DE69929327T2

DE69929327T2 - Verfahren zur schützung gegen ionisierende strahlung oder chemotherapeutisches-arzneimittel-schaden durch in vivo gentherapie

Info

Publication number: DE69929327T2
Application number: DE69929327T
Authority: DE
Inventors: S. Joel Sewickley GREENBERGER
Original assignee: University of Pittsburgh
Current assignee: University of Pittsburgh
Priority date: 1998-05-11
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2019-05-08
Also published as: EP1077728A1; ATE314864T1; DE69929327D1; EP1077728B1; AU3859399A; PT1077728E; AU769805B2; WO1999058154A1; US6221848B1; JP2002514608A; CA2331569A1; ES2257049T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Arzneimittels, das (A) ein Polynukleotid enthält, das ein Protein codiert, das transient in einem Subjekt exprimiert wird, wobei das besagte Protein in der Lage ist, toxische Spezies zu neutralisieren oder zu eliminieren, und (B) ein pharmazeutisch unbedenkliches Vehikel für das besagte Polynukleotid zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Schutz der Mundhöhle, des Mundrachenraums, der Speiseröhre, des Magens, des Dünndarms und des Dickdarms durch transiente Expression eines schützenden Proteins durch somatischen Gentransfer in vivo.
Es ist bekannt, dass therapeutische Konzentrationen von Antikrebs-Arzneimitteln und die klinische Strahlentherapie normale Gewebe und Zellen des Patienten schädigen. Es besteht eindeutig ein Bedarf an Mitteln zum Schutz der normalen Gewebe des Patienten während der Chemotherapie und/oder Strahlentherapie. Bereits bekannte Methoden, die solchen Schutz bieten, erfordern die Verabreichung von Sulfhydryl-Verbindungen, wie z. B. Thiole oder andere Radikalfänger-Verbindungen.
Die Strahlung schädigt Biomoleküle und Zellen hauptsächlich durch die Interaktion mit Wasser, bei der toxische freie Radikale (H⁺ OH⁺, e_xj) und H₂O₂ entstehen, oder durch Interaktion mit Sauerstoff, bei der Superoxidradikale (*O₂ ^–) entstehen. Ende der 40-er Jahre wurde entdeckt, dass Sulfhydryl-Verbindungen, wie z. B. Cystein und Cysteamin, bei Tieren einen Strahlenschutz bieten. Patt et al., Science 110: 213 (1949). Thiol-Gruppen beseitigen durch Strahlung erzeugte freie Radikale durch Abgabe eines Wasserstoffatoms an die geschädigten Moleküle. Trotz umfangreicher Bemühungen zur Entwicklung wirksamerer Schutzmittel konnte bisher von keinem Thiol-haltigen Strahlenschutzmittel festgestellt werden, dass es bedeutend besser als Cysteamin ist. Mitchell et al., Arch. Biochem. and Biophys. 289: 62 (1991). Die Verwendung von Thiol-Medikamenten zum Schutz gegen Strahlungsschäden wird jedoch durch die Toxizität solcher Verbindungen eingeschränkt.
Antineoplastika, insbesondere die Klasse der chemotherapeutischen Medikamente, die als Alkylierungsmittel bekannt sind, erzeugen ebenfalls freie Radikale, die aufgrund ihrer Fähigkeit, kovalente Bindungen mit Nukleinsäuren zu bilden, zytotoxisch sind. Die meisten Alkylierungsmittel bilden positiv geladene Carbonium-Ionen, die das geladene Alkylierungs-Zwischenprodukt R-CH₂-CH₂ erzeugen, das die elektronenreichen Stellen der Nukleinsäuren, Proteine, kleinen Moleküle und Aminosäuren angreift.
Es wurden einige endogene intrazelluläre Fänger freier Radikale, Superoxidradikale und Schwermetall-Kationen identifiziert. Es ist bekannt, dass die Induktion oder erhöhte Aktivität von Metallothionein (MT), Gamma-Glutamyl-Transpeptidase (γ-GTP) und Superoxid-Dismutase (SOD) eine Widerstandkraft gegen Schädigungen durch ionisierende Strahlung in vitro bietet. Diese Proteine wirken intrazellulär, um freie Radikale, Superoxid-Anionen oder Schwermetall-Kationen zu beseitigen. U.S. 5,599,712 beschreibt eine Methode zur Bereitstellung intrazellulärer therapeutischer Mengen von Metallothionein, Superoxid-Dismutase oder Gamma-Glutamyl-Transpeptidase, die normales Lungengewebe gegen die Nebenwirkungen einer Kombination aus Chemotherapie und Strahlentherapie schützen können.
Inhalt der Erfindung
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Verwendung eines Arzneimittels für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Schutz normaler, nicht an einem Tumor befindlicher Zellen gegen die schädigende Wirkung eines Antikrebs-Mittels oder ionisierender Strahlung durch Bereitstellung eines Gens, das ein Protein zum Schutz normaler somatischer Zellen codiert, bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, die Verwendung eines Arzneimittels für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Schutz normaler Zellen, insbesondere Zellen der Mundhöhle, des Mundrachenraums, der Speiseröhre, des Magens, des Dünndarms und des Dickdarms, gegen die schädigende Wirkung eines Antikrebs-Mittels oder ionisierender Strahlung durch Bereitstellung von Genen, die ein Protein zum Schutz normaler somatischer Zellen codieren, bereitzustellen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine transiente Expression des Oxydations- oder Kationen-Fänger-Proteins in den Zellen der Mundhöhle, des Mundrachenraums, der Speiseröhre, des Magens, des Dünndarms und des Dickdarms bereitgestellt, die diese Zellen gegen ein Antikrebs-Mittel schützt, wobei das transferierte Polynukleotid oder Gen nach therapeutischen Sitzungen mit ionisierter Strahlung oder Chemotherapie beseitigt wird oder das transferierte Polynukleotid oder Gen stabil in das Genom integriert wird; seine Expression ist jedoch temporär und wird für eine begrenzte Zeit durch die Therapie mit ionisierender Strahlung oder Chemotherapie induziert.
Bei der Erreichung dieser und anderer Ziele wurde gemäß der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Arzneimittels bereitgestellt, das (A) ein Polynukleotid enthält, das ein Protein codiert, das transient in einem Subjekt exprimiert wird, wobei das besagte Protein in der Lage ist, toxische Spezies zu neutralisieren oder zu eliminieren und (B) ein pharmazeutisch unbedenkliches Vehikel für das besagte Polynukleotid zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Schutz der Mundhöhle, des Mundrachenraums, der Speiseröhre, des Magens, des Dünndarms und des Dickdarms bei Krebspatienten, wobei das Medikament so adaptiert wird, dass es an der zu schützenden Stelle in vivo verabreicht werden kann, wobei die zu schützende Stelle entfernt ist von einem Tumor, der mit dem Mittel zu behandeln ist, das die Entstehung einer toxischen Spezies zur Folge hat, wobei die toxische Spezies aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus einem freien Radikal, einem Superoxid-Anion und einem Schwermetall-Kation besteht. Das Mittel kann ionisierende Strahlung, klinische Strahlentherapie oder ein chemotherapeutisches Arzneimittel sein. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind die Proteine der Erfindung, die die toxischen Spezies neutralisieren oder eliminieren, Gamma-Glutamyl-Transpeptidase, Mangan-Superoxid-Dismutase oder Metallothionein. In einer Ausführung der Erfindung beinhaltet die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung ein Gemisch aus Polynukleotiden, die aus einem Polynukleotid, das Gamma-Glutamyl-Transpetidase codiert, aus einem Polynukleotid, das Mangan-Superoxid-Dismutase codiert, oder einem Polynukleotid, das Metallothionein codiert, ausgewählt werden.
Liposome, ein Adenovirus-Vektor oder Ligand-DNA-Konjugate können verwendet werden, um erfindungsgemäß eine Polynukleotid einzubringen. Die Verabreichung der pharmazeutischen Verbindung wird vorzugsweise vor der Behandlung eines Subjekts mit einem Mittel durchgeführt. Die vorliegende Methode wird während der Behandlung einer Reihe von Krebserkrankungen wie Lungenkrebs, Prostatakrebs, Gebärmutterhalskrebs, Gebärmutterschleimhautkrebs, Eierstockkrebs und Blasenkrebs verwendet.
Andere Ziele, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung ersichtlich. Es versteht sich jedoch, dass die ausführliche Beschreibung und spezielle Beispiele zur Angabe bevorzugter Ausführungen der Erfindung nur zur Illustration dienen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1A und 1B sind schematische Zeichnungen der Konstruktion eines rekombinanten Adenovirus-Vektors (Ad-MT) mit Metallothionein (MT) der vorliegenden Erfindung. 1A illustriert das Wildtyp-Adenovirus-Typ-5 (qAd5)-Genom, das die E1a, E1b und E3-Regionen und den vom linken Ende des Ad5 zu deletierenden Anteil zur Insertion der entsprechenden Expressionskassetten zeigt. Eine Expressionskassette ist ein Nukleidsäure-Konstrukt, das als funktional verbundene Bestandteile, die die Transkription ermöglichen, eine Transkriptions-Initiationsregion, eine Nukleidsäure-Sequenz, die ein Protein von Interesse codiert, und eine Transkriptions-Terminationsregion enthält, wobei die Transkriptions-Regulationsregionen in den Ziel- Säugetierwirtszellen funktionell sind. 1B illustriert eine Expressionskassette, die Regulationssequenzen und eine rekombinante DNA-Sequenz, die Metallothionein codiert, enthält.
2A und 2B sind schematische Zeichnungen der Konstruktion eines rekombinanten Adenovirus-Vektors (Ad-γ-GTP) mit Gamma-Glutamyl-Transpeptidase. 2A illustriert das Wildtyp-Adenovirus-Typ-5 (Ad5)-Genom, das die E1A, E1b und E3-Regionen und den vom linken Ende der Ad5 zu deletierenden Anteil zur Insertion der entsprechenden Expressionskassetten zeigt. 2B illustriert eine Expressionskassette, die Regulations-Sequenzen und eine rekombinante DNA-Sequenz, die γ-GTP codiert, enthält.
3A und 3B sind schematische Zeichnungen der Konstruktion eines rekombinanten Adenovirus-Vektors (Ad-MnSOD) mit Mangan-Superoxid-Dismutase. 3A illustriert das Wildtyp-Adenovirus-Typ5 (Ad5)-Genom, das die E1A, E1b und E3-Regionen und den vom linken Ende der Ad5 zu deletierenden Anteil zur Insertion der entsprechenden Expressionskassen zeigt. 3B illustriert eine Expressionskassette, die Regulationssequenzen und eine rekombinante DNA-Sequenz, die Mangan-Superoxid-Dismutase codiert, enthält.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Ionisierende Strahlung erzeugt toxische Spezies freier Radikale. Antineoplastika, insbesondere die Klasse der chemotherapeutischen Medikamente, die als Alkylierungsmittel bekannt sind, erzeugen ebenfalls freie Radikale, die aufgrund ihrer Fähigkeit, kovalente Bindungen mit Nukleinsäuren zu bilden, zytotoxisch sind. Die meisten Alkylierungsmittel wie Cyclophosphamid, Stickstoffsenfgas, Melphalan, Chlorambuzil, Busulfan, Nitroharnstoff, Cisplatin, Streptozotocin, Aziridinylbenzoquinon (AZQ), Dacarbazin (DTIC), mAMSA und Mitoxantron bilden positiv geladene Carbonium-Ionen, die ein geladenes Alkylierungs-Zwischenprodukt R-CH₃-CH₃ ⁺ erzeugen, das die elektronenreichen Stellen auf Nukleinsäuren, Proteinen, kleinen Molekülen und Aminosäuren angreifen. Chabner et al., in CANCER; PRINCIPLES AND PRACTICE OF ONCOLOGY, 2^nd edition, DeVita et al. (eds.) (J. B. Lippincott Co., Philadelphia 1985).
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung liefert ein Medikament zur Verwendung zum Schutz normaler Zellen, insbesondere Zellen der Mundhöhle, des Mundrachenraums, der Speiseröhre, des Magens, des Dünndarms und des Dickdarms eines Individuums, gegen ein Mittel, das die Entstehung eines freien Radikals, eines Superoxid-Anions und/oder eines Schwermetall-Kations zur Folge hat. Die zu schützenden Zellen können sich an einer Stelle befinden, die vom Tumor entfernt ist. Die Verwendung der vorliegenden Erfindung setzt Gentherapie ein, die ein Transfer genetischen Materials in spezifische Zellen eines Patienten ist.
Transiente Genexpression gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch einen von zwei Mechanismen erzielt werden. Gentransfer kann benutzt werden, um DNA-Sequenzen in nicht integrierter Form in den Zellkern einzubringen. Dabei ist die transiente Expression oder die nicht integrierte Expression durch die Stabilität der/des nicht integrierten DNA-Moleküle(s) begrenzt und kann für längere Zeiträume anhalten, hält aber selten länger an als etwa ein bis drei Wochen. Alternativ kann ein Gen oder Polynukleotid stabil in das Genom integriert werden. Ein Gen, das in ein Individuum transferiert wird, wird Transgen genannt.
Die Gentherapiemethode, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, beinhaltet eine in vivo Methode der Gentherapie, die ein Polynukleotid bereitstellt, das ein Protein codiert, das in der Lage ist, ein toxisches freies Radikal, Superoxid-Anion und/oder Schwermetall-Kation zu neutralisieren oder zu eliminieren, wobei das Protein transient in dem Individuum exprimiert wird. Die Transgene codieren Proteine) wie Metallothionein, Superoxid-Dismutase oder Gamma-Glutamyl-Transpeptidase, die ein toxisches freies Radikal, Superoxid-Anion und/oder Schwermetall-Kation beseitigen.
γ-Glutamyltranspeptidase (γ-GTP) ist ein mit der Plasmamembran assoziertes Ektoenzym, das die Transpeptidation des extrazellulären Glutathions in Aminosäure-Zwischenprodukte katalysiert, die dann über die Zellmembran transportiert und dazu verwendet werden, Glutathion de novo zu synthetisieren. Glutathion (GSH) macht freie Radikale unschädlich. Zellen synthetisieren im Allgemeinen GSH de novo aus dessen Aminosäurebestandteilen. Die Empfindlichkeit einer Zelle gegen Strahlung ist direkt korreliert mit ihrer Fähigkeit, extrazelluläres Glutathion mittels γ-GTP durch Transpeptidation herzustellen. Zelllinien mit hoher γ-GTP-Aktivität sind gegen die Wirkung von Strahlen widerstandsfähiger und besser in der Lage, durch niedrig dosierte γ-Strahlen induzierte Schädigungen zu reparieren, als Zelllinien mit einer geringen γ-GTP-Aktivität. Siehe Beispiele 7 und 8. Bei Tumorzellen, denen GSH entzogen wurde, wurde gezeigt, dass diese eher empfindlich gegen ionisierende Bestrahlung und chemotherapeutische Mittel sind, da die GSH-abhängigen Entgiftungswege reduziert werden. Louie et al., Cancer Res. 45: 2110 (1985).
Der Schutz gegen Superoxid-Radikale erfordert Antioxidationsmittel wie GSH und das O₂-Fänger-Enzym Superoxid-Dismutase (SOD). SODs sind Metalloenzyme, die für die Dismutation von O₂ zu H₂O₂ und O₂ notwendig sind. Es gibt drei Formen von SODs: Kupfer-Zink (CuZnSOD), Mangan (MnSOD) und Eisen (FeSOD). Obwohl CuZnSOD und FeSOD konstitutiv hergestellt werden, ist die MnSOD-Synthese induzierbar. Es wurde gezeigt, dass nach der Röntgenbestrahlung von Herzgewebe eine MnSOD-Aktivität induziert wird. Oberley et al., Arch. Biochem. Biophys. 254: 69 (1987). Ferner zeigen hämatopoetische, mit MnSOD cDNA in vitro transfektierte Tumorzelllinien eine höhere Widerstandsfähigkeit gegen Strahlung. Suresh et al., Experimental Hematology 21: 1828 (1993).
Metallothioneine sind Proteine mit niedrigem Molekulargewicht, die aus einer einzigen Polypeptidkette aus 61 Aminosäureresten bestehen, wovon 20 Cysteine sind, die einen Chelatkomplex mit Kationen bilden. Es wurde gezeigt, dass die Induktion von Metallothionein zur Widerstandsfähigkeit gegen Schädigungen durch ionisierende Bestrahlung führt. Metallothionein-Protein schützt Zellen vor der toxischen Wirkung von Schwermetall-Ionen und ist ein wirksamer Fänger von strahlungsinduzierten OH-Radikalen in vitro. Zelllinien, die große Mengen von MT exprimieren, sind widerstandsfähig gegen DNA-schädigende Mittel wie Cisplatin, Chlorambuzil und ionisierende Strahlung. Andrews et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 19: 149 (1987); Bakka et al., Experientia 38: 381 (1982); Matsubara et al., Environ. Res. 43: 66 (1987). Metallothionein ist in der Lage, freie Radikale zu beseitigen, die durch elektrophile Antikrebs-Medikamente und ionisierende Strahlung in vitro entstanden sind. Endressen of al., Cancer Res. 43: 2918 (1983); Thornalley et al., Biochem., Biophys. Acta 827: 36 (1985). Wichtig ist, dass die Induktion von MT in Mäuselebern Schutz gegen tödliche Schädigungen durch hochdosierte Strahlung bietet. Matsubara et al., Rad. Res. 111: 267 (1987). Nichtsdestoweniger waren einige mit MT-Genen transfektierte Zelllinien ebenso empfindlich gegen ionisierende Strahlung und Bleomycin wie nicht transfektierte Empfängerzellen. Dennoch waren MT-transfektierte Zellen widerstandsfähig gegen Mitomycin, was darauf hindeutet, dass das MT-Protein einige Zellen in vitro vor monofunktionellen alkylierenden und vernetzenden Mitteln, jedoch nicht vor freien Radikalen, schützt. Lohrer et al., Carcinogenesis 10: 2279 (1989).
Eine DNA-Sequenz, die eine komplette codierende Region einer Superoxid-Dismutase, vorzugsweise MnSOD, codiert, kann durch im Fachgebiet bekannte Methoden auf der Grundlage der MnSOD-Sequenzen nach Oursler et al., J. Cell. Biochem. 46: 219 (1991) oder Beck of al., Nucl. Acids. Res. 15: 9076 (1987) isoliert oder synthetisiert werden oder der SOD-Sequenzen nach dem U.S. Patent No. 4, 751, 180; Lieman-Hurwitz et al., Proc. Natl. Acad. Sci,. USA 79: 2808 (1982); U.S. Patent No. 4, 742, 004; Xiang et al., Nucleic Acids Res. 15: 7654 (1987) oder Sherman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5465 (1983). Alternativ können diese Sequenzen mit den Fachleuten bekannten Methoden durch Polymerase-Kettenreaktion hergestellt werden. Siehe z. B. Wong et al., Cell 58: 923 (1989).
DNA-Sequenzen, die verschiedene Spezies und Isoformen von Metallothionein codieren, können isoliert oder synthetisiert werden durch im Fachgebiet bekannte Methoden auf der Grundlage der Sequenzen für humane MT nach [Yamazaki et al., Biochem. Int. 28: 451 (1992); Soumillion et al., Eur. J. Biochem. 209: 999 (1992); Karin et al., Proc. Natl. Acad. Sci,. USA 80: 4040 (1983); Paliwal et al., Neurochem. Int. 17: 441 (1990); Schmidt et al., J. Biol. Chem. 260: 7731 (1985); Richards et al., Cell 37: 263 (1984); Karin et al., Nature 299: 797 (1982); Hyland et al., Nucleic Acids Res. 15: 1350 (1987)]; für Schafe und Mäuse nach [Peterson et al., Eur. J. Biochem. 160: 579 (1986)], für Fische nach [(Lee et al., Korean Biochem. J. 25: 48 (1992); Bonham et al., DNA 6: 519 (1987)] und für Insekten nach (Lastowski-Perry of al., J. Biol. Chem. 260: 1527 (1985)]. Vorzugsweise werden entweder die von Yamazaki et al., (1992) siehe oben oder Soumillion et al., (1992) siehe oben veröffentlichten humanen Metallothionein-Sequenzen für die Methode der vorliegenden Erfindung verwendet.
DNA, die γ-GTP codiert, kann für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden durch Isolierung oder Synthese einer solchen Sequenz mit im Fachgebiet bekannten Methoden auf der Grundlage der Sequenzen nach Altman et al., Biochemistry 32: 3822 (1993); Ishiye et al., Biotech. Progr. 9: 323 (1993); Ishiye et al., FEMS Microbiol. Lett. 97: 235 (1992); oder Angele et al., Clin. Chem. 37: 662 (1991). DNA, die MT, SOD, MnSOD oder γ-GTP codiert, kann für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden mit im Fachgebiet bekannten Methoden wie (1) Oligonukleotid-Synthese der gewünschten DNA-Sequenzen auf der Grundlage der in der oben genannten Literatur veröffentlichten Sequenzen; (2) Isolierung der gewünschten DNA-Sequenzen aus den in der oben genannten Literatur angegebenen Plasmiden oder aus den in der American Type Culture Collection (ATCC) (12301 Parklawn Drive, Rockvill, Maryland 20852) verfügbaren Plasmiden wie: [a] ATCC 57117 – pHM6, das das humane Metallothionein-2-Pseudogen 1 enthält; [b] ATCC 57152, 57153 – bMT-IIA, das das humane Metallothionein-2-Gen enthält; [c] ATCC 20745 – pYAS11, das cDNA enthält, die humane Superoxid-Dismutase 1 codiert; [d] ATCC 20796 – pYLUIGF2 – 14, das DNA enthält, die humane Superoxid-Dismutase 1 codiert; [e] ATCC 39786 – pSOD alpha 2, das DNA enthält, die humane Superoxid-Dismutase 1 codiert; [f] ATCC 59946, 59947 – phMnSOD4, das DNA enthält, die humane Superoxid-Dismutase 2 codiert; [g] ATCC 61646, 61647, das cDNA enthält, die humane Superoxid-Dismutase 1 codiert; [h] ATCC 86406 – IB881, das cDNA enthält, die humane Superoxid-Dismutase codiert oder (3) Amplifikation der gewünschten DNA-Sequenzen durch Polymerase-Kettenreaktion aus den in der oben genannten Literatur angegebenen DNA-Bibliotheken, die Primer auf der Grundlage der in der oben genannten Literatur veröffentlichten Sequenzen verwenden.
Die transiente Expression von in vio verabreichten Genen wird in diesem Fachgebiet als große technische Beschränkung für die Gentherapie angesehen. Siehe Mulligan, Science 260: 926 (1993). In scharfem Gegensatz dazu ist gemäß der vorliegenden Erfindung die transiente Expression von Genen höchst wünschenswert, da der Schutz des normalen Gewebes nur für den Zeitraum der Strahlentherapie benötigt wird; danach ist eine schnelle Beseitigung des Genprodukts erwünscht. Die transiente Expression ist wünschenswert, weil die langfristigen klinischen Folgen von erhöhten MT, γ-GTP und/oder MnSOD unbekannt sind. Auch die Beseitigung des Transgens und seines Vektors kann nach der Chemotherapie oder Strahlentherapie klinisch erwünscht sein, um für die nächste Phase eines therapeutischen Ansatzes mit kombinierten Methoden vorzusorgen. Die Verwendung der vorliegenden Erfindung ist dazu bestimmt, die transiente oder nicht integrierte Expression eines exogenen Gens in vivo zu ergeben; falls sich jedoch auch ein begrenzter Wert stabiler Integration der exogen bereitgestellten DNA ergibt, bleibt die Methode in ihrer Fähigkeit ein Protein bereitzustellen, das dazu in der Lage ist, eine toxische Spezies in vivo zu neutralisieren oder zu eliminieren, funktionsfähig.
Transiente Expression kann durch gezieltes Einbringen des genetischen Materials, das das gewünschte Protein in den Zellen codiert, oder durch die Verwendung eines heterologen
Virusgenoms als Vektor, erreicht werden. Methoden zur Einbringung von Genen in Säugetierzellen zur Bereitstellung der transienten Expression, die für die Gentherapie verwendet werden kann, umfassen: Papovaviren, Adenovirus, Vacciniavirus, Herpesviren, Pockenviren, Poliovirus, Sindbis-Fieber-Virus und andere RNA-Viren, Ligand-DNA-Konjugate, Adenovirus-Ligand-DNA-Konjugate, nackte DNA, Lipofektion und Rezeptor-vermittelten Gentransfer. Siehe z. B. Mulligan, siehe oben. Coen in VIROLOGY, Fields of al. (eds.) Raven Press, Ltd., (New York, 1990); Ferkol et al., FASEB 7: 1081 (1993). In Studien mit Tiermodellen wurden Gene effizient transferiert unter Verwendung von Retroviren (Friedmann, Science 244: 1275 (1989)), von Adenoviren (Rosenfeld et al., Science 252: 431 (1991)); Rosenfeld et al., Cell 68: 143 (1992) und von Liposomen (Felgner of al., Nature 349: 351 (1991)).
Die transiente Expression wird erreicht durch einen induzierbaren Transkriptions-Promoter zur Kontrolle der Expression des Gens oder Polynukleotids. Der induzierbare Promoter kann direkt oder indirekt durch die Therapie mit ionisierender Strahlung oder das chemotherapeutische Mittel selbst induziert werden. Ein geeigneter Promoter ist der erg-1-Promoter, ein Promoter, der durch Bestrahlung induziert wird. Hallahan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2156–3160 (1991) und Datta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10149–10153 (1992). Die Transkription des/der Polynukleotids(e) oder Gens(e), die von erg-1 kontrolliert wird, endet etwa zwischen 60 und 90 Stunden nach der Induktion.
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um spezifische Gewebe bei Krebspatienten gegen die schädigende Wirkung von ionisierender Strahlung und chemotherapeutischen Medikamenten zu schützen, die freie Radikale, Superoxid-Anionen und/oder Schwermetall-Kationen erzeugen. Insbesondere kann die Verwendung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um vor der klinischen Strahlentherapie oder Verabreichung eines chemotherapeutischen Medikaments zur Bekämpfung von Krebs ein Gen auf normale Zellen, die von einem Tumorsitz entfernt sind, zu transferieren. Insbesondere kann die Verwendung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um vor der klinischen Strahlentherapie oder Verabreichung eines chemotherapeutischen Medikaments zur Bekämpfung von zum Beispiel Lungen-, Prostata-, Blasen-, Gebärmutterhals- oder Gebärmutterschleimhautkrebs ein Gen auf normale Zellen der Mundhöhle, des Mundrachenraums, der Speiseröhre, des Magens, des Dünndarms und des Dickdarms zu transferieren.
In einer bevorzugten Ausführung betrifft die Verwendung eines Arzneimittels der vorliegenden Erfindung ein Medikament für die transiente in vivo Gentherapie bei Lungenkrebspatienten, um einen Schutz für die Mundhöhle, den Mundrachenraum und die Speiseröhre zu bieten, wenn der Lungenkrebs durch Therapie mit ionisierender Strahlung oder antineoplastischen Alkylierungsmitteln behandelt wird. Ein limitierender Faktor bei der Behandlung von Lungenkrebs, insbesondere bei Therapiemethoden, die eine Kombination aus Strahlentherapie und Chemotherapie mit Paclitaxel, Vinblastin oder Cisplatin erfordern, war bisher die Entstehung einer Speiseröhrenentzündung während der Strahlenbehandlung.
In manchen Fällen können die Patienten wegen der Entstehung einer schweren Speiseröhrenentzündung den Therapieplan nicht beenden. Die Speiseröhrenentzündung ist das Ergebnis einer Verletzung der Schleimhautschicht der Speiseröhre. Nach der Bestrahlung kommt es zu einer erhöhten Zellteilungsaktivität in der Schleimhaut, um die Schädigung zu beheben. Insbesondere Paclitaxel wirkt, indem es die Zellteilung während des G₂/M-Stadiums, der Teil des Zellzyklus, der die höchste Strahlenempfindlichkeit aufweist, stoppt. Es wird vermutet, dass die Kombination aus der Hemmung der Zellteilung durch das chemotherapeutische Mittel und der Sensibilisierung der Schleimhautzellen während der Bestrahlung die Reparatur der Schleimhautschädigung verhindert und die Speiseröhrenentzündung verursacht.
In einer anderen Ausführung betrifft die Verwendung eines Arzneimittels der vorliegenden Erfindung ein Medikament für die transiente in vivo Gentherapie bei Prostata-, Blasen-, Gebärmutterhals- oder Gebärmutterschleimhautkrebspatienten, um Schutz für den Dünndarm und den Dickdarm zu bieten, wenn diese Krebserkrankungen mit einer Therapie mit ionisierender Strahlung oder antineoplastischen Alkylierungsmitteln behandelt werden. Der Mechanismus ist der gleiche, wie der vorstehend für den Schutz der Speiseröhre beschriebene. In diesem Fall wird vermutet, dass die Kombination aus der Hemmung der Zellteilung durch das chemotherapeutische Mittel und der Sensibilisierung der Schleimhautzellen während der Bestrahlung die Reparatur der Schleimhautschädigung an den Schleimdrüsenzellen des Dünndarms und des Dickdarms verhindert.
Zusätzlich zum Schutz der normalen Zellen an einer vom Tumor entfernten Stelle vor der klinischen Strahlentherapie oder der Therapie mit chemotherapeutischen Medikamenten ist die Verwendung eines Arzneimittels der vorliegenden Erfindung auch von Nutzen, um normale Zellen der Mundhöhle, des Mundrachenraums, der Speiseröhre, des Magens, des Dünndarms und des Dickdarms während der Behandlung eines Tumors in derselben Region zu schützen. In diesem Fall wird das Transgen in normalen Zellen effizienter eingebracht und exprimiert als in Tumoren solcher Gewebe. Eine effizientere Expression in normalem Gewebe als in Tumorgewebe wurde durch Studien an Versuchstieren, wie Ratten oder Mäusen, bestätigt. Die Tatsache, dass Tumorzellen, die in Tiere transplantiert wurden, eine geringere Expression des Transgens als Zellen im normalen umliegenden Gewebe aufweisen, bestätigt ein geringeres Verhältnis der Einbringung von therapeutischen Genen in Tumorzellen als in normale Zellen, die geschützt werden sollen.
Verbindungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung enthalten ein Polynukleotid, das ein Protein codiert, das transient in einem Subjekt exprimiert wird, wenn das Subjekt mit einem Mittel behandelt wird, das die Erzeugung einer toxischen Spezies, wie ein freies Radikal, ein Superoxid-Anion oder ein Schwermetall-Kation, zur Folge hat, wobei das Protein in der Lage ist, die toxische Spezies zu neutralisieren oder zu eliminieren; und ein pharmazeutisch unbedenkliches Vehikel für das Polynukleotid. In diesem Zusammenhang ist ein pharmazeutisch unbedenkliches Vehikel inaktiv oder anderweitig medizinisch unbedenklich und ist kompatibel mit dem Wirkstoff in einem bestimmten Verabreichungskontext. Zusätzlich zu einem geeigneten Trägerstoff kann ein pharmazeutisch unbedenklicher Träger konventionelle Zusätze wie Verdünnungsmittel, unterstützende Mittel, Antioxidationsmittel, Dispersionsmittel und Emulgierungsmittel, schaumhemmende Mittel, Geschmacksverbesserer, Konservierungsmittel, Lösungsmittel und Farbstoffe enthalten. Insbesondere zeichnen sich pharmazeutisch unbedenkliches Vehikel dadurch aus, dass sie physiologisch annehmbare pH-Werte und Ionenstärke aufweisen. Sterile, gepufferte Salzlösung, insbesondere Phosphat-gepufferte Salzlösung, ist eine bevorzugte Trägersubstanz für Verbindungen, die parenteral verabreicht werden sollen.
In einer bevorzugten Ausführung werden künstliche Lipidmembranen (d. h. Liposome) für die Einbringung verwendet. Verfahren zur Einbringung von DNA in Zellen, die Lipide verwenden, umfassen: Polyethylen-Glykol zur Bewirkung der Fusion von Protoplasten, die aus Plasmid-haltigen Bakterien stammen (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2163 (1980); DNA-haltige Erythrozyten-Schatten (Wiberg et al., Nucleic Acids Res. 11: 7287 (1983); DNA-haltige Liposome (Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3348 (1979); Plasmid-/Kationenliposom-Komplexe (Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11277 (1992); WO 93/12756) und Lipofektion (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413 (1987). Bei der Verwendung der vorliegenden Erfindung zur Gentherapie können alle obigen Verfahren eingesetzt werden, um genetisches Material in Zellen in vivo einzubringen, die Lipofektion mit Plasmid-/Kationenliposom-Komplexen ist jedoch eine bevorzugte Methode.
Bei der Lipofektion wird eine Liposom-Zusammensetzung aus Kationen-Lipiden eingesetzt, um Nukleinsäuren in Zellen zu transfektieren. Der Lipid-Nukleinsäure-Komplex fusioniert mit Plasmamembranen und transferiert die Nukleinsäure effizient in die Zellen, in denen die DNA exprimiert ist. Die Lipofektion ist bei der Einführung der DNA in Zellen fünf bis einhundert mal effizienter als Transfektionsmethoden mit Kalziumphosphat oder DEAE-Dextran. Chang et al., Focus 10: 66 (1988). Liposom-Präparate können, wie im Fachgebiet beschrieben, hergestellt werden oder aus kommerziell verfügbaren Quellen, wie z.B. GIBCO BRL's lipofectin (GIBCO BRL, Life Technologies, Inc. P.P. Box 9418, Gaithersburg, Maryland 20898) bezogen werden. Felgner et al., (1987) siehe oben; Schreier, J. of Liposome Res. 2: 145 (1992); Chang et al., (1988) siehe oben.
Die transiente Transfektion, bei der die Lipofektion eingesetzt wird, wird 24 bis 72 Stunden nach der Transfektion durch Tests gemessen, die die Genexpression des/der transfektierten Gens/Gene messen. Bei gängigen Tests wird die Enzymaktivität von Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), LAC-Z, β-Galaktosidase, Luciferase oder des humanen Wachstumshormons, das in den Konstrukten enthalten sein kann, geprüft. Durch Lipofektion wurden humane kleinzellige Lungenkarzinomzellen transient transfektiert. Chang et al. siehe oben. Die Lipofektion von DNA, die MT, CuZnSOD, FeSOD, MnSOD und γ-GTP codiert, das DNA in jedes beliebige Gewebe codiert, kann unter Anwendung der den Fachleuten bekannten Lipofektionstechniken durchgeführt werden.
Ein bevorzugtes Präparat eines Kationenlipid-Präparats besteht aus 1:1 DOTMA oder DDAB/DOPE (d. h.. 1:1 N-[1-(2,3-dioleyloxylpropyl]-N,N,N-trietylammonium (DOTMA) oder Dimethyldioctadecyl-ammoniumbromid (DDAB) und Cholesterol und Dioleoyl-phosphatiylethanolamin (DOPE). Um 1:1 DOTMA/DOPE- Kationenliposome herzustellen, werden Stammlösungen mit Lipiden in Chloroform gelöst und bei –20°C unter Argon gelagert.
Lipide werden in Rundbodenkolben gemischt und mit einem Rotierverdampfer unter vermindertem Druck bis zum Trocknen verdampft. Die Lipid-Endkonzentrationen von je 10 mM werden hergestellt, indem zweifach destilliertes Wasser zugegeben wird. Das resultierende Gemisch wird sonifiziert, um eine Liposom-Suspension herzustellen.
Plasmide werden wie folgt zu DOTMA/DOPE-Liposomen komplexiert. Plasmid-DNA und DOTMA/DOPE-Liposome werden vor dem Mischen separat mit Wasser verdünnt. Es kann eine Wassermenge zwischen 1 und 20 ml, vorzugsweise etwa 8 ml, verwendet werden. Die Zusammensetzung des Liposom-DNA-Komplexes kann von 4:1 bis etwa 1:10 Mikrogramm DNA zu Nanomol Kationenlipid, vorzugsweise etwa 1:1 bis 1:2 Mikrogramm DNA zu Nanomol Kationenlipid betragen.
Alternativ können speziell für den Transfer von DNA, die in der Lage ist, γ-GTP, MT, SOD und/oder MnSOD in ein gewünschtes/bestimmtes humanes Zielgewebe in vivo zu exprimieren, replikationsdefiziente rekombinante Adenoviren verwendet werden. Zum Beispiel Ad.CMV-lacZ (das den Cytomegalovirus enthält) und Ad.CB-MnSOD-Viren, die auf dem Adenovirus Typ 5 (Ad5) basieren und durch homologe Rekombination in transformierten primären humanen embryonalen Nierenzelllinien 293 (ATCC Katalog Nummer CRL1573) hergestellt werden, können in der Methode der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Graham et al., METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (Murray, Humana, 1991).
Um ein rekombinantes Adenovirus zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung zu konstruieren, können Ansätze verwendet werden, die Fachleuten bekannt sind. Zum Beispiel kann ein rekombinanter Adenovirus zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung aus einer Adenovirus-Typ-5 (Ad 5)-Deletionsmutante konstruiert werden, wie z. B. aus Ad-d1324 (Thimmappaya et al., Cell 31: 543 (1982)) und einem Plasmid, das das Ad5 5' Invertet Terminal Repeat, den Ursprung der Replikation, das Encapsidationssignal, den E1a-Enhancer, den Major Late Promoter, die dreiteilige Leader-Sequenz cDNA und die DNA-Sequenz, die die gesamte Proteinsequenz der humanen MT, γ-GTP oder MnSOD und das SV40 Early-Polyadenylationssignal codiert. Die rekombinanten Vektoren Ad-MT, Ad-γ-GTP und Ad-MnSOD werden konstruiert, indem der überwiegende Teil der E3-Region und 2,6 mu vom linken Ende des Ad5 deletiert wird und dem linken Ende die MT-, γ-GTP- oder MnSOD-Expressionskassetten zugefügt werden, die die Regulierungssequenzen und die rekombinante MT, γ-GTP oder MnSOD, die DNA codieren, enthält. Das linke Ende des Virusgenoms, einschließlich des E1a und des überwiegenden Teils der E1b-Region, werden deletiert und durch die MT-, γ-GTP- oder MnSOD-Expressionskassette ersetzt, die die notwendigen viralen cis-aktiven Elemente enthält, einschließlich Invertet Terminal Repeat, Ursprung der Replikation, Encapsidationssignal, E1a-Enhancer und kein E1a-Strukturgen. Vorzugsweise wird der E1a-Enhancer vom Adenovirus Typ 2 Major Late Promoter und cDNA gefolgt, die MT, γ-GTP oder MnSOD codiert. Der konstruierte rekombinante Adenovirus wird dann in einer permissiven Zelllinie repliziert, die ein funktionelles E1a-Gen enthält, um ein trans-aktives E1a-Protein, wie z. B. die 293 humane Nierenzelllinie, zu liefern Danach werden infektiöse rekombinante Adenovirusstämme mit hohem Titer hergestellt.
Eine andere Methode zur Herstellung eines rekombinanten Adenovirusvektors ist die Kopräzipitierung eines linearisierten Plasmids, das die gewünschte cDNA enthält, die MT, γ-GTP oder MnSOD codiert, mit dem großen Fragment von kompatibel geschnittener Ad-d1324-DNA unter Verwendung der Kalziumphosphat-Präzipitierungsmethode. Graham et al., Virology 52: 456 (1973); Wigler et al., Cell 14: 725 (1978). Die kopräzipitierten DNA werden dann in 293-Zellen kotransfektiert, damit es zu einer homologen Rekombination kommen kann. Die rekombinante Adenovirus-DNA wird in 293-Zellen transfektiert (Graham et al., J. Gen. Virol. 35: 59 (1977); Graham et al., Virology (1973), siehe oben), wenn es in einen infektiösen Virus repliziert, enkapsidiert und durch Plaquereinigung isoliert wird. Einzelne Plaques werden durch Propagation in 293-Zellen vergrößert, und die Virus-DNA wird extrahiert. Hirt., J. Mol. Biol. 26: 365 (1967).
Rekombinante Adenovirus-Plaques, die humane Gamma-Glutamyl-Transpeptidase, Mangan-Superoxid-Dismutase und Metallothionein-Protein-cDNA (Ad-γ-GTP; Ad-MnSOD und Ad-MT) enthalten, werden dann durch Restriktionsspaltung, Southern-Analyse und/oder Northern-Analyse unter Verwendung der geeigneten DNA-Sonde identifiziert. Kontroll-Viren, die eine Deletion der E1a-Region aufweisen und keine DNA von Interesse enthalten, werden in der Northern-Analyse keine feststellbaren γ-GTP-, MnSOD- oder MT-Transkripte zeigen, während Konstrukte, die die DNA von Interesse enthalten, ein feststellbares γ-GTP-, MnSOD- oder MT-Transkript zeigen werden.
Jeder der Ad-γ-GTP, Ad-MnSOD und Ad-MT-Vektoren wird in 293-Zellen vermehrt und 36 Stunden nach der Infektion durch mehrere Gefrier-/Auftauzyklen zurückgewonnen.
Alle Viruspräparate werden durch CaCl₂-Dichtezentrifugation gereinigt, dialysiert und im Virusdialysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM MgCl₂) bei 4°C zur sofortigen Verwendung gelagert oder bei –70°C unter Zugabe von 10%-igem Glycerol gefroren. Der Titer des Virusstamms wird durch Plaquetests unter Verwendung von 293-Zellen bestimmt. Alle Gewebe des menschlichen Körpers sind für die Gentherapie der vorliegenden Erfindung unter Verwendung des oben beschriebenen Adenovirusvektors geeignet.
Für die Evaluierung der MT-, γ-GTP- oder MnSOD mRNA- oder Proteinsynthese oder die Evaluierung des funktionellen Proteins wird der rekombinante Vektor verwendet, um entweder 293-Zellen oder Respirationsepithelzellen von Ratten zu infizieren. Zur Gewinnung von Respirationsepithelzellen von Ratten werden die Ratten getötet und die Lungen und die Luftröhre isoliert. Die Zellen werden durch zytologisches Bürsten (Rosenfeld et al., siehe oben (1991) gewonnen, plattiert und mit 2 × 10⁷ plaquebildenden Einheiten (PFU) von Ad-MT, Ad-γ-GTP oder Ad-MnSOD im Medium infiziert oder, als Kontrolle, nur dem Medium ausgesetzt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Bedingungen festgelegt, um in der Mehrheit der Zellen des in vivo zu schützenden Zielorgans eine rekombinante Genexpression zu erreichen. Möglicherweise ist es nicht notwendig, eine Transgenexpression zu erreichen, die größer als 50% ist oder auch größer als 10%, wenn im transfektierten Organ ein Zelle-zu-Zelle-Schutz beteiligt ist. Zum Beispiel kann eine Transgen-exprimierende Zelle in der Lage sein, zehn nicht transfektierte Zellen in einer lokalen Nische durch den Zelle-zu-Zelle-Transfer von Zwischenprodukten (z. B. ein Nukleotid oder ein Nukleosid), die in der zellulären Reparaturkaskade beteiligt sind, zu schützen.
Die Dosierungen der pharmazeutischen Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Die Dosierung von Liposom-DNA-Komplexen kann zwischen etwa 5 bis 50mg Plasmide pro 5 bis 100 μmol Liposome betragen, vorzugsweise etwa 12 mg Plasmide pro 24 μmol Liposome. Präparate unter Verwendung des Adenovirus gemäß der Erfindung werden in Form von Dosiereinheiten geliefert, die pro Dosiereinheit zwischen 10⁶ und 10¹⁴ PFU/ml des Virusvektors in einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger enthalten, vorzugsweise etwa 10¹⁰ bis 5 × 10¹³ PFU/ml des replikationsdefizienten Adenovirus Ad-γ-GTP, Ad-MnSOD und/oder Ad-MT. Die gewünschten PFU sind in einem Gesamtvolumen von 0,3 bis 2,0 ml der Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) enthalten und werden durch Techniken verabreicht, die den Fachleuten bekannt sind. Wenn ein Ligand-DNA-Komplex verwendet wird, um das gewünschte Gen in die Zielzellen einzubringen, dann wird das Ligand-Konjugat unter Verwendung eines molaren Verhältnisses von Träger zu DNA zwischen 10:1 und 500:1, vorzugsweise zwischen 300:1 und 500:1, zu Plasmid-DNA komplexiert.
Zum Schutz der Mundhöhle, des Mundrachenraums, der Speiseröhre, des Magens und des Dünndarms werden die Verbindungen zur Verwendung in der Methode vorzugsweise oral verabreicht. Zum Beispiel wird der Schutz der Mundhöhle, des Mundrachenraums und der Speiseröhre erreicht, indem man Patienten täglich vor der Strahlentherapie Plasmid-Liposom-Komplexe schlucken lässt. Die typische Therapie von Tumoren im Brustkorb umfasst 30–35 Strahlungsbehandlungen über 6 1/2–7 1/2 Wochen. Bei Lungenkrebs erhalten die Patienten gewöhnlich eine Bestrahlung des Lungenkrebstumorvolumens mit zwischen 6000 und 7000 cGy. Zum Schutz des Magens und des Dünndarms werden Langzeitpräparate, die mit einer magensaftresistenten Schutzhülle umhüllt sind, verwendet. Die magensaftresistente Schutzhülle ist dazu bestimmt, den aktiven Komplex in das zu schützende Organ freizugeben. Zum Schutz des Dickdarms wird die Verbindung vorzugsweise durch einen Einlauf oder durch ein Faseroptikkolonoskop in den Dickdarm bis zum Blinddarm verabreicht. Im Allgemeinen wird diese Behandlung nicht täglich durchgeführt, sondern aller zwei Tage oder drei mal pro Woche, besonders bei Verabreichung durch ein Faseroptikkolonoskop.
Die folgenden Beispiele illustrieren spezielle Ausführungen gemäß der vorliegenden Erfindung. Weitere Aspekte und Varianten der Erfindung auf der Grundlage der obigen Ausführungen und der folgenden Beispiele werden den Fachleuten ersichtlich sein.
Beispiel 1: Konstruktion der rekombinanten Adenovirus-Vektoren Ad-MT, Ad-MnSOD und Ad-γ-GTP
Der Adenovirus Major Late Promoter wird mit einem rekombinanten humanen MT-Gen verbunden (Yamazaki et al., siehe oben; Soumillion et al., siehe oben) und in eine replikationsdefiziente Rekombinante integriert. Straus in THE ADENOVIRUSES, Ginsberg (ed.) (Plenum Press, New York 1984); Gilardi et al., FEBS Lett. 267: 60 (1990).
Der Vektor weist eine Deletion eines Teils der E3-Region und eines Teils der viralen E1a-codierenden Sequenz auf, enthält jedoch ein Insert einer MT-Expressionskassette (1A und 1B). Ad-MT wird konstruiert durch Deletion des überwiegenden Teils der E3-Region und eines Teils des linken Endes des Ad5 und durch Zufügen der linken Seite der MT-Expressionskassette von einem Plasmid, das die Nukleinsäuresequenz, die MT codiert, enthält.
Der Adenovirus Major Late Promoter wird mit einem rekombinanten humanen γ-GTP-Gen verbunden (Altman et al., Biochemistry 32: 3822 (1993) und in eine replikationsdefiziente Rekombinante integriert. Straus, siehe oben; Gilardi et al., siehe oben. Der Vektor weist eine Deletion eines Teils der E3-Region und eines Teils der viralen E1a-codierenden Sequenz auf, enthält jedoch ein Insert einer γ-GTP-Expressionskassette (2A und 2B). Ad-γ-GTP wird konstruiert durch Deletion des überwiegenden Teils der E3-Region und eines Teils des linken Endes des Ad5 und durch Zufügen der linken Seite der γ-GTP-Expressionskassette von einem Plasmid, das die Nukleinsäuresequenz, die γ-GTP codiert, enthält.
Der Adenovirus Major Late Promoter wird mit einem rekombinanten humanen MnSOD-Gen verbunden (Beck et al., Nucl. Acids. Res. 15: 9076 (1987)) und in eine replikationsdefiziente Rekombinante integriert. Straus, siehe oben; Gilardi of al., siehe oben. Der Vektor weist eine Deletion eines Teils der E3-Region und eines Teils der viralen E1a-codierenden Sequenz auf, enthält jedoch ein Insert einer MnSOD-Expressiortskassette. Ad-MnSOD wird konstruiert durch Deletion des überwiegenden Teils der E3-Region und eines Teils des linken Endes des Ad5 und durch Zufügen der linken Seite der MnSOD-Expressionskassette von einem Plasmid, das die Nukleinsäuresequenz, die MnSOD codiert, enthält (3A und 3B.
Sobald die Expressionskassette in jedem der Fälle in einen infektiösen replikationsdfizienten Virus verpackt wurde, ist der rekombinante Vektor in der Lage, die Synthese der humanen MT, humanen γ-GTP, der humanen MnSOD in vitro in 293-, CHO- und HeLa-Zelllinien zu steuern. Gilardi et al., siehe oben. Die Expression wird durch funktionelle Tests bestätigt.
Beispiel 2: In vivo Expression von MT, γ-GTP und MnSOD nach der Transfektion mit den rekombinanten Adenovirusvektoren Ad-MT, Ad-γ-GTP und/oder Ad-MnSOD
Ad-MT, Ad-γ-GTP oder Ad-MnSOD oder eine Kombination aus (a) Ad-γ-GTP und Ad-MT oder (b) Ad-γ-GTP und Ad-MnSOD oder (c) Ad-MT und Ad-MnSOD oder (d) sowohl Ad-MT als auch Ad-MnSOD und Ad-γ-GTP werden verwendet, um Speiseröhrengewebe von C3H/HeNsd-Mäusen in vivo zu transfektieren. Die Mäuse werden injiziert, indem ein an einer 28-Gauge-Nadel befestigter Schlauch durch die Mundhöhle geführt wird und der rekombinante Vektor an der Oberseite der Speiseröhre deponiert wird. Eine Lösung nackter DNA, die die gleiche Konzentration aufweist, wie die in dem aktiven Präparat verwendete, dient als Kontrolle.
Die Mäuse werden 24 Stunden später getötet, und die Speiseröhre wird entfernt. Das Gewebe wird getestet auf: (1) immunoreaktive MT, MnSOD oder γ-GTP, wie gemessen durch Immunopräzipitation oder Western-Blot-Analyse und (2) funktionelle MT, MnSOD und/oder γ-GTP-Aktivität. Humane Transkripte der Proteine werden im transfektierten Gewebe beobachtet; SDS-PAGE und Autoradiographie der Proteinproben von entnommenem Gewebe zeigen de novo Expression einer 6.000 Dalton-human-MT, einer 16.000 bis 19.000 Dalton-human-MnSOD und einer 62.000 Dalton-human-γ-GTP. Es wird keine Expression bei Mäusen, die eine Lösung nackter DNA erhalten haben, beobachtet.
Beispiel 3: Herstellung von MT, MnSOD und/oder γ-GTP-Lipid-Träger-Nukleinsäure-Komplexen
Lipid-Träger-Nukleinsäure-Komplexe werden mit Hilfe von Methoden hergestellt, die im Fachgebiet bekannt sind, wie jene, die von Debs et al., WO 93/12756 oder Stribling et al., siehe oben veröffentlich werden. Alternativ können Liposome für die Lipofektion wie folgt hergestellt oder von GIBCO BRL bezogen werden. Zur Herstellung von Liposomen für die Lipofektion werden 20 mg Ei-Phosphatrolycholin 1 Stunde lang mit einem Rotationsvakuumtrockner von einer Chloroformlösung verdampft, um auf den Wänden eines 5 ml Rundbodenkolbens einen dünnen Film zu bilden. Der getrocknete dünne Lipidfilm wird in einer 0,5 ml Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) ph 7,4 mit einem Vortexmixer suspendiert und dann sonifiziert.
Ein Expressionsvektor, der DNA beinhaltet, die MT, MnSOD und/oder γ-GTP und einen Promoter codiert, wie z. B. den humanen Beta-Actin-Promoter in pHB APr-1, wird in der sonifizierten Liposom-Suspension durch starkes 1-minütiges Vortexen der 0,5 ml DNA-Lösung mit der sonifizierten Suspension, gefolgt von drei Gefrier- und Auftau-Zyklen, eingeschlossen. Die Liposome mit eingeschlossener DNA werden von der nicht eingeschlossenen DNA, die mit PBS gelöst wird, durch Gelfiltration auf einer Sepharose-4B-Säule getrennt.
Die Liposommenge (30–40 μg) und die DNA-Menge (1 bis 5 μg) wird auf der Grundlage einer Dosis-Wirkungs-Kurve für den Zelltyp optimiert, um die Zelltoxizität zu bestimmen. Felgner et al., (1989) siehe oben. Die Liposommenge, die für die Lipofektion verwendet wird, beträgt etwa 50% ihrer toxischen Konzentration.
Zur Herstellung von Plasmid-/Kationen-Komplexen werden Kationen-Liposome hergestellt, die ein Kationen-Lipid-Präparat mit 1:1 DOTMA/DOPE (d.h. mit 1:1 N-(1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triethylammonium (DOTMA) und Dioleoylposphatidyl-ethanolamin (DOPE) enthalten. Lipid-Stammlösungen werden in Chloroform gelöst und bei –20°C unter Argon gelagert. Die Lipide werden im Rundbodenkolben gemischt und bis zum Trocknen in einem Rotationsverdampfer unter geringem Druck verdampft. Die Lipid-Endkonzentrationen von je 10 mM werden durch Zugabe von zweifach destilliertem Wasser hergestellt. Das resultierende Gemisch wird etwa 20 Minuten sonifiziert. Zwischen 5 und 50 mg, vorzugsweise 12 mg Plasmid werden zu 5 bis 100 μmol, vorzugsweise 24 μmol DOTMA-/DOPE-Liposomen komplexiert. LacZ Plasmid-/Liposom-Komplexe werden als Kontrollen hergestellt.
Beispiel 4: In vivo Expression von MT, MnSOD und/oder γ-GTP nach der Lipofektion mit Plasmid-/Liposom-Komplexen
Mäuse werden unter Einsatz der Lipofektion mit DNA transfektiert, die MT, MnSOD und/oder γ-GTP oder LacZ-Plasmid-/Liposom-Komplexe codiert, die gemäß Beispiel 3 hergestellt werden. Ausgewachsene C3H/HeNsd-Mäuse im Alter von circa 12 Wochen werden mit dem Plasmid-/Liposom-Komplex injiziert, indem ein an einer 28-Gauge-Nadel befestigter Schlauch durch die Mundhöhle geführt wird und 150 μl des Plasmid-/Liposom-Komplexes, der 1 mg MT, MnSOD, γ-GTP oder LacZ-Plasmid-DNA (10 μg/ml) und 56 μl des Lipofektanten enthält, an der Oberseite der Speiseröhre deponiert/platziert wird. Eine Lösung nackter DNA, die die gleiche Konzentration aufweist, wie die in dem Liposompräparat verwendete, dient als Kontrolle.
Die Mäuse werden 24 Stunden später getötet, und die Speiseröhre wird entfernt. Das Gewebe wird getestet auf: (1) immunoreaktive MT, MnSOD oder γ-GTP, wie gemessen durch Immunopräzipitation oder Western-Blot-Analyse oder LacZ, wie gemessen durch Färbung, und (2) funktionelle MT, MnSOD und/oder γ-GTP-Aktivität. Humane Transkripte der Proteine werden im transfektierten Gewebe beobachtet; SDS-PAGE und Autoradiographie der Proteinproben von entnommenem Gewebe zeigen de novo Expression einer 6.000 Dalton-human-MT, einer 16.000 bis 19.000 Dalton-human-MnSOD und eine 62.000 Dalton-human-γ-GTP. LacZ-Expression wird bei Mäusen bestätigt, die LacZ-Plasmid-/Liposom-Komplexe erhielten. Es wird keine Expression bei Mäusen, die eine Lösung nackter DNA erhalten haben, beobachtet.
Beispiel 5: Schutz der Speiseröhre vor ionisierender Strahlung und Alkylierungsmitteln
Kontrollmäuse und Mäuse, die im Ergebnis der Lipofektion mit Plasmid-/Limpsom-Komplexen gemäß Beispiel 4 transient rekombinante MT, MnSOD, γ-GTP oder eine Kombination dieser Proteine im Speiseröhrengewebe exprimieren, werden getestet, um zu sehen, ob das/die rekominante(n) Proteine) die Speiseröhre während der Bestrahlung schützen. Eine erste Gruppe von Mäusen wird ionisierender Bestrahlung ausgesetzt, wobei die Lunge eine Dosis Halbkörper-Bestrahlung, die etwa 1800 bis 2500 cGY in einer Fraktion oder etwa 2000 bis 3000 cGY in mehreren Fraktionen liefert, erhält. Diese Behandlungen erzeugen bei ungeschützten Tieren zwei bis drei Tage nach der Bestrahlung mit einer Fraktion eine akute Speiseröhrenentzündung durch Strahlung. Zu aufeinander folgenden Zeitpunkten nach der Bestrahlung zwischen etwa einem Tag und zwei Wochen nach der Bestrahlung werden die Tiere getötet und die bestrahlten und die Kontrollspeiseröhren werden entfernt.
Die Wirkung der Transgen-Expression auf die Entstehung einer Chemoradiotherapie-induzierten Speiseröhrenentzündung wird ebenfalls beurteilt. Eine zweite Gruppe von Mäusen wird einer Chemoradio-Behandlung unter Verwendung von Taxol ausgesetzt, um festzustellen, ob eine erhöhte Expression von MT, MnSOD und/oder γ-GTP gegen die Entstehung einer Speiseröhrenentzündung infolge einer Chemoradiotherapie schützt. Dabei erhalten die Mäuse eine einmalige Dosis von 6 mg/kg Taxol oder über 5 Tage eine fraktionierte Dosis von 1,5 mg/kg/Tag Taxol durch intraperitoneale Injektion. Am letzten Tag der Taxol-Injektion erhalten die Versuchsmäuse eine Speiseröhreninjektion mit einem MT-, MnSOD- oder γ-GTP-Plasmid-/Liposom-Komplex. Die Kontroll- und Versuchsmäuse werden mit 1500, 1750 oder 2000 cGy bestrahlt.
Ein Mausmodel für Bestrahlungs-induzierte Speiseröhrenentzündung wurde bereits früher beschrieben. Rosenzeweig et al., Nucl. Med. Biol., 21: 171–178 (1994). Gemäß dem Modell wurde der LD50/30 verwendet, um die Sterberate infolge einer Speiseröhrenentzündung, die innerhalb der ersten 30 Tage nach der Bestrahlung auftrat, zu beschreiben. Bei C3H/HeJ-Mäusen wurde gezeigt, dass sie einen LD50/30 von 1900 cGy hatten, der auf 1252 oder 1686 gesenkt wurde, wenn jeweils 1 oder 7 Tage im Voraus Adriamycin verabreicht wurde.
Das Mausmodell für die Speiseröhrenentzündung wird verwendet, um die Sterberate durch Speiseröhrenentzündung, verursacht durch Strahlungsinduzierte Veränderungen, zu beurteilen, indem LD50/30 bei Kontroll- und Versuchsmäusen verglichen wird. Um LD50/30 zu ermitteln, werden die Mäuse 24 Stunden nach der Injektion mit dem Plasmid-/Liposom-Komplex mit einer einmaligen Bestrahlungsdosis zwischen 1800 und 2500 cGy bestrahlt. Die Mäuse werden so abgeschirmt, dass die Bestrahlung auf die Lungenhöhle begrenzt ist. Die Mäuse werden vor der Bestrahlung und dann 7, 14, 21 und 28 Tage nach der Bestrahlung gewogen. Die Mäuse werden täglich beobachtet und getötet, wenn sie mehr als 20% ihres Körpergewichts verlieren oder Schwierigkeiten beim Atmen oder Bewegen haben. Nach 30 Tagen werden alle restlichen Mäuse getötet.
Es wird auch ein fraktionierter Bestrahlungsplan verwendet. Dabei erhalten die Mäuse 24 Stunden vor der ersten Dosis und danach alle 48 Stunden eine Plasmid-/Liposom-Komplex-Injektion in die Speiseröhre. Die Bestrahlungsdosis wird fraktioniert in 400 cGy × 5, 300 cGy × 10 oder 250 cGy × 12.
Die Speiseröhrenentzündung wird auch durch Verfolgen ihres histologisches Fortschreitens überwacht. Die Mäuse werden zu aufeinander folgenden Zeitpunkten nach der Behandlung getötet. Die Speiseröhre wird entfernt, in Formalin fixiert, zerteilt und mit Hämatoxylin und Eosin eingefärbt. Die Teile werden unter einem Mikroskop nach Veränderungen an der Schleimhautschicht untersucht, die unter Verwendung der Bildanalyse-Software Optimas bewertet werden, um die Schädigung der Speiseröhre zu quantifizieren.
Die Werte für LD50/30 sind deutlich geringer bei Mäusen, die eine Plasmid-/Liposom-Komplex-Injektion, die MT, MnSOD oder γ-GTP enthält, in die Speiseröhre erhalten haben.
Ferner zeigt die histologische Untersuchung der Speiseröhre, dass die Komplexe die Schädigung der Schleimhautschicht, die mit der Bestrahlungs-induzierten Speiseröhrenentzündung zusammenhängt, wirksam verhindern.
Auch wenn die Erfindung hinsichtlich bestimmter bevorzugter Ausführungen ausführlich beschrieben wurde, versteht sich, dass eine solche Beschreibung der Illustration und nicht der Einschränkung dient.

Claims

Verwendung eines Pharmazeutikums umfassend (A) ein Polynukleotid, das für ein Protein kodiert, das vorübergehend in einem Subjekt exprimiert wird, wobei das Protein in der Lage ist, toxische Spezies zu neutralisieren oder zu eliminieren, und (B) ein pharmazeutisch akzeptables Vehikel für das Polynukleotid, zum Herstellen eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung der Mundhöhle, des Mund-Rachen-Raums, des Ösophagus, des Magens, des Dünndarms oder Colons eines Krebspatienten, wobei das Medikament eingerichtet ist zur Verabreichung in vivo an der zu schützenden Stelle, und wobei die zu schützende Stelle eine Stelle entfernt ist von einer Tumor-Stelle, die durch ein Agens behandelt werden soll, das die Produktion einer toxischen Spezies auslöst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem freien Radikal, einem Superoxid-Anion und einem Schwermetall-Kation.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Agens ionisierende Strahlung ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die ionisierende Strahlung klinische Strahlentherapie ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Agens ein Chemotherapeutikum ist.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Polynukleotid eine cDNA ist, und das Vehikel ein Liposom ist.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Polynukleotid eine cDNA ist und das Vehikel ein Adenovirus-Vektor ist.
Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gamma-Glutamyl-Transpeptidase, Mangansuperoxid-Dismutase und Metallothionein.
Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Protein Gamma-Glutamyl-Transpeptidase ist.
Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Protein Mangansuperoxid-Dismutase ist.
Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Protein Metallothionein ist.
Verwendung nach Anspruch 5 oder, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung umfasst: Eine Mischung aus Polynukleotiden, die ausgewählt sind aus den Gruppen bestehend aus einem Polynukleotid kodierend für Gamma-Glutamyl-Transpeptidase, einem Polynukleotid kodierend für Mangansuperoxid-Dismutase, und einem Polynukleotid kodierend für Metallothionein.
Verwendung nach Anspruch 8, 9, 10 oder 11, wobei das Polynukleotid unter der Kontrolle einer induzierbaren Transkriptionsregulationssequenz ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Polynukleotid unter der Kontrolle einer radioinduzierbaren Transkriptionsregulationssequenz ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Krebspatient ein Lungenkrebspatient ist, der Schutz von Gewebe der Mündhöhle, des Mund-Rachen-Raums und des Ösophagus benötigt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Krebspatient ein Krebspatient mit Krebs im Unterleib ist, der Schutz von Gewebe des Colons und des Dünndarms benötigt.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei der Krebs Gebärmutterhalskrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei der Krebs Prostatakrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei der Krebs Endometrium-Krebs ist.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei der Krebs Eierstockkrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei der Krebs Blasenkrebs ist.