden die Zellen mit 3% Paraformaldehyd für 5 min fixiert, zweimal mit PBS gespült und für 3 h in X-Gal-Puffer enthaltend 77 mM Na2HPO4, 23 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 1 mg/ml X-Gal, 3 mM K3Fe(CN)6, 3 mM K4Fe(CN)6 gefärbt. Die Reaktion wurde durch 70%-iges Ethanol gestoppt. Das Fotografieren wurde unter einem Phasenmikroskop unter Verwendung von Kodak Ektachrom 160T durchgeführt.
  • (B) Ergebnisse
  • Das erste Anzeichen, das der DAP-Kinase eine Funktion als ein positiver Mediator des Zelltods zuordnet, basierte auf dem Befund, dass ihre reduzierte Expression durch die Antisense-RNA HeLa-Zellen vor apoptotischem Zelltod, der durch IFN-γ-Rezeptoren ausgelöst wurde, schützte. Es war daher interessant zu untersuchen, ob erhöhte Spiegel des DAP-Kinaseproteins, die durch ektopische Expression der Volllängensense-cDNA gebildet wurden, selbst einen Zelltod ohne einen externen Stimulus verursachen könnten.
  • Um die DAP-Kinase in Säugerzellen zu exprimieren, wurde die Volllängen-cDNA in den pcDNA3-Vektor (In Vitrogen) unter der Kontrolle des CMV-Promotors kloniert. Ähnliche Konstrukte wurden hergestellt, die die katalytisch inaktive DAP-Kinase-Mutante K42A und die Mutante mit Deletion der CaM-regulatorischen Domäne (DAP-Kinase CaM) enthielten. Sowohl die DAP-Kinasekonstrukte als auch der leere Vektor wurden in HeLa-Zellen durch Calciumphosphatcopräzipitationstechnik transfiziert. Nach 2–3 Wochen Wachstum in Selektionsmedium (G-418) wurden die Wirkstoff-resistenten Zellen mit Kristallviolett gefärbt. Es wurde gefunden, dass die Transfektion mit der Wildtyp-DAP-Kinase die Zahl der überlebenden Kolonien im Vergleich zu den Transfektionen mit leerem Vektor signifikant erniedrigte (34A). Die inhibitorische Wirkung war sogar nach Transfektionen mit der konstitutiv aktiven DAP-Kinase-CaM-Mutante noch stärker, was vermuten lässt, dass diese Mutante die stärksten Wachstums-restriktiven Wirkungen hatte. Im Gegensatz dazu reduzierte die katalytisch inaktive DAP-Kinasemutante die Zahl der Kolonien überhaupt nicht. Im Gegenteil, die Zahl der Kolonien, die durch Transfektion mit der Mutante K42A gebildet wurde, war im Vergleich zu Transfektionen mit leerem Vektor leicht erhöht und die Größe der einzelnen Kolonien war oft größer (34A). Die Transfektion mit der katalytisch inaktiven DAP-Kinasemutante scheint daher bei den Zellen einen gewissen Wachstumvorteil während des Prozesses der Koloniebildung zu vermitteln. Diese Ergebnisse wurden in sechs unabhängigen Experimenten mit verschiedenen Präparationen von Plasmid-DNA wiederholt. Sie wurden auch mit anderen Typen von Expressionsvektoren wiederholt (nicht gezeigt). Diese Daten stellten die ersten Anzeichen dar, dass die ektopische Expression von DAP-Kinase mit kontinuierlichem Zellwachstum nicht kompatibel war und dass dieses Merkmal von der intrinsischen Kinaseaktivität abhing. Sie stellten auch den ersten Hinweis dar, dass die katalytisch inaktive Mutante der DAP-Kinase eine dominant negative Funktion haben könnte, eine Frage, die später unter den restriktiven Wirkungen von IFN-γ untersucht wurde (siehe unten).
  • Um das Schicksal der Zellen präziser zu bestimmen und um die Grundlage für die Unterdrückung der Koloniebildung zu verstehen, wurden die Zellen zwei Tage nach der Transfektion mit dem DAP-Kinasegen untersucht. In diesen Experimenten wurde das LacZ-Markergen verwendet, um die Erkennung von transfizierten Zellen, die DAP-Kinase ektopisch exprimieren, zu erleichtern. Ein Vektor wurde für diese Zwecke konstruiert, der die interne ribosomale Eintrittsstelle (Internal Ribosomal Entry Site; IRES) des Poliovirus enthielt und folglich die Expression von sowohl LacZ- als auch den Wildtyp-DAP-Kinasegenen in einer einzigen bicistronischen Message steuert. Die bicistronische mRNA wurde aus dem Tetracyclin-repremierbaren Promotor (Gossen & Bujard, PNAS 89: 5547–5551, 1992) exprimiert. Die Morphologie der LacZ-enthaltenden blauen Zellen wurde 48 Stunden nach der Transfektion in Kulturen bestimmt, die in Abwesenheit von Tetracyclin gehalten wurden, um die kontinuierliche Expression beider Gene zu erlauben. Es wurde gefunden, dass 34% der LacZ-enthaltenden Zellen, die die Widtyp-DAP-Kinase exprimierten, die Morphologie von apoptotischen Zellen zeigten, d.h. Zellenschrumpfen und Abrunden gefolgt von Ablösen von den Platten. Im Gegensatz dazu wurde in dem Kontrollvektor ein Hintergrund von weniger als 5% apoptotische Zellen nachgewiesen (34B). Zusammengenommen lassen die morphologischen Beurteilungen und die Koloniebildungstests vermuten, dass die Überexpression von DAP-Kinase den Zelltod fördert, wodurch die Rolle der DAP-Kinase als positiver Mediator des Zelltods verstärkt wird.
  • X. Die katalytisch inaktive DAP-Kinase schützt Zellen vor IFN-γ-induziertem Zelltod
  • Die Hypothese, dass die mutierte DAP-Kinase K42A in einer transdominant negativen Weise wirken könnte, wurde untersucht. Dies wurde durchgeführt, indem überprüft wurde, ob die katalytisch inaktive mutierte Kinase HeLa-Zellen vor dem IFN-γ-induzierten Zelltod ähnlich wie der durch die Antisense-RNA-Expression verliehener Schutz schützen würde. In diesem Experiment wurde der leere pcDNA3-Vektor und der, der die DAP-Kinase-Mutante K42A enthielt, in HeLa-Zellen transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen aufgeteilt und einer doppelten Selektion mit 700 μg/ml G-418 und 200 U/ml IFN-γ unterzogen. Unter diesen stringenten Bedingungen wurden die Transfektanten, die den Kontrollvektor exprimieren, wirksam abgetötet und der Hintergrund an G-418 resistenten Zellen war extrem niedrig. Im Gegensatz dazu hatte die Transfektion mit der K42A-Mutante die Anzahl der überlebenden Zellen signifikant erhöht (35A). Im Mittel war die relative Zahl der Kolonien, die die Gegenwart von IFN-γ überlebten, in den K42A-Transfektanten 5-fach höher als in den entsprechenden pcDNA3-Transfektanten (35B). Ebenso war die mittlere Zellzahl pro Kolonie in den K42A-Transfektanten höher. Diese Ergebnisse zeigen, dass die K42A-Mutante HeLa-Zellen vor dem IFN-γ-induzierten Zelltod schützen kann, wahrscheinlich, indem sie in einer dominant negativen Weise wirkt, wodurch sie die normale Funktion der endogenen DAP-Kinase stört. Dies ist ein Beispiel einer Mutation, die in der Neutralisation des endogenen DAP-Genprodukts resultieren kann. Eine solche Mutation wäre zum Beispiel in dem Tod-verhindernden Aspekt der Erfindung nützlich.
  • XI. Lokalisation der DAP-Kinase im Cytoskelett
  • Eine Kernfrage im Verständnis der Art der Wirkung der DAP-Kinase betrifft ihre intrazelluläre Lokalisation. Um die intrazelluläre Lokalisation der DAP-Kinase durch Immunfluoreszenzfärbung zu definieren, transformierten wir humane SV-80-Fibroblasten transient mit dem zuvor genannten FLAG-DAP-Kinase-K42A-Konstrukt und führten eine Immunfärbung der Zellen mit anti-FLAG-Antikörpern durch. Die K42A-Mutante wurde gewählt, um Tod-bezogene morphologische Veränderungen als Folge der Überexpression zu vermeiden (Transfektion von SV80-Zellen mit Wildtyp-DAP-Kinase induzierte den Zelltod in ähnlicher Weise, wie die in HeLa-Zellen beobachtet wurde und die wie oben ausgeführt war).
  • Die FLAG-DAP-Kinase-K42A wurde als Netzwerk von feinen Fasern gefärbt, die die Zellperipherie erreichten; Kerne waren nicht gefärbt (45A). Das gleiche Muster wurde auch durch Färbung mit monoklonalen anti-DAP-Kinase-Antikörpern erhalten (nicht gezeigt). Dies war der erste Hinweis, der eine Lokalisation des DAP-Kinaseproteins im Cytoskelett nahelegte. Doppelfärbung der Transfektanten mit anti-FLAG-Antikörpern und mit Fluorescein-konjugiertem Phalloidin, das Actinfasern bindet, ergab eine beträchtliche Überlappung (45A). Im Gegensatz dazu gab es keine Überlappung mit Mikrotubulifärbung (nicht gezeigt).
  • Die Lokalisation der DAP-Kinase im Cytoskelett wurde anschließend durch biochemische Fraktionierung von sowohl endogen als auch exogen exprimierten Protein bestätigt. Wir verwendeten das gut ausgearbeitete Protokoll der vorsichtigen Zellextraktion mit nicht ionischem Detergenz (0,5% Triton X-100), das Lipide und lösliche Proteine entfernt, wobei es die Detergenz-unlösliche Matrix, die aus dem Kern, dem Cytoskelettgerüst und den mit dem Cytoskelett-assoziierten Protein besteht, intakt lässt. In nicht-transfizierten HeLa-Zellen erschien die endogene DAP-Kinase (erkannt durch gegen den C-Terminus des Proteins hergestellte monoklonale Antikörper) ausschließlich in der Detergenz-unlöslichen Fraktion (45B). Im Gegensatz dazu wurden β-Tubulin und Actin, die beide einen konstanten löslichen Pool besitzen, sowohl in den Detergenz-löslichen als auch -unlöslichen Fraktionen gefunden. Wir verwendeten Nocodazol, einen Mikrotubuli-zerstörenden Wirkstoff, um die Löslichkeit von -Tubulin zu verändern. Wie aus 45B ersichtlich wird, wurde nach Behandlung der HeLa-Zellen mit Nocodazol das gesamte β-Tubulinprotein in der löslichen Fraktion gefunden, wohingegen die Löslichkeit von sowohl DAP-Kinase als auch Actin nicht verändert war. Andererseits wurde nach Behandlung der Zellen mit Latrunculin A, einem Mikrofilament-zerstörenden Mittel, ein wesentlicher Anteil der DAP-Kinase in der löslichen Fraktion gefunden. Hier wurde Actin fast ausschließlich in der löslichen Fraktion gefunden, wohingegen die Löslichkeit von β-Tubulin nicht verändert war. Diese Ergebnisse lassen in Kombination mit der doppelten Immunfärbung vermuten, dass die DAP-Kinase an das Mikrofilamentsystem des Cytoskeletts lokalisiert sein könnte.
  • Der Detergenzextrationstest wurde weiterhin verwendet, um die Region in der DAP-Kinase zu kartieren, die mit dem Cytoskelett assoziiert ist. Für diesen Zweck wurden COS-Zellen verwendet, die mit FLAG-DAP-Kinase transfiziert waren, in denen das Muster der Färbung mit anti-FLAG-Antikörpern ähnlich zu dem war, das in den zuvor getesteten SV-80- und HeLa-Zellen beobachtet wurde (46A). Eine Reihe von konstruierten DAP-Kinasedeletionsmutanten in den pECE-FLAG- oder pcDNA3-FLAG-Expressionsvektoren wurde in COS-Zellen transfiziert. Diese transfizierten COS-Zellen wurden, wie oben beschrieben, einer Detergenzextraktion unterzogen und die Immunoblots wurden mit Anti-FLAG-Antikörpern zur Reaktion gebracht, um in jedem der Fälle das Elutionsprofil eines jeden mutierten DAP-Kinaseprodukts zu beobachten. Die Ergebnisse sind in 46B zusammengefasst. Aus der ausführlichen Analyse wurde geschlossen, dass die Region, die die Aminosäuren 641–835 umfasst, zu der Detergenzunlöslichkeit der DAP-Kinase beiträgt und daher eine kritische Region ist, die für die Assoziation mit dem Cytoskelett verantwortlich ist. Ihre Deletion stört die Assoziation mit dem Cytoskelett und umgekehrt war diese Region selbst detergenzunlöslich. Interessanterweise waren Fragmente, die die Ankyrin-Repeats ohne die Bindungsdomäne zum Cytoskelett enthielten, vollständig detergenzlöslich.
  • Die intrazelluläre Lokalisation der DAP-Kinase könnte für die Veränderungen des Cytoskeletts relevant sein, die während des IFN-γ-induzierten Todes der HeLa-Zellen auftreten. Die Färbung von Actin mit Phalloidin zeigte, dass nach Behandlung mit dem Zytokin eine vollständige Zerstörung der Mikrofilamentorganisation stattfand und Stressfasern auftraten (47A). Der Verlust der Stressfasern trat auf, bevor die typischen nukleären Veränderungen, die aus Chromatinkondensation und Segmentierung bestehen (Deiss et al., 1995), stattgefunden hatten. Um mögliche Wirkungen der DAP-Kinase- Überexpression auf das Cytoskelettnetzwerk zu verfolgen, wurden REF-52-Fibroblasten verwendet, die ein gut organisiertes Actincytoskelett besitzen.
  • Die konstitutiv aktive FLAG-DAP-Kinase-CaM-Mutante wurde transient in diese Zellen transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen, die positiv mit den anti-FLAG-Antikörpern gefärbt waren, auf nukleäre und cytoskelettale Veränderungen im Vergleich zu den benachbarten nicht-transfizierten Zellen untersucht. Dies wurde durch Dreifachfärbung mit DAPI (für Kerne) und Phalloidin (für das Mikrofilamentsystem) erreicht (47B). Es wurde gefunden, dass die FLAG-positiven Zellen ein zerstörtes Muster der Mikrofilamentfärbung zeigten, die an die cytoskelettalen Veränderungen erinnerten, die in IFN–-behandelten Zellen auftreten. Es konnten zu diesem Zeitpunkt keine Anzeichen der Chromatinkondensation oder -fragmentierung in den DAP-Kinase-transfizierten Zellen nachgewiesen werden (47B). Im Gegensatz dazu führte die Transfektion mit der trunkierten katalytisch aktiven DAP-Kinase (DAP-Kinase-DEcoRV; Aminosäuren 1–305 in 46B), die in den Zellen fehllokalisiert war und eher eine Kernals eine cytoskelettale Färbung zeigte, zu keinen cytoskelettalen Veränderungen. In diesen Transfektionen zeigten die FLAG-positiven Zellen ein normales Muster der Mikrofilamentfärbung, die nicht von den benachbarten nicht-transfizierten Zellen unterschieden werden konnte (47B). Diese Ergebnisse wurden in SV80-Zellen wiederholt, in denen mehr als 80% der Transfektanten, die die FLAG-DAP-Kinase-DCaM-Mutante exprimierten, abnorme Muster der Mikrofilamentfärbung zeigten, wohingegen keine Veränderung durch die DAP-Kinase-DEcoRV-Tranfektionen verursacht wurde (nicht gezeigt). Diese Ergebnisse lassen eine Verbindung zwischen der korrekt lokalisierten aktiven DAP-Kinase und den Zelltod-bezogenen Veränderungen von Cytoskelett und Morphologie, die sich in Antwort auf IFN-γ entwickeln, vermuten.
  • Folglich kann die Lokalisation der DAP-Kinase, und vielleicht anderer DAP-Proteine, im Cytoskelett im Hinblick auf die Tod-fördernden und Tod-verhindernden Aspekte der Erfindung wichtig sein, z.B. im Hinblick auf Wirkstoffe, die die Lokalisation des Proteins im Cytoskelett verhindern.
  • XII. Expression der DAP-1- und DAP-2-Proteine in verschiedenen Zellen und Geweben
  • Die Untersuchung einer Vielzahl von Zelllinien und Geweben ergab, dass diese beiden Gene wahrscheinlich ubiquitär exprimiert sind. 10 zeigt die Northern-Blotanalyse von RNA aus verschiedenen hämatopoetischen Zellen, die mit der DAP-1-cDNA sondiert wurden. Das 2,4 Kb mRNA-Transkript dieses Gens wurde in Granulozyten (HL-60), B-Lymphoid (Daudi) und Makrophagen (U937)-Zellen nachgewiesen. Die Expressionsspiegel in den hämatopoetischen Zellen waren niedriger als in den HeLa-Zellen. 11 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung der mRNA-Expression in humanen embryonalen Geweben: Gehirn, Niere (hauptsächlich B-Zellen) und Leber (hauptsächlich Erythrozyten). Wiederum wurde ein einzelnes 2,4 Kb mRNA-Transkript in diesen Geweben durch die DAP-1-cDNA-Sonde nachgewiesen.
  • Die DAP-2-cDNA-Sonde 2 erkannte die 6,3 Kb mRNA, die von diesem Gen in verschiedenen Geweben kodiert wurde (11). Die embryonalen Leber- und Milzgewebe bei Downsyndrom schienen in diesem Blot höhere Spiegel des DAP-2-Gens (im Vergleich zu den GAPDH-Spiegeln) zu exprimieren, wohingegen das Hirngewebe bei Downsyndrom höhere Spiegel von DAP-1-mRNA als die entsprechenden normalen Gehirne enthielt.
  • XIII. Screenen von Zelllinien auf DAP-Kinase-Expression
  • (A) Experimentelle Vorgehensweise
    • 1. Haltung der Zelllinien und Behandlung mit 5-Azodesoxycytidin – alle hämatopoetischen Zelllinien (siehe ATCC zur Beschreibung von verschiedenen Zelllinien) wurden in RPMI 1640, das mit 10% Komplement-inaktivierten FCS (Gibco-BRL), 100 IU/ml Penicillin und Streptomycin und 2 mM L-Glutamin supplementiert war, bei 37°C und 5% CO2 wachsen gelassen. Für die aus Blasenkarzinom abgeleiteten Zelllinien (siehe ATCC zur Beschreibung der verschiedenen Zelllinien) wurde DMEM verwendet. Die Blasenkarzinomzelllinien wurden mit 1E5-Zellen/100 mm Platten ausplattiert und 24 Stunden später mit 5-Aza-2'-desoxycytidin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bei einer Endkonzentration von 1 μM behandelt. Das Medium wurde 24 Stunden nach Zugabe des Wirkstoffs und danach alle 3 Tage ausgetauscht. Die Proteine wurden 9 Tage nach Behandlung für die frühe Phase und 16 Tage danach für die späte Phase extrahiert.
    • 2. Northern-Blotanalyse – Die gesamte RNA wurde aus den verschiedenen Zelllinien unter Verwendung von Trireagent (MRC) extrahiert. Proben von 3 μg PolyA+-RNA, die mit Oligo-dT-Dynabeads (Dynal) wie vom Hersteller beschrieben präpariert waren, wurden auf 1% Agarosegelen getrennt und wie beschrieben (Sambrook, 1989) an Hybond-N-Nylonmembranen (Amersham) hybridisiert. DNA-Proben wurden unter Verwendung von [-32P]dCTP mit kommerziell erhältlichen zufällig primenden Kits (Boehringer Mannheim) hergestellt. Die Prähybridisierung, Hybridisierung und das Waschen der Filter wurden wie beschrieben durchgeführt (Sambrook, 1989).
    • 3. Immunoblotanalyse – Die Zellen wurden geerntet und Proteinextrakte wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (Deiss et al., 1995). Die Proteinextrakte (200 μg/Spur) wurden auf 7,5% SDS-PAGE fraktioniert. Die Proteine wurden auf Nitrocellulosefilter (Schleicher und Schuell) mit einem halbtrockenen Semiphor-Blotter (Hoefer Scientific Instruments) übertragen. Die monoklonalen Maus-Antikörper gegen humane DAP-Kinase waren von BioMaker (Rehovol, Israel). Die Antikörper gegen humanes Vinculin waren von Sigma. Die Antikörper gegen humanes DAP3 wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (Kissil et al., 1995). Die Immundetektion wurde unter Verwendung des ECL-Nachweissystems (Amersham) durchgeführt.
  • (B) Ergebnisse
  • Bei der Analyse der Expression des DAP-Kinase-mRNA-Transkripts in verschiedenen Zelllinien wurde gefunden, dass es in einem wesentlichen Teil der Zelllinien, die aus humanen B-Zellneoplasmen stammten, nicht exprimiert wurde. Neun verschiedene Zelllinien, die verschiedene Phasen der B-Zellreifung repräsentieren, wurden untersucht. Sieben von ihnen – SKW, 697, Daudi, RS4:11, MV4:11, SK-DHL und B380 – exprimierten keine nachweisbaren Spiegel an DAPk-mRNA. Zwei Zelllinien: ALL-1, welche einen unreifen B-Zellzustand darstellt (Erikson et al. PNAS 83: 1807–11, 1986) und B-1, welche einen frühen Vorläufer darstellt (Erikson et al., 1986; Cohen et al., 1991), exprimierten DAP-Kinase (36 und Tabelle 3). In EBV-immortalisierten B-Zelllinien, die aus peripheren B-Zellen etabliert wurden, nämlich GM1500 und GM607, war DAP-Kinase-mRNA vorhanden (Fig. *[1]37A). Die Signale in den DAP-Kinase-negativen Zelllinien blieben unter den Nachweisgrenzen, auch wenn höhere Mengen an Poly A+-RNA (15 μg) analysiert wurden (nicht gezeigt).
    Figure 00560001
    Tabelle 1. Zusammenfassung der Zelltypen, die auf Expression der DAP-Kinase auf Proteinniveau untersucht wurden. Die Daten wurden nach dem Ursprung der Zelllinie und dem Expressionsmuster der DAP-Kinase eingeteilt.
    • (a)
    Bestimmt durch Vergleich der Signalintensität auf Western-Blot mit den Signalniveaus der DAP-Kinase-positiven Blasenkarzinomzelllinien.
  • Interessanterweise wurden die c-Abl-mRNA-Transkripte in allen untersuchten Zelllinien exprimiert. Das c-Abl-Gen ist der näheste bekannte Marker zur DAP-Kinase (Feinstein et al., 1995). Die Expression von c-Abl schien normal zu sein und die zwei erwarteten mRNA-Transkripte wurden in allen Zelllinien beobachtet, unabhängig davon, ob sie DAP-Kinase-mRNA exprimierten (36B). Das ungestörte Muster der c-Abl-Expression erniedrigte die Wahrscheinlichkeit, dass der Mangel der DAPk-Expression eine Folge von weitreichenden Umordnungen oder Deletionen bei 9q34 ist.
  • Die Proteinanalyse bestätigte die RNA-Daten. Die aus den verschiedenen Zelllinien hergestellten Proteinextrakte wurden auf die Anwesenheit von DAP-Kinaseprotein durch Immunoblotanalyse untersucht. Es wurde gefunden, dass in allen Zelllinien, die DAP-Kinase mRNA-Transkripte exprimierten, das Proteinprodukt mit der erwarteten Größe von 160 kDa auch nachgewiesen wurde. Im Gegensatz dazu gab es in den Zelllinien, in welchen das DAP-Kinasetranskript nicht nachgewiesen wurde, keine Spur des DAP-Kinaseproteins (36C). Die gleichen Immunoblots wurden auch mit anti-Vinculin-Antikörpern als interne Kontrolle zur Reaktion gebracht (36D). Zusammengenommen zeigen die RNA- und Proteindaten, dass die Abwesenheit der DAP-Kinaseexpression höchstwahrscheinlich ein tatsächliches Phänomen und nicht ein Artefakt der Tests ist.
  • Die Expression des DAP-Kinaseproteins wurde dann in verschiedenen Zelllinien untersucht, die vom Blasenkarzinom abstammten. Dies wurde durch Western-Blotanalyse der Proteinextrakte, die aus 14 verschiedenen Zelllinien hergestellt waren, durchgeführt. Von den 14 Zelllinien, die untersucht wurden, exprimierten acht Zelllinien DAP-Kinase, vier zeigten keine nachweisbare DAP-Kinaseproteinexpression und zwei andere Linien exprimierten sie auf Spiegeln unter 1% im Vergleich zu den DAP-Kinase-positiven Linien (Tabelle 3). Diese Ergebnisse zeigten, dass ein Verlust oder sehr niedrige Spiegel der DAP-Kinaseexpression auch bei einem statistisch signifikanten Teil der Blasenkarzinomzelllinien auftreten. Zwei DAP-Kinase-negative Blasenkarzinomzelllinien wurden ausgewählt (T24 und HT1376) und mit 5-Azadesoxycytidin behandelt, um zu testen, ob die Abwesenheit der DAP-Kinaseexpression auf DNA-Hypermethylierung beruhte. Die Behandlung der Zellen mit 5-Azadesoxycytidin verursacht die Entfernung der Methylgruppen von CpG-Dinukleotiden und kann so eine) Promotorabschaltung/Silencing aufgrund von Hypermethylierung umkehren und kann die Expression des relevanten Gens wieder herstellen (Jones, 1985). Die Zellen wurden mit dem Wirkstoff für 24 Stunden behandelt, gewaschen und Proteinextrakte wurden danach in der frühen und der späten Phase hergestellt. Die Expression der DAP-Kinase wurde durch Reaktion der Immunoblots mit anti-DAP-Kinase-Antikörpern analysiert. Es wurde gefunden, dass die Zugabe von 5-Azadesoxycytidin zum Wachstumsmedium die DAP-Kinaseexpression wiederherstellte und dass starke Signale der erwarteten Proteingröße früh nach Wirkstoffbehandlung nachgewiesen wurden (37, Spuren 2 und 5), wohingegen die DAP-Kinase vor Behandlung nicht nachweisbar war (37, Spuren 1 und 4). Die wiederhergestellten Spiegel der DAP-Kinaseexpression waren den mittleren Expressionsspiegeln der DAP-Kinase in einigen DAP-Kinase-positiven Blasenkarzinomzelllinien, die getestet wurden, ähnlich (Daten nicht gezeigt). Die Wirkung war spezifisch, da die Expression von zwei anderen Proteinen, die im Gegensatz zur DAP-Kinase anfänglich in dieser Zelllinie vorhanden waren, Vinculin und DAP-3, überhaupt nicht durch die 5-Azadesoxycytidinbehandlung beeinflusst wurden (37, Spuren 1 bis 5). Lange nach der Wirkstoffbehandlung der T24-Zellen (nach sechs Passagen) war die Expression der DAP-Kinase wieder vollständig verhindert, wahrscheinlich aufgrund einer De-novo-Methylierung des Gens (37, Spur 3).
  • XIV. Klonierung und Sequenzierung von DAP-3, DAP-4 und DAP-5
  • Klon 259 (DAP-3) wurde sequenziert und verwendet, um eine K562-gt10-cDNA-Bibliothek, wie oben für DAP-1 und DAP-2 beschrieben, zu screenen. Die Sequenz der Volllängen-cDNA von DAP-3 und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in 12 gezeigt.
  • Klon 253 (DAP-4) wurde partiell, wie oben für DAP-1 und DAP-2 beschrieben, sequenziert und die Ergebnisse sind in 13 gezeigt.
  • Klon 260 war unter den geretteten Vektoren, die in Tabelle 1 beschrieben sind und die HeLa-Zellen vor IFN-γ-induziertem programmiertem Zelltod schützten. Er wurde, wie in der ausführlichen Beschreibung der Erfindung (Abschnitt I(A)) beschrieben, isoliert. Er trug ein cDNA-Fragment von 763 bp und die Sequenzanalyse zeigte, dass er einem neuen Gen (DAP-5 genannt) entsprach. Die Northern-Blotanalyse zeigte, dass DAP-5 in eine 3,8 Kb mRNA transkribiert wird. Von der DAP-5-mRNA wurde gefunden, dass sie in einer Vielzahl von normalen Geweben weit verbreitet exprimiert wird.
  • Das 763-cDNA-Fragment wurde zum Screenen einer cDNA-Bibliothek, die aus K562-Zellen stammte, verwendet. Der Phagenklon, der das längste cDNA-Insert (3,8 Kb) trug, wurde sequenziert. Dieser cDNA-Klon umfasst einen offenen Leserahmen (Open Reading Frame; ORF), der wie in 15 gezeigt, 940 Aminosäuren entspricht. Die abgeleitete Aminosäuresequenz sagt vorher, dass das Protein hoch homolog, aber nicht identisch, mit dem Translationsinitiationsfaktor 4 (translation initiation factor 4; eIF4, p220) ist. Folglich kann DAP-5 als neues Mitglied davon angesehen werden, was eine Familie von Translationsinitiationsfaktoren des eIF4-Typs zu sein scheint. Höchst interessanter und sehr unerwarteter Weise wurde das 763 bp Fragment, das in dem ursprünglich Klon #260 vorhanden war, in den Vektor in der Senseorientierung eingefügt. In dieser Region (durch eine dunkle Linie in 15 markiert; Nukleotide 1764–2528) gibt es ein ATG-Kodon, das die Synthese eines Miniproteins, das 230 Aminosäuren lang ist, betreiben könnte. In der Tat ergab die In-vitro-Transkription und -Translation dieses Fragments ein Protein der vorhergesagten Größe und die Mutation dieses ATGs schaltete die Miniproteinsynthese aus. Transfektionen der HeLa-Zellen mit Vektoren, die das 763 cDNA-Fragment aus dem Tetracyclin-regulierten Promotor exprimieren, schützten die Zellen vor Zytokininduziertem Zelltod. Eine Möglichkeit ist es, dass das Miniprotein als dominant negative Mutante wirkt, die mit den Tod-induzierenden Eigenschaften des Volllängenproteins kompetitiert. Es gibt auch andere Möglichkeiten.
  • XV. Die Expression des DAP-5-cDNA-Fragments (#260) übt eine zweifache Wirkung auf HeLa-Zellen aus.
  • (A) Experimentelle Vorgehensweise
  • 1. Transfektionen und Selektionsvorgehensweisen
  • Zwei sekundäre polyklonale HeLa-Zellpopulationen, die das DAP-5-763 bp-cDNA-Fragment aus dem pTKO1-Vektor exprimierten, wurden hergestellt. Dies wurde durch Transfektion von subkonfluenten Monolayern von 1,5 × 106 HeLa-Zellen mit 40 g des entsprechenden Plasmids (pTKO1-260 genannt) durchgeführt. Parallel dazu wurden HeLa-Zellen mit einem Kontrollvektor, pTKO1-DHFR (Deiss & Kimchi, 1991), transfiziert. Pools von 104 unabhängigen stabilen Klonen wurden aus jeder Transfektion gebildet. Die stabilen Transfektanten wurden in Gegenwart von 200 μg/ml Hygromycin B (Calbiochem) gehalten. Subkonfluente Monolayer von 1,5 × 106 HeLa-tTa-Zellen wurden mit 15 μg pSBc-bl-Plasmid oder pSBc-bl-Plasmid, das entweder das #260-Fragment (pSBc-bl-260) oder mutierte Derivate davon (Einfach- und Dreifach-ATG-Mutanten) trugen, transfiziert und in Gegenwart von entweder 10 oder 50 μg/ml Bleomycin selektioniert. Pools von 102–103 unabhängigen stabilen Klonen wurden aus jeder Transfektion gebildet.
  • 2. In-vitro-Translation von DAP-5-Protein in Reticulozytenlysat
  • Das Volllängen-cDNA-Insert oder die #260-Varianten, die in den Blueskriptvektor (Strategene) kloniert waren, wurden als Templates für die In-vitro-Transkription von dem T7-Promoter aus verwendet. Diese RNAs wurden dann in Reticulozytenlysate (Promega) unter Verwendung konventioneller Vorgehensweisen mit [35S]-Methionin (Amersham) als markiertem Vorläufer translatiert. Die Reaktionsprodukte wurden durch Fraktionierung auf 12,5% SDS-Polyacrylamidgel, gefolgt von Salizylsäureamplifikation des radioaktiven Signals, was wie in Kissil, J. L., et al, J. Biol. Chem. 270: 27932–936 (1995) beschrieben durchgeführ wurde, aufgelöst. Die ATG-Kodons an den Positionen 1785–1787, 2010–2012 oder 2040–2042 wurden durch Oligonukleotid-gesteuerte Mutagenese mutiert (ATG wurde in AAG oder TTC oder ATC umgewandelt).
  • 3. Herstellung von Antikörpern und Immunoblotanalyse
  • Die DAP-5-Sequenz, die den Aminosäuren 522–776 der kodierenden Region entsprach, die in dem #260-Fragment umfasst war, wurde im Leserahmen an pGEX1 (GST260) fusioniert. Die Expression der an Glutathion S-Transferase (GST) fusionierten Chimäre wurde in dem E. coli-Stamm XL1-Blue durch IPTG induziert. Das an GST fusionierte Produkt, das auf Glutathionkügelchen gereinigt war, wurde verwendet, um zwei Kaninchen zu immunisieren. Das Antiserum wurde von den anti-GST-Antikörpern durch Passieren durch CNBr-aktivierte Sepharosekügelchen (Pharmacia Biotech Inc.), die an GST gekoppelt waren, depletiert. Dann wurde eine Affinitätsreinigung auf CNBr-aktivierten Sepharosekügelchen, die an GST260 gekoppelt waren, durchgeführt. In einigen Experimenten war das Signal des Miniproteins in den HeLa-Zelltransfektanten unter den Nachweisgrenzen.
  • 4. Western-Analyse
  • HeLa-tTA-Zellen wurden geerntet und durch Kochen in Probenpuffer lysiert. Die Proteinproben wurden durch 10% SDS-PAGE fraktioniert und dann auf Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schuell) übertragen. Die Blots wurden mit den affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörpern (1:20 Verdünnung) zur Reaktion gebracht und die Immundetektion unter Verwendung des ECL-Nachweissystems (Amersham Corp.) durchgeführt.
  • (B) Ergebnisse
  • Das pTKO1-Konstrukt, das das DAP-5-cDNA-Fragment #260 enthielt, wurde (in Duplikaten) in HeLa-Zellen transfiziert, um zwei stabile polyklonale Zellpopulationen (260-t1 und 260-t2 genannt) zu bilden. Eine polyklonale HeLa-Zellkontrollpopulation (bezeichnet mit DHFR-t1) wurde durch Transfektion des pTKO1-Vektors, der das DHFR-Gen trug, erhalten. Diese drei transfizierten Zellkulturen wurden einer Langzeitbehandlung mit IFN-γ unterzogen. Wie in 38B gezeigt, gab es eine 100- bis 200-fache Erhöhung der Zahl der wachsenden Kolonien in den 260-t1- und 260-t2-Zellkulturen im Vergleich zu der DHFR-t1-Zellpopulation. Das bedeutet, dass die Gesamtzahl der Kolonien, die durch dieses cDNA-Fragment vor den inhibitorischen Wirkungen von IFN-γ gerettet wurden, nur 0,1–1% der anfänglichen Zellpopulation entsprach. Dieses Muster, in welchem nur eine kleine Fraktion der Zellen vor dem programmierten Zelltod geschützt wurde, war sehr ähnlich zu der Wirkung, die durch die Anti-Thioredoxin-RNA (4 in Deiss & Kimchi, 1991) und durch das Fragment #253 (nicht gezeigt), die alle in die Untergruppe II klassifiziert wurden, verliehen wurde.
  • Die Größe der exogenen DAP-5-RNA in den 260-t1- und 260-t2-Transfektanten betrug 1,7 Kb (bestehend aus 763 Basen des cDNA-Inserts, 800 Basen der Sequenzen, die aus der Expressionskassette stammten (Deiss & Kimchi, 1991), und dem Poly(A)Schwanz). Die Expressionsspiegel der exogenen RNA waren viel niedriger als jene des endogenen 3,8 kb Transkripts (38A). Dies stand in starkem Widerspruch zu den acht Plasmiden der Untergruppe I, deren RNA-Produkte sich in HeLa-Zellen in großem Überschuss gegenüber den endogenen mRNA-Transkripten akkumulierten (d.h. Antisense entsprechend DAP-1, DAP-Kinase, DAP-3 und Cathepsin D). Ein ausführlicherer Vergleich zwischen den zwei Untergruppen wurde durch Hybridisierung der Northern-Blots, die RNA aus verschiedenen HeLa-Transfektanten enthielten, mit einer allgemeinen DNA-Sonde, die aus dem pTKO1-Vektor stammte, durchgeführt. Wie in 38C gezeigt, war unter den Bedingungen, unter denen die RNA, die aus dem pTKO1-230-Vektor (enthaltend das Antisense-Fragment von DAP-1) exprimiert wird, ein starkes Signal ergab, die RNA, die aus dem Fragment #260 transkribiert wurde, weiterhin unter den Nachweisgrenzen. Ähnlich niedrige Spiegel an RNA wurden aus zwei anderen cDNA-Fragmenten der Untergruppe II, die von dem gleichen Vektor getragen wurden, nämlich Thioredoxin (Deiss & Kimchi, 1991) und DAP-4 (#253), exprimiert (38C). Folglich lieferten die niedrigen Spiegel an ektopisch exprimierter RNA in etablierten polyklonalen Populationen ein zweites charakteristisches Merkmal der cDNA-Fragmente der Untergruppe II. Dieses könnte entweder eine RNA- Instabilität oder alternativ eine Selektion der Transfektanten mit einer niedrigen Kopienzahl der Episomen widerspiegeln. Das letztere scheint tatsächlich vorzuliegen, da ein Transkript, das allen Transfektanten gemeinsam ist – die mRNA, die von dem Hygromycin B-Resistenzgen, das in dem pTKO1 unter der Kontrolle des Thymidinkinasepromotors platziert wurde, exprimiert wird – zu den Expressionsspiegeln der insertierten cDNA-Fragmente parallel verlief (38D). Folglich wurde postuliert, dass während der Etablierung der polyklonalen Zellpopulation, die in Gegenwart von nur Hygromycin B durchgeführt wurde, die Zellen, die eine niedrige Kopienanzahl der pTKO1-260-Episomen enthielten, einen signifikanten Wachstumsvorteil erlangten.
  • Um diese Möglichkeit weiter zu verfolgen, wurde die Frage untersucht, ob tatsächlich hohe Expressionsspiegel von partieller cDNA von DAP-5 mit einem kontinuierlichen Zellwachstum inkompatibel waren. Zu diesem Zweck wurde ein polycistronischer Vektor konstruiert (pSBc-bl-260), der die Expression einer bicistronischen Message steuert, die sowohl das #260-cDNA-Fragment als auch das SH-LacZ enthält, das die Synthese eines fusionierten Proteins steuert, das Resistenz gegen Bleomycin verleiht und b-Galactosidase (Cayla) produziert. Das LacZ wurde als ein Marker verwendet, um die bicistronischen mRNA-Spiegel in den einzelnen Zellen zu beurteilen. Das #260-Fragment wurde in einer Cap-abhängigen Weise translatiert, wohingegen das fusionierte SH-LacZ-Gen stromabwärts von der Poliovirus internen ribosomalen Eintrittsstelle (Internal Ribosomal Entry Site; IRES) platziert wurde. Da die IRES-gesteuerte Translation weniger effizient ist als die Cap-abhängige, mussten hohe Spiegel der bicistronischen Message exprimiert werden, um ein Überleben der Zellen unter Bleomycinselektion zu erlauben. Dies zwang das System hohe Spiegel von #260 stammenden Expressionsprodukten in den Zellen zu erzeugen.
  • Es wurde gefunden, dass Transfektionen von HeLa-tTA-Zellen mit dem pSBc-bl-260-Vektor keine stabilen Klone in Gegenwart von 50 μg/ml Bleomycin ergab, wohingegen die Transfektion mit dem Kontrollvektor, dem das Insert (pSBc-bl) fehlte, leicht Klone bildete. Bei niedrigeren Wirkstoffkonzentrationen (10 μg/ml Bleomycin) entstanden nach Transfektion mit dem pSBc-bl-260-Vektor kleine Klone; allerdings starben sie danach langsam. Dies zeigte, dass hohe Spiegel der Expression aus dem #260-cDNA-Fragment für die Zellen lethal war und dass der #260-abhängige Zelltod ein langsames Muster des Abtötens zeigte. Die Expressionsspiegel der bicistronischen mRNA und folglich des Fragments #260, die ein Zellwachstum erlaubten, waren nicht ausreichend, um eine Bleomycinresistenz zu verleihen und daher musste der Wirkstoff entfernt werden, um eine weitere Analyse dieser Transfektanten zu erlauben.
  • Die β-Galactosidaseaktivität diente dazu, in überlebenden Zellen die Expression auf Einzelzellbasis zu quantifizieren. In den pSBc-bl-260-transfizierten Kulturen war das Maß der Blaufärbung in allen Zellen auf der Platte sehr schwach. Im Gegensatz dazu zeigten die polyklonalen Zellpopulationen, die aus der Transfektion mit dem Kontrollvektor erhalten wurden und unter identischen Bedingungen selektioniert wurden, ein starkes Muster der β-Galactosidasefärbung, das das in den pSBc-bl-260-Transfektanten vielfach überstieg (39A). Zusammengenommen zeigten die reduzierte Klonierungseffizienz und die schwache β-Galactosidaseaktivität in den überlebenden Zellen, dass es eine negative Selektion gegen eine hohe Expression des #260-cDNA-Fragments gab. Wir schlossen, dass die Expression aus dem geretteten DAP-5-cDNA-Fragment eine zweifache Wirkung hatte: Bei niedrigen Spiegeln verlieh es IFN-γ-Resistenz (eine Eigenschaft, die zu seiner funktionellen Klonierung führte); bei hohen Spiegeln war es toxisch und erlaubte kein kontinuierliches Zellwachstum.
  • XVI. Das Fragment #260 steuert die Expression eines funktionellen Miniproteins
  • Drei AUG-Kodons, die als potentielle Initiatioren der Translation dienen könnten, wurden in dem ORF von Fragment #260 gefunden. Eines war am Anfang des Fragments lokalisiert und könnte potentiell die Synthese eines 28 kDa Proteins initiieren; die anderen beiden waren 85 und 75 As stromabwärts lokalisiert und würden zu 20 bzw. 18,8 kDa Proteinen führen. Die In-vitro-Translation der RNA, die aus dem 763 bp DAP-5-cDNA-Fragment transkribiert wurde, bildete ein Duplett von Proteinen, das eine ungefähr Größe von 28 kDa hatte (40A, Spur 3). Eine Misssensemutation in dem ersten ATG-Kodon schaltete die Synthese der beiden nahe beieinander wandernden Proteine aus ohne die beiden abwärts gelegenen zu beeinflussen. Die Missensemutation der nächsten beiden ATG-Kodons, ohne das erste zu beeinflussen, störte die Translation der Duplette nicht; eine Dreifachmutation aller potentieller Initiationskodons verhinderte die Proteintranslation vollständig, wie dies auch die Einfachmutation in dem ersten ATG-Kodon tat (40A jeweils Spuren 4–6). Es wurde daher geschlossen, dass das gerettete cDNA-Fragment die Expression eines Miniproteins steuern könnte, das bei Met 529 beginnt. Dieses Miniprotein wurde auch in der zuvor genannten Population von HeLa-Zellen nachgewiesen, die mit dem pSBc-bl-Vektor, der das #260-Fragment beherbergte, transfiziert worden waren. Wie in 40B gezeigt, identifizierten affinitätsgereinigte polyklonale Antikörper, die gegen das rekombinante Miniprotein hergestellt waren, zwei nahe beieinander wandernde Proteine mit einer ungefähren Größe von 28 kDa ausschließlich in Zellen, die mit dem pSBc-bl-260 transfiziert waren, und nicht in Zellen, die mit dem Leervektor transfiziert waren.
  • Es erhob sich die Frage, ob die biologischen Wirkungen, die den transfizierten Zellen von dem Fragment #260 verliehen wurden, aus der Expression des Miniproteins resultierten. Für diese Zwecke subklonierten wir jede der beiden mutierten cDNA-Fragmente, die in vitro nicht translatiert wurden, in den pSBc-bl-Vektor. Im Gegensatz zu den Transfektionen mit dem Protein-exprimierenden DAP-5-Fragment wurden die polyklonalen Zellpopulationen, die mit den Mutanten erhalten wurden, in Gegenwart von Bleomycin etabliert, wobei eine ähnliche Effizienz erhalten wurde, wie die des Kontrollvektors. Zusätzlich war die β-Galactosidaseaktivität in diesen Transfektanten so hoch wie in den Zellen, die mit dem Kontrollvektor transfiziert wurden (39B). Folglich erwiesen sich die hohen Spiegel der Expression des mutierten DAP-5-cDNA-Fragments als mit kontinuierlichem Wachstum kompatibel. Das translatierte Miniprotein ist daher für die zellulären Wirkungen verantwortlich, die das gerettete DAP-5-Fragment auf Zellen ausübt.
  • XVII. Charakterisierung von Cathepsin D als ein DAP-Molekül
  • Anfängliche mikroskopische Beobachtungen, die an verschiedenen HeLa-Zellen durchgeführt wurden, die mit den einzelnen geretteten pTKO1-Klonen (beschrieben in Tabelle 1) transfiziert wurden, zeigten, dass das Plasmid pTKO1-229 (Gruppe 6) ähnliche Wirkungen übertrug, wie die, die durch die Plasmide der Gruppe 1 verliehen wurden. Es reduzierte die Empfänglichkeit der Zellen für den IFN-γ-induzierten Zelltod, aber nicht für seine cytostatischen Wirkungen.
  • Die cDNA, die von dem Plasmid pTKO1-229 getragen wurde, wurde durch Sequenzieren als ein BamHI-HindIII-Fragment der humanen Cathepsin D-cDNA identifiziert, die in dem Expressionsvektor in der Antisenseorientierung vorhanden war. Die DNA-Sonde, die dem Fragment #229 entsprach, hybridisierte wie erwartet als einzelne endogene 2,5 Kb mRNA sowohl in den Kontroll- als auch in den transfizierten HeLa-Zellen. Die Gleichgewichtsspiegel von Cathepsin D-Sense-mRNA waren 3- bis 4-fach durch die IFN-γ-Behandlung erhöht. In den mit pTKO1-229 transfizierten Zellen hybridisierte die DNA-Sonde auch an die zusammengesetzte Antisense-RNA. Die Spiegel der Antisense-Cathepsin D-RNA wurden in Antwort auf IFNγ aufgrund der Gegenwart eines ISRE-Enhancerelements in dem pTKO1-Expressionsvektor 5-fach erhöht (nicht gezeigt).
  • Cathepsin D ist eine Aspartylprotease, die normalerweise in Lysosomen gefunden wird, wo sie im Proteinkatabolismus wirkt. Doch in einigen pathologischen Situationen wurde vermutet, dass diese Protease im Cytosol arbeiten kann und ihre Aktivität mit degenerativen Veränderungen im Gehirn, Muskeldystrophie und der Pathologie von Bindegewebskrankheiten assoziiert ist (Matus und Green (1987); Biochemistry, 26, 8083–8086). Die vorliegende Erfindung zeigt zum ersten Mal, dass die Expression dieser Protease für die Ausübung des programmierten Zelltods, der durch IFN-γ oder andere Zytokine induziert wird, unentbehrlich ist (siehe unten). Folglich wird Cathepsin D der wachsenden Liste von Proteasen hinzugefügt, die eine Schlüsselrolle in den verschiedenen Szenarien des programmierten Zelltods spielen.
  • Die DNA-Sequenz und Aminosäuresequenz von Cathepsin D sind in 14 gezeigt (Faust, P. L. et al. (1985) PNAS USA 82, 4910–4914).
  • XVIII. Antisense-Cathepsin D-RNA und Pepstatin A schützen HeLa-Zellen vor IFN-γ-induziertem Zelltod
  • (A) Experimentelle Vorgehensweise
  • 1. Neutralrotfarbstoffaufnahmetest
  • Die HeLa-Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in einer anfänglichen Zahl von 15.000 oder 20.000 Zellen/Vertiefung kultiviert und entweder jeweils mit IFN-γ oder anti-APO-1-Antikörpern behandelt oder unbehandelt belassen. Soweit angegeben, wurde Pepstatin A (pepA) (Sigma) oder DMSO zu dem Kulturmedium zugegeben. Das Kulturmedium und die Wirkstoffe wurden alle 3–4 Tage ersetzt. Lebensfähige Zellen wurden mit Neutralrot (Sigma) wie zuvor ausgeführt, gefärbt (Wallach D., J. Immunol. 132: 2464–2469, 1984). Die Farbstoffaufnahme wurde in Vierfachbestimmungen bei λ = 540 nm unter Verwendung eines automatisierten Mikro-Elisa-Autoreaders gemessen.
  • 2. RNA-Analyse
  • Die gesamte zelluläre RNA wurde unter Verwendung von Tri-ReagentTM (Molecular Research Center, Inc.) extrahiert. Proben von 20 μg der gesamten RNA wurden auf Northern-Blots wie zuvor ausführlich beschrieben verarbeitet (Yarden and Kimchi, Science 234: 1419–21, 1986). Die DNA-Fragmente, die als Sonden verwendet wurden, wurden aus Agarosegelen mit dem Geneclean-Kit (BIO 101 Inc.) gereinigt. Die Fragmente wurden mit 5 μCi[32P]-dCTP (Amersham > 3000 Ci/mmol) unter Verwendung eines Random-Priming-Kits (Boehringer) markiert.
  • 3. Proteinanalyse
  • Zellen wurden in RIPA (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1% Desoxychlolat und 5 mM EDTA), welches eine Mischung aus Protease- und Phosphataseinhibitoren (1 mM PMSF, 4 μg/ml Aprotenin, 100 μg/ml Leupeptin, 1,5 μg/ml Pepstatin A, 2 μg/ml Antipain, 2 μg/ml Chymostatin, 0,1 mM NaVO3 und 0,1 mM NaF) enthielt, extrahiert. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung eines Proteintestreagenz (Bio-Rad) bestimmt. Aliquots von 300 g der Zelllysate wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (12%) fraktioniert. Die Proteine wurden dann auf eine Nitrocellulosemembran elektrogeblottet und die Blots wurden in Blockerlösung (10% Magermilch und 0,05% Tween-20 (Sigma) in PBS) für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit einer Antikörper-enthaltenen Lösung für 18 Stunden bei 4°C zur Reaktion gebracht.
  • Die gewaschenen Membranen wurden mit Peroxidase-konjugierten Zweitantikörpern, entweder anti-Maus-IgG-(IgG(H + L))-Ketten aus Ziege (Jackson Immuno Research Lab.) bei einer Verdünnung von 1:10.000 oder Protein A-konjugiert an Meerrettichperoxidase (Amersham) bei einer Verdünnung von 1:10.000, inkubiert. Der Nachweis der gebundenen Antikörper wurde unter Verwendung von ECL-Nachweisreagenzien (Amersham) durchgeführt. Die monoklonalen anti-Cathepsin D-Antikörper (EURO/DPC-U. K.) wurden bei einer Verdünnung von 1:5 verwendet; diese Antikörper erkennen ein Epitop in der 30 Kd schweren Kette. Polyklonale Antikörper gegen die Kupferzinksuperoxiddismutase (SOD) wurden bei einer Verdünnung von 1:250 verwendet. Diese Antikörper wurden freundlicherweise von Y. Groner (Weizman Institute, Rehovot, Israel) zur Verfügung gestellt.
  • 4. Transiente Transfektionen
  • Das Cathepsin D-cDNA-Insert (2176 bp; Sall-EcoRI-Fragment enthaltend die kodierende Sequenz in voller Länge und flankierende nicht kodierende Regionen (siehe Faust et al., 1985)) wurde in den Tetracyclin-kontrollierten Expressionsvektor (pSBC-TtA) (Dirks et al., Gene 128: 247–249, 1993) subkloniert. Der Vektor (40 μg) wurde transient in einen HeLa-Zellklon (HtTA-1), der das Tetracyclintransaktivatorgen exprimiert, durch die Standardcalciumphosphattechniken transfiziert (2 × 105 Zellen wurden in 9 cm Platten 18–20 Stunden vor der Transfektion ausgesät). Ein leerer Tetracyclinpromotor-enthaltender Vektor wurde als eine Kontrolle in den Tests verwendet. Um ausschließlich die transfizierten Zellen zu verfolgen, wurden diese Konstrukte entweder mit dem CMV-β-Galaktosidasegen (Clontech) oder mit dem SEAP-Gen, das von dem SV40-Promotor (dem pSBC-2-Vektor) exprimiert wurde, kotransfiziert (Dirks et al., 1993). Das molare Verhältnis war 6:1 zugunsten der Tetracyclinvektoren. Jede Transfektion wurde auf zwei Platten verteilt, von denen eine sofort mit Tetracyclin (1,5 mg/ml) supplementiert wurde. Alle Enzymaktivitäten wurden 48 h nach den Transfektionen beurteilt.
  • 5. β-Galactosidasefärbung und Bestimmung der SEAP-Aktivität
  • Um die LacZ-Expression nachzuweisen, wurden Zellen mit 3% Paraformaldehyd für 5 min fixiert, zweimal mit PBS gespült und für 3 h in X-Gal-Puffer gefärbt, der 77 mM Na2HPO4, 23 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 1 mg/ml X-Gal, 3 mM K3Fe(CN)6 und 3 mM K4Fe(CN)6 enthielt. Die Reaktion wurde durch 70% Ethanol gestoppt. Das Fotografieren wurde unter dem Phasenmikroskop unter Verwendung von Kodak Ektachrom 160T vorgenommen.
  • Für den SEAP-Aktivitätstest wurde das Medium der transfizierten Zellen 5 h vor dem Test gewechselt. Aliquots von 100 μl Medium wurden von den transfizierten Platten entfernt und für 5 min bei 65°C erhitzt. Das Medium wurde dann durch Zentrifugation bei 14.000 × g für 2 min geklärt. Die Mediumaliquots wurden dann auf 1 × SEAP-Puffer eingestellt, der 2 M Diethanolamin pH 9,8, 1 M MgCl2 und 20 mM L-Homoarginin enthielt. 20 ml 120 mM p-Nitrophenylphosphat, das in Wasser gelöst war, wurde dann zu jeder Mischung zugegeben. Die Reaktionsgemische wurden dann für 30 min bei 37°C inkubiert. Die Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphat wurde bei 405 nm gemessen.
  • (B) Ergebnisse
  • Zuerst wurden die stabilen HeLa-Zelltransfektanten auf ihre Wachstumssensitivität gegenüber IFN-γ getestet. Zuvor war gezeigt worden, dass ursprüngliche HeLa-Zellen ein biphasisches Muster der Antwort auf IFN-γ zeigten, in welchen die Zellen zuerst aufhörten zu proliferieren, aber am Leben blieben, gefolgt von einem massiven Zelltod mit den cytologischen Charakteristika von PCD (Deiss et al., Genes Dev. 9: 15, 1995). Einer der Tests, der verwendet wurde, um die Antisense-RNA-vermittelten Wirkungen zu messen, basierte auf der Aufnahme von Neutralrotfarbstoff in lebende Zelle. In Abwesenheit von IFN-γ verhielten sich beide Zelllinien (DHFR- und Anticathepsin D-transfizierte Zellen) gleich und zeigten identische Wachstumskurven. Dies lässt vermuten, dass die Antisense-RNA-Expression keine Wirkungen auf das normale Wachstum der Zellen hatte (41Aa). Weiterhin war das Ausmaß der Reduktion der Neutralrotfarbstoffaufnahme während der ersten vier Tagen, die den cytostatischen Wirkungen von IFN- entsprechen (Deiss et al., 1995), in beiden Zelllinien ähnlich. Dies zeigte, dass die Cathepsin D- Antisense-RNA-Expression die Zellzyklus-inhibitorischen Wirkungen der Zytokine auch nicht störte. Der Unterschied zwischen den beiden Zellpopulationen wurde später während der IFN-γ-induzierten Zelltodphase bedeutend. In den IFN-γ-behandelten DHFR-transfizierten Zellen sank die Farbstoffaufnahme von Tag 4 an (41Aa, 41Ab). Die mikroskopischen Beobachtungen bestätigten, dass dies in dem massiven Zelltod begründet war, der fast alle lebenden-adhärenten Zellen von den Platten eliminierte (41 Da). Der Tod wurde signifikanter (aber nicht vollständig) durch die Antisense-Cathepsin D-RNA-Expression inhibiert, wie dies durch die beibehaltenen Werte der Farbstoffaufnahme gezeigt wird (41Aa). Jede der beiden Antisense-Cathepsin D-RNA-exprimierenden polyklonalen Populationen zeigte einen signifikanten Anstieg des Anteils der Zellen, die durch den lebensfähigen Farbstoff während der IFN-γ-induzierten Zelltodphase gefärbt wurden (41Ab).
  • Ein weiterer Weg, den Schutz vor Zelltod zu messen, bestand in dem Zählen der Anzahl der Kolonien, die nach Entlassen der Kulturen aus der Langzeitbehandlung mit den Zytokinen gebildet wurden. Die reduzierte Empfänglichkeit der Antisense-transfizierten Zellen gegenüber einem Abtöten durch IFN-γ wurde durch einen Anstieg von 1–2 Logs in der Zahl der Zellen, die Kolonien bilden konnten, offenbar, nachdem IFN-γ von den behandelten Zellkulturen entfernt wurde (41B).
  • Um die Beteiligung von Cathepsin D an dem IFN-γ-induzierten PCD zu erforschen, wurden die HeLa-Zellen mit Pepstatin A inkubiert, einem spezifischen Inhibitor von Aspartylproteasen (Shields et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 177: 1006, 1991). Aufgrund der Tatsache, dass Cathepsin D eine intrazelluläre Hauptaspartylprotease in Zellen ist, wird das Ergebnis der intrazellulären Wirkungen dieses Pentapeptids für gewöhnlich der spezifischen Inhibition der Cathepsin D-Aktivität zugeordnet. Pepstatin A wurde dem Kulturmedium auf eine Endkonzentration von 10–4 M in 0,2% DMSO gemäß vorhergegangener Berichte zugefügt, wobei ähnliche Inkubationsprotokolle zu wirksamen intrazellulären Konzentrationen des Wirkstoffs führten (Shields et al., 1991). Pepstatin hatte keine Wirkung auf wachsende HeLa-Zellen, die nicht mit IFN-γ behandelt waren. Die Zugabe von Pepstatin A zu den IFN-γ-behandelten DHFR-transfizierten Zellen inhibierte zu einem gewissen Ausmaß den Abtötungsprozess, was durch die erhöhten Werte der Neutralrotfarbstoffaufnahme widergespiegelt wird (41C). Die höchsten Werte der Farbstoffaufnahme, die in Anwesenheit von IFN-γ gemessen werden konnten, wurden bei Anwendung von Pepstatin A auf Antisense-Cathepsin D-RNA-exprimierende Zellen erhalten (41C).
  • Die mikroskopische Untersuchung der IFN-γ-induzierten Zellkulturen, die durch Doppelbehandlung (Antisense-RNA + Pepstatin A) geschützt wurden, ergab, dass die Mehrzahl der Zellen einen normalen adhärenten Phänotyp zeigte, wohingegen nur ungefähr 20% der Zellen eine runde apoptotische Morphologie aufwiesen (41Db). Dies zeigt weiter, dass die kombinierte Reduktion von sowohl Expression als auch Aktivität dieser Endoprotease beim Schutz der Zellen vor IFN-γ-induziertem Zelltod am effektivsten war. Zusammenfassend lassen die Antisense-RNA- und Pepstatin A-Daten eine aktive Rolle von Cathepsin D an dem IFN-γ-mediierten PCD vermuten.
  • XIX. Regulation der Cathepsin D-Proteinexpression und -Prozessierung während des IFN-γ-induzierten PCD.
  • Die Wirkung von IFN-γ auf die Expression und das Prozessieren des Cathepsin D-Proteins wurden auf Immunoblots analysiert. Eine typische Veränderung der relativen Menge verschiedener Cathepsin D-Formen wurde in den behandelten Zellen nachgewiesen (41A und 42B). Die 48 Kd Form von Cathepsin D, die für gewöhnlich in Spuren in unbehandelten HeLa-Zellen nachgewiesen wird, stieg zwischen den Tagen 4–7 der IFN-γ-Behandlung schrittweise auf hohe Spiegel an. Im Gegensatz dazu waren die Gleichgewichtsspiegel der 30 Kd Form nicht erhöht (42B) und in einigen Experimenten waren sie zu den späten Zeitpunkten sogar reduziert (42A).
  • Das 48 Kd Cathepsin D ist eine proteolytisch aktive, einzelkettige Form, die oft in prälysosomalen Vehikeln gefunden wird. Sie wird normalerweise zu Lysosomen gelenkt, wobei sie weiter in eine doppelkettige Form (30 und 14 Kd) des Enzyms prozessiert wird (siehe das Schema in 42C – bemerken Sie, dass die in 42 verwendeten monoklonalen Antikörper gegen ein Epitop in der schweren 30 Kd Kette gerichtet sind). Die ungewöhnliche Anhäufung der 48 Kd Form lässt daher vermuten, dass das normale Prozessieren des Proteins während des IFN-γ-mediierten Zelltods unterbrochen ist. Zusätzlich waren an den Tagen 5–7 der IFN-γ-Behandlung die Spiegel des 48 Kd Vorläufers 8–10-fach höher als die Spiegel der 30 Kd Form vor der Behandlung (42A). Die erhöhten Gleichgewichtsspiegel von Cathepsin D-Proteinen könnten, zumindest zum Teil, aus den Erhöhungen der RNA resultieren.
  • Es ist bemerkenswert, dass sich in einigen, aber nicht allen Experimenten, die intrazellulären Spiegel der 52 Kd Präpro-Cathepsin D-Form erhöhten, wie auch nach IFN-γ-Behandlung der ursprünglichen Zellen (42A). Spuren der 52 Kd Form wurden auch in dem Kulturmedium gefunden, aber es wurden keine Wirkungen von INF-γ auf die Spiegel dieser sekretierten Form nachgewiesen (nicht gezeigt).
  • Die bedeutende IFN-γ-vermittelte Erhöhung des Cathepsin D-Proteins und die Anhäufung der intermediären Form wurden beide in den polyklonalen HeLa-Zellpopulationen, die die Antisense-RNA exprimierten, verhindert (42B; die berechneten Werte waren eine 8,2- und 1,1-fache Erhöhung durch IFN- in den Cathepsin D-Proteinformen für DHFR- bzw. Anticathepsin D-Transfektanten). Wenige unabhängig gebildete Antisense-exprimierende polyklonale Populationen wurden untersucht und keine von diesen zeigte erhöhte Spiegel von Cathepsin D in Antwort auf IFN-γ. Diese Befunde bestätigen daher, dass der große Überschuss der Antisense- über die Sense-RNA während der IFN-γ-Selektion wie erwartet wirksam den Gesamtspiegel des Cathepsin D-Proteins reduziert. Die Frage, warum die verbleibenden Spiegel, die in diesen IFN-γ-behandelten Zellen weiter exprimiert wurden, sich nicht als intermediäre Form von Cathepsin D anhäuften, ist noch offen.
  • XX. Die Cathepsin D Aspartylprotease vermittelt den APO-1/Fas- und den TNF-α-induzierten PCD.
  • Die Frage, ob die Cathepsin D-Protease auch in andere apoptotische Systeme einbezogen ist, die durch die Aktivierung von Zelloberflächenrezeptoren getriggert werden, die sich von den IFN-γ-Rezeptoren unterscheiden, wurde auch untersucht. Die verschiedenen HeLa-Zelltransfektanten wurden mit dem monoklonalen, agonistischen anti-APO-1-Antikörper behandelt, um zu bestimmen, ob Cathepsin D die Fas/APO-1-induzierte Apoptose vermittelt. Die ursprünglichen und die DHFR-transfizierten Zellen wurden wirksam von anti-Fas/APO-1-Antikörpern abgetötet. Der Zelltod zeigte Eigenschaften, die für Apoptose charakteristisch sind, ähnlich zu den IFN-γ-Wirkungen. Nach 40 Stunden rundeten sich ungefähr 70% der Zellen ab und lösten sich von den Platten (nicht gezeigt) und die Aufnahme von Neutralrotfarbstoff war folglich reduziert (43A). Das Abtöten benötigte eine kurze Vorbehandlung der Zellen mit einer niedrigen Dosis von IFN-γ (50 U/ml), welche selbst keine Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen hatte. Die niedrige Dosierung von IFN-γ sensibilisierte die Zellen für die Abtötung durch die agonistischen Antikörper aufgrund der Erhöhung der Fas/APO-1-Expression. Die Expression der Antisense-Cathepsin D-RNA oder alternativ die Zugabe von Pepstatin A zu dem Kulturmedium der DHFR-transfizierten Zellen unterdrückte den Fas/APO-1-vermittelten Zelltod wesentlich, was in einem erhöhten Anteil an lebenden Zellen resultierte (43A). Das Letztere zeigte, dass Cathepsin D für den Fas/APO-1-induzierten PCD wesentlich ist.
  • Es wurde auch gefunden, dass Pepstatin A den apoptotischen Prozess, der in U937 histiozytischen Lymphomzellen durch Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) getriggert wird, stört. Die Abtötung war in diesem System sehr schnell und durch typische nukleäre Veränderungen, wie z.B. Chromatinkondensation, gefolgt von seiner Fragmentierung, charakterisiert. Die DAPI-Färbung von U937-Nuklei zeigte, dass 6 Stunden nach TNF-α-Verabreichung ungefähr ein Drittel der Zellpopulation bereits Kerne mit typischem fragmentiertem Chromatin enthielt (43B). Die Zugabe von Pepstatin A zu den Kulturen zeigte eine signifikante Reduktion der Zahl der fragmentierten Nuklei (43B). Interessanter Weise schien der frühere Schritt der Chromatinkondensation weniger empfänglich für die Wirkung von Pepstatin A zu sein. Diese Daten zeigen, dass die Cathepsin D-Endoprotease auch einige kritische Schritte während des apoptotischen Signalwegs vermittelt, was zum U937-Zelltod führt.
  • Eine Untersuchung der Muster der Cathepsin D-Expression in den TNF-α-behandelten U937-Zellen ergab, dass es einige gemeinsame Merkmale mit dem HeLa-Zellsystem teilte. Die Gesamt-Spiegel der Cathepsin D-Proteine waren signifikant erhöht. Darüber hinaus akkumulierte die proteolytisch aktive intermediäre 48 Kd Form in diesen TNF--behandelten U937-Zellen, was zeigt, dass wiederum das Prozessieren in die doppelkettige Form unterbrochen war (42D). Aber im Gegensatz zu dem HeLa-Zellsystem war diese Umwandlung nicht vollständig blockiert und ein schwacher Anstieg der 30 Kd Form wurde auch nachgewiesen. Diese Daten legen ein gemeinsames Muster der Veränderung von Expression/Prozessierung des Cathepsin D-Proteins in wenigen apoptotischen Systemen nahe.
  • XXI. Die ektopische Expression von Cathepsin D ist nicht mit der Zelllebensfähigkeit kompatibel.
  • Das Ergebnis der Überexpression von Cathepsin D wurde direkt in HeLa-Zellen durch Co-Transfektionen mit dem LacZ-Gen, das als ein Marker der Genexpression verwendet wurde, gemessen. Cathepsin D wurde von dem Tetracyclin-repremierbaren Promotor gesteuert (Gossen and Bujard, PNAS 89: 5547–5551, 1992) und das -Galactosidasegen wurde von dem konstitutiven CMV-Promotor gesteuert. Die Morphologie der LacZ-enthaltenen blauen Zellen wurde 48 Stunden nach der Transfektion in Kulturen, die, um die Cathepsin D-Transkription/Translation zu erlauben, in Abwesenheit von Tetracyclin gehalten wurden, bestimmt. Es wurde gefunden, dass 70% der LacZ-enthaltenen Zellen nach Co-Transfektion mit Cathepsin D einen runden apoptotischen Phänotyp zeigten, wohingegen Co-Transfektionen mit dem Tetracyclin-Kontrollvektor einen Hintergrund von weniger als 20% apoptotischen Zellen zeigten (44A, 44B, 44C).
  • Um die Wirkungen der ektopischen Expression von Cathepsin D auf Zellen zu quantifizieren, wurden in einem zweiten unabhängigen Ansatz Co-Transfektionen mit Vektoren durchgeführt, die die sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) anstelle von LacZ exprimierten. In diesen Experimenten wurde das Ergebnis des Tetracyclinentzugs auf die SEAP-Aktivität, die von den das Cathepsin D-Gen tragenden Transfektanten freigesetzt wurden, gemessen. Es wurde gefunden, dass die Aktivität von Cathepsin D durch Tetracyclinentzug signifikant die SEAP-Aktivität, die in das Kulturmedium ungefähr 48 Stunden nach Transfektion sekretiert wurde, im Vergleich zu den Werten, die aus der gleichen Population erhalten wurden, die in Gegenwart von Tetracyclin gehalten wurden, erniedrigte (44D). Im Gegensatz dazu hatte der Tetracyclinentzug keine Wirkung auf die SEAP-Aktivität, die von Kontrollkulturen, die mit einem leeren Vektor co-transfiziert wurden, freigesetzt wurde.
  • XXII. DAP-Kinaseezpression in metastasierenden Zelllinien
  • (A) Experimentelle Vorgehensweise
  • (A1) Transfektionen
  • Die Transfektionen wurden durch Standardcalciumphosphattechnik durchgeführt.
  • (A2) Der In-vitro-Immunkomplextest für DAP-Kinase
  • Die Immunpräzipitation von rekombinantem DAP-Kinaseprotein aus 1 mg Gesamtextrakt transfizierter Zellen wurde mit 20 μl anti-FLAG M2-Gel (IBI, Kodak) in 200 μl PLB, das mit Protease- und Phosphataseinhibitoren supplementiert war, für 2 h bei 4°C durchgeführt. Nach drei Waschschritten mit PLB wurden die Immunpräzipitate einmal mit Reaktionspuffer (50 mM Hepes pH 7,5, 8 mM MgCl2, 2 mM MnCl2 und 0,1 mg/ml BSA) gewaschen. Die an die Kügelchen gebundenen Proteine wurden für 15 min bei 25°C in 50 μl Reaktionspuffer inkubiert, der 15 μCi[γ-32P]ATP (3 pmol), 50 mM ATP, 5 μg MLC (Sigma) und 1 μM bovines Calmodulin (Sigma) und 0,5 mM CaCl2 enthielt. Proteinprobenpuffer wurde zugegeben, um die Reaktion zu beenden, und nach dem Kochen wurden die Proteine auf 11% SDS-PAGE analysiert. Das Gel wurde auf eine Nitrocellulosemembran geblottet und die 32P-markierten Proteine durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
  • (A3) DAPI-Färbung von Nuklei vor und nach Behandlung mit TNF-α.
  • Exponentiell wachsende Zellen wurden mit einer Kombination von murinem TNF-α (100 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis) und Cycloheximid (5 μg/ml; Sigma) (rechte Bilder mit + markiert) oder mit Cycloheximid alleine (linke Bilder mit – markiert) behandelt. Die DAPI-Färbung wurde nach 6 Stunden durchgeführt. Die Zellen wurden auf Glasdeckplättchen (13 mm Durchm.) plattiert, 20.000 Zellen/Vertiefung in 1 ml Medium in einer Platte mit 24 Vertiefungen. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, fixiert und gleichzeitig permeabilisiert. Dies wurde durch Inkubieren der Deckgläschen für 5 min in einer Mischung von 3% Paraformaldehyd und 0,3% Triton X-100 in PBS und dann durch Inkubieren mit 3% Paraformaldehyd alleine für zusätzliche 20 min durchgeführt. Die Zellen wurden dreimal in PBS gewaschen und dann in Blockerlösung (5% normales Ziegenserum und 1% BSA in PBS) für 60 min inkubiert. DAPI (0,5 μg/ml; Sigma) wurde zu diesem Zeitpunkt zugefügt.
  • (B) Ergebnisse
  • Die DAP-Kinaseproteinexpression wurde in zwei Sätzen von stark und schwach metastasierenden Zelllinien, die aus Maus Lewis- und CMT64-Lungenkarzinomzellen ausgewählt waren, untersucht. Hochinteressanterweise exprimierten die zwei verschiedenen stark metastasierenden Zelllinien keine) DAP-Kinase-mRNA (nicht gezeigt) oder -Protein, wohingegen ihre schwach metastasierenden Zellgegenstücke DAP-Kinase positiv waren (siehe 17 für A9-F- und D122-Unterlinien von murinem Lewis-Lungenkarzinom, die schwach bzw. stark metastasierende Fähigkeiten zeigen). Das Ziel war dann, in die stark metastasierenden D122-Zellen eine funkionelle DAP-Kinase einzuführen und den Einfluss dieser genetischen Manipulation auf das tumorigene und metastasierende Potential dieser aggressiven Tumorzellen zu testen.
  • Mit FLAG-Tag versehene Wildtyp-DAP-Kinase, die in pCDNA3 kloniert war, wurde in die D122-Zellen durch Calciumphosphat-Co-Präzipitationstechnik transfiziert. Ein leerer pCDNA3-Vektor wurde für die Kontrolltransfektionen verwendet. Einige stabile DAP-Kinase-positive Klone wurden isoliert, die in schwach (6-DAP-Kinase), schwach-mittel (48-DAP-Kinase), mittel (28-DAP-Kinase) und hoch (42-DAP-Kinase) exprimierende Zellen klassifiziert wurden (17; die schwach metastasierenden A9-F-Zellen wurden als Referenz verwendet). Drei Klone, die mit dem Kontrollvektor transfiziert waren, exprimierten wie erwartet keine DAP-Kinase (17). Danach wurde ein In-vitro-Immunkomplextest auf DAP-Kinase nach Immunpräzipitation durch die anti-FLAG-Antikörper durchgeführt, um zu testen, ob die exogen exprimierte Kinase aktiv ist. Es wurde bei Verwendung von Myosin leichte Kette (Myosin Light Chain; MLC) Protein als Substrat gefunden, dass das DAP-Kinaseprotein aus dem transfizierten Vektor katalytisch aktiv exprimiert wird (18).
  • Die Wachstumsgeschwindigkeit in Kulturen der DAP-Kinase-positiven Transfektanten in Medium, das 10% oder 1% fötales Kälberserum (FCS) enthielt, war der der Kontroll- und ursprünglichen Klone ähnlich (19). Die einzige Ausnahme war der 42-DAP-Kinaseklon, der bei der hohen Serumkonzentration aufgrund einiger Störungen der Cytokinese etwas langsamer wuchs (zweifacher Anstieg in der Verdoppelungszeit). Die DAPI-Färbung der Nuklei der 42-DAP-Kinase-Zellen, die in 10% FCS-haltigem Medium wuchsen, zeigte, dass der Anteil der fragmentierten Nuklei unter 0,1% lag (27), was zeigte, dass die DAP-Kinase selbst sogar in dem hoch exprimierenden stabilen Klon die Apoptose nicht triggerte. Zusammengenommen wurde geschlossen, dass die Wiederherstellung der DAP-Kinaseexpression entweder keine oder nur geringe Wirkungen auf das kontinuierliche Wachstum der Zellen in Kultur hatte.
  • XXIII. In-vivo-Aktivität von DAP-Kinase-transfizierten Zellen
  • (A) Experimentelle Vorgehensweise
  • (A1) Experimentelle Metastasenbildung.
  • Die verschiedenen D122-transfizierten Klone wurden in die Schwanzvenen von 10–12 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen injiziert (5 × 105 Zellen pro Maus). Die Mäuse wurden 30–32 Tage später getötet, ihre Lungen wurden entfernt, gewogen und in Bouin-Lösung fixiert. Die Zahl der metastatischen Knoten wurde durch Zählen der Oberflächenknoten unter dem Binokular bestimmt.
  • (A2) Lokaler Tumorwachstumstest
  • Die verschiedenen D122-transfizierten Klone wurden in die Fußballen von C57BL/6-Mäusen (10–12 Wochen alte Weibchen) injiziert; (2 × 105 Zellen pro Maus). Die Durchmesser der Tumor-tragenden Füße wurde unter Verwendung eines Tastzirkels alle 1–3 Tage gemessen. Wenn der Tumordurchmesser 8–9 mm erreichte, wurden die Tumortragenden Füße unter dem Knie amputiert und am Tage des Todes die resultierenden spontanen Lungenmetastasen in jeder einzelnen Maus gezählt. In wenigen Fällen wurden die Tumorzellen in Kultur von entnommenen Lungenknoten gewonnen und, wie alle D122-Transfektanten in Medium, das 10% fötales Kälberserum enthielt, das mit G-418 (800 μg/ml) supplementiert war, wachsen gelassen.
  • (B) Ergebnisse
  • Das tumorigene und metastatische Potential der mit DAP-Kinase transfizierten Zellen wurde in Mäusen getestet, wo sie einer Vielzahl von Tod-induzierenden Signalen ausgesetzt werden könnten. Zum Beispiel müssen die einwandernden Tumorzellen im Blutstrom dem programmierten Zelltod widerstehen, der durch die Wechselwirkungen mit cytotoxischen T-Lymphozyten, natürlichen Killerzellen und Makrophagen und mit den Zytokinen, die diese hämatopoetischen Zellen sezernieren (z.B. IFNs, TNF, IL-1β) induziert wird. Sie müssen auch den apoptotischen Zelltod, der durch Stickoxidanionen, die von Endothelzellen hergestellt werden, widerstehen und mechanische Scherkräfte aushalten, die von haemodynamischen Turbulenzen verursacht werden. Darüber hinaus triggern auch lokal produzierte inhibitorische Zytokine (z.B. TGF-β) oder der Verlust von Zellmatrixinteraktionen (z.B. die Ablösung von den Untergrundmembranen) den apoptotischen Zelltod während der Einwanderungs- oder Auswanderungsprozesse und während des Wachstums in einer feindlichen Mikroumgebung.
  • Die Injektionen in syngene C57BL/6-Mäuse bestanden aus zwei verschiedenen experimentellen Systemen und wurde in drei unabhängigen Experimenten wiederholt. Eine Gruppe erhielt Injektionen in die Fußballen (2 × 105 Zellen pro Injektion), um das lokale Tumorwachstum zu verfolgen. Die zweite Gruppe erhielt intravenöse Injektionen (5 × 105 Zellen pro Injektion), um experimentelle Metastasen in der Lunge zu verfolgen.
  • Es wurde gefunden, dass das Wachstum von lokalen Tumoren in den Fußballen signifikant im Vergleich zu den ursprünglichen und den G418-resistenten Kontrollklonen verzögert war und dass die Länge der Verzögerung direkt proportional zu den Spiegeln der ektopisch exprimierten DAP-Kinase war (20; eine Lag-Phase von 10 Tagen war bei dem mittel exprimierenden Klon (28-DAP-Kinase) charakteristisch und eine Verzögerung von mehr als 50 Tagen charakterisierte den hoch exprimierten Klon (42-DAP-Kinase)).
  • Um die Wirkung der DAP-Kinase auf die experimentellen Metastasen zu untersuchen, wurden die Lungen 30–32 Tage nach den intravenösen Injektionen untersucht. Die Metastasenbildung war stark unterdrückt, was durch das mittlere Lungengewicht und durch die mittlere Zahl an metastatischen Läsionen gemessen wurde (21, 22). Der experimentelle Metastasenbildungstest war gegenüber DAP-Kinaseexpression sehr viel sensitiver als der lokale Tumorwachstumstest. In dem Lungentest zeigen sogar die schwach und schwach-mittel exprimierenden Klone (6-DAP-Kinase bzw. 48-DAP-Kinase) eine fast maximale Reduktion des Lungengewichts und der Zahl der metastatischen Läsionen, wohingegen die Wirkungen auf das lokale Tumorwachstum bei den schwachmittel bzw. schwach exprimierenden Klonen sehr schwach oder sogar nicht nachweisbar waren.
  • XXIV. Verlust und Wiederherstellung der metastatischen Suppression
  • (A) Erebgnisse
  • Eine spontane Metastasenbildung erschien schließlich in den Lungen aller Experimente, die den 28-DAP-Kinaseklon verwendeten, und in einigen, aber nicht allen, 42-DAP-Kinasekloninjektionen, nachdem die tumortragenden Beine amputiert waren. Es war interessant zu untersuchen, ob die mittel und hoch DAP-Kinase-exprimierenden Klone, die schließlich in den Mäusefußballen (nach der Lag-Phase) wuchsen und die in der Lage waren, spontane Metastasen nach der Amputation der tumortragenden Beinen in den Lungen zu bilden, in vivo auf Verlust oder Inaktivierung des transfizierten Gens selektioniert wurden. Es wurde gefunden, dass die Zellen, die in Kulturen aus den Lungen der Mäuse, die Injektionen der 28-DAP-Kinase- und 42-DAP-Kinaseklone erhalten hatten, freigesetzt wurden, Spuren oder sogar nicht nachweisbare Spiegel von exogener DAP-Kinase exprimierten (23, Spuren 1, 2; 24, Spuren 1, 2; 25, Spur 1). Eine starke Selektion auf Abschwächung der ektopischen DAP-Kinaseexpression trat in vivo daher wahrscheinlich während der Lag-Phase auf, bevor die Fußballen einbezogen waren.
  • Es war möglich, die volle Expressionskapazität des transfizierten Gens in dem Klon 28-DAP-Kinase, der der In-vivo-Selektion unterlag, durch Behandeln der Zellen in Kultur mit dem Demethylierungsmittel 5-Aza-2'-desoxycytidin wieder herzustellen (25, Spuren 1, 2). Die Wiederherstellung war transient und die DAP-Kinasespiegel kehrten auf ihre unterdrückten Spiegel einige Passagen nach Entfernen des Wirkstoffs zurück (25, Spuren 3, 4). Keine Wirkung wurde in den ursprünglichen D122-Zellen nachgewiesen, die fortfuhren, einen Mangel an DAP-Kinaseexpression nach ähnlichen Behandlungen mit 5-Aza-2'-desoxycytidin aufzuweisen (nicht gezeigt). Die In-vivo-Selektion auf abgeschwächte Expression des transfizierten DAP-Kinasegens trat daher durch DNA-Methylierung auf, einem epigenetischen Mechanismus, der häufig von humanen Tumoren verwendet wird, um verschiedene Tumorsuppressorgene einschließlich des endogenen DAP-Kinasegens in Blasenkarzinomzellen abzuschalten. Diese Abschwächung trat in den 28-DAP-Kinasetransfektanten, die von den experimentellen Metastasen befreit wurden, d.h. von den sehr wenigen kleinen Metastasen, die in den Lungen nach Injektionen in die Vene vorhanden waren, nicht auf. Wie in 23 (Spuren 3, 4) gezeigt, waren die DAP-Kinasespiegel mit jenen identisch, die in dem originalen injizierten Klon nachgewiesen wurden. Dies ist mit der starken Unterdrückung des metastatischen Phänotyps, der oben beschrieben wurde, konsistent.
  • XXV. Antwort der DAP-Kinase-transfizierten Zellen auf apoptotische Stimuli
  • (A) Experimentelle Vorgehensweise
  • (A1) In-situ-TUNEL-Färbung – apoptotischer Index.
  • Fragmente von Mäusefußballen wurden für 12 Stunden in 4% Pufferformaldehyd (Frutarom) fixiert, in Paraffin eingebettet und geschnitten (4 μm dick). Die TUNEL-Tests wurden auf diesen Schnitten (Peroxidasefärbung von fragmentierter DNA und Gegenfärbung der Schnitte mit Methylgrünfarbstoff) gemäß den Angaben des Herstellers (ApopTag® Plus Peroxidase Kit; Oncor, Gaithersburg) durchgeführt. Sechs verschiedene Schnitte wurden ausgezählt; in jedem Fall wurden 500–1000 Tumorzellen gezählt und der mittlere apoptotische Index wurde berechnet. Die Mittelwerte waren 6,3% ± 1,13 und 1,9% ± 0,35 für 42-DAP-Kinase bzw. 4-cont.. Der Unterschied war mit P << 0,001 signifikant.
  • (A2) Weichagar-Verankerungs-unabhängiges Wachstum.
  • Die verschiedenen Klone wurden in 0,33% Weichagar (Bacto-agar; Difco) bei einer anfänglichen Zellzahl von 5 × 103 Zellen pro 6 cm Platte auf einer Schicht, die 0,5% Agar enthielt, kultiviert. (A) Die Durchmesser der Klone, die am Tag 7 auftraten, wurden unter einem Lichtmikroskop gemessen. Die Werte sind Mittelwerte des Koloniedurchmessers von 100 Klonen für jede Gruppe ±SD. Der Unterschied zwischen den Kontrollen (z.B. 18-cont.) und den DAP-Kinasetransfektanten (z.B. 1-DAP-Kinase) war mit P << 0,001 signifikant. (B) Mikroskopische Aufnahmen von Klonen, die in Weichagar für sieben Tage wie in (A) kultiviert wurden, wobei die ursprünglichen D122-Zellen (links: a, c) mit DAP-Kinase-42-Zellen (rechts: b, d) verglichen wurden. Die Balken entsprechen 350 mm in den oberen Bildern (a, b) und 80 mm in den unteren Bildern (c, d).
  • (B) Ergebnisse
  • Um herauszufinden, ob die anti-tumorigenen und anti-metastatischen Wirkungen der DAP-Kinase aus einer erhöhten Sensitivität der Zellen gegenüber apoptotischen Signalen resultierten, wurde in situ eine TUNEL-Färbung auf histologischen Schnitten der Mäusefußballen fünf Tage nach der Injektion durchgeführt. Die Färbung verdeutlicht, dass der apoptotische Index in den langsam wachsenden lokalen Tumoren, die durch die DAP-Kinase-transfizierten Zellen gebildet wurden, signifikant höher war als der Wert, der in der Tumormasse gemessen wurde, die durch den Kontrollklon gebildet wurde (26). Die berechneten Werte waren 6% bzw. 2%, was einen unerhörten Unterschied in dem Gesamtzelltod im Hinblick auf die schnelle Eliminierung von apoptotischen Zellen durch Makrophagen und durch Nachbarzellen reflektieren sollte. Die In-situ-Färbung ergab den ersten Hinweis, der das DAP-Kinasegen in die Erhöhung der Schwellensensitivität der Tumorzellen gegenüber verschiedenen apoptotischen Signalen einschloss.
  • Um dieser Frage weiter direkt nachzugehen, wurden einige definierte Arten apoptotischer Stimuli in Kulturen appliziert, von denen einer das Tod-induzierende Zytokin TNF-α war. Es wurde gefunden, dass der Klon 42-DAP-Kinase eine höhere Sensitivität gegenüber TNF--induziertem Zelltod zeigte, was durch DAPI-Färbung der Nuklei wenige Stunden nach Verabreichung des Zytokins gemessen wurde (27, 28). Interessanterweise ging diese erhöhte Sensitivität gegenüber apoptotischen Wirkungen von TNF-α nach der In-vivo-Selektion des Klons 42-DAP-Kinase auf abgeschwächte DAP-Kinaseexpression verloren, wodurch die DAP-Kinaseexpression und die Apoptose vor dem gleichen genetischen Hintergrund direkter verbunden werden (28).
  • Andere Typen von apoptotischem Stress wurden den Zellen durch Übertragung in Weichagar auferlegt, wobei ihr Verankerungs-unabhängiges Wachstum getestet werden konnte. Im Gegensatz zu den großen Kolonien, die in Weichagar von den ursprünglichen D122-Zellen und den Kontrollklonen gebildet wurden, bildeten die DAP-Kinasetransfektanten verkümmerte kleine Kolonien, in welchen die meisten Zellen starben (29, 30). Eine Rückkehr zu großen Kolonien wurde erhalten, wenn der zuvor genannte in vivo selektionierte 42-DAP-Kinaseklon, der eine abgeschwächte DAP-Kinaseexpression zeigt, getestet wurde (Daten nicht gezeigt). Es wurde daher geschlossen, dass der Zelltod, der durch Ablösen von der extrazellulären Matrix oder durch bisher noch nicht identifizierte Mechanismen, die während des Verlusts des Verankerungs-abhängigen Wachstums wirken, induziert wird, von der Gegenwart von funktioneller DAP-Kinase abhängt. Dies ist ein Beispiel für nicht Zytokin-induzierten programmierten Zelltod.
  • XXVI. Nicht-Zytokin-Auslöser des programmierten Zelltods
  • Zusätzlich zu programmiertem Zelltod, der durch Ablösung von der extrazellulären Matrix ausgelöst wird, tritt ein weiteres Beispiel von nicht Zytokin-induziertem Zelltod in reifen neuronalen Zellen auf, die einen apoptotischen Zelltod in Antwort auf verschiedene Stresssituationen erleiden, einschließlich einem Mangel an neurotrophen Faktoren, Anoxie, Exzitotoxizität, traumatischer Verletzung oder neurodegenerativen Störungen. Wenn der Tod von post-mitotischen Neuronen im ZNS eines Säugerorganismus auftritt, ist dies schädlich, da es keine Regeneration dieses Gewebes gibt. Das Ergebnis einer solchen Läsion wäre dann ein permanenter Verlust der Funktion.
  • Um die Wirkung von DAP-Molekülen auf nicht Zytokin-induzierten programmierten Zelltod in Neuronen zu untersuchen, können primäre Kulturen von Hippocampus-Neuronen aus 18 Tage alten Rattenembryonen hergestellt werden. Diese Zellkulturen können als Modell für bestimmte Szenarien dienen, in denen der Zelltod getriggert wird.
  • Es gibt einige Vorteile bei der Verwendung einer Hippocampus-Zellkultur: (1) Es ist eine homogene Kultur von Neuronen im Hinblick auf ihre Zelloberflächenrezeptoren für Neurotransmitter; (2) Hippocampus-Neuronen sind am stärksten empfänglich für die Induktion von Zelltod durch verschiedene Bedingungen: Exzitotoxizität (z.B. Glutamat), Anoxie, Sauerstoffradikale, Entzug von trophischen Faktoren. Zum Beispiel kann die katalytisch inaktive mutierte Version (K42A) verwendet werden, um die Rolle der DAP-Kinase in diesen Systemen zu testen. Ein Adenovirus-vermitteltes Gentransfersystem kann verwendet werden, um die K42A DAP-Kinase in die ruhenden Nervenzellen einzuführen und die apoptotischen Antworten der verschiedenen Nicht-Zytokin-Auslöser können beurteilt werden.
  • Andere Nicht-Zytokin-Auslöser von programmiertem Zelltod in Säugerzellen schließen im Allgemeinen Bestrahlung (sowohl γ als auch UV), das p53-Gen etc. ein.
  • Während die vorliegende Erfindung in Hinblick auf eine der bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, wird erwartet, dass verschiedene Modifikationen und Verbesserungen dem Fachmann nach Überdenken dieser Offenbarung in den Sinn kommen werden.
  • Der Umfang der Erfindung soll nicht so ausgelegt werden, dass er auf die hier ausgeführten, der Veranschaulichung dienenden Ausführungsformen beschränkt ist, sondern soll anhand der beigefügten Ansprüche bestimmt werden.

Claims (6)

  1. Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Expressionsvektors, umfassend die DNA-Sequenz SEQ ID NR. 3, die fähig ist, den programmierten Zelltod herbeizuführen, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung metastasierender Tumorzellen.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz ein DNA-Molekül ist, das dasselbe, von der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR. 3 kodierte Protein oder Polypeptid kodiert.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz ein Fragment der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR. 3 ist, das ein Protein oder ein Polypeptid kodiert, das die in dem von der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR. 3 kodierten Protein oder Polypeptid vorhandene Aktivität des Herbeiführens des programmierten Zelltods bewahrt.
  4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung gemeinsam mit einem Zytokin für die Verabreichung kombiniert wird.
  5. In-vitro-Verfahren zur Bestimmung der Prognose einer von metastasierenden Tumorzellen verursachten Krankheit, umfassend: (a) Zugeben einer Nukleinsäure-Sonde zu einer aus einem an der besagten Krankheit leidenden Individuum erhaltenen Probe, wobei die Probe ein Gewebeschnitt oder entweder aus Zellen erhaltene genomische DNA oder mRNA oder aus der mRNA hergestellte cDNA ist, wobei die Sonde eine Sequenz ist, ausgewählt aus: (i) der mit SEQ ID NR. 3 bezeichneten DNA-Sequenz; (ii) der mit Bezug auf (i) modifizierten DNA-Sequenz, wobei die Modifikation aus der Addition, Deletion oder dem Ersetzen eines oder mehrerer Nukleinsäure-Tripletts besteht, wobei die modifizierte DNA-Sequenz die Fähigkeit bewahrt, unter stringenten Bedingungen mit der Sequenz von (i) zu hybridisieren; (iii) der Sequenz, die ein Antisense zu der gesamten oder einem Teil der DNA-Sequenz von (i) oder (ii) ist und fähig ist, die Expression der mit SEQ ID NR. 3 bezeichneten DNA-Sequenz zu inhibieren; und (iv) der RNA-Sequenz, die komplementär zu der DNA-Sequenz von (i), (ii) oder (iii) ist; (b) Bereitstellen stringenter Bedingungen für die Hybridisierung zwischen der Sonde und der Probe; und (c) Bestimmen auf der Basis der Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, ob ein an dem programmierten Zelltod beteiligtes Gen mit der durch metastasierende Tumorzellen verursachten Krankheit assoziiert ist, wobei eine Abwesenheit der Hybridisierung ein Fehlen des Gens anzeigt und eine nicht normale Hybridisierung eine mögliche Inaktivierung des Gens anzeigt.
  6. In-vitro-Verfahren zur Bestimmung der Prognose metastasierender Tumorzellen, umfassend: (a) Zugeben eines spezifischen Antikörpers, der fähig ist, ein von der mit SEQ ID NR. 3 bezeichneten DNA-Sequenz kodiertes Protein zu binden, zu einer aus einem an der Krankheit leidenden Individuum erhaltenen Probe, wobei die Probe ein Zellextrakt oder ein Gewebeschnitt ist; (b) Bereitstellen von Bedingungen für die Bindung des Proteins in der Probe durch den Antikörper; und (c) Bestimmen auf der Basis der Bindung des Proteins, ob ein an dem programmierten Zelltod beteiligtes Protein mit den metastasierenden Tumorzellen assoziiert ist, wobei ein Fehlen der Bindung eine Abwesenheit des Proteins anzeigt und eine nicht normale Bindung eine mögliche Modifikation des Proteins anzeigt.
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