CN1729008A - 离域分子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到离域分子，制造它们的方法和它们作为药物，特别是治疗肿瘤的应用。

Description

离域分子及其应用

本发明涉及离域分子，其制备方法和它们作为药物特别是在治疗肿瘤上的应用。

蛋白质的定位，即在细胞、在组织或原生质中的居留方位对蛋白质的功能和活性有很大影响，对参与细胞调控的蛋白质影响更大。

真核生物细胞含有细胞内膜，它差不多将细胞体积一半划分成分割的空间，作为细胞器表述的隔室。在所有真核生物细胞中出现的被膜包围的细胞器主要类型有内质网、高尔基体、细胞核、线粒体、溶酶体、核内体和过氧化物酶体，每个细胞器都有一定的蛋白质值，由它们保证维持细胞器的专用功能。

新近合成的蛋白质跟踪专门的传输通道寻找到从生成它们的胞质溶胶到它们执行专门任务的细胞器的途径。传输通道是通过蛋白质氨基酸序列中的以信号肽或信号区的信号形式确定的，这些信号肽可由相应的目标细胞器受体识别。在胞质溶胶中完成其任务的蛋白质不含有信号肽，故保留在胞质溶胶中(Albertset al.，Molekularbiologie derzelle；VCH Verlag，3.Auflage)。

此外，蛋白质有目标指向的定位是通过其作为多聚体复合物的组构达到的，该复合物可有目的地转送至亚细胞的结构，它们通过其对固着蛋白质或支架蛋白质的亲和性和借助在该方位上的其它结构性的组分保持在相应的位置上，各蛋白质对这些结构的亲和性与相应定位域、转译后修饰、别构的变化和其它作用有关(stein et al.J.Cell.Biochem.Suppl.(2000)S.84-92)。

具有与DNA相结合的活性和反激活活性的不同蛋白质族系的功能，例如像连环蛋白、切迹或STAT-蛋白质基本上取决于从胞质溶胶进到细胞核的运输。

许多疾病都显示出由于突变基因产物改变定位而产生一种突变的功能性的后果。对慢性髓细胞白血病(CML)而言，例如Bcr-Abl.的转化潜能不仅取决于活化了的Abl的激酶活性，而且还与蛋白质被扰乱了的与肌动蛋白质相连的定位有关，基于这种定位，不论是促细胞分裂原，还是抗细胞程序死亡的信号通道都被激活，从而达到了转化的活性(Daley et al.，Science，Vol.247(1990)，S.824-830)。

Bcr-Abl的核胞包含物通过核胞输出机构的非特异性抑制作用导致Bcr-Abl阳性细胞的细胞程序死亡(Vigneri P.& Wang J.Y.，Nat.Med.，vol.7(2001)，S.228-234)。

对急性髓细胞白血病(AML)而言，恶生转化常常是与蛋白质的离域相连系的，最频繁的染色体移位产生包括转录因子的嵌合蛋白质，这样常常会使转录激活物DNA-结合域与转录阻抑物相融合，从而使得转录阻抑物错误传送到转录激活物的目标基因中。

在AML中最频繁的染色体移位是t(8；21)移位，它在患这种疾病的成年病人中发现有10-15％(Downing J.R，Br.J.Haematol.vol.106(1999)，S.296-308)。由于这种移位，使转录激活物AML1的C-末端被转录阻抑物ETO所取代和产生融合蛋白标记物AML1-ETO(Meyers et al.，Mol.Cell.Biol.，vol.15(1995)，S.1974-1982；和Leney etal.，Oncogene，vol.11(1995)，1761-1769)。

融合蛋白标记物AML1-ETO能起到使不同Co-阻抑物与组蛋白-脱乙酰基转移酶(HDACs)相结合的作用，用这种方法AML1目标基因例如CM-CSF，嗜中性白细胞的弹性蛋白酶和c/EBPα的表达受到抑制(Britos-Bray，M.& Friedman，A.D.，Mol.Cell.Biol.，vol.17(1997)，S.5127-5135)；Frank et al.，Oncogene，vol.11(1995)，S.2667-2674；Pabst，et al.，Nat.Med.Vol.7(2001)，S.444-451和Oelgeschlager et al.，Mol.Cell.Biol.，vol.16(1996)，S.4717-25)。基于此观点，AML1-ETO的这种作用对AML典型的分化阻断负有责任。

对肿瘤病的治疗目前通常是采用外科手术，放射和药物化学疗法的联合方法。对血液学的肿瘤疾病的治疗主要局限于药物化学疗法，传统的化学治疗配方如同放射方法一样，其作用不是专门指向癌细胞的，因而这种治疗方法对病人不可避免地带有严重的副作用，因为每一治疗配方会击中所有增生的细胞。

化学疗法的副作用可导致急性肾功能丧失和由毒性引起的心脏、肺、肝和神经系统的器官损害，这种治疗方法的免疫抑制作用的后果必须要考虑到大量导致死亡的感染，许多治疗方法因为其毒性恰恰对老年病人不宜采用。

专门针对癌细胞和能对其进行攻击的有效活性物质使用的有限性，是对许多癌症一直存在很差预后效果的一个重要原因。

目前的技术现状是试图开发对肿瘤细胞有特效的治疗配方，设计了一种有缺失的腺病毒，它只是在有P53突变的肿瘤中能阻抑信号转导通道(Bischoff et al.，1996，Science，vol.274，S.373-6)。通过这种措施使具有P53突变的肿瘤细胞受到感染，而对其它细胞则没有影响，该治疗方法的实际价值目前还在进行临床试验(McComick F.，2000，Semin.Cancer.Biol.，vol.10，S.453-9)。

大多数治疗配方都是集中在能应用作为癌基因蛋白质抑制剂的小分子鉴别上，例如酪氨酸激酶特异抑制剂。不同的酪氨酸激酶，其中包括Bcr-Abl，抑制剂STI591表现出治疗t(9；22)白血病是有效的(Vigneri et al.，2001，Nat.Med.，vol.7，S.228-34)。虽然STI571对阻抑伴有BCR-ABL的疾病分子目标有效果，但只是对早期慢性阶段的CML-病人才完全有效，而不是整个患病期。与此相反，对带有阳性Bcr-Abl的急性淋巴母细胞白血病和CML-原始细胞性白血病的大多数病人还观察到有复发的现象，其原因可能是恶性肿瘤是一系列基因改变的结果，这种致癌基因多方原因之一的反复只通过一种冶疗疾病的有效活性物质是不够的。

虽然分子攻击目标(所谓的targets)的鉴别在癌症治疗上发展速度很快，然而迄今该项知识还没有发展成专用治疗方法的思路。

因而本发明面对的任务是提供作为一种经物活性物质的化合物，它对肿瘤，特别是白血病有可能提高其治疗效果。

该任务现在通过对肿瘤特异分子具有结合亲和性和对肿瘤特异分子的离域能起作用的化合物而获得解决。

对于本申请的所有实施模式优选是以通过本发明的化合物对肿瘤特异分子的离域作用而抑制肿瘤特异细胞的生长或诱发肿瘤特异分子的细胞程序死亡。

与目前技术现状的治疗配方不同，本发明的治疗配方是指向一致癌基因分子的离域作用，在这里不是抑制致癌基因的功能，而是用于消除含有致癌基因的细胞。按本发明的化合物有特效性高，对不具有肿瘤特异分子的细胞没有任何作用。因此新的治疗配方不会出现个别致癌基因反复的经历，而是用消除肿瘤细胞的这种方法改变肿瘤细胞的一种特异性质，其中该方法利用的事实是，很多蛋白质的功能-也包括致癌蛋白质的功能-不仅仅是与它们的形态有关，而且完全起决定性的是与在细胞中致癌蛋白质的定位有关。

按本发明的一实施模式涉及到的化合物是肽、寡肽、蛋白质或熔合蛋白质，但也可以加入能与肿瘤特异分子有特定结合为特征的小分子。此处可应用的有大量的有机分子，作为有机分子可理解为所述的低分子量的碳氢化合物，它们的分子量可＜5000Da，优选为＜1000Da和特别优选为＜500Da，也可以设想应用由两个不同组分构成的拼合在一起的分子。

肿瘤特异分子是这样的分子，其形态或者是在肿瘤细胞中唯一存在的，或者它在细胞中存在的浓度有别于健康细胞。在肿瘤特异分子中优选也涉及到肽、寡肽、蛋白质、融合蛋白质、RNA或DNA，此处也可以是肿瘤特异的转译后的修饰物，如磷酸化、糖基化、乙酰化、甲基化和相类似的修饰作为肿瘤特异的参变物。

按本发明的一个实施模式在肿瘤特异分子中涉及到一种仅在肿瘤细胞中存在的融合蛋白质，例如AML1-ETO分子，另外涉及到的肿瘤特异分子是由其它染色体移位形成的白血病以及其它恶性疾病(例如肉瘤中的EWS-Fli)的融合蛋白标记物(Bcr-Abl，PML-RARalpha，PLZF-RARalpha，MLL-融合蛋白标记物等)。

按本发明的化合物对肿瘤特异分子具有结合亲和性，结合亲和性优选在10^-5至10^-12的范围，特别优选在10^-7至10^-9的范围。

按本发明的化合物能对肿瘤特异分子的离域起作用。在本发明的范围内对肿瘤特异分子离域的理解是将细胞或组织内部的分子转送到通常肿瘤细胞的该分子不存在的地址，例如离域作用可使肿瘤特异蛋白质(例如转录激活剂或阻抑剂)与在某位置上的基因组DNA相结合，而一般肿瘤特异蛋白质在该位置上是不相结合的。

按另一实例，一个肿瘤特异分子离域作用的结果能使它分泌出来或转送到细胞器中，尽管它在肿瘤细胞中是胞核分子；例如虽然肿瘤特异分子在肿瘤分子中是胞核分子，却可以从细胞核中转送出来。

按本发明的一特别优选的实施模式，肿瘤特异分子的离域作用导致肿瘤细胞生长的抑制超过60％，此处特别优选是大于80％的抑制，生长抑制作用可根据Mizuki方法在甲基纤维素中通过生成菌群的减少来测定(Mizuki，M.et al.，″F1t3 mutations from patients with acutemyeloid leukemia induce transformation of 32D cells mediated by the Rasand STATS pathways″，Blood，2000 Decl，vol.96(12)，3907-14)。

按可替代的实施模式离域作用导致在肿瘤细胞中诱发细胞程序死亡，在用本发明的分子处置的细胞中肿瘤细胞程序死亡与未经处置的细胞相比优选提高2倍，此时细胞程序死亡的提高至少为3倍时为特别优选，在肿瘤细胞中诱发细胞程序死亡的增加可借助标准检定方法测定(Darzynkiewitz，z.et al.，″Flow cytometry in analysis of cell cycleand apoptosis，Semin Hematol.2001 Apr.，vol 38(2)，179-93″)。

在本发明的范围内肿瘤特异分子的离域作用例如可导致肿瘤特异分子与调节基因转录的核酸序列相结合，通过肿瘤特异分子的结合可使基因转录激活或抑制。

按一特别优选的实施模式化合物包括c-myb DNA结合界域(-Domane)的肽序列和/或MEF(“myeloid elf like factor”)的AML1-结合界域的肽序列。按一特别优选的实施模式本发明的化合物具有在SEQ ID NO：1中显示出的氨基酸序列。

此外，本发明涉及对本发明的与肿瘤特异分子有结合亲和性的、又能使肿瘤特异分子离域的肽或蛋白质编码的核酸，其中的核酸优选涉及DNA或RNA。核酸可以是媒介体(载体)的一部分，该媒介体能读出对核酸的表达。按一特别优选的实施模式本发明的化合物由在SEQ ID NO：2中显示出的核苷酸序列编码。

按一另外的实施模式本发明涉及具有本发明的核酸的宿主细胞。

本发明还包括含有本发明的化合物、核酸或宿主细胞的药物，该药物还可以包含在制药学上能相容的载体和能制成口服、静脉或肌肉用药。

此外，本发明涉及按本发明的化合物、核酸或宿主细胞制成用于治疗肿瘤、白血病，特别是急性髓细胞白血病的一种药物，对由于t(8；21)移位引起的急性髓细胞白血病的治疗特别优选。

在本发明范围内还包括制造本发明化合物的方法，此处只要是涉及肽或蛋白质，该方法可进行重组体表达或通过蛋白质合成制取。

最后本发明涉及到鉴别适用于治疗肿瘤的化合物的方法，其中包括：

(a)鉴别肿瘤特异分子，和

(b)鉴别化合物，该化合物对肿瘤特异分子具有结合亲和性和能对肿瘤特异分子的离域起作用。

肿瘤特异分子在本方法中借助现代化的Genomik-和Proteomik-方法进行鉴别。此处作为举例采用微阵列分析或2D-蛋白质凝胶电泳法与其相连的质谱鉴定法以及这些方法的联合使用。

所有在现有技术中分析肿瘤细胞与没有质变细胞之间的区别的已知方法按本发明都可用于鉴别肿瘤特异分子。

在第二步中是鉴别能用于使肿瘤特异分子离域的目标分子，此处涉及到的仍然是肽、RNA或DNA-片瑕。

筛选方法优选是应用大通量方法，借助自动滴管机器手动试验数千个样品和肿瘤特异分子及离域分子的结合，然后选出那些与两类分子之一或同时与二者结合上有高亲和性和特异性的化合物。如果鉴别出两种不同的分子(其中一种是与肿瘤特异分子结合的和另一种是引起离域作用的)，则将这些分子通过化学方法，例如通过引入多接头剂进行偶联，这种筛选方法的优点在于，每个分子必须与目标分子相结合，但不一定非要对目标分子的功能有所影响。

在下面的举例中制成了经重组的融合蛋白质，以便使AML1-ETO-阻抑物的活性指向对骨髓细胞的生存和增生有重要作用的启动子。通过各种不同的作用达到了很高程度的特异性。C-myb结合位被作为对GFP-M&M和AML1-ETO阻抑物复合物的目标。C-myb对造血细胞是必不可少的，但对其它器官的发育成长并不重要(Muenski，1991，cellvol.65.S.677-89)。

C-myb对于白血病细胞的细胞增生之重要意义一般是已知的。抑制myb-有关的基因成为治疗白血病的重要目标(Mucenski，1991，cellvol.65，S.677-89；Ratajczak，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.89，S.118237；Gewirtz et al.，1988，Sci.Vol.242，S.1303-6；Gewirtz A.M.，1999，Oncogene，vol.18，3056-62)。

实验表明，按本发明的离域分子(此处为经重组的融合蛋白质)与不能表达AML1-ETO的细胞相比是非毒性的，而对肿瘤诱发转化的细胞达到了特效的毒性。

附图说明

图1：AML1-ETO离域蛋白质的设计(构思)图

a.由C-myb的DNA结合界域和MEF的AML1结合界域构成的嵌合体蛋白质功能的假设。

b.嵌合体蛋白质和中间缺失突变体的构造。

c.含GFP、GFP-ΔM&M和GFP-M&M的细胞转染后带有抗-GFP-抗体的Cos7-细胞分解物的免疫印迹证明。

图2：在试管中GFP-M&M在myb结合位上的特异结合和AML1-ETO结合，用c-myb GFP-M&M和AML1-ETO转染的Cos7-细胞的胞核萃取物的分析是采用“电泳迁移率变动分析”(EMSA)方法，用特异的myb和非特异的寡核苷酸的竞争实验显示GFP-M&M结合的特异性，通过GFP-M&M与AML1-ETO的共转染生成的M&M过度变位表明AML1-ETO离域到myb结合位。

图3：借助GFP-M&M使AML1-ETO在内源的c-kit启动子上结合。用FLAG-AML1-ETO和GFP或GFP-M&M转染KCL22细胞，结合DNA的蛋白质借助甲醛牢固地偶合在DNA上，使细胞分解，DNA断裂和用抗-FLAG或非特异的抗体免疫沉淀，在免疫沉淀的染色质中C-kit和P14^ARF的启动子序列用PCR检测，展示的是有代表性的两组试验。

图4：在AML1-ETO存在时通过GFP-M&M，myb-有关启动子的特异阻抑作用，用myb-有关的荧光素酶构造物和C-myb、AML1、AML1-ETO、GFP-ΔM&M和GFP-M&M(如所示)瞬时转染KCL22细胞，表示了三组无关联试验的平均值和标准误差。

图5：GFP-M&M抑制在AML1-ETO表达的细胞中的菌落生长

a.用GFP作为对照检查或用AML1-ETO和GFP-M&M如说明转染32D细胞，和在菌落验证方法中迁移1×10⁵细胞，照片显示在第10天有代表性的菌落。

b.按说明进行转染的32D细胞在菌落验证方法中迁移，在第1O天计数菌落，此处表示菌落生长的阻抑与用GFP(表示为1)已进行对照检查转染的比较，表示出3组无关联试验的平均值和标准误差。

c.AML1-ETO单独或与GFP-M&M或GFP-ΔM&M配合一起转染32D-细胞，尔后用菌落验证方法迁移，表示3组无关联实验的平均值和标准误差。

d.GFP或GFP-M&M转染到自然表达AML1-ETO的Kasumi-1-细胞中和在菌落验证方法中迁移，表示3组无关联实验的平均值和标准误差。

图6：在AML1-ETO表达的细胞中GFP-M&M诱发细胞程序死亡。32D细胞用AML1-ETO、GFP-M&M或两个媒介体转染，转染的细胞用通过量细胞计数法分类，然后在-TUNEL-验证方法中分析转染的细胞。

a.图示BrdU-阳性的程序死亡细胞的FACS结果，空位曲线表示作为对照目的在用空媒介体转染的细胞中细胞程序死亡率。

b.表示在转染的32D细胞中程序死亡的细胞分额。

图7：在无AML1-ETO的细胞中MYB-有关的启动子在体内不受GFP-M&M抑制，因GFP或GFP-M&M转导原始的鼠骨髓细胞，继而分析在阳性的细胞中KIT表达，表示出由2组无关联实验之一的结果。

材料和方法

在举例中应用了下述材料和方法：

1.质粒：

借助PFU-聚合酶链反应(PCR)应用鼠的c-myb表达质粒和KCL22细胞的CDNA作为模板制备在pcDNA3.1的GFP-M&M表达质粒，其中特异引物应用于C-myb(由SEQ ID NO：13的核苷酸193-594编码；包括KpnI和BamHI的限制(性内切酶)酶切位)的DNA结合界域和MEF(由SEQ ID NO：12的核苷酸编码；包括BamHI和EcoRI的限制(性内切酶)酶切位)的AML1结合界域。PCR产物克隆在GFP-PcDNA3.1(GFP相当于SEQ ID NO：11的核苷酸91-813)中的读带方向，GFP ΔM&M也相应克隆，其中应用了PCR片段，但缺少C-Myb结合界域中最初的159基础对。

活于MEF的AML1结合界域的引物

MEF-BamH1 for：5′-ATA GGA TCC GCC ACC TCG CAC ACCATG TCA-3′(SEQ ID NO：3)

MEF-EcoR1 rev：5′-CAG AAT TCG CCT TTG CCA TCC TTT GATTTC-3′(SEQ ID NO：4)

适于C-myb的DNA-结合界域的引物

myb-Kpnl for：5′-CAG AGA GGT ACC GTC ATT GCC AAT TATCTG-3′(SEQ ID NO：5)

myb-BamH1 rev：5′-CAG AGA GGA TCC GTA GCC TTC CTGTTC CAC-3′(SEQ ID NO：6)

myb-TK(胸苷激酶)荧光素酶结构由klempnauer教授赠送，AML1-ETO亚克隆在pcDNA3.1中。

2.细胞系和转染

按现有技术已知的方法对IL-3有关的鼠骨髓细胞系32Dc13、人的骨髓细胞系KC122和Kasumi-1以及猿猴肾的细胞系Cos7进行培育，32Dcl3细胞和KC122细胞通过电穿孔法用15μg DNA质粒转染，而Cos-细胞应用Lipofectamin试剂(在活体外)条件下用5μg DNA质粒转染。

3.免疫印迹法

由用GFP、GFP-M&M或GFP-ΔM&M的表达媒介体转染的Cos-细胞制备蛋白溶解物，用单克隆的鼠的GFP-抗体(Clonetech，Heidelerg德国)证明了三种蛋白质。此项验证是通过用四季萝卜-过氧化酶共轭的次生IgG-抗体对家鼠IgG完成孵化的。(Jackson免疫研究)

4.电泳迁移率变动分析

Cos7-细胞应用总量为5μg的C-myb、AML1-ETO、GFP和GFP-M&M以及不同组合进行转染，转染的Cos7-细胞的胞核萃取物的制备，结合反应和具有C-myb共有区结合序列的寡核苷酸在Müller et al.，1999，Blood，vol.94，S.4255-62一文中作过描述。取100ng或有myb共有序列位或有非特异结合位的双链段寡核苷酸用于竞争性实验。

5.染色质免疫沉淀

KCL22细胞用FLAG AML1-ETO和GFP或GFP-M&M转染，转染后12小时加入1％甲醛，10分钟细胞蛋白质结合在DNA上，接着通过添加0.125M甘氨酸终止反应。细胞两次加到冰冷的PBS中洗涤和在1ml RIPA溶胞缓冲剂中用蛋白酶阻抑剂200μM原钒酸钠和50μMNaF分解。经10分钟用冰孵化之后染色质腊助紫外线断裂(5秒9脉冲)。细胞碎屑用离心过滤法分离，并保存50μl作为“Input”对照检查物，其它的破裂溶解物在含有5μg家免-和鼠-IgG的40ml蛋白质A/G-琼脂糖中-预净化。每一溶胞产物的剩余物分成两个样品，免疫沉淀或者是用3μg抗-FLAG或者是用含40μl蛋白质A/G琼脂糖的鼠-IgG过夜进行的。免疫复合物用8倍含微量盐的缓冲剂洗涤(0.1％SDS，150μM NaCl，1％Triton x-100。2μM EDTA，pH8.0，20μM Tris-HCl，pH8.1)，紧接着，再次溶解免疫复合物和“input”对照检查物中的DNA和蛋白质之间的化合物，DNA从苯酚/氯仿溶液中萃取出来，然后借助PCR检测样品中C-kit启动子区域和P14^ARF启动子区域的特异启动子序列。

PCR是用Tag-聚合酶(Promega)在-Mastercycler(Eppendorf)中进行的(95℃3分钟，37个循环：95℃1分钟；60℃1分钟和72℃1分钟)，产物用琼脂糖凝胶分离和用溴化乙锭染色。

P14 ^ARF 启动子区域的引物

P14^ARF for：5′-AGT GGC TAC GTA AGA GTG ATC GC-3′(SEQ IDNO：7)

P14^ARF rev：5′-CTT ACA GAT CAG ACG TCA AGC CC-3′(SEQ IDNO：8)

C-kit启动子区域的引物

C-kit for：5′-ACT GTT GTT GCT TTC CGT TCA A-3′(SEQ IDNO：9)

C-kit rev：5′-TTA AGC CCG ATT TCA CTG CC-3′(SEQ ID NO：10)

6.荧光素酶-验证

启动子活性的验证是按目前技术现状已知的方法进行的(Muller etal.，2000，mol.Cell.Biol.，vol.20，S.3316-29)。借助电泳法转染15.5μg总量的质粒。混合物是由5μg myb-TK荧光素酶构造物，0.5μg PRL-null质粒(Promega，Madison，WI)作为内标用和5μg不同组合的AML1、AML1-ETO、GFP-ΔM&M与GFP-M&M表达媒介体组成的。为平衡转染DNA的总量将空媒介体一起转染，18小时后细胞经破裂溶解和Firelly-和Renilla-荧光素酶的活性系用Promega公司的“双数荧光素酶分析系统”检测，Renilla-荧光素酶的活性作为转染效率的内标利用，由3组无关联的实验中计算平均值和标准误差。

7.在甲基纤维素中克隆体的生长

用总量为15g的AML1、AML1-ETO、GFP-M&M和GFP-ΔM&M的表达媒介体以不同组合瞬时转染32DC13细胞和Kasumi细胞。为了试验克隆体的生长，用电穿孔法在处理的当天进行分级离心分离，并以在每35mm平板上有1×10⁵存活细胞的浓度移往1ml的混合培养物中。该混合物是由“Isocove改进的Dulbecco培养基”(IMDM，lifeTechnologies，Grand Island，N.Y.)，1％甲基纤维素，20％FCS，IL-3(1ng/ml)和0.6mg/dl G418组成的。所有试验做了三次，在第10天计数菌落，从三次无关联的实验(对kasumi细胞是二次实验)中计算平均值和标准误差。

8.细胞程序死亡检测

用GFP、GFP-M&M和AML1-ETO的表达媒介体以不同组合瞬时转染32Dcl3细胞，经24小时后GFP-阳性的细胞借助流通量细胞计数法从全部细胞中分选出来和继续试验，在GFP阳性细胞之内的细胞程序死亡的百分数可用TUNEL分析法(Pharmiger公司的APO-Brdukit)测定，实验按制造商操作指南进行，给出的是具有相似结果的三组无关联实验之一的结果。

9.原生骨髓细胞的逆转录病毒的转导

从Femura 6个月大的BALB/C小鼠中取出骨髓细胞，在添加鼠科IL-3的RPMI1640-培养基中培育，Phoenix-细胞借助LipofectaminPlus(在体外)用GFP或GFP-M&M在MSCV2.2中瞬时转染，24小时后更换培养基，转染后48小时收取成熟的，经过滤(0.45μm)，在补加4μg/ml的1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物之后加到骨髓细胞中，然后在2000g离心力时将细胞离心过滤45分钟，在37℃孵化2小时，然后如所述第二次转导，第二天再完成其它两轮转导。

转导结束后24小时借助流通量细胞计数法按厂家提供的说明检查细胞中GFP表达和KIT(Pharmingen公司的抗-CD117-PE)表达。并用膜联蛋白V-PE(Pharmingen公司)检验细胞程序死亡。

例1GFP-M&M的克隆和在Cos-细胞中的表达

由“增强的缘荧光蛋白质”(GFP，用于验证目的，用SEQ ID NO：11的核苷酸91-813编码)，鼠的C-myb(SEQ ID NO：13的核苷酸对鼠的C-myb的氨基酸根193-594编码；参照Sakura et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.86，S.5758-61)和人的髓细胞11相似因子的AML1-结合界域，MEF(SEQ ID：12的核苷酸251-618对人的MEF氨基酸报编码，参照Mao S.et al.，1999，Mol.Cell.Biol.，vol.19，S.3635-44)设计构组融合蛋白质。

转录因子C-myb对于正常的生成血细胞和造血细胞的存活有着重要作用是已知的(Mucenski et al.，1991，cell，vol.65，S.677-89)还可表明，通过反义对策的C-myb阻抑或失效鼠的C-myb不具有生成正常血细胞的能力(Ratajczak et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.89，S.11823-7)。

作为嵌合蛋白质的第二部分应用MEF(髓细胞相似ELF因子)的AML1结合。MEF的氨基酸87-206在体内和体外在AML1和AML1-ETO上结合力很强(Mao S.Et al.，1999，Mol.cell.Biol.，vol.19，S.3635-44)所有三个界域都克隆在PcDNA3.1表达媒介体中的读带方向。这一构造物称为GFP-M&M(图1b)。为了对照检查目的制备出不具有C-myb DNA结合界域最初53氨基酸的缺失突变体。将缺失突变体称为GFP-M&M。

重组蛋白质表达的分析是在瞬时转染到Cos7-细胞上之后借助免疫印迹验证方法应用抗-GFP-抗体进行的(GFP单独35KDa，GFP-M&M80KDA；GFP-M&M 85kDa；图1c)。

例2GFP-M&M结合在myb结合位上的分析

为分析GFP-M&M与myb DNA结合位的相互作用，采用电泳迁移率变动分析法(参照图2)，为此制备出用胞核萃取物瞬时转染的Cos7-细胞，将双链的myb共有序列寡核苷酸作为目标DNA。该实验表明，GFP-M&M类似于C-myb结合在myb DNA-结合位上，AML1-ETO单独在myb结合位上不能结合，但GFP-M&M可使AML1-ETO结合在DNA上，其结果导致由DNA、GFP-M&M和AML1-ETO组成的复合物形成一个过度移位(图2)。

例3GFP-M&M与在内源的C-kit启动子上的AML1-ETO相结合

GFP-M&M和AML1-ETO在内源的C-myb目标启动子上的结合在KCL22细胞中应用染色质免疫沉淀-检验方法(chip)分析。

作为C-myb有内源启动子选择了C-kit启动子，分析经过验证的在P14ART启动子上结合的AML1-ETO作为肯定结果的对照(Linggi etal.，Nature Medicine，8(7)，Juli 2002)。表达为与在KCL22细胞中GFP或GFP-M&M组合的一种用FLAG标记的AML1-ETO形态。转录因子应用甲醛与DNA交联，在细胞的破裂溶解和DNA断裂之后将DNA/AML1-ETO复合物在应用抗-FLAG-抗体时或为非特异抗体的对照目的时进行免疫沉淀。交联被中止并借助PCR分析C-kit-与P14^ARF-启动子DNA序列的存在，在用AML1-ETO和GFP转染的KCL22细胞的Chip样品中没有检验出C-kit启动子序列。

在GFP-M&M存在时带有AML1-ETO的C-kit启动子序列能免疫沉淀(图3)。与此相反，在用AML1-ETO和GFP转染的KCL22细胞的免疫复合物中的P14^ARF启动子序列可检验出来，在AML1-ETO和GFP-M&M存在下却没有检验出该序列(图3)。

这一结果表明，GFP-M&M、AML1-ETO在内源的C-myb有关的启动子在体内可以是结合的。

例4在GFP-M&M和AML1-ETO存在下myb有关启动子的阻抑作用

GFP-M&M结合在myb有关的启动子上，与AML1-ETO(只要存在时)形成复合物和由此而抑制基因表达。

为了进一步验证进行了荧光素酶分析，此时荧光素酶-基因是在微量的带有3个附加myb DNA-结合位的胸苷激酶素对照之下(Zieboldet al.，1997，Curr.Biol.Vol.7.S.253-60)。用报道的构造物和GFP、GFP-M&M和AML1-ETO以不同组合转染KCL22细胞(图4)，没有任何蛋白质单独对荧光酶素活性有实质的影响。GFP-M&M和AML1-ETO一起表达的细胞表现出对启动子活性大于5倍的抑制作用(图4)。然后进行分析，在GFP-M&M和myb DNA结合位之间功能的交互作用是否对荧光素酶活性的阻抑借助于在AML1-ETO阳性细胞中的GFP-M&M是必需的，在GFP-ΔM&M中的DNA结合位的突变阻抑了重组蛋白质的DNA结合而蛋白质的表达没有改变(图1b)。既不是GFP-ΔM&M单独表达，也不是GFP-ΔM&M和AML1-ETO共同表达阻抑了荧光素酶活性。

这些结果表明，结合在DNA上的GFP-M&M对在AML1-ETO存在下myb有关的基因的阻抑才是必需的(图4)。

例5通过在AML1-ETO表达细胞中的GFP-M&M阻抑菌落生长

转录因子myb的活性和myb有关基因的表达对造血细胞的生长和增殖有着重要意义(white et al.，2000，Oncogene，vol.19，S.1196-205)。所以分析了GFP-M&M对含有AML1-ETO细胞的增殖和存活率的作用。

首先试验了经转染的造血的32D细胞对生成菌落的能力，在用AML1、GFP-M&M或AML1和GFP-M&M转染细胞中的菌落生长并未受到阻抑。

单独用AML1-ETO转染的细胞表现出对菌落生长的6倍的抑制作用。这可能是由于AML1-ETO本身的毒性效应所致(Muller et al.，Mol.cell.Bio.，2000，vol.20.，S.3316-29)。在AML1-ETO存在时用GFP-M&M转染的32D细胞对菌落生长大约减少了60倍(图5a和b)。对照在菌落分析中的GFP-M&M和GFP-ΔM&M可以确定，GFP-M&M和AML1-ETO的共同表达使菌落的相对数目减少80％以上；与此相反，GFP-ΔM&M和AML1-ETO对菌落生长没有抑制作用(图5c)。后一观察表明，GFP-M&M和myb DNA结合位间的功能交互作用对阻抑在AML1-ETO阳性细胞中菌落生长才是必需的。

除了在AML1-ETO转染的细胞中GFP-M&M的作用外，还试验了GFP-M&M在t(8；21)阳性Kasumi-1的白血病细胞中的活性。在用GFP-M&M转染后与用GFP-PcDNA3.1单独(对照用)转染的细胞相比，菌落生长降低了12倍(图5d)。

例6通过在含有AML1-ETO的细胞中的GFP-M&M诱发细胞程序死 亡

不显示C-myb活性的造血细胞会遭遇细胞程序死亡(Taylor et al.，1996，Genes Dev.，vol.10，S.2732-44)。

为了试验在AML1-ETO阳性的细胞中GFP的作用和其对细胞程序死亡的影响，借助TUNEL分析法检查DNA断裂链的存在，用GFP、AML1-ETO或GFP-M&M或者用AML1-ETO与GFP-M&M的组合物转染32D-细胞，24小时之后GFP、AML1-ETO或GFP-M&M单独表达的细胞约有10％细胞程序死亡。与此相反，在那些既表达AML1-ETO又表达GFP-M&M的细胞中程序死亡的细胞的百分数为39％，这相当于细胞程序死亡率提高了4倍(图6a和b)。

例7在没有AML1-ETO的细胞中MYB有关的启动子在体内不受 GFP-M&M阻抑

为了表明在没有AML1-ETO存在的GFP-M&M在体内不阻抑MYB-有关的启动子，将原始的鼠骨髓细胞用GFP或GFP-M&M逆转录病毒转导。基于此在GFP-阳性的细胞中在KIT的表达(图7)和细胞程序死亡率上没有出现显著的差别，这就表明，本发明的化合物在健康的细胞中不诱发MYB有关启动子转录的特异阻抑作用。

                                 序列表

<110>明斯特大学(University Munster)

<120>离域分子(Dyslokationsmolekule)

<130>SCT051983-46

<160>13

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>497

<212>PRT

<213>kūnstliche Sequenz

<223>Aminosāuresequenz von GFP-M&M

<400>1

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1               5                   10                  15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

            20                  25                  30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

        35                  40                  45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

    50                  55                  60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65                  70                  75                  80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

                85                  90                  95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

            100                 105                 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

        115                 120                 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

    130                 135                 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145                 150                 155                 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

                165                 170                 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

            180                 185                 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

        195                 200                 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

    210                 215                 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly

225                 230                 235                 240

Thr Val Ile Ala Asn Tyr Leu Pro Asn Arg Thr Asp Val Gln Cys Gln

                245                 250                 255

His Arg Trp Gln Lys Val Leu Asn Pro Glu Leu Ile Lys Gly Pro Trp

            260                 265                 270

Thr Lys Glu Glu Asp Gln Arg Val Ile Glu Leu Val Gln Lys Tyr Gly

        275                 280                 285

Pro Lys Arg Trp Ser Val Ile Ala Lys His Leu Lys Gly Arg Ile Gly

    290                 295                 300

Lys Gln Cys Arg Glu Arg Trp His Asn His Leu Asn Pro Glu Val Lys

305                 310                 315                 320

Lys Thr Ser Trp Thr Glu Glu Glu Asp Arg Ile Ile Tyr Gln Ala His

                325                 330                 335

Lys Arg Leu Gly Asn Arg Trp Ala Glu Ile Ala Lys Leu Leu Pro Gly

            340                 345                 350

Arg Thr Asp Asn Ala Ile Lys Asn His Trp Asn Ser Thr Met Arg Arg

        355                 360                 365

Lys Val Glu Gln Glu Gly Tyr Gly Ser Ala Thr Ser His Thr Met Ser

    370                 375                 380

Thr Ala Glu Val Leu Leu Asn Met Glu Ser Pro Ser Asp Ile Leu Asp

385                 390                 395                 400

Glu Lys Gln Ile Phe Ser Thr Ser Glu Met Leu Pro Asp Ser Asp Pro

                405                 410                 415

Ala Pro Ala Val Thr Leu Pro Asn Tyr Leu Phe Pro Ala Ser Glu Pro

            420                 425                 430

Asp Ala Leu Asn Arg Ala Gly Asp Thr Ser Asp Gln Glu Gly His Ser

        435                 440                 445

Leu Glu Glu Lya Ala Ser Arg Glu Glu Ser Ala Lys Lys Thr Gly Lys

    450                 455                 460

Ser Lys Lys Arg Ile Arg Lys Thr Lys Gly Asn Arg Ser Thr Ser Pro

465                 470                 475                 480

Val Thr Asp Pro Ser Ile Pro Ile Arg Lys Lys Ser Lys Asp Gly Lys

                485                 490                 495

Gly

<210>2

<211>1491

<212>DNA

<213>artificial sequence

<223>Nucleotide sequence of GFP-M&M

<400>2

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac     60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac    120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc    180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag    240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc    300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg    360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac    420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac    480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc    540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac    600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc    660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagggt    720

accgtcattg ccaattatct gcccaaccgg acagatgtgc agtgccaaca ccggtggcag    780

aaagtgctga accctgaact catcaaaggt ccctggacca aagaagaaga tcagagagtc    840

atagagcttg tccagaaata tggtccgaag cgttggtctg ttattgccaa gcacttaaaa    900

gggagaattg gaaagcagtg tcgggagagg tggcacaacc atttgaatcc agaagttaag     960

aaaacctcct ggacagaaga ggaggacaga atcatttacc aggcacacaa gcgtctgggg    1020

aacagatggg cagagatcgc aaagctgctg cccggacgga ctgataatgc tatcaagaac    1080

cactggaatt ccaccatgcg tcgcaaggtg gaacaggaag gctacggatc cgccacctcg    1140

cacaccatgt caaccgcgga agtcttactc aatatggagt ctcccagcga tatcctggat    1200

gagaagcaga tcttcagtac ctccgaaa tgcttccagact cggaccctgc accagctgtc    1260

actctgccca actacctgtt tcctgcctct gagcccgatg ccctgaacag ggcgggtgac    1320

actagtgacc aggag9g9ca ttctctggag gagaaggcct ccagaga99a aagtgccaag    1380

aagactggga aatcaaagaa gagaatccgg aagaccaagg gcaaccgaag tacctcacct    1440

gtcactgacc ccagcatccccattaggaag aaatcaaagg atggcaaagg c              1491

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<223>Oligonucleotide primer MEF-BamHI for

<400>3

ataggatccg ccacctcgca caccatgtca                                       30

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<223>Oligonucleotide primer MEF-EooRI rev

<400>4

cagaattcgc ctttgccatc ctttgatttc                                       30

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<223>Oligonucleotide primer myb-KpnI for

<400>5

cagagaggta ccgtcattgc caattatctg                                        30

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<223>Oligonucleotide primer myb-BamHI rev

<400>6

cagagaggat ccgtagcctt cctgttccac                                      30

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>artificial sequence

<223>Oligonucleotide primer p14^ARF for

<400>7

agtggctacg taagagtgat cgc                                             23

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>artificial sequence

<223>Oligonucleotide primer p14^ARF rev

<400>8

cttacagatc agacgtcaag ccc                                             23

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>artificial sequence

<223>Oligonucleotide primer c-kit for

<400>9

actgttgttg ctttccgttc aa                                              22

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>artificial sequence

<223>Oligonucleotide primer c-kit rev

<400>10

ttaagcccga tttcactgcc                                                  20

<210>11

<211>4151

<212>DNA

<213>artificial sequence

<223>cDNA EGFP

<400>11

tagttattac tagcgctacc ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg      60

acggtaccgc gggcccggga tccaccggtc gccaccatgg tgagcaaggg cgaggagctg     120

ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc     180

agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc     240

tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc     300

gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc     360

atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag     420

acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc     480

atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc     540

cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc     600

cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc     660

atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg     720

agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc     780

gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtaaagcg gccgcgactc tagatcataa     840

tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc     900

tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata     960

atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc    1020

attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta aggcgtaaat tgtaagcgtt    1080

aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt taaccaatag    1140

gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt    1200

gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga    1260

aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg    1320

gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg atttagagct    1380

tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc    1440

gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt    1500

aatgcgccgc tacagggcgc gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct    1560

atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga    1620

taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtcctgagg cggaaagaac cagctgtgga    1680

atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa    1740

gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca    1800

gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc    1860

ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt    1920

tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag aagtagtgag    1980

gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aagatcgatc aagagacagg atgaggatcg    2040

tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg    2100

ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg    2160

ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat    2220

gaactgcaag acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca    2280

gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg    2340

gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat    2400

gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa    2460

catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg    2520

gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgagcatg    2580

cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg    2640

gaaaatg9cc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat    2700

caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac    2760

cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc    2820

cttcttgacg agttcttctg agcgggactc tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc    2880

ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg    2940

gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt    3000

tcttcgccca ccctaggggg aggctaactg aaacacggaa ggagacaata ccggaaggaa    3060

cccgcgctat gacggcaata aaaagacaga ataaaacgca cggtgttggg tcgtttgttc    3120

ataaacgcgg ggttcggtcc cagggctggc actctgtcga taccccaccg agaccccatt    3180

ggggccaata cgcccgcgtt tcttcctttt ccccacccca ccccccaagt tcgggtgaag    3240

gcccagggct cgcagccaac gtcggggcgg caggccctgc catagcctca ggttactcat    3300

atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc    3360

tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag    3420

accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct    3480

gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac    3540

caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc    3600

tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg    3660

ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt    3720

tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt    3780

gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc    3840

tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca    3900

gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata    3960

gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg    4020

ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct    4080

ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta    4140

ccgccatgca t                                                         4151

<210>12

<211>1992

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<223>cDNA MEF

<400>12

atggctatta ccctacagcc cagtgacctg atctttgagt tcgcaagcaa cgggatggat      60

gatgatatcc accagctgga agacccctct gtgttcccag ctgtgatcgt ggagcaggta     120

ccctaccctg atttactgca tctgtactcg ggactggagt tggacgacgt tcacaatggc     180

atcataacag acgggacctt gtgcatgacc caggatcaga tcctggaagg cagttttttg     240

ctgacagatg acaatgaggc cacctcgcac accatgtcaa ccgcggaagt cttactcaat     300

atggagtctc ccagcgatat cctggatgag aagcagatct tcagtacctc cgaaatgctt     360

ccagactcgg accctgcacc agctgtcact ctgcccaact acctgtttcc tgcctctgag     420

cccgatgccc tgaacagggc gggtgacact agtgaccagg aggggcattc tctggaggag     480

aaggcctcca gagaggaaag tgccaagaag actgggaaat caaagaagag aatccggaag     540

accaagggca accgaagtac ctcacctgtc actgacccca gcatccccat taggaagaaa     600

tcaaaggatg gcaaaggcag caccatctat ctgtgggagt tcctcctggc tcttctgcaa     660

gacagaaaca cctgtcccaa gtacatcaag tggacccagc gagagaaagg catcttcaaa     720

ctggtggact ccaaagctgt gtccaagctg tgggggaagc agaaaaacaa gcctgacatg     780

aactatgaga caatggggcg ggcactaaga tactactacc aaagaggcat actggccaaa     840

gtggaagggc agaggctggt gtaccagttt aaggagatgc ccaaggacct ggtggtcatt     900

gaagatgagg atgagagcag cgaagccaca gcagccccac ctcaggcctc cacggcctct     960

gtggcctctg ccagtaccac ccggcgaacc agctccaggg tctcatccag atctgccccc    1020

cagggcaagg gcagctcttc ttgggagaag ccaaaaattc agcatgtcgg tctccagcca    1080

tctgcgagtc tggaattggg accgtcgcta gacgaggaga tccccactac ctccaccatg    1140

ctcgtctctc cagcagaggg ccaggtcaag ctcaccaaag ctgtgagtgc atcttcagtg    1200

cccagcaaca tccacctagg agtggccccc gtggggtcgg gctcggccct gaccctgcag    1260

acgatcccac tgaccacggt gccgaccaat gggcctcctg ccagtactac tgctcccact    1320

cagctcgttc tccagagtgt tccagcggcc tctactttca aggacacctt cactttgcag    1380

gcctctttcc ccctgaacgc cagtttccaa gacagccagg tggcagcccc aggggctcca    1440

ctgattctca gtggcctccc ccaacttctg gctggggcca accgtccgac caacccggcg    1500

ccacccacgg tcacaggggc tggaccagca gggcccagct ctcagccccc tgggactgtc    1560

attgctgcct tcatcaggac ttctggcact acagcagccc ctagggtcaa ggaggggcca    1620

ctgaggtcct cctcctatgt tcagggtatg gtgacggggg cccccatgga ggggctgctg    1680

gttcctgaag agaccctgag ggagctcctg agagatcagg ctcatcttca gccacttcca    1740

acccaggtgg tttccagggg ttccacaatc ccgagccttc tgggcaacca gactttgtct    1800

cctcccagcc gccccactgt tgggctgacc ccagtggctg aacttgagct ctcctcaggc    1860

tcagggtccc tgctgatggc tgagcctagt gtgaccacat ctgggagcct tctgacaaga    1920

tcccccaccc cagccccttt ctccccattc aaccctactt ccctcattaa gatggagccc    1980

catgacatat aa                                                        1992

<210>13

<211>1913

<212>DNA

<213>Mus musculus

<223>cDNA c-myb

<400>13

atggcccgga gaccccgaca cagcatctac agtagcgatg aagatgatga agacattgag     60

atgtgtgacc atgactacga tgggctgctg cccaaatctg gaaagcgtca cttggggaaa    120

actaggtgga caagggaaga ggatgagaag ctgaagaagc tggtggaaca gaacggaaca    180

gacgactgga aagtcattgc caattatctg cccaaccgga cagatgtgca gtgccaacac    240

cggtggcaga aagtgctgaa ccctgaactc atcaaaggtc cctggaccaa agaagaagat    300

cagagagtca tagagcttgt ccagaaatat ggtccgaagc gttggtctgt tattgccaag    360

cacttaaaag ggagaattgg aaagcagtgt cgggagaggt ggcacaacca tttgaatcca    420

gaagttaaga aaacctcctg gacagaagag gaggacagaa tcatttacca ggcacacaag    480

cgtctgggga acagatgggc agagatcgca aagctgctgc ccggacggac tgataatgct    540

atcaagaacc actggaattc caccatgcgt cgcaaggtgg aacaggaagg ctacctgcag    600

aagccttcca aagccagcca gacgccagtg gccacgagct tccagaagaa caatcatttg    660

atggggtttg ggcatgcctc acctccatct cagctctctc caagtggcca gtcctccgtc    720

aacagcgaat atccctatta ccacatcgcc gaagcacaaa acatctccag tcacgttccc    780

tatcctgtcg cattgcatgt taatatagtc aacgtccctc agccggctgc ggcagccatc     840

cagagacact ataacgacga agaccctgag aaggaaaagc gaataaagga gctggagttg     900

ctcctgatgt caacagagaa cgagctgaag ggacagcagg cattaccaac acagaaccac     960

acttgcagct accccgggtg gcacagcacc tccattgtgg accagaccag acctcatggg    1020

gatagtgcac ctgtttcctg tttgggagaa caccatgcca ccccatctct gcctgcagat    1080

cccggctccc tacctgaaga aagtgcctca ccagcaaggt gcatgatcgt ccaccagggc    1140

accattctgg acaatgttaa gaacctctta gaatttgcag aaacactcca gtttatagat    1200

tctttcttga acacttccag caaccatgaa aactcgggct tagatgcacc taccttaccc    1260

tccactcctc tcattggtca caaactgaca ccatgtcgag accagactgt gaaaacccag    1320

aaggaaaatt ccatctttag aactccagct atcaaaaggt caatcctcga aagctctcct    1380

cgaactccca caccattcaa acatgccctt gcagctcaag aaattaaata cggtcccctg    1440

aagatgctac ctcagacccc ctcccatgca gtggaggacc tacaagatgt gattaagcgg    1500

gaatcggatg aatctggaat tgttgctgag tttcaagaga gtggaccacc gttactgaaa    1560

aaaatcaagc aggcggtgga gtcgccaact gagaaatcgg gaaacttctt ctgctcaaac    1620

cactgggcag agaacagcct gagcacccaa ctgttctcgc aggcgtctcc tgtggcagat    1680

gccccaaata ttcttacaag ctctgtttta atgacacctg tatcagaaga tgaagacaat    1740

gtcctcaaag cctttaccgt acctaagaac aggcccctgg tgggtccctt gcagccatgc    1800

agtggtgcct gggagccagc atcctgtggg aagacagagg accagatgac ggcctccggt    1860

ccggctcgga aatacgtgaa cgcgttctca gctcgaactc tggtcatgtg aga           1913

Claims (36)

1.一种对特异分子的肿瘤显示出结合亲和性和对肿瘤特异分子的离域能起作用的化合物。

2.按权利要求1的化合物，其中离域作用抑制了肿瘤特异细胞的生长。

3.按权利要求1或2的化合物，使肿瘤特异细胞的离域作用诱发细胞程序死亡。

4.按权利要求1到3之一的化合物是肽、寡肽、蛋白质、融合蛋白质或分子量＜5000、＜1000或＜500的有机分子。

5.按权利要求1到4之一的化合物，其中肿瘤特异分子是肽、寡肽、蛋白质、融合蛋白质、RNA或DNA。

6.按权利要求1至5之一的化合物，其结合亲和性位于10^-5-10^-12、和特别优选位于10^-7-10^-9。

7.按权利要求1至6之一的化合物，其中肿瘤特异分子在健康的细胞中不存在或在是以其它形态存在。

8.按权利要求1至7之一的化合物，其中肿瘤特异分子是融合蛋白质。

9.按权利要求1至8之一的化合物，其中肿瘤特异分子是AML1-ETO。

10.按权利要求1至9之一的化合物，其中肿瘤特异分子显示出DNA结合界域、信号肽、激酶活性、染色体调节性能、蛋白质-蛋白质交互作用区域或转录的性能。

11.按权利要求1至10之一的化合物，其中肿瘤特异分子的离域结合在核酸序列上，该核酸序列调控基因的转录。

12.按权利要求1至11之一的化合物，其中肿瘤特异分子的离域结合在核酸序列上，该核酸序列调控基因的转录，从而可激活或抑制基因的转录。

13.按权利要求1至12之一的化合物，其中该化合物包含C-mybDNA-结合界域的肽序列。

14.按权利要求1至13之一的化合物，其中该化合物包含“髓细胞11相似因子”的AML1-结合界域的肽序列。

15.按权利要求13或14之一的化合物，其中该化合物包括C-mybDNA-结合界域的肽序列和“髓细胞11相似因子”的AML-1-结合界域的肽序列。

16.按权利要求15的化合物，其中该化合物具有在SEQ ID NO：1中所表示的序列。

17.对按权利要求2至16之一的肽或蛋白质编码的核酸。

18.按权利要求17的核酸是DNA或RNA。

19.包括按权利要求17或18之一的核酸的媒介体。

20.具有按权利要求17或18之一的核酸或按权利要求19的媒介体的宿主细胞。

21.包括按权利要求1至16之一的化合物、按权利要求17或18之一的核酸、按权利要求19的媒介体或按权利要求20的宿主细胞的药物。

22.按权利要求21的药物还包括在制药学上能相容的载体。

23.按权利要求21或22的药物配制成能口服、静脉或肌内用药。

24.按权利要求1至16之一的化合物，按权利要求17或18之一的核酸、按权利要求19的媒介体或按权利要求20的宿主细胞的应用是制备治疗肿瘤的一种药物。

25.按权利要求24的应用，此处的肿瘤是白血病，特别是急性髓细胞白血病。

26.按权利要求1至16之一的化合物的制备方法，此处肽或蛋白质是重组表达的或通过蛋白质合成制取的。

27.适用于治疗肿瘤的化合物的鉴别方法包括：

(a)鉴别肿瘤的特异分子，

(b)鉴别化合物，它具有对肿瘤特异分子的结合亲和性和能对肿瘤特异分子的离域起作用。

28.按权利要求27的方法，此处鉴别的化合物其离域作用抑制肿瘤特异细胞的生长和或在肿瘤特异细胞中诱发细胞程序死亡。

29.按权利要求27或28的方法，此处肿瘤特异分子是借助微阵列分析法，2D-蛋白质凝胶电泳法连接质谱鉴定法或借助上述方法的联合进行鉴别的。

30.按权利要求27至29之一的方法，此处对肿瘤特异分子具有结合亲和性和对肿瘤特异分子的离域能起作用的化合物是蛋白质、RNA、DNA或有机化合物。

31.按权利要求27至30之一的方法，此处对肿瘤特异分子具有结合亲和性和对肿瘤特异分子的离域能起作用的化合物借助于物料通量筛选方法进行鉴别。

32.按权利要求27至29之一的方法，此处对肿瘤特异分子具有结合亲和性、对肿瘤分子的离域能起作用的化合物是由两部分组成的。

33.按权利要求32的方法，此处化合物的一部分对肿瘤的特异分子具有结合亲和性和第二部分对肿瘤特异分子的离域起作用。

34.按权利要求32或33的方法，此处该两部分是以分别筛选方法鉴别的。

35.制备一种药物的方法，它包括的步骤有：

(a)适用于治疗肿瘤的化合物是借助按权利要求27至33的一种方法鉴别的，

(b)化合物是用合成法或重组法制备的，和

(c)将化合物配制成一种药物。

36.按权利要求35的方法，此处的药物适合用于治疗肿瘤，例如冶疗白血病，特别是治疗急性髓细胞白血病。

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