JP2003525060A - スルビビン・アポトーシス経路の選択的調節法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新しい生物学的現象の発見に基づき、スルビビンのリン酸化、スルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体の間の相互作用、およびスルビビンとカスパーゼ−９の間の相互作用を調節する薬剤の特定に使用するための方法および組成物を提供する。関係する方法および組成物を使用して、スルビビン調節性アポトーシスを調節することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願） 本出願は、１９９８年４月１日出願の米国特許仮出願番号６０／０８０，２８
８、１９９９年４月１日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０７２０５、１９９
９年４月１日出願の米国特許出願番号０９／２８３，１４４、１９９６年１１月
２０日出願の米国特許仮出願番号６０／０３１，４３５、１９９７年１１月２０
日出願の米国特許出願番号０８／９７５，０８０および１９９７年１１月２０日
出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／２１８８０に関連するものであり、２０００
年２月２９日出願の米国特許出願番号０９／５１５，５１４に対する優先権の恩
典を主張するものであるが、これらのすべてが全体としてここに援用される。

【０００２】 （技術分野） 本発明は、新しい生物学的現象の発見に基づくものであり、スルビビン（ｓｕ
ｒｖｉｖｉｎ）のリン酸化、スルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ
複合体の間の相互作用、およびスルビビンとカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）−９
の間の相互作用を調節する薬剤の特定に使用するための方法および組成物を提供
する。関係する方法および組成物を使用して、スルビビン調節性アポトーシスを
調節（変調）することができる。

【０００３】 （連邦政府の支援に対する謝辞） 本明細書に記載する研究および発見は、合衆国国立衛生研究所からの交付金Ｈ
Ｌ４３７７３およびＨＬ５４１３１による援助を受けた。

【０００４】 （発明の背景） Ａ．プログラムされた細胞死におけるスルビビンの役割 プログラムされた細胞死（アポトーシスと呼ばれる場合もある）は、形態学的
にも機能的にもネクローシスとは区別される。プログラムされた細胞死は、生物
が細胞を処分するために用いる自然な形の死である。プログラムされた細胞死に
よって死ぬ細胞は、通常、収縮し、めったに溶解せず、および炎症が現われるこ
となく生物から有効に除去される（マクロファージによって迅速に認識され、飲
み込まれる）（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｈｅｎｇａｒｔｎｅｒ，“Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔ
ｈ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ，
”（細胞死および老化、その分子メカニズム）ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩ
ＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ １５８−６２（Ｒ．Ａ．Ｍ
ｅｙｅｒｓ編、１９９５））。

【０００５】 アポトーシスは、膜ブレビング、細胞質の収縮、染色質凝縮および「ＤＮＡラ
ダー」の形成を含む特定セットの形態学的特徴を共有するサブセットのプログラ
ムされた細胞死を説明するために、最初は用いられた。アポトーシスの間、細胞
は、それらの細胞間結合および微小絨毛を喪失し、細胞質凝縮および核染色質は
、辺縁趨向して多数の離散した塊になる。核は分断するが、細胞質は、接触し、
ミトコンドリアおよびリボソームは、稠密に密集してくる。細胞質内網状構造の
拡大およびその細胞質膜との融合後、細胞は、アポトーシス体と呼ばれる膜胞を
結合した幾つかの膜に分解し、これは、通常、隣接する細胞によって貪食される
。アポトーシスが起こるには、脊椎動物の腫瘍サプレッサー遺伝子など、特定の
遺伝子の活性化が必要であると考えられる。非常に多数の細胞毒剤によって誘導
されるアポトーシスは、細胞質タンパクＢｃｌ−２を生産する遺伝子ｂｃｌ−２
の発現によって阻害することができる（ＴＨＥ ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ Ｏ
Ｆ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ６７版、Ｊｏｈｎ Ｋｅｎｄｒｅｗ
ら、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１
９９４）。

【０００６】 スルビビンは、最近、アポトーシスの新規阻害因子（ＩＡＰ）として特定され
た。スルビビンをコードする遺伝子は、染色体１７ｑ２５に位置する。スルビビ
ンは、単一の部分保存ＢＩＲ（バキュロウイルスＩＡＰ反復）ドメイン、および
Ｂ細胞前駆体内で伝達される時、成長因子（ＩＬ−３）離脱によって誘導される
アポトーシスを阻害するＲＩＮＧフィンガーに代わる高荷電カルボキシ末端多重
らせん領域を含む１６．５ｋＤ細胞質タンパクである（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ，Ｇ
．ら、１９９７）。ＩＡＰ系統の他のメンバーとは異なり、スルビビンは、ＢＩ
Ｒドメインを一つしか有さず、カルボキシ末端ＲＩＮＧフィンガーを有さない。
その代わり、スルビビンは、カルボキシ末端多重らせん領域を有する。すべての
配列の保存、カルボキシ末端ＲＩＮＧフィンガーの不在および単一の部分的に保
存されたＢＩＲドメインの存在を基づき、スルビビンは、ＮＡＩＰとの類似性を
最も高い度合いで共有する、最も遠い関係のＩＡＰ系統メンバーである（Ｒｏｙ
，Ｎ．ら、１９９５）。さらに、他のＩＡＰタンパクとは異なり、スルビビンは
、成人組織では検出することができないが、肺、結腸、乳腺、膵臓および前立腺
の最も一般的なヒトの癌すべてにおいて、および〜５０％の高度ホジキンリンパ
腫において、インビボで、顕著に発現してくる。

【０００７】 胎芽および胎児の発育におけるスルビビンの発現は、組織恒常性、およびｂｃ
ｌ−２とは無関係である組織分化の一因となる（Ａｄｉｄａら、１９９８）。こ
のスルビビン関連発育経路異常によって、新形成におけるスルビビンの顕著な再
発現および異常持続性細胞生存性がもたらされる（Ａｄｉｄａら、１９９８）。

【０００８】 プログラムされた細胞死の非制御は、癌を含む多様なヒトの疾病の病原の一因
となる第一メカニズムとして浮かび上がってきた。細胞質内の抗アポトーシス遺
伝子の影響は、例えば、濾胞性リンパ腫におけるｂｃｌ−２の役割に焦点をあて
られ、一方、スルビビンなどのＩＡＰタンパクの潜在的分布は、研究され始めた
にすぎない。スルビビンは、成人組織にはめったに存在しないが、膵臓の腺癌、
乳腺癌、大腸癌、頭部および頚部扁平細胞癌、神経芽腫、悪性胸腺種、前立腺癌
、および良性前立腺肥大において検出されている（ＵＳＳＮ ０８／９７５，０
８０を参照のこと）。この発現パターンは、スルビビンの過発現またはスルビビ
ン遺伝子制御における変化が、一般に、腫瘍形成中に発生することを示唆してい
る。

【０００９】 Ｂ．細胞周期 生きている生物は細胞から成り、この増殖および分裂には、細胞周期を含む事
象およびプロセスの規則的な連続性が求められる。細胞周期事象は、連続性であ
るものもあるし（例えば、タンパク質および脂質の合成）、非連続性であるもの
もある（例えば、ＤＮＡ合成）。細胞生存のための二つの非連続プロセスは、有
糸分裂中のＤＮＡの複製および細胞分裂の娘細胞への染色体の分離である。これ
らのステップのいずれかが不正確に行われると、娘細胞は互いに異なるものとな
り、ほぼ確実に傷がつく。染色体の分離は、有糸分裂中、通常は、非常に目立つ
細胞分裂活動が最高点に達する細胞周期における比較的短い期間（例えば、細胞
質分裂）の間に発生する。残りの細胞周期には、細胞分裂間期が含まれ、この間
に増殖が起きる。染色体の複製は、真核細胞において、細胞分裂間期でのみ起き
、複製および分離は、相互排除的なプロセスである。

【００１０】 細胞分裂間期は、ＤＮＡ合成が起きるＳ期と、Ｓ期と有糸分裂とを分けるギャ
ップ期とに細分される。Ｇ１は、有糸分裂後、ＤＮＡ合成開始前のギャップ期で
あり、Ｇ２は、ＤＮＡ合成が完了した後、有糸分裂および細胞分裂の前のギャッ
プ期である。細胞の構成成分は、調節要素として働くことによって細胞周期を指
揮する。

【００１１】 Ｃ．アポトーシスおよび細胞周期についてのチェックポイントメカニズム ホメオスタシスの維持におけるアポトーシス（プログラムされた細胞死）の中
心的機能の一つは、損傷した潜在的に有害な細胞の排除である（Ｖａｕｘ ａｎ
ｄ Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ，１９９９）。このプロセスが有効であるために、アポ
トーシスの機構は、ＤＮＡ損傷、有害な環境条件、および腫瘍遺伝子またはウイ
スルの形質転換を検知する監視メカニズム、すなわち「チェックポイント」に常
に連動していなければならない（Ｈｕｎｔｅｒ，１９９７；Ｐａｕｌｏｗｉｃｈ
ら、１９９７）。これらの条件のもとでのチェックポイントの活性化は、哺乳動
物細胞において、上流細胞死プロテアーゼ、カスパーゼ−９、そのアダプター／
コファクタータンパク質Ａｐａｆ−１、ミトコンドリア誘導シトクロムｃおよび
ｄＡＴＰ／ＡＴＰ（Ｇｒｅｅｎ，１９９８）を含む進化保存「アポトソーム」の
集成によってアポトーシスを開始させる（Ｅｖａｎ ａｎｄ Ｌｉｔｔｌｅｗｏ
ｏｄ，１９９８）。どのようにアポトソームの集成がカスパーゼ−９触媒活性を
促進するかは討議されている（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｌａｚｅｂｎｉｋ
，１９９９；Ｚｏｕら、１９９９）が、このプロセスは、下流のエフェクターカ
スパーゼの活性化および重要な細胞基質の分割で最高点に達している（Ｓａｌｖ
ｅｓｅｎ ａｎｄ Ｃｉｘｉｔ，１９９７；Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ ａｎｄ Ｌ
ａｚｅｂｎｉｋ，１９９８）。アポトーシスの制御をチェックポイントの活性化
に結びつける類似のパラダイム（Ｌｅｖｉｎｅ，１９９７）は、細胞周期の推移
を支配する監視メカニズム（Ｐｉｎｅｓ，１９９９）、双極有糸分裂装置の組み
立て（Ｍｅｒｄｅｓ ａｎｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，１９９７）、多倍数性の保
存（Ｎｉｃｋｌａｓ，１９９７）、および細胞質分裂のタイミング（Ｆｉｅｌｄ
ら、１９９９）に拡大された。これに関連して、アポトーシス阻害因子ｂｃｌ−
２およびｂｃｌ−ＸＬの異常調節発現が、Ｓ期侵入を阻害すること（Ｌｉｎｅｔ
ｔｅら、１９９６）、細胞周期退出を促進すること（Ｈｕａｎｇら、１９９７）
、および異数性の原因となること（Ｍｉｎｎら、１９９６）が示された。これは
、細胞周期進行におけるアポトーシス機構の役割をさらに実証した。

【００１２】 スルビビンは、細胞周期依存性でＧ２／Ｍにおいて発現し、細胞分裂中、有糸
分裂紡錐体微小管およびアクトミオシン細胞間橋、すなわち、中間体に局在する
（Ｌｉら、１９９８）。このトポグラフィーの干渉またはスルビビン発現のブロ
ックは、Ｇ２／Ｍにおけるカスパーゼ−３の活性を増加させ（Ｌｉら、１９９８
）、有糸分裂の進行の深在性異常調節をもたらす（Ｌｉら、１９９９）。このこ
とは、スルビビンが、細胞分裂時に新規アポトーシスチェックポイントを制御で
きることを示唆する。この経路は、癌において非常に開発され（Ａｍｂｒｏｓｉ
ｎｉら、１９９７）、この経路で、スルビビンは、癌では一様に発現されるが、
正常な組織では発現されない３５０万のｍＲＮＡのうちの上位４つの「トランス
クリプトーム」の一つとして特定された（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、１９９９）
。さらに、保存バキュロウイルスＩＡＰ反復（ＢＩＲ）ドメインにおける点突然
変異を伴うドミナントネガティブ突然変異体またはスルビビンアンチセンスを用
いてスルビビンの発現および機能を干渉すると、異常有糸分裂（Ｌｉら、１９９
９）および自発性アポトーシス（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉら、１９９９；Ｇｒｏｓｓ
ｍａｎら、１９９９ａ；Ｇｒｏｓｓｍａｎら、１９９９ｂ）がもたらされたので
、この有糸分裂チェックポイントでの操作に、形質転換細胞が非常に敏感である
ことが示されている。Ｂｃｌ−２のアンチセンス阻害は、アポトーシスに対する
感受性を増加させたが、本質的には細胞死を誘導しなかった（Ｊａｎｓｅｎら、
１９９８）ので、この表現型は、スルビビンに特有のものであり、新形成の一因
となる可能性がある他のアポトーシス阻害因子では観察されない。

【００１３】 本発明は、スルビビンが哺乳動物細胞における細胞分裂の制御とアポトーシス
の調節とを一体化しうるメカニズムを特定する。本発明は、スルビビンの発現を
調節するもの、およびインビボで黒色腫瘍における抗アポトーシス性スルビビン
経路に干渉するもの、二種類のスルビビン拮抗物質をも提供する。さらに本発明
は、有効量のスルビビン拮抗物質を腫瘍に投与することを含む腫瘍の成長を抑制
する方法を提供する。

【００１４】 （発明の概要） 本発明は、スルビビンが、主有糸分裂キナーゼ複合体、ｐ３４^cdc2−サイクリ
ンＢ１（Ｎｕｒｓｅ，１９９４）によってリン酸化されること、およびこのプロ
セスが、有糸分裂を通り抜ける細胞の生存性を保持するために重要であることの
発見に、部分的に基づく。

【００１５】 本発明は、ｐ３４^cdc2によるスルビビンのリン酸化の欠如によって、スルビビ
ン活性カスパーゼ−９複合体の解離、中間体からのカスパーゼ−９の選択的異常
局在化、および有糸分裂を通り抜ける細胞のカスパーゼ−９依存性アポトーシス
が生じることの発見にも、部分的に基づく。

【００１６】 本発明は、スルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体を薬剤と
共にインキュベートするステップ、および前記薬剤が、スルビビンのリン酸化を
調節するかどうかを決定し、それによって、スルビビンのリン酸化を調節する薬
剤を特定するステップを含む、スルビビンのリン酸化を調節する薬剤を特定する
方法を提供する。

【００１７】 本発明は、さらに、スルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体
の相互作用を調節する薬剤を特定する方法を提供する。

【００１８】 本発明は、スルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体の間の少
なくとも一つの相互作用を調節する薬剤を有効量投与するステップを含む、スル
ビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体の間の相互作用を調節する
方法も提供する。

【００１９】 本発明は、さらに、スルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体
の間の相互作用を調節する薬剤を有効量、細胞に投与することを含む、細胞にお
けるアポトーシスを調節する方法を包含する。本発明は、さらに、スルビビンと
ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体の間の相互作用を調節する薬剤、組
成物およびペプチドを提供する。

【００２０】 本発明は、リン酸化スルビビンとカスパーゼ−９の間の相互作用を調節する薬
剤を特定する方法をも提供する。本発明は、さらに、リン酸化スルビビンとカス
パーゼ−９の間の相互作用を調節する薬剤、組成物およびペプチドを提供する。

【００２１】 本発明は、細胞内でのスルビビンの発現を変調するための、ドミナントネガテ
ィブスルビビン突然変異体（Ｔｈｒ³⁴→Ａｌａ）およびスルビビンアンチセンス
核酸などのスルビビン拮抗物質を提供する。本発明は、インビボおよびインビト
ロで腫瘍の成長を阻害するためのスルビビン拮抗物質の使用も開示する。

【００２２】 （発明の詳細な説明） Ｉ． 一般的な説明 本発明は、スルビビンが、主有糸分裂キナーゼ複合体、ｐ３４^cdc2−サイクリ
ンＢ１（Ｎｕｒｓｅ，１９９４）によってリン酸化されること、およびこのプロ
セスが、有糸分裂を通り抜ける細胞の生存性を保持するために重要であることの
発見に部分的に基づく。

【００２３】 本発明は、スルビビンがｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体に結合す
るということの発見にも、部分的に基づく。さらに、本発明は、リン酸化スルビ
ビンがカスパーゼ−９と相互作用することの発見に、部分的に基づく。

【００２４】 ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体によるスルビビンタンパク質のリ
ン酸化、キナーゼ複合体へのスルビビンの結合、およびカスパーゼ−９へのスル
ビビンの結合は、スルビビン媒介機能を阻害または誘導する薬剤を特定するため
に用いることができ、またはそうした薬剤の目標としての役割を果たすことがで
きる。前記薬剤を用いて、細胞アポトーシスのスルビビン媒介阻害を調節するこ
と、異常な細胞増殖をブロックすることまたは培養物における細胞増殖を拡大す
ることができる。本明細書中で用いる「アポトーシスの調節」は、所定の細胞個
体群の中で、さもなければアポトーシスを被る細胞の数を増加させることまたは
減少させることを意味する。これは、ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合
体によるスルビビンのリン酸化、前記キナーゼ複合体へのスルビビンの結合、ま
たはカスパーゼ−９へのリン酸化スルビビンの結合を調節する（増大させるかま
たは減少させる）ことによって果たすことができる。好ましくは、アポトーシス
を調節することができる所定の細胞個体群は、腫瘍、またはその調節によって有
益な影響がもたらされる他の細胞組織もしくは細胞群に見出される。好ましくは
、所定の細胞個体群の中で、さもなければアポトーシスを被るであろう細胞の数
の増加または減少は、その個体群中の細胞の少なくとも約１０％、２０％、４０
％またはさらに好ましくは少なくとも約５０％である。

【００２５】 さらに、本発明は、ドミナントネガティブスルビビン突然変異体（Ｔｈｒ³⁴→
Ａｌａ）およびアンチセンススルビビン核酸などのスルビビン拮抗物質が、黒色
腫における内在性スルビビンの発現を阻害し、インビボおよびインビトロでの黒
色腫の成長を阻害することの発見に、部分的に基づく。従って、本発明は、有効
量のスルビビン拮抗物質を腫瘍に投与することによって腫瘍の成長が阻害される
ことの発見にも、部分的に基づく。

【００２６】 ＩＩ．特定の実施の形態 Ａ． ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体によるスルビビンのリン酸
化、ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体へのスルビビンの結合またはカ
スパーゼ−９へのスルビビンの結合を調節または阻害する薬剤を特定する方法 上に記載したように、本発明は、ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体
によるスルビビンのリン酸化を調節、減少、または阻害する薬剤を特定するため
の方法を提供する。本発明は、スルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナー
ゼ複合体との会合を調節、減少または阻害する薬剤を特定するための方法も提供
する。本発明は、カスパーゼ−９へのスルビビンの会合を調節、減少または阻害
する薬剤を特定するための方法も提供する。

【００２７】 一つのアッセイ方式では、試験される薬剤の存在下および不在の状態で、スル
ビビンをｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体と混合する。スルビビンの
前記キナーゼ複合体との会合が可能な条件のもとで混合した後、二つの混合物を
分析し、比較して、前記薬剤が、スルビビンのリン酸化、またはスルビビンのｐ
３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体に対する結合を調節、増大、促進、減
少、または阻害するかどうかを決定する。リン酸化スルビビン／カスパーゼ−９
または非リン酸化スルビビン／カスパーゼ−９についてのアッセイの場合（実施
例３を参照のこと）、同様に、試験薬剤の存在下および不在の状態で、リン酸化
スルビビンをカスパーゼ−９と混合するか、または非リン酸化スルビビンを〜４
６ｋＤａおよび〜３５ｋＤａのプロフォーム／活性、いずれかのカスパーゼ−９
とそれぞれ混合して、前記薬剤が、前記二つのタンパク質の相互作用を調節、増
大、促進、低下、または阻害するかどうかを決定する。

【００２８】 スルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体との会合、またはス
ルビビンとカスパーゼ−９の会合を阻害または減少させる薬剤は、試験薬剤を含
有するサンプルに存在する会合の量を減少させるそれらの能力によって特定する
ことができる。ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体によるスルビビンの
リン酸化をブロックまたは減少させる薬剤は、試験薬剤を含有するサンプル中の
スルビビンの量を減少させるそれらの能力によって特定することができる。

【００２９】 本明細書中で用いる場合、薬剤の存在がスルビビンの量を減少させるか、また
はスルビビンのリン酸化を全体としてブロックするとき、「薬剤が、ｐ３４^cdc2 −サイクリンＢ１キナーゼ複合体によるスルビビンのリン酸化を減少させるまた
は阻害する」と言う。ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体に結合するこ
とによってスルビビンのリン酸化を減少または阻害する種類の薬剤がある一方で
、スルビビンに結合することによってスルビビンのリン酸化を減少または阻害す
る種類の薬剤もある。

【００３０】 本明細書中で用いる場合、薬剤の存在によって、前記キナーゼ複合体がスルビ
ビンと会合した状態になる程度が減少するかまたはそれが防止されるとき、「薬
剤が、スルビビン／ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体の会合を減少さ
せるまたはブロックする」と言う。ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体
に結合することによって会合を減少またはブロックする種類の薬剤がある一方で
、スルビビンに結合することによって会合を減少またはブロックする種類の薬剤
もある。

【００３１】 本明細書中で用いる場合、薬剤の存在によって、カスパーゼがスルビビンと会
合した状態になる程度が減少するかまたはそれが防止されるとき、「薬剤が、リ
ン酸化スルビビン／カスパーゼ−９の複合化または非リン酸化スルビビン／プロ
カスパーゼ（プロカスパーゼ）−９の複合化を減少させるまたは阻害する」と言
う。薬剤はカスパーゼ−９またはプロカスパーゼ−９に結合することによって会
合を減少させるまたは阻害する種類の薬剤がある一方で、スルビビンに結合する
ことによって会合を減少させるまたは阻害する種類の薬剤もある。

【００３２】 上記の方法で検定した薬剤は、ランダムに選択することができ、または合理的
に選択もしくは設計することができる。本明細書中で用いる場合、薬剤が、スル
ビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体との会合またはスルビビン
とカスパーゼ−９との会合に関係する特定の配列を考慮することなくランダムに
選択されるとき、「薬剤が、ランダムに選択される」と言う。ランダムに選択さ
れる薬剤の例は、ケミカルライブラリまたはペプチド・コンビナトリアルライブ
ラリ、または生物の増殖液体培地に用いられるものである。

【００３３】 本明細書中で用いる場合、薬剤が、薬剤の作用と関係するターゲット部位の配
列および／またはその配座を考慮に入れる非ランダムベースで選択されるとき、
「薬剤が、合理的に選択または設計される」と言う。上記のように、スルビビン
／ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体の相互作用およびスルビビン／カ
スパーゼ−９の相互作用をブロックする薬剤には、少なくとも二つの作用部位：
スルビビンに対する結合パートナー接触部位、および前記キナーゼ複合体に対す
るまたはカスパーゼ−９に対するスルビビン接触部位がある。薬剤は、スルビビ
ン／ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体の接触部位およびスルビビン／
カスパーゼ−９複合体の接触部位を形成するペプチド配列を利用することによっ
て、合理的に選択または合理的に設計することができる。例えば、合理的に選択
される薬剤は、アミノ酸配列がキナーゼ複合体に対する、またはカスパーゼ−９
に対するスルビビン接触部位と同一であるペプチドであることができる。こうし
た薬剤は、ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体に結合することによって
スルビビンと前記キナーゼ複合体との会合、またはカスパーゼ−９に結合するこ
とによってスルビビンの会合を減少またはブロックするであろう。

【００３４】 本発明の薬剤は、例として、ペプチド、小分子、ビタミン誘導体、ならびに炭
水化物であることができる。当業者は、本発明の薬剤の構造的特徴に関して制限
がないことが、容易に理解できる。

【００３５】 本発明のペプチド薬剤は、当該技術分野において知られているような、標準的
な固相（または液相）ペプチド合成法を用いて調製することができる。さらに、
これらのペプチドをコードするＤＮＡは、市販のオリゴヌクレオチド合成機器を
用いて合成することができ、標準的な組換え生産システムを用いて、組換えによ
って生産することができる。固相ペプチド合成を用いる製造は、非遺伝子コード
アミノ酸を含むことになるときに必要である。

【００３６】 本発明のもう一つの種類の薬剤は、スルビビン、ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１
キナーゼ複合体、またはカスパーゼ−９の重要な位置と免疫反応する抗体である
。抗体は、ペプチドで、抗体がターゲットにするためのスルビビンまたは結合パ
ートナーの部分を抗原領域として含む、適する哺乳動物の被験体を免疫すること
によって得ることができる。重要領域は、スルビビンとキナーゼ複合体との会合
に関係する接触部位、特に、スルビビンのアミノ酸残基３４にわたる領域を含む
。

【００３７】 本明細書中で用いる「スルビビンタンパク質（またはスルビビン）」は、Ａｍ
ｂｒｏｓｉｎｉらの文献（１９９７）において記載されたヒトスルビビンのアミ
ノ酸配列を有するタンパク質を指す。用語「スルビビンタンパク質」は、スルビ
ビンの天然対立遺伝子変異体、および特に上で挙げたものとはわずかに異なるア
ミノ酸配列を有する天然タンパク質も包含する。対立遺伝子変異体は、上で挙げ
たものとはわずかに異なるアミノ酸配列を有するが、細胞のアポトーシスを阻害
するために必要な能力をなお有するであろう。

【００３８】 本明細書中で用いる「スルビビン系統のタンパク質」とは、ヒトに加え、生物
から単離されたスルビビンタンパク質を指す。スルビビン系統のタンパク質の他
のメンバーを特定および単離するために用いられる方法は、容易に利用すること
ができ、米国特許出願番号０８／９７５，０８０に記載されている。

【００３９】 本発明のアッセイまたは他の実施の形態で用いるスルビビンタンパク質は、好
ましくは単離された形態である。本明細書中で用いる場合、物理学的、機械的ま
たは化学的方法を用いて、スルビビンタンパク質と通常会合している細胞構成成
分からスルビビンタンパク質を除去する時、「タンパク質は単離された」と言う
。当業者は、標準的な精製法を容易に用いて、単離スルビビンタンパク質を得る
ことができる。

【００４０】 本発明の用いられるスルビビンタンパク質は、さらに、本明細書中に記載する
スルビビンの保存的変異体を包含する。「保存的変異体」は、ｐ３４^cdc2−サイ
クリンＢ１キナーゼ複合体およびカスパーゼ−９などのスルビビン結合パートナ
ーに結合する、および／または細胞のアポトーシスを阻害するスルビビンタンパ
ク質の能力に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の改変を指す。改変した配列が、
スルビビンタンパク質がスルビビン結合パートナーと会合することを妨げる、お
よび／またはスルビビンタンパク質またはスルビビンタンパク質が細胞のアポト
ーシスの阻害を妨げる時、「置換、挿入、または欠失がスルビビンタンパク質に
悪影響を及ぼす」と言う。例えば、スルビビンの総合的な電荷、構造または疎水
性／親水性特性は、スルビビンの活性に悪影響を及ぼすことなく変化させること
ができる。従って、スルビビンのアミノ酸配列を変化させて、スルビビンの活性
に悪影響を及ぼすことなく、例えば、ペプチドをより疎水性または親水性にする
ことができる。

【００４１】 対立遺伝子変異体、保存的置換変異体およびスルビビン系統のタンパク質のメ
ンバーは、細胞のアポトーシスを阻害する能力を保有する。こうしたタンパク質
は、ヒトスルビビン配列と通常は少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくと
も約８０％、さらにいっそう好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少
なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。本明細書において、こ
うした配列についての同一性またはホモロジーは、必要であれば最大のパーセン
トのホモロジーを達成するために、その配列を整列し、ギャップを導入して、お
よび相同であるような一切の保存的置換を含めた後に、既知のペプチドと同一で
ある候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。Ｎ−末端、
Ｃ−末端または内部伸張、欠失、またはペプチド配列への挿入は、ホモロジーに
影響を及ぼすものとは解釈されないだろう。

【００４２】 上で用いたようなホモロジーまたは同一性は、配列類似性検索用に作成される
、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよ
びｔｂｌａｓｔｘ（Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．
Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００（１９９３）、参考文献とし
て完全に援用する）によって利用されるアルゴリズムを用いるＢＬＡＳＴ（基本
局所配列検索ツール）分析によって決定される。ＢＬＡＳＴプログラムによって
用いられるアプローチは、まず、問い合わせ配列とデータベース配列の間で類似
したセグメントを考慮し、次に、特定されるすべてのマッチの統計学的有意性を
評価し、最後に、前もって選択した有意性閾値を満たすマッチのみをまとめるも
のである。配列の類似性検索用データベースにおける基本的な問題の論議につい
ては、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：１１９−１
２９（１９９４））を参照のこと。この文献は参考文献として完全に援用される
。ｈｉｓｔｇｒａｍ、ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ、ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ、ｅｘ
ｐｅｃｔ（すなわち、データベース配列に対するマッチを報告するための統計学
的優位性閾値）、ｃｕｔｏｆｆ、ｍａｔｒｉｘおよびｆｉｌｔｅｒについての検
索パラメータは、デフォルト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌ
ａｓｔ、およびｂｌａｓｔｘによって用いられるデフォルトスコアリングマトリ
ックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２
）、参考文献として完全に援用する）である。ｂｌａｓｔｎについてのスコアリ
ングマトリックスは、Ｍ（すなわち、一対のマッチング残基についての報酬点）
のＮ（すなわち、マッチングしなかった残基についての罰点）に対する比率によ
って設定され、この場合、ＭおよびＮのデフォルト値は、それぞれ５および−４
である。

【００４３】 本発明は、スルビビン擬似体の使用も包含する。スルビビン擬似体は、スルビ
ビンペプチドの活性を模倣する化合物である。これらは、構造的にスルビビンペ
プチとに類似しているが、化学的に変性されたペプチド主鎖を有する。スルビビ
ン擬似体は、例えば：より経済的な製造；より大きな化学的安定性；薬理学的特
性（半減期、吸収性、力価、有効性など）の向上；特異性（例えば、広範囲の生
物学的活性）の変更；抗原性の低下；およびその他を含む、ポリペプチドの実施
形態を越える有意な利点を有する。

【００４４】 従って、本発明のスルビビンタンパク質には、Ａｍｂｒｏｓｉｎｉらの文献（
１９９７）に開示されているアミノ酸配列を有する分子；スルビビンタンパク質
の少なくとも約３、５、１０または１５以上のアミノ酸残基の連続配列を有する
それらの断片；アミノ酸残基がスルビビン配列のＮ−またはＣ−末端にまたはス
ルビビン配列内に挿入されているような配列のアミノ酸配列変異型；別の残基に
よって置換されているスルビビン配列のアミノ酸配列変異型、または上で定義し
たようなそれらの断片が挙げられる。考慮される変異型には、さらに、例えば、
相同組換え、特定部位のまたはＰＣＲ突然変異誘発による所定の突然変異体；他
の動物（ウサギ、ラット、マウス、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、およびヒト以外
の霊長類を含むが、それらに限定されない）の対応するスルビビンタンパク質；
スルビビン系統のタンパク質の対立遺伝子または他の天然変異体；およびスルビ
ビンタンパク質が、置換、化学的手段、酵素的手段、または天然アミノ酸以外の
成分（例えば、酵素または放射性同位元素などの検出可能な成分）を用いる他の
適する手段によって共有結合修飾された誘導体を含むものが挙げられる。組換え
スルビビンタンパク質を用いて、２Ｄ−ＮＭＲ、円偏光二色性およびＸ線結晶学
によってスルビビンの分子構造を解明することもでき、こうして、特定部位の突
然変異誘発アプローチおよび特異的小分子阻害剤の合理的設計を組み入れること
ができる。

【００４５】 本明細書中で用いる用語「カスパーゼ−９」は、リン酸化スルビビンと相互作
用するあらゆるカスパーゼ−９を包含する。この用語は、カスパーゼ−９の活性
化形、カスパーゼ−９の天然対立遺伝子変異体、異なる供給源から単離した天然
カスパーゼ−９タンパク質、スルビビンと相互作用するカスパーゼ−９の変異体
、およびスルビビンと相互作用するカスパーゼ−９の断片を包含する。本明細書
中で用いる「プロカスパーゼ−９」は、カスパーゼ−９のプロフォームを指す（
Ｚｏｕ，Ｈ．ら、１９９９を参照のこと）。

【００４６】 本明細書中で用いる用語「ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体」は、
ｐ３４^cdc2とサイクリンＢ１キナーゼを含む複合体を指す。用語「ｐ３４^cdc2」
は、サイクリンＢ１と複合体を形成するあらゆるｐ３４^cdc2タンパク質を包含し
、得られる複合体は、スルビビンをリン酸化し、スルビビンと結合する。この用
語は、ｐ３４^cdc2の天然対立遺伝子変異体、異なる供給源から単離される天然ｐ
３４^cdc2タンパク質、スルビビンと相互作用するｐ３４^cdc2の変異体、およびス
ルビビンと相互作用するｐ３４^cdc2の断片を包含する。用語「サイクリンＢ１」
は、ｐ３４^cdc2と複合体を形成するあらゆるサイクリンＢ１タンパク質を包含し
、得られる複合体は、スルビビンをホスホリル化し、スルビビンに結合する。こ
の用語は、サイクリンＢ１の天然対立遺伝子変異体、異なる供給源から単離され
る天然サイクリンＢ１、タンパク質、スルルビンと相互作用するサイクリンＢ１
の変異体、およびスルビビンと相互作用するサイクリンＢ１の断片を包含する。

【００４７】 本発明のアッセイは、スルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合
体の結合またはスルビビンのカスパーゼ−９への結合をモニターする大量処理ア
ッセイを含む利用可能なあらゆる方式で修正または準備することができる。化合
物のライブラリを試験する多数の薬品スクリーニングプログラムでは、所定の時
間内に調査する化合物の数を最大にするために大量処理アッセイが望ましい。精
製または半精製タンパク質を用いて誘導することができるような、無細胞系で行
われるアッセイは、多くの場合、「一次」スクリーンとして好まれ、これらは、
試験化合物によって媒介される分子ターゲットの変化を迅速に展開し、比較的容
易に検出することができるように作製することができる。さらに、試験化合物の
細胞の毒性および／またはバイオアベイラビリティーの影響は、一般に、インビ
トロ系では無視することができる、その代わり、本アッセイでは、例えば二分子
間の結合の阻害において明白であるような、その薬物の分子ターゲットに対する
影響に主として焦点を合わせている。

【００４８】 大量処理スクリーニングアッセイの実施の形態において、スルビビン、ｐ３４ ^cdc2 −サイクリンＢ１キナーゼ複合体およびカスパーゼ−９は、試験を受ける薬
剤の存在下および不在の状態で、マイクロタイタープレートのウエルに添加する
ことができる。市販されているカスパーゼ−９基質をウエルに加え、Ｑａｕｎら
、（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１０３７７−１０３７９また
はＳｔｅｎｎｉｃｋｅら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２５７
１９−２５７２３に記載されているような連続観測機器を用いて、前記基質の分
解または遊離を分析することができる。

【００４９】 大量処理スクリーニングアッセイのもう一つの実施の形態において、アッセイ
は、スルビビンのｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体に対する、または
スルビビンのカスバーゼ−９に対する競合または非競合的な結合を阻害する試験
化合物の能力を検出するように、組み立てることができる。複合体形成の阻害は
、多様な手法によって検出することができる。例えば、複合体形成の調節は、例
えば放射標識（例えば、³²Ｐ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃまたは³Ｈ）、蛍光標識（例えば、Ｆ
ＩＴＣ）、もしくは酵素標識したスルビビンなどの検出可能な標識スルビビンを
用いて、またはイムノアッセイによって、またはクロマトグラフ検出によって定
量することができる。

【００５０】 例示すれば、既知のＨ２受容体リガンドの結合を阻害する能力に基づき、Ｈ２
受容体拮抗物質（他の拮抗物質を含む）を検出するための、当該技術分野におい
て公知である多様な結合アッセイがある。一つの実施の形態において、Ｎｏｒｒ
ｉｓら（１９８５）Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎ １６：１７０によって記載さ
れたインビトロアッセイを用いて、Ｈ２受容体に結合する置換Ｎ−ヘテロ芳香族
化合物を点数付けすることができる（およびその後の生物学的アッセイにおいて
、その受容体の作用物質または拮抗物質としてさらに特性付けすることができる
）。詳細には、Ｎｏｒｒｉｓらのアッセイは、モルモット大脳皮質Ｈ２受容体に
結合する³Ｈ−チオチジンの阻害を検出する競合結合測定を利用している。

【００５１】 あるアッセイにおいて、結合を評価する受容体、それらのサブユニット、また
は他のターゲットタンパク質までもが、純粋または半純粋形態で提供さうる。典
型的には、これらの例には、タンパク質の一つを固定化して、タンパク質−タン
パク質複合体と非複合形態との分離を助長すること、ならびに、アッセイを自動
化できるようにすることが望ましいであろう。候補薬剤の存在下および不在の状
態での一つのタンパク質のもう一つのタンパク質への結合、例えば、スルビビン
のｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体への結合またはスルビビンのカス
パーゼ−９への結合は、反応体を収容するために適するあらゆる容器内で遂行す
ることができる。それらの例には、マイクロタイタープレート、試験管、および
微小遠心分離管が挙げられる。一つの実施の形態において、タンパク質がマトリ
ックスに結合することができるドメインを追加する融合タンパク質を提供するこ
とができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タ
ンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープ
レートに吸収させることができ、その後、残りの標識タンパク質（リガンド）お
よび試験化合物と混合する。その後、複合体形成を助長する条件の下でこの混合
物をインキュベートする。インキュベーション後、ビーズを洗浄して、一切の非
結合リガンドを除去し、直接、またはその後タンパク質／リガンド複合体を解離
させた後の上清中で、マトリックス固定化標識を測定することができる。適時、
複合体をマトリックスから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、ビー
ズ画分中に見出されるリガンドのレベルを、標準的な電気泳動手法を用いてゲル
から定量することができる。

【００５２】 マトリックス上にタンパク質を固定化するための他の方法も主題のアッセイに
用いるために利用することもできる。例えば、ビオチンおよびストレプトアビジ
ンのコンジュゲーションを利用して、いずれかのタンパク質を固定化することが
できる。当該技術分野において周知である手法（例えば、ビオチン化キット、Ｐ
ｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）を用いてビオチ
ン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）からビオチン化分子を調製し、
ストレプトアビジンをコーティングした９６ウエルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウエルに固定化することができる。あるいは、タンパク質
と反応性であるがリガンド結合に干渉しない抗体を前記プレートのウエルに誘導
体化し、重合チューブリンなどの第一タンパク質を抗体抱合によってウエルに捕
捉することができる。上記のように、リガンドおよび試験化合物の調製物を前記
プレートのタンパク質提供ウエル内でインキュベートし、前記ウエル内に捕捉さ
れたタンパク質／リガンド複合体の量を定量することができる。こうした複合体
を検出するための方法の例には、上記のものに加えて、リガンドと反応性の抗体
、またはタンパク質と反応性であり、リガンドとの結合と競合する抗体を用いる
複合体の免疫検出法が挙げられる。

【００５３】 本発明のアッセイは、二つのタンパク質の間の相互作用を検出するための、あ
らゆる利用可能なインビボベースのスクリーニングシステムも包含する。例えば
、一般に利用可能な遺伝子系は、いずれのタンパク質が既知タンパク質と相互作
用するかを迅速に検出し、タンパク質のいずれの領域が相互作用するかを決定し
、二つのタンパク質の間の相互作用を調節する薬剤を特定することができる。こ
うした系の一つは、二つのタンパク質を酵母内で発現させ、対象となるタンパク
質の一方をＤＮＡ結合ドメインに融合させ、対象となるタンパク質のもう一方を
転写活性ドメインに融合させる、ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔ
ｅｍである（Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５；Ｇｙ
ｕｒｉｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７５：７９１；Ｈａｒｐｅｒら（１９９３）
Ｃｅｌｌ ７５：８０５；Ｓｅｒｒａｎｏら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６６
：７０４；およびＨａｒｍｏｎら（１９９３）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．７：２
３７８）。

【００５４】 リン酸化スルビビンの量は、当業者によって日常的に実施される方法によって
定量することができる。一つのよく知られている方法は、放射標識、電気泳動お
よびシンチレーションカウンティングを利用する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてリ
ン酸化サンプルを電気泳動した後、ゲルをオートラジオグラフィーに付し、リン
酸化スルビビンを含むゲルバンドを切り出し、シンチレーションカウンター内に
入れて、リン酸化の量を測定する（米国特許第６，０２８，１７１号）。あるい
は、ＴＣＡを用いてリン酸化サンプルを沈降させ、シンチレーションカウンター
内でカウントする（米国特許第６，０２８，１７１号）。第二の周知の方法は、
リン酸化化合物を認識する抗体を用いる。実施例１は、Ｔｈｒ３４でリン酸化し
たスルビビンに特異的に結合する抗体の例を開示している。その抗体は、非リン
酸化スルビビンを認識しない。抗体を用いて、サンプルからリン酸化スルビビン
を直接免疫沈降させることができる。免疫沈降後、シンチレーションカウンター
内でサンプルをカウントすることができる。また、スルビビン抗体を用いる免疫
沈降、続いて、免疫沈降サンプルの電気泳動、ニトロセルロース上へのゲルのト
ランスファ、および抗体での免疫ブロットは、抗ホスホチロシン抗体を用いてリ
ン酸化化合物の量を定量するもう一つの方法である（米国特許第５，６３５，３
８８号）。さらに、リン酸化スルビビンの量は、定量デンシトメトリーによって
測定することができる。最近、Ａｎｇｅｌｅｓらは、比色読み出しで抗ホスホチ
ロシン抗体を用いる、または蛍光検出でランタニド（ユーロピウム）標識抗ホス
ホチロシン抗体を用いる新規リン酸化定量法を開発した（Ａｎｇｅｌｅｓら、Ａ
ｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（２０００），２７８（２）：９３）。さらに、リン酸
化スルビビンの定量は、マイクロタイタープレートを用いて行うことができる。

【００５５】 キナーゼアッセイは、スルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合
体との、またはスルビビンとカスパーゼ−９との結合を調節する薬剤のインビト
ロ検出のためのツールとして有用である。薬剤の存在下および不在の状態でのリ
ン酸化スルビビンの量によって、当業者は、その薬剤がスルビビンとｐ３４^cdc2 −サイクリンＢ１キナーゼ複合体との、またはスルビビンとカスパーゼ−９との
結合を阻害するかどうかを決定することができる。

【００５６】 上記アッセイは、Ｔｈｒ３４でスルビビンを脱リン酸化する薬剤をスクリーニ
ングするように修正することができる。これらの薬剤は、スルビビンのリン酸化
を解除し、カスパーゼとの抗アポトーシス複合体の形成を妨げる腫瘍サプレッサ
ーとして働くことが予想される。そのアッセイは、薬剤の存在下で脱リン酸化ス
ルビビンの量を検出または定量し、その薬剤が不在の状態でのものと比較するよ
うに標準的なインビトロキナーゼアッセイを修正することによって、行うことが
できる。スルビビンを脱リン酸化するタンパク質について可能性があるライブラ
リをスクリーニングすることができる。

【００５７】 Ｂ． アポトーシスアッセイ スルビビンのリン酸化、スルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複
合体との間の相互作用、またはスルビビンとカスパーゼ−９との間の相互作用を
調節する薬剤の特定における第二ステップとして、一次スクリーニングによって
特定された薬剤を、次に、その薬剤のアポトーシス活性を決定するためのアポト
ーシスアッセイにおいて評価することができる。以下の参考文献に例示されてい
るように、アポトーシスアッセイの特定の例は、当該技術分野において幅広く利
用可能である。

【００５８】 リンパ球におけるアポトーシスについてのアッセイは、 Ｌｉら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：４２９−４３１；Ｇｉｂｅｌｌ
ｉｎｉら（１９９５）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．８９：２４−３３；Ｍａｒ
ｔｉｎら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３３０−４２；Ｔｅｒａｉ
ら、（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．８７：１７１０−５；Ｄｈｅｉ
ｎら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４３８−４４１；Ｋａｔｓｉｋｉｓら
（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１５：２０２９−２０３６；Ｗｓｅｔｅ
ｎｄｒｏｐら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７５：４９７；およびＤｅＲｏｓｓ
ｉら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８：２３４−４４によって開示されて
いる。

【００５９】 繊維芽細胞におけるアポトーシスについてのアッセイは、Ｖｏｓｓｂｅｃｋら
（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６１：９２−９７；Ｇｏｒｕｐｐｉら
（１９９４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：１５３７−４４；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら（
１９９４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：２００９−１７；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら（
１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．，１３：３２８６−３２９５；およびＩｔｏｈら、（
１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１０９３２−７によって開示され
ている。

【００６０】 ニューロン細胞におけるアポトーシスについてのアッセイは、Ｍｅｌｉｎｏら
（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４：６５８４−６５９６；Ｒｏｓ
ｅｎｂｌａｕｍら（１９９４）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３６：８６４−８７０；
Ｓａｔｏら（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２５：１２２７−１２３４；
Ｆｅｒｒａｒｉら（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５１６：２８５７−２
８６６；Ｔａｌｌｅｙら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５８５：
２３５９−２３６６；Ｔａｌｌｅｙら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．１５：２３５９−２３６６；およびＷａｌｋｉｎｓｈａｗら（１９９５）Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：２４５８−２４６４によって開示されている。

【００６１】 昆虫細胞におけるアポトーシスについてのアッセイは、Ｃｌｅｍら（１９９１
）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１３３８−９０；Ｃｒｏｏｋら（１９９３）Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ：６７：２１６８−７４；Ｒａｂｉｚａｄｅｈら（１９９３）Ｊ．Ｎｅ
ｕｒｏｃｈｅｍ．６１：２３１８−２１；Ｂｉｒｎｂａｕｍら（１９９４）Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．６８：２５２１−８，１９９４；およびＣｌｅｍら（１９９４）Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：５２１２−５２２２によって開示されている
。

【００６２】 Ｃ． スルビビンのｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体との会合をブ
ロックする薬剤についての使用 発明の背景のセクションで提供したように、スルビビンは、細胞のアポトーシ
スを阻害する。スルビビンのリン酸化、スルビビンのｐ３４^cdc2−サイクリンＢ
１キナーゼ複合体との相互作用、またはスルビビンとカスパーゼ−９との相互作
用を低減またはブロックする薬剤を用いて、スルビビンの機能および活性に関係
する生物学的および病理学的プロセスを調節することができる。

【００６３】 詳細には、スルビビンによって媒介される生物学的または病理学的プロセスは
、スルビビンのｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体との相互作用、スル
ビビンのリン酸化、またはスルビビンとカスパーゼ−９との相互作用をブロック
する薬剤を被験者に投与することによって、調節することができる。

【００６４】 本明細書中で用いる「被験者」とは、その哺乳動物にスルビビンによって媒介
される病理学的または生物学的プロセスの調節が必要である限り、あらゆる哺乳
動物であることができる。用語「哺乳動物」は、哺乳類に属する個体を意味する
。本発明は、特に、ヒト被験者の治療に有用である。

【００６５】 本明細書中で用いる「細胞のスルビビンのリン酸化、スルビビン／ｐ３４^cdc2 −サイクリンＢ１キナーゼ複合体またはスルビビン／カスパーゼ−９の相互作用
によって媒介される生物学的および病理学的プロセス」とは、スルビビンによっ
て媒介される多種多様な細胞の事象を指す。「病理学的プロセス」とは、有害作
用を生じる生物学的プロセスの一つのカテゴリーである。例えば、スルビビンに
よって媒介される病理学的プロセスは、腫瘍細胞における細胞のアポトーシスの
阻害である。この病理学的プロセスは、スルビビンのリン酸化、スルビビン／ｐ
３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体の結合、またはスルビビン／カスパー
ゼ−９の結合を低減またはブロックする薬剤を用いて調節することができる。

【００６６】 本明細書中で用いる場合、その薬剤が、そのプロセスの度合いまたは重度を軽
減するとき、「薬剤が、病理学的プロセスを調節する」と言う。例えば、その薬
剤が細胞分裂の速度または程度を低下させる時、「薬剤が、腫瘍細胞の増殖を調
節する」と言う。

【００６７】 Ｄ． スルビビン拮抗物質を用いて腫瘍の成長を抑制する方法 本明細書で用いる用語「スルビビン拮抗物質」は、スルビビンの発現またはス
ルビビンの活性を拮抗するあらゆる化合物を包含する。スルビビン拮抗物質の例
には、スルビビン突然変異体、スルビビン抗体、スルビビンアンチセンス核酸、
およびスルビビンの活性または発現を拮抗または阻害するあらゆる化合物が挙げ
られる。スルビビン拮抗物質の特定の例には、ドミナントネガティブスルビビン
突然変異体Ｔｈｒ³⁴→Ａｌａおよび特定の配列を有するスルビビンアンチセンス
核酸が挙げられるが、それらに限定されない。

【００６８】 アンチセンススルビビン分子は、スルビビン遺伝子（「センス遺伝子」）によ
ってコードされるＲＮＡと相補的であり、前記ＲＮＡとハイブリダイズすること
ができる。アンチセンススルビビン分子を用いて、スルビビン遺伝子の発現を阻
害し、それによって、腫瘍の成長を抑制することができ、腫瘍の成長に関連する
疾病を予防し、治療することができる。

【００６９】 アンチセンス核酸は、好ましくは、その補体、従って、これらのＤＮＡによっ
てコードされる各ＲＮＡの相補性を転写できるように、転写のための正常な表示
を基準としてセンス遺伝子のコーディング領域を逆転させることによって構成す
ることができる。センス遺伝子によって生産されるｍＲＮＡの生産を阻止するた
めに、アンチセンス核酸が細胞内で発現されることになる場合には、好ましくは
、アンチセンスＤＮＡがセンス遺伝子とほぼ同時に発現されるべきである。セン
ス遺伝子によってコードされるＲＮＡの機能をブロックするために、アンチセン
スＲＮＡが細胞内に存在しなければならないという意味で、それらのタイミング
は、近似していなければならない。この結果を達成するために、アンチセンスＤ
ＮＡのコーディング領域は、多くの場合、センス遺伝子において見られるものと
同じプロモータの制御下に置かれ、それによって、同時に両方が転写されること
となる。

【００７０】 設計の考察およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用の総説としては、Ｕ
ｈｌｍａｎｎらの文献（１９９０）およびＭｉｌｌｉｇａｎらの文献（１９９３
）を参照のこと。本明細書には、これらの文献の開示を参考文献として援用する
。

【００７１】 原則として、スルビビン遺伝子のいずれかの領域に対して相補的な配列を有す
るアンチセンス核酸は、本発明の腫瘍成長抑制法に有用であり得るが、翻訳開始
コドンを含むスルビビン ｍＲＮＡの転写部分に対して相補的な核酸分子が、特
に好ましい。翻訳開始コドンから上流（５’方向）に約４０ヌクレオチドまたは
下流（３’方向）に約４０ヌクレオチドの範囲内にあるスルビビン ｍＲＮＡ転
写位置に対して相補的な核酸分子も好ましい。

【００７２】 もう一つの実施形態において、細胞内の少なくともスルビビン ｍＲＮＡの位
置に対してハイブリダイズまたはアニールするアンチセンスオリゴヌクレオチド
を本発明の方法に用いることができる。こうしたオリゴヌクレオチドは、典型的
に、長さが短く、細胞に相当容易に拡散しうる。こうしたアンチセンスオリゴヌ
クレオチドには、２’−デオキシ−Ｄ−リボースを含むポリデオキシヌクレオチ
ド、Ｄ−リボースを含むポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基の
Ｎ−グリコシドである他のあらゆるタイプのポリヌクレオチド、またはポリマー
が、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるような塩基対合および塩基の積み重ねを可能
ならしめる立体配置でヌクレオチドを含むことを条件として、非ヌクレオチド主
鎖（例えば、タンパク質核酸および市販の合成配列特異的核酸ポリマー）もしく
は非標準的結合を含む他のポリマーが挙げられるが、それらに限定されない。こ
れらには、２本および１本鎖ＤＮＡ、ならびに２本および１本鎖ＲＮＡ、および
ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドが含まれ、およびポリヌクレオチドもしくはオリゴ
ヌクレオチドの非修飾形態はもちろん、既知のタイプの修飾、例えば、当業者に
知られている標識、「キャップ」、メチル化、類似体での一つ以上の天然ヌクレ
オチドの置換、例えば、非荷電結合を有するもの（例えば、ホスホン酸メチル、
ホスホロトリエステル、ホスホラアミデート、カルバメートなど）および荷電結
合または硫黄含有結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジ
チオエートなど）、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害因子、
トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなどを含む）および糖類
（例えば、単糖類）などのペンダント部分を含むもの、インターカレーター（例
えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレート化剤（例えば、金属
、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）を含有するむもの、アルキル化剤を含
むもの、修飾結合を有するもの（例えば、α−アノマー核酸など）などのヌクレ
オチド間修飾も含まれる。

【００７３】 スルビビンアンチセンス核酸分子に関連して用いられる用語「ヌクレオシド」
、「ヌクレオチド」および「核酸」には、既知プリンおよびピリミジン塩基ばか
りでなく、修飾されている他の複素環塩基も含有する部分も含まれる。こうした
修飾には、メチル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンおよびピリミジン
、または他の複素環が挙げられる。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドには、
例えば、一つ以上のヒドロキシル基がハロゲン、脂肪族基で置換されるか、また
はエーテル、アミンその他として官能化される糖部分に対する修飾も含まれる。

【００７４】 本発明は、スルビビン拮抗物質を腫瘍成長部位に投与することによって腫瘍成
長を抑制する方法を提供する。実施例に示すように、テトラサイクリン（ｔｅｔ
）調節性プロモータの制御下で、スルビビン拮抗物質、スルビビンアンチセンス
またはドミナントネガティブスルビビン突然変異体（Ｔｈｒ³⁴→Ａｌａ）で安定
にトランスフェクトしたＹＵＳＡＣ−２ヒト黒色腫細胞のサブクローンを作製し
た。これらのスルビビン拮抗物質を発現する細胞は、インビトロで自発性アポト
ーシスを被り、ＣＢ．１７マウスに皮下注射しても腫瘍を形成しなかった。確立
した腫瘍におけるスルビビンＴｈｒ³⁴→Ａｌａの発現は、黒色腫細胞において、
それらの成長を遅速させ、アポトーシスおよび異常有糸分裂進行をもたらした。
スルビビンをターゲットにすることによるアポトーシス経路の操作は、癌治療に
有益でありうる。本発明のスルビビン拮抗物質を用いて、癌の診断を受けた患者
を治療することができる。

【００７５】 Ｅ． スルビビン／ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体の相互作用お
よびスルビビン／カスパーゼ−９の相互作用を調節する薬剤の投与 スルビビンのリン酸化、スルビビン／ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複
合体の会合、またはスルビビン／カスパーゼ−９の相互作用をブロックする薬剤
などの本発明の薬剤は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、または
口腔内経路で投与することができる。あるいは、または同時に、投与は、経口経
路によることが可能である。投与される用量は、受容者の年齢、健康状態および
体重、もしあれば併用療法の種類、治療の頻度、および望まれる効果の性質に依
存するであろう。例えば、腫瘍細胞におけるアポトーシスに対するスルビビン阻
害をブロックする一つの手段として、スルビビンのリン酸化、スルビビン／ｐ３
４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体の会合をブロックする薬剤が、治療を受
ける個体に全身または局所投与される。下で説明するように、こうした薬剤を容
易に投与できるようにする多くの方法がある。

【００７６】 本発明は、さらに、スルビビンのリン酸化、スルビビン／ｐ３４^cdc2−サイク
リンＢ１キナーゼ複合体の会合、またはスルビビン／カスパーゼ−９の会合をブ
ロックする一つ以上の薬剤を含有する組成物を提供する。個々の要求は変化する
が、その組成物中の各成分の有効量の最適な範囲の決定は、当業者の裁量内であ
る。典型的な投与量は、０．１〜１００μｇ／（体重１ｋｇ）を含む。好ましい
投与量は、０．１〜１０μｇ／（体重１ｋｇ）を含む。最も好ましい投与量は、
０．１〜１μｇ／（体重１ｋｇ）を含む。

【００７７】 薬理学的に活性な薬剤に加え、本発明の組成物は、作用部位に送達するために
薬学的用いることができる、製剤への活性化合物の加工を助長する賦形剤および
添加剤を含む、適する薬学的許容されうる担体を含有することができる。非経口
投与に適する処方には、水溶性形態、例えば水溶性塩での活性化合物の水溶液が
挙げられる。さらに、適切な油性注射懸濁液のような活性化合物の懸濁液を投与
することができる。適する親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油、例えばゴマ
油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリ
ドが挙げられる。水性注射懸濁液は、その懸濁液の粘度を上げる、例えば、カル
ボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストラ
ンなどの物質を含有することができる。任意に、前記懸濁液は、安定剤も含有す
ることができる。リポソームを用いて、細胞に送達するための薬剤を内包するこ
ともできる。

【００７８】 本発明による全身投与用の製剤は、腸内、腸管外または局所投与用に処方する
ことができる。実際に、３タイプすべての処方を同時に用いて、有効成分の全身
投与を達成することができる。

【００７９】 経口投与に適する処方には、硬質または軟質ゼラチンカプセル、ピル、コーチ
ング錠を含む錠剤、エリキシル、懸濁液、シロップまたは吸入薬およびそれらの
制御放出形態が挙げられる。

【００８０】 本発明の方法の実施において、本発明の化合物は、単独で、または組み合わせ
て、すなわち、他の治療もしくは治療薬と組み合わせて用いることができる。あ
る好適な実施の形態において、本発明の化合物は、化学療法剤などの、一般に許
容される医療行為に従ってこれらの状態のために典型的に処方される他の化合物
と共に投与することができる。

【００８１】 Ｆ． スルビビン拮抗物質を送達する方法 核酸分子ではないスルビビン拮抗物質は、上のセクションＥで論議したように
ターゲット部位に送達することができる。核酸分子であるスルビビン拮抗物質は
、以下で論議するようにターゲット部位に送達することができる。

【００８２】 遺伝子療法は、機能的に活性な治療用または他の形態の遺伝子をターゲット細
胞に送達する方法である。体組織への遺伝子伝達の最初の努力は、ターゲット細
胞を体から除去し、組換え遺伝子を保持するベクターでトランスフェクトまたは
感染させて、再び体に移植する、エクスビボと呼ばれる間接的手段に頼っていた
。ＤＮＡを細胞にインビトロで伝達するために最近用いられる手法には、リン酸
カルシウム−ＤＮＡ沈降法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、エ
レクトロポレーション、リポソーム媒介ＤＮＡ伝達または組換えウイルスベクタ
ーでの形質導入が挙げられる。これらのトランスフェクションプロトコルを用い
て、上皮細胞（米国特許第４，８６８，１１６号；Ｍｏｒｇａｎら、１９８７）
、内皮細胞（ＷＯ９８／０５３４５）、肝細胞（Ｌｅｄｌｅｙら、１９８７；Ｗ
ｉｌｓｏｎら、１９９０）、繊維芽細胞（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９８８；米
国特許第４，９６３，４８９号）、リンパ球（米国特許第５，３９９，３４６号
；Ｂｌａｅｓｅら、１９９５）および造血幹細胞（Ｌｉｍら、１９８９；米国特
許第５，３９９，３４６号）を含む、異なる細胞タイプにＤＮＡを導入してきた
。

【００８３】 直接インビボ遺伝子導入は、リポソーム内（Ｌｅｄｌｅｙら、１９８７）、ウ
イルス外皮膜受容体タンパク質を含有するプロテオリポソーム内（Ｎｉｃｏｌａ
ｕら、１９８７）に捕捉されたＤＮＡの製剤を用いて、およびポリリジン−グリ
コプロテイン運搬複合体に結合したＤＮＡを用いて行われてきた。さらに、細胞
への遺伝子導入のために「遺伝子銃」が用いられてきた（オーストラリア特許第
９０６８３８９号）。最後に、裸のＤＮＡ、またはリポソームと会合したＤＮＡ
は、細胞へＤＮＡを導入するために間質腔に注射するための液状担体溶液に処方
することができる（ＷＯ９０／１１０９２）。

【００８４】 ウイルスベクターは、多くの場合、最も有効な遺伝子治療システムであり、組
換え複製欠陥ウイルスベクターは、エクスビボとインビボの両方で細胞を形質導
入する（すなわち、感染させる）ために用いられてきた。こうしたベクターには
、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベク
ターおよびヘルペスウイルスベクターが挙げられる。従って、一つの実施の形態
では、スルビビントランスジーンまたはスルビビンアンチセンス分子を適切なベ
クターにサブクローニングし、上で論議した遺伝子導入手法によって細胞または
組織に導入することができる。

【００８５】 もう一つの実施の形態では、望ましいポリヌクレオチドを含むカチオン性リポ
ソームなどのトランスフェクション促進組成物を用いて、スルビビンアンチセン
ス分子を細胞または組織に提供することができる。

【００８６】 Ｇ． 併用療法 本発明の薬剤およびスルビビン拮抗物質は、単独で、または特定の生物学的ま
たは病理学的プロセスを調節する他の薬剤と組み合わせて提供することができる
。例えば、スルビビン／ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体の会合、ス
ルビビンのリン酸化、またはスルビビン／カスパーゼ−９の相互作用を阻害する
本発明の薬剤は、癌細胞の増殖を制御するための方法において、抗癌剤と組み合
わせて投与することができる。同様に、スルビビン拮抗物質を抗癌剤と組み合わ
せて投与して、腫瘍の成長を抑制することができる。本明細書中で用いる場合、
二つの薬剤を同時に投与するか、または薬剤が同時に作用するような方法で別々
に投与する時、「二つの薬剤を組み合わせて投与する」と言う。

【００８７】 スルビビン活性の阻害は、通常の化学療法または抗脈管形成薬と組み合わせて
用いることができる。スルビビン活性を阻害する薬剤と組み合せてこうした薬剤
を用いるためのタイミングは、用いられる化学療法剤および治療される腫瘍細胞
のタイプに依存する。スルビビン活性を生じさせる薬剤と組み合わせて用いるこ
とができる化学療法剤の例には、シクロホスファミド（ＣＴＸ；シトキサン）、
クロラムブシル（ＣＨＬ；ロイケラン）、シスプラチン（ＣｉｓＰ；プラチノー
ル）、ブスルファン（マイレラン）、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）
、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、ミトマイシンＣ、お
よびこれらに類するアルキル化剤などのアルキル化剤；メトトリキセート（ＭＴ
Ｘ）、エトポシド（ＶＰ１６；ベピシド）、６−メルカプロプリン（６ＭＰ）、
６−チオグアニン（６ＴＧ）、シラタビン（Ａｒａ−Ｃ）、５−フルオロウラシ
ル（５ＦＵ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、およびこれらに類する代謝拮抗物質
などの代謝拮抗物質；アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（ＤＸＲ；アドリア
マイシン）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイ
シン、およびこれらに類する抗生物質などの抗生物質；ビンクリスチン（ＶＣＲ
）、ビンブラスチン、およびこれらに類するものなどのビンカアルカノイドのよ
うなアルカロイド；タキソールおよびタキソール誘導体、デキサメタゾン（ＤＥ
Ｘ；デカドロン）などのグルココルチコイドおよびプレドニゾンなどのコルチコ
ステロイドのような細胞増殖阻害剤、ヒドロキシ尿素などのヌクレオシド酵素阻
害剤、アスパラギナーゼなどのアミノ酸消耗酵素、およびこれらに類する多種多
様な抗腫瘍剤などの他の抗腫瘍剤が挙げられるが、それらに限定されない。

【００８８】 化学療法薬養生法における上記載細胞毒剤の使用は、一般に、癌治療の技術分
野においてよく特性付けられており、本願におけるそれらの使用は、寛容性およ
び有効性をモニターするため、および何らかの調整で投与経路および投与量を調
節するために同じ考慮のもとで行われる。例えば、細胞毒剤の実際の投与量は、
本組織培養法を用いて測定される患者の培養細胞応答に依存して変化しうる。一
般に、投与量は、スルビビンの活性／発現を生じさせる薬剤が不在の状態で用い
た量と比較して減少するであろう。

【００８９】 有効な細胞毒剤の典型的な投与量は、製造者によって推奨された、およびイン
ビトロ応答または動物モデルにおける応答によって示される範囲であることがで
き、約一桁の濃度または量までに減少させることができる。従って、実際の投与
量は、医者の判断、患者の状態、および初代培養された悪性細胞または組織培養
された組織サンプルのインビトロ応答性または適切な動物モデルにおいて観察さ
れた応答に基づく治療法の有効性に依存するであろう。

【００９０】 さらに説明しなくとも、当業者は、前の説明および以下の例示的な実施例を用
いて、本発明の化合物を製造、利用して、特許請求の範囲に記載の方法を実施す
ることができる。従って、以下の実施例は、本発明の好ましい実施の形態を特に
指摘するものであり、いかなる点においても残りの開示を制限するものと見なさ
れるべきではない。本願全体を通して引用するすべての論文、出版物、特許およ
び文献は、それらの全体が参考文献として、本明細書に援用される。

【００９１】

【実施例】

（材料および方法） 細胞系： 子宮頚癌ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ，Ｇｅｍｉｎ
ｉ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｌａｂａｓａｓ，ＣＡ）および抗生物質を
含有するＤｕｌｂｅｃｃｏの変性Ｅａｇｌｅ最小必須培地（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣ
Ｏ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で維持した。内在性スルビビ
ンを発現するＹＵＳＡＣ−２黒色腫細胞系は、以前に特性決定されている（Ｇｒ
ｏｓｓｍａｎら、１９９９）。４００μＭのミモシン（Ｇ１）、２ｍＭのチミジ
ン（Ｓ）または０．４μｇ／ｍＬのノコダゾール（Ｇ２／Ｍ）の存在下で、１６
時間、３７℃で培養することによって、報告されている（Ｌｉら、１９９８）よ
うに、細胞周期の同調化を行った。多様な条件のもとでの細胞周期停止を、ヨウ
化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによるＤＮＡ含量分析によって
確認した。

【００９２】 抗体： 野生型組換えスルビビンに対する親和カラム精製ウサギ抗体は、以前
に報告されている（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、１９９９）。報告されている（Ｌｉｅ
ら、１９９８）ように、抗スルビビン ｍＡｂ ８Ｅ２（ＩｇＧ１）を免疫蛍光
検査法に用いた。カスパーゼ−９に対するウサギ抗体（１：２０００希釈）およ
びカスパーゼ−８に対するウサギ抗体（１μｇ／ｍＬ）は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅ
ｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから購入した。ｐ３４^cdc2に対するウサギ抗体（
１〜１０μｇ／ｍＬ）およびＣｄｋ２に対するウサギ抗体（１０μｇ／ｍＬ）は
、Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡおよびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ
からそれぞれ購入した。ＨＡに対するラット抗体（０．１〜５μｇ／ｍＬ）は、
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからのも
のである。発表されているプロトコル（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、１９９９）に従っ
て、リン酸化Ｔｈｒ³⁴（^*）を含むスルビビンペプチド配列Ｌ²⁸ＥＧＣＡＣＴ^*Ｐ
ＥＲＭＡＥＡＧＦＩ⁴⁴（配列番号１）に対してウサギ抗体を作製した。一定量の
免疫血清を、４℃で一定攪拌のもと、セファロース２Ｂと共に一晩インキュベー
トすることによって、予備浄化して、親非リン酸化スルビビンペプチドＬ²⁸ＥＧ
ＣＡＣＴＰＥＲＭＡＥＡＧＦＩ⁴⁴（配列番号１）を含有するセファロースカラム
にかけ、非結合材料を、リン酸化Ｌ²⁸ＥＧＣＡＣＴ^*ＰＥＲＭＡＥＡＧＦＩ⁴⁴（
配列番号１）スルビビンペプチドカラムを用いてさらに親和カラム精製した。結
合免疫グロブリンを０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．５）で溶出し、中和して、Ｐ
ＢＳ（ｐＨ７．４）に一晩透析して、１０μｇ／ｍＬで免疫ブロット実験に用い
た。リン酸化スルビビンを認識する抗体は、本発明の方法に用いることができ、
スルビビンリン酸化の拮抗物質を用いる治療の有効性をモニターするために用い
てもよいし、または免疫組織化学法またはウエスタンブロット法によって腫瘍サ
ンプルなどの細胞サンプルにおいてリン酸化スルビビンを検出するために用いて
もよい。

【００９３】 オリゴヌクレオチド、プラスミドおよび組換えタンパク質： 製造者の仕様書に従って、Ｔｈｒ³⁴→Ａｌａ（Ｔ３４Ａ）置換を挿入したター
ゲティングオリゴヌクレオチド５’ＧＧＣＴＧＣＧＣＣＴＧＣｇＣＣＣＣＧＧＡ
ＧＣＧＧＡＴＧ３’（配列番号２）で、ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒシステム（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、野生型スルビビンｃＤＮＡの部位
特異的突然変異誘発（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉら、１９９７）を行った。抗生物質選
択後、変異プラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡシークエンスによって確認した。
スルビビン（Ｔ３４Ａ）ｃＤＮＡを、別途、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびｐＥＧＦＰｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｓ
ａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）ベクターのＨｉｎＤＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位
にも挿入した。野生型スルビビンおよびスルビビン（Ｔ３４Ａ）をコードするＨ
Ａ標識された構築体は、ＨＡ標識を含む５’−オリゴヌクレオチド５’ＣＣＣＡ
ＡＧＣＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＧＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＣＴＧＡＴＴＡＴＧＣＴＧ
ＧＴＧＣＣＣＣＧＡＣＧＴＴＧＣＣＣ３’（配列番号３）および３’−オリゴヌ
クレオチド５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＴＣＴＧ
３’（配列番号４、野生型スルビビン）または５’ＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＣ
ＡＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧ３’（配列番号５、スルビビン（Ｔ３４Ａ））を用い、
ＰＣＲによって得た。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ（５２２ｂｐ、
ＨＡ−スルビビン）またはＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ（４７３ｂｐ、ＨＡ−ス
ルビビン（Ｔ３４））のいずれかで消化し、ｐｃＤＭＡ３中で指向性クローニン
グして、ＤＮＡシークエンスによって確認した。ｐＥＧＦＰｃ１中の野生型スル
ビビン ｃＤＮＡは、以前に特性決定されている（Ｌｉら、１９９９）。

【００９４】 Ｍｅｔ¹−Ａｓｐ³³⁰をコードするカスパーゼ−９ ｃＤＮＡを、オリゴヌクレ
オチド（５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＧＡＴＣＧＧ３
’、配列番号６、順方向）および（５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＧＣ
ＴＧＧＴＣＧＡＡＧＧＴＣ３’、配列番号７、逆方向）を用いてＰＣＲによって
増幅させ、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化して、ｐＥＧＦＰｃ１中で指向性
クローニングし、ＤＮＡシークエンシによって確認した。オリゴヌクレオチド
５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＧＡＴＣＧＧ３’（配列
番号６、順方向）および５’ＧＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡＣＣｇｇｃＧＧ
ＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＧＣ３’（配列番号８、逆方向）で８９２ｎｔ
のカスパーゼ−９ ｃＤＮＡの５’産物を増幅すると共に、オリゴヌクレオチド
５’ＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣｇｃｃＧＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡ
ＧＡＡＡＧＡＣ３’（配列番号９、順方向）および５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡ
ＴＧＡＴＧＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＣＣ３’（配列番号１０、
逆方向）で４２２ｎｔの３’産物を増幅することによるオーバーラッッピングＰ
ＣＲによって、カスパーゼ−９ドミナントネガティブ突然変異体（Ｃｙｓ²⁸⁷→
Ａｌａ）を作製した。オリゴヌクレオチド ５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧ
ＧＡＣＧＡＡＧＣＧＧＡＴＣＧＧ３’（配列番号６、順方向）および５’ＣＧＧ
ＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＣＣ３’
（配列番号１０、逆方向）を用いて、ＰＣＲにより等濃度の各ゲル精製カスパー
ゼ−９断片を増幅した。１２７２ｎｔ ＰＣＲから得られた産物をＨｉｎｄＩＩ
Ｉ／ＥｃｏＲＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３またはｐＥＧＦＰｃ１中で指向性クロー
ニングして、ＤＮＡシークエンスによって確認した。すべてのプラスミドをイオ
ン交換クロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって
精製した。ｐＧＥＸ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）
中の野生型スルビビンまたはスルビビン（Ｔ３４Ａ）を、以前に報告されている
ように（Ｌｉら、１９９８）、ＢＬ２１ Ｅ．Ｃｏｌｉ中でＧＳＴ融合タンパク
質として発現させた。トロンビンを用いて一晩分解し、その後、１−Ｍ ベンズ
アミジン中で中和して、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で一晩透析することによって、組
換えタンパク質をＧＳＴフレームから遊離させた。カスパーゼ−８（Ｃ３６０Ｃ
）ドミナントネガティブ突然変異体（Ｂｏｌｄｉｎら、１９９６）は、Ｖ．Ｄｉ
ｘｉｔ博士（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）から
入手した。

【００９５】 トランスフェクション実験： 一過性トランスフェクションのために、Ｃ−６組織培養プレート（Ｃｏｓｔａ
ｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中、集密度〜６０から７０％でのＨｅＬａ細胞
を、１ｍＬの無血清ＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で２０分間インキュベートし、２．５μ
ｇの多様なプラスミド ｃＤＮＡおよび９μＬのリポフェクタミン（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でトランスフェクトした。３７℃で５時間インキュ
ベートした後、混合物をアスピレートし、４８から７２時間、完全増殖培地で置
換した。安定なＹＵＳＡＣ−２トランスフェクタントを作製するために、Ｔｅｔ
耐性オペロン（ＴｅｔＯ）の調節配列の下流のｐＴｅｔ−スプライスベクター（
Ｄ．Ｓｃｈａｔｚ博士，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｅＩ部位にスルビビン（Ｔ３４Ａ
）ｃＤＮＡを挿入した。１ｍＬのＯｐｔｉＭｅｍ中の０．８μｇのｐＴｅｔ−Ｔ
３４Ａ、０．８μｇのトランスアクチーベション／選択プラスミドｐｔＴＡ−Ｎ
ｅｏおよび５μＬのリポフェクタミンでＹＵＳＡＣ−２細胞をトランスフェクト
した。トランスフェクション４８時間後、１．５ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉ
ｎ（Ｇ４１８，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭの水酸化ナトリ
ウムおよび０．５μｇ／ｍＬのＴｅｔ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
（選択培地）を含有する増殖培地中で、細胞を低密度で１５×１５０ｍｍのプレ
ートに再びプレーティングした。培養３週間後、Ｔｅｔの存在下または不在の状
態での増殖差について、９６の個体のクローンをスクリーニングした。三つのク
ローンは、Ｔｅｔが不在の状態で増殖を示さず、それらのうちの一つ（Ｆ５．Ｃ
４）を限界希釈法により再びクローニングした。

【００９６】 フローサイトメトリー： 広範囲なカスパーゼ阻害因子Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（２０μＭ）の存在下または
不在の状態で種々のＧＦＰ構築体でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を４８時
間後に回収し（非接着および接着細胞）、ｐＨ７．０のＰＢＳ中で洗浄して、氷
を用いて３０分間、７０％冷エタノール中に固定した。ＰＢＳ中で洗浄後、細胞
（１０×１０⁶／ｍＬ）を２２℃で４５分間、２５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジ
ウム（Ｓｉｇｍａ）、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１００μｇ
／ｍＬのＲＮＡｓｅ Ａ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉ
ａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて染色した。Ｃｅｅｌ Ｑｕｅｓｔソフトウエ
アを用いるＦＡＣＳｏｒｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏ
ｓｅ，ＣＡ）を用いたフローサイトメトリーによって、ゲーテッドＧＦＰ発現細
胞をＤＮＡ含量について分析した。他の実験では、Ｔｅｔの存在下または不在の
状態で、１６時間３７℃で５ｍＭのチミジンを用いて培養することによって、Ｆ
５−Ｃ４細胞をＧ１／Ｓ境界で同調化した。インキュベーション終了時に、細胞
をチミジンブロックから遊離させて、ヨウ化プロピジウム染色およびフローサイ
トメトリーによるＤＮＡ含量分析のため、あるいはウエスタンブロット法（以下
参照）によるカスパーゼ−９処理のために、３時間間隔で回収した。

【００９７】 ＴＵＮＥＬ染色： Ｔｅｔの存在下または不在の状態でのＦ５．Ｃ４細胞のヌクレオソーム間ＤＮ
Ａ分断を、以前に報告された（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、１９９９）ように、Ａｐｏ
ｐＴａｇキット（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ，Ｐｕｒｃｈａｓｅ，ＮＹ）を用いて末端デ
オキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）およびペルオキシダーゼ抱合
抗ジゴキシゲニン抗体で末端標識することによって行った。

【００９８】 免疫沈降およびウエスタンブロット法： ３０分間、４℃で、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１％のＮＰ−４０、
０．２５％のＤＯＣ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍ
Ｌのアプロチン、１０μｇ／ｍＬのロイペプチン、１０μｇ／ｍＬのペプスタチ
ン、１ｍＭのＮａ₃ＶＯ₄、２０ｍＭのＮａＦ、０．２ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭの
ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する２００ｍＬの溶解バッファーにＨｅＬａ細胞
を溶解した。１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによって不溶性物
質を除去し、一定攪拌しながら３時間、４℃で、２５μＬの５０：５０プロテイ
ンＡセファローススラリー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、２００μｇのタン
パク質溶解産物を予備吸収させた。予備浄化溶解産物を、一定攪拌しながら４℃
で１６時間、ｐ３４^cdc2、Ｃｄｋ２またはＨＡに対する抗体と共に別々にインキ
ュベートした。４℃で２時間、５０μＬの５０：５０プロテインＡスラリーを添
加することによって、免疫複合体を沈降させ、３５０ｍＭのＮａＣｌ／溶解バッ
ファー中で三回洗浄し、さらに１５０ｍＭのＮａＣｌ／溶解バッファー中で三回
洗浄した。１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いる電気泳動法によっ
てサンプルを分離し、イモビロン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）にトラ
ンスファして、４℃で、１６時間、ＴＢＳとＴｗｅｅｎ−２０の中で、ｐ３４^{cd c2} に対する抗体（１μｇ／ｍＬ）、カスパーゼ−９、カスパーゼ−８、スルビビ
ン、またはＨＡに対する抗体（０．１μｇ／ｍＬ）と共に別々にインキュベート
した。洗浄後、化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって免疫反応性バンドを視覚
化しながら、トランスファ膜を、ＨＲＰ抱合抗マウス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、抗
ウサギ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、または抗ラット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）二次抗
体（１：２０００）と共に別々にインキュベートした。再プローブのために、膜
は、１００ｍＭの２−βメルカプロエタノール、２％のＤＳＤ、６２．５ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．７）中、５０℃で、３０分間ストリッピングした。
別の系列の実験では、集密度６０％のＨｅＬａ細胞をＨＡ−スルビビンまたはＨ
Ａ−スルビビン（Ｔ３４Ａ）でトランスフェクトし、８時間、３７℃で完全増殖
培地を補給した。１６時間、３７℃で２ｍＭのチミジンを用いて処理することに
よって、細胞をＧ１／Ｓ境界で同調化し、完全増殖培地中で解除して、上で説明
したような免疫沈降およびフローサイトメトリーによるＤＮＡ含量分析のために
漸増時間間隔で回収した。

【００９９】 スルビビンリン酸化およびインビトロキナーゼアッセイ： 指数増殖ＨｅＬａ細胞をＨＡ−スルビビンで一過的にトランスフェクトし、完
全ＤＭＥＭ中で４４時間、回復させた。１時間、３７℃で、細胞に無リン酸塩Ｄ
ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補給した。さらに５時間、３
７℃で、１０％の無リン酸塩血清の存在下で、２００μＣｉ／ｍＬ³²Ｐ_I（ＮＥ
Ｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．）を用いて細胞を
標識した。標識細胞を冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で２回洗浄し、溶解バッファー
に溶解して、ＨＡに対する抗体を用いて免疫沈降させ（上記参照）、その後、オ
ートラジオグラフィーに付した。インビトロキナーゼアッセイのために、バキュ
ロウイルス発現ヒトｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１またはＣｄｋ２−サイクリンＥ
キナーゼ複合体を、３０分間、３０℃で、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）
、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．５ｍＭのＤＴＴ、１０μＭのＡＴＰおよび１０μ
Ｃｉの³²Ｐ−ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含有する２５μＬの反応混合物中で
、１μｇのヒストンＨ１、６μｇの野生型スルビビンまたはスルビビン（Ｔ３４
Ａ）と共に、別々にインキュベートした。２５μＬの２ｘＬａｅｍｍｌｉサンプ
ルバッファの添加によって、反応を停止させた。５〜２０％のＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲルを用いてサンプルを電気泳動し、オートラジオグラフィーによって
リン酸化バンドを視覚化した。各キナーゼ反応において等しいタンパク質の使用
量をゲルのクマシーブルー染色によって確認した。

【０１００】 免疫蛍光検査法および共焦点顕微鏡検査法： 多様なＧＦＰ構築体でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を４８時間後に回収
し、２２℃で１０分間、０．２５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する４％
のｐ−ホルムアルデヒド中に固定した。６．５μｇ／ｍＬの４，６−ジアミジノ
−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ）、１６％のポリビニルアル
コール（Ａｉｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ａｌｌｅｎ
ｔｏｗｎ，ＰＡ）、および４０％のグリセロールを用いて細胞核を染色した。報
告されている（Ｌｉら、１９９９）ように、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡を用いて、Ｇ
ＥＰ発現細胞を、個々に、アポトーシスの核形態（染色質濃度、ＤＮＡ分断）に
ついて点数付けした。共焦点顕微鏡分析のために、光学グレードのカバーガラス
上にＨｅＬａ細胞を固定し、報告されている（Ｌｉら、１９９８）ように、スル
ビビンに対するｍＡｂ ８Ｅ２で、またはｐ３４^cdc2に対するウサギ抗体で標識
した。ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（スルビビン）およびＴｅｘａｓ Ｒｅ
ｄ（ＲＴ）抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ｐ３４^cdc2）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒ
ｏｂｅｓ，Ｊｕｎｃｔｉｏｎ Ｃｉｔｙ，ＯＲ）の添加によって、一次抗体の結
合を明らかにした。他の実験では、ＨｅＬａ細胞を、ＨＡ−スルビビン、ＨＡ−
スルビビン（Ｔ３４Ａ）、またはスルビビン（Ｌ６４Ａ）でトランスフェクトし
、ＨＡに対する抗体、ｍＡｂ ８Ｅ２（Ｌ６４Ａ）、またはカスパーゼ−９、続
いて、抗マウス（ＦＩＴＣ）または抗ウサギ（ＴＲ）抱合抗体をそれぞれ用いて
染色した。全ての実験に対して、非結合マウスまたはウサギを対照として使用し
た。Ｍｏｗｉｏｌ ４−８８（Ｈｏｅｃｈｓｔ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ／Ｍａｉｎ
，Ｇｅｒｍａｎｙ）に装着したカバーガラスを、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ
顕微鏡を用いて、または共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ Ｂｉｏ−Ｒａｄ
１０２４）によって分析した。ファイルをアセンブルし、ＡＤＯＢＥ Ｐｈｏ
ｔｏｓｈｏｐ ５．０を用いて印刷した。

【０１０１】 （実施例１） スルビビンのリン酸化 Ａ．ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１によるＴｈｒ³⁴でのスルビビンのリン酸化 スルビビンの一次配列を調べると、ｐ３４^cdc2のための潜在的リン酸化部位が
Ｔｈｒ³⁴と明らかになった（図１Ａ）。Ｃｌｕｓｔａｌ整列によって、ｐ３４^{cd c2} コンセンサスリン酸化配列Ｓ／Ｔ−Ｐ−Ｘ−Ｒ（配列番号１１；Ｈｏｌｍｅｓ
ａｎｄ Ｓｏｌｏｍｏｎ，１９９６）にマッチする領域Ｔ³⁴−Ｐ−Ｅ−Ｒ（配
列番号１１）は、ヒトおよびマウススルビビンにのみ見出され、多様な種からの
ＩＡＰタンパク質中には不在であった（図１ＡおよびＤｅｖｅｒａｕｘ ａｎｄ
Ｒｅｅｄ，１９９９）。インビトロキナーゼアッセイにおいて、バキュロウイ
ルス発現ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１は、組換え野生型スルビビンを容易にリン
酸化し、これに対して、Ｔｈｒ³⁴→Ａｌａの置換、すなわち、スルビビン（Ｔ３
４Ａ）は、ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１によるリン酸化を完全にやめさせた（図
１Ｂ）。対照実験において、バキュロウイルス発現Ｄｄｋ２−サイクリンＥは、
野生型スルビビンまたはスルビビン（Ｔ３４Ａ）をリン酸化しなかったのに対し
て、ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１またはＣｄｋ２−サイクリンＥは、ヒストンＨ
１を容易にリン酸化した（図１Ｂ）。リン酸化Ｔｈｒ³⁴（Ｔ^*）を含むスルビビ
ンペプチド配列Ｌ²⁸ＥＧＣＡＣＴ^*ＰＥＲＭＡＥＡＧＦＩ⁴⁴（配列番号１）に対
してウサギ抗体を作製し、連続的に、非リン酸化／リン酸化ペプチド−セファロ
ースカラムを用いて親和カラム精製して、免疫ブロット法に用いた。リン酸化Ｔ
ｈｒ³⁴に対する抗体は、ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１によるインビトロでのリン
酸化後には野生型スルビビンを認識したが、ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１とのイ
ンキュベーション後には非リン酸化スルビビンまたはスルビビン（Ｔ３４Ａ）を
認識しなかった（図１Ｃ）。対照的に、スルビビンに対する抗体（Ｇｒｏｓｓｍ
ａｎら、１９９９）は、ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１媒介リン酸化を伴う、また
は伴わない野生型スルビビンまたはスルビビン（Ｔ３４Ａ）を見分けがつかない
ほど認識した（図１Ｄ）。他の実験において、ＨＡ標識スルビビンをＨｅＬａ細
胞内でトランスフェクトし、³²Ｐｉオルトリン酸塩で代謝標識した。ＨＡに対す
る抗体での免疫沈降は、インビボで１６．５ｋＤａ スルビビンの顕著なリン酸
化を示したのに対し、対照の非結合抗体は、ＨｅＬａ細胞からの放射標識バンド
を免疫沈降しなかった（図１Ｄ）。

【０１０２】 Ｂ．スルビビンとｐ３４^cdc2の間の物理的会合 Ｇ１、Ｓ，またはＧ２／Ｍで停止させたＨｅＬａ細胞を清浄溶解し、ｐ３４^{cd c2} に対する抗体を用いて免疫沈降させた。Ｇ２／Ｍ停止ＨｅＬａ細胞からのｐ３
４^cdc2免疫沈降物のウエスタンブロット法は、会合した１６．５ｋＤａ スルビ
ビンの存在を示し、これは、非同調増殖培養物と比較して有糸分裂細胞が豊富で
あった（図２Ａ）。対照的に、Ｇ１−またはＳ−停止培養物からのｐ３４^cdc2免
疫沈降物では、スルビビンバンドは、免疫ブロットされなかった（図２Ａ）。ス
ルビビンのｐ３４^cdc2リン酸化の特異性（図１）と一致して、Ｇ１−，Ｓ−また
はＧ２／Ｍ−同調化ＨｅＬａ細胞からのＣｄｋ２免疫沈降物は、ウエスタンブロ
ット法によると、１６．５ｋＤａ スルビビンを含まなかった（図２Ａ）。相互
的な実験において、ＨＡ−スルビビンまたはＨＡ−スルビビン（Ｔ３４Ａ）は、
ウエスタンブロット法によると、顕著なｐ３４^cdc2バンドを含むＨｅＬａ細胞か
ら免疫沈降せず、従って、スルビビン−ｐ３４^cdc2の相互作用は、Ｔｈｒ³⁴とは
無関係であることが実証された。二重免疫蛍光標識および共焦点顕微鏡検査法に
よると、内在性ｐ３４^cdc2およびスルビビンは、前期および中期には有糸分裂紡
錐体微小管上に強く共局在化し、終期には中間体内に集中した（図２Ｃ）。

【０１０３】 （実施例２） アポトーシスのスルビビン調節 Ａ．リン酸化不能スルビビン（Ｔ３４Ａ）の発現によって誘導される自発性アポ
トーシス 外因性アポトーシス刺激が不在の状態で、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）
に融合させたスルビビン（Ｔ３４Ａ）でのＨｅＬａ細胞のトランスフェクション
によって、〜８０％のＧＦＰ発現細胞において自発染色質凝縮およびＤＮＡ分断
が生じた（図３Ａ、Ｂ）。同様の結果が、ＧＦＰ−カスパーゼ−９（Ｍｅｔ¹−
Ａｓｐ³³⁰）のトランスフェクションで得られたのに対し、ＧＦＰベクターまた
は野生型スルビビンの発現は、ＨｅＬａ細胞の核形態に作用しなかった（図３Ａ
、Ｂ）。ＨｅＬａ細胞における多様な構築体の同等の発現が、ＧＦＰ発現個体群
に対するゲーティングによるフローサイトメトリーによって確認された（図示せ
ず）。他の実験では、ＧＥＰ−スルビビン（Ｔ３４Ａ）の発現の結果、広範囲な
カスパーゼ阻害因子、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによって逆行させた反応において、ヨ
ウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによる低二倍体（ｓｕｂ−Ｇ
１）ＤＮＡ含量を有するＨｅＬａ細胞が出現した（図３Ｃ）。β−チューブリン
に対する抗体でのＨｅＬａ細胞発現スルビビン（Ｔ３４Ａ）の免疫蛍光標識は、
多極性で肉眼的に異常な有糸分裂紡錐体の集合を特徴とする有糸分裂トランジシ
ョンの深在性異常調節を示した（図３Ｄ）。対照的に、野生型スルビビンでトラ
ンスフェクトしたＨｅＬａ細胞は、正常二極性紡錐体を形成した（図３Ｄ）。

【０１０４】 Ｂ．スルビビン（Ｔ３４Ａ）によって誘導されるアポトーシスは、有糸分裂と
同時に起きる。 内在性スルビビンを発現するＹＵＳＡＣ−２黒色腫細胞（Ｇｒｏｓｓｍａｎら
、１９９９）を安定にトランスフェクトして、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）調節
プロモータ（Ｔｅｔ−ｏｆｆシステム）（Ｓｈｏｃｋｅｔｔら、１９９５）の制
御のもとでスルビビン（Ｔ３４Ａ）を発現させた。三つの独立したトランスフェ
クトテッド細胞系からのＴｅｔの抜取り（Ｔｅｔ−）の結果、ウエスタンブロッ
ト法による〜１６．５ｋＤａ スルビビン（Ｔ３４Ａ）の強い誘導を生じたが、
Ｔｅｔ含有培養物（Ｔｅｔ＋）では生じなかった（図示せず）。スルビビン（Ｔ
３４Ａ）の誘導後、Ｔｅｔ細胞系は、ヨウ化プロピジウム染色およびフローサイ
トメトリーにより、有糸分裂（Ｇ２／Ｍ）細胞のほぼ完全な欠失、およびアポト
ーシス（ｓｕｂ−Ｇ１）ＤＮＡ含量を有する顕著な個体群の出現を示した（図４
Ａ）。対照的に、Ｔｅｔ＋系は、正常なＧ２／Ｍ ＤＮＡ含量を有し、アポトー
シス（ｓｕｂ−Ｇ１）画分の増加は示さなかった（図４Ａ）。一つのトランスフ
ェクトされたＹＵＳＡＣ−２細胞系（Ｆ５．Ｃ４）を、限界希釈法によって再び
クローニングし、その後の実験で用いた。真性アポトーシス形態（図２）と一致
して、Ｆ５．Ｃ４細胞系は、Ｔｅｇが不在の状態ではＴＵＮＥＬによるヌクレオ
ソーム間ＤＮＡ分断について強く標識されたが、Ｔｅｔの存在下ではされなかっ
た（図４Ｂ）。

【０１０５】 Ｔｅｔを伴い、または伴わずに、Ｆ５．Ｃ４細胞をＧ１／Ｓ境界で同調化し、
遊離させて、ヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによって３時
間間隔で細胞周期の移行をモニターした。Ｔｅｔの存在下（Ｔｅｔ＋）で、Ｆ５
．Ｃ４細胞は、細胞周期全体を通してアポトーシス（ｓｕｂ−Ｇ１）画分に有意
な変化を伴わず、チミジン遊離９時間後に第一有糸分裂に近づき、１５〜１８時
間までに細胞分裂を完了して、２１時間後に再びＧ１に入った（図４Ｃ）。Ｔｅ
ｔが不在の状態で、（Ｔｅｔ−）Ｆ５．Ｃ４細胞は、類似の細胞周期進行速度を
示した（図４Ｃ）。しかし、Ｔｅｔ−Ｆ５．Ｃ４細胞の有糸分裂への突入は、有
糸分裂全体を通しておよび後のＧ１ピークが相当減少する次の有糸分裂期におい
て着実に増加するｓｕｂ−Ｇ１ ＤＮＡ含量を伴うアポトーシス個体群の出現と
正確に一致した（図４Ｃ）。

【０１０６】 （実施例３） スルビビンおよびカスパーゼ−９ Ａ．スルビビン−カスパーゼ−９の相互作用のリン酸化依存性調節 有糸分裂時のスルビビンとターゲットカスパーゼ（類）の潜在的な会合を研究
した。トランフェクション２４時間後、ＨｅＬａ生細胞からのＨＡ−スルビビン
またはＨＡ−スルビビン（Ｔ３４Ａ）の免疫沈降物は、ウエスタンブロット法に
より、会合した〜４６ｋＤａプロフォームカスパーゼ−９の存在を示した（図５
Ａ）。対照的に、野生型スルビビンまたはスルビビン（Ｔ３４Ａ）の免疫沈降物
は、ウエスタンブロット法によると、上流の別のイニシエーター・カスパーゼ、
カスパーゼ−８を含まなかった（図５Ｂ）。共免疫沈降法およびウエスタンブロ
ット法の実験を、トランスフェクション後４８時間の接着または非接着、すなわ
ち有糸分裂／アポトーシスＨｅＬａ細胞から繰り返した。図５Ｃに示すように、
接着または非接着ＨｅＬａ細胞抽出物からのＨＡ−スルビビン免疫沈降物は、ウ
エスタンブロット法により、会合した〜３５ｋＤａ 活性カスパーゼ−９の存在
を明らかにした（図５Ｃ）。これらの免疫沈降物からの上清の分析は、接着細胞
からの抽出物において主４６ｋＤａプロフォームカスパーゼ−９バンドを、およ
び有糸分裂／アポトーシス抽出物において〜３５ｋＤａ活性カスパーゼ−９を明
らかにした（図５Ｃ）。対照的に、接着細胞、すなわちＨｅＬａ生細胞からのリ
ン酸化不能ＨＡ−スルビビン（Ｔ３４Ａ）の免疫沈降物は、ウエスタンブロット
法によると、ほとんど検出できない量の〜３５ｋＤａ活性カスパーゼ−９を含有
し、〜４６ｋＤａプロフォームカスパーゼ−９を含有しなかった（図５）。有糸
分裂／アポトーシスＨｅＬａ細胞抽出物を用いて同様の実験を繰り返したとき、
ＨＡ−スルビビン（Ｔ３４Ａ）の免疫沈降物は、ウエスタンブロット法によると
、会合したプロフォームバンドまたは活性カスパーゼ−９バンドを含まなかった
（図５Ｃ）。上で提供したデータと一致して、これらの免疫沈降からの上清は、
接着細胞において〜４６ｋＤａプロフォームカスパーゼ−９を、および有糸分裂
／アポトーシス抽出物において〜３５ｋＤａ活性カスパーゼ−９を含有した（図
５Ｃ）。Ｔｈｒ³⁴リン酸化が有糸分裂時に活性／プロフォームカスパーゼ−９に
ついてのスルビビンの認識に影響を及ぼすかどうかを決定するために、共免疫沈
降法およびウエスタンブロット法の実験を、細胞周期進行中に同調化したＨｅＬ
ａ細胞から行った。チミジン遊離後０または６時間の中期ＨｅＬａ細胞からの野
生型スルビビンまたはスルビビン（Ｔ３４Ａ）の免疫沈降物は、〜４６ｋＤａお
よび〜３５ｋＤａのプロフォーム／活性カスパーゼ−９バンドをそれぞれ含有し
ていた（図５Ｄ）。しかし、チミジン遊離の１２時間後、有糸分裂に入った同調
化ＨｅＬａ細胞において、ＨＡ−スルビビン免疫沈降物は、〜３５ｋＤａ活性カ
スパーゼ−９としか会合しなくなったのに対し、プロフォームと活性、両方のカ
スパーゼ−９バンドが、上清において検出された（図５Ｄ）。対照的に、有糸分
裂ＨｅＬａ細胞からのリン酸化不能スルビビン（Ｔ３４Ａ）の免疫沈降物は、関
係する上清中に蓄積した会合プロフォームまたは活性カスパーゼ−９バンドを含
有していなかった（図５Ｄ）。対照実験において、チミジン遊離の１２時間後、
同調化ＨｅＬａ細胞の有糸分裂への突入が、ＤＮＡ含量分析およびフローサイト
メトリーによって実証された（図示せず）。

【０１０７】 Ｂ．インビボでのスルビビン−カスパーゼ−９複合体のリン酸化依存性局在化 免疫蛍光検査法および共焦点顕微鏡検査法によると、ＨＡ−スルビビンおよび
ＨＡ−スルビビン（Ｔ３４Ａ）は、中期において、有糸分裂紡錐体微小管に結合
したＨｅＬａ細胞中でトランスフェクトし（図示せず）、後期において、内在性
スルビビンと見分けがつかないほど中間体内に蓄積された（図６Ａ、Ｂ）。ＨＡ
−スルビビントランスフェクト体において、カスパーゼ−９についての同時標識
は、終期の異なるステップでの中間体において分散した細胞質の反応性およびカ
スパーゼ−９のスルビビンとの顕著な共局在化を明らかにした（図６Ａ）。これ
は、上で提供した免疫沈降データと一致する。ＨＡ−スルビビン（Ｔ３４Ａ）で
トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞も、細胞質全体にわたってカスパーゼ−９に
ついての分散した標識を示した（図６Ｂ）。しかし、リン酸化不能ＨＡ−スルビ
ビン（Ｔ３４Ａ）の存在下では、カスパーゼ−９は、選択的に中間体へのその局
在化を喪失し、終期においてスルビビン（Ｔ３４Ａ）と共に会合しなかった（図
６Ｂ）。このことは、スルビビン（Ｔ３４Ａ）−活性カスパーゼ−９複合体の解
離と一致する（上記参照）。対照実験において、バイキュロウイルスＩＡＰ反復
（ＢＩＲ）、における別のスルビビン点突然変異体（Ｌｅｕ⁶⁴→Ａｌａ）は、ア
ポトーシスをもたらさず（図示せず）、終期において中間体内に内在性カスパー
ゼ−９と共に物理的に局在化した（図６Ｃ）。

【０１０８】 Ｃ．有糸分裂時のカスパーゼ−９依存性アポトーシスのチェックポイント 活性カスパーゼ−９がリン酸化不能スルビビン（Ｔ３４Ａ）によって誘導され
るアポトーシスに関与したかどうかを決定すること。ウエスタンブロット法によ
って、細胞周期同調化Ｔｅｔ−Ｆ５．Ｃ４のアポトーシスは、〜４６ｋＤａプロ
フォームカスパーゼ−９の時間依存性分解ならびに〜３５ｋＤａおよび〜３７ｋ
Ｄａ活性カスパーゼ−９バンドの生成と関係付けられた（図７Ａ）。Ｔｅｔ−Ｆ
５．Ｃ４細胞のアポトーシスの動態と一致して、活性カスパーゼ−９バンドの生
成は、チミジン遊離９時間後に始まり、有糸分裂に増加して、遊離２４時間後の
後期有糸分裂細胞において、〜４６ｋＤａプロフォームカスパーゼ−９バンドの
ほぼ完全な消失とともに、ピークに達した（図７Ａ）。ＴＮＦα／シクロヘキシ
ミドで処理したＨｅＬａ細胞では、見分けがつかないカスパーゼ−９分解の結果
が観察された（図７Ａ）。対照的に、Ｔｅｔ＋Ｆ５．Ｃ４細胞は、有糸分裂時に
〜４６ｋＤａ カスパーゼ−９のタンパク質分解性の分解を示さなかった（図７
Ａ）。他の実験において、カスパーゼ−９（Ｃ２８７Ａ）ドミナントネガティブ
突然異性体（Ｄｕａｎら、１９９６）でのＨｅＬａ細胞のトランスフェクション
は、エトポシドによって誘導される核分断およびクロマチン凝縮を阻害した（図
７Ｂ）。これは、以前の観察と一致する（Ｐａｎら、１９９８）。カスパーゼ−
９（Ｃ２８７Ａ）の発現は、スルビビン（Ｔ３４Ａ）によって誘導されるＨｅＬ
ａ細胞アポトーシスをベクター対照トランスフェクト体で観察されるバックグラ
ウンドレベルに逆行し（図７Ｂ）、中間体でのカスパーゼ−９と内在性スルビビ
ンとの共局在化を回復させた（図示せず）。対照実験において、ＨｅＬａ細胞の
カスパーゼ−８（Ｃ３６０Ｓ）ドミナントネガティブ突然変異体（Ｂｏｌｄｉｎ
ら、１９９６）でのコ・トランスフェクションは、スルビビン（Ｔ３４Ａ）によ
って誘導されるアポトーシスを減少させなかったのに対し、ＴＮＦα／シクロヘ
キシミドによって誘導される細胞死を完全に阻害した（図７Ｂ）、これは、以前
の観察と一致する（Ｂｏｌｄｉｎら、１９９６）。

【０１０９】 実施例１から３の結果は、スルビビン、癌において過発現される（Ａｍｂｒｏ
ｓｉｎｉら、１９９７；Ｖｅｌｕｌｅｓｃｕら、１９９９）ＩＡＰアポトーシス
阻害因子（Ｄｅｖｅｒａｕｘ ａｎｄ Ｒｅｅｄ，１９９９）が、サイクリン依
存性キナーゼ複合体、ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１（Ｎｕｒｓｅ，１９９４）と
物理的に会合し、Ｔｈｒ³⁴においてｐ３４^cdc2によってリン酸化されることを示
している。リン酸化不能スルビビン（Ｔ３４Ａ）突然変異体を発現する表現型の
細胞に基づき、Ｔｈｒ³⁴に対するリン酸化は、活性対プロフォームカスパーゼ−
９に対するスルビビンの親和性を切り換え、有糸分裂時にこの抗アポトーシス複
合体を安定化する（図１３）。逆に言えば、ｐ３４^cdc2によるスルビビンリン酸
化の喪失は、スルビビン−活性カスパーゼ−９複合体の解離、中間体からのカス
パーゼ−９の選択的異常局在化、および有糸分裂を通り抜ける細胞のカスパーゼ
−９依存性アポトーシスをもたらす（図１３）。

【０１１０】 (実施例４) スルビビンのリン酸化を調節する薬剤を特定する方法 スルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体との間の上記相互作
用によって、スルビビンのリン酸化を調節する薬剤を特定するためのアッセイを
開発することができる。こうしたアッセイは、共通のステップとして、薬剤の存
在下でスルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体とを接触させる
ステップおよびその薬剤が前記キナーゼ複合体によるスルビビンのリン酸化を調
節するかどうかを決定するステップを用いる。スルビビンのリン酸化を定量する
ためのあらゆる手段を用いることができる。

【０１１１】 一つの方式において、スルビビンのリン酸化を調節する薬剤の能力を検定する
。２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．５ｍＭの
ＤＴＴ、１０μＭのＡＴＰおよび１０μＣｉの³²Ｐ−ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
）を含有する２５μＬの反応混合物中、薬剤の存在下および不在の状態で、バキ
ュロウイルス発現ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体を、１μｇのヒス
トンＨ１、６μｇの野生型スルビビンと共に、３０℃で３０分間インキュベート
する。この二つの反応を、２５μＬの２ｘＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファーの
添加によって停止させる。リン酸化したスルビビンの量を定量するために、上記
サンプルを５から２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動にかけ
、リン酸化バンドをオートラジオグラフィーによって視覚化する。ゲルのクマシ
ーブルー染色によって、各キナーゼ反応において等しいタンパク質使用量を確認
する。次に、ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体によるスルビビンのリ
ン酸化を調節する薬剤の能力を、薬剤にさらしたサンプルにおけるリン酸化スル
ビビンの量または分量と、対照（薬剤にさらしていない）サンプル中のリン酸化
スルビビンの量または分量とを比較することによって決定する。リン酸化スルビ
ビンの量は、スルビビンゲルバンドを切り出すことによって定量し、シンチレー
ションカウンターでカウント（計数）する。リン酸化スルビビンの量は、定量デ
ンシトメトリーによって決定することもできる。

【０１１２】 （実施例５） スルビビン／ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体の会
合またはリン酸化スルビビン／カスパーゼ−９複合体の会合を調節する薬剤を特
定する方法 スルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体との間の、およびリ
ン酸化スルビビンとカスパーゼ−９との間の上記相互作用によって、スルビビン
と３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体の会合およびスルビビンとカスパー
ゼ−９の会合を調節する薬剤を特定するためのアッセイを開発することができる
。こうしたアッセイは、共通のステップとして、薬剤の存在下でスルビビンとｐ
３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体とを接触させるステップ、およびその
薬剤がスルビビンの前記キナーゼとの結合またはスルビビンとカスパーゼ−９と
の結合を調節かどうかを決定するステップを用いる。

【０１１３】 一つの方式において、スルビビン／ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合
体の会合を調節する薬剤の能力を検定する。非同調増殖ＨｅＬａ細胞を、スルビ
ビンをコードする核酸でトランスフェクトし、２４時間後に清浄溶解する。清浄
溶解細胞のサンプルの一つを試験薬剤とともにインキュベートする。第二のサン
プルは、いずれの試験薬剤ともインキュベートしない。サンプルを、ｐ３４^cdc2 に対する抗体を用いて免疫沈降させ、電気泳動法によって分離して、ナイロン膜
にトランスファし、ｐ３４^cdc2抗体で免疫ブロットする。その後、スルビビン／
ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体の相互作用を調節する薬剤の能力を
、その薬剤の存在下および不在の状態でのゲル上のｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１
キナーゼ複合体の位置を比較することによって、決定する。

【０１１４】 別法として、スルビビン／ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼを調節する薬
剤は、実施例４のもとで説明したものに類似したインビトロキナーゼアッセイを
用いることによって特定することができる。例えば、上記のリン酸化スルビビン
特異的抗体を用いることによってリン酸化スルビビンの量を決定すること、およ
び試験薬剤の存在下および不在の状態でリン酸化スルビビンの量を比較すること
によって、当業者は、その薬剤がスルビビンのリン酸化および／またはスルビビ
ンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼの間の相互作用を阻害するかどうかを
決定することができる。

【０１１５】 もう一つの方式において、リン酸化スルビビン／カスパーゼ−９の会合を調節
する薬剤の能力を検定する。２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭの
ＭｇＣｌ₂、０．５ｍＭのＤＴＴ、１０μＭのＡＴＰおよび１０μＣｉの³²Ｐ−
ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含有する２５μＬの反応混合物中で、バキュロウ
イルス発現ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体を、１μｇのヒストンＨ
１、６μｇの野生型スルビビンと共に３０℃で３０分間インキュベートする。反
応を停止させる。カスパーゼ−９および試験薬剤をそのサンプルに添加する。バ
キュロウイルス発現ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１およびスルビビンを含有する対
照サンプルには、カスパーゼ−９のみを添加する。その後、リン酸化スルビビン
とカスパーゼ−９の間の会合を検出する。例えば、カスパーゼ−９に対する抗体
を用いてサンプルを免疫沈降させ、電気泳動法によって分離して、ナイロン膜に
トランスファし、カスパーゼ−９抗体で免疫ブロットする。その後、スルビビン
／カスパーゼ−９の相互作用を調節する薬剤の能力を、その薬剤の存在下および
不在の状態でのゲル上のカスパーゼ−９の位置を比較することによって決定する
。

【０１１６】 （実施例６） ヒト黒色腫細胞に対するスルビビン拮抗物質の影響 内在性スルビビンを構成的に発現するＹＵＳＡＣ−２ヒト黒色腫細胞（Ｇｒｏ
ｓｓｍａｎら、１９９９ｂ）を、テトラサイクリン（ｔｅｔ）調節（「ｔｅｔ−
オフ」）プロモータ系（Ｓｈｏｃｋｅｔｔら、１９９５）の制御のもとで、スル
ビビン拮抗物質を用いて安定にトランスフェクトした。

【０１１７】 オリゴヌクレオチド５’ＧＧＣＴＧＣＧＣＣＴＧＣｇＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＧ
ＡＴＧ３’（配列番号２）および製造者の指示書に従ってＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ
システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、部位特異的突然
変異誘発により、Ｔｈｒ³⁴→Ａｌａ突然変異を１．６ｋｂヒトスルビビンｃＤＮ
Ａに導入した（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉら、１９９７）。この突然変異体を、他のス
ルビビンＢＩＲドメイン突然変異体と共に、報告されている（Ｌｉら、１９９８
）ように一過性トランスフェクション基づく自発性アポトーシスを誘導する能力
によって、ドミナントネガティブ機能について評価し、特に有効であることがわ
かった。Ｔｈｒ³⁴→Ａｌａ突然変異を含むスルビビンｃＤＮＡを、ｐＴｅｔスプ
ライスのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓｐｅ１部位にクローニングした（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ，Ｌａ Ｊｌｌａ，ＣＡ）。アンチセンス構築体を作製するために、野生型
スルビビン ｃＤＮＡをｐＴｅｔスプライスに逆方向でクローニングした。

【０１１８】 これら二つのスルビビン拮抗物質は、ｔｅｔ耐性オペロン（ＴｅｔＯ）の調節
配列の下流でｐＴｅｔスプライスにクローニングした。プラスミドｐＴＡ−Ｎｅ
ｏは、ＴｅｔＯの下流のｔｅｔ調節トランスアクチベータ（ｔＴＡ）配列、およ
びネオマイシン耐性遺伝子を含む。このタンデムプラスミド系において、ｔｅｔ
は、ＴｅｔＯに対するｔＴＡの結合およびトランスジーンの転写を防止し、ｔｅ
ｔが不在の状態において、ｔＴＡは、その固有転写をアップレギュレートして、
トランスジーンを発現させる。

【０１１９】 １ウエルにつき、０．８μｇの拮抗物質ベクター、０．８μｇのｐＴＡ−Ｎｅ
ｏ、０．５μｇのｔｅｔ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、および５μ
ｇのリポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を同時に添加することによって、ＹＵＳＡＣ−２細胞（Ｇｒ
ｏｓｓｍｍａｎら、１９９９）を６ウエルのプレート内でトランスフェクトした
。９時間後、トランスフェクション培地をアスピレートし、０．５μｇ／ｍＬの
ｔｅｔを含有する標準培地で置換した。トランスフェクションの開始から４８時
間で、細胞をトリプシン処理し、洗浄して、１．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭの水酸化ナトリウムおよび０．５μ
ｇ／ｍＬのｔｅｔを含有する培地中、低濃度で、１５×１５０ｍｍのプレートに
、再びプレーティングした。この選択培地を６日ごとに交換し、三週間後、ｔｅ
ｔの存在下と不在の状態での増殖差に基づく拡大およびスクリーニングのために
、９６のコロニーをＵ底マイクロタイターウエルにトランスファした。ＢＩＲ突
然変異体トランスフェクテッドクローンのうち、三つはｔｅｔが不在の状態で増
殖せず、そのうち二つ（Ｆ５．Ｃ４およびＦ５．Ｅ５と呼ぶ）を限界希釈法によ
って再びクローニングした。アンチセンスでトランスフトされたクローンのうち
、一つ（Ｂ８と呼ぶ）だけがｔｅｔ依存性増殖を示した。細胞は、Ｇ４１８およ
びｔｅｔを含有する選択培地中で維持した。

【０１２０】 培地からｔｅｔを抜くと、Ｔｈｒ³⁴→Ａｌａ突然変異体でトランスフェクトし
たＹＵＳＡＣ−２サブクローンＦ５．Ｃ４は、ウエスタンブロット法により１６
．５ｋＤａ誘導スルビビンバンドを強く発現した（図８Ａ）。対照してみると、
ｔｅｔが培地中に存在した時、スルビビン発現の調節は観察されなかった（図８
Ａ）。Ｔｈｒ³⁴→Ａｌａ突然変異体でトランスフェクトしたもう一つのサブクロ
ーン、Ｆ５．Ｅ５は、同様に、ｔｅｔ調節性トランスジーン発現を実証した（図
示せず）。スルビビンアンチセンスでトランスフェクトしたサブクローンＢ８に
おいて、培地からのｔｅｔの除去は、ＲＴ−ＰＣＲによって評価されるように、
スルビビンアンチセンスＲＮＡの急速な発現と関連した（図示せず）。Ｔｈｒ³⁴ →Ａｌａ突然変異体またはスルビビンアンチセンスのｔｅｔ調節性発現の結果、
ヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリー（図８Ｂ、および図示なし
）によって評価されるように、有糸分裂（Ｇ２／Ｍ）細胞の進行時間依存性損失
および低二倍体（ｓｕｂ−Ｇ１）ＤＮＡ含量を有するアポトーシス細胞の一致し
た蓄積を生じた。Ｔｅｔ無摂取Ｆ５．Ｃ４細胞は、ＴＵＮＥＬによって、アポト
ーシス核形態を示し、ヌクレオソーム間ＤＮＡ分断について強く染色された（図
８Ｃ）。対照的に、ｔｅｔの存在下で培養したＦ５．Ｃ４細胞は、正常な有糸分
裂進行（図８Ｂ）およびＴＵＮＥＬ反応性の欠如（図８Ｃ）を実証した。

【０１２１】 （実施例７） ＣＢ．１７免疫不全マウスに対するスルビビン拮抗物質の影響 スルビビン拮抗物質の調節発現によるスルビビン機能の干渉が、ＣＢ．１７免
疫不全マウスにおける黒色腫腫瘍形成をブロックしうるかどうかを決定するため
に、マウスを皮下注射後８週間モニターし、腫瘍の測定を４週および８週の時点
で行った（表Ｉ）。ＹＵＳＡＣ−２細胞は、１〜３×１０⁶の細胞を皮下注射後
約３から４週間の、週齢６〜８歳の雌ＣＢ．１７ ＳＣＩＤ／ベージュマウス（
Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）に、局在性腫瘍を
一貫して形成することが測定された。４ヶ月までの間、動物をモニターし、死亡
率または著しい転移のいずれかを、増大する腫瘍サイズ（５０００ｍｍ³まで）
または腫瘍形成と関係づけた。注射の一日前、マウスの右側腹部を剃り、報告さ
れている（Ｓｈｏｃｋｅｔｔら、１９９５）ように、いつもの飲み水を、単独の
または１００μｇ／ｍＬのｔｅｔを含有する５％のスクロースに替えた。細胞は
、対数増殖期に回収し、ＰＢＳ中で２回洗浄して、ＰＢＳ中に再び浮遊させ（１
ｍＬあたり１２×１０⁶の細胞）、皮下注射した（０．２５ｍＬ、３×１０⁶の細
胞）。飲み水を２から３日ごとに交換した。腫瘍のサイズは、二つの垂直径と皮
膚表面上の高さとの積によって決定した。

【０１２２】 トランスフェクトされていないＹＵＳＡＣ−２細胞は、局在性小結性メラニン
欠乏性腫瘍を容易に形成し、腫瘍形成は、飲み水からのｔｅｔの追加または不在
による影響を受けなかった（図８）。組織分析によってＨＭＢ−４５、ヒト黒色
腫細胞のマーカーをポジティブに染色した大きな類上皮悪性細胞のシートが明ら
かとなった（図示せず；Ｋｉｋｕｃｈｉら、１９９６）。ＨＭＢ−４５抗体（Ｚ
ｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）は
、製造者の指示書に従って用いた。対照的に、ｔｅｔを飲み水から与えなかった
時、スルビビン Ｔｈｒ³⁴→ＡｌａでトランスフェクトしたＦ５．Ｃ４細胞は、
動物１５匹中１３匹（８７％）に腫瘍を形成しなかった（図８Ｄ、図Ｉ）。これ
らの動物は、さらに３ヶ月の観察期間の間、腫瘍がないままであった。ｔｅｔを
摂取していない動物に形成された腫瘍は、サイズが相当小さく、ｔｅｔを与えた
動物のものと比較して著しく遅延した発症が現れた（表Ｉ）。スルビビン Ｔｈ
ｒ³⁴→Ａｌａおよびスルビビンアンチセンスでそれぞれトランスフェクトしたサ
ブクローンＦ５．Ｅ５およびＢ８を注射した動物で同様の結果を得た（表Ｉ）。

【０１２３】 表Ｉ すべての動物についての腫瘍形成の概要 ＣＢ．１７マウスに細胞を注射し、ｔｅｔを飲み水から追加したかまたは与え
なかった。この「ｔｅｔ−オフ」プロモータ系において、トランスジーンは、ｔ
ｅｔが不在の状態でのみ発現さる。腫瘍発生率は、指示したように４および８週
で観察した動物について報告する。平均腫瘍サイズ（ｍｍ³）±標準偏差は、指
示した観察時点で腫瘍を形成していたマウスについてのみ書きとめた。トランス
フェクトされていないＹＵＳＡＣ−２細胞と比較してスルビビン拮抗物質サブク
ローンによって形成された腫瘍のサイズがわずかに小さいのは、プロモータ系の
なんらかの漏出または解明されていないトランスジーンインサーションの結果の
ためであろう。

【０１２４】

【表１】

【０１２５】 （実施例８） 確立腫瘍に対するスルビビン拮抗物質の影響 次に、確立腫瘍に対するスルビビン拮抗物質の影響を評価した。１５匹のマウ
スにＦ５．Ｃ４細胞を注射し、ｔｅｔを提供して、腫瘍を形成させた。腫瘍が現
われて（２０〜５０ｍｍ³）きたら、ｔｅｔを飲み水を与えず、腫瘍を５週間の
間モニターした。ｔｅｔを用いて維持した動物では、Ｆ５．Ｃ４腫瘍に匹敵する
速度で成長した腫瘍はなかった（図１０Ａ）。それよりは、ｔｅｔの投与を中止
した後、少しも成長しなかった幾つかの腫瘍で一定範囲の成長曲線を観察した（
図１０Ａ）。組織分析は、ＴＵＮＥＬによって、スルビビン Ｔｈｒ³⁴→Ａｌａ
の導入が、広範囲のネクローシスおよび顕著な細胞アポトーシスに関係付けられ
ることを示した。これは、これらの動物における腫瘍量の変化が実際の腫瘍成長
に反映されなかったことを示唆している。Ｆ５．Ｃ４腫瘍からのｔｅｔの撤回、
正常な有糸分裂像の欠如および異常有糸分裂の存在にも関係付けられた。これは
インビトロでのスルビビンのターゲティングに関連する有糸分裂進行の異常調節
と一致する（Ｌｉｅら、１９９８）。ｔｅｔが不在の状態で形成された二つの小
さなＦ５．Ｃ４腫瘍（表Ｉ）において、類似パターンのアポトーシス細胞死が見
られた（図示せず）。

【０１２６】 次に、インビボで観察される腫瘍の成長および生存性に対するこれらの影響が
、スルビビン Ｔｈｒ³⁴→Ａｌａのｔｅｔ調節性発現によって誘導される自発性
アポトーシスに起因するかどうかを決定した。細胞をこれらの腫瘍の幾つから再
び確立し、インビトロでのアポトーシスのｔｅｔ調節性導入について評価した。
腫瘍を外科手術によって摘出し、皮膚および皮下組織を切除した。次に、安全カ
ミソリの刃を用いて腫瘍を小片に切断し、ＰＢＳ中で激しく渦巻き攪拌すること
によって、解離させて単個細胞浮遊液にした。細胞をＰＢＳ中で二回洗浄し、Ｇ
４１８およびｔｅｔを含有する選択培地中に再び浮遊させて、２から３継代培養
した。培地からｔｅｔを除去した時にｔｅｔ応答性を保持したこれらの細胞は、
ＤＮＡ含量分析によって低二倍体（アポトーシス）細胞の発生に関係付けられた
（図１０Ｂ）。ｔｅｔ無摂取腫瘍における一部の生細胞の残存は、動物から完全
にｔｅｔを除去するおよびインビボで最大のトランスジーン発現を達成すること
が不可能であることを反映しうる。さらに、スルビビンの阻害は、細胞周期のＧ
２／Ｍ期の間の選択的作用をもたらすので非分割細胞を排除することができない
（Ｌｉら、１９９９）。

【０１２７】 上の実施例を参照しながら本発明を詳細に説明してきたが、本発明の精神から
逸脱することなく多様な修正を施すことができることが理解される。従って、本
発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ制限される。

【０１２８】 （追加参考文献） 以下の論文は、本明細書において、参考文献としてそれら全体が援用される。
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【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 スルビビンおよびＩＡＰタンパク質（配列番号１１〜２１）のクラスター整列
を示す図である（Ｔｈｒ³⁴でのスルビビンのｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１リン酸
化）。スルビビンにおけるＴｈｒ³⁴周辺のコンセンサスｐ３４^cdc2リン酸化配列
（Ｓ／ＴＰＸＲ／Ｋ、配列番号１１）を四角で囲まれている。

【図１Ｂ】 インビトロでのキナーゼアッセイを示す図である（Ｔｈｒ³⁴でのスルビビンの
ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１リン酸化）。野生型（ＷＴ）スルビビン、スルビビ
ン（Ｔ３４Ａ）（Ｔ３４Ａ）、または対照（Ｈ１）を、キナーゼバッファと１０
μＣｉγ−³²Ｐ−ＡＴＰの中で、３０分間、３０℃で、バキュロウイルス発現ｐ
３４^cdc2−サイクリンＢ１またはｃｄｋ２−サイクリンＥと共にインキュベート
した。ＳＤＳゲル電気泳動によってサンプルを分離し、オートラジオグラフィー
によって放射活性バンドを視覚化した。ゲルのクマシーブルー染色によって、等
しいタンパク質の使用量を確認した。

【図１Ｃ】 リン酸化スルビビンＴｈｒ³⁴に対する抗体との反応性を示す図である（Ｔｈｒ ³⁴ でのスルビビンのｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１リン酸化）。リン酸化Ｔｈｒ³⁴ （Ｔ^*）を含むスルビビンペプチド配列Ｌ²⁸ＥＧＣＡＣＴ^*ＰＥＲＭＡＥＡＧＦＩ ⁴⁴ （配列番号１）に対して作製された抗体でサンプルを免疫ブロットし、続いて
、非リン酸化／リン酸化ペプチド−セファロースカラム（α−ｐｈｏｓｐｈ．Ｔ
３４）を用いて親和カラム精製したこと、または組換えスルビビン（α−スルビ
ビン）（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、１９９９）に対して作製された抗体でサンプルを
免疫ブロットしたことを除き、キナーゼアッセイについての実験条件は、Ｂの場
合と同じである。

【図１Ｄ】 インビボでのスルビビンのリン酸化を示す図である（Ｔｈｒ³⁴でのスルビビン
のｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１リン酸化）。リン酸塩を含まないＤＭＥＭ媒質中
で、２００μＣｉ／ｍＬの³²Ｐｉで標識したＨＡ−スルビビンでＨｅＬａ細胞を
トランスフェクトし、オートラジオグラフィーによって放射活性バンドを視覚化
しながら、対照ＩｇＧまたは抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降させた。実験を少なく
とも三回繰り返して、比較可能な結果を得た。すべてのパネルについて、比分子
量マーカーを左側に示す。

【図２Ａ】 サイクリン依存性キナーゼの免疫沈降を示す図である（スルビビンとｐ３４^{cd c2} の間の物理的会合）。非同調増殖（Ａｓｙｎｃ．）またはＧ１、Ｓ、またはＧ
２／Ｍに同調したＨｅＬａ細胞を清浄溶解し、ｐ３４^cdc2（左のパネル）または
Ｃｄｋ２（右のパネル）に対する抗体を用いて免疫沈降させた。サンプルを電気
泳動にかけ、ナイロン３４膜へトランスファして、スルビビン、ｐ３４^cdc2また
はＣｄｋ２に対する抗体をそれぞれ用いて、別々に免疫沈降させた。

【図２Ｂ】 スルビビンの免疫沈降を示す図である（スルビビンとｐ３４^cdc2の間の物理的会
合）。非同調増殖ＨｅＬａ細胞をＨＡ−スルビビンまたはＨＡ−スルビビン（Ｔ
３４Ａ）でトランスフェクトし、ＨＡに対する抗体で免疫沈降させて、ｐ３４^{cd c2} またはＨＡに対する抗体で免疫ブロットしたことを除き、実験手順は、Ａの場
合と同じである。

【図２Ｃ】 インビボでのスルビビンとｐ３４^cdc2の共局在化を示す図である（スルビビン
とｐ３４^cdc2の間の物理的会合）。アセトン／メタノール中で光学グレードのカ
バーガラス上にＨｅＬａ細胞を固定して、スルビビンに対するｍＡｂ ８Ｅ２お
よびｐ３４^cdc2に対するウサギ抗体と共に同時にインキュベートし、その後、Ｆ
ＩＴＣ抱合ヤギ抗マウス抗体（スルビビン）およびＴＲ抱合ヤギ抗ウサギ抗体（
ｐ３４^cdc2）と共にインキュベートした。指示した細胞周期で、共焦点レーザー
走査顕微鏡によって画像を分析した。画像マージ分析を各パネルの右側に示す。
パネルＡおよびＢについては、比分子量マーカーを左側に示す。

【図３Ａ】 核の形態を示す図である（リン酸化不能スルビビン（Ｔ３４Ａ）の発現は、自
発性アポトーシスおよび有糸分裂の異常調節を誘導する）。ＧＦＰベクター（ベ
クター）、ＧＦＰ−スルビビン（Ｔ３４Ａ）（Ｔ３４Ａ）、またはＧＦＰ−カス
パーゼ−９（Ｍｅｔ¹−Ａｓｐ³³⁰）（カスパーゼ−９）でトランスフェクトした
ＨｅＬａ細胞を、４８時間後に、ＤＡＰＩ染色によって核の完全性について形態
学的に点数付けした。矢印：ＧＦＰ発現細胞における核分断および染色質凝縮。

【図３Ｂ】 スルビビン（Ｔ３４Ａ）の発現によって誘導されるＨｅＬａ細胞アポトーシス
の要約を示す図である（リン酸化不能スルビビン（Ｔ３４Ａ）の発現は、自発性
アポトーシスおよび有糸分裂の異常調節を誘導する）。実験手順は、Ａの場合と
同じである。データは、４つの独立した実験の平均±ＳＥＭである。

【図３Ｃ】 スルビビン（Ｔ３４Ａ）によって誘導されるカスパーゼ依存性アポトーシスを
示す図である（リン酸化不能スルビビン（Ｔ３４Ａ）の発現は、自発性アポトー
シスおよび有糸分裂の異常調節を誘導する）。２０μＭのカスパーゼ阻害因子、
Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋの存在下または不在の状態で、ＧＦＰ−スルビビン（Ｔ３４
Ａ）を用いてＨｅｌａ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション４８
時間後に、ヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによって、ゲー
テッドＧＦＰ発現細胞をＤＮＡ含量について分析した。ｓｕｂ−Ｇ１（低二倍体
）３５ＤＮＡ含量を有するアポトーシス細胞の百分率を示す。ＧＥＰベクタート
ランスフェクト体中のアポトーシスＨｅＬａ細胞は、８％であった。データは、
少なくとも三回の独立した測定のうちの一つの実験を表わす。

【図３Ｄ】 異常有糸分裂を示す図である（リン酸化不能スルビビン（Ｔ３４Ａ）の発現は
、自発性アポトーシスおよび有糸分裂の異常調節を誘導する）。野生型スルビビ
ン（ＷＴ）またはスルビビン（Ｔ３４Ａ）（Ｔ３４Ａ）でトランスフェクション
したＨｅＬａ細胞を微小管安定化バッファ（Ｌｉら、１９９８）中で固定し、β
−チューブリンに対するｍＡｂ ２０Ｃ６、続いて、ＦＩＴＣ抱合ヤギ抗マウス
ＩｇＧで標識した。図２Ｃで説明したように、共焦点顕微鏡によって像を分析し
た。

【図４Ａ】 ｔｅｔ調節ＹＵＳＡＣ−２トランスフェクト体を示す（スルビビン（Ｔ３４Ａ
）によって誘導されるアポトーシスは、有糸分裂と一致する）。ｐＴｅｔスプラ
イス中でスルビビン（Ｔ３４Ａ）で安定にトランスフェクションした３つのＹＵ
ＳＡＣ−２黒色腫細胞系を、Ｔｅｔの存在下（Ｔｅｔ＋）、または不在の状態（
Ｔｅｔ−）で、ヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによってＤ
ＮＡ含量について分析した。３７℃で立体培養後の、ｓｕｂ−Ｇ１（アポトーシ
ス）ＤＮＡ含量を有する細胞のパーセンテージを示す。

【図４Ｂ】 ＴＵＮＥＬ標識化を示す図である（スルビビン（Ｔ３４Ａ）によって誘導され
るアポトーシスは、有糸分裂と一致する）。末端デオキシリボヌクレオチドトラ
ンスフェラーゼ（ＴｄＴ）およびペルオキシダーゼ抱合抗ジゴキシゲニン抗体で
末端標識することによって、ＹＵＳＡＣ−２トランスフェクト体のサブクローン
、Ｆ５．Ｃ４をＴｅｔの存在下（Ｔｅｔ＋）、または不在の状態（Ｔｅｔ−）で
ヌクレオソーム間ＤＮＡ分断について分析したことを除き、実験条件は、Ａの場
合と同じである。

【図４Ｃ】 細胞周期分析を示す図である（スルビビン（Ｔ３４Ａ）によって誘導されるア
ポトーシスは、有糸分裂と一致する）。Ｆ５．Ｃ４細胞をＴｅｔの存在下（Ｔｅ
ｔ＋）、または不在の状態（Ｔｅｔ−）でＧ１／Ｓ境界で同調させ、解除して、
ヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによって３時間間隔でＤＮ
Ａ含量の変化を分析した。分析した各時点についてのｓｕｂ−Ｇ１（アポトーシ
ス）、Ｇ１、Ｓ、またはＧ２／Ｍ ＤＮＡ含量を有する細胞の百分率を示す。デ
ータは、少なくとも三回の独立した測定のうちの一つの実験を表わす。

【図５Ａ】 分裂間期細胞におけるスルビビン−プロフォームカスパーゼ−９のリン酸化非
依存性会合を示す図である（Ｔｈｒ³⁴リン酸化は、有糸分裂時にスルビビン−カ
スパーゼ−９の相互作用の特異性を変化させる）。非同調増殖ＨｅＬａ細胞をＨ
Ａ−野生型スルビビン（ＷＴ）またはＨＡ−スルビビン（Ｔ３４Ａ）（Ｔ３４Ａ
）でトランスフェクションし、２４時間後に清浄溶解して、ＨＡに対する抗体を
用いて免疫沈降し、続いて、カスパーゼ−９に対する抗体でウエスタンブロッテ
ィングした。矢印：〜４６ｋＤａプロフォームカスパーゼ−９の位置。

【図５Ｂ】 スルビビン−カスパーゼ−９相互作用の特異性を示す図である（Ｔｈｒ³⁴リン
酸化は、有糸分裂時にスルビビン−カスパーゼ−９の相互作用の特異性を変化さ
せる）。ＨＡ−スルビビンとＨＡ−スルビビン（Ｔ３４Ａ）免疫沈降物を、別々
に、カスパーゼ−８に対する抗体またはＨＡ．Ｓ、ＨＡ−スルビビン免疫沈降物
の上清を用いて免疫ブロットしたことを除き、実験条件は、Ａの場合と同じであ
る。矢印：〜５５ｋＤａプロフォームカスパーゼ−８の位置。

【図５Ｃ】 細胞周期におけるスルビビン−カスパーゼ−９の相互作用の調節を示す図であ
る（Ｔｈｒ³⁴リン酸化は、有糸分裂時にスルビビン−カスパーゼ−９の相互作用
の特異性を変化させる）。接着（Ａ）または非接着（Ｎ−Ａ）、すなわち有糸分
裂／アポトーシスＨｅＬａ細胞からの抽出物をトランスフェクションの４８時間
後に回収したことを除き、実験条件は、Ａの場合と同じである。免疫沈降物（ペ
レット、Ｐ）またはそれらの上清（Ｓ）の一定量をカスパーゼ−９またはＨＡに
対する抗体で免疫ブロットした。矢印：〜４６ｋＤａプロフォームカスパーゼ−
９および〜３５ｋＤａ活性カスパーゼ−９の位置。Ｗ：有糸分裂／アポトーシス
ＨｅＬａ細胞からの全抽出物。

【図５Ｄ】 有糸分裂時のスルビビン−活性カスパーゼ−９認識のリン酸化依存性調節を示
す図である（Ｔｈｒ³⁴リン酸化は、有糸分裂時にスルビビン−カスパーゼ−９の
相互作用の特異性を変化させる）。示したＨＡ構築体でＨｅＬａ細胞をトランス
フェクトし、チミジンで１６時間処理することによってＧ１／Ｓ境界に同調させ
て、解除した。多様な培養物の一定量を示した時間間隔でＨＡに対する抗体を用
いて免疫沈降させ、カスパーゼ−９に対する抗体またはＨＡ．Ｐ（ペレット）、
Ｓ（上清）で免疫ブロットした。すべてのパネルについて、分子量マーカー左側
に示す。すべてのパネルについて、実験を少なくとも二回繰り返し、比較可能な
結果を得た。

【図６Ａ】 スルビビン（Ｔ３４Ａ）の発現は、終期に中間体からカスパーゼ−９を異常局
在させることを示す図である。

【図６Ｂ】 スルビビン（Ｔ３４Ａ）の発現は、終期に中間体からカスパーゼ−９を異常局
在させることを示す図である。

【図６Ｃ】 スルビビン（Ｔ３４Ａ）の発現は、終期に中間体からカスパーゼ−９を異常局
在させることを示す図である。 ＨＡ野生型スルビビン（スルビビン）（Ａ）、スルビビン（Ｔ３４Ａ）（Ｂ）
、またはスルビビン（Ｌ６４Ａ）（Ｃ）でトランスフェクションしたＨｅＬａ細
胞をＨＡに対するｍＡｂ（Ａ，Ｂ）、またはｍＡｂ ８Ｅ２（Ｃ）およびカスパ
ーゼ−９に対するウサギ抗体で標識した。ＦＩＴＣ抱合ヤギ抗マウス抗体（スル
ビビン）またはＴＲ抱合抗ウサギ抗体（カスパーゼ−９）を添加することによっ
て一次抗体の結合を検出し、共焦点顕微鏡によって分析した。各パネルの右側に
個々の染色の画像マージ分析を示す。矢印：終期の中間体における野生型／突然
変異体スルビビンおよびカスパーゼ−９の局在化。実験を少なくとも四回繰り返
し、比較可能な結果を得た。

【図７Ａ】 有糸分裂時のカスパーゼ−９のタンパク質分解活性化を示す図である（細胞分
裂時のカスパーゼ−９依存性アポトーシスチェックポイント）。図４で説明した
ような特徴を有するＴｅｔ＋およびＴｅｔ− Ｆ５．Ｃ４細胞を、チミジン遊離
後、示した時間間隔で回収し、カスパーゼ−９に対する抗体で免疫ブロットした
。ＴＮＦ＋ＣＨＸ：１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαと１０μｇ／ｍＬのシクロヘキシ
ミドで処理したＨｅＬａ細胞の抽出物。矢印：〜４６ｋＤａのプロフォームカス
パーゼ−９バンド、ならびに〜３５ｋＤａおよび〜３７ｋＤａの活性カスパーゼ
−９バンドの位置。

【図７Ｂ】 スルビビン（Ｔ３４Ａ）によって誘導されるアポトーシスに対するカスパーゼ
−９（Ｃ２８７Ａ）ドミナントネガティブ突然変異体の影響を示す図である（細
胞分裂時のカスパーゼ−９依存性アポトーシスチェックポイント）。エトポシド
（１０μｇ／ｍＬ）またはＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍＬ）とシクロヘキシミド（１
０μｇ／ｍＬ）を有する、または有さない、示した多様な組み合わせのＧＦＰ構
築体でＨｅＬａをトランスフェクトし、４８時間後に回収して、図２Ｂで説明し
たようにＤＡＰＩ染色によってＧＥＰ標識細胞を核分断について形態学的に点数
付けした。ＤＮ：ドミナントネガティブ。データは、四回の独立した実験の平均
±ＳＥＭである。

【図８Ａ】 ｔｅｔ（０．５μｇ／ｍＬ）の存在下または不在の状態でＦ５．Ｃ４細胞を培
養し、示した時間間隔で回収したことを示す図である（スルビビンＢＩＲ突然変
異体、Ｆ５．Ｃ４細胞におけるアポトーシス、およびＣＢ．１７マウスにおける
腫瘍形成のＴｅｔ調節誘導）。説明されている（Ｇｒａｓｓｍａｎら、１９９９
）ように、溶解物を、スルビビン（上のパネル）またはβ−アクチン（下のパネ
ル）に対する抗体を用いてウエスタンブロットティングした。ＢＩＲ突然変異体
の大量発現を想定して、個別のバンドを視覚化するためにオートラジオグラフィ
ーの照射時間を制限した。非誘導（＋ｔｅｔ）細胞において、内在性野生型スル
ビビンタンパク質は、この照射レベルでは出現しなかったが、より長い照射時間
では出現した。

【図８Ｂ】 ｔｅｔの存在下または不在の状態で、示した時間間隔でＦ５．Ｃ４細胞を培養
し、非接着細胞と接着細胞の両方を回収したことを示す図である（スルビビンＢ
ＩＲ突然変異体、Ｆ５．Ｃ４細胞におけるアポトーシス、およびＣＢ．１７マウ
スにおける腫瘍形成のＴｅｔ調節誘導）。その後、細胞を固定し、透過性にして
、説明されているように（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、１９９９）ＤＮＡ含量のために
ヨウ化プロピジウムで染色した。マーカーは、アポトーシス細胞に対応するサブ
Ｇ１画分を示す。

【図８Ｃ】 ２％のゼラチン（Ｓｉｇｍａ）で処理したカバーガラス上にＦ５．Ｃ４細胞を
プレーティングし、ｔｅｔの存在下または不在の状態で、４８時間、インキュベ
ートしたことを示す図である（スルビビンＢＩＲ突然変異体、Ｆ５．Ｃ４細胞に
おけるアポトーシス、およびＣＢ．１７マウスにおける腫瘍形成のＴｅｔ調節誘
導）。細胞を１０分間、室温で、１％ｐ−ホルムアルデヒド中に固定し、その後
、５分間、−２００℃で、酢酸およびエタノールを用いて透過性にした。矢印は
、アポトーシス形態を有するＴＵＮＥＬ反応性（Ｓｈｏｃｋｅｔｔら、１９９５
）細胞を示す。

【図８Ｄ】 ＹＵＳＡＣ−２親細胞（３×１０⁶、上のパネル）またはスルビビン Ｔｈｒ^{3 4} →Ａｌａ突然変異体でトランスフェクトしたＦ５．Ｃ４細胞（下のパネル）を
ＣＢ．１７マウスに皮下注射し、示したように、飲み水からｔｅｔ（１００μｇ
／ｍＬ）を追加した（パネルの左側）、または与えなかった（パネルの右側）こ
とを示す図である（スルビビンＢＩＲ突然変異体、Ｆ５．Ｃ４細胞におけるアポ
トーシス、およびＣＢ．１７マウスにおける腫瘍形成のＴｅｔ調節誘導）。写真
は、注射の８週間後に撮影した代表的なものである。

【図９Ａ】 図１で説明したように行ったＤＮＡ含量分析を示す図である（スルビビンアン
チセンスでトランスフェクションしたサブクローンＢ８のインビトロでのキャラ
クタリゼーション）。

【図９Ｂ】 示したようにｔｅｔの存在下または不在の状態で培養した細胞のＲＴ−ＰＣＲ
分析を示す図である（スルビビンアンチセンスでトランスフェクションしたサブ
クローンＢ８のインビトロでのキャラクタリゼーション）。ＲＮＡは、ＴｒｉＴ
ｅａｇｅｎｔを用いて調製し、逆転写は、スルビビンセンスプライマーでプライ
ムした。

【図１０Ａ】 ｔｅｔを用いて飼われた５匹の動物におけるＦ５．Ｃ４腫瘍の成長（黒三角）
を示す図である（インビボでの確立腫瘍におけるスルビビンＢＩＲ突然変異体発
現の影響、およびインビトロで再確立した腫瘍系のＴｅｔ調節アポトーシス）。
誤差棒は、標準偏差を示す。腫瘍形成時（当日）にｔｅｔを与えなかった１５匹
の動物からの５つの代表的成長曲線（記号なし）も示す。

【図１０Ｂ】 代表的なＦ５．Ｃ４腫瘍を示す図である（インビボでの確立腫瘍におけるスル
ビビンＢＩＲ突然変異体発現の影響、およびインビトロで再確立した腫瘍系のＴ
ｅｔ調節アポトーシス）。ｔｅｔ除去後のＦ５．Ｃ４腫瘍をインビトロでＧ４１
８およびｔｅｔの存在下で拡大させて、７２時間培養した後、ｔｅｔの存在下（
上のパネル）または不在の状態（下のパネル）で、図１の場合のようにＤＮＡ含
量について試験した。 腫瘍を外科手術で摘出し、皮膚および皮下組織を切除した。次に、腫瘍を安全
かみそりの刃で小片に切断し、ＰＢＳ中で激しく渦攪拌することによって、解離
させて、単個細胞浮遊液にした。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、選択培地Ｇ４１
８およびｔｅｔ中に再浮遊させて、２〜３継代、培養した。

【図１１Ａ】 ＹＵＳＡＣ−２腫瘍の組織分析図である。

【図１１Ｂ】 ＹＵＳＡＣ−２腫瘍の組織分析図である。トランスフェクトしていないＹＵＳ
ＡＣ−２細胞によって形成された腫瘍を、（Ａ）ヘマトキシリンおよびエオシン
、ならびに（Ｂ）ＨＭＢ−４５抗体で染色した。

【図１２】 Ｆ５．Ｅ５細胞を有するＣＢ．マウスにおける腫瘍形成を示す図である。Ｆ５
．Ｅ５細胞（３×１０⁶、上のパネル）またはＢ８細胞（下のパネル）をＣＢ．
１７マウスに皮下注射し、飲み水からｔｅｔ（１００ｍｇ／ｍＬ）を追加した（
パネルの左側）か、または与えなかった（パネルの右側）。

【図１３】 細胞周期進行中のスルビビンの役割を表す略図である（細胞周期進行中のスルビ
ビンの役割の要約）。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ ４Ｈ０４５ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｆ Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 33/573 Ａ 33/573 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA13 BB03 BB20 DA15 DA20 DA36 DA37 FB01 FB08 4B063 QA18 QQ08 QQ27 QQ30 QQ36 QQ63 QR77 QS03 QS33 QX02 QX07 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AB02 CA24 CA44 4C084 AA13 AA17 BA19 CA59 DC32 MA52 MA55 MA66 NA14 ZB211 ZB261 ZC781 4C086 AA01 AA02 EA16 MA04 MA55 MA66 NA14 ZB21 ZB26 ZC78 4H045 AA10 AA11 AA30 BA09 CA40 DA75 EA20 EA28 EA50 FA72 FA74

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 スルビビンのリン酸化を調節する薬剤を特定する方法であっ
   て、 （ａ） 薬剤の存在下で、スルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ
   複合体をインキュベートするステップ；および （ｂ） 前記薬剤が、ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体によるスル
   ビビンのリン酸化を調節するかどうかを決定し、それによって、スルビビンのリ
   ン酸化を調節する薬剤を特定するステップ を含むことを特徴とする前記方法。
2. 【請求項２】 ステップ（ａ）が、ＡＴＰの存在下で行われる、請求項１に
   記載の方法。
3. 【請求項３】 前記ＡＴＰが放射標識されている、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 ステップ（ｂ）が、前記薬剤の存在下および前記薬剤が存在
   しない状態で、リン酸化スルビビンの量を定量することを含む、請求項１に記載
   の方法。
5. 【請求項５】 ステップ（ｂ）が、抗体を用いて、スルビビンのリン酸化を
   検出することを含む、請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記抗体がリン酸化Ｔｈｒを認識する、請求項５に記載の方
   法。
7. 【請求項７】 配列番号１に記載の配列を含み、リン酸化Ｔｈｒ³⁴（Ｔ^*）
   を含むスルビビンペプチドを用いて前記抗体を生成する、請求項５に記載の方法
   。
8. 【請求項８】 無細胞環境で、スルビビンおよびｐ３４^cdc2−サイクリンＢ
   １キナーゼ複合体を薬剤にさらす、請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 ステップ（ａ）が、スルビビンを発現する細胞とｐ３４^cdc2 −サイクリンＢ１キナーゼ複合体とを薬剤の存在下で、インキュベートすること
   を含む、請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記薬剤が、スルビビンポリペプチドまたはその小分子擬
    似体である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 【請求項１１】 薬剤が、スルビビンアミノ酸配列の３４位に対応するトレ
    オニンを含むスルビビンポリペプチドである、請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 スルビビンのリン酸化が、ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キ
    ナーゼ複合体とスルビビンの結合を含む、請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 スルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体
    との間の相互作用を調節する薬剤を有効量投与することを含む、スルビビンとｐ
    ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体の間の相互作用を調節する方法。
14. 【請求項１４】 スルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体
    の間の相互作用を調節する薬剤を有効量、細胞に投与することを含む、細胞のス
    ルビビン依存性アポトーシスを調節する方法。
15. 【請求項１５】 ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体によるスルビ
    ビンのリン酸化を調節する薬剤を有効量、細胞に投与することを含む、細胞のア
    ポトーシスを調節する方法。
16. 【請求項１６】 ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体によるスルビ
    ビンのリン酸化、またはｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合体へのスルビ
    ビンの結合を阻害することを含む、スルビビンによって媒介される病状の重度を
    低下させる方法。
17. 【請求項１７】 前記調節が、スルビビンとｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キ
    ナーゼ複合体の間の相互作用を阻害する薬剤を有効量、細胞に投与することを含
    む、請求項１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 リン酸化スルビビンとカスパーゼ−９の間の相互作用を調
    節する薬剤を特定する方法であって、 （ａ）スルビビンとカスパーゼ−９を薬剤の存在下でインキュベートするステ
    ップ；および （ｂ）前記薬剤がスルビビンとカスパーゼ−９の相互作用を調節するかどうか
    を決定し、それによって、リン酸化スルビビンとカスパーゼ−９の間の相互作用
    を調節する薬剤を特定するステップを含むことを特徴とする前記方法。
19. 【請求項１９】 スルビビンが、ｐ３４^cdc2−サイクリンＢ１キナーゼ複合
    体を用いてスルビビンをリン酸化することによって得られる、請求項１８に記載
    の方法。
20. 【請求項２０】 スルビビンとカスパーゼ−９の間の相互作用を調節する薬
    剤を、有効量投与することを含む、リン酸化スルビビンとカスパーゼ−９の間の
    相互作用を調節する方法。
21. 【請求項２１】 スルビビンとカスパーゼ−９の間の相互作用を調節する薬
    剤を有効量、細胞に投与することを含む、細胞におけるルビビン依存性アポトー
    シスを調節する方法。
22. 【請求項２２】 前記調節が、スルビビンとカスパーゼ−９の間の相互作用
    を阻害する薬剤を有効量、細胞に投与することを含む、請求項２１に記載の方法
    。
23. 【請求項２３】 カスパーゼ−９へのスルビビンの結合を阻害することを含
    む、スルビビンによって媒介される病状の重度を低下させる方法。
24. 【請求項２４】 有効量のスルビビン拮抗物質を腫瘍に投与することを含む
    、腫瘍の増殖を抑制する方法。
25. 【請求項２５】 前記スルビビン拮抗物質が、アンチセンススルビビン核酸
    またはスルビビン Ｔｈｒ³⁴→Ａｌａをコードする核酸である、請求項２４に記
    載の方法。
26. 【請求項２６】 前記腫瘍が哺乳動物に存在する、請求項２５に記載の方法
    。
27. 【請求項２７】 ３４位でリン酸化したスルビビンに結合する抗体。
28. 【請求項２８】 配列番号１に記載のアミノ酸を有し、リン酸化Ｔｈｒ³⁴（
    Ｔ^*）を含むペプチドを用いて前記抗体を生成させる、請求項２７に記載の抗体
    。
29. 【請求項２９】 単離された請求項２８に記載の抗体。