ES2257049T3 - Proteccion frente a la irradiacion ionizante o la lesion por farmacos quimioterapeuticos por terapia de genes in vivo. - Google Patents
Proteccion frente a la irradiacion ionizante o la lesion por farmacos quimioterapeuticos por terapia de genes in vivo.Info
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Abstract
Uso de una composición farmacéutica que comprende (A) un polinucleótido que codifica una proteína que se expresa transitoriamente en un sujeto, en el que la mencionada proteína es capaz de neutralizar o eliminar especies tóxicas; y (B) un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mencionado polinucleótido, con el fin de preparar un medicamento para uso en la proteccción de la cavidad oral, la orofarínge, el esófago, el estómago, el intestino delgado y el colon en un paciente con cáncer, en el que el medicamento está adaptado para su administración in vivo en el sitio a proteger, y en el que sitio a proteger que está alejado del sitio del tumor a tratar con un agente, que induce la producción de una especie tóxica, especie tóxica seleccionada entre el grupo constituido por un radical libre, un anión superóxido y un catión de un metal pesado.
Description
Protección frente a la irradiación ionizante o la
lesión por fármacos quimioterapéuticos por terapia de genes in
vivo.
La presente invención está dirigida al uso de una
composición farmacéutica que comprende (A) un polinucleótido que
codifica una proteína que se expresa transitoriamente en un sujeto,
en la que la mencionada proteína es capaz de neutralizar o eliminar
especies tóxicas; y (B) un vehículo farmacéuticamente aceptable
para el mencionado polinucleótido, con el fin de preparar un
medicamento para uso en la protección de la cavidad oral, la
orofarínge, el esófago, el estómago, el intestino delgado y el
colon por expresión transitoria de una proteína mediante
transferencia somática de genes in vivo.
Es conocido que concentraciones terapéuticas de
fármacos anticancerosos y la terapia por radiaciones clínicas dañan
los tejidos y células normales de un paciente. Existe claramente
necesidad de medios para proteger los tejidos normales del paciente
durante la quimioterapia y/o la terapia por radiaciones. Entre los
procedimientos anteriores para suministrar tal protección está
incluida la administración de compuestos sulfhidrilo tales como
tioles u otros compuestos secuestradores de radicales.
La vía principal por la que la radiación daña
biomoléculas y células es la de su interacción con agua para
producir radicales libres tóxicos (H^{+}, OH^{-},
e_{ac}^{-}) y H_{2}O_{2}, o mediante interacción con
oxígeno, para producir radicales superóxido (*O_{2}^{-}). Al
final de la década de 1940 se descubrió que los compuestos
sulfhidrílicos, tales como cisteína y cisteamina, proporcionan
protección frente a la radiación en animales. (Patt y otros,
Science, 110: 213 (1949)). Los grupos tiol secuestran radicales
libres producidos por radiación donando un átomo de hidrógeno a
moléculas dañadas. A pesar de los extensos esfuerzos para
desarrollar agentes protectores más efectivos, no se ha encontrado
un radioprotector basado en tiol que sea significativamente mejor
que la cisteína. (Mitchell y otros, Arch. Biochem. and Biophys,
289, 62 (1991). Sin embargo, el uso de fármacos de tiol para
proteger frente a daños producidos por radiaciones está limitado
por la toxicidad de tales compuestos.
Los agentes antineoplásicos, en particular la
clase de fármacos quimioterapéuticos conocidos como agentes de
alquilación, producen también radicales libres que son citotóxicos
debido a su capacidad para formar enlaces covalentes con ácidos
nucleicos. La mayor parte de los agentes de alquilación forman
iones carbonio cargados positivamente que dan el intermedio de
alquilación cargado
R-CH_{2}-CH_{2}* que ataca
sitios ricos en electrones de ácidos nucleicos, proteínas,
moléculas pequeñas y aminoácidos.
Se han identificado varios secuestradores
intracelulares endógenos de radicales libres, radicales superóxido
y cationes de metales pesados. Es conocido que la inducción o las
actividades elevadas de metalotioneína (MT),
gamma-glutamil transpeptidasa
(\gamma-GTP) y superóxido de dismutasa (SOD)
proporcionan resistencia a daños por radiaciones ionizantes in
vitro. Estas proteínas actúan intracelularmente para secuestrar
radicales libres, aniones superóxido o cationes de metales pesados.
La patente U.S. nº. 5.599.712 describe un procedimiento para
suministrar niveles terapéuticos intracelulares funcionales de
metalotioneína, superóxido de dismutasa o
gamma-glutamil transpeptidasa para proteger tejidos
normales de pulmón frente a los efectos adversos de una combinación
de quimioterapia y terapia por irradiación.
Es, por tanto, un objetivo de la presente
invención proporcionar el uso de un producto farmacéutico para la
preparación de un medicamento para uso en la protección de células
normales fuera del sitio de un tumor frente a los efectos dañinos
de un agente anticanceroso o una radiación ionizante, que
proporciona genes que codifican una proteína protectora a células
somáticas normales.
Es otro objetivo de la presente invención
proporcionar el uso de un producto farmacéutico para la preparación
de un medicamento para uso en la protección de células normales, en
particular células de la cavidad oral, la orofaringe, el esófago,
el estómago, el intestino delgado y el colon, frente a los efectos
dañinos de un agente anticanceroso o una radiación ionizante, que
proporciona genes que codifican una proteína protectora a células
somáticas normales.
En el contexto de la presente invención, se
proporciona la expresión transitoria de la proteína de oxidación o
secuestradora de cationes en las células de la cavidad oral, la
orofaringe, el esófago, el estómago, el intestino delgado y el
colon para proteger estas células frente a un agente anticanceroso,
en la que el polinucleótido o gen transferido se elimina después de
las etapas terapéuticas de la terapia por radiación ionizante o
quimioterapia, o el polinucleótido o gen transferido se integra
dentro del genoma, si bien su expresión es temporal, y es inducida
por un tiempo limitado por la terapia con radiación ionizante o la
quimioterapia.
Para lograr estos y otros objetivos, se ha
proporcionado, de acuerdo con la presente invención, el uso de una
composición farmacéutica que comprende (A) un polinucleótido que
codifica una proteína que se expresa transitoriamente en un sujeto,
en la que la mencionada proteína es capaz de neutralizar o eliminar
especies tóxicas; y (B) un vehículo farmacéuticamente aceptable para
el mencionado polinucleótido, con el fin de preparar un medicamento
para uso en la proteccción de la cavidad oral, la orofarínge, el
esófago, el estómago, el intestino delgado y el colon en un
paciente con cáncer, medicamento que está adaptado para su
administración in vivo en el sitio a proteger, sitio a
proteger que está alejado del sitio del tumor a tratar con el
agente que induce la producción de una especie tóxica, especie
tóxica seleccionada entre el grupo constituido por un radical
libre, un anión superóxido y un catión de un metal pesado. El
agente puede ser una radiación ionizante, terapia clínica por
irradiación o un fármaco quimioterapéutico. En una realización
preferente de la invención, las proteínas de la invención que
neutralizan o eliminan la especie tóxica son
gamma-glutamil transpeptidasa, superóxido de
manganeso dismutasa o metalotioneína. En una realización de la
invención, la composición farmacéutica de la invención comprende una
mezcla de polinucleótidos seleccionados entre un polinucleótido que
codifica gamma-glutamil transpeptidasa, un
polinucleótido que codifica superóxido de manganeso dismutasa o un
polinucleótido que codifica metalotioneína.
Para introducir un polinucleótido de acuerdo con
la invención se pueden usar liposomas, un vector de adenovirus o
conjugados de ligando-DNA. La administración de la
composición farmacéutica se realiza antes de exponer el sujeto a un
agente. El presente procedimiento se usa durante el tratamiento de
una variedad de cánceres, incluidos cáncer de pulmón, cáncer de
próstata, cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer de ovario y
cáncer de vejiga.
Otros objetivos, rasgos y ventajas de la presente
invención resultarán evidentes al considerar la descripción
detallada posterior. Debe tenerse en cuenta, empero, que la
descripción detallada y los ejemplos específicos, si bien indican
realizaciones preferentes, se dan sólo a fines ilustrativos.
Las Figuras 1A y 1B son dibujos esquemáticos de
la construcción de un vector adenovirus recombinante de
metalotioneína (MT) (Ad-MT) de la presente
invención. La Figura 1A ilustra el genoma de tipo 5 de adenovirus
de tipo salvaje (Ad5) que presenta las regiones E1a, E1b y E3 y la
porción a suprimir del extremo izquierdo de Ad5 para la inserción
de las casetes de expresión apropiadas. Una casete de expresión es
una construcción de ácido nucleico que incluye, como componentes
unidos operativamente en la dirección de transcripción, una región
de iniciación transcripcional, una secuencia de ácidos nucleicos que
codifica una proteína de interés y una región de terminación
transcripcional, en la que las regiones reguladoras
transcripcionales son funcionales en la célula huésped de mamífero
diana. La Figura 1B ilustra una casete de expresión que contiene
secuencias reguladoras y una secuencia de DNA recombinante que
codifica metalotioneína.
Las Figuras 2A y 2B son dibujos esquemáticos de
la construcción de un vector de adenovirus recombinante de
gamma-glutamil transpeptidasa
(Ad-\gamma-GTF). La Figura 2A
ilustra el genonoma de tipo 5 de adenovirus de tipo salvaje (Ad5)
que presenta las regiones E1a, E1b y E3 y la porción a suprimir del
extremo izquierdo de Ad5 para insertar la casete de expresión
adecuada. La Figura 2B ilustra una casete de expresión que contiene
secuencias reguladoras y una secuencia de DNA recombinante que
codifica \gamma-GTF.
Las Figuras 3A y 3B son dibujos esquemáticos de
la construcción de un vector de adenovirus recombinante de
superóxido de manganeso dismutasa (Ad-MnSOD). La
Figura 3A ilustra el genonoma de tipo 5 de adenovirus de tipo
salvaje (Ad5) que presenta las regiones E1a, E1b y E3 y la porción
a suprimir del extremo izquierdo de Ad5 para insertar la casete de
expresión adecuada. La Figura 3B ilustra una casete de expresión
que contiene secuencias reguladoras y la secuencia de DNA
recombinante que codifica superóxido de manganeso dismutasa.
La radiación ionizante produce radicales libres
tóxicos. Los agentes antineoplásicos, en particular los de la clase
de fármacos quimioterapéuticos conocidos como agentes de
alquilación, producen también radicales libres que son citotóxicos
por su capacidad de formar enlaces covalentes con ácidos nucleicos.
La mayoría de los agentes de alquilación, incluidas ciclofosfamidas,
mostaza nitrogenada, melfalán, clorambucil, busulfano, nitrosourea,
cis-platino, estreptozoticina,
aziridinilbenzoquinona (AZD), dicarbazina (DTIC), mAMSA y
mitoxantrona, forma iones carbonio cargados positivamente que dan un
intermedio de alquilación cargado,
R-CH_{2}-CH_{2}^{+}, que ataca
los sitios ricos en electrones de ácidos nucleicos, proteínas,
moléculas pequeñas y aminoácidos. Chabner y otros, en Cancer:
Principles and Practice of Oncology, 2ª edición, DeVita y otros
(eds.) (J.B. Lippincott Co., Filadelfia 1985).
El uso de la presente invención proporciona un
medicamento para uso en la protección de células normales, en
particular células de la cavidad oral, la orofarínge, el esófago,
el estómago,. el intestino delgado y el colon, de un individuo
contra un agente que provoca la producción de un radical libre, un
anión superóxido y/o un catión de un metal pesado. La célula a
proteger puede ser de un sitio alejado del sitio del tumor. El uso
de la presente invención emplea terapia de genes, que es la
transferencia de material genético a las células específicas de un
paciente.
La expresión transitoria de genes de acuerdo con
la presente invención, puede efectuarse por uno de dos mecanismos.
La transferencia de genes se puede usar para introducir secuencias
de DNA en el núcleo de una forma no integrada. En ese caso, la
expresión transitoria, o la expresión no integrada, está limitada
por la estabilidad de la(s) molécula(s) de DNA no
integrada(s) y puede persistir durante períodos mayores que
aproximadamente una a dos semanas. Alternativamente, un gen o
polinucleótido se puede integrar establemente en el genoma. Un gen
que es transferido establemente a un individuo se denomina
transgén.
El procedimiento de la terapia de genes de la
presente invención implica una terapia de genes in vivo que
proporciona un polinucleótido que codifica una proteína que es
capaz de neutralizar o eliminar un radical libre, un anión
superóxido y/o un catión de un metal pesado tóxicos, expresándose la
proteína transitoriamente en el individuo. Los transgenes codifican
proteínas tales como metalotioneína, superóxido dismutasa o
gamma-glutamil transpeptidasa que secuestran un
radical libre, un anión superóxido y/o un catión de un metal pesado
tóxicos.
La
\gamma-glutamiltranspeptidasa
(\gamma-GTF) es una ectoenzima asociada a
membrana que cataliza la transpeptidación de glutationa extracelular
en intermedios de aminoácidos, que luego se transportan a través de
la membrana celular y se usan para resintetizar glutationa de novo.
La glutationa (GSH) desintoxica radicales libres. Generalmente, las
células sintetizan GSH de novo a partir de los aminoácidos
constituyentes. La sensibilidad de una célula a la radiación está
correlacionada directamente con su capacidad de transpeptidar la
glutationa extracelular a través de \gamma-GTP.
Las líneas de células con una actividad de
\gamma-GTP alta son más resistentes a los efectos
de la radiación y son más capaces de reparar daños inducidos por
dosis bajas de radiaciones g que las líneas de tumores con una
actividad de \gamma-GTP baja. Véanse los Ejemplos
7 y 8. Las células de tumores empobrecidas en GSB han revelado ser
más susceptibles a la irradiación ionizante y los agentes
quimioterapéuticos porque se reducen las rutas de desintoxicación
GSH-dependientes. Louise y otros, Cancer Res., 45:
2110 (1985).
La protección contra radicales superóxido
requiere antioxidantes, tales como GSH, y la enzima secuestradora
de O_{2} superóxido-dismutasa (SOD). Las SODs son
metaloenzimas que son esenciales para la dismutación de O_{2} a
H_{2}O_{2} y O_{2}. Hay tres formas de SODs:
cobre-zinc (CuZnSOD), manganeso (MnSOD) y hierro
(FeSOD). Aunque la CuZnSOD y la FeSOD se hacen constitutivamente,
la síntesis de MnSOD es inducible. Se ha visto que la inducción de
la actividad de MnSOD se produce después de irradiar con rayos X el
tejido cardíaco. Oberley y otros, Arch. Biochem. Biophys. 254: 69
(1987). Además, las líneas de células tumorales transfectadas con
cDNA de MnSOD in vitro demuestran una resistencia
incrementada a la radiación. Suresh y otros, Experimental
Hematology 21: 1828 (1993).
Las metalotioneínas son proteínas de bajo peso
molecular constituidas por una cadena individual de polipéptido de
61 restos de aminoácidos, de los que 20 son cisteínas que quelatan
cationes. La inducción de matalotioneína ha revelado que
proporciona resistencia a daños por irradiación ionizante. La
proteína metalotioneína protege las células de los efectos tóxicos
de iones de metales pesados y es un poderoso secuestrador de
radicales OH inducidos por radiaciones in vitro. Las líneas
de células que expresan niveles altos de MT son resistentes a los
agentes nocivos de DNA, tales como cis-platino y
clorambucil, y a la radiación ionizante. Andrews y otros, Cancer
Chemother. Pharmacol. 19: 149 (1987); Bakka y otros, Experimentia
38: 381 (1982); Matsubara y otros, Environ. Res. 43: 66 (21987). La
metalotioneína es capaz de secuestrar radicales libres producidos
por fármacos anticancerosos electrófilos y radiación ionizante
in vitro. Endresen y otros, Cancer Res. 43: 2918 (1983);
Thornalley y otros, Biochim., Biophys. Acta 827: 36 (1985). Es
importante que la inducción de MT en el hígado de ratón proporciona
protección contra el daño letal producido por dosis altas de
radiación. Matsubara y otros, Rad. Res. 111: 267 (1987). Pero
algunas líneas de células transfectadas con gen de MT in vivo
eran tan sensibles a la radiación ionizante y la bleomicina como
las células receptoras no transfectadas. Sin embargo, las células
transfectadas con MT eran resistentes a la mitocina, lo que sugiere
que la proteína MT protege algunas células in vitro de los
agentes de alquilación monofuncionales y de reticulación, pero no
de los radicales libres. Lohrer y otros, Carcinogenesis 10: 2279
(1989):
Se puede aislar o sintetizar una región de
codificación que codifica una superóxido dismutasa entera,
preferiblemente MnSOD, por procedimientos conocidos en la técnica,
basados en las secuencias de MnSOD dadas por Oursler y otros, J.
Cell. Biochem. 46 219 (1991) o Beck y otros, Nucl. Acids Res. 15:
9076 (1987), o las secuencias de SOD indicadas en la patente U.S.
nº. 4.751.180; por Lieman-Hurwitz y otros, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 79: 2808 (1982); en la patente U.S. nº.
4.742.004; por Xiang y otros, Nucleic Acids Res. 15: 7654 (1987) o
sherman y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5465 (1093).
Alternativamente, estas secuencias se pueden preparar por reacción
en cadena de polimerasa por procedimientos bien conocidos por los
expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Wong y otros, Cell 58:
913 (1989).
Las secuencias de DNA que codifican varias
especies e isomorfos de metalotioneína se pueden aislar o
sintetizar por procedimientos bien conocidos en la técnica basados
en las secuencias dadas para MT humana por Yamakazi y otros,
Biochem. Int. 28: 451 (1992); Soumillion y otros, Eur. J. Biochem.
209: 999 (1992); Karin y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4040
(1983); Paliwal y otros, Neurochem. Int. 17: 441 (1990); Schmidt y
otros, J. Biol. Chem. 260: 7731 (1985); Richards y otros, Cell 37:
263 (1984); Karin y otros, Nature 299: 797 (1982); Hyland y
otros, Nucleic Acids Res. 15: 1350 (1987); oveja y ratón [(Peterson
y otros, Eur. J Biochem. 160:579 (1986)]; peces [(Lee y otros,
Korean Biochem J. 25: 48 (1992); Bonham y otros, DNA 6: 519 (1987)]
e insectos [Lastowski-Perry y otros, J. Biol. Chem.
260: 1527 (1985)]. Preferiblemente, en el procedimiento de la
presente invención se usan las secuencias de metalotioneína humana
descritas por Yamazaki y otros, 1992, referida antes, o por
Soumillion y otros, 1992, referida antes.
Se puede proporcionar DNA que codifica
\gamma-GTP para uso en la presente invención
aislando o sintetizando tal secuencia por procedimientos bien
conocidos en la técnica basados en las secuencias dadas por
cualquiera de los investigadores Altman y otros, Biochemistry, 32:
3822 (1993), Ishiye y otros, Biotech. Progr. 9: 323 (1993); Ishiye
y otros, FEMS Microbiol. Lett 97: 235 (1992), o Angele y otros,
Clin. Chem. 37: 662 (1991). Se puede proporcionar DNA que codifica
MT, SOD, MnSOD o \gamma-GTP para uso en la
presente invención por procedimientos bien conocidos por los
expertos en la técnica, tales como (1) síntesis de
oligonucleótidos de las secuencias de DNA deseadas basadas en las
secuencias descritas en las referencias citadas antes; (2)
aislamiento de las secuencias de DNA deseadas de los plásmidos
descritos en las referencias anteriores o de plásmidos disponibles
en la American Type Culture Collection (ATCC) (12301 Parklawn
Drive, Rockville, Mryland 20852) tales como: (a) ATCC 57117 -pHM6
que contiene el pseudógeno 1 de metalotioneína 2 humana; (b) ATCC
57153 -bMT-IIA que contiene el gen de
metalotioneína 2 humana; (c) ATCC 20745 -pYAS11 que contiene cDNA
que codifica superóxido dismutasa humana; (d) ATCC 20796
-pYLUIGF2-14 que contiene DNA que codifica
superóxido dismutasa 1 humana; (e) ATCC 39786 - pSOD alfa 2 que
contiene DNA que codifica superóxido dismutasa 1; (f) ATCC 59946,
59947 -phMnSOD4 que contiene DNA que codifica superóxido dismutasa
2 humana; (g) ATCC 61646, 61647 que contiene cDNA que codifica
superóxido dismutasa 1 humana; (h) ATCC 86406 - IB861 que contiene
cDNA que codifica superóxido dismutasa humana o (3) amplificación
por reacción en cadena de polimerasa de las secuencias de DNA
deseadas a partir de bibliotecas de DNA descritas en las referencias
anteriores usando cebadores basados en las secuencias descritas en
las referencias anteriores.
La expresión transitoria de genes administrados
in vivo se considera en esta técnica como una limitación
técnica importante para la terapia de genes. Véase Mulligan,
Science 260: 926 (1993). En marcado contraste, de acuerdo con la
presente invención, la expresión transitoria de los genes es muy
deseable porque la protección del tejido normal sólo es necesaria
durante el período de la terapia de radiación o la quimioterapia;
después, es deseable una rápida eliminación del producto de gen. La
expresión transitoria es deseable porque son desconocidos los
efectos clínicos prolongados de MT, \gamma-GTP y/o
MnSOD altos. También puede ser clínicamente deseable, después de
quimioterapia o terapia por radiaciones, la eliminación del
transgén y su vector para la siguiente fase de un enfoque
terapéutico de modalidad combinada. El uso de la presente invención
está diseñado para que de por resultado la expresión transitoria o
no integrada de un gen exógeno in vivo; sin embargo, en el
caso de que también se produzca una cantidad limitada de integración
estable del DNA proporcionado exógenamente, el procedimiento sigue
siendo funcional en cuanto a su capacidad para proporcionar una
proteína capaz de neutralizar o eliminar una especie iónica tóxica
in vivo.
La expresión transitoria se puede lograr por
introducción dirigida del material genético que codifica las
proteínas deseadas en las células o usando un genoma de virus
heterólogo como vector. Los procedimientos para suministrar genes en
células de mamíferos para lograr la expresión transitoria que se
pueden utilizar para la terapia de genes incluyen: transferencia de
papovirus, adenovirus, virus de vacunas, virus de herpes, virus de
polio, virus de sindbis y otros virus de RNA, conjugados de
ligando-DNA, conjugados de
adeniovirus-ligando-DNA, DNA
desnudo, lipofección y transferencia de genes mediada por receptor.
Véase, por ejemplo, Mulligan cita anterior; Coen en
Virology, Fields y otros, (eds.) Raven Press, Ltd., (New
York, 1990); Perkol y otros, Faseb 7: 1081 (1993)). Los estudios en
modelos animales han transferido genes eficientemente usando
retrovirus (Friedman, Science 244: 1275 (1989)), adenovirus
(Rosenfeld y otros, Science 252: 431 (1991); Rosenfeld y otros,
Cell 68: 143 (1992)) y liposomas (Felgner y otros, Nature 349: 351
(1991)).
La expresión transitoria se logra en virtud de un
promotor transcripcional inducible para controlar la expresión del
gen o polinucleótido. El promotor inducible se puede inducir
directa o indirectamente por la terapia con radiación ionizante o
el propio agente de quimioterapia. Un promotor adecuado es el
promotor erg1, un promotor inducido por irradiación. Hallahan y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 2156-2160
(1991) y Datta y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
10149-10153 (1992). La transcripción de
polinucleótido(s) o gen(es) controlada por
erg-1 se para aproximadamente entre 60 y 90 horas
después de la infección.
La presente invención se puede usar para proteger
tejidos específicos en pacientes con cáncer contra los efectos
dañinos de una radiación ionizante y fármacos quimioterapéuticos
que producen radicales libres, aniones superóxido y/o cationes de
metales pesados. En particular, la presente invención se puede usar
para transferir un gen a células normales en un sitio alejado del
sitio del tumor antes de la terapia da irradiación clínica o la
administración del fármaco quimioterapéutico para combatir un
cáncer. En particular, la presente invención se puede usar para
transferir un gen a células normales de la cavidad oral, la
orofaringe, el esófago, el estómago, el intestino delgado o el colon
antes de la terapia por irradiación clínica o la administración de
un fármaco quimioterapéutico para combatir, por ejemplo, cáncer de
pulmón, de próstata, de vejiga, de cervicales o endometrial.
En una realización preferente, el uso de una
composición farmacéutica de la presente invención está dirigido a
un medicamento para la terapia de genes transitoria in vivo
con el fin de proporcionar protección de la cavidad oral, la
orofaringe y el esófago cuando se trata el cáncer de pulmón por
terapia con radiación ionizante o agentes antineoplásicos de
alquilación. Un factor limitativo en el tratamiento del cáncer de
pulmón, en particular con regímenes de tratamiento que implican una
combinación de terapia por radiación y quimioterapia con
paclitaxel, vinblastina o cisplatino, ha sido el desarrollo de
esofagitis durante los tratamientos con irradiación. En algunos
casos, los pacientes no pueden completar una tanda de terapia a
causa de manifestarse una esofagitis severa. La esofagitis es el
resultado de una lesión causada a la capa de mucosa del esófago.
Después de irradiación, hay un aumento de la actividad mitótica en
la mucosa para reparar el daño. El paclitaxel, en particular, actúa
bloqueando la mitosis durante G_{2}/M, la porción del ciclo
celular más sensible a la radiación. Se supone especulativamente que
la combinación de la inhibición de mitosis por el agente
quimioterapéutico y la sensibilización de las células mucosas
durante la irradiación impide la reparación de la lesión de la
mucosa y causa la esofagitis.
En otra realización, el uso de un producto
farmacéutico de la presente invención está dirigido a un
medicamento para terapia de genes transitoria in vivo de
pacientes con cáncer de próstata, vejiga, cervicales o de endometrio
con el fin de proporcionar protección al intestino delgado y el
colon cuando estos cánceres se tratan por terapia con radiación
inonizante o agentes antineoplásicos de alquilación. El mecanismo
es el mismo descrito antes para la protección del esófago. En este
caso se supone que la combinación de la inhibición de la mitosis
por el agente quimioterapéutico y la sensibilización de las células
de la mucosa durante la irradiación impide la reparación del daño
causado a la mucosa en células criptointestinales o células del
colon.
Además de ser útil el uso de un compuesto de la
presente invención para proteger células normales en un sitio
alejado del sitio del tumor antes de la terapia por una radiación
clínica o la quimioterapia con un fármaco quimioterapéutico, los
compuestos de la presente invención son también útiles para proteger
células normales de la cavidad oral, la orofaringe, el esófago, el
estómago, el intestino delgado y el colon durante el tratamiento de
un tumor en la misma región. En este caso, el transgén se
suministra y expresa más eficientemente en un tejido normal que en
tumores del mismo tejido. La expresión más eficiente en tejido
normal que en tejido tumoral ha sido confirmada por estudios en
animales experimentales, por ejemplo, ratas y ratones. Una expresión
inferior del transgén en células tumorales transplantadas a
animales que en el tejido normal circundante confirma una relación
inferior de suministro de genes terapéuticos a células tumorales
que a células normales diana a proteger.
Las composiciones para uso en la presente
invención comprenden un polinucleótido que codifica una proteína
que se expresa transitoriamente en un sujeto cuando el sujeto se
expone a un agente que provoca la producción de una especie tóxica,
tal como un radical libre, un anión superóxido o un catión de un
metal pesado, siendo la proteína capaz de neutralizar o eliminar la
especie tóxica; y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el
nucleótido. En este contexto, un vehículo farmacéuticamente
aceptable es inerte o aceptable médicamente de alguna manera, y es
compatible con el agente activo, en un contexto de administración
particular. Además de un excipiente adecuado, un vehículo
farmacéuticamente aceptable puede contener aditivos convencionales
como diluyentes, coadyuvantes, antioxidantes, agentes dispersivos y
emulsivos, agentes antiespumantes, correctivos del sabor,
conservantes, agentes solubilizantes y colorantes. Más en
particular, los vehículos farmacéuticamente aceptables se
caracterizan por tener un pH y una fuerza iónica fisiológicamente
aceptables. Un vehículo preferido para composiciones a administrar
parenteralmente es una solución salina estéril, tamponada, en
particular tamponada con fosfato.
Una realización preferente usa membranas
lipídicas artificiales (esto es, liposomas) para suministro. Entre
los procedimientos que emplean lípidos para introducir DNA en
células están incluidos: polietilenglicol para mediar la fusión de
protoplasto derivado de bacterias que contienen plásmidos
(Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2163 (1980)); membranas
cuyo citoplasma se ha eliminado de eritrocitos que contienen DNA
(Wiberg y otros, Nucleic Acids Res. 11: 7287 (1983)); liposomas que
contienen DNA (Fraley y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3348
(1979)); complejos de plásmido/liposoma catiónico (Stribling y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11277 (1992) documento WO
93/12756) y lipofección (Felgner y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84: 7413 (1987)). Al usar la terapia de genes de la presente
invención se puede emplear cualquiera de los procedimientos
anteriores para introducir material genético en células in
vivo, pero el procedimiento preferido es la lipofección con
complejos de plásmido/liposoma
catiónico.
catiónico.
La lipofección emplea una formulación de
liposomas de lípidos catiónicos para transfectar ácidos nucleicos a
células. El complejo de lípido-ácido nucleico se funde con las
membranas de plasma y transfiere eficientemente el ácido nucleico a
las células en que se expresa el DNA. La lipofección es de 5 a 100
veces más eficiente para introducir DNA en las células que los
procedimientos de transfección con fosfato cálcico o
DEAE-dextrano. Chang y otros, Focus 10:66 (1988).
Los preparados de liposomas se pueden preparar como se describe en
la técnica o se pueden comprar de fuentes disponibles
comercialmente, tales como lipofectina de GIBCO BRL (GIBCO BRL,
Life Technologies, Inc., P.O. Box 9418, Gaithersburg, Maryland
20898). Felgner y otros (1987), cita anterior; Schreier. J. of
Liposome Res. 2: 145 (1992); Chang y otros, (1988), cita
anterior.
La transfección transitoria empleando la
lipofección se mide al cabo de 24 a 72 horas después de la
transfección por ensayos que miden la expresión de genes del (los)
gen(es) transfectado(s). Los ensayos comúnmente usados
controlan las actividades enzimáticas de la cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT), LAC-Z,
\beta-galactosidasa, luciferasa o la hormona
humana de crecimiento que pueden estar contenidas en las
construcciones. Usando la lipofección, se han transfectado
transitoriamente células de cáncer de pulmón humano, de células
pequeñas. Chang y otros, referencia anterior. La lipofección de DNA
que codifica MT, CuZnSOD, FeSOD, MnSOD y
\gamma-GTP que codifica DNA a cualquier tejido
diana se puede realizar usando técnicas de lipofección bien
conocidas por los expertos en la técnica.
Un preparado preferido de una preparación de
lípido catiónico está compuesto por DOTMA o DDAB/DOPE 1:1 (esto es,
1:1 de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietlamonio
(DOTMA) o dimetildioctadecil-bromuro de amonio
(DDAB) y colesterol y dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE)). Para
producir liposomas catiónicos de DOTMA/DOPE 1:1, se disuelven en
cloroformo soluciones de acopio de lípidos y se almacenan a -20ºC
bajo argón. Se mezclan los lípidos en matraces de fondo redondo y
la solución se evapora a sequedad en un evaporador rotatorio a
presión reducida. Las concentraciones finales de 10 mM de lípido se
hacen añadiendo agua doblemente destilada. La mezcla resultante se
sonica para producir una suspensión de liposomas.
El plásmido se compleja de la siguiente manera a
liposomas de DOTMA/DOPE. Se diluyen separadamente en agua, antes de
mezclarlos, DNA de plásmido y liposomas de DOTMA/DOPE. El volumen
de agua puede variar entre 1 y 20 ml, preferiblemente es de
aproximadamente 8 ml. La composición del complejo de
liposoma-DNA puede variar de aproximadamente 4:1 a
aproximadamente 1:10 microgramos de DNA a nanomoles de lípido
catiónico, preferiblemente de aproximadamente 1:1 a 1:2 microgramos
de DNA a nanomoles de lípido catiónico.
Alternativamente, para transferir específicamente
DNA capaz de expresar \gamma-GTP, MT, SOD y/o
MnSOD in vivo en un tejido diana humano deseado/particular,
se puede usar adenovirus recombinante deficiente en replicación.
Por ejemplo, en el procedimiento de la presente invención se pueden
usar los virus Ad CMV-lacZ (que contienen
citomegalovirus) y Ad.CB-MnSOD, basados en el tipo
5 de adenovirus (Ad5) y producidos por recombinación homóloga en la
línea 293 (nº. CRL1573 del catálogo ATCC) de células embrionarias
humanas primarias de riñón. Graham y otros, Methods in Molecular
Biology (Murray, Humana, 1991).
Para construir un adenovirus recombinante para
uso de acuerdo con la presente invención, se pueden utilizar
métodos bien conocidos por los expertos corrientes en la técnica.
Por ejemplo, se puede construir un adenovirus recombinante para uso
en la presente invención a partir de un mutante de supresión del
tipo 5 de adenovirus (Ad 5), tal como Ad-d1324
(Thimmappaya y otros, Cell 31: 543 (1982)) y un plásmido que
contiene la terminal 5' invertida de Ad5, origen de replicación,
señal de encapsidación, intensificador de E1a, el promotor tardío
importante, cDNA de la secuencia líder tripartita y la secuencia de
DNA que codifica la secuencia entera de proteína de MT,
\gamma-GTP o MnSOD humanas y la señal de
poliadenilación temprana de SV40. Los vectores recombinantes
Ad-MT,
Ad-\gamma-GTP y
Ad-MnSOD se construyen suprimiendo la mayor parte de
la región E3 y 2,6 mu del extremo izquierdo de Ad5 y añadiendo al
extremo izquierdo las casetes de expresión de MT,
\gamma-GTP o MnSOD, que contienen las secuencias
reguladoras y el DNA que codifica MT, \gamma-GTP o
MnSDOD recombinante. Se suprime el extremo izquierdo del genoma
viral, que incluye E1a y la mayor parte de la región E1b, y se
reemplaza con la casete de expresión de MT,
\gamma-GTP o MnSOD que contiene los elementos
virales esenciales que actúan en sentido cis, incluida la
repetición del terminal invertido, un origen de replicación, la
señal de encapsilación, el intensificador de E1a y ningún gen
estructural de E1a. Preferiblemente, al intensificador de E1a sigue
el promotor tardío principal de tipo 2 de adenovirus y cDNA que
codifica la MT, \gammaGTP o MnSOD. El adenovirus recombinante
construido se replica luego en una línea de células permisiva que
contiene un gen de E1a funcional para proporcionar una proteína de
E1a que actúa en sentido trans, tal como la línea 293 de células de
riñón humano. Luego se preparan acopios de adenovirus recombinantes,
infecciosos, de alto título.
Otra vía para producir un vector adenoviral
recombinante es coprecipitar un plásmido linearizado que contiene
el cDNA deseado que codifica MT, \gamma-GTP o
MnSOD con el fragmento grande de DNA de Ad-d1324
cortado compatiblemente usando el método de precipitación con
fosfato cálcico. Graham y otros, Virology 52: 456 (1973); Wigler y
otros, Cell 14: 725 (1978). Luego, los DNAs coprecipitados se
cotransfectan en células 293 para que pueda producirse una
recombinación homóloga. El DNA de adenovirus recombinante se
transfecta en células 293 (Graham y otros, J. Gen. Virol. 35: 59
(1977); Graham y otros, Virology (1973), cita anterior) en las que
replica, se encapsida en un virus infeccioso y se aísla mediante
purificación por placas. Las placas individuales se amplifican por
propagación en células 293 y se extrae DNA viral. Hirt, J. Mol.
Biol. 26: 365 (1987)).
Las placas de adenovirus recombinante que
contienen la gamma glutamiltranspeptidasa humana, superóxido de
manganeso dismutasa y cDNA de proteína metalotioneína
(Ad-\gammaGTP; Ad-MnSOD y
Ad-MT, respectivamente) se identifican luego por
escisión de restricción, análisis Southern y/o análisis Northern
usando cebadores de DNA apropiados. Los virus de control que tienen
una supresión de la región de E1a y no contienen el DNA de interés
no mostrarán transcriptos detectables de
\gamma-GTP, MnSOD o MT en un análisis Northern,
mientras que las construcciones que contienen el DNAn de interés
mostrarán un transcrito detectable de \gamma-GTP,
MnSOD o MT.
Cada uno de los vectores
Ad-\gammaGTP, Ad-MnSOD y
Ad-MT se propaga en células 293 y se recupera 36
horas después de la infección mediante varios ciclos de
congelación/descongelación. Todas las preparaciones virales se
purifican por centrifugación de densidad con CaCl_{2}, se
dializan y se almacenan en tampón de diálisis de virus (Tris 10
mM-HCl, pH 7,4, MgCl_{2}) a 4ºC para uso
inmediato, o se congelan a -70ºC añadiendo glicerol al 10%. El
título del acopio viral se determina por ensayos de placas usando
células 293. Para la terapia de genes de la presente invención
usando los vectores adenovirales descritos se puede usar como diana
cualquier tejido del cuerpo humano.
Para evaluar mRNA de MT,
\gamma-GTP o MnSOD, o la síntesis de proteínas o
evaluar proteína funcional, el vector recombinante se usa para
infectar células 293 o células epiteliales respiratorias de
rata. Para obtener células epiteliales respiratorias de rata,
se sacrifican las ratas y se extraen los pulmones y la tráquea. Las
células se obtienen por barrido citológico (Rosenfeld y otros, cita
anterior, (1991)), se cultivan y se infectan con 2 x 10^{7}
unidades formadoras de placa (PPU) de Ad-MT,
Ad-\gamma-GTP o
Ad-MnSOD en un medio, o, como control, se exponen
sólo al medio.
De acuerdo con la presente invención, se
establecen las condiciones para lograr expresión de genes
recombinantes en una mayoría de las células del órgano diana a
proteger in vivo. Puede no ser necesario alcanzar una
expresión de más del 50% del transgén, o incluso una expresión de
más del 10% del transgén, si en el órgano transfectado está
implicada una protección célula a célula. Por ejemplo, una célula
que expresa transgén puede ser capaz de proteger las células no
transfectadas en un nicho local por transferencia célula a célula de
intermedios (por ejemplo, un nucleótido o un nucleósido) implicados
en la cascada de reparación celular.
Generalmente, las dosis de las composiciones
farmacéuticas para uso de acuerdo con esta invención son conocidas
en la técnica. La dosis de complejo de liposoma-DNA
puede oscilar entre aproximadamente 5 y 50 mg de plásmido por 5 a
100 \mumoles de liposoma, preferiblemente puede ser de
aproximadamente 12 mg de plásmido por 24 \mumoles de liposoma.
Los preparados en que se usan adenovirus de acuerdo con la
invención se dispensan en forma de unidosis que comprenden entre
10^{6} y 10^{14} PPU/ml de vector viral en un vehículo
farmacéuticamente aceptable por unidosis, preferiblemente
aproximadamente de 10^{10} a 5 x 10^{13} de PPU/ml del
adenovirus deficiente en replicación
Ad-\gamma-GTP.
Ad-MnSOD y/o Ad-MT. Los pfu deseados
están contenidos en un volumen total entre 0,3 y 2,0 ml de solución
salina tamponada con fosfato (PBS) y se administran por técnicas
conocidas por los expertos en la técnica. Cuando se utiliza un
complejo de ligando-DNA para suministrar el gen
deseado a las células diana, el conjugado del ligando se compleja
al DNA de plásmido usando una relación molar de vehículo a DNA de
aproximadamente 10:1 a 500:1, preferiblemente entre 300:1 y
500:1.
Para proteger la cavidad oral, la orofaringe, el
esófago, el estómago y el intestino delgado, las composiciones para
uso en el procedimiento preferiblemente se usan oralmente. Por
ejemplo, la protección de la cavidad oral, la orofaringe, el
esófago, el estómago y el intestino delgado se logra administrando
diariamente a los pacientes el complejo de liposoma- plásmido
bebido antes de la radioterapia. La terapia típica para tumores en
el pecho comprende 30-35 tratamientos de radiación
durante 6½ a 7½ semanas. Para cáncer de pulmón, típicamente, los
pacientes reciben entre 6000 y 7000 cGy de radiación en el volumen
del tumor de cáncer de pulmón. Para la protección del estómago y el
intestino delgado, se usan formulaciones de liberación lenta que
están encapsuladas con un revestimiento entérico. El revestimiento
entérico se diseña para liberar el complejo activo en el órgano a
proteger. Para proteger el colon, preferiblemente, la composición se
administra en el colon hasta el ciego mediante enema o por
colonoscopia de fibra óptica. Por lo general, este tratamiento no
se aplica diariamente, sino en días alternos o tres veces a la
semana, especialmente en el caso de administración mediante
colonoscopia con fibra
óptica.
óptica.
Los ejemplos siguientes ilustran realizaciones
específicas de acuerdo con la presente invención. Las personas con
conocimientos corrientes en la técnica identificarán otros aspectos
y variaciones de la invención sobre la base de la descripción
anterior y los ejemplos siguientes.
El promotor tardío principal de adenovirus se une
a un gen de MT recombinante humano (Yamazaki y otros, cita
anterior; Soumillion y otros, cita anterior) y se incorpora en un
recombinante deficiente en replicación. Strauss en The
Adenoviruses, Ginsberg (ed.) [Plenum Press, New York 1984];
Gilardi y otros, Febs Lett. 267: 60 (1990). El vector tiene
suprimida parte de la región de E3 y parte de la secuencia de
codificación de E1a viral, pero contiene un inserto de una casete
de expresión de MT (Figuras 1A y 1B). Ad-MT se
construye suprimiendo la mayor parte de la región de E3 y una
porción del extremo izquierdo de Ad5 y añadiendo el extremo
izquierdo de la casete de expresión de MT de un plásmido que
contiene la secuencia de ácido nucleico que codifica MT.
El promotor tardío importante de adenovirus se
une a un gen de \gamma-GTP humano recombinante
(Altman y otros, Biochemistry 32: 3822 (1993) y se incorpora en un
recombinante deficiente en replicación. Straus, cita anterior;
Gilardi y otros, cita anterior. El vector tiene suprimida parte de
la región de E3 y parte de la secuencia de codificación de E1a
viral, pero contiene un inserto de una casete de expresión de
\gamma-GTP (Figuras 2A y 2B).
Ad-\gamma-GTP se construye
suprimiendo la mayor parte de la región de E3 y una porción del
extremo izquierdo de Ad5 y añadiendo el extremo izquierdo de la
casete de expresión de MT de un plásmido que contiene la secuencia
de ácido nucleico que codifica \gamma-GTP.
El promotor tardío principal de adenovirus se une
a un gen de MnSOD (Beck y otros, Nucleic Acids Res. 15: 9076
(1987)) y se incorpora en un recombinante deficiente en
replicación. (Strauss, cita anterior; Gilardi y otros, cita
anterior). El vector tiene suprimida parte de la región de E3 y
parte de la secuencia de codificación de E1a viral, pero contiene
un inserto de una casete de expresión de MnSOD.
Ad-MnSOD se construye suprimiendo la mayor parte de
la región de E3 y una porción del extremo izquierdo de Ad5 y
añadiendo el extremo izquierdo de la casete de expresión de MnSOD
de un plásmido que contiene la secuencia de ácido nucleico que
codifica MnSOD (Figuras 3A y 3B).
En cada caso, una vez que se ha encajado la
casete de expresión en un virus infeccioso, deficiente en
replicación, el vector recombinante es capaz de dirigir la síntesis
in vitro de MT, \gamma-GTP o MnSOD humana,
respectivamente, en líneas de células 293, CHO y Hela. Gilardi y
otros, cita anterior. La expresión se confirma por ensayos
funcionales.
Para transfectar in vivo tejido de esófago
de ratones C3H/HeNad se usa Ad-MT,
Ad-\gamma-GTP o
Ad-MnSOD, o una combinación de (a)
Ad-\gamma-GTP y
Ad-MnSOD, o (b)
Ad-\gamma-GTP y
Ad-MnSOD, o (c) Ad-MT y
Ad-MnSOD, o (d) Ad-MT y
AD-MnSOD, y
Ad-\gamma-GTP. Los vectores se
inyectan a los ratones haciendo pasar un tubo unido a una aguja de
galga 28 a través de la cavidad oral y depositando vector
recombinante en la parte superior del esófago. Como control actúa
una solución de DNA-desnudo a la misma concentración
usada en la preparación activa.
Los ratones se sacrifican 24 horas más tarde y se
extrae el esófago. El tejido se ensaya en cuanto a: MT, MnSOD o
\gamma-GTP inmunorreactivo, medido por
inmunoprecipitación o transferencia Western, y (2) (b) actividad
funcional de MT, MnSOD y/o \gamma-GTP. Se
observan los transcriptos humanos de las proteínas en el tejido
transfectado; la SDS-PAGE y la autorradiografía de
las muestras de proteína del tejido sometido a biopsia revelan
expresión de novo de MT humano de 6.000 dalton, MnSOD humano de
16.000-19.000 dalton y \gamma-GTP
humano de 62.000 dalton. No se observó expresión en ratones que
recibieron una solución de DNA desnudo.
Los complejos de vehículo lipídico-ácido nucleico
se preparan por métodos bien conocidos en la técnica tales como los
descritos por Debs y otros en WO 93/12756, o por Stribling y otros,
cita anterior. Alternativamente, los liposomas para lipofección se
pueden producir como sigue o se pueden comprar de GIBCO BRL. Para
preparar liposomas para lipofección, se evaporan por rotación 20 mg
de fosfatrolicolina de huevo con una secadora en vacío a partir de
una solución en cloroformo para obtener una película delgada sobre
las paredes de un matraz de fondo redondo, de 5 ml, durante 1 hora.
El lípido de la película delgada seca se pone en 0,5 ml de una
solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, en una
mezcladora de vórtice y luego se sonica.
En la suspensión sonicada de liposoma se atrapa
un vector de expresión que comprende DNA que codifica MT, MnSOD y/o
\gamma-GTP y un promotor tal como el promotor
humano de beta-actina en pHB Apr1, remolinando
extensamente 0,5 ml de solución de DNA con suspensión sonicada
durante 1 minutos, a lo que siguen tres ciclos de congelación y
descongelación. Los liposomas con DNA atrapado se separan del DNA
no atrapado por filtración en gel en una columna Sepharose 4B
diluidos con PBS.
Para determinar la toxicidad, se optimizan la
cantidad de liposomas (30-40 \mug) y la cantidad
de DNA (1 a 5 \mug) para el tipo de célula sobre la base de una
curva de dosis-respuesta. Felgner y otros, 1989,
cita anterior. La cantidad de liposoma usada para la lipofección es
de aproximadamente 50% de su concentración tóxica.
Para preparar los complejos de plásmido/liposoma
catiónico, se hacen liposomas catiónicos que contienen un preparado
1:1 de DOTMA/DOPE (esto es,
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamonio
(DOTMA y dioleilfosfatidiletanol-amina (DOPE) 1:1).
Las soluciones de acopio de los lípidos se disuelven en cloroformo
y se almacenan bajo argón a -20ºC. Los lípidos se mezclan en
matraces de fondo redondo y se evaporan a sequedad en un evaporador
rotatorio a presión reducida. La concentración final de lípidos de
10 mM se realiza añadiendo agua doblemente destilada. La mezcla
resultante se sonica durante aproximadamente 20 min. Entre 5 y 50
mg, preferiblemente 12 mg de plásmido, se complejan a entre 5 y 100
\mumol, preferiblemente 24 \mumol de liposomas de DOTMA/DOPE.
Como controles se preparan complejos de plásmido LacZ/liposoma.
Se transfectan ratones por lipofección con DNA
que codifica MT, MnSOD, \gamma-GTP, o complejos
de plásmido LacZ/liposoma preparados de acuerdo con el Ejemplo 3. A
ratones C3H/HeNsd adultos, de aproximadamente 12 semanas de edad,
se inyecta el complejo de plásmido/liposoma haciendo pasar un tubo
unido a una aguja de galga 28 a través de la cavidad oral y
depositando 150 \mul de complejo de plásmido/liposoma que
comprende 1 mg de MT, MnSOD, \gamma-GTP, o DNA de
plásmido LacZ (10 \mug/ml), y 56 \mul de lipofectante en la
parte superior del esófago. Como control se usa una solución de DNA
desnudo a la misma concentración que en el preparado de
liposomas.
Se sacrifican los ratones 24 horas después y se
extrae el esófago. El tejido se ensaya en cuanto a: MT, MnSOD o
\gamma-GTP inmunorreactivo, medido por
inmunoprecipitación o transferencia Western, o LacZ, medida por
tinción, y (2) (b) actividad funcional de MT, MnSOD y/o
\gamma-GTP. Se observan los transcriptos humanos
de las proteínas en el tejido transfectado; la
SDS-PAGE y la autorradiografía de las muestras de
proteína del tejido sometido a biopsia revelan expresión de novo de
MT humano de 6.000 dalton, MnSOD humano de
16.000-19.000 dalton y \gamma-GTP
humano de 62.000 dalton. Se confirma la expresión de LacZ en
ratones que recibieron complejos de plásmido LacZ/liposoma. No se
observó expresión en ratones que recibieron una solución de DNA
desnudo.
Se ensayan ratones de control y ratones que
expresan transitoriamente MT, MnSOD, \gamma-GTP
recombinantes o una combinación de estas proteínas en tejido de
esófago, como resultado de lipofección con complejo de
plásmido/liposoma de acuerdo con el Ejemplo 4, para ver si
la(s) proteína(s) recombinante(s)
protege(n) el esófago durante la irradiación. Un primer grupo
de ratones se expone a radiación ionizante aplicada al pulmón con
suministro de una dosis de irradiación hemicorporal de
aproximadamente 1800 a 2500 cGY en una fracción o de
aproximadamente 2000 a 3000 cGY en fracciones múltiples. Estos
regímenes producen una esofagitis aguda por la radiación en
animales no protegidos al cabo de dos o tres días de la irradiación
suministrada en una sola fracción. Al cabo de tiempos seriales
después de irradiación, entre aproximadamente un día y dos semanas,
se sacrificaron los animales y se extrajeron los esófagos
irradiados y los de control.
También se evaluó el efecto de la expresión de
transgén sobre el desarrollo de la esofagitis inducida por
quimiorradiación. Un segundo grupo de ratones se expone a un
tratamiento de quimiorradiación, usando taxol, para determinar si
una expresión incrementada de MT, MnSOD y/o
\gamma-GTP protege contra el desarrollo de
esofagitis resultante de la terapia por quimiorradiación. En este
caso, los ratones reciben una sola dosis de 6 mg/kg de taxol o una
dosis fraccionada de 1,5 mg/kg/día a lo largo de 5 días, por
inyección intraperitoneal. El último día de inyección de taxol, los
ratones experimentales reciben una inyección esofágica de complejo
de MT, MnSOD o \gamma-GTP plásmido/liposoma. Los
ratones experimentales y los de control se irradian con 1500, 1750
o 2000 cGy.
Se ha descrito anteriormente un modelo de ratón
para esofagitis inducida por irradiación. Rozenzweig y otros, Nucl.
Med. Biol., 21: 171-178 (1994). De acuerdo con el
modelo, se usó LD50/30 para describir la mortalidad por muertes
debidas a esofagitis producida en los 30 primeros días después de
irradiación. Se observó que los ratones C3H/HeJ tenían LD50/30 de
1900 cGy, que disminuyó a 1252 o 1262 cGy cuando se administró
adriamicina 1 o 7 días antes, respectivamente.
El modelo de ratón para la esofagitis se usa para
estimar la mortalidad por esofagitis causada por cambios inducidos
por radiaciones, comparando LD50/30 de control y ratones
experimentales. Con el fin de determinar LD50/30, los ratones se
irradian 24 horas después de inyectar el complejo de
plásmido/liposoma con una única dosis de irradiación que varía de
1800 a 2500 cGy. Los ratones se protegen de manera que la
irradiación esté restringida a la cavidad pulmonar. Los ratones se
pesan antes de ser irradiados y al cabo de 7, 14, 21 y 28 días
después de irradiación. Los ratones se observan diariamente y se
sacrifican si pierden más de 20% de su peso corporal o tienen
dificultades para respirar o moverse. Después de 30 días, se
sacrifican los ratones restantes.
También se usa un programa de irradiación
fraccionada. En este caso, los ratones reciben una inyección
intraesofágea de complejo de plásmido/liposoma 24 horas antes de la
primera dosis y cada 24 horas después. La dosis de irradiación se
fracciona en 400 cGy x 5, 300 cGy x 10 o 250 cGy x 12.
La esofagitis se controla también siguiente su
progresión histológica. Se sacrifican los ratones a tiempos
seriales después del tratamiento y se extrae el esófago, se fija en
formalina, se secciona y se tiñe con hematoxilina y eosina. Se
examinan con el microscopio las secciones en cuanto a alteraciones
de la capa mucosa, que se puntúan usando el soporte lógico Optimas
Image Analysis para cuantificar el daño del esófago.
Los valores de LD50/30 son significativamente más
bajos en ratones que recibieron inyecciones intraesofágeas de
complejo de plásmido/liposoma que contiene MT, MnSOD o
\gamma-GTP. Además, el examen histológico del
esófago demuestra que los complejos evitan efectivamente el daño
que se produce a la capa mucosa que está asociado con la esofagitis
inducida por radiaciones.
Si bien la invención se ha descrito
detalladamente con respecto a realizaciones particulares
preferentes, debe entenderse que tal descripción se presenta a modo
de ilustración y no de limitación.
Claims (20)
1. Uso de una composición farmacéutica que
comprende (A) un polinucleótido que codifica una proteína que se
expresa transitoriamente en un sujeto, en el que la mencionada
proteína es capaz de neutralizar o eliminar especies tóxicas; y (B)
un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mencionado
polinucleótido, con el fin de preparar un medicamento para uso en
la proteccción de la cavidad oral, la orofarínge, el esófago, el
estómago, el intestino delgado y el colon en un paciente con
cáncer, en el que el medicamento está adaptado para su
administración in vivo en el sitio a proteger, y en el que
sitio a proteger que está alejado del sitio del tumor a tratar con
un agente, que induce la producción de una especie tóxica, especie
tóxica seleccionada entre el grupo constituido por un radical
libre, un anión superóxido y un catión de un metal pesado.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que el
mencionado agente es una radiación ionizante.
3. El uso de la reivindicación 2, en el que la
mencionada radiación ionizante es terapia de radiación clínica.
4. El uso de la reivindicación 1, en el que el
mencionado agente es un fármaco quimiorerapéutico.
5. El uso de la reivindicación 3 o 4, en el que
el mencionado polinucleótido es un cDNA y el mencionado vehículo es
un liposoma.
6. El uso de la reivindicación 3 o 4, en el que
el mencionado polinucleótido es un cDNA y el mencionado vehículo es
un vector adenovirus.
7. El uso de la reivindicación 5 o 6, en el que
la mencionada proteína se selecciona entre el grupo constituido por
gamma-glutamil transpeptidasa, superóxido de
manganeso dismutasa y metalotioneína.
8. El uso de la reivindicación 5 o 6, en el que
la mencionada proteína es gamma-glutamil
transpeptidasa.
9. El uso de la reivindicación 5 o 6, en el que
la mencionada proteína es superóxido de manganeso dismutasa.
10. El uso de la reivindicación 5 o 6, en el que
la mencionada proteína es metalotioneína.
11. El uso de la reivindicación 5 o 6, en el que
la mencionada composición farmacéutica comprende una mezcla de
polinucleótidos seleccionados entre los grupos constituidos por un
polinucleótido que codifica gamma-glutamil
transpeptidasa, un polinucleótido que codifica superóxido de
manganeso dismutasa y un polinucleótido que codifica
metalotioneína.
12. El uso de la reivindicación 8, 9, 10 u 11, en
el que el mencionado polinucleótido está bajo control de una
secuencia reguladora transcripcional inducible.
13. El uso de la reivindicación 12, en el que el
mencionado polinucleótido está bajo control de una secuencia
reguladora transcripcional radioinducible.
14. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 4, en el que el mencionado paciente de cáncer es un paciente de
cáncer de pulmón que requiere protección de los tejidos de la
cavidad oral, la orofarínge y el esófago.
15. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 11, en el que el mencionado paciente con cáncer es un paciente
con cáncer en el abdomen inferior que requiere protección de los
tejidos del colon e intestino delgado.
16. El uso de la reivindicación 15, en el que el
mencionado cáncer es cáncer cervical.
17. El uso de la reivindicación 15, en el que el
mencionado cáncer es cáncer de próstata.
18. El uso de la reivindicación 15, en el que el
mencionado cáncer es cáncer endometrial.
19. El uso de la reivindicación 15, en el que el
mencionado cáncer es cáncer de ovario.
20. El uso de la reivindicación 15, en el que el
mencionado cáncer es cáncer de vejiga.
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