CN108187035B - E3连接酶fbw7在延缓衰老及相关疾病方面的医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供E3连接酶FBW7在制备抑制端粒损伤延缓衰老和防治衰老相关疾病的药物中的应用，所述FBW7的氨基酸序列如SEQID No.2所示。研究证明，敲除或RNA干扰抑制FBW7的基因表达，或表达FBW7基因突变体竞争性抑制FBW7蛋白，或过表达TPP1克服FBW7引起的降解作用，能够保护应激如辐射，博来霉素和双氧水引起的染色体端粒损伤，防止了TPP1在基础状态下或应激状态中降解，导致延长端粒长度的效果，增加了组织干细胞数量，改善基础状态下的肺呼吸功能，防止了应激状态下发生肺组织衰老及肺纤维化，可在制备防治端粒功能异常药物中的应用。本发明为抗衰老提供新思路和手段。

Description

E3连接酶FBW7在延缓衰老及相关疾病方面的医药用途

技术领域

本发明属于生物技术，涉及抑制FBW7蛋白表达的医药用途，具体涉及E3连接酶FBW7 在延缓衰老及相关疾病方面的医药用途。通过抑制FBW7蛋白保护其底物TPP1在制备延缓衰老、防治衰老相关疾病药物中的用途，尤其涉及通过抑制TPP1稳态异常、过度降解、染色体端粒的损伤和缩短，达到抗衰老和防治相关疾病的药物中的应用。

背景技术

衰老相关的慢性疾病如肺纤维化、皮肤纤维损伤，是因为端粒DNA损伤、进而细胞衰老引起。染色体端粒损伤逐渐缩短是导致细胞衰老的公认机制。应激、如射线照射、抗生素等化学物质引起的DNA断裂、以及氧化应激，加速端粒损伤缩短，引起过早衰老，但几十年来、应激是如何引起端粒损伤缩短进而导致过早衰老及相关疾病的机制还不清楚。作为过早衰老相关的疾病，特发性肺纤维化的病因、先天性皮肤角化不良综合症的病因也都不清楚，临床上无治疗药物。

辐照应激，氧化应激和DNA损伤药物博来霉素已被证明引起肺纤维化，引起端粒缩短，但具体机制未知。有趣的是，不同应激可激活E3泛素连接酶FBW7。FBW7(F-box andWD40repeat domain-containing 7,also termed FBXW7,Sel-10,hCDC4,or hAgo)具有特定的基因和蛋白结构(SEQ ID No.1-2)，作为E3泛素连接酶的底物识别组分。已知的FBW7靶向降解底物蛋白包括c-myc，n-myc，Notch，cyclin E，c-Jun，Aurora-A和mTOR等癌蛋白的降解。但未知FBW7是否对端粒蛋白具有调节作用。在哺乳动物小鼠中，FBW7功能的缺失激活干细胞扩增；在多种人类肿瘤中FBW7有发生突变，但FBW7在细胞增殖中的抑制作用尚不完全清楚。

端粒结合蛋白TPP1(SEQ ID No.3-4)是覆盖端粒DNA蛋白复合体shelterin的一个重要组分。编码TPP1的ACD基因突变参与衰老相关疾病如先天性角化不良和骨髓衰竭。端粒损伤，包括端粒缩短、端粒功能异常，引起端粒损伤反应，参与衰老过程，加速衰老，是衰老相关疾病的重要致病前体。已经报道的与端粒异常密切相关的衰老相关疾病包括慢性阻塞性肺病如肺纤维化等纤维组织增生性疾病，肝纤维化，骨髓干细胞减少、贫血及免疫功能低下，胸腺纤维化，免疫功能低下，卵巢纤维化，卵巢早衰，骨关节纤维化，骨质疏松，血管纤维化动脉硬化，心脏疾病，肾纤维化，神经退行性损伤和疾病，糖尿病，皮肤老化如角化不良,肿瘤等(Science,350:1193-8,2015；Clin Sci(Lond).120(10):427-40，2011)。例如，肺衰老是肺纤维化的重要前体，作为高致死率的特发性肺纤维化，TPP1含量降低，端粒损伤缩短，肺泡上皮干细胞复制、增殖和分化障碍。

发明内容

本发明目的是提供E3连接酶FBW7在制备抑制端粒损伤延缓衰老和防治衰老相关疾病的药物中的应用，所述FBW7的基因序列和蛋白质序列如SEQ ID No.1-2所示。

所述的抑制端粒损伤包括端粒脱落，端粒“脱帽”，端粒缩短，端粒DNA重组，端粒构象变化，端粒功能异常，端粒DNA损伤反应。

所述延缓衰老的状态包括上皮组织衰老如肺上皮、肝上皮、皮肤老化等，骨髓组织衰老如骨髓干细胞、造血干细胞和免疫干细胞的衰老，器官和机体衰老如过早死亡。如气管应用 shRNA抑制FBW7基因表达从而改善肺功能、防止肺组织衰老。

所述的防治衰老相关疾病，包括慢性阻塞性肺病和因端粒损伤或缩短引起的包括肺纤维化，心肌纤维化，肝纤维化如肝硬化，肾纤维化，骨髓纤维化，骨髓干细胞减少、贫血及免疫功能低下，胸腺纤维化，免疫功能低下，卵巢纤维化，卵巢早衰，骨关节纤维化，骨质疏松，血管纤维化，神经退行性损伤，糖尿病，皮肤老化如皮肤皱纹、角化不良、毛发再生障碍及白发，肿瘤。如气管应用shRNA抑制FBW7基因表达防治肺纤维化。

本发明从特异性敲除、敲低、基因突变或过高表达FBW7基因，在培养的A549细胞和小鼠肺脏组织，通过系统研究SEQ ID No.1-2所示的FBW7与肺上皮细胞衰老及肺纤维化的关系，结果发现：敲除或RNA干扰抑制FBW7(SEQ ID No.1-2)的基因表达，或表达FBW7基因突变体竞争性抑制FBW7蛋白，或过表达TPP1(SEQ ID No.3-4)克服FBW7引起的降解作用，能够保护辐射，博来霉素和双氧水引起的染色体端粒损伤，防止了TPP1在基础状态下或应激状态中降解，导致延长端粒长度的效果，增加了组织干细胞数量，改善基础状态下的肺呼吸功能，防止了应激状态下发生肺组织衰老及肺纤维化。与抑制表达的作用相反，过量表达FBW7基因(SEQ ID No.1-2)，TPP1发生快速降解，引起端粒DNA损伤、端粒缩短，肺泡干细胞减少、衰老增加，对放射性损伤、博来霉素应激性损伤敏感性增加，导致肺纤维化、呼吸功能障碍。深入研究发现，FBW7直接结合端粒蛋白、包括TPP1，引起端粒蛋白泛素化降解，引起端粒损伤，细胞衰老，组织纤维化。

本发明可抑制端粒蛋白降解、尤其是在环境应激状态下如放射损伤或氧化应激等引起的端粒蛋白降解,防止应激或压力引起端粒损伤缩短、组织器官机体衰老及其相关疾病，是通过抑制FBW7基因(SEQ ID No.1)表达，或是抑制FBW7蛋白质结构及功能如酶活性(SEQ ID No.2)，或是抑制FBW7蛋白质(SEQ ID No.2)在端粒上的招募或与端粒相互作用。本发明另一种克服应激或压力通过FBW7引起端粒损伤缩短的方法是增加补充TPP1蛋白(SEQ ID No.3-4)，通过 TPP1基因表达、如气管递送TPP1表达慢病毒，有效地抵抗FBW7作用，防止因端粒损伤引起的细胞衰老，可在制备防治端粒功能异常药物中的应用。本发明为抗衰老提供新思路和手段。

附图说明

图1为在本发明的一个实施方案中，应激条件下抑制FBW7对端粒结合蛋白TPP1的保护作用。其中图A,B和C分别为双氧水，博来霉素和辐照条件下不同E3连接酶对TPP1表达的保护作用。图D为不同E3连接酶的mRNA表达情况。图E和F为双氧水条件下抑制FBW7 对TPP1的保护作用。图G和H为博来霉素处理下FBW7对TPP1的保护作用。图I为辐照条件下FBW7对TPP1的保护作用。图J和K为CHX作用下过量表达FBW7α和γ亚基对TPP1 表达的作用。图L和M为不同抑制剂对FBW7与TPP1结合作用的影响。

图2为在本发明的一个实施方案中，应激条件下抑制FBW7对端粒DNA损伤的保护作用。其中图A,B和C抑制不同E3连接酶表达后，并对细胞进行辐射，博来霉素和双氧水处理，检测端粒DNA损伤情况。图D和E为抑制TPP1及FBW7表达后，端粒DNA损伤情况。图F为在辐照条件下FBW7和TPP1的mRNA表达情况。

图3为在本发明的一个实施方案中，FBW7对端粒长度，端粒DNA损伤及细胞衰老的作用。其中A-D为将FBW7的三个亚型过量表达后的表达情况，端粒DNA损伤，端粒长度情况。图E-J为过量表达和亚基后端粒损伤，细胞周期，衰老相关蛋白的表达情况。图K-M 为利用siRNA干扰FBW7表达后的端粒DNA损伤情况。图N-Q为稳定低表达FBW7后的端粒长度。

图4为在本发明的一个实施方案中，过量表达TPP1逆转FBW7引起的端粒DNA损伤，端粒酶招募及细胞衰老。其中图A为同时过量表达TPP1和FBW7的表达情况。图B-C为同时过量表达TPP1和FBW7对端粒酶招募的作用。图D-E为同时过量表达TPP1和FBW7对端粒DNA的损伤情况。图F-G为同时过量表达TPP1和FBW7对细胞衰老的作用。

图5为在本发明的一个实施方案中，FBW7与TPP1特异性结合并诱导其泛素化降解。其中图A-B为FBW7特异性与TPP1结合。图C为FBW7的突变体与TPP1的结合情况。图D 为FBW7的截断体与TPP1的结合情况。图E为GST-pull结果。图F为TPP1突变体与FBW7 的结合情况。图G-H为FBW7对TPP1的泛素化降解情况。图I为FBW7突变体对TPP1的表达情况。图J为FBW7对TPP1潜在泛素化位点的点突变体的泛素化降解情况。图K-L为 FBW7的野生型及突变体与端粒DNA的结合情况。图M为干扰TPP1的表达后FBW7与端粒DNA的结合情况。图5N-O为在TPP1表达降低的情况下，FBW7与端粒DNA的结合情况。

图6为在本发明的一个实施方案中，FBW7介导博莱霉素引起肺纤维化。其中图A，B和C为特异性敲除FBW7小鼠及对照在博来霉素作用下小鼠的呼吸功能检测。图D为上述条件处理下TPP1和α-SMA的表达情况。图E为敲除FBW7并给予博来霉素处理后小鼠肺组织中FBW7，T1α，α-SMA和SPC的mRNA表达情况。图F为上述情况下肺二型上皮细胞的端粒DNA损伤情况。图G为敲除FBW7后端粒的长度变化。图H为上述情况下二型细胞的比例。图I-M为FBW7特异性敲除及对照小鼠在博来霉素处理下增殖，二型细胞比例，损伤及纤维化标志物的表达情况。

图7为在本发明的一个实施方案中，FBW7介导X-射线引起肺损伤。其中图A-B为辐照后，敲除FBW7及对照小鼠肺组织中FBW7和SPC的mRNA及蛋白表达。图C为上述处理条件下肺组织的衰老及纤维化水平。图D-E为上述处理条件下肺二型上皮细胞的端粒DNA 损伤和端粒长度。图F-I为上述处理条件下肺二型上皮的DNA损伤，衰老及二型上皮细胞的比例。

图8为在本发明的一个实施方案中，FBW7介导抑制TPP1引起肺损伤。其中图A和B为在博来霉素处理下，分别敲低FBW7，TPP1和同时敲低2者后TPP1的表达及二型上皮细胞中端粒的长度。图C为上述处理条件下FBW,TPP1,SPC和p21的mRNA表达。图D为上述处理条件下肺二型上皮细胞的比例及出现损伤细胞的比例。图E,F和G为上述处理条件下肺纤维化的程度。

图9为在本发明的一个实施方案中，过量表达TPP1对FBW7引起的肺损伤起保护作用。其中图A为分别过量表达FBW7，TPP1及同时过量表达2者后TPP1，FBW7和p53的表达。图B为上述处理条件下FBW7，TPP1，SPC，p21和HP1γ的mRNA表达水平。图C和D为上述处理条件下肺二型细胞端粒的长度及二型细胞的百分比。图E为上述处理条件下肺纤维化的程度。图F为上述处理条件下二型细胞中HP1g的比例。图G为上述处理条件下α-SMA, T1α,s100a4,Col1α,Vimentin和MMP3的mRNA表达水平。

图10为在本发明的一个实施方案中，过量表达TPP1对博来霉素引起的肺纤维化和肺损伤的保护。其中图A，B和C为过量表达TPP1在博来霉素处理下小鼠肺呼吸功能的检测。图D为上述条件下肺纤维化的情况。图E和F为上述处理条件下端粒DNA的损伤及端粒长度变化。图G为上述处理条件下肺二型上皮细胞的比例情况。图H为上述处理条件下肺纤维化的情况。图I为上述处理条件下TPP1，FBW7，SPC，P21，HP1γ，α-SMA，T1α，Col1α， Vimentin和MMP3的mRNA表达情况。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的实施方案进行详细描述，实施举例仅用于说明本发明，而不应试为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生成厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1应激条件下抑制FBW7对端粒结合蛋白TPP1的保护作用

实验对象：人肺泡基底腺癌细胞A549和人胚肾细胞293T。

实验方法：利用针对FBW7，MKRN1，CHIP，FBX4，hDM2，RNF8，SIAH2及对照的 siRNA转染(转染试剂为lipofectemin2000)A549细胞以抑制其表达，在转染24小时后对细胞给予双氧水(100μM，16小时)，博来霉素(BLM，200μM，16小时)和X-射线照射(0 Gy和6Gy)处理，利用实时定量PCR检测FBW7，MKRN1，CHIP，FBX4，hDM2，RNF8 和SIAH2的干扰效率，利用免疫印迹检测TPP1及内参GAPDH的表达；将过量表达FBW7, FBW7γ及带有HA标签的TPP1的质粒通过lipofectemin2000转染293T细胞，转染48小时后对细胞进行CHX(分别处理3,6和9个小时)或CHIR99021(10μM)或TC-G24(1μM) 处理，利用免疫印迹检测TPP1的表达。

结果显示：对培养的人肺癌上皮细胞A549给予双氧水，博来霉素和辐照等应激处理后， TPP1蛋白表达降低，表现为不稳定(图1A-D)。抑制E3泛素连接酶的表达后发现，仅抑制 FBW7后应激引起的TPP1表达降低被恢复，而FBX4，CHIP，Hdm2，SIAH2，RNF8或MKRN1 的抑制则对TPP1的表达无影响。此外，不同处理时间的双氧水和博来霉素结果显示，抑制 FBW7维持TPP1蛋白的稳定性(图1E-H)。同样，不同X-射线剂量也得到了相同的结果(图 1I)。相反的，过量表达FBW7α和γ亚基则加速TPP1的降解，在无FBW7α或γ存在的情况下， TPP1的半衰期延长3倍以上(图1J-L)。GSK3的抑制剂抑制则阻断FBW7介导的TPP1 稳定性(图1M)。

实施例2应激条件下抑制FBW7对端粒DNA损伤的保护作用

实验对象：人宫颈癌细胞Hela。

实验方法：利用针对FBW7，MKRN1，CHIP，FBX4，hDM2，RNF8，SIAH2及对照的 siRNA转染(转染试剂为lipofectemin2000)Hela细胞以抑制其表达，在转染24小时后对细胞给予双氧水(100μM和200μM处理4小时)，博来霉素(BLM，200μM处理16小时) 和X-射线照射(5Gy)处理，利用免疫荧光(一抗为53BP1)结合原位杂交(Cy3标记的端粒探针)(IF-FISH)检测端粒DNA损伤；利用针对FBW7和TPP1的siRNA转染Hela细胞，转染48小时后，对细胞进行X-射线照射(0Gy和5Gy)，再继续培养1小时后利用IF-FISH (同上)检测端粒DNA损伤，并用实时定量PCR检测TPP1和FBW7的mRNA表达。

结果显示：在对细胞给予X-射线照射，博来霉素或双氧水应激反应后，端粒DNA损伤增加，而抑制FBW7则显著降低应激引起的端粒DNA损伤(图2A-C)。此外，TPP1表达降低与应激引起的端粒DNA损伤类似，抑制FBW7不仅降低辐照应激引起的端粒DNA损伤也降低TPP1缺失引起的端粒DNA损伤(图2D-F)。

实施例3FBW7对端粒长度，端粒DNA损伤及细胞衰老的作用

实验对象：人宫颈癌细胞Hela和人纤维肉瘤细胞HT1080。

实验方法：将表达人FBW7α，β和γ亚基的质粒转染Hela或HT1080细胞，转染48小时后免疫印迹检测三个亚基的表达情况；染色质免疫共沉淀检测三个亚基对端粒DNA损伤的作用；分别利用原位杂交和流式结合原位杂交(Flow-FISH)检测端粒DNA的长度；将细胞利用秋水仙素处理后的处于分裂中期的细胞利用FISH检测染色体末端端粒信号；利用流式检测细胞周期的分布情况，并用免疫印迹检测衰老相关蛋白p16，p53和p21的表达；利用免疫荧光检测HP1γ和p21的表达；利用siRNA转染Hela细胞以抑制FBW7的表达，利用IF-FISH 检测端粒DNA损伤，实时定量PCR检测FBW7的干扰效率，Flow-FISH和原位杂交检测端粒的长度。

结果显示：过量表达FBW7或亚基引起端粒DNA损伤(图3A-B)，并缩短端粒(图 3C-D)以及造成染色体末端端粒丢失(图3E-F)。对细胞周期分布分析后发现，过量表达 FBW7α或γ亚基引起S期阻滞(图3G)，并增加衰老相关蛋白p16，p53，p21和HP1γ表达增加(图3H-J)。与此相对的是，抑制FBW7的表达端粒DNA损伤显著降低(图3K-M)，端粒长度得到延长(图3N-Q)。

实施例4过量表达TPP1逆转FBW7引起的端粒DNA损伤，端粒酶招募及细胞衰老

实验对象：稳定表达人FBW7α和γ亚基的Hela细胞以及同时稳定表达TPP1及FBW7和的人宫颈癌细胞Hela。

实验方法：通过慢病毒构建稳定表达人FBW7α和γ亚基的Hela细胞以及稳定过量表达 TPP1及FBW7α和γ的细胞，利用co-fish(hTR+端粒探针)检测端粒酶的招募，利用IF-FISH 检测端粒DNA损伤；利用β-gal染色检测细胞的衰老水平。

结果显示：TPP1过量表达逆转FBW7引起的端粒酶招募抑制(图4A-C)，以及FBW7 或辐照引起的端粒DNA损伤(图4D-E)和细胞衰老的增加(图4F-G)。这些结果说明在应激条件下，FBW7介导TPP1的表达，限制端粒酶的招募，而过量表达TPP1则扭转应激或 FBW7过量表达引起的端粒损伤。

实施例5FBW7与TPP1特异性结合并诱导其泛素化降解

实验对象：人胚肾293T细胞。

实验方法：在293T细胞中共转染带有HA标签的TPP1及其点突变体S354A，S358A和带有Flag标签的FBW7α，β或γ亚基，R465H，R479G和R505L点突变体及ΔF，ΔWD40和 WD40截断体，转染48小时后利用免疫共沉淀检测TPP1与FBW7及其突变体的结合；在体外细菌中表达纯化GST标签的FBW7-WD40，利用GST-pulldown检测FBW7的WD40结构域与TPP1及其截断体ΔS/T的体外结合；同时转染带有Flag标签的TPP1，HA标签的泛素和FBW7α或γ，利用免疫共沉淀检测FBW7对TPP1的泛素化降解；同时转染flag标签的 FBW7α或γ或突变体和HA标签的TPP1，免疫印迹检测TPP1的表达；构建Flag标签的TPP1 潜在泛素化位点的点突变体并与FBW7α共转染，检测TPP1的潜在泛素化位点；利用染色质免疫共沉淀检测FBW7及其突变体与端粒DNA的结合；用siRNA抑制TPP1的表达后，利用免疫荧光和FISH检测FBW7与端粒DNA的结合情况。

结果显示：TPP1与FBW7α或γ亚基相互结合，而与β亚基则无结合作用(图5A)。且FBW7α与TPP1特异结合，与shelterin复合物的另一个组分POT1则无结合(图5B)。FBW7在肿瘤中经常出现的465,479和505位点的突变体也不能与TPP1结合(图5C)。进一步发现FBW7的WD结构域或是缺失F-box结构域的FBW7可与TPP1结合，但是缺失WD40结构域的 FBW7α则不能与TPP1结合(图5D)。FBW7的WD40结构域与TPP1的结合需要TPP1的 S/T区域(第341-482位氨基酸)(图5E)。TPP1的S/T区域的点突变体S354A或S358A则不与FBW7α结合(图5F)。FBW7与TPP1结合后引起其泛素化将降解(图5G)。FBW7引起的TPP1降解被蛋白酶体抑制剂MG132所抑制(图5H)，且FBW7的点突变体也不能降解 TPP1(图5I)。此外，TPP1潜在的泛素化位点的点突变表明FBW7可能介导TPP1包括K233， J299，K453和K459等多个位点的泛素化(图5J-K)。另外，FBW7与端粒DNA结合，同样其点突变体也不能与端粒DNA结合(图5L-M)。在TPP1表达降低的情况下，FBW7与端粒 DNA的结合则也相应降低(图5N-O)。这些结果表明FBW7的WD40结构域与TPP1的S/T 区域介导FBW7与TPP1的直接结合并使TPP1在多个位点发生泛素化降解。

实施例6FBW7介导博莱霉素引起肺纤维化

实验对象：肺特异性敲除Fbw7(SPA；Fbw7^flox/flox)6只，对照小鼠(Fbw7^flox/flox)18只(3-6 个月)。

实验方法：取肺特异性敲除Fbw7(SPA；Fbw7^flox/flox)及对照小鼠(Fbw7^flox/flox)各6只，其中3只通过气管灌注博莱霉素(3mg/kg体重)，另外3只通过气管灌注PBS(与博来霉素等体积)作为对照，在博来霉素处理21天后，对小鼠进行气管插管检测呼吸功能；利用流式分选肺二型上皮细胞(CD45^-，EpCAM⁺，T1α^-)，并计算二型细胞占总细胞数的百分比；取分选的二型细胞甩片后利用免疫荧光(53BP1抗体)结合FISH(端粒探针)检测二型细胞的端粒DNA损伤；取肺组织制作石蜡切片，Masson和H&E染色，免疫荧光检测肺二型细胞的百分比(SPC抗体)，肺二型细胞(SPC阳性)中Ki67，HP1γ和α-SMA的百分比，以及二型细胞的端粒长度(SPC抗体+端粒探针)；取Fbw7^flox/flox小鼠12只，分为4组，每组3只，分别进行如下处理，气管灌注control或Cre慢病毒，气管灌注PBS或博来霉素，具体方法：第一天灌注control或Cre慢病毒，第二天灌注PBS或博来霉素，以后每隔4天灌注一次control 或Cre慢病毒，第22天取各组小鼠肺组织，提取RNA检测FBW7，T1α，α-SMA和SPC的 mRNA表达。

结果显示：肺上皮细胞特异性敲除FBW7的小鼠与对照小鼠同时进行博来霉素处理后， FBW7敲除小鼠的肺呼吸功能显著优于对照组(图6A-C)。在FBW7敲除小鼠的肺组织中TPP1 和SPC的表达较对照增加(图6D-E)，端粒DNA损伤降低(图6F)，端粒延长(图6G)，并且肺二型上皮细胞的比例增加(图6H-I)。增殖标志物Ki67阳性细胞的比例在FBW7敲除小鼠中也显著增加(图6J)。此外，博来霉素诱导的肺衰老和肺纤维化在FBW7敲除的小鼠中被显著抑制(图6K-M)。这些结果说明敲除FBW7对肺纤维化具有显著的保护作用。

实施例7FBW7介导X-射线引起肺损伤

实验对象：他莫昔芬诱导的Fbw7敲除(ERT Cre；Fbw7^flox/flox)及对照小鼠(Fbw7^{flox /flox}) 各9只(3-6个月)。

实验方法：将他莫昔芬诱导的Fbw7敲除(ERT Cre；Fbw7^flox/flox)及对照小鼠(Fbw7^flox/flox) 分成3组，每组3只，在对小鼠利用含有他莫昔芬的饲料喂食4周后(诱导FBW7的敲除)，分别对小鼠进行0Gy，4Gy和8G的X-射线照射处理，在照射后72小时后取小鼠肺组织，提取RNA，利用实时定量PCR检测FBW7和SPC的mRNA表达；提取肺总蛋白，利用免疫印迹检测SPC，HP1γ及内参GAPDH的表达；将肺组织包埋切片(5μm)后进行β-gal和Masson 染色，利用免疫荧光检测肺二型细胞的百分比(SPC阳性细胞数)以及肺二型细胞(SPC阳性)中HP1阳性细胞数；利用免疫荧光检测α-SMA的表达；利用免疫荧光结合FISH检测二型细胞的端粒长度(SPC+端粒探针)。

结果显示：为了检测FBW7在其他应激条件下引起的肺衰老和损伤，对他莫昔芬诱导的 FBW7敲除小鼠和对照小鼠给予辐射处理，FBW7敲除小鼠显著增加肺二型上皮细胞标志物 SPC的表达及二型细胞的比例(图7A-C)。此外，FBW7敲除小鼠在辐照条件下显著降低端粒DNA损伤，抑制辐照引起的端粒缩短，保护端粒DNA损伤反应以及细胞衰老(图7D-I)。

实施例8FBW7介导抑制TPP1引起肺损伤

实验对象：3-6月龄野生型小鼠12只。

实验方法：取野生型小鼠12只，分为4组，每组3只，分别进行如下处理，气管灌注control或shTPP慢病毒，气管灌注PBS或博来霉素，具体方法：第一天灌注control或shTPP1慢病毒，第二天灌注PBS或博来霉素，以后每隔4天灌注一次control或shTPP1慢病毒，第 22天取各组小鼠肺组织。取肺组织提取蛋白质，免疫印迹检测TPP1和内参GAPDH的表达；提取肺组织RNA，实时定量PCR检测FBW7，TPP1，SPC，p21，α-SMA和Col1α的mRNA 表达；肺组织石蜡包埋切片，Masson染色，利用免疫荧光检测肺二型细胞的百分比(SPC阳性细胞数)以及肺二型细胞(SPC阳性)中γH2AX和HP1阳性细胞数；利用免疫荧光结合FISH检测二型细胞的端粒长度(SPC+端粒探针)以及肺组织中的端粒DNA损伤(53BP1+ 端粒探针)。

结果显示：为证实FBW7介导的肺衰老和肺纤维化是由TPP1介导，分别抑制TPP1，FBW7 及同时抑制二者在小鼠肺中的表达后发现，抑制TPP1表达后端粒酶缩短(图8A-B)，SPC 表达降低，SPC阳性细胞的百分比降低，p21表达增加，HP1γ阳性的二型细胞数增加(图8C-D)，并引起肺纤维化(图8E)，α-SMA和Collage1的表达增加(图8F-G)。博来霉素处理的结果类似TPP1抑制的结果，同样引起端粒缩短(图8A-B)，二型上皮细胞数减少以及出现纤维化(图8B-G)。然而，同时干扰FBW7和TPP1的表达则引起端粒延长，SPC表达和二型上皮细胞数的增加(图8A-D)。FBW7缺失降低基础水平的α-SMA和col1α，抑制博来霉素或TPP1降低引起的肺纤维化(图8E-G)。

实施例9TPP1保护由于FBW7过量表达引起的小鼠端粒肺损伤

实验对象：3-6月龄野生型小鼠12只

实验方法：取野生型小鼠12只，分为4组，每组3只，分别进行如下处理，分别气管灌注control，TPP1，FBW7，TPP1+FBW7慢病毒，每隔4天灌注一次，共计灌注4次，在第4 次灌注后4天结束实验。取肺组织提取蛋白质，免疫印迹检测FBW7，TPP1，p53和内参GAPDH 的表达；提取肺组织RNA，实时定量PCR检测FBW7，TPP1，SPC，p21，HP1γ，α-SMA， T1α，s100a4，Col1α，Col6a，Vimentin和MMP3的mRNA表达；肺组织石蜡包埋切片，Masson 和H&E染色，利用免疫荧光检测肺二型细胞的百分比(SPC阳性细胞数)以及肺二型细胞(SPC 阳性)中HP1阳性细胞数及-SMA表达情况；利用免疫荧光结合FISH检测二型细胞的端粒长度(SPC+端粒探针)。

结果显示：过量表达TPP1保护由于FBW7过量表达引起的小鼠端粒肺损伤。FBW7过量表达引起TPP1在蛋白和基因水平上表达降低(图9A)，并增加HP1γ阳性的二型细胞数，同时增加纤维化标志物α-SMA,T1α，s100a4，Col1α，Vimentin和MMP3的表达(图9E-G)。过量表达TPP1消除FBW7过量表达引起的端粒长度缩短，二型细胞数减少以及p53，p21和 HP1γ及纤维化标志物表达的增加(图9A-B，E-G)。这些结果进一步说明TPP1是FBW7介导的端粒缩短和肺衰老相关损失的主要效应分子。

实施例10TPP1保护由于博来霉素引起的小鼠端粒肺纤维化

实验对象：实验对象：实验对象：3-6月龄野生型小鼠12只。

实验方法：取野生型小鼠12只，分为4组，每组3只，分别进行如下处理，气管灌注control或TPP1慢病毒，气管灌注PBS或博来霉素，具体方法：第一天灌注control或TPP1 慢病毒，第二天灌注PBS或博来霉素，以后每隔4天灌注一次control或TPP1慢病毒，第22 天对小鼠进行气管插管检测呼吸功能。提取肺组织RNA，实时定量PCR检测FBW7，TPP1， SPC，p21，HP1γ，α-SMA，T1α，Vimentin和MMP3的mRNA表达；肺组织石蜡包埋切片， Masson和H&E染色，利用免疫荧光检测肺二型细胞的百分比(SPC阳性细胞数)以及肺二型细胞(SPC阳性)中HP1阳性细胞数及α-SMA表达情况；取10mg肺组织检测羟脯氨酸含量；利用免疫荧光结合FISH检测二型细胞的端粒长度(SPC+端粒探针)。

结果显示：过量表达或保护TPP1在改善博来霉素引起的呼吸功能(图10A-C)，肺纤维化(图10D)，端粒DNA损伤，端粒缩短(图10E-F)，二型细胞数比例降低(图10G)，衰老增加和纤维化增加(图10H-I)等方面功能类似。

序列表

<110> 杭州师范大学

<120> E3连接酶FBW7在延缓衰老及相关疾病方面的医药用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3927

<212> DNA/RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

taccgcgccg gagccttccg cagctgccgc ttcagtccga aggaggaagg gaaccaaccc 60

actttctcgg cgccgcggct cttttctaaa agtaatgtga aaacctttgc atcttctgat 120

agtctagcca aggtccaaga agtagcaagc tggcttttgg aaatgaatca ggaactgctc 180

tctgtgggca gcaaaagacg acgaactgga ggctctctga gaggtaaccc ttcctcaagc 240

caggtagatg aagaacagat gaatcgtgtg gtagaggagg aacagcaaca gcaactcaga 300

caacaagagg aggagcacac tgcaaggaat ggtgaagttg ttggagtaga acctagacct 360

ggaggccaaa atgattccca gcaaggacag ttggaagaaa acaataatag atttatttcg 420

gtagatgagg actcctcagg aaaccaagaa gaacaagagg aagatgaaga acatgctggt 480

gaacaagatg aggaggatga ggaggaggag gagatggacc aggagagtga cgattttgat 540

cagtctgatg atagtagcag agaagatgaa catacacata ctaacagtgt cacgaactcc 600

agtagtattg tggacctgcc cgttcaccaa ctctcctccc cattctatac aaaaacaaca 660

aaaatgaaaa gaaagttgga ccatggttct gaggtccgct ctttttcttt gggaaagaaa 720

ccatgcaaag tctcagaata tacaagtacc actgggcttg taccatgttc agcaacacca 780

acaacttttg gggacctcag agcagccaat ggccaagggc aacaacgacg ccgaattaca 840

tctgtccagc cacctacagg cctccaggaa tggctaaaaa tgtttcagag ctggagtgga 900

ccagagaaat tgcttgcttt agatgaactc attgatagtt gtgaaccaac acaagtaaaa 960

catatgatgc aagtgataga accccagttt caacgagact tcatttcatt gctccctaaa 1020

gagttggcac tctatgtgct ttcattcctg gaacccaaag acctgctaca agcagctcag 1080

acatgtcgct actggagaat tttggctgaa gacaaccttc tctggagaga gaaatgcaaa 1140

gaagagggga ttgatgaacc attgcacatc aagagaagaa aagtaataaa accaggtttc 1200

atacacagtc catggaaaag tgcatacatc agacagcaca gaattgatac taactggagg 1260

cgaggagaac tcaaatctcc taaggtgctg aaaggacatg atgatcatgt gatcacatgc 1320

ttacagtttt gtggtaaccg aatagttagt ggttctgatg acaacacttt aaaagtttgg 1380

tcagcagtca caggcaaatg tctgagaaca ttagtgggac atacaggtgg agtatggtca 1440

tcacaaatga gagacaacat catcattagt ggatctacag atcggacact caaagtgtgg 1500

aatgcagaga ctggagaatg tatacacacc ttatatgggc atacttccac tgtgcgttgt 1560

atgcatcttc atgaaaaaag agttgttagc ggttctcgag atgccactct tagggtttgg 1620

gatattgaga caggccagtg tttacatgtt ttgatgggtc atgttgcagc agtccgctgt 1680

gttcaatatg atggcaggag ggttgttagt ggagcatatg attttatggt aaaggtgtgg 1740

gatccagaga ctgaaacctg tctacacacg ttgcaggggc atactaatag agtctattca 1800

ttacagtttg atggtatcca tgtggtgagt ggatctcttg atacatcaat ccgtgtttgg 1860

gatgtggaga cagggaattg cattcacacg ttaacagggc accagtcgtt aacaagtgga 1920

atggaactca aagacaatat tcttgtctct gggaatgcag attctacagt taaaatctgg 1980

gatatcaaaa caggacagtg tttacaaaca ttgcaaggtc ccaacaagca tcagagtgct 2040

gtgacctgtt tacagttcaa caagaacttt gtaattacca gctcagatga tggaactgta 2100

aaactatggg acttgaaaac gggtgaattt attcgaaacc tagtcacatt ggagagtggg 2160

gggagtgggg gagttgtgtg gcggatcaga gcctcaaaca caaagctggt gtgtgcagtt 2220

gggagtcgga atgggactga agaaaccaag ctgctggtgc tggactttga tgtggacatg 2280

aagtgaagag cagaaaagat gaatttgtcc aattgtgtag acgatatact ccctgccctt 2340

ccccctgcaa aaagaaaaaa agaaaagaaa aagaaaaaaa tcccttgttc tcagtggtgc 2400

aggatgttgg cttggggcaa cagattgaaa agacctacag actaagaagg aaaagaagaa 2460

gagatgacaa accataactg acaagagagg cgtctgctgt ctcatcacat aaaaggcttc 2520

acttttgact gagggcagct ttgcaaaatg agactttcta aatcaaacca ggtgcaatta 2580

tttctttatt ttcttctcca gtggtcattg ggcagtgtta atgctgaaac atcattacag 2640

attctgctag cctgttcttt taccactgac agctagacac ctagaaagga actgcaataa 2700

tatcaaaaca agtactggtt gactttctaa ttagagagca tctgcaacaa aaagtcattt 2760

ttctggagtg gaaaagctta aaaaaattac tgtgaattgt ttttgtacag ttatcatgaa 2820

aagctttttt tttttttttt ttgccaacca ttgccaatgt caatcaatca cagtattagc 2880

ctctgttaat ctatttactg ttgcttccat atacattctt caatgcatat gttgctcaaa 2940

ggtggcaagt tgtcctgggt tctgtgagtc ctgagatgga tttaattctt gatgctggtg 3000

ctagaagtag gtcttcaaat atgggattgt tgtcccaacc ctgtactgta ctcccagtgg 3060

ccaaacttat ttatgctgct aaatgaaaga aagaaaaaag caaattattt ttttttattt 3120

tttttctgct gtgacgtttt agtcccagac tgaattccaa atttgctcta gtttggttat 3180

ggaaaaaaga ctttttgcca ctgaaacttg agccatctgt gcctctaaga ggctgagaat 3240

ggaagagttt cagataataa agagtgaagt ttgcctgcaa gtaaagaatt gagagtgtgt 3300

gcaaagctta ttttctttta tctgggcaaa aattaaaaca cattccttgg aacagagcta 3360

ttacttgcct gttctgtgga gaaacttttc tttttgaggg ctgtggtgaa tggatgaacg 3420

tacatcgtaa aactgacaaa atattttaaa aatatataaa acacaaaatt aaaataaagt 3480

tgctggtcag tcttagtgtt ttacagtatt tgggaaaaca actgttacag ttttattgct 3540

ctgagtaact gacaaagcag aaactattca gtttttgtag taaaggcgtc acatgcaaac 3600

aaacaaaatg aatgaaacag tcaaatggtt tgcctcattc tccaagagcc acaactcaag 3660

ctgaactgtg aaagtggttt aacactgtat cctaggcgat cttttttcct ccttctgttt 3720

atttttttgt ttgttttatt tatagtctga tttaaaacaa tcagattcaa gttggttaat 3780

tttagttatg taacaacctg acatgatgga ggaaaacaac ctttaaaggg attgtgtcta 3840

tggtttgatt cacttagaaa ttttattttc ttataactta agtgcaataa aatgtgtttt 3900

ttcatgttaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 3927

<210> 2

<211> 707

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Asn Gln Glu Leu Leu Ser Val Gly Ser Lys Arg Arg Arg Thr Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Gly Asn Pro Ser Ser Ser Gln Val Asp Glu Glu Gln

20 25 30

Met Asn Arg Val Val Glu Glu Glu Gln Gln Gln Gln Leu Arg Gln Gln

35 40 45

Glu Glu Glu His Thr Ala Arg Asn Gly Glu Val Val Gly Val Glu Pro

50 55 60

Arg Pro Gly Gly Gln Asn Asp Ser Gln Gln Gly Gln Leu Glu Glu Asn

65 70 75 80

Asn Asn Arg Phe Ile Ser Val Asp Glu Asp Ser Ser Gly Asn Gln Glu

85 90 95

Glu Gln Glu Glu Asp Glu Glu His Ala Gly Glu Gln Asp Glu Glu Asp

100 105 110

Glu Glu Glu Glu Glu Met Asp Gln Glu Ser Asp Asp Phe Asp Gln Ser

115 120 125

Asp Asp Ser Ser Arg Glu Asp Glu His Thr His Thr Asn Ser Val Thr

130 135 140

Asn Ser Ser Ser Ile Val Asp Leu Pro Val His Gln Leu Ser Ser Pro

145 150 155 160

Phe Tyr Thr Lys Thr Thr Lys Met Lys Arg Lys Leu Asp His Gly Ser

165 170 175

Glu Val Arg Ser Phe Ser Leu Gly Lys Lys Pro Cys Lys Val Ser Glu

180 185 190

Tyr Thr Ser Thr Thr Gly Leu Val Pro Cys Ser Ala Thr Pro Thr Thr

195 200 205

Phe Gly Asp Leu Arg Ala Ala Asn Gly Gln Gly Gln Gln Arg Arg Arg

210 215 220

Ile Thr Ser Val Gln Pro Pro Thr Gly Leu Gln Glu Trp Leu Lys Met

225 230 235 240

Phe Gln Ser Trp Ser Gly Pro Glu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Glu Leu

245 250 255

Ile Asp Ser Cys Glu Pro Thr Gln Val Lys His Met Met Gln Val Ile

260 265 270

Glu Pro Gln Phe Gln Arg Asp Phe Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Leu

275 280 285

Ala Leu Tyr Val Leu Ser Phe Leu Glu Pro Lys Asp Leu Leu Gln Ala

290 295 300

Ala Gln Thr Cys Arg Tyr Trp Arg Ile Leu Ala Glu Asp Asn Leu Leu

305 310 315 320

Trp Arg Glu Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ile Asp Glu Pro Leu His Ile

325 330 335

Lys Arg Arg Lys Val Ile Lys Pro Gly Phe Ile His Ser Pro Trp Lys

340 345 350

Ser Ala Tyr Ile Arg Gln His Arg Ile Asp Thr Asn Trp Arg Arg Gly

355 360 365

Glu Leu Lys Ser Pro Lys Val Leu Lys Gly His Asp Asp His Val Ile

370 375 380

Thr Cys Leu Gln Phe Cys Gly Asn Arg Ile Val Ser Gly Ser Asp Asp

385 390 395 400

Asn Thr Leu Lys Val Trp Ser Ala Val Thr Gly Lys Cys Leu Arg Thr

405 410 415

Leu Val Gly His Thr Gly Gly Val Trp Ser Ser Gln Met Arg Asp Asn

420 425 430

Ile Ile Ile Ser Gly Ser Thr Asp Arg Thr Leu Lys Val Trp Asn Ala

435 440 445

Glu Thr Gly Glu Cys Ile His Thr Leu Tyr Gly His Thr Ser Thr Val

450 455 460

Arg Cys Met His Leu His Glu Lys Arg Val Val Ser Gly Ser Arg Asp

465 470 475 480

Ala Thr Leu Arg Val Trp Asp Ile Glu Thr Gly Gln Cys Leu His Val

485 490 495

Leu Met Gly His Val Ala Ala Val Arg Cys Val Gln Tyr Asp Gly Arg

500 505 510

Arg Val Val Ser Gly Ala Tyr Asp Phe Met Val Lys Val Trp Asp Pro

515 520 525

Glu Thr Glu Thr Cys Leu His Thr Leu Gln Gly His Thr Asn Arg Val

530 535 540

Tyr Ser Leu Gln Phe Asp Gly Ile His Val Val Ser Gly Ser Leu Asp

545 550 555 560

Thr Ser Ile Arg Val Trp Asp Val Glu Thr Gly Asn Cys Ile His Thr

565 570 575

Leu Thr Gly His Gln Ser Leu Thr Ser Gly Met Glu Leu Lys Asp Asn

580 585 590

Ile Leu Val Ser Gly Asn Ala Asp Ser Thr Val Lys Ile Trp Asp Ile

595 600 605

Lys Thr Gly Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln Gly Pro Asn Lys His Gln

610 615 620

Ser Ala Val Thr Cys Leu Gln Phe Asn Lys Asn Phe Val Ile Thr Ser

625 630 635 640

Ser Asp Asp Gly Thr Val Lys Leu Trp Asp Leu Lys Thr Gly Glu Phe

645 650 655

Ile Arg Asn Leu Val Thr Leu Glu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Val

660 665 670

Trp Arg Ile Arg Ala Ser Asn Thr Lys Leu Val Cys Ala Val Gly Ser

675 680 685

Arg Asn Gly Thr Glu Glu Thr Lys Leu Leu Val Leu Asp Phe Asp Val

690 695 700

Asp Met Lys

705

<210> 3

<211> 2095

<212> DNA/RNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

gcgtcatcac gctgaggtcc gcgcgccccc ggagtctggg gagcagggct ccgccaatcc 60

gaggggaggg cgaaggaagt accatttatt tagcgctgtg tgtgtgctct tatttccact 120

ggccttacaa gaccgtgcac tgtgtagatg aggaaactga gtcataataa atatgtgctg 180

aaccgttcgg gggtcacacg gtgctgaaat ggtttcgagt caactcgctc ggacggcact 240

cggcctcagc ctccggccct ggaaccctct ccagggacgg gaccagccct tgttctgttc 300

cctaccggta ccacaggaat cttgacgaac ggcccaaatg cctggccgct gtcagagtga 360

cgccgcgatg agagtaaacg ggccagcatc ccgtgcacca gcggggtgga ccagcgggag 420

tctgcacaca ggcccccgag caggacgccc tcgtgcgcag gcgcggggtg tacgtgggcg 480

gggcctcctc ctccggcccc gcccagcgaa ggagcttcct cttccgagga aaggcggggc 540

ctgggcgccc gcgggaaacc cgggcccgtt gcatccgctg ggtgtagccg tggggatggc 600

aggttcgggg aggctggtcc tacggccctg gattcgggag ctgattctgg ggtcagagac 660

accctccagt ccacgagccg ggcagctgct tgaggtacta caggacgccg aggccgcggt 720

cgcgggccca tcccacgccc ctgatacgtc cgacgtcggg gccacgctgc ttgtgtctga 780

cgggacccac agtgtccgat gcctggtgac gcgggaggcc ctggacacct cggactggga 840

ggagaaggag ttcggcttcc gcgggacaga gggccggctg ctgctgctgc aggactgcgg 900

ggttcatgtc caggtcgctg agggcggcgc gcccgcagag ttctatctcc aggtggaccg 960

cttcagcctg ctgcccacgg agcagccccg gctacgggtg cctggttgca accaagactt 1020

agatgttcag aaaaagctct atgactgcct tgaggagcac ctttcagagt ccacctcgtc 1080

caatgcaggc ctatcactgt cccagcttct ggatgaaatg cgggaggacc aggagcatca 1140

gggggcactc gtgtgcctgg ctgaaagctg cctgacactg gagggccctt gcacagcacc 1200

ccctgtcacc cactgggctg cctcacgatg caaggccacg ggagaagctg tgtacactgt 1260

ccccagctca atgctgtgca tctctgagaa tgaccagcta attctgagct ctctaggccc 1320

ctgtcagagg acacagggcc ctgagctgcc cccaccagac ccggctctgc aggacctatc 1380

tctgaccctc atagcctctc ctccttcctc acccagttcc tcaggaaccc cggccttacc 1440

cggccacatg tcatccgagg aaagtggtac cagcatcagc cttctgcctg ccctgtcctt 1500

ggctgctcca gacccagggc agagaagcag ctcccagccc tcaccagcca tctgctcagc 1560

ccctgccacc ctgaccccca ggtccccaca cgccagccgt acccccagct ccccactcca 1620

gagctgcact cccagtctct caccccgtag ccatgtcccc agtccacacc aggctcttgt 1680

gaccaggccc cagaaaccta gcctggagtt caaggagttt gtagggttgc cctgcaagaa 1740

tcggccgcct tttcccagga ccggagctac caggggagcc caggagccct gctctgtctg 1800

ggaaccccca aagaggcatc gtgatggttc tgccttccag tatgagtatg agccaccctg 1860

cacgtccctc tgtgctcggg tccaagctgt caggcttcct ccccagctca tggcctgggc 1920

cttgcacttt ctgatggatg cacagccagg gtctgagcca actccgatgt gagacgtcac 1980

gcaggacaga taccgctcca cactctgctt cctttgagtt ttttaataaa ataatctcat 2040

gcggcaggag aggagaggat cagggaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 2095

<210> 4

<211> 544

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Pro Gly Arg Cys Gln Ser Asp Ala Ala Met Arg Val Asn Gly Pro

1 5 10 15

Ala Ser Arg Ala Pro Ala Gly Trp Thr Ser Gly Ser Leu His Thr Gly

20 25 30

Pro Arg Ala Gly Arg Pro Arg Ala Gln Ala Arg Gly Val Arg Gly Arg

35 40 45

Gly Leu Leu Leu Arg Pro Arg Pro Ala Lys Glu Leu Pro Leu Pro Arg

50 55 60

Lys Gly Gly Ala Trp Ala Pro Ala Gly Asn Pro Gly Pro Leu His Pro

65 70 75 80

Leu Gly Val Ala Val Gly Met Ala Gly Ser Gly Arg Leu Val Leu Arg

85 90 95

Pro Trp Ile Arg Glu Leu Ile Leu Gly Ser Glu Thr Pro Ser Ser Pro

100 105 110

Arg Ala Gly Gln Leu Leu Glu Val Leu Gln Asp Ala Glu Ala Ala Val

115 120 125

Ala Gly Pro Ser His Ala Pro Asp Thr Ser Asp Val Gly Ala Thr Leu

130 135 140

Leu Val Ser Asp Gly Thr His Ser Val Arg Cys Leu Val Thr Arg Glu

145 150 155 160

Ala Leu Asp Thr Ser Asp Trp Glu Glu Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gly

165 170 175

Thr Glu Gly Arg Leu Leu Leu Leu Gln Asp Cys Gly Val His Val Gln

180 185 190

Val Ala Glu Gly Gly Ala Pro Ala Glu Phe Tyr Leu Gln Val Asp Arg

195 200 205

Phe Ser Leu Leu Pro Thr Glu Gln Pro Arg Leu Arg Val Pro Gly Cys

210 215 220

Asn Gln Asp Leu Asp Val Gln Lys Lys Leu Tyr Asp Cys Leu Glu Glu

225 230 235 240

His Leu Ser Glu Ser Thr Ser Ser Asn Ala Gly Leu Ser Leu Ser Gln

245 250 255

Leu Leu Asp Glu Met Arg Glu Asp Gln Glu His Gln Gly Ala Leu Val

260 265 270

Cys Leu Ala Glu Ser Cys Leu Thr Leu Glu Gly Pro Cys Thr Ala Pro

275 280 285

Pro Val Thr His Trp Ala Ala Ser Arg Cys Lys Ala Thr Gly Glu Ala

290 295 300

Val Tyr Thr Val Pro Ser Ser Met Leu Cys Ile Ser Glu Asn Asp Gln

305 310 315 320

Leu Ile Leu Ser Ser Leu Gly Pro Cys Gln Arg Thr Gln Gly Pro Glu

325 330 335

Leu Pro Pro Pro Asp Pro Ala Leu Gln Asp Leu Ser Leu Thr Leu Ile

340 345 350

Ala Ser Pro Pro Ser Ser Pro Ser Ser Ser Gly Thr Pro Ala Leu Pro

355 360 365

Gly His Met Ser Ser Glu Glu Ser Gly Thr Ser Ile Ser Leu Leu Pro

370 375 380

Ala Leu Ser Leu Ala Ala Pro Asp Pro Gly Gln Arg Ser Ser Ser Gln

385 390 395 400

Pro Ser Pro Ala Ile Cys Ser Ala Pro Ala Thr Leu Thr Pro Arg Ser

405 410 415

Pro His Ala Ser Arg Thr Pro Ser Ser Pro Leu Gln Ser Cys Thr Pro

420 425 430

Ser Leu Ser Pro Arg Ser His Val Pro Ser Pro His Gln Ala Leu Val

435 440 445

Thr Arg Pro Gln Lys Pro Ser Leu Glu Phe Lys Glu Phe Val Gly Leu

450 455 460

Pro Cys Lys Asn Arg Pro Pro Phe Pro Arg Thr Gly Ala Thr Arg Gly

465 470 475 480

Ala Gln Glu Pro Cys Ser Val Trp Glu Pro Pro Lys Arg His Arg Asp

485 490 495

Gly Ser Ala Phe Gln Tyr Glu Tyr Glu Pro Pro Cys Thr Ser Leu Cys

500 505 510

Ala Arg Val Gln Ala Val Arg Leu Pro Pro Gln Leu Met Ala Trp Ala

515 520 525

Leu His Phe Leu Met Asp Ala Gln Pro Gly Ser Glu Pro Thr Pro Met

530 535 540

Claims (2)

1.一种E3连接酶FBW7的siRNA在制备防治衰老相关疾病的药物中的应用，所述FBW7的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，其特征在于，所述的衰老相关疾病是慢性阻塞性肺病和因端粒损伤或缩短引起的肺纤维化。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的衰老表现包括肺上皮组织衰老。

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