JP2002511739A - プログラムされた細胞死を含む疾患の治療用組成物 - Google Patents

プログラムされた細胞死を含む疾患の治療用組成物

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Abstract

(57)【要約】 転移性の病的な細胞増殖に関連した疾患または障害の治療において用いられる薬学的組成物の調製における、プログラムされた細胞死を誘導することができるDNAの使用。同様に、非サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死を促進することができるDNA配列を、制御されない病的な細胞増殖に関連した疾患または障害の治療に、または非サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死に関連した疾患または障害の治療に有用な薬学的組成物の調製に使用することについても記述する。

Description

【発明の詳細な説明】 プログラムされた細胞死を含む疾患の治療用組成物 発明の分野 本発明は、プログラムされた細胞死の遺伝子およびその産物の分野に関する。 発明の背景 細胞の増殖状態を決定する要因の一つは、癌原遺伝子の増殖促進作用と、腫瘍 抑制遺伝子の増殖抑制作用とのバランスである。 これらの腫瘍抑制遺伝子がその増殖抑制作用を発揮する一つのメカニズムは、 細胞を生理的なタイプの死に誘導することによる。そのような制御された細胞死 は、変態、神経のシナプス発生、受容体の種類選択時のリンパ球の死、骨髄およ び他の増殖組織における制御された生体恒常性等を含む、多数の生理条件におい て明らかである。そのような細胞死は、例えば、適したサイトカインの活性を通 じて、細胞と他の細胞または細胞産物との相互作用によって調節される。 抑制遺伝子を不活化する遺伝子変異は、他の細胞またはサイトカインによって 与えられる正常な増殖抑制から細胞を解放し、その結果外部シグナルと何の関係 もない、制御されない増殖または細胞生存率が起こる。この制御されない増殖が 腫瘍発生の第一段階である。 今日まで、十分に特徴付けがなされていた腫瘍抑制遺伝子は、網膜芽細胞腫（ Rb）遺伝子、p53、DCC、NM23 WT-1、NF-1、APCそしてras抑制遺伝子を含むほん の数個に過ぎない。上記遺伝子のいずれか、発現の遮断または偽タンパク質産生 のいずれかが起こる両対立遺伝子における変異はおそらく、増殖の正常な制御お よび細胞の生存を妨害し、このため癌を生じる可能性がある。 プログラムされた細胞死と腫瘍発生の多段階プロセスとの間には多くの関連が 発見されている。最初の発見は、ヒト濾胞性リンパ腫における典型的な染色体転 座によって活性化されるBc12遺伝子が、細胞死の抑制因子であるという知見であ る（ツジモトら（Tsujimoto Y.）、1985、Nature 315：340〜343）。第二の関連 は、様々なヒト腫瘍において最も一般的な変異した腫瘍抑制遺伝子であるp53が 、アポトーシスの正のメディエータとして機能するという知見であった。P53は ゲントキシック（gentoxic）障害および低酸素症のような異なるストレスに反応 して細胞死を誘導する。このように、細胞生存率が増加した後に遺伝子障害の蓄 積および腫瘍の制御されない増殖が起こることは、p53の不活化変異によって腫 瘍発生が促進されるメカニズムの中に含まれる（ローウェら（Lowe，S.W.）、19 93、Nature 362：847〜849）。近年、結腸直腸癌の初期においてしばしば失われ ている、または不活化されている腺腫様多発結腸ポリープ（APC）の腫瘍抑制遺 伝子は、培養した結腸直腸細胞の死を誘導することが報告され（モーリンら（Mo rin）、1996、Proc．Natl．Acad．Sci．93：7950〜54）、このようにアポト一シ ス制御との第３の関連が示された。別の研究では、微小転移におけるアポトーシ スは、循環中の血管新生阻害剤の濃度が減少した結果として、血管新生の誘導後 に有意に減少することが判明した（ホルムグレンら（Holmgren，L.）、1995、Na ture Medicine 1：149〜153)。しかし、原発腫瘍の解離、播種および浸潤プロセ スのような転移の初期段階に関してはほとんど明らかになっていない。 増殖抑制性サイトカインは、標的細胞に対して二重の作用を有する。それらは 、細胞の増殖を阻害することができる、および／または細胞死を生じることがで きる。今日まで、既知の腫瘍抑制遺伝子の発現を遮断または活性化するとそれぞ れ、細胞増殖のサイトカインによる阻害に拮抗する、またはこれを増強する（キ ムチ（Kimchi A.）による総説、1992、J．Cell．Biochem．50：１〜９）ことが 示されたが、サイトカインの細胞死促進作用に対しては全く影響を及ぼさなかっ た。例えば、TGF-βのようなサイトカインに対する増殖阻害反応は、Rb遺伝子の 不活化によって著しく低下する、またはIL-6に対する反応は、活性化されたp53 遺伝子の導入によって増強される（ピーテンポルら（Pietenpol）、1990、Cell 61：777〜785；レヴィら（Levy）、1993、Mol．Cell．Biol．13：7942〜7952） 。 小さい水素担体タンバク質であるチオレドキシンは、これまでHeLa細胞のIFN- γ媒介増殖停止に関係していた（ダイス＆キムチ（Deiss，L.P．andKimchi，A. ）、1991、Science 234：117〜120）。 発明の要約 以下の明細書において、「プログラムされた細胞死」という語は、何らかの細 胞メカニズムの活性化の結果生じた生理的なタイプの細胞死、すなわち機械とし ての細胞によって制御される死を指す。プログラムされた細胞死は、例えば外部 誘因、例えばサイトカインによって機械としての細胞の活性化の結果である可能 性があり、これによって細胞死が起こる。「アポトーシス」という語もプログラ ムされた細胞死と互換に用いられる。 以下の明細書における「腫瘍」という語は、制御されずに増殖する異常な細胞 塊を指す。この語には、良性であっても悪性であってもよい原発腫瘍と共に、生 体の他の部位に広がった二次腫瘍または転移が含まれる。 本発明は、特定の遺伝子発現の阻害がプログラムされた細胞死に対抗するとい う先駆的知見に基づいている。すなわち、これらの遺伝子が正常に機能する限り 、細胞死が誘導される；該遺伝子の発現が阻害されれば、細胞死は阻害される。 それによって、これらの遺伝子の正常な発現産物は、サイトカイン誘導型または 非サイトカイン誘導型の双方のプログラムされた細胞死に関係しているというこ とになる。HeLa細胞では、サイトカインであるIFN-γは、最初の細胞増殖抑制相 そしてその後の細胞毒性相（プログラムされた細胞死）を含む、二相性のプロセ スを誘導する。本発明において発見された新規遺伝子は、後者のみ、すなわち細 胞毒性相のみに影響を及ぼすことが判明した。本明細書において、これらの遺伝 子を「DAP（細胞死関連タンパク質）遺伝子」と呼ぶ。DAP遺伝子の発現産物また は同様の生物活性を有する発現産物をコードするコード配列を含むDNA分子は、 本明細書において集合的に「DAP DNA分子」と呼ぶ。DAP DNA分子の発現産物は本 明細書において集合的に「DAP産物」と呼ぶ。 本発明は、さらに、転移する細胞は細胞内のアポトーシス・メカニズムが欠損 している可能性があるという先駆的知見にさらに基づいている。このように、転 移の際に、腫瘍細胞はいくつかの新しいタイプのアポトーシス刺激に遭遇するが 、細胞は転移し続ける。 細胞におけるアポトーシスメカニズムの機能不全に至る欠損を修正することに よって、細胞の転移性特徴が抑制されることがさらに発見された。 本明細書において「細胞死促進局面」として呼ぶ本発明の一つの局面に従って 、 上記DAP DNA分子、それを含む発現ベクター、またはDAP産物は、正常または腫瘍 細胞の死を促進するために、および腫瘍細胞の転移活性を抑制するために用いら れる。細胞死促進局面は、制御されない病的な細胞増殖、例えば癌（原発癌およ び転移）、乾癬、自己免疫疾患等に関連した疾患または障害の治療において特に 応用される。DAP DNA分子または、細胞外に産生されるならばDAP産物、を遺伝子 療法に使用する際には、本発明の細胞死促進局面に従って、サイトカインによる プログラムされた細胞死の治療において、サイトカイン、例えばIFN-γと併用し てもよい。 本明細書において「細胞死予防局面」として呼ばれる、発明のもう一つの局面 に従って、該DAP DNA分子の発現を予防する物質、またはDAP産物に拮抗、阻害、 または中和する物質は、プログラムされた細胞死から細胞を保護するために用い られる。発明の細胞死予防局面について考えられる応用例は、特定の神経サブセ ットの未成熟な死亡に関連している、アルツハイマー病、またはパーキンソン病 のような様々な変性性神経疾患における細胞死の予防；その死がプログラムされ た細胞死に類似している、AIDS患者におけるT-細胞の死の予防；少なくともその 一部がプログラムされた細胞死の結果であると考えられる、移植における拒絶関 連細胞死の予防；特定の抗癌剤療法の細胞障害作用からの正常な細胞の保護、で ある。 本発明において時に「予後的局面」と呼ばれる本発明のさらなる局面に従って 、DAP DNA分子は、疾患がDAP遺伝子活性の欠損に関連しているか否か、およびい ずれの治療様相が有効であるかを調べるために、疾患に苦しむ人を調べるために 、用いられる。例えば、DAP陽性細胞は、アポトーシスの誘導によって作用する 化学療法剤による制御をより受けやすい可能性があるため、治療様相の選択は細 胞のDAP状態に基づいて行ってもよい。 この局面に従って、個体におけるDAP DNA分子のそれぞれの配列をそれぞれのD AP遺伝子の配列と比較することによって、またはRNAおよび／またはタンパク質 の発現後に試験を行う。 例えば、DAP DNA分子の存在および／または組成物は、サザンブロット分析お よび／またはPCRによって評価してもよい。mRNAはノザンブロットおよび／また は逆転写PCR（RT-PCR）によって分析してもよく、その後配列分析および／また は組織切片のインサイチュー・ハイブリダイゼーションによって分析してもよい 。タンパク質の発現は、DAPタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタン分析 によって、または組織切片のインサイチュー免疫染色によって、細胞抽出物にお いてモニターしてもよい。DAP遺伝子が存在しないこと、部分的欠失または必須 領域における変異を示すその他の配列の違い、またはその結果機能が喪失する可 能性があるDAP RNAおよび／またはタンパク質の欠損は、癌および／または転移 に対する素因となる可能性がある。好ましくは、異なる抗体と共に、一組の異な るDAP遺伝子を用いてもよい。 DAP遺伝子はプログラムされた細胞死において重要な役割を果たしているよう に思われ、それらの発現を阻害すれば、またはそれらの発現産物を中和すれば、 サイトカイン促進細胞死から細胞が保護される。そのような遺伝子の例は、図６ 、８、12、15および16に示す遺伝子、またはその部分配列を図13に示す遺伝子で ある。その配列が図14に示される既知のプロテアーゼであるカテプシンDの遺伝 子もまた、DAP遺伝子として機能することが本明細書において初めて明らかとな る。 発明の細胞死促進局面において有用なDAP DNA分子は、DAP遺伝子の核酸配列ま たはDAP産物と類似の生物活性を有する産物をコードするその他の配列を有して もよい。そのようなDAP分子には、DAP遺伝子の配列以外の配列を有するが、遺伝 子コードの縮重特性のために、DAP遺伝子によってコードされるものと同じタン パク質またはポリペプチドをコードするDNA分子が含まれる。 特定の生物機能にとって必須ではない特定のアミノ酸を置換または欠失するこ とによって、またはタンパク質の生物機能に必須ではない領域にアミノ酸を付加 することによって、そのような改変がタンパク質の生物活性に本質的に影響を及 ぼすことなく、タンパク質を改変することが時に可能であることは周知である。 このように、発明の細胞死促進局面において有用なDAP DNA分子もまた、そのよ うな改変されたタンパク質をコードする改変配列を有してもよい。改変された配 列は、１つ以上の核酸トリプレット（配列のオープンリーディングフレームにお いて）が付加、欠失、または置換されている、DAP遺伝子の配列または上記の変 性配列の配列に由来する配列を有し、それによってコードされるタンパク質産物 はDAP産物の本質的な生物特性を保持する。さらに、時に、タンパク質断片は、 親の断片化されていないタンパク質の本質的な生物特性を保持しているため、発 明の細胞死促進局面において有用なDAP DNA分子はそのような断片をコードする 配列も有してもよい。 例えば、DAP-2（DAP-キナーゼ）の導出アミノ酸構造は、この酵素がセリン／ トレオニンタイプのキナーゼであることを示唆している。そのキナーゼドメイン は、セリン／トレオニンキナーゼに典型的なサブドメイン11個を含み、他のキナ ーゼのカルモジュリン調節ドメインと有意な相同性を有する領域がその後に続く ことが判明した。後者に隣接して、アンキリン・リピート８個が認められるが、 その後には２つのＰループ・モチーフが続くことが判明した。その上、典型的な 細胞死ドメインの基本単位はタンパク質の3'末端で確認され、その後にセリンお よびトレオニンに富むアミノ酸の枝が続く（ファインスタインら（Feinstein） 、1995、Trends Biochem．Sci.20：342〜44）。当業者は、そのような情報に基 づいて、およびさらに後述するように、活性を有する改変されたタンパク質分子 および断片を調製する方法を知るであろう。 発明の細胞死予防局面において有用なDNA分子は、その遮断がDAP遺伝子の発現 を阻害するために十分である、DAP遺伝子の配列に対してアンチセンス配列であ る、またはDAP遺伝子の一部に対してアンチセンス配列である配列を有してもよ い。遺伝子の一部はDAP遺伝子のコードまたは非コード部分のいずれかとなるこ とができる。アンチセンス配列のmRNA転写物は、DAP遺伝子のmRNA転写物とハイ ブリダイズして、最終的なタンパク質発現を妨害する。 特異的なアンチセンス配列を含むcDNAクローンの非制限的な例を下記の表１に 示す。好ましいアンチセンス配列は、図６のDAP-1遺伝子の1000位から始まって1 320位で終わる配列、図８のDAP-2遺伝子の3781〜4148位、図12のDAP-3遺伝子の1 08〜360位、および図14のカテプシンD遺伝子の1203〜1573位の配列である。 発明の細胞死予防局面において有用なもう一つのDNA分子は、触媒的に不活性 なキナーゼ（DAPキナーゼ）のように、または細胞中にその物質が存在するため に、本来のタンパク質の正常な活性を、例えば不活性である改変および非改変タ ンパク質等を含む偽ヘテロダイマーを産生することによって、妨害する他の改変 されたタンパク質のように、負の作用が優勢となるように、改変されていないDA P産物の活性を阻害することができる改変されたDAP産物をコードするDNA分子で ある。例えば、キナーゼドメインにおいてリジンからアラニンへの置換を有する 触媒的に不活性なDAPキナーゼ変異体（K42A）は、細胞障害性でなく、細胞をIFN -y誘導細胞死から保護することが判明した。 発明のスクリーニング局面において有用なDNA分子は、DAP遺伝子の配列または その断片の配列、もしくは特異的抗体を含む。 第一の局面において、本発明はこのように、DNA配列が： (a) その発現産物がプログラムされた細胞死に関係する、細胞において発現さ れたDNA配列； (b) (a)で定義したDNA以外であって、(a)で定義したDNA配列によってコードさ れる同じ発現産物をコードするDNA配列； (c) 改変されたDNA配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチドが 、(a)または(b)で定義した該遺伝子によってコードされるタンパク質または ポリペプチドと同様に、プログラムされた細胞死を媒介する、核酸トリプレ ットの１つ以上が付加、欠失、または置換されている(a)または(b)の改変さ れたDNA配列；および (d) 該生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする(a)、(b) 、または(c)のDNA配列のいずれかの断片、 からなる群より選択される、プログラムされた細胞死を誘導することができるDN A配列を含む発現ベクターの治療的有効量を、病的な細胞増殖の転移に関連した 疾患または障害の治療において用いられる薬学的組成物の調製に使用することを 提供する。 本明細書において改変したDNAまたはポリペプチド分子に関連して用いられる 「生物活性」という語は、先に定義したように、発明の細胞死促進、細胞死予防 およびスクリーニング局面に関する改変されていない分子の活性に関する。 特定の態様に従って、本発明は、DNA配列が細胞において発現される核酸配列 であって、その発現産物がプログラムされた細胞死に関係していて、以下の： (i) 図６に示す配列の160〜162位の核酸トリプレットから始まり、466〜468位 のトリプレットで終了するコード配列を含むDNA配列（配列番号：１）； (ii) 図６に示す配列の287〜289位の核酸トリプレットで始まり、816〜818位の トリプレットで終了するコード配列を含むDNA配列（配列番号：２）； (iii) 図８に示す配列の337〜339位の核酸トリプレットで始まり、4603〜4605位 のトリプレットで終了するコード配列を含むDNA配列（配列番号：３）； (iv) 図12に示す配列の74〜76位の核酸トリプレットで始まり、1268〜1270位の トリプレットで終了するコード配列を含むDNA配列（配列番号：４）； (v) 図13に示す配列を含むDNA配列（配列番号：５）； (vi) 図14に示すカテプシンのDNA配列（配列番号：７）；または (vii) 図15に示す配列の201〜203位の核酸トリプレットで始まり、3018〜3020位 のトリプレットで終了するコード配列を含むDNA配列（配列番号：８）、 の１つである、上記のような使用を提供する。 配列番号：８の特に興味深いサブ配列は、図15に示す配列の1767位で始まり、 2529位で終了する核酸配列である。 発明の用途はまた、先に定義した核酸のいずれか１つによってコードされる同 じタンパク質またはポリペプチド、１つ以上の核酸トリプレットが付加、欠失ま たは置換されている核酸配列、先に定義したDNA分子のいずれか１つによってコ ードされる活性と本質的に同じ生物活性を有する配列によってコードされるタン パク質またはポリペプチド、および先に定義したように該核酸配列によってコー ドされるタンパク質またはポリペプチド中に存在する生物活性を保持するタンパ ク質またはポリペプチドをコードする先に定義した核酸配列の断片、をコードす るDNA分子にも関する。 本発明はまた、薬学的に許容される賦形剤と共に上記のような使用によって調 製される薬学的組成物、および薬学的組成物を用いた治療法を提供する。 同様に、患者の腫瘍細胞が活性なDAP遺伝子を含むか否かを決定する工程；お よびその作用機序がアポトーシスを誘導する化学療法剤を選択する工程を含む、 癌患者の化学療法治療を選択する方法も、本発明によって提供される。腫瘍細胞 にDAP遺伝子を発現させることによって、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、ア ドリアマイシン）、分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン）、グルココルチコイ ド（例えば、デキサメタゾン）、葉酸拮抗剤（例えば、メソトレキサート）、お よび広範囲蛋白キナーゼ（PKC、PKA等）阻害剤（例えば、スタウロスポリン）の ような、様々な化学療法剤に対する細胞の感受性を増加させることができる。 発明の予後的局面に従って、１つのDNAプローブによって、もしくはDAP遺伝子 の完全なもしくは部分的配列を有する多数のDNAプローブによって、個体からの ゲノムDNA、cDNAもしくはRNAを調べる工程、または特異的抗体をプローブとして タンパク質抽出物を調べる工程を含む、DAP遺伝子が存在しないこと、個体のDAP 遺伝子における部分的欠失もしくは変異（すなわち、点突然変異、欠失もしくは その他の変異）、またはDAP関連RNAもしくはタンパク質が存在しないこと、を検 出する方法が提供される。 予後的局面に従った方法の一例は、以下の工程： (a) 試料が組織切片、細胞から得られたゲノムDNAもしくはmRNA、または該mRNA から産生されたcDNAである、該疾患に苦しむ個体から試料を得る工程； (b) １つ以上のプローブが： (i)その発現産物がプログラムされた細胞死に関係している、細胞において 発現されたDNA； (ii)改変されたDNA配列が(i)の配列とハイブリダイズする能力を保持してい る、１つ以上の核酸トリプレットが付加、欠失、または置換されている(i) の改変されたDNA配列； (iii)(i)または(ii)のDNA配列の全体または一部に対してアンチセンスであ る配列；および (iv)(i)、(ii)または(iii)のDNA配列と相補的であるRNA配列； からなる群より選択される、１つ以上の核酸プローブを該試料に加える工程 ； (c) １つ以上のプローブと該試料とをハイブリダイゼーションさせる条件を提 供する工程； (d) ハイブリダイゼーションが存在しなければ該遺伝子が存在しないことを示 し、および異常なハイブリダイゼーションを認めれば該遺伝子がおそらく不 活化されていることを示している、プログラムされた細胞死に関係する 遺伝子が該転移疾患に関連するか否かを該ハイブリダイゼーションに基づい て決定する工程、 を典型的に含む。 この局面のもう一つの態様は、以下の工程： (a) 試料が細胞抽出物または組織切片である、疾患に苦しむ個体から試料を得 る工程； (b) 先に定義したようにDNAによってコードされるタンパク質を結合することが できる１つ以上の特異的な抗体試料を該試料に加える工程； (c) 該試料中の該蛋白と該抗体が結合する条件を提供する工程； (d) 結合が存在しなければ該タンパク質が存在しないことを示し、異常な結合 を認めれば、該タンパク質がおそらく改変されていることを示す、プログラ ムされた細胞死に関係するタンパク質が該転移疾患に関連しているか否かを 、該タンパク質の結合に基づいて決定する工程； を含んでもよい。 発明の予後的局面に関する他の例は当業者に周知であり、この中にはノザンブ ロット、RNアーゼ保護アッセイ、および様々なPCR技法が含まれるが、これらに 限定しない。 発明の予後的局面の特殊な態様は、図６、８、12、13、14または15に示す完全 な、または部分配列を使用することを含む。 おそらく転移に対する素因を示すDAP遺伝子の変異もまた、変異して機能的で ないDAP遺伝子産物と正常な機能的DAP遺伝子産物を識別することができる適当な 抗体の助けを借りて検出することができる。さらに、タンパク質翻訳を消失させ る変異またはプロモーターの不活化によるRNAの喪失は、タンパク質の細胞抽出 物と反応する抗体の助けを借りて検出することができる。DAP-キナーゼRNAの喪 失ならびにB細胞リンパ腫および膀胱癌細胞株におけるタンパク質の喪失に関し て、一例を後述する。 発明の第２の局面は、非サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死に関す る治療方法および薬学的組成物に関する。 このように発明のこの局面は、DNA配列が： (a) その発現産物が非サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死に関係す る、細胞において発現されたDNA配列； (b) (a)で定義したDNA配列によってコードされる同じ発現産物をコードする、 (a)で定義されたDNA以外のDNA配列； (c) 改変されたDNA配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチドが 、(a)または(b)で定義される該遺伝子によってコードされるタンパク質また はポリペプチドと同様にプログラムされた細胞死を媒介する、１つ以上の核 酸トリプレットが付加、欠失、または置換している、(a)または(b)の改変さ れたDNA配列：および (d) 該生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする(a)、(b) 、または(c)のDNA配列の断片、 からなる群より選択される、非サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死を 促進することができるDNA配列を含む発現ベクターの治療的有効量を、制御され ない病的な細胞増殖に関連した疾患または障害の治療において有用な薬学的組成 物の調製に使用することを提供する。 特定の態様に従って、本発明は、DNA配列が細胞において発現される核酸配列 であって、その発現産物がプログラムされた細胞死に関係し、以下の： (i) 図６に示す配列の160〜162位の核酸トリプレットから始まり、466〜468位 のトリプレットで終了するコード配列を含むDNA配列（配列番号：１）； (ii) 図６に示す配列の287〜289位の核酸トリプレットから始まり、816〜818位 のトリプレットで終了するコード配列を含むDNA配列（配列番号：２）； (iii) 図８に示す配列の337〜339位の核酸トリプレットから始まり、4603〜4605 位のトリプレットで終了するコード配列を含むDNA配列（配列番号：３） ； (iv) 図12に示す配列の74〜76位の核酸トリプレットから始まり、1268〜1270位 のトリプレットで終了するコード配列を含むDNA配列（配列番号：４）； (v) 図13に示す配列を含むDNA配列（配列番号：５）； (vi) 図14に示すカテプシンのDNA配列（配列番号：７）；または (vii) 図15に示す配列の201〜203位の核酸トリプレットから始まり、3018〜3020 位のトリプレットで終了するコード配列を含むDNA配列(配列番号：８）、 の１つである、上記のような使用を提供する。 発明のもう一つの局面は、DNA配列が： (a) アンチセンスがDNA分子の発現を阻害することができる、その発現産物が非 サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死に関係する、細胞において発 現されるDNA分子の全体または一部に対してアンチセンスである配列；およ び (b) 改変された配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチドが、 該タンパク質またはポリペプチドによる、該プログラムされた細胞死の阻害 能によって表される優勢な負の作用を有する、１つ以上の核酸トリプレット が付加、欠失、または置換されている、(i)において定義されるDNA分子の改 変されたDNA配列：および (c) 先に定義したDNA配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチド の阻害剤または拮抗剤、 からなる群より選択される、非サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死を 阻害することができるDNA配列を含む発現ベクターの治療的有効量を、非サイト カイン誘導型のプログラムされた細胞死に関連した疾患または障害の治療におい て有用な薬学的組成物の調製に使用することに関する。 発明の第一の局面に関連した上記の予後的局面もまた、発明の第二の局面に関 係している。 発明の他の局面は、以下の説明から明らかとなるであろう。 図面の説明 本発明は、以下の図面と共に、好ましい態様に関する以下の詳細な説明からさ らによく理解されるであろう： 図1A-Dは、DAP-1遺伝子のRNAおよびタンパク質発現を示す： 図1(A)は、構築物230、255、260、259でトランスフェクトしたHeLa細胞および 対照細胞（親細胞）から得て、構築物230の標識したcDNA断片をプローブとして 調べたセンスおよびアンチセンスmRNAのノザンブロット分析を示す。総RNAは、 トランスフェクション前（親）またはそれぞれ230-t1、255-t1、260-t1および 259-t1と呼ばれるpTKO1構築物#230または#255（グループ１）、#260（グループ ５）、および#259（グループ３）でトランスフェクトした後にHeLa細胞から調製 した。ノザンブロット上でRNA 20gを処理して、DNA断片#230をプローブとして用 いた。矢印はセンスおよびアンチセンスRNAの位置を示す。 図１(B)は、IFN-γ750U/mlの存在下（＋）、または非存在下（−）で24時間処 置した対照構築物（DHFR-t2）、230構築物でトランスフェクトしたHeLa細胞また は対照細胞（親細胞）から得たセンスおよびアンチセンスMRNAのノザンブロット 分析を示す。IFN-γ（750U/ml）の非存在下（−）または存在下（＋）で４日間 増殖させた表示のHeLa細胞からRNAを抽出した。RNA試料20μgを含むノザンブロ ットをλ1ファージのcDNAインサートとハイブリダイズさせた。mRNA試料のエチ ジウムブロマイド染色を示す。 図1(C)は、網状赤血球溶解物標本においてインビトロで翻訳したDAP-1 cDNAの 発現された蛋白産物のSDSポリアクリルアミド電気泳動ゲルを示す。1 cDNA（レ ーン２）から、ならびにサブクローンp6、p4、p5、およびp8から転写したRNA（0 .5g）のインビトロ翻訳をそれぞれレーン３〜６に示す。レーン１は網状赤血球 溶解物にRNAを加えなかった場合に得られるバックグラウンドに相当する。標識 したタンパク質を12％SDSポリアクリルアミドゲル上で分画した。放射活性分子 量マーカー（アマシャム社）の位置を記す。翻訳された２つのタンパク質、大き い15kDaタンパク質および小さい22kDaタンパク質を矢印で示す。 図１(D)は、組換え型および細胞性15kDa DAP-1タンパク質のイムノブロット分 析を示す。細菌によって産生されたDAP-1タンパク質（300ng）および表示のHeLa 細胞抽出物（350μg）をSDSポリアクリルアミドゲル（12％）上で分画し、ニト ロセルロースにブロットし、15kDa DAP-1に対して作製されたアフィニティ精製 抗体と反応させた。細胞を抽出前にIFN-γ（750U/ml）で４日間処置した。２つ の矢印は細胞性DAP-1タンパク質の位置を示す。抗体はまた、アンチセンスRNA発 現によって制御されない60および45kDaの２つの非関連バンドも認識する。DAP-1 タンパク質が減少したことを定量するには、密度測定分析によって行った。各ス ロットにおけるタンバク質含量の較正は、非関連バンドのシグナルを対照とする ことによって行った。予め染色したタンパク質マーカー（シグマ社）に印を つける。 図２A-Dは、DAP-2遺伝子のRNAおよびタンパク質発現を示す。 図２(A)は、対照構築物（DHFR-t1およびDHFR-t2）および256構築物（t1および t2）でトランスフェクトした細胞の２つのクローンから得たセンスおよびアンチ センスmRMAのノザンブロット分析を示す。256-t1および256-t2 HeLa細胞トラン スフェクタントからIFN-γ（750U/ml）による処置の前（０時間）、または３お よび24時間後のいずれかに総RNAを調製し、試料20gをノザンブロット上で処理し た。断片#256をプローブとして用いた。センスおよびアンチセンスmRNAの位置を 示す。各ブロットにおけるRNA量の較正のために、GAPDH mRNAレベルを用いた。 図2(B)では、ブロットは、K562細胞、親HeLa細胞、２つのDHFR-トランスフェ クトHeLa細胞集団およびpTKO1-256でトランスフェクトした２つのHeLa細胞集団 からの総RNA（20μg）を含む。ブロットをλ29のcDNAインサートとハイブリダイ ズさせた。RNA試料のエチジウムブロマイド染色を示す。 図2(C)は、インビトロ燐酸化アッセイを示す。λ29cDNAのコード領域を有する PECE-FLAG発現ベクターによるトランスフェクションの前（レーン１）または後 （レーン２）のいずれかで、細胞溶解物をCOS-7細胞から調製した。試料400pgを 抗FLAG（登録商標）(M2)モノクローナル抗体（IBI）で免疫沈降させて、燐酸化 アッセイを行った。 図2(D)は、組換え型および細胞性DAP-2タンパク質のイムノブロット分析を示 す。COS-7細胞をPECE-FLAG-DAP-2発現ベクターで一過性にトランスフェクトさせ た。細胞溶解物の試料、すなわちCOS-7細胞から100μgおよびHeLa細胞から400μ gをSDSポリアクリルアミドゲル（7.5％）上で分画し、イムノブロットを行って 、N-末端DAP-2ペプチドに対して作製されたアフィニティ精製ポリクローナル抗 体と反応させた。下のパネルでは、ブロットをビンキュリン（シグマ・イムノケ ミカルズ社）に対するモノクローナル抗体と反応させた。レーン：１、トランス フェクトしていないCOS-1細胞；２、トランスフェクトしたCOS-1細胞：３、DHFR -t1細胞；４、256-t1細胞；５、256-t2細胞。レーン２では、同じ160kDaタンパ ク質についても抗FLAG（登録商標）(M2)モノクローナル抗体（IBI）によって検 出された（示していない）。 図3A-Cは、HeLa細胞におけるIFN-γに対する細胞抑制反応および細胞障害反応 の形態学的特徴を示す。培養は全て、初回密度10,000個/cm2で播種した。 図3(A)は、IFN-γ（750U/ml）の非存在下（a,c）または存在下（b,d）で培養 した３日および８日目に、pTKO1-DHFR構築物（DHFR-t1細胞）でトランスフェク トさせたHeLa細胞の光学顕微鏡写真を示す。（倍率400倍）。IFN-γに対する反 応の細胞抑制相(b)の際に、光屈折性の分裂細胞が存在しないこと、および細胞 障害相(d)の際に、基層から剥離した丸い細胞が出現することに注意すること。 図3(B)は、DAPIによるDNAの染色を示す；a．DHFR-t1非処置細胞をトリプシン 処理によって回収してガラススライド上に載せた。b．剥離したDHFR-t1細胞をIF N-γ処置後７日目に回収した。濃縮または断片化染色質を有する核を矢印で示す （倍率1000倍）。 図3(C)は、対照構築物DHFR-t1および230-t1構築物によってトランスフェクト した細胞の走査型および透過型電子顕微鏡写真を示す。DHFR-t1 HeLa細胞集団(a 〜d)および230-t1アンチセンス・トランスフェクト細胞(eおよびf)をIFN-γ（75 0U/ml）の非存在下（a,c,e）または非存在下（b,d,f）のいずれかで培養した。( a,b,e,f)、GSM 6400 SEM（ジョール）を用いて７日後に走査型電子顕微鏡写真を 撮影した。バー＝10mm（４試料全てについて2200倍）。(cおよびd)、2800倍でTE M（フィリップス410）を用いて７日後に撮影した透過型電子顕微鏡写真。濃縮し た核および表面の水疱を矢印で示す。 図4A-Cは、グループ１および２のプラスミドからのアンチセンスRNA発現が、I FN-γの障害作用に対するHeLa細胞の感受性を減少させるが、初期のIFN-γシグ ナリングに対しては影響を及ぼさないことを示す。 図4(A-B)は、５４０ｎｍでの光の吸収によって決定される生存細胞数を時間の 関数として示す；対照構築物DHFR-t1（・-1(A)および1(B)）；255または230構 ずれかで細胞をトランスフェクトした。結果をIFN-γ（750U/ml）の存在下（＋ ）または非存在下（−）での細胞増殖として示す。各点は４本の測定の平均値お よび範囲２〜５％のSDである。 図４(C)は、2〜5Aシンターゼ遺伝子誘導に関するノザンブロット分析を示す。 表示のHeLa細胞トランスフェクタントを、IFN-y（750U/ml）の存在下(+)または 非存在下(−)で24時間インキュベートした。総RNA 20mgを分析した。2〜5Aシン ターゼのcDNAをプローブとして用いた。 図５は、DAP-1 DNAを有するλ1 cDNAクローンの制限マップを示す。 図６は、DAP-1のDNA配列および予想されるアミノ酸配列を示す。 図７は、DAP-2 DNAを有するλ29 cDNAクローンの制限マップを示す。 図８は、DAP-2のDNA配列および予想されるアミノ酸配列を示す。 図９A-Cは、他のセリン／トレオニンキナーゼとのDAP-2配列相同性、およびDA P-2のアンキリンリピートの配置を示す。 図9(A)では、DAP-2のタンパク質キナーゼドメイン配列を、他のカルモジュリ ン依存型キナーゼの対応するドメインと共に配置する。キナーゼのサブドメイン 構造（I〜XIという番号をつける）ならびにカルモジュリンの認識および結合に 関係する部位（カルモジュリン調節領域と呼ぶ）を示す。キナーゼドメイン内で 必ず保存されるアミノ酸を星印で示す。右の数値は、各キナーゼの一次翻訳産物 のN-末端と比較した位置を記す。黒い背景は、比較したキナーゼ内での同一アミ ノ酸を示す。斑点状の背景は、アミノ酸が同一ではないが類似している位置を示 す。nm-mlck−非筋ミオシン軽鎖キナーゼ（トリ）；sm-mlck−平滑筋ミオシン軽 鎖キナーゼ（トリ）；skm-mlck−骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼ（ラット）；camd k-alph、-beta、-ganHn−それぞれ、カルシウム／カルモジュリン依存型蛋白キ ナーゼIIのα、β、およびγサブユニット；mlck-dicdi−細胞性粘菌（dictyost elium discoidium）（粘菌類）ミオシン軽鎖キナーゼ。 図９(B)は、DAP-2のキナーゼ・サブドメインIIおよびIIIの配置、ならびに異 なる細胞周期依存的キナーゼの対応するドメインを示す。dm2−ショウジョウバ エCDC2相同体；pssalre−ヒトのセリン／トレオニン・キナーゼPSSALRE；kpt2− ヒトのセリン／トレオニン・キナーゼPCTAIRE-2；kin28−酵母（S．cerevisiae ）の推定タンパク質キナーゼ；mo15−減数成熟の負の調節剤であるcdc2に関連し たアフリカツメガエルのタンパク質キナーゼ；kklalre−ヒトのセリン／トレオ ニン・タンパク質キナーゼKKIALRE。 図9(C)は、DAP-2のアンキリン・リピートの配置を示す。黒い背景は、同一の アミノ酸を示す。DAP-2アンキリン・リピートのコンセンサス配列を下に示す。c DNAに沿った各個々のリピートの位置を図９(B)に示す。ar 1〜8、アンキリン・ リピート。 図10は、標識したDAP-1 DNAをプローブとして調べたいくつかの造血細胞から 得たmRNAのノザンブロット分析を示す。 図11は、いずれも標識したcDNA、DAP-1またはDAP-2をプローブとして調べた、 健常な胎児（２）およびダウン症候群の胎児（１）の肝臓、脾臓、または脳から 得たmRNAのノザンブロット分析を示す。総mRNA量を評価するために、GAPDHを用 いた（下）。 図12は、DAP-3のDNA配列および予想されるアミノ酸配列を示す。 図13は、DAP-4の部分的DNA配列を示す。 図14は、カテプシンDのDNA配列およびアミノ酸配列を示す。 図15は、DAP-5のDNA配列およびアミノ酸配列を示す。 図16は、DAP-キナーゼ発現のイムノブロット分析を示す。親D122細胞およびpc DNA対照ベクター（-cont）またはpcDNA-DAP-キナーゼ（-DAPk）でトランスフェ クトした異なるG418耐性誘導体クローンのサブコンフルエント培養、を溶解して 、既に詳述されているように（ダイスら(Deiss，L.P.）、1995、Genes Dev．９ ：15）処理した（１試料あたりタンパク質300μg）。イムノブロットを、抗DAP キナーゼ・モノクローナル抗体（シグマ社）および抗ビンキュリン抗体（シグマ 社）と反応させた。A9-F細胞におけるDAP-キナーゼの内在量を陽性対照として用 いた。 図17は、異所で発現されたDAP-キナーゼ遺伝子のインビトロ・キナーゼ活性を 示す。総細胞抽出物1000μgの試料を抗FLAG抗体によって免疫沈降させ、ミオシ ン軽鎖（MLC）タンパク質（５μg；シグマ社）を内因性基質として用いたキナー ゼ・アッセイを行った（上のパネル）。下のパネルは、同じブロットを抗DAP-キ ナーゼ抗体とインキュベートした場合のDAP-キナーゼ・タンパク質の量を示す。 図18A&Bは、トランスフェクトしたD122クローンのインビトロ増殖曲線である 。細胞を、24ウェルプレート中で初回細胞密度１×104個／ウェルで培養した； 培地には10％（図18A）または１％（図18B）仔ウシ胎児血清（FCS）（ギブコBRL ） のいずれかを加えた。24時間の間隔で、クリスタルバイオレット法によって細胞 数を定量し（クェングら（Kueng，W.）、1989、Anal Biochem．182：16）、溶解 した細胞のO.D.をλ=５４０ｎｍで測定した。データは２つの実験の２本ずつの 測定の平均値である。印は： （○）D122；（◇）1-cont．；（□）4-cont．；（X）6-DAPk；（◆）28-DAPk 図19は、足蹠における腫瘍の局所増殖を注射後の日数の関数として示す。異な るD122トランスフェクトクローンをC57BL/6マウス（10〜12週令の雌性マウス） の足蹠に注射した。腫瘍を有する足の直径を１〜３日毎に測定した。値は各群の 個体の平均足蹠直径を表す（１群８匹）。印は図18と同じである。 SDは、測定値の０％〜32％の範囲であった。対応のない片側のスチューデント t-検定を多くの時点において実施したところ、最も増殖が遅い対照クローン（1- cont.）によって形成された増殖する腫瘍の大きさと、28-DAPkまたは42-DAPkク ローンによって形成された腫瘍の大きさとの差は、P＜0.001で有意であることが 示された。DAP-キナーゼによるトランスフェクションは局所腫瘍の増殖を遅らせ ることを見ることができる。 図20は、静脈内注射したマウスの平均肺重量および平均転移病変数を示す。上 記のようにマウスの尾静脈に注射をして30〜32日後に屠殺した。肺を切除して重 量を測定し、ヴアン溶液で固定した。双眼鏡で表面結節数を計数することによっ て転移結節数を決定した。値は、１群５匹の平均値±SDで、マウス１匹あたりの 肺重量（棒グラフ）または転移結節数を表す（表）。棒グラフにおける実線は非 注射マウスの平均肺重量を示す。 より活性の弱い1-cont．クローンとDAP-キナーゼ・トランスフェクタントの各 クローンとの差は、48-、28-、および42-DAPkクローンではP＜0.001で有意で、 発現率が低いクローン6-DAPkについては0.025＜P＜0.05で有意であった（後者の クローンは、4-cont.および親D122細胞とはP＜0.001で有意差を示した）。この ように、DAP-キナーゼによるトランスフェクションは実験転移を強く抑制した。 図21は、図20の各群のマウス３例の代表的な肺の写真である。A9-Fの低転移性 クローン（対照として使用）をI.V.注射した後に得られた肺と比較すると、肺の 大きさおよび表面結節に差があることに注目。尺度棒、１cm． 図22は、図16のようにクローン28-DAPkのDAP-キナーゼ・タンパク質レベルの イムノブロット分析を示す。I.F.PおよびI.V.注射に用いた最初のクローン（そ れぞれ、レーン１および３）ならびに注射したマウスの肺から再培養した腫瘍細 胞の双方において発現を調べた。後者の細胞培養は、手術後35日で出現した多数 の自然発生肺結節（レーン２）または実験的転移アッセイにおいて現れた非常に 少ない結節（レーン４）のいずれかから回収した。 DAP-キナーゼレベルは、4-cont.トランスフェクトクローンでは、注射前でも 自然発生肺病変からの腫瘍細胞の回収後でも検出限界以下で、腫瘍細胞が周辺の DAP-キナーゼ陽性一次肺細胞によって汚染されていないことが確認された。レー ン７は、低転移性クローンA9-Fにおける内因性DAP-キナーゼの発現レベルを示す 。 図23は、足の切断後34日目に形成された自然発生肺転移からの培養において、 その回収の前後で調べたクローン42-DAPkのイムノブロット分析を示す（それぞ れ、レーン１および２）。レーン３は、低転移性のクローンA9-Fにおける内因性 DAP-キナーゼの発現レベルを示す。 図24は、クローン28-DAPkのI.F.P.注射後に形成された自然発生肺転移病変か ら得られた細胞培養のイムノブロット分析を示す。培養をインビトロで10μMの5 -アザ-2'-デオキシシチジンで24時間処置した。非処置および薬物処置を行った 培養におけるDAP-キナーゼのタンパク質発現を、処置後３日目（それぞれ、レー ン１および２）または14日目（それぞれ、レーン３および４）に調べた。 図25は、4-cont.細胞（左側の写真）または42-DAPk細胞（右側の写真）２×105 個を局所注射後５日目に調製した足蹠切片のインサイチューTUNEL染色を示す。 断片化DNAのペルオキシダーゼ染色および切片のメチルグリーン色素による対比 染色は、製造元の指示に従って実施した（アポップタグ（登録商標）プラス・ペ ルオキシダーゼ・キット；オンコー社、ガイサースバーグ）。尺度棒、100μm。 図26は、TNF-αによる処置前後の核のDAPI染色を示す。18-cont.および42-DAP kトランスフェクタントに対応する指数増殖細胞を、マウスTNF-α(100ng/ml；R& Dシステムズ社、ミネアポリス）とシクロヘキシミド（５μg/ml；シグマ社）の 併用（+で印をつけた右のパネル）、またはシクロヘキシミド単独（− で印をつけた左のパネル）によって処置した。DAPI染色は６時間後に行った。矢 印はアポトーシス核を示す。 図27は、TNF-αによる細胞障害の時間速度論を示す。TNF-αおよびシクロヘキ シミドによる処置の条件ならびにDAPI染色によるアポトーシス核の評価は図26と 同じであった。42-DAPkトランスフェクタント(Ｘ)をこのアッセイにおいて親D12 2細胞（○）、4-cont.（□）および18-cont.（◇）と比較した。値は、表示の時 間で、各視野において核延べ100個を異なる５視野において採点することによっ て計数した、無傷の核の百分率の平均値±SDである。 42-DAPkと4-cont.クローンとの差は、4.5時間および６時間のいずれにおいて もP＜＜0.001で有意で、７時間に関しては0.005＜P＜0.001であった。 図28は、図26および27での記述と同様に、TNF-αおよびシクロヘキシミドに対 する反応アッセイの結果を示す。最初の42-DAPkクローンを、図23で記述した自 然発生肺転移から回収した培養と比較した（ここで、42-DAPk*と呼ぶ）。値は二 重処置後６時間で、各視野において核延べ100個を異なる５視野において採点す ることによって計数した、アポトーシス核の百分率の平均値±SDである。 結果は、減弱したDAP-キナーゼ発現に対するインビボ選択によって、クローン 42-DAPkのTNF-αに対する感受性の増加が消去されるとを示している。 図29は、半固形培地において接着非依存的条件でのD122-トランスフェクタン トの増殖を示す。異なるクローンを0.33％の軟寒天（バクト・アガー；ディフコ 社）中で、初回細胞数５×103個／６cmプレートで培養し、上層は0.5％アガーを 含有した。７日目に出現したクローンの直径を光学顕微鏡下で測定した。値は各 群100クローンのコロニー直径の平均値±SDである。 クローン1-DAPkおよび21-DAPkは、クローン28-DAPk（図16）と同等のレベルで 、外因性DAPキナーゼタンパク質を発現した。対照（例えば18-ct.）およびDAP- キナーゼ・トランスフェクタント（例えば、1-DAPk）との差はP＜＜0.001で有意 であった。 図30は、図29において７日間軟寒天中で培養したクローンの顕微鏡写真を、親 D122細胞（左：a,c）とDAPk-42細胞（右:b,d）とを比較することによって示す。 尺度棒は、上のパネル（a,b）では350μmであり、下のパネル（c,d）では80μm に相当する。 図31は、これらの試験において用いたDAP-キナーゼおよびその変異体の図によ る説明である。導出アミノ酸配列および／または実験的研究から予想される様々 なモチーフおよびドメインを示す。下に示す数値は、アミノ酸の位置を示す。K4 2A、CaMおよび（1-1271）DD変異体は下に図で示す。 図32は、DAP-キナーゼのインビトロ・キナーゼ活性を示す。DAP-キナーゼまた はDAP-キナーゼ変異タンパク質を、下記のようにCa2+/CaMおよひMLCの存在下で 、キナーゼ活性に関してインビトロでアッセイした。タンパク質を11％SDS-PAGE 上で流してニトロセルロースメンブレンにブロットした。上および中央のパネル は、X線フィルムに露出後に認められる、DAP-キナーゼの自己燐酸化およびMLC燐 酸化をそれぞれ示す。下のパネルは、同じブロットを抗FLAG抗体とインキュベー トすることによるDAP-キナーゼタンパク質、およびECL検出を示す。 図33A-Cは、DAP-キナーゼがカルモジュリンと結合し、その活性がカルシウム ／カルモジュリンによって調節されることを示している。 （33A）。カルモジュリンをDAP-キナーゼに上層する。上のパネルは35S-メチ オニン標識組換え型CaMとのハイブリダイゼーションの結果を示す。下のパネル は、DAP-キナーゼタンパク質を検出するために、同じブロットを抗FLAG抗体とハ イブリダイゼーションさせた場合の結果を示す。 （33B）。DAP-キナーゼ活性のCa2+/CaM調節。DAP-キナーゼに対し、後述する ように、Ca2+およびCaMの存在下または非存在下で、インビトロ・キナーゼ・ア ッセイを行った（自己燐酸化を検出するために反応を15分後に停止させる、また は２分後に、MCL燐酸化を測定した）。下のパネルは、抗FLAG抗体とのインキュ ベーションの結果を示す（同じブロットにおいて）。 （33C）。DAP-キナーゼDCaM活性はCa2+CaMの非存在下で最大である。細部は（ 33B）と同じである。 図34A&Bは、DAP-キナーゼの異所発現がどのように細胞死を誘導するかを図示 している。 （34A）。HeLa細胞（５×105個／プレート）を、pcDNA3ベクターのDNA20μgま たは同じベクターにクローニングしたDAP-キナーゼ構築物でトランスフェクト させた。48時間後、細胞培養を１：５に分割して、G418による選別を行った。２ 〜３週間後、プレートをクリスタル・バイオレットで染色した。 （34B）。HeLa細胞（５×105個／プレート）を空のpSBC-b1プラスミドのDNA20 μgまたは野生型DAP-キナーゼを有するベクターでトランスフェクトした。細胞 を、テトラサイクリンの非存在下で48時間増殖させて、X-Gal溶液で染色した。 ２つのトランスフェクションから得られた異なる６視野から青い細胞延べ600個 を計数することによって、アポトーシスの丸い形態を有する青い細胞の発生率を 評価した。矢印は、トランスフェクトした死につつある細胞を示す。 図35A&Bは、DAP-キナーゼK42A変異体がIFN-γ誘導細胞死からHeLa細胞をどの ように保護するかを示している。 （35A）HeLa細胞（５×105個／プレート）を、空のpcDNA3ベクターのDNA 20μ gまたは同じベクターにクローニングしたDAP-キナーゼ-K42Aでトランスフェクト させた。48時間後、細胞培養を１：５に分割して、G418およびIFN-γ 200U/mlに よる選別を行った。２〜３週間の選別後、プレートをクリスタル・バイオレット で染色した。光学顕微鏡下でコダックTMXIOOフィルム（倍率40倍）を用いて写真 撮影を行った。 （35B）。１cm2あたりの生存コロニー数を計数して、IFN-γの非存在下で実施 したG-148選別において出現したコロニー数に従って標準化した。値は、代表的 な10視野の平均値を表す。 図36A-Dは、様々な造血細胞株におけるDAP-キナーゼ発現の分析を示す。 36AおよびB：DAP-キナーゼおよびc-Ab1に対するプローブをそれぞれ用いた、 様々な細胞株からのポリA+ RNAのノザンブロット分析。 36CおよびD：それぞれ、DAP-キナーゼタンパク質およびビンキュリン（無関係 なタンパク質対照として）のウェスタンブロット分析。 図37は、5-アザデオキシシチジンで処置した膀胱癌細胞株T24およびHT1376に おけるDAP-キナーゼのウェスタンブロット分析を示す。タンパク質抽出物を以下 のように載せた：レーン１および４−それぞれ無処置のT24およびHT1376膀胱癌 細胞；レーン２および５−それぞれ、5-アザデオキシシチジンで処理し、処置を 行わずに２回継代した後に回収したT24およびHT1376膀胱癌細胞。レーン３−処 置を行わずに６回継代後に回収したT24膀胱癌細胞。同じブロットを抗ビンキュ リンおよび抗DAP3抗体と反応させた。 図38A-Cは、サブグループIのcDNA断片と比較して、DAP-5 763 bp断片がHeLa細 胞において非常に低レベル発現されていることを示す。 38A。pTKO1-260またはpTKO1-DHFRトランスフェクト細胞からのRNAのノザンブ ロット分析。表示のHeLa細胞からRNAを抽出した。総RNA試料20pgを含むノザンブ ロットを、DAP-5の763bp断片（#260）とハイブリダイズさせた。１、DHFR-t1； ２、260-t1；３、260-t2。 38B。pTKO1-260でトランスフェクトさせたHeLa細胞のIFN-γ耐性表現型。HeLa 細胞を、対照ベクターTKO1-DHFRまたは単離したpTKO1-260のいずれかでトランス フェクトさせた。安定にトランスフェクトした細胞のポリクローナル抗体を作製 するために、独立したクローン104個以上のプールをまず、ヒグロマイシンBで選 別した。これらのプールを９cmプレートに播種して（プレートあたり細胞100,00 0個）、IFN-γ（1000単位/ml）およびヒグロマイシンB（200g/ml）で二重に選別 した。選別の４週間後、細胞をクリスタル・バイオレットで染色した。IFN-γの 非存在下では、これらのプレートは４日後にコンフルエンシーに達する。 38C。サブグループIおよびIIからのRNAの発現レベルの比較。260-t1および260 -t2は、38Aにおいて用いられるものと同じ抽出物を表す。RNA試料20pgを含むノ ザンブロットを、駆動されたSV-40プロモーターの一部であるSV-40スプライシン グおよびポリアデニル化シグナル（ダイス＆キムチ（Deiss and Kimchi）、1991 ）を含むBglII-BamHI断片、およびエピソームから発現されたmRNAを含む#260と ハイブリダイズさせた。D。5Cと同じであるが、TKプロモーターによって駆動さ れたヒグロマイシンB耐性遺伝子を認識するプローブとハイブリダイズさせた。 図39は、DAP-5の763bp断片またはその変異体でトランスフェクトさせたHeLa-t TA細胞のβ-ガラクトシダーゼ活性のアッセイを示す。 pSBc-b1ベクター（対照）、pSBc-b1-260（260）、または単置換もしくは３置 換ATG#260変異体のいずれかに存在するpSBc-b1ベクターでトランスフェクトさせ た安定なポリクローン集団を、10μg/mlブレオマイシンによる選別によって確立 した。２週間後、薬剤を除去して培養をさらに拡大した。増殖した細胞を３％パ ラホルムアルデヒドで５分間固定して、PBSで２回すすぎ、X-galを基質として用 いてβ-ガラクトシダーゼ活性の有無をチェックした。コダック・エクタクロー ム160Tを用いて位相差顕微鏡下で写真撮影を行った。 図40A&Bは、DAP-5の763bp断片のインビトロ翻訳、および#260断片を発現する 細胞におけるミニタンパク質のイムノブロット分析を示す。 40A。様々なDAP-5改変体を含むBleuscriptベクターから転写したRNAのインビ トロ翻訳をウサギ網状赤血球溶解物において実施した。得られた35Ｓ標識タンパ ク質を12.5％SDS-PAGE上で分画した。放射活性分子量マーカー（アマシャム社） の位置に印をつけた。１．非プログラムウサギ網状赤血球溶解物；２．全長のDA P-5 3.8kbクローン：３．DAP-5 763bp断片（#260）；４．変異した#260断片：17 85位のATGがAAGに置換している（単ATG変異）；５．変異した#260断片：2010位 のATGがTTCに変換し、2040位のATGがATCに置換している；６．上記の変異の全て を含む３置換ATG変異体。翻訳されたミニタンパク質の位置を矢印で示す；さら に高い位置のバンドは、非プログラム網状赤血球溶解物にもしばしば現れる非特 異的バックグラウンドである。 40B。pSBc-b1ベクターまたは#260断片に含まれるpSBc-b1ベクターのいずれか でトランスフェクトしたHeLa-tTA細胞を溶解して、10%SDS-PAGE上で分画して、 ニトロセルロース上にブロットし、GST融合組換え産物に対して作製したアフィ ニティ精製ポリクローナル抗体（１：20希釈）と反応させた。矢印は、大きさが 約28kDaであるDAP-5ミニタンパク質特異的ダブレットの位置を示す。 図41A、B、C&Dは、IFN-γ媒介細胞死におけるカテプシンDプロテアーゼの関与 を示す。 （41A）。アンチセンスRNA発現によるIFN-γ誘導細胞死からの保護。（a）DHF Rでトランスフェクトしたポリクローナル細胞集団（□）および抗カテプシンDで トランスフェクトしたポリクローナル細胞集団（○）の一つをIFN-γ（1000U/ml ；黒い印）で処理し、または無処置（白い印）とした。生存細胞をニュートラル ・レッドで染色して、色素の取り込みをλ540nmで測定した。それぞれの点は、 ４本の測定の平均値を表す。（b）DHFRでトランスフェクトした異なる ２つのポリクローナル細胞集団（○および●）、および抗カテプシンDでトラン スフェクトした一対のポリクローナル細胞集団（○および●）を、IFN-γ（1000 U/ml）で処置し、または無処置とした。表示の時点において、IFN-γ処置細胞の ニュートラスレッド色素の取り込みを無処置培養と比較することによって、生存 細胞の分画を決定した。それぞれの点は、４本の測定の平均値±S.E.を表す。 （41B）。IFN-γ（1000U/ml）をDHFRおよび抗カテプシンDトランスフェクタン トから除去後の生存細胞の再増殖。細胞は初回密度10,000個／cm2で播種し、ヒ グロマイシンＢおよびIFN-γ（1000U/ml）を組み合わせて２週間処置し、７日後 に洗浄してクリスタル・バイオレットで染色した。 （41C）。ペプスタチンAによるIFN-γ誘導細胞死の保護。HeLa細胞（DHFRおよ び抗カテプシンDトランスフェクタント）を、ペプスタチンA（10-4Mの0.2％DMSO 溶液）の存在下、またはその非存在下（0.2％DMSO単独）で、IFN-γ（1000U/ml ）と８日間インキュベートした。DHFRトランスフェクト細胞もまた、IFN-γの非 存在下でペプスタチンAに対する反応性について調べた。データは４本の試料か らのニュートラル・レッドの色素取り込みの平均値±S.E.として表す。 （41D）。IFN-γ処置の８日目でのHeLa細胞の光学顕微鏡写真：(a)阻害剤を含 まないDHFRトランスフェクタント；(b)ペプスタチンAの存在下で培養した抗カテ プシンDトランスフェクタント（倍率200倍）。 図42A、B、C&Dは、IFN-γおよびTNF-αによるカテプシンDプロテアーゼの発現 およびプロセシングの調節を示す。 （42A&B）IFN-γ（1000U/ml）による処置の前後でのカテプシンD型のイムノブ ロット分析。表示の時点で、親HeLa細胞(A)およびDHFRおよび抗カテプシンDトラ ンスフェクタント(B)から細胞溶解物を調製した。試料300μgをSDS-ポリアクリ ルアミドゲル（12％）上で分画して、ニトロセルロースにブロットし、ECLシス テム（アマシャム社）を用いて検出した。カテプシンD型の大きさを示す。各ス ロットにおけるタンパク質の量について起こりうる差を修正するために、同じブ ロットを、銅・亜鉛スーパーオキサイド・ディスムターゼ（SOD）に対して作製 したポリクローナル抗体と反応させた。 （42C）ラットのカテブシンDについてこれまでに報告されたようなカテプシン Dのプロセシングの異なる工程を示す図（フジタら（Fijita）、1991、BBRC179： 190〜196）。 （42D）TNF-αによるU937の処置前（レーン１）および処置後（レーン２およ び３；それぞれ、24および48時間）のカテプシンD型のイムノブロット分析。 図43A&Bは、Fas/APO-1におけるカテプシンDプロテアーゼの関与およびTND-α 媒介細胞死を示す。 （43A）抗カテプシンD RNAまたはペプスタチンAによるFas/APO-1媒介細胞死の 抑制。HeLa細胞（DHFRおよび抗カテプシンDトランスフェクタント；マイクロタ イターウェルあたり細胞20,000個）を、下記のように、抗APO-1抗体に40時間暴 露した。必要な場合には、抗APO-1体に対する暴露の20時間前に、ペスタチンA（ 10-4Mの0.2％DMSO溶液）をDHFRトランスフェクタントに加えた。試料４本につい て、ニュートラル・レッドアッセイによって生存率を評価した；結果は、抗体に 暴露されていない対応する対照ウェル（生存率100％）における総取り込みから 、各処置の終了時の色素の取り込みの百分率として表す。 （43B）ペプスタチンAは、U937細胞におけるTNF-α誘導アポトーシス細胞死を 妨害する。細胞をペプスタチンA（10-4Mの１％DMSO溶液）またはDMSO単独でプレ インキュベートした24時間後、２×105個／mlの密度で播種した。必要な場合、T NF-α（100U/ml；10ng/ml）を加えて、６時間後にガラススライド上に試料のサ イトスピンを行って、DAPI（0.5μg/ml、シグマ社）で染色した。蛍光条件下で 顕微鏡観察を行った（倍率100倍）。断片化した染色質を有する核を矢印で示す ；中空の矢印は分裂核を示す。データは断片化した核の形態を有する細胞の百分 率±S.E.として表す。各条件について、異なる14視野において少なくとも細胞40 0個を採点した。 図44A、B、C&Dは、カテプシンDの異所発現が細胞生存率を低下させることを示 している。 （44A&B）lacZ（CMVプロモーターによって駆動される）およびカテプシンDcDN A（テトラサイクリン抑制性プロモーターによって駆動される）または対照ベク ターのいずれかで共トランスフェクトしたHeLa細胞のX-Gal染色。いずれの場合 にも、細胞はテトラサイクリンの非存在下で培養し、48時間後にX-Gal溶液で ３時間染色した。光学顕微鏡写真を示す（倍率、200倍）。正常な青く染色され た細胞（Aにおける）およびアポトーシスの青く染色された細胞（Bにおける）の 例を矢印で示す。 （44C）アポトーシス性の丸い形状を示す青い細胞の発現頻度は、２つのトラ ンスフェクタントに由来する異なる８視野から青い細胞延べ800個を計数するこ とによって評価した（AおよびBに記述）。 （44D）アルカリ・フォスファターゼ（SEAP）および対照ベクターまたは上記 カテプシンDベクターのいずれかと共トランスフェクトしたHeLa細胞の増殖培地 に分泌されたSEAPの評価；各トランスフェクションを２つのプレートに分割し、 その１つには直ちにテトラサイクリン（1.5μg/ml）を加えた。最後の５時間の インキュベーションの際に、増殖培地中に分泌されたSEAP活性をトランスフェク ションの48時間後に測定した。SEAP活性のデータは４つの実験から２本ずつ得た 。値は、テトラサイクリンの存在下で生じた総活性がら、テトラサイクリンの非 存在下で測定したSEAP活性の百分率を示す。 図45A&Bは、DAP-キナーゼが細胞骨格にどのように局在するかを示している。 （45A）。DAP-キナーゼ-K42Aで一過性にトランスフェクトしたSV-80細胞を、 下記のように抗FLAG-抗体および蛍光結合ファロイジンで48時間目に染色した。 いずれの写真も同じ視野を表す（倍率、400倍）。 （45B）。HeLa細胞の洗浄剤抽出。HeLa細胞を0.5％トライトンX-100で抽出し 、下記のように可溶性分画（Sol）および不溶性分画（Insol）に分けた。タンパ ク質抽出物を10％SDS-PAGE上で分離して、ニトロセルロースメンブレンにブロッ トした。メンブレンを、表示のように抗DAP-キナーゼ・モノクローナル抗体、抗 チューブリン抗体、および抗アクチン抗体と反応させた。 図46A&Bは、細胞骨格結合の原因である領域のマッピングを示す。 （46A）。組換え型DAP-キナーゼの免疫染色。PECE-FLAG-DAP-キナーゼでトラ ンスフェクトしたCOS細胞を、下記のように抗FLAG-モノクローナル抗体で免疫染 色した（倍率、400倍）。 （46B）。COS細胞を、表示のように、DAP-キナーゼまたはDAP-キナーゼ欠失変 異体のいずれがを有するpECEまたはpCDNA3ベクターでトランスフェクトした。細 胞を図45に記述のように0.5％トライトンX-100で抽出した。検出は抗FLAG抗体に よって行った。Sol−可溶性分画、Insol−洗浄剤不溶性分画。DAP-キナーゼ欠失 変異体の図を左側に示す。 図47A&Bは、IFN-γ誘導細胞死および構成的DAP-キナーゼの異所発現時におけ るアクチン細胞骨格構築の変化を示す。 （47A）。カバーグラス上で増殖させたHeLa細胞をIFN-γ（1000U/ml）で処置 した（b）または無処置のままとした（a）。４日後、細胞を蛍光結合ファロイジ ンで染色した（倍率、1000倍）。 （47B）。REF-52細胞を、表示のようにDAP-キナーゼ変異体で一過性にトラン スフェクトした。48時間後、下記のように細胞を抗FLAG抗体、蛍光結合ファロイ ジン、およびDAPIで三重染色した（倍率、100倍）。矢印は、トランスフェクト した細胞を示す。 発明の詳細な説明 I．細胞をIFN-γの細胞障害作用から保護するアンチセンスcDNAの単離 (A) 実験手順 (A1) cDNA クローンを得る HeLa細胞をIFN-γ（200U/ml）によって処置する前、そして処置した１、２、 ４、12、24および48時間後に回収したmRNAの混合物から、cDNAライブラリ（DNA1 00g）を作製した。これを、既に詳しく記述されているように（ダイス＆キムチ （Deiss and Kimchi）、前記）、EBVに基づくpTKO1発現ベクターの中にアンチセ ンス方向にクローニングした。得られた独立したクローン約105個の発現ライブ ラリを、リン酸カルシウムトランスフェクション技法によってHeLa細胞８×106 個（９cmプレートあたり106個）に導入した。トランスフェクション効率を決定 するために、トランスフェクタントの分画をヒグロマイシンB（200μg/ml、カル ビオケム社）で選別した。得られた効率はおおよそ５％であった。これと平行し て、トランスフェクトした細胞の大部分を、細胞密度1500個／cm2で播種して、 ヒグロマイシンB（200μg/ml）およびIFN-γ（750U/ml）の双方による選別を行 った。選別用培地を３〜４日毎に交換した。28日後、IFN-γ存在下で生存および ／または増殖した細胞を２週間増殖させてプールした。ヒルト （Hirt，B.）、（1967）、J．Mol．Biol.、26：365）の方法に従って、染色体外 DNAを得て、これを制限酵素DpnIによって開裂し、大腸菌HB101宿主細胞に導入し た。DpnIによる開裂によって、HeLa細胞中で複製されたエピソームDNAのみが確 実に細菌にトランスフェクトされた。 上記の技法によって、DNAアンチセンス配列を含むいくつかの細菌クローンを 得たが、そのいくつかはIFN-γの細胞死促進作用から細胞を保護することができ た。 (A2) アンチセンスcDNAクローンの分類 プラスミドDNAを個々の細菌クローン10個から調製した。pTKO1ベクターにおけ るcDNA挿入部位に直接隣接する配列に対応する特異的プライマーを用いて、PCR によって増幅したcDNAインサートを各プラスミドから作製した。cDNAインサート の大きさは300から800bpの範囲であった。PCR断片を標識プローブとして用いて 、取り出したアンチセンスcDNAクローンのいくつかとの起こりうる交叉ハイブリ ダイゼーションをサザンブロット上で調べた。 (B) 結果 (B1) クローンの分類 上記のcDNAクローン10個を異なる６つの互いに重なり合わないグループに分類 したが、複数のメンバー（クローン）を含むグループもあったが、メンバーが１ つのグループもあった。本発明に関係するそれらのクローンを以下の表１に示す ： 表１：IFN-γ処置HeLa細胞から取り出したアンチセンスcDNAクローンの初回特 徴付け グループ１のインサート230、254、255、264および258は、互いに完全に同一 であるように思われる。PCR断片をシークエンシングして、結果をEMBA核酸デー タベースに存在する配列と比較した。グループ１〜５のインサートは全て、新規 であることが判明した。 (B2) mRNA の検出 このようにして得られたDNA断片を用いて、これらの断片とハイブリダイズし たmRNAのHeLa細胞における発現レベルを検出および決定した。親HeLa細胞からの 総RNA 20μgをゲル上で分画して、ブロットし、異なるプローブと反応させた。 各プローブは異なる大きさの単一のmRNA転写物を認識した（表１）。グループ２ と反応するmRNAの発現レベルは低いが、グループ１と反応するmRNAの発現レベル は比較的高かった。 II．単離されたアンチセンスcDNAによる第二のトランスフェクション 二次トランスフェクタントにおけるアンチセンスRNAの発現レベル (A) 実験手順 上記のように単離されたアンチセンスcDNAがIRN-γの細胞死促進作用から細胞 を保護するために十分であることをさらに確認するために、HeLa細胞のサブコン フルエント単層を、取り出された個々のpTKO1プラスミドのDNA 40μgでトランス フェクトし（１試料あたり２本ずつ）、ヒグロマイシンBによる単選別を行った 。各トランスフェクションからヒグロマイシン耐性クローン約104個のプールを 作製して、安定なポリクローナル集団を１試料あたり６本ずつ保存した。次に、 IFN-γ適用に対する上記クローンの感受性を決定した。 無関係構築物を有するベクターpTKO1-DHFR（ダイス＆キムチ（Deiss and Kimc hi）、前記）を対照とした。同時進行で対照ベクターをHeLa細胞に導入すると、 安定なトランスフェクタントの２つの独立したポリクローナル集団が得られ、こ れをDHFR-t1およびt2と名付けた。 トランスフェクトしていないおよびトランスフェクトしたHeLa細胞の双方にお けるmRNA転写物を検出するために、構築物230および256（それぞれグループ１お よび２）からの二本鎖cDNA断片を、ノザンブロット分析においてプローブとして 用いた。これらの２つの特異的cDNAインサートを、一般的に用いられる市販の標 識キットによって標識した。cDNAインサートの調製およびそれから得られる一本 鎖RNAプローブの作製を共に容易にするために、それらをBluescript（登録商標 ）ベクター（ストラタジーン社、アメリカ）にサブクローニングした。 (B) 結果 構築物230（グループ１） 図1Aに見ることができるように、この構築物におけるcDNAインサートは、トラ ンスフェクトしていないおよびトランスフェクトしたHeLa細胞の双方において、 単一の内因性2.4KbのmRNA転写物とハイブリダイズした。クローン230および255 のアンチセンス構築物を含む安定なトランスフェクタントにおいて、この230プ ローブによってさらなる複合アンチセンス転写物が検出された。これはもとのcD NAインサートの320塩基および発現カセット（ポリアデニル化シグナルまでの配 列と共にSV40プロモーター）に由来する配列のさらなる800塩基を含んだ。Bleus cript（登録商標）ベクターによって産生したRNA標識鎖の一つは、内因性の2.4K bのmRNAのみとハイブリダイズしたが、相補鎖は1.1KbのRNAのみとハイブリダイ ズし、後者が実際にアンチセンスmRNAであることを確認した（データは示してい ない）。 クローン230および255におけるアンチセンスRNAの量は、センスmRNAレベルを ３〜６倍超えていた（図1A、1B）。IFN-γ処置後、アンチセンス発現レベルは、 pTKO1ベクターに存在するIFN-γ刺激反応エレメント（ISRE）（ダイス＆キムチ （Deiss and Kimchi）、前記）のためにさらに上昇し、このようにアンチセンス 転写物はセンス転写物に対して15倍過剰となった（図1B）。内因性の2.4KbmRNA レベルはIFN-γによって制御されず、高いアンチセンス発現によって影響を受け なかった。 構築物256（グループ２） 図2Aおよび2Bに見ることができるように、256クローンの構築物（大きさ367bp ）は、ノザンブロット上で、調べた全ての細胞において比較的低いレベルで発現 された単一の内因性6.3KbのmRNA転写物とハイブリダイズした。256-t1およびt2 トランスフェクト細胞では、これはまたcDNAインサートの367塩基およびベクタ ー中の発現カセットに山来する配列の800塩基を含む、複合1.2KbRNAとハイブリ ダイズした（図２）。pTKO1ベクターにおける断片#256がアンチセンス方向 であることは、センスcDNAクローンのシークエンシングの際に確認した（図７） 。無処置のHeLa細胞においてpTKO-1プラスミド#256から発現されたアンチセンス RNAの量は、センスmRNAレベルを100倍以上超えた。その上、pTKO1ベクターにIFN -刺激反応エレメント（ISRE）が存在するために、アンチセンスInRNA発現レベル は、IFN-γ処置後にさらに上昇した（図３）。 III．アンチセンスcDNAでトランスフェクトした細胞のIFN-γに対する反応 (A) 実験手順 個々のアンチセンスcDNAでトランスフェクトしたHeLaのポリクローナル集団を 、ヒグロマイシンBとIFN-γ（750U/ml）の双方の存在下で培養した。増殖および 生存率パラメータを：(1)光学顕微鏡下、(2)電子顕微鏡下、および(3)DAPI染色 （0.5μg/ml；シグマ社）によって調べた。より詳しい定量のために、ニュート ラルレッド取り込みアッセイを行った：異なるポリクローナルHeLa細胞集団をサ ブコンフルエント細胞密度で96ウェルマイクロタイタープレートにおいて培養し 、IFN-γ（750U/ml）で処置するか、または無処置のままとした。全ての細胞を 持続的にヒグロマイシンBを含む培地で維持して、トランスフェクトした細胞を 選別した。上記のように調製した２つのDHFRトランスフェクトHeLa細胞集団（t1 、t2）を、IFN-γに対して典型的な増殖感受性曲線を示す対照培養とした。調べ たアンチセンスcDNAトランスフェクト細胞は230-t1、255-t1（グループ１）およ び256-t1、256-t2（グループ２）であった。生存細胞をニュートラル・レッドで 染色して、実験の14日の間に５４０ｎｍでのO.D.を１試料あたり４本ずつ測定す ることによって色素の取り込みを定量した。 (B) 結果 親および対照のDHFR-トランスフェクトHeLa細胞の顕微鏡検査によって、IFN- γが２相性の反応パターンを誘発することが明らかになった。細胞はIFN-γ処置 の最初の４日間で増殖を停止したが、なおも生存しており（トリパンブル一排除 法）、IFN-γに対する細胞抑制的反応に特徴的な平坦な形態を示した（図3A、b ）。この期間中の増殖速度の減少もまた、DNAへのチミジンの取り込みの急激な 減少（90％以上）によって測定した（示していない）。このタイプのIFN-γによ る増殖停止の後、さらに10日の間に塊状の細胞死が非同調的に起こった。細胞は 徐々にその大きさが減少して丸くなり、プレートから剥離した（図3A、d）。基 層から細胞が剥離した後のDNAのDAPIによる染色から、プログラムされた細胞死 の特徴である、核の形態に大きい変化があることが明らかになった。この中には 、核濃縮、時に核の辺縁部に選択的に検出される染色質凝縮、そして染色質沈降 （図3B、b）が含まれた。IFN-γ処置細胞が剥離する前の透過型電子顕微鏡写真 から、核濃縮および染色質凝縮の他に、表面微絨毛の消失、表面水痘形成、細胞 質突起の分離、そして細胞質崩壊を含むその他の形態学的変化が明らかになった （図3C、dに詳細を記す）。グループ１のpTKO-1プラスミドからのアンチセンスR NA発現によって、IFN-γの細胞障害作用に対する細胞の感受性は低下した；より 多くの細胞がプレート上で生存し、上記の死に関連した形態学的変化の発生率は 、はるかに低かった（図3C、bのIFN-γ処置DHFRトランスフェクト細胞の走査型 電子顕微鏡写真を、図3C、fのIFN-γ処置230-t1細胞と比較）。前記の群のアン チセンスcDNAからの他の３つのクローン、すなわち２〜６に関しても、同様の顕 微鏡観察を行って、IFN-γ誘導細胞死からの保護が示された（下記参照）。 次に、IFN-γに対する対照培養の典型的な二相性反応およびIFN-γ誘導細胞死 に対するアンチセンス発現培養の感受性の減少をいずれも、より正確に定量的に 測定するために、ニュートラル・レッド取り込みアッセイを実施した。２つのDH FRトランスフェクトHeLa細胞集団（t1、t2）をこのアッセイにおいて対照培養と し、調べたアンチセンスcDNAトランスフェクト細胞は230-t1、255-t1（グループ １）（図4A）および256-t1、256-t2（グループ２）（図4B）であった。IFN-γの 非存在下では、トランスフェクトしたHeLa細胞の全てが同じ挙動を示して実質的 に同一の増殖曲線を示し、このことはアンチセンスRNA発現が細胞の正常な増殖 に影響を及ぼさないことを示唆している。アンチセンスRNA発現によって変化し なかったもう一つの特徴は、IFN-γの細胞抑制反応の程度であった。図4Aおよび 4Bに示すように、IFN-γは全てのトランスフェクト培養の増殖速度を同程度に減 少させ、それらは全て、最初の４日間のニュートラル・レッド色素の取り込みに 同程度の減少を示した（顕微鏡下で見て細胞死が明らかになり始める前）。処置 の４日後、写真は劇的に変化した。ほとんど全ての対照培養がその後のIFN-γ処 置日の間に死亡して、14日目でのニュートラル・レッド色素の取り込み量は最 小値となったが、色素取り込みが一定値にあることから反映されるように、アン チセンスRNAを発現した細胞の有意な分画はIFN-γの存在下でも生存した。IFN- γ誘導細胞障害に対する耐性は、異なる２つのアンチセンスRNAを発現する、調 べた４つ全ての培養において非常に類似していた（図4A、4B）。これらのデータ は、グループ１および２からのアンチセンスRNAの発現によって、HeLa細胞はIFN -誘導細胞死に限って保護され、その細胞抑制作用に対しては保護されないこと を示している。これらのトランスフェクトした細胞において、2-5Aシンターゼ遺 伝子のIFN-γによる正常なmRNA誘導から推理すると、アンチセンスRNA発現は、I FN-γのシグナル伝達における初期の生化学段階に影響を及ぼさなかったことは 注目に値する（図4C）。要するに、調べた全ての基準において、IFN-γの細胞死 誘導作用のみがアンチセンスRNA発現によって妨害された、と結論される。 IV．アンチセンス構築物でトランスフェクトした細胞の壊死性細胞死に対する反 応 この段階で、アンチセンスRNA発現によって、HeLa細胞が壊死型の細胞死から 保護されるか否かをチェックすることが興味深くなった。このため、シクロヘキ シミド（CHX）と併用して加えたTNFの効果を様々なHeLa細胞集団において調べた 。IFN-γの作用とは異なり、HeLa細胞においてTNF-α＋CHXによって誘導された 細胞死は非常に急速（３時間で50％細胞障害性）で、細胞は溶解する前に、細胞 の膨張のような壊死の典型的特徴を示した。表２に示すように、グループ１およ び２からのアンチセンスRNA発現によって、細胞はIFN-γ誘導細胞障害に対して 保護されるが、TNF-α誘導壊死性細胞死に対しては保護されなかった。調べた全 てのHeLa細胞トランスフェクタントは、TNF+CHX併用によって、同様の時間速度 論および同じ効率で細胞死に至った。ノザンブロット分析によって、256-t1にお けるアンチセンスmRNA転写物のレベルは、５時間ではTNF+CHX処置によって減少 せず（示していない）、このように、壊死性細胞死に対する保護作用がなかった ことは、処置によって引き起こされたアンチセンスRNA発現の喪失が原因である 可能性は除外される。これはさらに、細胞障害のタイプに関する保護メカニズム に特定の特異性があることを示唆する。 表２：アンチセンスRNA（グループ１および２からの）の発現はIFN-γによるプ ログラムされた細胞死に対して保護するが、TNF-による壊死性細胞死に対して保 護しない（A＝５４０ｎｍ） それぞれの処置を１試料あたり４本ずつ実施して、１＝５４０ｎｍでのODによ って測定した色素の取り込みの平均値を、表示の時間間隔で示した。SDは２〜４ ％であった。N.D.、実施していない。ｐ Ｖ．DAP-1 cDNAのクローニングおよびアミノ酸配列の決定 λgt10ベクターに構築したHL-60のcDNAライブラリを、pTKO1-230のcDNAインサ ートでスクリーニングした。ほぼ完全に重なり合っており、約2.3KbのcDNAイン サートを有する２つの独立したクローン、λ1およびλ2を分析した。λ1 cDNAク ローンは、5'-非翻訳領域、短いコード領域そしてcDNAクローンの60％以上を構 成する比較的長い3'-非翻訳領域を含んだ（図５）。 λ1が有するcDNAのヌクレオチド配列およびその予想されるアミノ酸パターン を図６に示す。このcDNAは長さが2232bpで、その3'末端に可能性があるポリアデ ニル化シグナルATTAAAを含む。オープンリーディングフレーム（ORF）は非常に 短く、ヌクレオチド160〜162位の開始コドンから始まって、466〜468位の終了コ ドンTGAで終了する。このORFの前には極めてGC-に富む5'-非翻訳領域が存在し、 おそらく、計算分子量11.2kDaであるアミノ酸102個を含むタンパク質をコードす る。アミノ酸組成は、プロリンに富み（15％）、２つの塊の荷電残基を、１つは タンパク質の中央部そしてもう一つは3'末端部に示す塩基性タンパク質（等電点 ＝10）を予想する。プロリン含量が高いために、ゲル上のタンパク質の移動度に 何らかの異常を生じる可能性がある。モチーフの探索（「モチーフ」プログラム ；GCGソフトウェア・パッケージ）によって、タンパク質が、３位および36位で キナーゼII燐酸化に関する２つの考えられる部位、すなわちC-末端での単一のお そらくタンパク・キナーゼC燐酸化部位（91位）、そして51位でcdkのコンセン サス燐酸化部位、を含むことが示された。さらに、タンパク質は65〜67位で、い くつかのタンパク質において細胞接着に何らかの役割を果たすトリペプチドであ るコンセンサス配列RGD、そして49〜53位で可能性があるSH3結合モチーフ、sPSP Pを含む（カウバーン（Cowburn）(1994)、Struc．Biol．1、489〜491）。シグナ ルペプチドまたは膜通過ドメインの存在を示す証拠を認めなかった（SAPS予測； ブレンデルら（Brendel）、（1992）PNAS USA、89；2002〜2006）。アミノ酸配 列は既知のタンパク質と有意な相同性を示さなかった。 ヒトゲノムDNAを含むサザンブロットにおいて、断片#230をプローブとして用 い、これを切断しない様々な制限酵素で消化させた。EcoRI、BamHI、PstIおよび XbaI開裂させたDNAとハイブリダイズすると、単一のバンドが可視化され、この ことは単一のコピー遺伝子の存在を示唆している（示していない）。この新しい 遺伝子をDAP-1と名付けた（細胞死関連タンパク-1）。 網状赤血球溶解物におけるインビトロ翻訳アッセイにおいて、予想されるORF は、クローニングした2.4Kb転写物から翻訳された主な15kDaタンパク質をコード することを確認した。分子の異なる４つの領域に広がる４つのクローン（すなわ ち、p6、p5、p8、およびp4；図５参照）と共に全長のcDNAインサートを、インビ トロで転写して翻訳した。調べた全てのサブクローンにおいて、DAP-1 cDNA（p6 ）の5.1Kb部分のみがタンパク質のインビトロ合成を指向した（図1C）。主要な 翻訳産物はゲル上を15kDaタンパク質として移動した。160〜162位でのATGコドン の変異（ATGからGGC）によって、15kDaタンパク質の合成は完全に消失し、この ようにこのタンパク質の開始点の位置を確認した（データは示していない）。15 kDaタンパク質産物の他に、22kDaの第二のタンパク質についても、λ1とp6cDNA から低い効率で翻訳された（図1C）。その翻訳は160位のATコドンの消失によっ て影響を受けないが、タンパク質はDraIおよびBstTI制限エンドヌクレアーゼに よるp6サブクローンの開裂によってそれぞれ、大きさ16および18kDaに短くなっ た（示していない；制限マップについては図５参照）。これらの基準は、可能性 がある別のオープンリーディングフレームにも適合し、これは第一のORFに関し て異なる相でのヌクレオチド配列において検出される（図６）。これはATGコド ン（287〜289位）で始まり、終了コドンTGA（816〜818位）で終了する。こ れは計算分子量19.9kDaを有するアミノ酸176個を含むタンパク質をコードする可 能性があり、いかなる既知のタンパク質とも有意な相同性を示さない。 主要なDAP-1タンパク質の細胞における発現を分析するため、細菌が産生した1 5kDaタンパク質に対してウサギポリクローナル抗体を作製した。アフィニティ精 製抗体は、イムノブロット上で、HeLa細胞の抽出物において共に移動する２つの タンパク質を認識した；下のバンドは、ゲル上で細菌が産生した15kDa DAP-1タ ンパク質と共に移動した。より遅い移動型はタンパク質の翻訳後改変型を表す可 能性がある。IFN-γ（15：１の比）の存在下で起こるアンチセンスRNAの上昇し たレベルを発現するHeLa細胞トランスフェクタント、230-t1および255-t1では、 DAP-1ンパク質レベルはDHFR-トランスフェクト培養と比較してそれぞれ、75％お よび78％減少した（図1D）。上の２つの非特異的バンド（細菌が産生したDAP-1 の過剰量とは競合しない）は、アンチセンス発現によって影響を受けず、このよ うに、作用の選択性が支持される。 VI．DAP-2のクローニングとアミノ酸配列の決定 上記のように、発現実験は、二本鎖cDNA断片#256（大きさ367bp）が、ノザン ブロット上で内因性の6.3kb mRNA転写物とハイブリダイズすることを示した。同 じ単一の6.3kb mRNA転写物は、全長のcDNA（下記参照）をノザンブロット上でプ ローブとして用いると、HeLa細胞（親およびトランスフェクタント）およびK562 細胞に検出された（図2B）。したがって、pTKO1-256からのcDNAインサートを用 いて、K562 cDNAライブラリのスクリーニングを行った。 #256 cDNAインサートに関して約４×106pfuをスクリーニングして、連続ウォ ーキング・スクリーニングを２回行った後に陽性クローン40個を単離した。アプ ライド・バイオシステムズ・DNAシークエンサー373 A上でシークエンシングを行 った。配列の独自性および関連性は、ヌクレオチドレベルでFASTA（GCGソフトウ ェア・パッケージ）、そしてアミノ酸レベルでFASTA、BLASTP、およびBLOCKSプ ログラムを用いて決定した（S.ヘニコフ&J.G.ヘニコフ（S．Henikoff and J．G ．Henikoff）、Nucleic Acids Res．19、6565（1991））。 ２つのクローンλ29およびλ32をシークエンシングに選択した（図７）。両cD NAに関して得られた複合配列は、ヌクレオチド5886個を含み、5872位で始まり、 ２つのポリAアデニル化シグナルAATAAAの後に続くポリAテールを含む（図８）。 3'-非翻訳療域もまた、短命なmTNAの3'-非翻訳部分に認められる２つのATTTA不 安定モチーフを含む（ショウ＆カーメン（G．Shaw and R．Kamen）、Cell 46、6 59（1986））。mRNAは、337位で始まり、4605位で終わる単一の長いオープンリ ーディングフレームを含み、おそらくアミノ酸1423個のタンパク質をコードする （図８）。タンパク質産物の計算分子量は約160kDaである。タンパク質のN-末端 のアミノ酸20個に対して、アフィニティ精製ポリクローナル抗体を作製した。こ れらの抗体は、イムノブロット上で、cDNAの全コード領域を発現したベクターで トランスフェクションを行った後にCOS-1細胞において産生される160kDaの組換 えタンパク質を認識する（図2D）。これらの抗体はHeLa細胞において同じ大きさ の内因性タンパク質と反応した。アンチセンスRNA発現細胞、256-t1および256-t 2では、160kDaタンパク質の定常状態レベルは、DHFR対照細胞の場合より10およ び５倍低かったが、非関連タンパク質である、ビンキュリンは、全てのHeLa細胞 トランスフェクタントにおいて同程度の発現レベルを示した（図2D）。このよう に、HeLa細胞におけるpTKO-1プラスミド#256からアンチセンスRNAが発現された 結果、対応するタンパク質の量は有意に減少した。 われわれは、このタンパク質において存在するいくつかの既知のドメインおよ びモチーフを定義することができた。その末端のN-末端は、13〜267位までのア ミノ酸255個に及ぶタンパクキナーゼドメインを含む。その構造に基づき、これ は、存在する全ての保存モチーフを有する古典的なXIサブドメインの組成物を有 するタンパク・キナーゼのセリン／トレオニン型である可能性がある（図８）（ ハンクス＆クイン（S．K．Hanks and A.M．Quinn）、Methods Enzymol．200、38 （1991））。この新規キナーゼをDAP-2またはDAP-キナーゼ（細胞死関連タンパ クキナーゼ）と名付けた。 キナーゼドメインは、カルモジュリン依存型キナーゼのファミリーに属する。 ミオシン軽鎖キナーゼを含む、このグループに属する既知のキナーゼドメインと の相同性は、34〜49％である（図9A）。３つの主な違いによって、DAP-キナーゼ のキナーゼ・ドメインは、カルモジュリン依存型キナーゼファミリーの他のメン バーと区別される：1）サブドメインIIは比較的長く、塩基性アミノ酸の枝 （KKRRTKSSRR）を有する；2）サブドメインIIIは、細胞周期依存型キナーゼのそ れに最も類似している（図９）。興味深いことに、細胞周期依存型キナーゼの典 型的な配列（PSTAIRE、PSSALRE、PCTAIRE、KKIALRE）はサブドメインIIIに存在 する；そして3）サブドメインVIIは極めて短く、アミノ酸７個を含むに過ぎない 。 キナーゼドメインのすぐ下流に、カルモジュリン依存型キナーゼのファミリー のほぼ全てのメンバーに存在するさらなる相同性の枝が存在し、これはカルモジ ュリンの認識および結合に関係していた；ハーリング、スツル、ギャラガー、（ B．P．Herring，J．T．Stull，P.J．Gallagher）、Mol．Biol．Chem．265、1724 （1990）；シューメーカーら（M．O．Shoemaker）、J．Cell．Biol．111、1107 （1990）；クルザレギら（F.H.Cruzalegui)、Proc．Natl．Acad．Sci．USA89、1 2127（1992））。カルモジュリン認識ドメインの下流には、365位〜629位のアミ ノ酸265個に及ぶアンキリン・リピート・ドメインが確認された。これはそれぞ れアミノ酸33個の８リピートを含み、５個のC-末端からの３つのN-末端リピート を分離する単一のプロリン残基を除いては、スペーサーによって分離されていな い（図８および9C）。アンキリン・リピートは様々なタンパク質においてタンパ ク・タンパク相互作用に関係する（ミカレイ＆ベネット（P．Michaely and V．B ennett）、Trends in Cell Biology 2、127（1992））が、セリン／トレオニン ・キナーゼとの関係についてはこれまで記述されていない。アンキリン・リピー トを有する一つのチロシンキナーゼが、最近ヒドラ・ブルガリス（Hydra vulgar is）において同定された（チャンら（Ｔ．A．Chan）、Oncogene 9、1253（1994 ））。DAP-キナーゼにおいて、アンキリン・リピート８個は、推定のイフェクタ ーまたは調節分子との相互作用を媒介する可能性があり、または基質の安定性お よび／またはキナーゼ・基質相互作用の安定性に影響を及ぼす可能性がある。 アンキリン・リピートのすぐ下流には、コンセンサス配列G[A]XXXXGKT[S]を通 じて同定される、これに続いて可能性があるP-ループモチーフ２個、すなわちAL TTDGKTおよびGHSGSGKTが存在する。DAP-キナーゼの可能性があるp-ループ・モチ ーフとATPまたはGTP結合タンパク質ファミリー７個内の対応するコンセンサス配 列との比較によって、3'のP-ループのみが、伸長因子であるATPシンターゼのb- サブユニットおよびチミジン・キナーゼと何らかの類似性を有することが示され る。実際に、推定の5'Pループを含むアンキリン・リピート８個の後に続くアミ ノ酸33個の枝は、他よりあまり保存されていない９番目のアンキリン・リピート を表す可能性がある。DAP-キナーゼはまた、翻訳後改変に関して多数の考えられ る部位を有する可能性があり、膜通過ドメインもシグナルペプチドも有しない。 プログラム・モチーフ（GCGソフトウェア・パッケージ）を用いたPrositeバンク ・サーチによって、DAP-キナーゼタンパク質が1376位でのC-末端アミド生成に関 するコンセンサス配列を含むことが明らかになった（これはC-末端のアミノ酸47 個をタンパク質の本体から開裂することができることを示唆している）。これは また、N-グリコシル化部位に関するコンセサス配列も含み、cAMP-依存型キナー ゼの考えられる燐酸化部位（６個）、カゼインキナーゼII（28個）およびタンパ クキナーゼC（20個）も含む。 また、DAP-キナーゼの導出アミノ酸配列から、カルモジュリン調節セリン／ト レオニン・キナーゼの非常に独自のタイプが得られることが示唆される。セリン ／トレオニン・キナーゼ・ドメイン、アンキリン・リピートおよび１つのタンパ ク質におけるキナーゼドメイン以外のさらなる考えられるATP/GTP結合部位の組 合せは（図10）これまで記述されていない。160kDaの大きさは、セリン／トレオ ニン・キナーゼではまれで、DAP-キナーゼは、実際に今日まで知られている最大 のカルモジュリン-依存型キナーゼである。最近、酵母の二ハイブリッド系にお いて確認された（示していない）DAP-キナーゼのカルモジュリン結合能は、多く の場合、プログラムされた細胞死がCa2+依存的であるという考え方と一致する（ セン（S．Sen）、Biol．Rev．Camb．Philos．Soc．67、287（1992）；リー、ク リスタコス、スモール（S．Lee、S．Christakos、M．B．Small）、Curr．Opin． Cell．Biol．5、286（1993））。その上、カルモジュリン拮抗剤はグルココルチ コイド誘導アポトーシスを阻害したこと（ダウド、マック、コム、ハウスラー、 ミースフィールド（D．R．Dowd、D．P．Mac、B．S．Komm、M．Ｒ．Haussler、R ．Miesfield）、J．Biol．Chem．266、18423（1991））、そしてミオシン軽鎖キ ナーゼの阻害剤がTNF誘導アポトーシス細胞死を阻害すること（ライト、ツェン 、ツォン、トルチ、ラリック（S.C．Wright、H．Zheng、J．Zhong、F．M．Torti 、 J．W．Larrick)、J．Cell．Biochem．53、222（1993））。 DAP-2が真のキナーゼであることを確認するために、全コード領域（上記の開 始ATGから3'末端での最初のEcoRI部位まで）を含むλ29 cDNAの断片を有する発 現ベクター（PECE-FLAG）で、COS細胞を一過性にトランスフェクトした。細胞溶 解物を抗FLAGモノクローナル抗体で免疫沈降させ、洗浄した免疫沈降物をカルモ ジュリンとCa2+の存在下でインビトロ自己燐酸化についてアッセイした。図2Cに 示すように、ポリアクリルアミドゲル上でインビトロ反応産物の分画時に、160k Daの単一の燐酸化バンドが出現した。この実験は、組換え型タンパク質がその予 想されるアミノ酸構造から示唆されるように、固有のキナーゼ活性を有する最初 の証拠となる。 VII．インビトロキナーゼ活性の評価 (A) 実験手順 １．細胞培養 HeLaヒト上皮癌細胞、COS-7サル腎細胞、SV-80細胞（SVO-40ラージT抗原で形 質転換したヒト繊維芽細胞）、およびREF-52ラット胎児繊維芽細胞を、10％FCS （ギブコ社）、４mMグルタミン、100U/mlペニシリンおよび0.1mg/mlストレプト マイシンを含むDMEM（バイオラブ社）で増殖させた。HeLa-tTAは、G-418 200μg /mlの存在下で増殖させた（ゴッセン＆ブヤール（Gossen and Bujard）、1992） 。トランスフェクションは標準的なリン酸カルシウム技法を用いて行った。組換 え型ヒト・インターフェロン-γ（３×107U/ml）は、ペプロテック社から購入し た。ノコダゾールはシグマ社から、ラトロンキュリンAは、イスラエルのレオボ ットにあるワイツマン・インスチチュートのA．D．バーシャドスキー（A.D．Ber shadsky）氏より寄贈された。 ２．プラスミドの構築 SV-80、REF-52、またはCOS細胞に一過性にトランスフェクションするため、そ してHeLa細胞に安定にトランスフェクションするためのDAP-キナーゼ発現構築物 を、pECE（デング＆カリン（Deng and Karin）、1993）、またはpCDNA3（インビ トロゲン社）ベクターのいずれかにおいて調製した。全ての構築物において、DA P-キナーゼ配列のN-末端にFLAGエピトープでタグをつけた。C-末端欠失構築物 では、オリゴヌクレオチド指向変異誘発によって開始ATGコドンに導入されたNde I制限部位を通じて、DAP-キナーゼ配列をFLAGエピトープに融合させた。別の構 築物では、対応する制限部位を通じてDAP-キナーゼ配列をFLAGエピトープに融合 させた。C-末端欠失構築物：1〜1271、1〜835、1〜641および1〜305はそれぞれ 、DAP-キナーゼcDNAをHind III（nt 4146）、XbaI（nt 2838）、Bgl II（nt 225 6）、およびEcoR V（nt 1247）で消化することによって調製した。全長のDAP-キ ナーゼcDNA構築物は、3'UTRの4932位でEcoR I部位に達する。DAP-キナーゼ発現 構築物305〜641、641〜835、および641〜1423はそれぞれ、EcoR VとBgl II（nt 1247〜2256）、Bgl IIとXba I（nt 2256〜2838）による二重消化によって、また はBgl II（nt 2256〜4827）によって得たcDNA断片を含む。３つのDAP-キナーゼ 変異体：K42A、CaMおよびcytはそれぞれ、5'-GTATCCCGCCGCATTCATCAAGA-3'、5'- CAGCATCCCTGGATCAAGTCCAGAAGTAACATGAGT-3'、および5'-AAGACGGCAGAAGATCTAGAAG AGCCCTAT-3'オリゴヌクレオチドによるオリゴヌクレオチド指向変異誘発を用い てそれぞれ、調製した。全てのヌクレオチドの番号はX76104に従ってつけた。 DAP-キナーゼは、HeLa細胞において、LacZ配列を有するニシストロン性のメッ セージとしてテトラサイクリン抑制可能プロモーターから一過性に発現された。 DAP-キナーゼ配列は、開始ATGコドンで導入したNde I部位を通じてN-末端でHAエ ピトープのタグをつけた。DAP-キナーゼ-LacZ二シストロン性メッセージを発現 させるためのベクターは、pUT535ベクター（ケイラ社）からのBH-LacZ融合遺伝 子を、pSBCベクターのNot I部位に挿入することによって調製した（コルヒホフ ら（Korchhoff）、1995）。得られたベクターをpSBC-b1と名付けた。 (B) 結果 DAP-キナーゼタンパク質の導出アミノ酸構造は、図31に示すようにいくつかの 機能的モチーフおよびドメインを予測する。アミノ末端は、13〜267位までのア ミノ酸255個に及ぶ、セリン／トレオニン型のタンパク・キナーゼ・ドメインを 含む（ダイスら（Deiss）、1995）。キナーゼ活性を測定するために、DAP-キナ ーゼのためのインビトロ免疫複合体キナーゼ・アッセイを作製した。FLAGタグ野 生型DAP-キナーゼ、またはDAP-キナーゼ変異体をCOS細胞に一過性に発現させた 。 DAP-キナーゼタンパク質を抗FLAG抗体で免疫沈降させ、0.5mM Ca2+および１mM組 換え型カルモジュリン（CaM）の存在下でインビトロ・キナーゼ・アッセイを行 った。DAP-キナーゼの２つの変異型：デス・ドメインを含み、セリン／トレオニ ンに富むアミノ酸の枝を含む領域である最後のアミノ酸152個を欠損するC-末端 切断DAP-キナーゼ（ファインスタインら（Feinstein）、1995）（DAP-キナーゼ1 -1271-DDと名付ける；図31）、およびキナーゼサブドメインII（42位）において 保存されたリジンがアラニンに置換された変異体（DAP-キナーゼ-K42A）、をこ の実験に用いた。後者の変異は、他のキナーゼでは、燐酸転移反応を妨害して、 触媒的に不活性なタンパク質を生じることが示された（ハンクス＆クィン（Hank s and Quinn）、1991）。 図32に示すように、免疫複合体中に存在する組換え型DAP-キナーゼタンパク質 をインビトロで燐酸化すると、予想されるタンパク質の大きさのところで顕著な32 P-標識バンドが得られた。対照的に、変異体DAPキナーゼ-K42Aは、燐酸化され ず、このことは、変異が実際に酵素を不活化したこと、そしてDAP-キナーゼの標 識が自己燐酸化によるものであったことを示唆している。DAP-キナーゼのキナー ゼドメインとミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）（ダイスら（Deiss）、1995）が相 同であったことから、ミオシン軽鎖（MLC）がインビトロDAP-キナーゼ・アッセ イの外因性基質である可能性があるか否かを調べる試験を行った。図32に示すよ うに、その触媒的に不活性な変異体（DAP-キナーゼ-K42A）ではなくて、DAP-キ ナーゼは、インビトロ・キナーゼ・アッセイ条件下でMLCを燐酸化した。切断さ れたDD変異体、DAP-キナーゼ1〜1271は、MLCの燐酸化と共に自己燐酸化を行うこ とができた。このことは、まず、C-末端の領域、特にセリンおよびトレオニンに 富むアミノ酸の最も末端部の枝（ファインスタインら（Feinstein）、1995）が 、自己燐酸化を受けないか、または最も可能性が高いのは、その活性の唯一の標 的ではない、ということ；そして第二に、C-末端のアミノ酸152個は基質として のMLCの認識に関与していないことを示している。各免疫複合体中に存在する組 換え型DAP-キナーゼタンパク質の量は、32Pシグナルを可視化した後に抗FLAG抗 体とブロットを反応させることによって決定した（図32）。 VIII．DAP-キナーゼはカルモジュリン調節セリン／トレオニン・キナーゼであ る。 (A) 実験技法 １．カルモジュリンの重層 COS細胞へのトランスフェクション、細胞溶解物の調製、SDS-PAGE、およびニ トロセルロースへのタンパク質の移動については、これまでに記述されているよ うに実施した（ダイスら、1995）。トランスフェクトしていない、またはFLAG-D AP-キナーゼまたはDAP-キナーゼ変異体でトランスフェクトしたCOS細胞からのタ ンパク質抽出物（１レーンあたり300μg）を7.5％SDS-PAGE上で流し、ニトロセ ルロース・メンブレンにブロッティングした。１％脱脂粉乳を含むカルモジュリ ン結合緩衝液（50mMトリス塩酸、pH7.5、150mM NaCl、１mM CaCl2）中で、メン ブレンを30分プレインキュベートした。組換え型35S-標識カルモジュリン（バウ ムら（Baum）、1993）を加え、メンブレンを室温で16時間ゆるく震盪させ、カル モジュリン結合緩衝液中で３回洗浄して（各５分）、乾燥させ、X線フィルムに 露光した。FLAG-DAP-キナーゼの検出は、抗FLAG-抗体（１：500；IBI、コダック 社）およびECLウェスタン・ブロット検出システムを記述のように（ダイスら（D eiss）、1995）用いて実施した。 ２．インビトロ・キナーゼ・アッセイ COSトランスフェクト細胞の細胞溶解物をこれまでに記述のように調製した（ ダイスら（Deiss）、1995）。総抽出物150μgからの組換え型DAP-キナーゼ・タ ンパク質の免疫沈降は、プロテアーゼおよびフォスファターゼ阻害剤を加えたPL B 200μlにおいて抗FLAG M2-ゲル（IBI、コダック社）201によって40℃で２時間 実施した。PLBで３回洗浄した後、免疫沈降物を反応緩衝液（50mM Hepes、pH7.5 、８mM MgCl2、２mM MnCl2および0.1mg/ml BSA）で１回洗浄した。ビーズに結合 したタンパク質を、15 Ci[γ-32P]ATP（３pmol）、50mM ATP、５μgMLC（シグマ 社）を含み、必要であれば１mMウシカルモジュリン（シグマ社）0.5mM CaCl2、 またはCaCl2の非存在下で３mM EGTAを含む、反応緩衝液50l中で、25℃で15分間 インキュベートした。反応を停止させるために、タンパク質試料緩衝液を加えて 、沸騰させた後タンパク質を１％SDS-PAGE上で分析した。ゲルをニトロセルロー ス・メンブレンにブロッティングして、32P標識タンパク質をオー トラジオグラフィーによって可視化した。 (B) 結果 キナーゼ・ドメイン（アミノ酸280〜312個；図32）の下流に存在する領域は、 CaM依存型キナーゼ・ファミリーに属するいくつかのメンバーのCaM-調節ドメイ ンとの配列相同性に基づいて、CaMと結合すると予想された（ダイスら（Deiss） 、1995）。実施して以下に記述したいくつかの異なるアッセイによって、CaMのD AP-キナーゼタンパク質との結合およびCaMによるキナーゼ活性の調節はいずれも 確認された。 DAP-キナーゼのCaM結合能は、まず、重層結合アッセイにおいて標識したCaMを 用いて調べた。このアッセイにおいて、様々なFLAG-タグ組換え型DAP-キナーゼ 構築物をCOS細胞に発現させ、タンパク質抽出物をSDS-PAGE上で電気泳動し、ニ トロセルロース・メンブレンにブロッティングして、35S-Met標識組換え型CaMと 反応させた（バウムら（Baum）、1993）。カルモジュリン調節結合領域を欠損す るDAP-キナーゼの欠失型（すなわち、アミノ酸266〜312位；DAP-キナーゼ-CaMと 名付ける）および先に述べたDD変異体と共に、野生型のDAP-キナーゼを調べた。 同じブロットを抗FLAG抗体とも反応させて、組換え型タンパク質が各スロットに おいて予想される大きさで出現することを確認した。野生型DAP-キナーゼおよび 切断されたDDはいずれも、標識したCaMに結合することができたが、DAP-キナー ゼ-CaMは結合できなかった（図33A）。 DAP-キナーゼのCaM結合能は、酵母の二ハイブリッド選別系（フィールズ＆ス ターグランツ（Fields and Sterglanz）、TIG 10：286〜292，1994）を用いてさ らに確認した。このアッセイにおいて、キナーゼ・ドメインの末端を含む領域、 CaM調節領域、アンキリン・リピート・ドメイン、および第一のPループを含む領 域（詳細については図31参照）をHeLa発現cDNAライブラリ（クロンテック社）が らの釣り餌のような相互作用タンパク質として用いた。陽性クローン約90個を得 たが、それらの全てがヒトCaM全長cDNAと同一であった。取り出されたCaMクロー ンはまた、酵母システムにおいて、キナーゼ・ドメインの末端およびCAM調節ド メイン（アミノ酸251〜364位）のみを含むDAP-キナーゼの切断構築物と反応させ た。要するに、CaM重層アッセイおよび酵母の二ハイブリッド系におけるDAP-キ ナーゼ断片とカルモジュリンとの相互作用によって、DAP-キナーゼが、キナーゼ ・ドメインの下流に存在する保存されたドメインを通じてCaMに結合するという 予測が確認された。 インビトロ・キナーゼ・アッセイにおいて、キナーゼ活性のCa2+/CaM調節につ いてさらに調べた。Ca2+/CaMの非存在下では、DAP-キナーゼによる自己燐酸化お よびMLC燐酸化は、Ca2+/CaMの存在下での燐酸化より８〜10倍低かった（図33B） 。興味深いことに、CaM調節ドメイン欠失変異体（DAP-キナーゼ-CaM）は、Ca2+/ CaMの非存在下で高いレベルの酵素活性を示し、このことは、この領域にカルモ ジュリンとの相互作用によって軽減することができる負の調節機能が存在するこ とを示唆している（図33C）。これらの結果は、他のCaM依存的キナーゼにおける この領域の欠失によって生じた刺激効果と一致した（シューメーカーら（Shoema ker）、1990）。したがって、われわれは、インビトロ・キナーゼ・アッセイか ら、DAP-キナーゼのキナーゼ活性がCa2+/CaMによって調節されること、そしてCa M調節ドメインの除去によって構成的に活性である脱制御キナーゼが産生される 、という結論に達した。 このタイプの変異は、‘機能獲得’変異、すなわち、細胞死促進活性が増加し たDAP遺伝子産物を生じる変異の例である。そのような変異は例えば、発明の細 胞死促進局面において有用である。 IX．DAP-キナーゼの異所発現はHeLa細胞の死を誘導する (A) 実験手順 １．界面活性剤抽出アッセイ ９cmプレート上で増殖させたCOSトランスフェクト細胞またはHeLa細胞のサブ コンフルエント培養を、PBSで１回洗浄して、次に必要であればMES緩衝液（50mM MES-pH6.8、2.5mM EGTA、2.5mM MgCl2）で洗浄し、抽出前に、HeLa細胞を１mg/ mlノコダゾールで0.5時間、または5mMラトルンキュリンAで１時間前処置した。 細胞を、プロテアーゼ阻害剤を加えた0.5％トライントンX-100のMES緩衝液溶液0 .5mlで３分間抽出した。上清（可溶性分画、Sol）を回収し、４℃、16,000×gで ２分間遠心し、透明な上清を新しいチューブに移した。冷エタノール２容量を加 えて、チューブを-20℃で一晩インキュベートして、４℃、16,000 ×gで10分間遠心し、色素を含まない２×タンパク質試料緩衝液200l中に再懸濁 した。プレート上に残存する界面活性剤不溶性マトリクス（InSol）を２×タン パク質試料緩衝液200μlで抽出し、プレートからラバー・ポリスマンを用いては がしてチューブに回収した。試料を10％SDS-PAGEに載せて、Sol分画からのタン パク質抽出物100μgを各レーンに載せ、InSolの等量を載せた。タンパク質の分 析は抗FLAG抗体（コダック社）、DAP-キナーゼに対するモノクローナル抗体（１ ：1000希釈；シグマ社）、抗チューブリン抗体（１：2000希釈；シグマ社）、ま たはポリクローナル抗アクチン抗体（１：100希釈；シグマ社）を上記のように 用いて行った。 ２．細胞の免疫染色 トランスフェクトした細胞（SV-80、REF-52、またはCOS細胞）を、24ウェルプ レートのガラスカバーグラス（直径、13mnl）上に20,000個／ウェルで１ml培地 中に播種した。48時間後、細胞をPBSで２回洗浄して、同時に固定および可溶化 を行った。これはカバーグラスを３％パラホルムアルデヒドと0.3％トライトンX -100のPBS溶液の混合液中で５分間インキュベートし、３％パラホルムアルデヒ ドのみでさらに20分インキュベートすることによって実施した。細胞をPBSで３ 回洗浄して、次にブロッキング溶液（５％正常ヤギ血清および１％BSAのPBS溶液 ）中で60分間インキュベートした。細胞を第一抗体（抗FLAG、１：300）30mlと 共に室温で60分間インキュベートし、次にPBS中で３回洗浄して、ローダミン結 合ヤギ抗マウス抗体（希釈１：200；ジャクソン・イムノ・リサーチ・ラボラト リーズ）30mlと共に30分インキュベートした。DAPI（0.5μg/ml；シグマ社）お よびフルオレセイン結合ファロイジン（１：100；モレキュラー・プローブス・ インク）をこの段階で加えた。カバーグラスをPBSで３回洗浄して、排液を行っ て、モヴィオル（Mowisol）に載せた。顕微鏡観察を蛍光条件下で行った。コダ ックTMX400フィルムを用いて写真撮影を行った。 ３．X-Gal染色 LacZ発現を検出するために、細胞を３％パラホルムアルデヒドで５分間固定し て、PBSで２回すすぎ、77mM Na2HPO4、23mM NaH2PO4、1.3mM MgCl2、１mg/ml X- Gal、３mM K3Fe(CN)6、３mM K4Fe(CN)6を含むX-Gal緩衝液中で３時間 染色した。70％エタノールを加えて反応を停止させた。コダック・エクタクロー ム160Tを用いて位相差顕微鏡下で写真を撮影した。 (B) 結果 細胞死の陽性メディエータとしての機能がDAP-キナーゼのためであることを最 初に示したのは、アンチセンスRNAによってDAPキナーゼの発現が減少したことに よって、HeLa細胞は、IFN-γ受容体によって開始されるアポトーシス細胞死から 保護されるという知見に基づいていた。したがって、全長のセンスcDNAの異所発 現によって生成したDAP-キナーゼタンパク質のレベルが上昇すれば、いかなる外 部刺激がなくとも、自身の死を引き起こす可能性があるか否かを調べることは興 味深かった。 哺乳類細胞にDAP-キナーゼを発現させるために、CMVプロモーターの調節下で 、全長のcDNAをpcDNA3ベクター（インビトロゲン社）にクローニングした。触媒 的に不活性なDAP-キナーゼ-K42A変異体、およびCaM調節ドメイン欠失変異体（DA P-キナーゼCaM）を含む類似の構築物を調製した。DAP-キナーゼ構築物を空のベ クターと共に、リン酸カルシウム共沈殿技法によってHeLa細胞にトランスフェク トした。選別培地（G-418）で２〜３週間増殖させた後、薬剤耐性細胞をクリス タル・バイオレットで染色した。野生型DAP-キナーゼによるトランスフェクショ ンは、空のベクターによるトランスフェクションと比較して生存コロニーの数を 有意に減少させることが判明した（図34A）。この阻害効果は、構成的に活性なD AP-キナーゼCaM変異体によるトランスフェクションではより一層顕著で、このこ とはこの変異体が最も顕著な増殖抑制作用を有することを示唆している。対照的 に、触媒的に不活性なDAP-キナーゼ変異体はコロニー数を全く減少しなかった。 その代わりに、K42A変異体によるトランスフェクションによって生じたコロニー 数は、空のベクターでのトランスフェクションと比較してわずかに増加し、個々 のコロニーの大きさはしばしばより大きかった（図34A）。したがって、触媒的 に不活性のDAP-キナーゼ変異体によるトランスフェクションは、コロニー形成の プロセスにおいて細胞に対して何らかの長所を付与するように思われた。これら の結果は、６回の独立した実験においてプラスミドDNAの異なる調製物を用いて 繰り返された。それらはまた、他のタイプの発現ベクターについても繰り返され た（示していない）。これらのデータは、DAP-キナーゼの異所発現が持続的な細 胞増殖と両立しなかったこと、そしてこの特徴は固有のキナーゼ活性に依存する ことを初めて示した。それらはまた、DAP-キナーゼの触媒的に不活性な変異体が ドミナント・ネガティブ（dominant-negative）機能を有する可能性があるとい う最初のヒントとなった、この問題はIFN-γの抑制作用の項で後に検討する（下 記参照）。 細胞の運命をより正確に決定し、コロニー形成が抑制される基礎をよりよく理 解するため、DAP-キナーゼ遺伝子によるトランスフェクションの２日後に細胞を 調べた。これらの実験では、DAP-キナーゼを異所発現するトランスフェクト細胞 の認識を容易にするために、LacZマーカー遺伝子を用いた。ポリオウイルスの内 部リボソーム流入部位（IRES）を含み、このように１つのニシストロン性メッセ ージ内で、LacZおよび野生型DAP-キナーゼ遺伝子双方の発現を指向するベクター をこの目的のために構築した。ニシストロン性mRNAは、テトラサイクリン抑制可 能プロモーターから発現された（ゴッセン＆ブヤール（Gossen and Bujard）、P NAS 89：5547〜5551、1992）。青い細胞を含むLacZの形態は、両遺伝子を持続的 に発現させるためにテトラサイクリンの非存在下で維持した培養において、トラ ンスフェクションの48時間後に決定した。野生型DAP-キナーゼを発現したlacZ含 有細胞の34％が、アポトーシス細胞死の形態、すなわち細胞の収縮、および丸く なってプレートから剥離するという形態を示すことが判明した。対照的に、対照 ベクターで検出されるバックグラウンドでは、アポトーシス細胞は５％未満であ った（図34B）。要するに、形態学的評価およびコロニー形成アッセイから、DAP キナーゼの過剰発現によって細胞死が促進され、このように、細胞死の正のメデ ィエータとしてのDAP-キナーゼの役割を強化することが示唆される。 X．触媒的に不活性なDAP-キナーゼはIFN-γ誘導細胞死から細胞を保護する。 DAP-キナーゼ-K42A変異体がトランス・ドミナント・ネガティブ（trans-domin at negative）に機能するかも知れないという仮説を調べた。これは、触媒的に 不活性な変異体キナーゼが、アンチセンスRNA発現によって得られる保護作用と 同様に、IFN-γ誘導細胞死に対してHeLa細胞を保護するか否かをチェックするこ とによって行った。トランスフェクションの48時間後、細胞を分割して、G- 418 700μg/mlおよびIFN-γ200U/mlで二重に選別したところ、対照ベクターを発 現したトランスフェクタントは効率よく殺され、G-418耐性細胞のバックグラウ ンドは極めて低かった。対照的に、K42A変異体でトランスフェクションした場合 は、生存細胞数が有意に増加した（図35A）。平均すると、K42Aトランスフェク タントでは、IFN-γの存在下で生存したコロニーの相対数は、対応するpcDNA3ト ランスフェクタントより５倍高かった（図35B）。コロニーあたりの平均細胞数 はK42Aトランスフェクタントでは高かった。これらの結果は、K42A変異体がおそ らくドミナント・ネガティブ（dominant-negative）に作用し、このため内因性D AP-キナーゼの正常な機能を妨害することによって、IFN-γ誘導細胞死からHeLa 細胞を保護することができることを示している。 これは、内因性DAP遺伝子産物を結果的に中和することができる変異の例であ る。そのような変異は例えば、発明の細胞死予防局面において有用であろう。 XI．DAP-キナーゼの細胞骨格局在 DAP-キナーゼの作用機序を理解する上で重要な間題の一つは、その細胞内局在 部位に関する。免疫蛍光染色によってDAP-キナーゼの細胞内局在部位を明確にす るために、われわれは、前記のFLAG-DAP-キナーゼ-K42A構築物でSV-80ヒト繊維 芽細胞を一過性にトランスフェクトし、細胞を抗FLAG抗体で免疫染色した。過剰 発現時の細胞死関連形態学的変化を防止するためにK42A変異体を選択した（SV80 細胞を野生型のDAP-キナーゼでトランスフェクトすると、後で詳述するように、 HeLa細胞において認められた細胞死と同様の細胞死を誘導した）。 FLAG-DAP-キナーゼK42Aは、細胞辺縁に達する繊細な繊維網として染色された ；核は染色されなかった（図45A）。抗DAP-キナーゼモノクローナル抗体で染色 しても、同じパターンが示された（示していない）。これはDAP-キナーゼ・タン パク質が細胞骨格に局在することを示唆した最初の証拠であった。抗FLAG-抗体 およびアクチン繊維に結合することができるフルオレセイン結合ファロイジンに よるトランスフェクタントの二重染色により、かなりの重なり合いが明らかにな った（図45A）。対照的に、微小管染色では、染色の重なりを認めなかった（示 していない）。 DAP-キナーゼが細胞骨格に局在することは、細胞内および細胞外で発現された タンパク質双方の生化学分画によってその後確認された。われわれは、非イオン 性の界面活性剤（0.5％トライトンX-100）によって細胞を緩やかに抽出する、入 念に作られたプロトコルを使用して、これによって脂質および可溶性タンパク質 は除去され、核、細胞骨格の枠組み、そして細胞骨格関連タンパク質を含む界面 活性剤不溶性マトリクスは無傷のままとなる。トランスフェクトしていないHeLa 細胞では、内因性のDAP-キナーゼ（タンパク質のC-末端に対して作製されたモノ クローナル抗体によって認識される）は、界面活性剤不溶性分画のみに出現した （図45B）。対照的に、共に一定の可溶性プールを有するβ-チューブリンおよび アクチンは、界面活性剤可溶性および不溶性分画の双方に存在した。われわれは 、微小管破壊剤であるノコダゾールを用いてチューブリンの溶解性を変化させた 。図45Bに見ることができるように、HeLa細胞をノコダゾールで処置すると、全 てのβ-チューブリンタンパク質が可溶性分画に認められたのに対し、DAP-キナ ーゼとアクチンの溶解性は共に変化しなかった。一方、細胞をマイクロフィラメ ント破壊剤であるラトルンキュリンAで処置すると、実質的な部分のDAP-キナー ゼを可溶性分画に認めた。この場合、アクチンはほぼ可溶性分画のみに認めたが 、β-チューブリンの溶解度は変化しなかった。これらの結果を二重免疫染色と 併せて検討すると、DAP-キナーゼは、細胞骨格のマイクロフィラメントシステム に局在することが示唆される。 界面活性剤抽出アッセイをさらに用いて、細胞骨格と会合するDAP-キナーゼ内 の領域をマッピングした。この目的のため、われわれは、FLAG-DAP-キナーゼで トランスフェクトしたCOS細胞を用いたが、この細胞の抗FLAG抗体による染色パ ターンは、先に調べたSV-80およびHeLa細胞において認めたパターンと類似して いた（図46A）。pECE-FLAGまたはpcDNA3-FLAG発現ベクターにおいて構築された 一連のDAP-キナーゼ欠失変異体をCOS細胞にトランスフェクトさせた。これらの トランスフェクトしたCOS細胞に対して、上記のように界面活性剤抽出を行い、 イムノブロットを抗FLAG-抗体と反応させて、それぞれの場合について、各DAP- キナーゼ変異体産物の溶出プロフィールをモニターした。結果を図46Bに要約す る。詐細な分析から、アミノ酸641〜835個を含む領域がDAP-キナーゼの界面活性 剤不溶性に関与し、したがって、細胞骨格との会合に関与する重要な領域である と結論された。その欠失により細胞骨格会合が妨害され、逆に言えば、この領域 そのものが界面活性剤不溶性であった。興味深いことに、細胞骨格結合ドメイン がないアンキリン・リピートを含む断片は、完全に界面活性剤可溶性であった。 DAP-キナーゼが細胞内に局在することは、HeLa細胞のIFN-γ誘導死の際に起こ る細胞骨格の変化に関連する可能性がある。ファロイジンによってアクチンを染 色すると、サイトカンによる処置後、マイクロフィラメント構造の完全な破壊が 起こり、ストレスファイバーが消失することが示された（図47A）。ストレスフ ァイバーの喪失は、染色質濃縮および断片化を含む典型的な核の変化が起こる前 に起こった（ダイス（Deiss）ら、1995）。DAP-キナーゼの過剰発現が、細胞骨 格ネットワークに及ぼす考えられる作用を追跡するために、よく構築されたアク チン細胞骨格を有するREF-52繊維芽細胞を用いた。 構成的に活性なFLAG-DAP-キナーゼ-CaM変異体を、これらの細胞に一過性にト ランスフェクトした。48時間後、抗FLAG抗体で染色して陽性であった細胞に、隣 接するトランスフェクトしていない細胞と比較して核および細胞骨格の変化があ るか否かを調べた。これは、DAPI（核のため）そしてファロイジン（マイクロフ ィラメントシステムのため）で三重染色することによって得られた（図47B）。F LAG陽性細胞は、IFN-処置細胞に起こる細胞骨格の変化を思わせる、破壊された マイクロフィラメント染色パターンを示すことが判明した。染色質濃縮または断 片の徴候は、この時点ではDAP-キナーゼ・トランスフェクト細胞に検出できなか った（図47B）。対照的に、切断された触媒的に活性なDAP-キナーゼが細胞内で 誤った部位に存在するトランスフェクション（図46BにおけるDAP-キナーゼ-DEco RV；アミノ酸１〜305個）では、細胞骨格染色よりむしろ核染色を示し、いかな る細胞骨格変化も生じなかった。これらのトランスフェクションでは、FLAG陽性 細胞は、トランスフェクトしていない隣接する細胞と区別することができない正 常なマイクロフィラメント染色パターンを示した（図47B）。これらの結果をSV8 0細胞において繰り返したところ、FLAG-DAP-キナーゼ-DCaM変異体を発現するト ランスフェクタントの80％以上が異常なマイクロフィラメント染色パターンを示 したが、DAP-キナーゼ-DEcoRVトランスフェクションでは変化を生じなかった（ 示していない）。これらの結果は、正しい位置に存在する活性なDAP-キナー ゼと、IFN-γに反応して生じる細胞死に関連した骨格および形態学的変化との間 に関連があることを示唆している。 このように、DAP-キナーゼそしておそらくその他のDAPタンパク質も細胞骨格 に存在することは、本発明の細胞死促進および細胞死予防局面に関して、例えば 、細胞骨格におけるタンパク質の局在を防止することができる薬剤の場合には、 重要となりうる。 XII．様々な細胞および組織におけるDAP-1およびDAP-2タンパク質の発現 様々な細胞株および組織を調べると、これらの二つの遺伝子は、至る所に発現 される可能性があることが明らかになった。図10は、DAP-AcDNAをプローブとし て調べた異なる造血細胞からのRNAのノザンブロット分析を示す。この遺伝子の2 .4Kb mRNA転写物は、顆粒球（HL-60）、Bリンパ球（Daudi）およびマクロファー ジ（U937）細胞において検出された。造血細胞での発現レベルはHeLa細胞より低 かった。図11は、ヒト胎児組織：脳、脾臓（特にB細胞）、および肝臓（特に赤 血球）におけるmRNA発現を調べた結果を示す。この場合も、DAP-1 cDNAプローブ によって、単一の2.4KbのmRNA転写物をこれらの組織において検出した。 DAP-2 cDNAプローブ２は、これらの異なる組織においてこの遺伝子によってコ ードされる6.3Kb mRNAを認識した（図11）。ダウン症候群の胎児の肝および脾組 織は、このブロットにおいて、DAP-2遺伝子のより高レベルを発現するように思 われた（GAPDHレベルと比較して）が、ダウン症候群の脳組織では、対応する健 常脳より高いレベルのDAP-1 mRNAが含まれた。 XIII．DAP-キナーゼ発現を調べる細胞株のスクリーニング (A) 実験手順 １．細胞株の維持および5-アザデオキシシチジンによる処置−造血細胞（様々 な株の記述に関してはATCCを参照のこと）は全て、10％補体不活化FCS（ギブコ ・BRL社）、100IU/mlペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびに２mM L-グ ルタミンを加えたRPMI 1640培地中で、37℃、５％CO2下で増殖させた。膀胱癌由 来細胞株（様々な株の記述に関してはATCCを参照のこと）についてはDMEMを用い た。膀胱癌細胞株をlE5個／100mm皿で播種して、24時間後に5-アザ-2'-デオキシ シチジン（シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ州）を最終濃度１ μMとなるように処置した。薬剤を加えて24時間後に培地を交換し、その後３日 毎に交換した。処置後９日および16日目にそれぞれ、最初の継代と最後の継代時 に、タンパク質を抽出した。 ２．ノザンブロット分析−トリリージェント（MRC社）を用いて総RNAを様々な 細胞株から抽出した。オリゴ-dTダイナビーズ（ダイナル社）によって製造元の 説明に従って調製したポリA+RNA３μgの試料を、１％アガロース・ゲル上で分離 して、記述通りに（サムブルック（Sambrook）、1989）、ハイボンド-Nナイロン メンブレン（アマシャム社）とハイブリダイズさせた。DNAプローブは、市販の ランダム・プライミング・キット（ベーリンガー・マンハイム社）によって[-32 P]dCTPを用いて調製した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーショ ン、およびフィルターの洗浄は記述通りに実施した（サムブルック（Sambrook） 、1989）。 ３．イムノブロット分析−既に記述されているように、細胞を回収してタンパ ク質抽出物を調製した（ダイスら（Deiss）、1995）。タンパク質抽出物（200pg /レーン）を7.5％SDS-PAGE上で分画した。セミドライ・セミフォア（semi-phor ）ブロッター（ホーファ・サイエンティフィック・インストルメンツ社）によっ て、タンパク質をニトロセルロースフィルター（シュライヒャー＆シュエル（Sc hleicher and Schuell））に移した。マウス抗ヒトDAP-キナーゼモノクローナル 抗体はバイオメーカー社（レオボット、イスラエル）から購入した。抗ヒトビン キュリン抗体はシグマ社から購入した。抗ヒトDAP3はこれまでに記述されている ように調製した（キシルら（Kissil）、1995）。免疫学的な検出はECL検出シス テムを用いて実施した（アマシャム社）。 (B) 結果 DAP-キナーゼmRNA転写物の発現を様々な細胞株において分析すると、ヒトB細 胞新生物に由来する細胞株ではかなりの細胞株にこれが発現されていないことが 判明した。B細胞成熟の段階が異なる９個の細胞株を調べた。それらのうち７個 −SKW、697、Daudi、RS4:11、MV4:11、SK-DHL、およびB380は、検出可能なレベ ルのDAPk mRNAを発現することができなかった。２つの細胞株、すなわち未成熟 段階のB細胞を表すALL-1（エリクソンら（Erikson）、PNAS83：1807〜11、 1986）そして初期前駆細胞を表すB-1（エリクソンら（Erikson）、1986；コーエ ンら（Cohen）、1991）は、DAP-キナーゼを発現した（図36および表３）。正常 な末梢B細胞から確立されたEBV不死化B細胞株、GM1500およびGM607では、DAP-キ ナーゼmRNAが存在した（図*[1]37A）。DAP-キナーゼ陰性細胞株におけるシグナ ルは、より大量のポリA+ RNA（15μg）を分析した場合においても、検出限界以 下のままであった（示していない）。 表１．タンパク質レベルでのDAP-キナーゼの発現を調べた細胞タイプの要約。 データは、細胞株の起源およびDAP-キナーゼの発現パターンに従って分類した。 （a）ウェスタン・ブロット上でのシグナル強度をDAP-キナーゼ陽性膀胱癌細 胞株のシグナルレベルと比較することによって決定。 興味深いことに、c-Abl mRNA転写物は調べた全ての細胞株において発現された 。 c-Abl遺伝子はDAP-キナーゼに対して最も近い既知のマーカーである（ファイン スタインら（Feinstein）、1995）。c-Ablの発現は正常であるように思われ、予 想される２つのmRNA転写物は、それらがDAP-キナーゼmRNAを発現したか否かにか かわらず、全ての細胞株に認められた（図36B）。c-Abl発現パターンが乱されて いないことから、DAPk発現の欠如は9q34の大きい再配列または欠失の結果である という可能性はほとんどなくなった。 タンパク質分析によってRNAデータを確認した。様々な細胞株から調製された タンパク質抽出物にDAP-キナーゼ・タンパク質が存在するが否かをイムノブロッ ト分析によって調べた。DAP-キナーゼmRNA転写物を発現した全ての細胞株におい て、予想される大きさ160kDaのタンパク質産物も検出されたことが判明した。対 照的に、DAP-キナーゼ転写物が検出されなかった細胞株では、DAP-キナーゼ・タ ンパク質を痕跡量も認めなかった（図36C）。同じイムノブロットを、内部対照 として抗ビンキュリン抗体と反応させた（図36D）。併せて、RNAとタンパク質の データから、DAP-キナーゼ発現が存在しないことは真の現象である可能性が最も 高く、アッセイのアーチファクトではないことが示されている。 次に、DAP-キナーゼ・タンパク質の発現を様々な膀胱癌起源の細胞株において 調べた。これは、異なる14個の細胞株から調製したタンパク質抽出物のウェスタ ン・ブロット分析によって行った。調べた14株のうち８株がDAP-キナーゼを発現 し、４株は検出可能なDAP-キナーゼタンパク質発現を示さず、別の２つの株はDA P-キナーゼ陽性株と比較して１％未満のレベルであるがこれを発現した（表３） 。これらの結果は、膀胱癌細胞株では、DAP-キナーゼ発現の喪失または非常に低 いレベルが、統計学的に有意な発生率で起こることを示した。DAP-キナーゼ発現 が存在しないことがDNAの過メチル化によるものであるか否がを調べるために、D AP-キナーゼ陰性膀胱癌細胞株２種類（T24およびHT1376）を選択して、5-アザデ オキシシチジンで処置した。細胞を5-アザデオキシシチジンで処置すると、CpG ジヌクレオチドからメチル基の除去を引き起こし、このように過メチル化による プロモーターの遮断／沈黙を逆転させ、関連する遺伝子発現を回復する可能性が ある（ジョーンズ（Jones）、1985）。細胞を薬剤で24時間処置し、その後初期 の継代および後期の継代時にタンパク質抽出物を調製した。イムノブロットを抗 DAP-キナーゼ抗体と反応させることによって、DAP-キナーゼの発現を分析した。 処置前では、DAP-キナーゼは検出不能であったが（図37、レーン１および４）、 5-アザデオキシシチジンを増殖培地に加えると、薬剤処置後早期にDAP-キナーゼ 発現が回復して、予想されるタンパク質の大きさで強いシグナルが検出されるこ とが判明した（図37、レーン２および５）。回復したDAP-キナーゼの発現レベル は、調べたDAP-キナーゼ陽性膀胱癌細胞株数株ではDAP-キナーゼの平均発現レベ ルと同程度である（データは示していない）。DAP-キナーゼとは異なり、この細 胞株に最初から存在する他の２つのタンパク質、すなわちビンキュリンとDAP-3 の発現は、5-アザデオキシシチジン処置によって全く影響を受けなかった ため、この作用は特異的であった（図37、レーン１〜５）。T24細胞の薬剤処置 後（６回継代後）の後期では、DAP-キナーゼの発現は再度、完全に消失したが、 これはおそらく、遺伝子のデノボ・メチル化によるものであつた（図37、レーン ３）。 XIV．DAP-3、DAP-4およびDAP-5のクローニングおよびシークエンシング クローン（DAP-3）をシークエンシングして、これを用いて、DAP-1およびDAP- 2について先に記述したように、K562 gt10 cDNAライブラリをスクリーニングし た。DAP-3の全長のcDNA配列および導出アミノ酸配列を図12に示す。 クローン253（DAP-4）を、DAP-1およびDAP-2について先に記述したように、部 分的にシークエンシングし、その結果を図13に示す。 クローン260は表１に記述した救済されたベクターの中に存在し、IFN-γ誘導 プログラムされた細胞死からHeLa細胞を保護した。これは、発明の詳細な説明に おいて記述したように単離した（第I(A)章）。これは763bpのcDNA断片を有し、 配列分析から、これが新規遺伝子に相当することが示された（DAP-5と名付けた ）。ノザンブロット分析から、DAP-5が3.8KbのmRNAに転写されることが示された 。DAP-5 mRNAは多様な正常組織に広く発現されることが判明した。 K562細胞に端を発するcDNAをスクリーニングするために、763 cDNA断片を用い た。最も長いcDNAインサート（3.8Kb）を有するファージ・クローンをシークエ ンシングした。このcDNAクローンは、図15に示すように、アミノ酸940個に相当 するオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。導出アミノ酸配列は、この タンパク質が、翻訳開始因子４（eIF4、p220）と同一ではないが非常に相同であ ることを予測する。このように、DAP-5は、eIF4型の翻訳開始因子ファミリーで あると思われる新規メンバーとして見なされる可能性がある。最も興味深いこと 、そして非常に予想外のことは、最初のクローン#260に存在した763bp断片は、 ベクターにセンス方向に挿入された。この領域（図15において実線で示す；ヌク レオチド1764〜2528位）には、長さがアミノ酸230個のミニタンパク質の合成を 促進することができるATGコドンが存在する。実際、この断片のインビトロ転写 および翻訳によって、予想される大きさのタンパク質を生じ、このATGの変異は ミニタンパク質の合成を消失させた。テトラサイクリン調節プロモーターからの 763 cDNA断片を発現するベクターでHeLa細胞をトランスフェクトすると、細胞は 、サイトカイン誘導細胞死から保護された。一つの可能性は、ミニタンパク質が 、全長のタンパク質の細胞死誘導特性と競合するドミナント・ネガティブ変異体 として機能するという点である。別の可能性も存在する。 XV．DAP-5 cDNA断片（#260）の発現はHeLa細胞に対して二重の効果を発揮する 。 (A) 実験技法 １．トランスフェクションおよび選別技法 pTKO1ベクターからのDAP-5763bp cDNA断片を発現する２つの二次ポリクローナ ルHeLa細胞集団を作製した。これは、HeLa細胞1.5×106個のサブコンフルエント 単層を、対応するプラスミド40gでトランスフェクトすることによって行った（p TKO1-260と名付けた）。これと平行して、対照ベクター、pTKO1-DHFRでHeLa細胞 をトランスフェクトした（ダイス＆キムチ(Deiss and Kimchi）。独立した安定 なクローン104個のプールを各トランスフェクションから作製した。安定なトラ ンスフェクタントを200μg/mlのヒグロマイシンB（カルビオケム社）の存在下で 維持した。HeLa-tTA細胞1.5×106個のサブコンフルエント単層を、pSBc-blプラ スミドまたは#260断片（pSBc-bl-260）もしくはその変異誘導体（単置換＆三置 換ATG変異体）のいずれかを有するpSBc-blプラスミド15μgでトランスフェクト し、10または50μg/mlブレオマイシンの存在下で選別した。独立した安定なクロ ーン102〜103個のプールを各トランスフェクションから作製した。 ２．網状赤血球溶解物におけるDAP-5タンパク質のインビトロ翻訳 Bluescriptベクター（ストラタジーン社）にクローニングした全長のcDNAイン サートまたは#260変種を、T7-プロモーターからのインビトロ転写の鋳型として 用いた。次にこれらのRNAを、[35S]-メチオニン（アマシャム社）を標識前駆体 として用いた従来の技法を用いて、網状赤血球溶解物（プロメガ社）において翻 訳した。反応産物を12.5％SDSポリアクリルアミドゲル上で分画して分離し、そ の後キシルら（Kissil，J．K.、J．Biol．Chem．270：27932〜936（1995））が 記述したように、放射活性シグナルのサリチル酸増幅を行った。1785〜1787位、 2010〜2012位、または2040〜2042位で、オリゴヌクレオチド指向変異誘発（ATG はAAGまたはTTCもしくはATCにそれぞれ変換する）によって、ATGコドンを変異さ せた。 ３．抗体の調製とイムノブロット分析 #260断片に含まれるコード領域のアミノ酸522〜776位に相当するDAP-5配列を 、インフレームでpGEX1（GST260）と融合させた。グルタチオンS-トランスフェ ラーゼ（GST）融合キメラの発現は、大腸菌株XLI-BlueにおいてIPTGによって誘 導した。グルタチオン・ビーズ上で精製したGST融合産物を用いて、二羽のウサ ギを免役した。GSTとカップリングさせたCNBr-活性化セファロース・ビーズ（フ ァルマシア・バイオテック・インク）に抗血清を通過させて、抗血清から抗GST 抗体を除去した。次に、GST260とカップリングさせたCNBr-活性化セファロース ・ビーズ上でアフィニティ精製を行った。いくつかの実験において、HeLa細胞ト ランスフェクタントにおけるミニタンパク質のシグナルは検出限界以下であった 。 ４．ウェスタン分析 HeLa-tTA細胞を回収して試料緩衝液中で沸騰させることによって溶解した。タ ンパク質試料を10％SDS-PAGEによって分画し、これをニトロセルロース・フィル ターに移した（シュライヒャー＆シュエル（Schleicher and Schuell））。ブロ ットをアフィニティ精製ポリクローナル抗体（20倍希釈）と反応させ、ECL検出 システム（アマシャム社）を用いて免疫学的検出を行った。 (B) 結果 DAP-5cDNA断片#260を含むpTKO1構築物をHeLa細胞にトランスフェクトして、２ つの安定なポリクローナル細胞集団（260t1および260-t2と名付ける）を得た。 対照ポリクローナルHeLa細胞集団（DHFR-t1と名付ける）は、DHFR遺伝子を有す るpTKO1ベクターのトランスフェクションによって得た。これら３つのトランス フェクトした細胞培養に対して、IFN-γによる長期間の処置を行った。図38Bに 示すように、260-t1および260-t2細胞培養では、DHFR-t1細胞集団と比較して、 増殖しつつあるコロニー数の100〜200倍増加を認めた。このことは、このcDNA断 片によってIFN-γの阻害作用がら救済された総コロニー数は、初回細胞集団の0. 1〜１％に相当するに過ぎないことを意味している。細胞のごく小さい分画のみ がプログラムされた細胞死から保護されたこのパターンは、その全てがサブグル ープIIに分類される、抗チオレドキシンRNA（図４、ダイス＆キムチ（Deiss and Kimchi）、1991）および断片#253（示していない）によって得られた効果と 非常に類似していた。 260-t1および260-t2トランスフェクタントにおける細胞外DAP-5RNAの大きさは 、1.7Kb（cDNAインサートの763塩基、発現カセットに由来する配列（ダイス＆キ ムチ（Deiss and Kimchi）、1991）800塩基、およびポリ(A)テールの配列を含む ）であった。細胞外RNAの発現レベルは、内因性の3.8kb転写物のレベルよりはる かに低かった（図38A）。これは、そのRNA産物がHeLa細胞において内因性mRNA転 写物に対してかなり過剰量蓄積される、サブグループIのプラスミド８個とは明 確な対比をなす（すなわち、DAP-1、DAP-キナーゼ、DAP-3およびカテプシンDに 相当するアンチセンス）。２つのサブグループのより詳しい比較は、異なるHeLa トランスフェクタントからのRNAを含むノザンブロットをpTKO1ベクターによって 促進される一般的なDNAプローブとのハイブリダイゼーションによって実施した 。図38Cに示すように、pTKO1-230ベクター（DAP-1のアンチセンス断片を含む） から発現されたRNAが強いシグナルを生じる条件下でも、断片#260から転写したR NAはなお検出限界以下であった。同じベクターによって運ばれる他の２つのサブ グループIIのcDNA断片、すなわちチオレドキシン（ダイス＆キムチ（Deiss and Kimchi）、1991）およびDAP-4（#253）から発現されたRNAも同様の低レベルであ った（図38C）。このように、確立されたポリクローナル集団において異所発現 されたRNAのレベルが低いことは、サブグループIIのcDNA断片に関する第二の特 徴的な特徴となった。これは、RNAが不安定であること、またはエピソームのコ ピー数が少ないトランスフェクタントが選別されたことのいずれがを反映した。 全てのトランスフェクタントに共通である転写物は−ヒグロマイシンB耐性遺伝 子から発現されたmRNAは、チミジン・キナーゼ・プロモーターの制御下でpTKO1 内に存在した一挿入されたcDNA断片の発現レベルと平行であったため、後者は本 当であるように思われた（図38Ｄ）。このように、ポリクローナル細胞集団の確 立時にヒグロマイシンBのみの存在下で、pTKO1-260エピソームのコビー数が少な い細胞は、増殖に対して有意な利益を獲得するという仮定がなされた。 この可能性をさらに追求するために、実際に高い発現レベルのDAP-5部分的 cDNAが持続的な細胞増殖と不適合であるか否かを調べた。この目的のため、#260 cDNA断片と、ブレオマイシンに対する耐性を付与し、b-ガラクトシダーゼ（ケイ ラ社）を産生する融合タンパク質の合成を指向するSH-LacZの双方を含む二シス トロン性のメッセージの発現を指向する多シストロン性のベクター（pSBc-bl-26 0）を構築した。LacZをマーカーとして用いて個々の細胞における二シストロン 性のmRNAレベルを評価した。SH-LacZ融合遺伝子はポリオウイルス・リボソーム 進入部位（IRES）の下流に存在したのに対し、#260 cDNA断片はキャップ依存的 に翻訳された。IRES-指向翻訳はキャップ依存型翻訳より効率が悪いため、ブレ オマイシン選別下での細胞の生存を可能にするためには、二シストロン性メッセ ージの高レベルが発現されなければならない。このため、システムは細胞におい て高レベルの#260由来発現産物を産生することを余儀なくされる。 HeLa-tTa細胞をpSBc-bl-260ベクターでトランスフェクションしても、50μg/m lブレオマイシンの存在下で安定なクローンを生じないが、インサート（pSBc-bl ）を欠損する対照ベクターでトランスフェクトすると、容易にクローンを生成す ることが判明した。より低い薬剤濃度（10μg/mlブレオマイシン）では、pSBc-b l-260ベクターによるトランスフェクション後に小さいクローンを生じたが；そ れらはその後徐々に死亡した。これは、#260 cDNA断片からの発現が高レベルで あれば細胞にとって致死的となること、そして#260依存的細胞死は、遅い細胞死 パターンを示すことを示した。ニシストロン性のmRNAの発現レベルそしてこのよ うに細胞にとって許容される#260の発現レベルは、ブレオマイシン耐性の付与に は十分でなく、従って、これらのトランスフェクタントをさらに分析するために は薬剤を除去しなければならない。 β-ガラクトシダーゼ活性は、生存細胞の単細胞になっていることに基づいて 発現を定量するために用いた。pSBc-bl-260トランスフェクト培養では、青い染 色の程度はプレート上の全ての細胞において非常に弱かった。対照的に、対照ベ クターによるトランスフェクションから得られ、同一の条件下で選別されたポリ クローナル細胞集団は、強いβ-ガラクトシダーゼ染色パターンを示し、これはp SBc-bl-260トランスフェクタントにおける染色を何倍も超えていた（図39A）。 全体として、生存細胞におけるクローニング効率の減少とβ-ガラクトシダーゼ 活性が弱いことから、#260 cDNA断片の高い発現に対する負の選別が存在するこ とが証明された。われわれは、救済されたDAP-5 cDNA断片からの発現が、二重の 作用、すなわち低レベルではIFN-γ耐性（その機能的クローニングに至る特性） を付与する；高レベルでは毒性を示し、持続的な細胞増殖にとって許容されない 、作用を有するという結論に達した。 XVI．断片#260は機能的ミニタンパク質の発現を指向する 断片#260のORFには、可能性がある翻訳イニシエータとして作用する３つのAUG コドンが認められた。１つは断片の開始部位に存在し、おそらく28kDaタンパク 質の合成を開始させることができる；他の２つはアミノ酸85および77個下流に存 在し、それぞれ20および18.8kDaタンパク質を生成することができた。763bpDAP- 5 cDNA断片から転写したRNAのインビトロ翻訳では、大きさ約28kDaのタンパク質 のダブレットを生成した（図40A、レーン３）。最初のATGコドンにミスセンス変 異が起こると、下流の２つに影響を及ぼすことなく、これら２つの近接して移動 するタンパク質合成は完全に消失した。最初のコドンに影響を及ぼすことなく次 の２つのATGコドンにミスセンス変異が起こっても、ダブレットの翻訳は妨害さ れなかった；考えられる開始コドンに３つの変異が起こると、最初のATGコドン における単変異と同様に、タンパク質の翻訳は完全に消失した（図40Aそれぞれ レーン４〜６）。このように、救済されたcDNA断片が、529位のメチオニンから 始まるミニタンパク質の発現を起動させるという結論に達した。このミニタンパ ク質も、#260断片を有するpSBc-blベクターでトランスフェクトした前記のHeLa 細胞集団において検出された。図40Bに示すように、組換え型ミニタンパク質に 対して作製したアフィニティ精製ポリクローナル抗体は、pSBc-bl-260でトラン スフェクトした細胞では、大きさ約28kDaの近接して移動するタンパク質２個を 確認したが、空のベクターでトランスフェクトした細胞ではこれを認めなかった 。 このため、断片#260によってトランスフェクトした細胞に与えられた生物学的 作用が、ミニタンパク質発現に起因するか否か、という疑問が生じた。その目的 のため、われわれは、インビトロで翻訳できなかった２つの変異体cDNA断片のそ れぞれをpSBc-blベクターにサブクローニングした。DAP-5断片を発現するタンパ ク質のトランスフェクションの場合とは対照的に、変異体によって得られたポリ クローナル細胞集団はブレオマイシンの存在下で確立され、対照ベクターと同程 度の効率を示した。さらに、これらのトランスフェクタントにおけるβ-ガラク トシダーゼ活性は、対照ベクターでトランスフェクトした細胞と同程度に高かっ た（図39B）。このように、変異体DAP-5 cDNA断片の高レベル発現は、持続的な 細胞増殖と適合することがわかった。したがって、翻訳されたミニタンパク質は 、救済されたDAP-5断片が細胞に及ぼす細胞作用の原因である。 XVII．DAP分子としてのカテプシンDの特徴付け 救済された個々のpTKO1クローン（表１に記述）でトランスフェクトした異な るHeLa細胞について実施した最初の顕微鏡観察から、プラスミドpKTO1-229（グ ループ６）は、グループ１のプラスミドによって得られた作用と類似の作用を伝 えたことが示された。これはIFN-γ誘導細胞死に対する細胞の感受性を低下させ るが、その細胞抑制作用に対しては作用を及ぼさなかった。 プラスミドpTKO1-229によって運ばれるcDNAは、発現ベクターにおいてアンチ センス方向に存在するヒト・カテプシンD cDNAのBamHI-HindIII断片としてのシ ークエンシングに基づいて同定された。断片#229に対応するDNAプローブは、対 照およびトランスフェクトしたHeLa細胞の双方において、予想されるように、単 一の内因性2.5Kb mRNAとハイブリダイズした。カテプシンDのセンスmRNAの定常 状態レベルは、IFN-γ処置によって３〜４倍増加した。pTKO1-229トランスフェ クト細胞では、DNAプローブはまた、複合アンチセンスRNAとハイブリダイズした 。アンチセンス・カテプシンD RNAのレベルは、pTKO1発現ベクターにISREエンハ ンサー・エレメントが存在するために、IFN-γに反応して５倍刺激された（示し ていない）。 カテプシンDは、タンパク質の異化において機能する、ライソゾームに通常存 在するアスパラギン酸プロテアーゼである。しかし、何らかの病理状態では、こ のプロテアーゼはサイトゾルにおいて機能することができること、そしてその活 性は、脳の変性変化、筋萎縮そして結合組織疾患の病理に関連することが示唆さ れている（マツス＆グリーン（Matus and Green）、（1987）：Biochemistry 26 、8083〜8036）。本発明は、このプロテアーゼの発現が、IFN-γおよび他のサイ ト カインによって誘導される、プログラムされた細胞死の実行にとって不可欠であ ることを初めて示す（下記参照）。このように、プログラムされた細胞死の異な るシナリオにおいて重要な役割を果たすプロテアーゼは増えつつあるが、カテプ シンDはそのリストに含まれる。 カテプシンDのDNA配列およびアミノ酸配列は図14に示す（ファウストら（Faus t，P．L.）（1985）、PNAS USA 82、4910〜4914）。 XVIII．アンチセンス・カテプシンD RNAおよびペプスタチンAはIFN-γ誘導細 胞死からHeLa細胞を保護する (A) 実験技法 １．ニュートラル・レッド色素取り込みアッセイ HeLa細胞を96ウェルマイクロタイター・プレートにおいて、初回細胞数15,000 または20,000個／ウェルとして培養し、IFN-γもしくは抗-APO-1抗体のいずれか をそれぞれ処置、または無処置とした。必要であれば、ペプスタチンA（pepA） （シグマ社）またはDMSOを培養培地に加えた。培養培地および薬剤は３〜４日毎 に交換した。生存細胞は、既に記述されているように（ワラック（Wallach D.） 、J．Inlmunol．132：2464〜2469、1984）、ニュートラル・レッド（シグマ社） で染色した。自動マイクロ・エライザ・オートリーダーを用いて、色素の取り込 みをλ＝５４０ｎｍで１試料あたり４本ずつ測定した。 ２．RNA分析 トリ・リージェントTM（モレキュラー・リサーチ・センター・インク）を用い て総細胞RNAを抽出した。総RNA試料20μgを、これまでに詳しく記述されている ように、ノザンブロット上で処理した（ヤーデン＆キムチ（Yarden and Kimchi ）、Science 234：1419〜21、1986）。プローブとして用いるDNA断片を、ジェネ クリーン・キット（バイオ101インク）によってアガロース・ゲルから精製した 。ランダム・プライミング・キット（ベーリンガー社）を用いて、断片を[-32P] -dCTP（アマシャム社、＞3000Ci/mmol）で標識した。 ３．タンパク質分析 細胞を、プロテアーゼおよびフォスファターゼ阻害剤の混合物（１mM PMSP、 ４μg/mlアプロテニン（aprotenin）、100μg/mlロイペプチン、1.5μg/mlペブ スタチンA）２μg/mlアンチペイン、２μg/mlキモスタチン、0.1mM NaVO3および 0.1mM NaF）を含むRIPA（10mMトリス塩酸、pH7.2、150mM NaCl、１％トライトン X-100、0.1％SDS、１％デオキシコール酸塩および5mMEDTA）中で抽出した。タン パク質濃度は、タンパク質アッセイ試薬（バイオラッド社）を用いて測定した。 細胞溶解物のアリコット300gをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（12％）に よって分画した。次に、タンパク質をニトロセルロース・メンブレンに電気的に ブロットし、ブロッキング溶液（10％スキムミルクおよび0.05％ツイーン-20（ シグマ社）のPBS溶液）中で室温で２時間インキュベートし、次に抗体を含む溶 液と４℃で18時間反応させた。 洗浄したメンブレンを、ペルオキシダーゼ結合第二抗体、すなわちヤギ抗マウ スIgG（IgG(H+L)鎖、ジャクソン・イムノ・リサーチ・ラボラトリーズ）の10,00 0倍希釈液、またはホースラディッシュ・ぺルオキシダーゼ（アマシャム社）と 結合させたプロテインＡの10,000倍希釈液のいずれかとインキュベートした。結 合抗体の検出は、ECL検出試薬（アマシャム社）を用いて行った。抗カテプシンD モノクローナル抗体（EURO/DPC-U.K.）は、５倍希釈で使用した；これらの抗体 は30Kd重鎖のエピトープを認識する。銅亜鉛スーパーオキサイド・ディスムター ゼ（SOD）に対して作製したポリクローナル抗体を250倍希釈で使用した。これら の抗体は、グロナー氏（Y．Groner）ワイツマン、インスチチュート、レオボッ ト、イスラエル）から寄贈された。 ４．一過性のトランスフェクション カテプシンD cDNAインサート（2176bp；全長のコード配列および隣接する非コ ード領域（ファウストら（Faust）、1985）を含むSalI-EcoRI断片をテトラサイ クリン制御発現ベクター（pSBC-TtA）にサブクローニングした（ダークスら（Di rks）、Gene 128：247〜249、1993）。ベクター（40μg）を、テトラサイクリン ・トランス活性化遺伝子を発現するHeLa細胞クローン（HtTA-1）に、標準的なリ ン酸カルシウム技法を用いて（細胞２×105個をトランスフェクションの18〜20 時間前に９cmプレートに播種した）一過性にトランスフェクトした。空のテトラ サイクリン・プロモーター含有ベクターをアッセイの対照として使用した。トラ ンスフェクトされた細胞のみを追跡するために、これらの構築物をCMV-β- ガラクトシダーゼ遺伝子（クロンテック社）、またはSV40プロモーターから発現 されたSEAP遺伝子（pSBC-2ベクター）のいずれかと、共トランスフェクトした（ ダークスら（Dirks）、1993）。モル比はテトラサイクリン・ベクターに都合よ く６：１であった。各トランスフェクションを２つのプレートに分割し、その一 つにはテトラサイクリン（1.5mg/ml）を直ちに加えた。酵素活性は全て、トラン スフェクションの48時間後に評価した。 ５．β-ガラクトシダーゼ染色とSEAP活性の測定 LacZ発現を検出するため、細胞を３％パラホルムアルデヒドで５分間固定して 、PBSで２回すすぎ、77mM Na2HPO4、23mM NaH2PO4、1.3mM MgCl2、１mg/mlX-Gal 、3mM K3Fe(CN)6、3mM K4Fe(CN)6を含むX-Gal緩衝液で３時間染色した。 70％エタノールによって反応を停止させた。コダック・エクタクローム160Tを用 いて位相差顕微鏡下で写真を撮影した。 SEAP活性アッセイに関しては、トランスフェクトした細胞の培地をアッセイの ５時間前に交換した。培地100μlのアリコットをトランスフェクトしたプレート から採取して、65℃で５分間加熱した。次に培地を14000×gで２分間遠心して、 透明にした。培地のアリコットを、２MジエタノールアミンpH9.8、１M MgCl2お よび20mM L-ホモアルギニンを含む１×SEAPアッセイ緩衝液で調整した。120mMp- ニトロフェニル燐酸塩の水溶液20mlを各混合液に加えた。反応混合液を37℃で30 分インキュベートした。p-ニトロフェニル燐酸塩の加水分解を405ｎｍで測定し た。 (B) 結果 まず、安定なHeLa細胞トランスフェクタントのIFN-γに対する増殖感受性を調 べた。親HeLa細胞はIFN-γに反応して二相性のパターンを示すこと、つまり、細 胞はまず増殖をやめるが生存したままで、その後PCDの細胞学的特徴を有する塊 状の細胞死を起こすことがこれまでに示されていた（ダイスら（Deiss）、Genes Dev.、９：15、1995）。アンチセンスRNA媒介作用を測定するために用いられた アッセイの一つは、生存細胞へのニュートラル・レッド色素の取り込みに基づい た。IFN-γの非存在下では、双方の細胞株（DHFRおよび抗カテプシンD-トランス フェクト細胞）が同様の挙動を示し、同一の増殖曲線を示した。このことは、ア ンチ センスRNA発現が細胞の正常な増殖には影響を及ぼさないことを示唆した（図41A a）。同様に、IFN-の細胞抑制作用に対応して、最初の４日間の間にニュートラ ル・レッド色素の取り込み量が減少した程度（ダイスら（Deiss）、1995）は、 両細胞株において類似していた。このことは、カテプシンDアンチセンスRNAを発 現しても、サイトカインの細胞周期阻害作用は妨害されなかったことを示した。 ２つの細胞集団の差は、後のIFN-γ誘導細胞死の相の際に顕著となった。IFN-γ 処置DHFRトランスフェクト細胞では、色素の取り込みは４日目以降低下した（図 41Aa、41Ab）。顕微鏡下で観察すると、これが大規模な細胞死によるもので、ほ ぼ全ての生存接着細胞がプレートから消失したことが確認された（図41Da）。細 胞死は、持続的な色素の取り込み値によって示されるように、アンチセンス・カ テプシンD RNA発現によって有意に（しかし完全ではない）阻害された（図41Aa ）。２つのアンチセンス・カテプシンD RNA発現ポリクローナル集団のそれぞれ は、IFN-誘導細胞死相においても、生存色素によって染色された細胞分画に有意 な増加を示した（図41Ab）。 殺細胞作用に対する保護を測定する別の方法は、培養をサイトカインによる長 期処置から解放した後に形成されたコロニー数を計数することを含んだ。アンチ センス・トランスフェクト細胞のIFN-γによる細胞障害性に対する感受性の低下 は、処置した細胞培養からのIFN-gの除去後、コロニーを形成することができる 細胞数が対数で１〜２倍増加していることから明らかになった（図41B）。 IFN-γ誘導PCDにおけるカテプシンDの関与をさらに調べるために、HeLa細胞を 、アスパラギン酸プロテアーゼの特異的阻害剤であるペプスタチンAと共にイン キュベートした（シールズら（Shields）、Biochem．Biophys．Res．Comm．177 ：1006、1991）。カテプシンDが、細胞における主な細胞内アスパラギン酸プロ テアーゼであるという事実によつて、このペンタ・ペプチドの細胞内作用の転帰 は一般に、カテプシンD活性が特異的に阻害されたためであった。ペプスタチンA を、同様のインキュベーション・プロトコルによって有効な細胞内濃度が得られ たこれまでの報告（シールズら（Shields）、1991）に従って、0.2％DMSO中で最 終濃度10-4 Mとなるように培養培地に加えた。ペプスタチンAは、IFN-γで処置 していない増殖しつつあるHeLa細胞に対して影響を及ぼさなかった。ペプスタチ ンA をIFN-γ処置DHFRトランスフェクト細胞に加えると、ニュートラル・レッドの色 素取り込み値が上昇したことによって反映されるように、殺細胞プロセスがある 程度阻害された（図41C）。IFN-γの存在下で測定した色素の取り込みの最高値 は、ペプスタチンAをアンチセンス・カテプシンD RNA発現細胞に加えた場合に得 られた（図41C）。 二重処置（アンチセンスRNA＋ペプスタチンA）によって保護されたIFN-γ誘導 細胞培養の顕微鏡観察によって、大部分の細胞が正常な接着した表現型を示し、 丸いアポトーシス形態を示した細胞は約20％に過ぎないことが明らかになった（ 図41Db）。これはさらに、このエンドプロテアーゼの発現および活性がいずれも 減少することが、IFN-γ誘導細胞死から細胞を保護する上で最も有効であること を示した。要約すると、アンチセンスRNAおよびペプスタチンAのデータは、IFN- γ媒介PCDにおけるカテプシンDの積極的な役割を示唆している。 XIX．IFN-γ誘導PCDの際のカテプシンDタンパク質発現とプロセシングの調節 次に、IFN-γがカテプシンDタンパク質の発現およびプロセシングに及ぼす作 用を、イムノブロット上で分析した。処置細胞において、異なるカテプシンD型 の相対量に典型的な変化を検出した（図42Aおよび42B）。無処置のHeLa細胞に検 出される量は通常微量であるカテプシンDの48Kd型は、IFN-γ処置の４〜７日の 間に徐々に高レベルまで蓄積された。対照的に、30Kd型の定常状態レベルは増加 せず（図42B）、いくつかの実験では、後期の時点では減少すら認めた（図42A） 。 48KdカテプシンDは、しばしばプレ・ライソゾーム小胞に認められる蛋白溶解 活性を有する一本鎖型である。これは通常ライソゾームを標的とし、それによっ てさらに酵素の二本鎖型にプロセシングされる（図42Cの略図を参照のこと。図4 2で用いたモノクローナル抗体は30Kd重鎖のエピトープに対して作製されたこと に注意）。したがって、48Kd型の異常な蓄積は、プロテアーゼの正常なプロセシ ングがIFN-γ媒介細胞死の際に妨害されたことを示唆した。さらに、IFN-γ処置 の５〜７日目では、48Kd前駆体のレベルは処置前の30Kd型のレベルより８〜10倍 高かった（図42A）。カテプシンDタンパク質の定常状態レベルの増加は、少なく とも部分的に、RNA上昇に起因した。 全てではないが、いくつかの実験において、親細胞のIFN-γ処置後に52Kdプレ プロ-カテプシンD型の細胞内レベルも増加したことは注目に値する（図42A）。5 2Kd型の微量は細胞培地中にも認めたが、この分泌型のレベルに及ぼすIFN-γの 影響は検出されなかった（示していない）。 カテプシンDタンパク質の顕著なIFN-γによる上昇および中間体の蓄積はいず れも、アンチセンスRNAを発現するHeLaポリクローナル細胞集団において防止さ れた（図42B；計算値は、DHFRおよび抗カテプシンDトランスフェクタントのカテ プシンDタンパク質型においてそれぞれ、IFNによって8.2倍および1.1倍であった ）。個別に生成されたアンチセンス発現ポリクローナル集団をいくつか調べたが 、それらのいずれもIFN-γに反応してカテプシンDレベルの上昇を示さなかった 。したがってこれらの知見は、IFN-γ選別の際にセンスRNAに対してアンチセン スが大過剰量存在すると、予想されるように、カテプシンDタンパク質の総量が 有効に減少することを確認した。これらのIFN-γ処置細胞において持続的に発現 された残留レベルが何故カテプシンDの中間型として蓄積しながったのかという 疑問についてははなおわかっていない。 XX．カテプシンDアスパラギン酸プロテアーゼはAPO-1/FasおよびTNF-α誘導PCD を媒介する。 カテプシンDプロテアーゼが、IFN-γ受容体とは異なる細胞表面受容体の活性 化によって誘発される他のアポトーシスシステムに関与しているか否かという疑 問についても調べた。カテプシンDがFas/APO-1誘導アポトーシスを媒介するか否 かを調べるために、異なるHeLa細胞トランスフェクタントをアゴニスト性の抗AP O-1モノクローナル抗体で処置した。親およびDHFRトランスフェクト細胞は抗Fas /APO-1抗体によって効率よく殺された。細胞死は、IFN-γの作用と類似のアポト ーシス特有の特徴を示した。40時間までに、細胞の約70％が丸くなってプレート から剥離し（示していない）、ニュートラル・レッド色素の取り込みはそれにし たがって減少した（図43A）。殺細胞には、細胞生存率にそれ自身影響を及ぼさ ないIFN-γの低用量（50U/ml）で短期間処置することが必要であった。IFN-γの 低用量は、Fas/APO-1発現の上昇によって、アゴニスト様抗体による殺細胞を受 けるように細胞を感作した。アンチセンス・カテプシンD RNAの発現、 またはDHFRトランスフェクト細胞の培養培地へのペプスタチンAの添加によって 、Fas/APO-1媒介細胞死は実質的に抑制され、その結果、生存細胞の分画は増加 した（図43A）。後者は、カテプシンDがFas/APO-1誘導PCDにとって必須であるこ とを示した。 また、ペプスタチンAが、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）によってU937組織球性リ ンパ球細胞に誘発されるアポトーシス・プロセスを妨害したことも判明した。こ の系における障害は非常に迅速で、染色質濃縮のような典型的な核の変化の後に 断片化が起こることを特徴とした。U937細胞核のDAPI染色から、TNF-α投与後６ 時間で、細胞集団の約３分の１が既に典型的な、断片化した染色質を有する核を 含むことが示された（図43B）。ペプスタチンAを培養に加えると、断片化した核 の数は有意に減少した（図43B）。興味深いことに、より初期段階の染色質濃縮 は、ペプスタチンAの効果に対してより感受性が低いように思われた。これらの データは、カテプシンDエンドプロテアーゼがまたアポトーシス経路に沿ったい くつかの重要な段階を媒介し、それがU937細胞死に至ることを示した。 TNF-α処置U937細胞におけるカテプシンD発現パターンを調べると、これがHeL a細胞系と共通する特徴をいくつか有することが明らかになった。カテプシンDタ ンパク質の総量は有意に増加した。その上、蛋白溶解活性を有する48Kd中間体が これらのTNF-処置U937細胞に蓄積し、この場合も二本鎖型へのプロセシングが妨 害されたことを示している（図42D）。しかし、HeLa細胞系とは対照的に、この 変換は完全には遮断されず、30Kd型の軽度の増加も検出された。これらのデータ は、いくつかのアポトーシス系において、カテプシンDタンパク質の発現／プロ セシングにおける変化の共通パターンを示唆している。 XXI．カテプシンDの異所発現は細胞生存率と適合しない。 カテプシンDの過剰発現の転帰は、HeLa細胞において、遺伝子発現のマーカー として用いたLacZ遺伝子の共トランスフェクションによって直接測定した。カテ プシンDは、テトラサイクリン抑制可能プロモーターによって起動され（ゴッセ ン＆ブヤール（Gossen and Bujard）、PNAS89：5547〜5551、1992）、-ガラクト シダーゼ遺伝子はCMV構成的プロモーターによって起動された。青い細胞を含むl acZの形態は、カテプシンDの転写／翻訳が行われるようにテトラサイクリン の非存在下で維持した培養において、トランスフェクションの48時間後に検出し た。カテプシンDとの共トランスフェクションにより、LacZ含有細胞の70％が丸 いアポトーシス表現型を示すが、対照テトラサイクリン・ベクターによる共トラ ンスフェクションでは、アポトーシス細胞のバックグラウンドは20％未満である ことが判明した（図44A、44B、44C）。 カテプシンDの異所発現が細胞に及ぼす影響をさらに定量するために、第二の 異なるアプローチにおいて、lacZの代わりに、分泌されたアルカリフォスファタ ーゼ（SEAP）を発現するベクターによる共トランスフェクションを行った。これ らの実験において、テトラサイクリン処置中止が、カテプシンD遺伝子を有する トランスフェクタントによって放出されたSEAP活性に及ぼす転帰を測定した。テ トラサイクリン処置中止によるカテプシンDの活性化によって、トランスフェク ションの約48時間後に培養培地に分泌されたSEAP活性は、テトラサイクリンの存 在下で維持した同じ集団から得た値と比較して、有意に減少することが判明した （図44D）。対照的に、テトラサイクリン処置中止は、空のベクターで共トラン スフェクトした対照培養によつて放出されたSEAP活性に影響を及ぼさなかった。 XXII．転移性細胞株におけるDAPキナーゼ発現 (A) 実験技法 (A1) トランスフェクション トランスフェクションは標準的なリン酸カルシウム技法によって行った。 (A2) DAP-キナーゼのためのインビトロ免疫複合体アッセイ トランスフェクトした細胞の総抽出物１mgからの組換え型DAP-キナーゼタンパ ク質の免疫沈降は、抗FLAG M2ゲル（IBI、コダック社）20μlによって、プロテ アーゼおよびフォスファターゼ阻害剤を加えたPLB 200μlにおいて４℃で２時間 行った。PLBで３回洗浄した後、免疫沈降物を反応緩衝液（50mM Hepes、pH7.5、 ８mM MgCl2、２mM MnCl2および0.1mg/ml BSA）で１回洗浄した。ビーズに結合し たタンパク質を、15μCi[γ-32P]ATP（３pmol）、50mM CaCl2、５μg MLC（シグ マ社）および１μMウシ・カルモジュリン（シグマ社）ならびに0.5mM CaCl2を含 む反応緩衝液50μl中で、25℃で15分間インキュベートした。タンパク質試料緩 衝液を加えて反応を終了させ、タンパク質を沸騰させた後、11％SDS- PAGE上で分析した。ゲルをニトロセルロース・メンブレンにブロッティングして 、32P標識タンパク質をオートラジオグラフィーによって可視化した。 (A3) TNF-α処置の前後での核のDAPI染色 指数増殖細胞を、マウスTNF-α（100ng/ml；R&Dシステムズ、ミネアポリス） とシクロヘキシミド（５μg/ml；シグマ社）との併用（+で示す右のパネル）、 またはシクロヘキシミド単独（along）（−で示す左のパネル）で処置した。６ 時間後にDAPI染色を実施した。細胞をガラス・カバー・グラス（直径13mm）上に 、細胞20,000個／ウェルを１ml培地中で24ウェルプレートに播種した。細胞をPB Sで２回洗浄し、同時に固定および可溶化した。これはカバーグラスを、３％パ ラホルムアルデヒドおよび0.3％トライトンX-100のPBS溶液の混合液中で５分間 インキュベートし、その後３％パラホルムアルデヒドのみでさらに20分インキュ ベートすることによって行った。細胞をPBSで３回洗浄し、次にブロッキング溶 液（５％正常ヤギ血清および１％BSAのPBS溶液）中で60分間インキュベートした 。DAPI（0.5pg/ml；シグマ社）はこの段階で加えた。 (B) 結果 DAP-キナーゼタンパク質の発現を、マウス・ルイスおよびCMT64肺癌細胞から 選択される２組の高転移および低転移細胞株において調べた。興味深いことに、 異なる２つの高転移細胞株はDAP-キナーゼmRNA（示していない）またはタンパク 質を発現しなかったが、対応する低転移性の細胞株はDAP-キナーゼ陽性であった （それぞれ低転移および高転移能を示す、マウスルイス肺癌のA9-FおよびD122亜 細胞株に関して、図17を参照のこと）。そのため目標は、高転移性のD122細胞の 中に機能的DAP-キナーゼを導入し、この遺伝子操作がこれらの活発な腫瘍細胞の 腫瘍発生および転移能に及ぼす影響を調べることであった。 pCDNA3にクローニングしたFLAG-タグ野生型DAP-キナーゼを、リン酸カルシウ ム共沈殿技法によってD122細胞にトランスフェクトした。空のpCDNA3ベクターを 対照トランスフェクションのために用いた。安定なDAP-キナーゼ陽性クローンを いくつか単離して、これを、低発現（6-DAP-キナーゼ）、低から中等度発現（48 -DAP-キナーゼ）、中等度発現（28-DAP-キナーゼ）および高発現（42-DAP-キナ ーゼ）細胞に分類した（図17：A9-F低転移性細胞を対照として使用した）。 対照ベクターでトランスフェクトした３つのクローンは、予想されたようにDAP- キナーゼを発現しなかった（図17）。次に、細胞外に発現されたキナーゼに活性 があるか否かを調べるために、抗FLAG抗体による免疫沈降後に、DAP-キナーゼに 関するインビトロ免疫複合体アッセイを行った。ミオシン軽鎖（MLC）タンパク 質を基質として用いることによって、トランスフェクトされたベクターから発現 されたDAP-キナーゼタンパク質は触媒的に活性であることが判明した（図18）。 10％または１％仔ウシ胎児血清（FCS）を含む培地中でのDAP-キナーゼ陽性ト ランスフェクタント培養の増殖速度は、対照および親クローンの増殖速度と同程 度であった（図19）。唯一の例外は、高い血清濃度で、細胞質分裂の何らかの破 壊によってわずかに遅く（倍加時間が２倍増加）増殖する42-DAP-キナーゼ・ク ローンであった。10％FCS含有培地で増殖した42-DAP-キナーゼ細胞の核のDAPI染 色から、断片化した核の発生率が0.1％未満で（図27）、このように、DAP-キナ ーゼそのものは、たとえ高発現の安定なクローンにおいても、アポトーシスを誘 発しないことが示された。併せて、DAP-キナーゼ発現の回復は、培養中の細胞の 持続的な増殖に対して、全く、またはかすかな効果しか示さないという結論が得 られた。 XXIII．DAP-キナーゼトランスフェクト細胞のインビトロ活性 (A) 実験技法 (A1) 実験的転移 異なるD122トランスフェクト・クローンを10〜12週齢のC57BL/6雌性マウス（ ５×105個／マウス）の尾静脈に注射した。マウスを30〜32日後に屠殺して肺を 摘出し、重量を測定してヴアン溶液中で固定した。表面の結節を双眼鏡で計数す ることによって転移結節数を決定した。 (A2)局所腫瘍増殖アッセイ 異なるD122トランスフェクトクローンをC57BL/6マウス（10〜12週齢の雌性マ ウス）の足腑に注射した（２×105個／マウス）。ノギスを用いて担癌足の直径 を１〜３日毎に測定した。腫瘍の直径が８〜９mmに達すれば、担癌足を膝の下が ら切断し、自然発生肺転移による死亡日をそれぞれ個々のマウスについて採点し た。場合によっては、切除した肺結節を培養して腫瘍細胞を回収し、全ての D122トランスフェクタントと同様に、G418（800μg/ml）を加えた10％仔ウシ胎 児血清を含む培地において増殖させた。 (B) 結果 DAP-キナーゼ・トランスフェクト細胞の腫瘍発生および転移能を、多様な細胞 死誘導シグナルに暴露される可能性があるマウスにおいてアッセイした。例えば 、血流中では、侵入しようとする腫瘍細胞は細胞障害性Tリンパ球、ナチュラル ・キラー細胞、およびマクロファージとの相互作用、ならびにこれらの造血細胞 が分泌するサイトカイン（例えば、IFN、TNF、IL-1β）との相互作用によって誘 導されるプログラムされた細胞死に抵抗しなければならない。それらはまた、内 皮細胞によって産生された酸化窒素陰イオンによって誘導されるアポトーシス細 胞死に抵抗しなければならず、血行力学の乱れによって生じる機械的剪断力にも 耐えなければならない。その上、侵入または滲出プロセスの際、そして異物に対 して敵意に満ちた微小環境での増殖の際に、局所的に産生された阻害性サイトカ イン（例えば、TGF-β）または細胞・マトリクス相互作用（例えば、基底膜から の剥離）の喪失もまた、アポトーシス細胞死を誘発する。 異なる２つの実験系において、C57BL/6同系マウスに注射して、これを３回の 独立した実験において繰り返した、１つのグループは、局所腫瘍増殖を追跡する ために、足蹠内に注射した（２×105個／注射）。第二のグループは肺における 実験的肺転移を追跡するために、静脈内注射（５×105個／注射）を行った。 足蹠における局所腫瘍の増殖が親およびG418耐性対照クローンと比較して有意 に遅いこと、そして増殖の遅れの期間は異所発現されたDAP-キナーゼのレベルと 正比例することが判明した（図20；10日の遅れは軽度に発現したクローン（28-D AP-キナーゼ）の特徴で、50日以上の遅れは高度に発現したクローン（42-DAP-キ ナーゼ）の特徴であった）。 DAP-キナーゼが実験的転移に及ぼす影響を調べるために、静脈内注射後30〜32 日目に肺を調べた。平均肺重量および転移病変の平均数から測定すると、転移は 強く抑制された（図21、22）。実験的転移アッセイは、局所腫瘍増殖アッセイよ りDAP-キナーゼ発現に対してはるかに感受性が高かった。肺のアッセイでは、低 発現、および低〜中等度発現クローン（それぞれ、6-DAP-キナーゼ；48-DAP-キ ナーゼ）でも、肺重量はほぼ最大限に減少し、転移病変数もほぼ最大限に減少し たが、局所腫瘍増殖に及ぼす作用は、低〜中等度および低発現クローンではそれ ぞれ、非常に軽度または検出不可能であった。 XXIV．転移抑制の喪失と回復 (A) 結果 自然発生転移は、28-DAP-キナーゼ・クローンを用いた全ての実験の肺に最終 的に現れたが、42-DAP-キナーゼ・クローンを注射した場合には全てではないが 数例において、担癌足を切断後に転移を認めた。マウス足蹠において最終的に増 殖し（遅滞期の後）、担癌足の切断後、肺に自然発生転移を生じることができる 中等度および高度DAP-キナーゼ発現クローンが、インビボにおいて、トランスフ ェクト遺伝子の喪失または不活化に関して選別されるか否かを調べることは興味 深い。28-DAP-キナーゼおよび42-DAP-キナーゼ・クローンの足蹠内注射を行った マウスの肺からの培養において放出された細胞が、外因性DAP-キナーゼの微量ま たは検出不可能なレベルを発現することが判明した（図23、レーン１、２；図24 、レーン１、２；図25、レーン１）。したがって、DAP-キナーゼ異所発現を減弱 させる強い選別が、おそらく足蹠に腫瘍が生着する前の遅滞期にインビボで起こ った。 インビボ選別を受けたクローン28-DAP-キナーゼにおいて、脱メチル化剤であ る5-アザ-2'-デオキシシチジンによって培養細胞を処置することによって、トラ ンスフェクトした遺伝子の全発現能を回復することが可能であった（図25、レー ン１、２）。回復は一過性で、DAP-キナーゼレベルは、薬剤除去後の数回の継代 で、もとの抑制されたレベルに戻った（図25、レーン３、４）。5-アザ-2'-デオ キシシチジンによる同様の処置後でもDAP-キナーゼ発現を認めないままである親 のD122細胞には影響を認めなかった（示していない）。したがって、トランスフ ェクトしたDAP-キナーゼ遺伝子発現が減弱したクローンを選別するインビボ選別 は、DNAメチル化によって起こり、これは、膀胱癌細胞における内因性DAP-キナ ーゼ遺伝子を含む様々な腫瘍抑制遺伝子のスイッチを切るためにヒト腫瘍がしば しば用いる発生遺伝的メカニズムである。この減弱は、実験的転移から、すなわ ち静脈内注射後の肺に存在した非常に小さい転移から放出された28-DAP-キナー ゼ・トランスフェクタントでは起こらなかった。図23（レーン３、４）に示すよ うに、DAP-キナーゼのレベルは、最初に注射したクローンにおいて検出されたレ ベルと同一であった。これは上記のように転移表現型の強い抑制と一致した。 XXV．DAP-キナーゼトランスフェクト細胞のアポトーシス刺激に対する反応 (A) 実験手順 (A1) インサイチューTUNEL染色−アポトーシス指標 マウスの足蹠踪の断片を４％ホルムアルデヒド緩衝液（フルタロム社）中で12 時間固定して、パラフィンに抱埋して切片にした（厚さ４μm）。これらの切片 上で、TUNELアッセイ（断片DNAのぺルオキシダーゼ染色およびメチル・グリーン 色素による切片の対比染色）を、製造元の指示通りに実施した（アポップタグ（ 登録商標）プラス・ペルオキシダーゼ・キット；オンコー社、ガイサースバーグ ）。異なる６個の切片を採点した；それぞれの場合について腫瘍細胞500〜1000 個を計数して、アポトーシス指標の平均値を計算した。平均値は、42-DAP-キナ ーゼおよび4-cont．についてそれぞれ、6.3％±1.13および1.9±0.35であった。 差はP＜＜0.001で有意であった。 (A2) 軟寒天接着非依存的増殖 異なるクローンを、上層に0.5％アガーを含む0.33％軟寒天（バクト・アガー 、ディフコ社）中で、初回細胞数５×103個／６cmプレートで培養した。（A）７ 日目に出現したクローンの直径を光学顕微鏡下で測定した。値は、各群100クロ ーンのコロニー直径の平均値±SDである。対照（例えば、18-cont.）とDAP-キナ ーゼ・トランスフェクタント（例えば、1-DAP-キナーゼ）との差は、P＜＜0.001 で有意であった。（B）親D122細胞（左；a,c）とDAP-キナーゼ-42細胞（右：b,d ）を比較した、（A）と同様に軟寒天中で７日間培養したクローンの顕微鏡写真 。バーは上のパネル（a,b）では350mmそして下のペーンズ（panes）（c,d）では 80mmに相当する。 (B) 結果 DAP-キナーゼの抗腫瘍発生および抗転移作用が、アポトーシス・シグナルに対 ずる細胞の感受性の増加に起因するか否かを解明するために、注射５日後のマウ ス足蹠の組織学的切片についてインサイチューTUNEL染色を行った。染色から、 DAP-キナーゼでトランスフェクトした細胞によって形成された増殖の遅い局所腫 瘍におけるアポトーシス指標が、対照クローンによって形成された腫瘍塊におい て測定した値より有意に高いことが示された（図26）。計算値はそれぞれ６％お よび２％であったが、これはマクロファージと近隣の細胞によってアポトーシス 細胞が急速に排除されることから、総細胞死では大きい差を反映するはずである 。インサイチュー染色によって、異なるアポトーシスシグナルに対する腫瘍細胞 の閾値感度の増強にDAP-キナーゼ遺伝子が関与していることを示す最初のヒント が得られた。 この問題にさらに直接対処するために、いくつかのより明確なタイプのアポト ーシス刺激を培養に加えたが、その一つは細胞死誘導サイトカインであるTNF-α であった。クローン42-DAP-キナーゼは、サイトカインの投与後数時間での核のD API染色によって測定されるように、TNF-誘導細胞死に対してより高い感受性を 示すことがわかった（図27、28）。興味深いことに、TNF-αのアポトーシス作用 に対する感度の増加は、DAP-キナーゼ発現が減弱しているクローンを選別する、 クローン42-DAP-キナーゼのインビボ選別後に失われ、このように、同じ遺伝的 背景内でDAP-キナーゼ発現およびアポトーシスに直接関係していた（図28）。 接着非依存的増殖を調べることができる軟寒天中に細胞を移すことによって、 他のタイプのアポトーシス・ストレスを細胞に与えた。親D122細胞および対照ク ローンによって軟寒天中に形成された大きいコロニーとは対照的に、DAP-キナー ゼトランスフェクタントは、ほとんどの細胞が死滅した、生育不全の小さいコロ ニーを形成した（図29、30）。大きいコロニーへの復帰は、DAP-キナーゼ発現の 減弱を示す前記のインビボ選別42-DAP-キナーゼ・クローンを調べた場合に得ら れた（データは示していない）。したがって、細胞外マトリクスからの剥離によ って、または接着依存型増殖の喪失の際に機能する可能性がある他のまだ同定さ れていないメカニズムによって誘導される細胞死は、機能的DAP-キナーゼの存在 に依存すると結論された。これは非サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞 死の例である。 XXVI．プログラムされた細胞死のサイトカイン以外の誘発因子 細胞外マトリクスからの剥離によって誘導されたプログラムされた細胞死の他 に、非サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死のもう一つの例は、神経栄 養因子の欠乏、酸素欠乏、興奮毒性、外傷的損傷、または神経変性疾患を含む、 多様なストレス疾患に反応したアポトーシス細胞死を受ける成熟神経細胞におい て起こる。分裂後の神経の死が哺乳類生体のCNSに起こると、この組織の再生は ないため、これは有害となる。このため、そのような病変の転帰は永続的な機能 の喪失となるであろう。 神経における非サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死に及ぼすDAP分 子の作用を明らかにするために、海馬の神経の初代培養を18日齢のラット胚から 調製した。これらの細胞培養は、細胞死が誘発される特定のシナリオのモデルと することができる。 海馬の細胞培養を使用することにはいくつかの利点：（1）それが、神経伝達 物質の細胞表面受容体に関して均一な培養であること；（2）海馬の神経は、様 様な状態：興奮毒性（例えば、グルタメート）、酸素欠乏、酸素ラジカル、栄養 因子の枯渇、による細胞死の誘導に対して最も感受性が高いこと、である。例え ば、これらのシステムにおいてDAP-キナーゼの役割を調べるために、触媒的に不 活性な変異体型、K42Aを用いてもよい。アデノウイルス媒介遺伝子トランスファ ーシステムを用いて、K42A-DAP-キナーゼを休止期の神経細胞に導入してもよく 、様々な非サイトカイン誘導剤に対するアポトーシス反応を評価してもよい。 哺乳類細胞におけるプログラムされた細胞死のその他の非サイトカイン誘導剤 には、一般に放射線（γ線およびUV）、p53遺伝子等が含まれる。 本発明は、いくつかの好ましい態様に関して記述してきたが、本開示を検討す れば、当業者は様々な改変および改善を行うであろうと予想される。 本発明の範囲は、本明細書にこれまでに述べた態様の説明によって制限的に解 釈してはならず、添付の請求の範囲に従って決定されると解釈されるべきである 。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ Ｇ０１Ｎ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 33/566 33/566 33/574 Ｚ 33/574 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．DNA配列が： （a）その発現産物がプログラムされた細胞死に関係する、細胞において発現さ れるDNA配列； （b）（a）で定義したDNA以外であって、（a）で定義したDNA配列によってコー ドされる同じ発現産物をコードするDNA配列； （c）改変されたDNA配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチドが 、（a）または（b）で定義した遺伝子によってコードされるタンパク質また はポリペプチドと同様にプログラムされた細胞死を媒介する、１つ以上の核 酸トリプレットが付加、欠失、または置換されている（a）または（b）の改 変されたDNA配列；および （d）生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする、（a）、（ b）または（c）のDNA配列のいずれかの断片、 からなる群より選択される、病的な細胞増殖の転移に関連した疾患または障害の 治療において用いられる薬学的組成物の調製における、プログラムされた細胞死 を誘導することができるDNA配列を含む発現ベクターの治療的有効量の使用。 ２．その発現産物がプログラムされた細胞死に関係している、DNA配列が、細 胞において発現された核酸配列であって、以下の： （viii）配列番号：１； （ix） 配列番号：２： （x） 配列番号：３； （xi） 配列番号：４； （xii） 配列番号：５； （xiii）配列番号：７；または （xiv） 配列番号：15に示される配列の201〜203位の核酸トリプレットで始まり 、3018〜3020位の核酸トリブレットで終了するコード配列を含むDNA配列（配列 番号：８）、 の１つである、請求項１に記載の使用。 ３．DNA配列が配列番号：３である、請求項２に記載の使用。 ４．DNA配列が、請求項２に記載の核酸配列のいずれか１つによってコードさ れる同じタンパク質またはポリペプチドをコードするDNA分子である、請求項１ に記載の使用。 ５．DNA配列が、配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチドが 、請求項２に記載のDNA分子のいずれか１つによってコードされる活性と同じ生 物活性を本質的に有する、１つ以上の核酸トリプレットが付加、欠失、または置 換されている、請求項２に記載の核酸配列である、請求項１に記載の使用。 ６．DNA配列が、請求項２に記載の核酸配列によってコードされるタンパク質 またはポリペプチド中に存在する生物活性を保持するタンパク質またはポリペプ チドをコードする、請求項２に記載の核酸配列の断片である、請求項１に記載の 使用。 ７．薬学的組成物がサイトカインと共に投与される、請求項１に記載の使用。 ８．以下の： （a）試料が組織切片、または細胞から得られたゲノムDNAもしくはmRNA、または 該mRNAから産生されたcDNAである、疾患に苦しむ個体から試料を得る工程 ； （b）１つ以上のプローブが、以下の： （i）その発現産物がプログラムされた細胞死に関係している、細胞におい て発現されたDNA配列； （ii）改変されたDNA配列が（i）の配列とのハイブリダイズ能を保持してい る、１つ以上の核酸トリプレットが付加、欠失、または置換されている 、（i）の改変されたDNA配列； （iii）（i）または（ii）のDNA配列の全体または一部に対してアンチセン スである配列；および （iv)（i）、（ii）または（iii）のDNA配列と相補的であるRNA配列、 からなる群より選択されろ配列を含む、該試料に１つ以上の核酸プロー ブを加える工程； （c）１つ以上のプローブと該試料とのハイブリダイゼーションに関する条件を 提供する工程；および （d）ハイブリダイゼーションが存在しなければ遺伝子が存在しないことを示し 、ハイブリダイゼーションが異常であれば該遺伝子がおそらく不活化されて いることを示す、プログラムされた細胞死に関係する遺伝子が転移性疾患に 関連するか否かを該ハイブリダイゼーションに基づいて決定する工程、 を含む、転移性疾患の予後を決定する方法。 ９．１つ以上のDNAプローブが、以下の： （i） 配列番号：１； （ii） 配列番号：２： （iii）配列番号：３； （iv） 配列番号：４； （v） 配列番号：５； （vi） 配列番号：７；または （vii）配列番号：15に示される配列の200〜202位の核酸トリプレットで始まり 、3017〜3019位の核酸トリプレットで終了するコード配列を含むDNA配列(配列番 号：８)、 からなる群より選択されるDNA配列の完全または部分的配列を含む、請求項８に 記載の方法。 10．以下の： （a）試料が細胞抽出物または組織切片である、疾患に苦しむ個体から試料を得 る工程； （b）請求項１〜３に記載のDNAによってコードされるタンパク質と結合すること ができる１つ以上の特異的抗体を該試料に加える工程； （c）該試料中の該タンパク質と該抗体との結合に関する条件を提供する工程； （d）結合がなければ、該タンパク質が存在しないことを示し、結合が異常であ れば、該タンパク質がおそらく改変されていることを示す、プログラムされ た細胞死に関係するタンパク質が転移性疾患に関連するが否かを、該タンパ ク質の結合に基づいて決定する工程、 を含む、転移性疾患の予後を決定する方法。 11．DNA分子が変異を受けて、その結果該変異分子の産物が、サイトカイン誘 導型のプログラムされた細胞死促進活性の増加を有する、以下の： （a）その発現産物がサイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死の媒介に必 要である遺伝子；および （b）（a）において定義された遺伝子によってコードされる同じタンパク質また はポリペプチドをコードするDNA配列； からなる群より選択される配列を含むDNA分子。 12．図15に示される配列の1767位で始まり、2529位で終了する核酸配列を含む DNA配列。 13．カテプシンDに関連したプログラムされた細胞死の治療において用いられ る薬学的組成物の調製における、ペプスタチンAの治療的有効量の使用。 14．DNA配列が以下の： （a）その発現産物が非サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死に関係す る、細胞において発現されるDNA配列； （b）（a）で定義したDNA以外であって、（a）で定義したDNA配列によってコー ドされる同じ発現産物をコードするDNA配列； （c）改変されたDNA配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチドが 、（a）または（b）で定義した遺伝子によってコードされるタンパク質また はポリペプチドと同様にプログラムされた細胞死を媒介する、１つ以上の核 酸トリプレットが付加、欠失、または置換されている、（a）または（b）の 改変されたDNA配列；および （d）生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする、（a）、（ b）または（c）のDNA配列のいずれかの断片、 からなる群より選択される、制御されない病的な細胞増殖に関連した疾患または 障害の治療において有用な薬学的組成物の調製における、非サイトカイン誘導型 のプログラムされた細胞死を促進することができるDNA配列を含む発現ベクター の治療的有効量の使用。 15．その発現産物が非サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死に関係し ている、DNA配列が、細胞において発現された核酸配列であって、以下の： （i） 配列番号：１； （ii） 配列番号：２： （iii）配列番号：３； （iv） 配列番号：４； （v） 配列番号：５； （vi） 配列番号：７；または （vii）配列番号：図15において示される配列の201〜203位の核酸トリプレット で始まり、3018〜3020位の核酸トリプレットで終了するコード配列を含む DNA配列（配列番号：８）、 の１つである、請求項14に記載の使用。 16．DNA配列が配列番号：３である、請求項15に記載の使用。 17．DNA配列が、請求項15に記載の核酸配列のいずれか１つによってコードさ れる同じタンパク質またはポリペプチドをコードするDNA分子である、請求項14 に記載の使用。 18．DNA配列が、配列によってコードされるタンパク質またはポリペプチドが 請求項15に記載のDNA分子のいずれか１つによってコードされる活性と同じ生物 活性を本質的に有する、１つ以上の核酸トリプレットが付加、欠失、または置換 されている、請求項15に記載の核酸配列である、請求項14に記載の使用。 19．DNA配列が、請求項15に記載の核酸配列によってコードされるタンパク質 またはポリペプチド中に存在する生物活性を保持するタンパク質またはポリペプ チドをコードする、請求項15に記載の核酸配列の断片である、請求項14に記載の 使用。 20．疾患が癌である、請求項14に記載の使用。 21．DNA分子が変異を受けて、その結果該変異分子の産物が、増加したサイト カイン誘導型のプログラムされた細胞死促進活性を有する、以下の： （a）その発現が、非サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死の媒介に必 必要である遺伝子；および （b）（a）において定義された遺伝子によってコードされる同じタンパク質また はポリペプチドをコードするDNA配列、 からなる群より選択される配列を含むDNA分子。 22．DNA配列が、以下の： （a）アンチセンスがDNA分子の発現を阻害することができる、その発現産物が非 サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死に関係する、細胞において発 現されたDNAの全体または一部とアンチセンスである配列； （b）改変された配列によってコードされるタンパク質またはペプチドが、該タ ンパク質またはペプチドの該プログラムされた細胞死の阻害能によって明ら かとなるドミナント・ネガティブ（dominant negative）作用を有する、１ つ以上の核酸トリプレットが付加、欠失または置換されている、（i）にお いて定義されたDNA分子の改変されたDNA配列；および （c）請求項15に記載のDNA配列によってコードされるタンパク質またはポリペプ チドのいずれかの阻害剤または拮抗剤、 からなる群より選択される、非サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死に 関連した疾患または障害の治療において有用な薬学的組成物の調製における、非 サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死を阻害することができるDNA配列 を含む発現ベクターの治療的有効量の使用。 23．DNA分子が、請求項15に記載の核酸配列の全体または一部から転写されたm RNAと配列が相補的であって、しかも該配列の発現を阻害することができるアン チセンス分子である配列である、請求項22に記載の使用。 24．DNA配列が、改変されたタンパク質またはポリペプチドが、ドミナント・ ネガティブ作用を有し、しかも請求項15に記載の該配列のいずれか１つによって コードされるタンパク質またはポリペプチドの機能を阻害することができる、１ つ以上の核酸トリプレットが付加、欠失、または置換されている、請求項15に記 載の配列のいずれか１つの改変されたDNA配列である、請求項22に記載の使用。 25．疾患がアルツハイマー病またはパーキンソン病である、請求項22に記載の 使用。 26．制御されない病理的な細胞増殖に関連した疾患の予後を決定する方法であ って、以下の： （a）試料が組織切片、または細胞から得られたゲノムDNAもしくはmRNA、または 該mRNAから産生されたcDNAである、疾患に苦しむ個体から試料を得る工程； （b）１つ以上のプローブが、以下の： （i）その発現産物が非サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死に関 係している、細胞において発現されたDNA配列； （ii）改変されたDNA配列が（i）の配列とのハイブリダイズ能を保持してい る、１つ以上の核酸トリプレットが付加、欠失、または置換されている 、（i）の改変されたDNA配列； （iii）（i）または（ii）のDNA配列の全体または一部に対してアンチセン スである配列；および （iv）（i）、（ii）または（iii）のDNA配列と相補的であるRNA配列、 からなる群より選択される配列を含む、該試料に１つ以上の核酸プロー ブを加える工程； （c）１つ以上のプローブと該試料とのハイブリダイゼーションに関する条 件を提供する工程；および （d）ハイブリダイゼーションが存在しなければ遺伝子が存在しないことを 示し、ハイブリダイゼーションが異常であれば該遺伝子がおそらく不活 化されていることを示す、非サイトカイン誘導型のプログラムされた細 胞死に関係する遺伝子が該疾患に関連するか否かを、該ハイブリダイゼ ーションに基づいて決定する工程、 を含む方法。 27．１つ以上のDNAプローブが、以下の： （i） 配列番号：１； （ii） 配列番号：２： （iii）配列番号：３； （iv） 配列番号：４； （v） 配列番号：５： （vi） 配列番号：７；または （vii）配列番号：図15において示される配列の200〜202位の核酸トリブレット で始まり、3017〜3019位の核酸トリプレットで終了するコード配列を含 むDNA配列（配列番号：８）、 からなる群より選択されるDNA配列の全体または一部の配列を含む、請求項26に 記載の方法。 28．制御されない病的な細胞増殖に関連した疾患の予後を決定する方法であっ て、以下の： （a）試料が細胞抽出物または組織切片である、疾患に苦しむ個体から試料を得 る工程； （b）請求項14〜16に記載のDNAによってコードされるタンパク質と結合すること ができる１つ以上の特異的抗体を該試料に加える工程； （c）該試料中の該タンパク質と該抗体との結合に関する条件を提供する工程； （d）結合がなければ、該タンパク質が存在しないことを示し、結合が異常であ れば、該タンパク質がおそらく改変されていることを示す、非サイトカイン 誘導型のプログラムされた細胞死に関係するタンパク質が転移性疾患に関連 するか否かを、該タンパク質の結合に基づいて決定する工程、 を含む方法。 29．非サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死が、該細胞の接着依存型 増殖の喪失によって誘導される、請求項14〜20または22〜24のいずれかに記載の 使用。 30．非サイトカイン誘導型のプログラムされた細胞死が、グルタメートによっ て神経細胞に誘導される、請求項14〜20または22〜25のいずれかに記載の使用。
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