ES2257049T3 - Proteccion frente a la irradiacion ionizante o la lesion por farmacos quimioterapeuticos por terapia de genes in vivo. - Google Patents

Abstract

Uso de una composición farmacéutica que comprende (A) un polinucleótido que codifica una proteína que se expresa transitoriamente en un sujeto, en el que la mencionada proteína es capaz de neutralizar o eliminar especies tóxicas; y (B) un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mencionado polinucleótido, con el fin de preparar un medicamento para uso en la proteccción de la cavidad oral, la orofarínge, el esófago, el estómago, el intestino delgado y el colon en un paciente con cáncer, en el que el medicamento está adaptado para su administración in vivo en el sitio a proteger, y en el que sitio a proteger que está alejado del sitio del tumor a tratar con un agente, que induce la producción de una especie tóxica, especie tóxica seleccionada entre el grupo constituido por un radical libre, un anión superóxido y un catión de un metal pesado.

Description

Protección frente a la irradiación ionizante o la lesión por fármacos quimioterapéuticos por terapia de genes in vivo.

Antecedentes de la invención

La presente invención está dirigida al uso de una composición farmacéutica que comprende (A) un polinucleótido que codifica una proteína que se expresa transitoriamente en un sujeto, en la que la mencionada proteína es capaz de neutralizar o eliminar especies tóxicas; y (B) un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mencionado polinucleótido, con el fin de preparar un medicamento para uso en la protección de la cavidad oral, la orofarínge, el esófago, el estómago, el intestino delgado y el colon por expresión transitoria de una proteína mediante transferencia somática de genes in vivo.

Es conocido que concentraciones terapéuticas de fármacos anticancerosos y la terapia por radiaciones clínicas dañan los tejidos y células normales de un paciente. Existe claramente necesidad de medios para proteger los tejidos normales del paciente durante la quimioterapia y/o la terapia por radiaciones. Entre los procedimientos anteriores para suministrar tal protección está incluida la administración de compuestos sulfhidrilo tales como tioles u otros compuestos secuestradores de radicales.

La vía principal por la que la radiación daña biomoléculas y células es la de su interacción con agua para producir radicales libres tóxicos (H^{+}, OH^{-}, e_{ac}^{-}) y H_{2}O_{2}, o mediante interacción con oxígeno, para producir radicales superóxido (*O_{2}^{-}). Al final de la década de 1940 se descubrió que los compuestos sulfhidrílicos, tales como cisteína y cisteamina, proporcionan protección frente a la radiación en animales. (Patt y otros, Science, 110: 213 (1949)). Los grupos tiol secuestran radicales libres producidos por radiación donando un átomo de hidrógeno a moléculas dañadas. A pesar de los extensos esfuerzos para desarrollar agentes protectores más efectivos, no se ha encontrado un radioprotector basado en tiol que sea significativamente mejor que la cisteína. (Mitchell y otros, Arch. Biochem. and Biophys, 289, 62 (1991). Sin embargo, el uso de fármacos de tiol para proteger frente a daños producidos por radiaciones está limitado por la toxicidad de tales compuestos.

Los agentes antineoplásicos, en particular la clase de fármacos quimioterapéuticos conocidos como agentes de alquilación, producen también radicales libres que son citotóxicos debido a su capacidad para formar enlaces covalentes con ácidos nucleicos. La mayor parte de los agentes de alquilación forman iones carbonio cargados positivamente que dan el intermedio de alquilación cargado R-CH_{2}-CH_{2}* que ataca sitios ricos en electrones de ácidos nucleicos, proteínas, moléculas pequeñas y aminoácidos.

Se han identificado varios secuestradores intracelulares endógenos de radicales libres, radicales superóxido y cationes de metales pesados. Es conocido que la inducción o las actividades elevadas de metalotioneína (MT), gamma-glutamil transpeptidasa (\gamma-GTP) y superóxido de dismutasa (SOD) proporcionan resistencia a daños por radiaciones ionizantes in vitro. Estas proteínas actúan intracelularmente para secuestrar radicales libres, aniones superóxido o cationes de metales pesados. La patente U.S. nº. 5.599.712 describe un procedimiento para suministrar niveles terapéuticos intracelulares funcionales de metalotioneína, superóxido de dismutasa o gamma-glutamil transpeptidasa para proteger tejidos normales de pulmón frente a los efectos adversos de una combinación de quimioterapia y terapia por irradiación.

Sumario de la invención

Es, por tanto, un objetivo de la presente invención proporcionar el uso de un producto farmacéutico para la preparación de un medicamento para uso en la protección de células normales fuera del sitio de un tumor frente a los efectos dañinos de un agente anticanceroso o una radiación ionizante, que proporciona genes que codifican una proteína protectora a células somáticas normales.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar el uso de un producto farmacéutico para la preparación de un medicamento para uso en la protección de células normales, en particular células de la cavidad oral, la orofaringe, el esófago, el estómago, el intestino delgado y el colon, frente a los efectos dañinos de un agente anticanceroso o una radiación ionizante, que proporciona genes que codifican una proteína protectora a células somáticas normales.

En el contexto de la presente invención, se proporciona la expresión transitoria de la proteína de oxidación o secuestradora de cationes en las células de la cavidad oral, la orofaringe, el esófago, el estómago, el intestino delgado y el colon para proteger estas células frente a un agente anticanceroso, en la que el polinucleótido o gen transferido se elimina después de las etapas terapéuticas de la terapia por radiación ionizante o quimioterapia, o el polinucleótido o gen transferido se integra dentro del genoma, si bien su expresión es temporal, y es inducida por un tiempo limitado por la terapia con radiación ionizante o la quimioterapia.

Para lograr estos y otros objetivos, se ha proporcionado, de acuerdo con la presente invención, el uso de una composición farmacéutica que comprende (A) un polinucleótido que codifica una proteína que se expresa transitoriamente en un sujeto, en la que la mencionada proteína es capaz de neutralizar o eliminar especies tóxicas; y (B) un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mencionado polinucleótido, con el fin de preparar un medicamento para uso en la proteccción de la cavidad oral, la orofarínge, el esófago, el estómago, el intestino delgado y el colon en un paciente con cáncer, medicamento que está adaptado para su administración in vivo en el sitio a proteger, sitio a proteger que está alejado del sitio del tumor a tratar con el agente que induce la producción de una especie tóxica, especie tóxica seleccionada entre el grupo constituido por un radical libre, un anión superóxido y un catión de un metal pesado. El agente puede ser una radiación ionizante, terapia clínica por irradiación o un fármaco quimioterapéutico. En una realización preferente de la invención, las proteínas de la invención que neutralizan o eliminan la especie tóxica son gamma-glutamil transpeptidasa, superóxido de manganeso dismutasa o metalotioneína. En una realización de la invención, la composición farmacéutica de la invención comprende una mezcla de polinucleótidos seleccionados entre un polinucleótido que codifica gamma-glutamil transpeptidasa, un polinucleótido que codifica superóxido de manganeso dismutasa o un polinucleótido que codifica metalotioneína.

Para introducir un polinucleótido de acuerdo con la invención se pueden usar liposomas, un vector de adenovirus o conjugados de ligando-DNA. La administración de la composición farmacéutica se realiza antes de exponer el sujeto a un agente. El presente procedimiento se usa durante el tratamiento de una variedad de cánceres, incluidos cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer de ovario y cáncer de vejiga.

Otros objetivos, rasgos y ventajas de la presente invención resultarán evidentes al considerar la descripción detallada posterior. Debe tenerse en cuenta, empero, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, si bien indican realizaciones preferentes, se dan sólo a fines ilustrativos.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B son dibujos esquemáticos de la construcción de un vector adenovirus recombinante de metalotioneína (MT) (Ad-MT) de la presente invención. La Figura 1A ilustra el genoma de tipo 5 de adenovirus de tipo salvaje (Ad5) que presenta las regiones E1a, E1b y E3 y la porción a suprimir del extremo izquierdo de Ad5 para la inserción de las casetes de expresión apropiadas. Una casete de expresión es una construcción de ácido nucleico que incluye, como componentes unidos operativamente en la dirección de transcripción, una región de iniciación transcripcional, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de interés y una región de terminación transcripcional, en la que las regiones reguladoras transcripcionales son funcionales en la célula huésped de mamífero diana. La Figura 1B ilustra una casete de expresión que contiene secuencias reguladoras y una secuencia de DNA recombinante que codifica metalotioneína.

Las Figuras 2A y 2B son dibujos esquemáticos de la construcción de un vector de adenovirus recombinante de gamma-glutamil transpeptidasa (Ad-\gamma-GTF). La Figura 2A ilustra el genonoma de tipo 5 de adenovirus de tipo salvaje (Ad5) que presenta las regiones E1a, E1b y E3 y la porción a suprimir del extremo izquierdo de Ad5 para insertar la casete de expresión adecuada. La Figura 2B ilustra una casete de expresión que contiene secuencias reguladoras y una secuencia de DNA recombinante que codifica \gamma-GTF.

Las Figuras 3A y 3B son dibujos esquemáticos de la construcción de un vector de adenovirus recombinante de superóxido de manganeso dismutasa (Ad-MnSOD). La Figura 3A ilustra el genonoma de tipo 5 de adenovirus de tipo salvaje (Ad5) que presenta las regiones E1a, E1b y E3 y la porción a suprimir del extremo izquierdo de Ad5 para insertar la casete de expresión adecuada. La Figura 3B ilustra una casete de expresión que contiene secuencias reguladoras y la secuencia de DNA recombinante que codifica superóxido de manganeso dismutasa.

Descripción detallada de la invención

La radiación ionizante produce radicales libres tóxicos. Los agentes antineoplásicos, en particular los de la clase de fármacos quimioterapéuticos conocidos como agentes de alquilación, producen también radicales libres que son citotóxicos por su capacidad de formar enlaces covalentes con ácidos nucleicos. La mayoría de los agentes de alquilación, incluidas ciclofosfamidas, mostaza nitrogenada, melfalán, clorambucil, busulfano, nitrosourea, cis-platino, estreptozoticina, aziridinilbenzoquinona (AZD), dicarbazina (DTIC), mAMSA y mitoxantrona, forma iones carbonio cargados positivamente que dan un intermedio de alquilación cargado, R-CH_{2}-CH_{2}^{+}, que ataca los sitios ricos en electrones de ácidos nucleicos, proteínas, moléculas pequeñas y aminoácidos. Chabner y otros, en Cancer: Principles and Practice of Oncology, 2ª edición, DeVita y otros (eds.) (J.B. Lippincott Co., Filadelfia 1985).

El uso de la presente invención proporciona un medicamento para uso en la protección de células normales, en particular células de la cavidad oral, la orofarínge, el esófago, el estómago,. el intestino delgado y el colon, de un individuo contra un agente que provoca la producción de un radical libre, un anión superóxido y/o un catión de un metal pesado. La célula a proteger puede ser de un sitio alejado del sitio del tumor. El uso de la presente invención emplea terapia de genes, que es la transferencia de material genético a las células específicas de un paciente.

La expresión transitoria de genes de acuerdo con la presente invención, puede efectuarse por uno de dos mecanismos. La transferencia de genes se puede usar para introducir secuencias de DNA en el núcleo de una forma no integrada. En ese caso, la expresión transitoria, o la expresión no integrada, está limitada por la estabilidad de la(s) molécula(s) de DNA no integrada(s) y puede persistir durante períodos mayores que aproximadamente una a dos semanas. Alternativamente, un gen o polinucleótido se puede integrar establemente en el genoma. Un gen que es transferido establemente a un individuo se denomina transgén.

El procedimiento de la terapia de genes de la presente invención implica una terapia de genes in vivo que proporciona un polinucleótido que codifica una proteína que es capaz de neutralizar o eliminar un radical libre, un anión superóxido y/o un catión de un metal pesado tóxicos, expresándose la proteína transitoriamente en el individuo. Los transgenes codifican proteínas tales como metalotioneína, superóxido dismutasa o gamma-glutamil transpeptidasa que secuestran un radical libre, un anión superóxido y/o un catión de un metal pesado tóxicos.

La \gamma-glutamiltranspeptidasa (\gamma-GTF) es una ectoenzima asociada a membrana que cataliza la transpeptidación de glutationa extracelular en intermedios de aminoácidos, que luego se transportan a través de la membrana celular y se usan para resintetizar glutationa de novo. La glutationa (GSH) desintoxica radicales libres. Generalmente, las células sintetizan GSH de novo a partir de los aminoácidos constituyentes. La sensibilidad de una célula a la radiación está correlacionada directamente con su capacidad de transpeptidar la glutationa extracelular a través de \gamma-GTP. Las líneas de células con una actividad de \gamma-GTP alta son más resistentes a los efectos de la radiación y son más capaces de reparar daños inducidos por dosis bajas de radiaciones g que las líneas de tumores con una actividad de \gamma-GTP baja. Véanse los Ejemplos 7 y 8. Las células de tumores empobrecidas en GSB han revelado ser más susceptibles a la irradiación ionizante y los agentes quimioterapéuticos porque se reducen las rutas de desintoxicación GSH-dependientes. Louise y otros, Cancer Res., 45: 2110 (1985).

La protección contra radicales superóxido requiere antioxidantes, tales como GSH, y la enzima secuestradora de O_{2} superóxido-dismutasa (SOD). Las SODs son metaloenzimas que son esenciales para la dismutación de O_{2} a H_{2}O_{2} y O_{2}. Hay tres formas de SODs: cobre-zinc (CuZnSOD), manganeso (MnSOD) y hierro (FeSOD). Aunque la CuZnSOD y la FeSOD se hacen constitutivamente, la síntesis de MnSOD es inducible. Se ha visto que la inducción de la actividad de MnSOD se produce después de irradiar con rayos X el tejido cardíaco. Oberley y otros, Arch. Biochem. Biophys. 254: 69 (1987). Además, las líneas de células tumorales transfectadas con cDNA de MnSOD in vitro demuestran una resistencia incrementada a la radiación. Suresh y otros, Experimental Hematology 21: 1828 (1993).

Las metalotioneínas son proteínas de bajo peso molecular constituidas por una cadena individual de polipéptido de 61 restos de aminoácidos, de los que 20 son cisteínas que quelatan cationes. La inducción de matalotioneína ha revelado que proporciona resistencia a daños por irradiación ionizante. La proteína metalotioneína protege las células de los efectos tóxicos de iones de metales pesados y es un poderoso secuestrador de radicales OH inducidos por radiaciones in vitro. Las líneas de células que expresan niveles altos de MT son resistentes a los agentes nocivos de DNA, tales como cis-platino y clorambucil, y a la radiación ionizante. Andrews y otros, Cancer Chemother. Pharmacol. 19: 149 (1987); Bakka y otros, Experimentia 38: 381 (1982); Matsubara y otros, Environ. Res. 43: 66 (21987). La metalotioneína es capaz de secuestrar radicales libres producidos por fármacos anticancerosos electrófilos y radiación ionizante in vitro. Endresen y otros, Cancer Res. 43: 2918 (1983); Thornalley y otros, Biochim., Biophys. Acta 827: 36 (1985). Es importante que la inducción de MT en el hígado de ratón proporciona protección contra el daño letal producido por dosis altas de radiación. Matsubara y otros, Rad. Res. 111: 267 (1987). Pero algunas líneas de células transfectadas con gen de MT in vivo eran tan sensibles a la radiación ionizante y la bleomicina como las células receptoras no transfectadas. Sin embargo, las células transfectadas con MT eran resistentes a la mitocina, lo que sugiere que la proteína MT protege algunas células in vitro de los agentes de alquilación monofuncionales y de reticulación, pero no de los radicales libres. Lohrer y otros, Carcinogenesis 10: 2279 (1989):

Se puede aislar o sintetizar una región de codificación que codifica una superóxido dismutasa entera, preferiblemente MnSOD, por procedimientos conocidos en la técnica, basados en las secuencias de MnSOD dadas por Oursler y otros, J. Cell. Biochem. 46 219 (1991) o Beck y otros, Nucl. Acids Res. 15: 9076 (1987), o las secuencias de SOD indicadas en la patente U.S. nº. 4.751.180; por Lieman-Hurwitz y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 2808 (1982); en la patente U.S. nº. 4.742.004; por Xiang y otros, Nucleic Acids Res. 15: 7654 (1987) o sherman y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5465 (1093). Alternativamente, estas secuencias se pueden preparar por reacción en cadena de polimerasa por procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Wong y otros, Cell 58: 913 (1989).

Las secuencias de DNA que codifican varias especies e isomorfos de metalotioneína se pueden aislar o sintetizar por procedimientos bien conocidos en la técnica basados en las secuencias dadas para MT humana por Yamakazi y otros, Biochem. Int. 28: 451 (1992); Soumillion y otros, Eur. J. Biochem. 209: 999 (1992); Karin y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4040 (1983); Paliwal y otros, Neurochem. Int. 17: 441 (1990); Schmidt y otros, J. Biol. Chem. 260: 7731 (1985); Richards y otros, Cell 37: 263 (1984); Karin y otros, Nature 299: 797 (1982); Hyland y otros, Nucleic Acids Res. 15: 1350 (1987); oveja y ratón [(Peterson y otros, Eur. J Biochem. 160:579 (1986)]; peces [(Lee y otros, Korean Biochem J. 25: 48 (1992); Bonham y otros, DNA 6: 519 (1987)] e insectos [Lastowski-Perry y otros, J. Biol. Chem. 260: 1527 (1985)]. Preferiblemente, en el procedimiento de la presente invención se usan las secuencias de metalotioneína humana descritas por Yamazaki y otros, 1992, referida antes, o por Soumillion y otros, 1992, referida antes.

Se puede proporcionar DNA que codifica \gamma-GTP para uso en la presente invención aislando o sintetizando tal secuencia por procedimientos bien conocidos en la técnica basados en las secuencias dadas por cualquiera de los investigadores Altman y otros, Biochemistry, 32: 3822 (1993), Ishiye y otros, Biotech. Progr. 9: 323 (1993); Ishiye y otros, FEMS Microbiol. Lett 97: 235 (1992), o Angele y otros, Clin. Chem. 37: 662 (1991). Se puede proporcionar DNA que codifica MT, SOD, MnSOD o \gamma-GTP para uso en la presente invención por procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como (1) síntesis de oligonucleótidos de las secuencias de DNA deseadas basadas en las secuencias descritas en las referencias citadas antes; (2) aislamiento de las secuencias de DNA deseadas de los plásmidos descritos en las referencias anteriores o de plásmidos disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC) (12301 Parklawn Drive, Rockville, Mryland 20852) tales como: (a) ATCC 57117 -pHM6 que contiene el pseudógeno 1 de metalotioneína 2 humana; (b) ATCC 57153 -bMT-IIA que contiene el gen de metalotioneína 2 humana; (c) ATCC 20745 -pYAS11 que contiene cDNA que codifica superóxido dismutasa humana; (d) ATCC 20796 -pYLUIGF2-14 que contiene DNA que codifica superóxido dismutasa 1 humana; (e) ATCC 39786 - pSOD alfa 2 que contiene DNA que codifica superóxido dismutasa 1; (f) ATCC 59946, 59947 -phMnSOD4 que contiene DNA que codifica superóxido dismutasa 2 humana; (g) ATCC 61646, 61647 que contiene cDNA que codifica superóxido dismutasa 1 humana; (h) ATCC 86406 - IB861 que contiene cDNA que codifica superóxido dismutasa humana o (3) amplificación por reacción en cadena de polimerasa de las secuencias de DNA deseadas a partir de bibliotecas de DNA descritas en las referencias anteriores usando cebadores basados en las secuencias descritas en las referencias anteriores.

La expresión transitoria de genes administrados in vivo se considera en esta técnica como una limitación técnica importante para la terapia de genes. Véase Mulligan, Science 260: 926 (1993). En marcado contraste, de acuerdo con la presente invención, la expresión transitoria de los genes es muy deseable porque la protección del tejido normal sólo es necesaria durante el período de la terapia de radiación o la quimioterapia; después, es deseable una rápida eliminación del producto de gen. La expresión transitoria es deseable porque son desconocidos los efectos clínicos prolongados de MT, \gamma-GTP y/o MnSOD altos. También puede ser clínicamente deseable, después de quimioterapia o terapia por radiaciones, la eliminación del transgén y su vector para la siguiente fase de un enfoque terapéutico de modalidad combinada. El uso de la presente invención está diseñado para que de por resultado la expresión transitoria o no integrada de un gen exógeno in vivo; sin embargo, en el caso de que también se produzca una cantidad limitada de integración estable del DNA proporcionado exógenamente, el procedimiento sigue siendo funcional en cuanto a su capacidad para proporcionar una proteína capaz de neutralizar o eliminar una especie iónica tóxica in vivo.

La expresión transitoria se puede lograr por introducción dirigida del material genético que codifica las proteínas deseadas en las células o usando un genoma de virus heterólogo como vector. Los procedimientos para suministrar genes en células de mamíferos para lograr la expresión transitoria que se pueden utilizar para la terapia de genes incluyen: transferencia de papovirus, adenovirus, virus de vacunas, virus de herpes, virus de polio, virus de sindbis y otros virus de RNA, conjugados de ligando-DNA, conjugados de adeniovirus-ligando-DNA, DNA desnudo, lipofección y transferencia de genes mediada por receptor. Véase, por ejemplo, Mulligan cita anterior; Coen en Virology, Fields y otros, (eds.) Raven Press, Ltd., (New York, 1990); Perkol y otros, Faseb 7: 1081 (1993)). Los estudios en modelos animales han transferido genes eficientemente usando retrovirus (Friedman, Science 244: 1275 (1989)), adenovirus (Rosenfeld y otros, Science 252: 431 (1991); Rosenfeld y otros, Cell 68: 143 (1992)) y liposomas (Felgner y otros, Nature 349: 351 (1991)).

La expresión transitoria se logra en virtud de un promotor transcripcional inducible para controlar la expresión del gen o polinucleótido. El promotor inducible se puede inducir directa o indirectamente por la terapia con radiación ionizante o el propio agente de quimioterapia. Un promotor adecuado es el promotor erg1, un promotor inducido por irradiación. Hallahan y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 2156-2160 (1991) y Datta y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10149-10153 (1992). La transcripción de polinucleótido(s) o gen(es) controlada por erg-1 se para aproximadamente entre 60 y 90 horas después de la infección.

La presente invención se puede usar para proteger tejidos específicos en pacientes con cáncer contra los efectos dañinos de una radiación ionizante y fármacos quimioterapéuticos que producen radicales libres, aniones superóxido y/o cationes de metales pesados. En particular, la presente invención se puede usar para transferir un gen a células normales en un sitio alejado del sitio del tumor antes de la terapia da irradiación clínica o la administración del fármaco quimioterapéutico para combatir un cáncer. En particular, la presente invención se puede usar para transferir un gen a células normales de la cavidad oral, la orofaringe, el esófago, el estómago, el intestino delgado o el colon antes de la terapia por irradiación clínica o la administración de un fármaco quimioterapéutico para combatir, por ejemplo, cáncer de pulmón, de próstata, de vejiga, de cervicales o endometrial.

En una realización preferente, el uso de una composición farmacéutica de la presente invención está dirigido a un medicamento para la terapia de genes transitoria in vivo con el fin de proporcionar protección de la cavidad oral, la orofaringe y el esófago cuando se trata el cáncer de pulmón por terapia con radiación ionizante o agentes antineoplásicos de alquilación. Un factor limitativo en el tratamiento del cáncer de pulmón, en particular con regímenes de tratamiento que implican una combinación de terapia por radiación y quimioterapia con paclitaxel, vinblastina o cisplatino, ha sido el desarrollo de esofagitis durante los tratamientos con irradiación. En algunos casos, los pacientes no pueden completar una tanda de terapia a causa de manifestarse una esofagitis severa. La esofagitis es el resultado de una lesión causada a la capa de mucosa del esófago. Después de irradiación, hay un aumento de la actividad mitótica en la mucosa para reparar el daño. El paclitaxel, en particular, actúa bloqueando la mitosis durante G_{2}/M, la porción del ciclo celular más sensible a la radiación. Se supone especulativamente que la combinación de la inhibición de mitosis por el agente quimioterapéutico y la sensibilización de las células mucosas durante la irradiación impide la reparación de la lesión de la mucosa y causa la esofagitis.

En otra realización, el uso de un producto farmacéutico de la presente invención está dirigido a un medicamento para terapia de genes transitoria in vivo de pacientes con cáncer de próstata, vejiga, cervicales o de endometrio con el fin de proporcionar protección al intestino delgado y el colon cuando estos cánceres se tratan por terapia con radiación inonizante o agentes antineoplásicos de alquilación. El mecanismo es el mismo descrito antes para la protección del esófago. En este caso se supone que la combinación de la inhibición de la mitosis por el agente quimioterapéutico y la sensibilización de las células de la mucosa durante la irradiación impide la reparación del daño causado a la mucosa en células criptointestinales o células del colon.

Además de ser útil el uso de un compuesto de la presente invención para proteger células normales en un sitio alejado del sitio del tumor antes de la terapia por una radiación clínica o la quimioterapia con un fármaco quimioterapéutico, los compuestos de la presente invención son también útiles para proteger células normales de la cavidad oral, la orofaringe, el esófago, el estómago, el intestino delgado y el colon durante el tratamiento de un tumor en la misma región. En este caso, el transgén se suministra y expresa más eficientemente en un tejido normal que en tumores del mismo tejido. La expresión más eficiente en tejido normal que en tejido tumoral ha sido confirmada por estudios en animales experimentales, por ejemplo, ratas y ratones. Una expresión inferior del transgén en células tumorales transplantadas a animales que en el tejido normal circundante confirma una relación inferior de suministro de genes terapéuticos a células tumorales que a células normales diana a proteger.

Las composiciones para uso en la presente invención comprenden un polinucleótido que codifica una proteína que se expresa transitoriamente en un sujeto cuando el sujeto se expone a un agente que provoca la producción de una especie tóxica, tal como un radical libre, un anión superóxido o un catión de un metal pesado, siendo la proteína capaz de neutralizar o eliminar la especie tóxica; y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el nucleótido. En este contexto, un vehículo farmacéuticamente aceptable es inerte o aceptable médicamente de alguna manera, y es compatible con el agente activo, en un contexto de administración particular. Además de un excipiente adecuado, un vehículo farmacéuticamente aceptable puede contener aditivos convencionales como diluyentes, coadyuvantes, antioxidantes, agentes dispersivos y emulsivos, agentes antiespumantes, correctivos del sabor, conservantes, agentes solubilizantes y colorantes. Más en particular, los vehículos farmacéuticamente aceptables se caracterizan por tener un pH y una fuerza iónica fisiológicamente aceptables. Un vehículo preferido para composiciones a administrar parenteralmente es una solución salina estéril, tamponada, en particular tamponada con fosfato.

Una realización preferente usa membranas lipídicas artificiales (esto es, liposomas) para suministro. Entre los procedimientos que emplean lípidos para introducir DNA en células están incluidos: polietilenglicol para mediar la fusión de protoplasto derivado de bacterias que contienen plásmidos (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2163 (1980)); membranas cuyo citoplasma se ha eliminado de eritrocitos que contienen DNA (Wiberg y otros, Nucleic Acids Res. 11: 7287 (1983)); liposomas que contienen DNA (Fraley y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3348 (1979)); complejos de plásmido/liposoma catiónico (Stribling y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11277 (1992) documento WO 93/12756) y lipofección (Felgner y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413 (1987)). Al usar la terapia de genes de la presente invención se puede emplear cualquiera de los procedimientos anteriores para introducir material genético en células in vivo, pero el procedimiento preferido es la lipofección con complejos de plásmido/liposoma
catiónico.

La lipofección emplea una formulación de liposomas de lípidos catiónicos para transfectar ácidos nucleicos a células. El complejo de lípido-ácido nucleico se funde con las membranas de plasma y transfiere eficientemente el ácido nucleico a las células en que se expresa el DNA. La lipofección es de 5 a 100 veces más eficiente para introducir DNA en las células que los procedimientos de transfección con fosfato cálcico o DEAE-dextrano. Chang y otros, Focus 10:66 (1988). Los preparados de liposomas se pueden preparar como se describe en la técnica o se pueden comprar de fuentes disponibles comercialmente, tales como lipofectina de GIBCO BRL (GIBCO BRL, Life Technologies, Inc., P.O. Box 9418, Gaithersburg, Maryland 20898). Felgner y otros (1987), cita anterior; Schreier. J. of Liposome Res. 2: 145 (1992); Chang y otros, (1988), cita anterior.

La transfección transitoria empleando la lipofección se mide al cabo de 24 a 72 horas después de la transfección por ensayos que miden la expresión de genes del (los) gen(es) transfectado(s). Los ensayos comúnmente usados controlan las actividades enzimáticas de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), LAC-Z, \beta-galactosidasa, luciferasa o la hormona humana de crecimiento que pueden estar contenidas en las construcciones. Usando la lipofección, se han transfectado transitoriamente células de cáncer de pulmón humano, de células pequeñas. Chang y otros, referencia anterior. La lipofección de DNA que codifica MT, CuZnSOD, FeSOD, MnSOD y \gamma-GTP que codifica DNA a cualquier tejido diana se puede realizar usando técnicas de lipofección bien conocidas por los expertos en la técnica.

Un preparado preferido de una preparación de lípido catiónico está compuesto por DOTMA o DDAB/DOPE 1:1 (esto es, 1:1 de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietlamonio (DOTMA) o dimetildioctadecil-bromuro de amonio (DDAB) y colesterol y dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE)). Para producir liposomas catiónicos de DOTMA/DOPE 1:1, se disuelven en cloroformo soluciones de acopio de lípidos y se almacenan a -20ºC bajo argón. Se mezclan los lípidos en matraces de fondo redondo y la solución se evapora a sequedad en un evaporador rotatorio a presión reducida. Las concentraciones finales de 10 mM de lípido se hacen añadiendo agua doblemente destilada. La mezcla resultante se sonica para producir una suspensión de liposomas.

El plásmido se compleja de la siguiente manera a liposomas de DOTMA/DOPE. Se diluyen separadamente en agua, antes de mezclarlos, DNA de plásmido y liposomas de DOTMA/DOPE. El volumen de agua puede variar entre 1 y 20 ml, preferiblemente es de aproximadamente 8 ml. La composición del complejo de liposoma-DNA puede variar de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:10 microgramos de DNA a nanomoles de lípido catiónico, preferiblemente de aproximadamente 1:1 a 1:2 microgramos de DNA a nanomoles de lípido catiónico.

Alternativamente, para transferir específicamente DNA capaz de expresar \gamma-GTP, MT, SOD y/o MnSOD in vivo en un tejido diana humano deseado/particular, se puede usar adenovirus recombinante deficiente en replicación. Por ejemplo, en el procedimiento de la presente invención se pueden usar los virus Ad CMV-lacZ (que contienen citomegalovirus) y Ad.CB-MnSOD, basados en el tipo 5 de adenovirus (Ad5) y producidos por recombinación homóloga en la línea 293 (nº. CRL1573 del catálogo ATCC) de células embrionarias humanas primarias de riñón. Graham y otros, Methods in Molecular Biology (Murray, Humana, 1991).

Para construir un adenovirus recombinante para uso de acuerdo con la presente invención, se pueden utilizar métodos bien conocidos por los expertos corrientes en la técnica. Por ejemplo, se puede construir un adenovirus recombinante para uso en la presente invención a partir de un mutante de supresión del tipo 5 de adenovirus (Ad 5), tal como Ad-d1324 (Thimmappaya y otros, Cell 31: 543 (1982)) y un plásmido que contiene la terminal 5' invertida de Ad5, origen de replicación, señal de encapsidación, intensificador de E1a, el promotor tardío importante, cDNA de la secuencia líder tripartita y la secuencia de DNA que codifica la secuencia entera de proteína de MT, \gamma-GTP o MnSOD humanas y la señal de poliadenilación temprana de SV40. Los vectores recombinantes Ad-MT, Ad-\gamma-GTP y Ad-MnSOD se construyen suprimiendo la mayor parte de la región E3 y 2,6 mu del extremo izquierdo de Ad5 y añadiendo al extremo izquierdo las casetes de expresión de MT, \gamma-GTP o MnSOD, que contienen las secuencias reguladoras y el DNA que codifica MT, \gamma-GTP o MnSDOD recombinante. Se suprime el extremo izquierdo del genoma viral, que incluye E1a y la mayor parte de la región E1b, y se reemplaza con la casete de expresión de MT, \gamma-GTP o MnSOD que contiene los elementos virales esenciales que actúan en sentido cis, incluida la repetición del terminal invertido, un origen de replicación, la señal de encapsilación, el intensificador de E1a y ningún gen estructural de E1a. Preferiblemente, al intensificador de E1a sigue el promotor tardío principal de tipo 2 de adenovirus y cDNA que codifica la MT, \gammaGTP o MnSOD. El adenovirus recombinante construido se replica luego en una línea de células permisiva que contiene un gen de E1a funcional para proporcionar una proteína de E1a que actúa en sentido trans, tal como la línea 293 de células de riñón humano. Luego se preparan acopios de adenovirus recombinantes, infecciosos, de alto título.

Otra vía para producir un vector adenoviral recombinante es coprecipitar un plásmido linearizado que contiene el cDNA deseado que codifica MT, \gamma-GTP o MnSOD con el fragmento grande de DNA de Ad-d1324 cortado compatiblemente usando el método de precipitación con fosfato cálcico. Graham y otros, Virology 52: 456 (1973); Wigler y otros, Cell 14: 725 (1978). Luego, los DNAs coprecipitados se cotransfectan en células 293 para que pueda producirse una recombinación homóloga. El DNA de adenovirus recombinante se transfecta en células 293 (Graham y otros, J. Gen. Virol. 35: 59 (1977); Graham y otros, Virology (1973), cita anterior) en las que replica, se encapsida en un virus infeccioso y se aísla mediante purificación por placas. Las placas individuales se amplifican por propagación en células 293 y se extrae DNA viral. Hirt, J. Mol. Biol. 26: 365 (1987)).

Las placas de adenovirus recombinante que contienen la gamma glutamiltranspeptidasa humana, superóxido de manganeso dismutasa y cDNA de proteína metalotioneína (Ad-\gammaGTP; Ad-MnSOD y Ad-MT, respectivamente) se identifican luego por escisión de restricción, análisis Southern y/o análisis Northern usando cebadores de DNA apropiados. Los virus de control que tienen una supresión de la región de E1a y no contienen el DNA de interés no mostrarán transcriptos detectables de \gamma-GTP, MnSOD o MT en un análisis Northern, mientras que las construcciones que contienen el DNAn de interés mostrarán un transcrito detectable de \gamma-GTP, MnSOD o MT.

Cada uno de los vectores Ad-\gammaGTP, Ad-MnSOD y Ad-MT se propaga en células 293 y se recupera 36 horas después de la infección mediante varios ciclos de congelación/descongelación. Todas las preparaciones virales se purifican por centrifugación de densidad con CaCl_{2}, se dializan y se almacenan en tampón de diálisis de virus (Tris 10 mM-HCl, pH 7,4, MgCl_{2}) a 4ºC para uso inmediato, o se congelan a -70ºC añadiendo glicerol al 10%. El título del acopio viral se determina por ensayos de placas usando células 293. Para la terapia de genes de la presente invención usando los vectores adenovirales descritos se puede usar como diana cualquier tejido del cuerpo humano.

Para evaluar mRNA de MT, \gamma-GTP o MnSOD, o la síntesis de proteínas o evaluar proteína funcional, el vector recombinante se usa para infectar células 293 o células epiteliales respiratorias de rata. Para obtener células epiteliales respiratorias de rata, se sacrifican las ratas y se extraen los pulmones y la tráquea. Las células se obtienen por barrido citológico (Rosenfeld y otros, cita anterior, (1991)), se cultivan y se infectan con 2 x 10^{7} unidades formadoras de placa (PPU) de Ad-MT, Ad-\gamma-GTP o Ad-MnSOD en un medio, o, como control, se exponen sólo al medio.

De acuerdo con la presente invención, se establecen las condiciones para lograr expresión de genes recombinantes en una mayoría de las células del órgano diana a proteger in vivo. Puede no ser necesario alcanzar una expresión de más del 50% del transgén, o incluso una expresión de más del 10% del transgén, si en el órgano transfectado está implicada una protección célula a célula. Por ejemplo, una célula que expresa transgén puede ser capaz de proteger las células no transfectadas en un nicho local por transferencia célula a célula de intermedios (por ejemplo, un nucleótido o un nucleósido) implicados en la cascada de reparación celular.

Generalmente, las dosis de las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con esta invención son conocidas en la técnica. La dosis de complejo de liposoma-DNA puede oscilar entre aproximadamente 5 y 50 mg de plásmido por 5 a 100 \mumoles de liposoma, preferiblemente puede ser de aproximadamente 12 mg de plásmido por 24 \mumoles de liposoma. Los preparados en que se usan adenovirus de acuerdo con la invención se dispensan en forma de unidosis que comprenden entre 10^{6} y 10^{14} PPU/ml de vector viral en un vehículo farmacéuticamente aceptable por unidosis, preferiblemente aproximadamente de 10^{10} a 5 x 10^{13} de PPU/ml del adenovirus deficiente en replicación Ad-\gamma-GTP. Ad-MnSOD y/o Ad-MT. Los pfu deseados están contenidos en un volumen total entre 0,3 y 2,0 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se administran por técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Cuando se utiliza un complejo de ligando-DNA para suministrar el gen deseado a las células diana, el conjugado del ligando se compleja al DNA de plásmido usando una relación molar de vehículo a DNA de aproximadamente 10:1 a 500:1, preferiblemente entre 300:1 y 500:1.

Para proteger la cavidad oral, la orofaringe, el esófago, el estómago y el intestino delgado, las composiciones para uso en el procedimiento preferiblemente se usan oralmente. Por ejemplo, la protección de la cavidad oral, la orofaringe, el esófago, el estómago y el intestino delgado se logra administrando diariamente a los pacientes el complejo de liposoma- plásmido bebido antes de la radioterapia. La terapia típica para tumores en el pecho comprende 30-35 tratamientos de radiación durante 6½ a 7½ semanas. Para cáncer de pulmón, típicamente, los pacientes reciben entre 6000 y 7000 cGy de radiación en el volumen del tumor de cáncer de pulmón. Para la protección del estómago y el intestino delgado, se usan formulaciones de liberación lenta que están encapsuladas con un revestimiento entérico. El revestimiento entérico se diseña para liberar el complejo activo en el órgano a proteger. Para proteger el colon, preferiblemente, la composición se administra en el colon hasta el ciego mediante enema o por colonoscopia de fibra óptica. Por lo general, este tratamiento no se aplica diariamente, sino en días alternos o tres veces a la semana, especialmente en el caso de administración mediante colonoscopia con fibra
óptica.

Los ejemplos siguientes ilustran realizaciones específicas de acuerdo con la presente invención. Las personas con conocimientos corrientes en la técnica identificarán otros aspectos y variaciones de la invención sobre la base de la descripción anterior y los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1 Construcción de los vectores adenovirales recombinantes Ad-MT, Ad-MnSOD y Ad-\gamma-GTF

El promotor tardío principal de adenovirus se une a un gen de MT recombinante humano (Yamazaki y otros, cita anterior; Soumillion y otros, cita anterior) y se incorpora en un recombinante deficiente en replicación. Strauss en The Adenoviruses, Ginsberg (ed.) [Plenum Press, New York 1984]; Gilardi y otros, Febs Lett. 267: 60 (1990). El vector tiene suprimida parte de la región de E3 y parte de la secuencia de codificación de E1a viral, pero contiene un inserto de una casete de expresión de MT (Figuras 1A y 1B). Ad-MT se construye suprimiendo la mayor parte de la región de E3 y una porción del extremo izquierdo de Ad5 y añadiendo el extremo izquierdo de la casete de expresión de MT de un plásmido que contiene la secuencia de ácido nucleico que codifica MT.

El promotor tardío importante de adenovirus se une a un gen de \gamma-GTP humano recombinante (Altman y otros, Biochemistry 32: 3822 (1993) y se incorpora en un recombinante deficiente en replicación. Straus, cita anterior; Gilardi y otros, cita anterior. El vector tiene suprimida parte de la región de E3 y parte de la secuencia de codificación de E1a viral, pero contiene un inserto de una casete de expresión de \gamma-GTP (Figuras 2A y 2B). Ad-\gamma-GTP se construye suprimiendo la mayor parte de la región de E3 y una porción del extremo izquierdo de Ad5 y añadiendo el extremo izquierdo de la casete de expresión de MT de un plásmido que contiene la secuencia de ácido nucleico que codifica \gamma-GTP.

El promotor tardío principal de adenovirus se une a un gen de MnSOD (Beck y otros, Nucleic Acids Res. 15: 9076 (1987)) y se incorpora en un recombinante deficiente en replicación. (Strauss, cita anterior; Gilardi y otros, cita anterior). El vector tiene suprimida parte de la región de E3 y parte de la secuencia de codificación de E1a viral, pero contiene un inserto de una casete de expresión de MnSOD. Ad-MnSOD se construye suprimiendo la mayor parte de la región de E3 y una porción del extremo izquierdo de Ad5 y añadiendo el extremo izquierdo de la casete de expresión de MnSOD de un plásmido que contiene la secuencia de ácido nucleico que codifica MnSOD (Figuras 3A y 3B).

En cada caso, una vez que se ha encajado la casete de expresión en un virus infeccioso, deficiente en replicación, el vector recombinante es capaz de dirigir la síntesis in vitro de MT, \gamma-GTP o MnSOD humana, respectivamente, en líneas de células 293, CHO y Hela. Gilardi y otros, cita anterior. La expresión se confirma por ensayos funcionales.

Ejemplo 2 Expresión in vivo de MT, \gamma-GTP y MnSOD después de transcripción con los vectores adenovirales recombinantes Ad-MT, Ad-\gamma-GTP y/o Ad-MnSOD

Para transfectar in vivo tejido de esófago de ratones C3H/HeNad se usa Ad-MT, Ad-\gamma-GTP o Ad-MnSOD, o una combinación de (a) Ad-\gamma-GTP y Ad-MnSOD, o (b) Ad-\gamma-GTP y Ad-MnSOD, o (c) Ad-MT y Ad-MnSOD, o (d) Ad-MT y AD-MnSOD, y Ad-\gamma-GTP. Los vectores se inyectan a los ratones haciendo pasar un tubo unido a una aguja de galga 28 a través de la cavidad oral y depositando vector recombinante en la parte superior del esófago. Como control actúa una solución de DNA-desnudo a la misma concentración usada en la preparación activa.

Los ratones se sacrifican 24 horas más tarde y se extrae el esófago. El tejido se ensaya en cuanto a: MT, MnSOD o \gamma-GTP inmunorreactivo, medido por inmunoprecipitación o transferencia Western, y (2) (b) actividad funcional de MT, MnSOD y/o \gamma-GTP. Se observan los transcriptos humanos de las proteínas en el tejido transfectado; la SDS-PAGE y la autorradiografía de las muestras de proteína del tejido sometido a biopsia revelan expresión de novo de MT humano de 6.000 dalton, MnSOD humano de 16.000-19.000 dalton y \gamma-GTP humano de 62.000 dalton. No se observó expresión en ratones que recibieron una solución de DNA desnudo.

Ejemplo 3 Preparación de complejos de MT, MnSOD y/o \gamma-GTP con vehículo lipídico-ácido nucleico

Los complejos de vehículo lipídico-ácido nucleico se preparan por métodos bien conocidos en la técnica tales como los descritos por Debs y otros en WO 93/12756, o por Stribling y otros, cita anterior. Alternativamente, los liposomas para lipofección se pueden producir como sigue o se pueden comprar de GIBCO BRL. Para preparar liposomas para lipofección, se evaporan por rotación 20 mg de fosfatrolicolina de huevo con una secadora en vacío a partir de una solución en cloroformo para obtener una película delgada sobre las paredes de un matraz de fondo redondo, de 5 ml, durante 1 hora. El lípido de la película delgada seca se pone en 0,5 ml de una solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, en una mezcladora de vórtice y luego se sonica.

En la suspensión sonicada de liposoma se atrapa un vector de expresión que comprende DNA que codifica MT, MnSOD y/o \gamma-GTP y un promotor tal como el promotor humano de beta-actina en pHB Apr1, remolinando extensamente 0,5 ml de solución de DNA con suspensión sonicada durante 1 minutos, a lo que siguen tres ciclos de congelación y descongelación. Los liposomas con DNA atrapado se separan del DNA no atrapado por filtración en gel en una columna Sepharose 4B diluidos con PBS.

Para determinar la toxicidad, se optimizan la cantidad de liposomas (30-40 \mug) y la cantidad de DNA (1 a 5 \mug) para el tipo de célula sobre la base de una curva de dosis-respuesta. Felgner y otros, 1989, cita anterior. La cantidad de liposoma usada para la lipofección es de aproximadamente 50% de su concentración tóxica.

Para preparar los complejos de plásmido/liposoma catiónico, se hacen liposomas catiónicos que contienen un preparado 1:1 de DOTMA/DOPE (esto es, N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamonio (DOTMA y dioleilfosfatidiletanol-amina (DOPE) 1:1). Las soluciones de acopio de los lípidos se disuelven en cloroformo y se almacenan bajo argón a -20ºC. Los lípidos se mezclan en matraces de fondo redondo y se evaporan a sequedad en un evaporador rotatorio a presión reducida. La concentración final de lípidos de 10 mM se realiza añadiendo agua doblemente destilada. La mezcla resultante se sonica durante aproximadamente 20 min. Entre 5 y 50 mg, preferiblemente 12 mg de plásmido, se complejan a entre 5 y 100 \mumol, preferiblemente 24 \mumol de liposomas de DOTMA/DOPE. Como controles se preparan complejos de plásmido LacZ/liposoma.

Ejemplo 4 Expresión in vivo de MT, MnSOD y/o \gamma-GTP después de lipofección con complejos de plásmido/liposoma

Se transfectan ratones por lipofección con DNA que codifica MT, MnSOD, \gamma-GTP, o complejos de plásmido LacZ/liposoma preparados de acuerdo con el Ejemplo 3. A ratones C3H/HeNsd adultos, de aproximadamente 12 semanas de edad, se inyecta el complejo de plásmido/liposoma haciendo pasar un tubo unido a una aguja de galga 28 a través de la cavidad oral y depositando 150 \mul de complejo de plásmido/liposoma que comprende 1 mg de MT, MnSOD, \gamma-GTP, o DNA de plásmido LacZ (10 \mug/ml), y 56 \mul de lipofectante en la parte superior del esófago. Como control se usa una solución de DNA desnudo a la misma concentración que en el preparado de liposomas.

Se sacrifican los ratones 24 horas después y se extrae el esófago. El tejido se ensaya en cuanto a: MT, MnSOD o \gamma-GTP inmunorreactivo, medido por inmunoprecipitación o transferencia Western, o LacZ, medida por tinción, y (2) (b) actividad funcional de MT, MnSOD y/o \gamma-GTP. Se observan los transcriptos humanos de las proteínas en el tejido transfectado; la SDS-PAGE y la autorradiografía de las muestras de proteína del tejido sometido a biopsia revelan expresión de novo de MT humano de 6.000 dalton, MnSOD humano de 16.000-19.000 dalton y \gamma-GTP humano de 62.000 dalton. Se confirma la expresión de LacZ en ratones que recibieron complejos de plásmido LacZ/liposoma. No se observó expresión en ratones que recibieron una solución de DNA desnudo.

Ejemplo 5 Protección del esófago contra la radiación ionizante y los agentes de alquilación

Se ensayan ratones de control y ratones que expresan transitoriamente MT, MnSOD, \gamma-GTP recombinantes o una combinación de estas proteínas en tejido de esófago, como resultado de lipofección con complejo de plásmido/liposoma de acuerdo con el Ejemplo 4, para ver si la(s) proteína(s) recombinante(s) protege(n) el esófago durante la irradiación. Un primer grupo de ratones se expone a radiación ionizante aplicada al pulmón con suministro de una dosis de irradiación hemicorporal de aproximadamente 1800 a 2500 cGY en una fracción o de aproximadamente 2000 a 3000 cGY en fracciones múltiples. Estos regímenes producen una esofagitis aguda por la radiación en animales no protegidos al cabo de dos o tres días de la irradiación suministrada en una sola fracción. Al cabo de tiempos seriales después de irradiación, entre aproximadamente un día y dos semanas, se sacrificaron los animales y se extrajeron los esófagos irradiados y los de control.

También se evaluó el efecto de la expresión de transgén sobre el desarrollo de la esofagitis inducida por quimiorradiación. Un segundo grupo de ratones se expone a un tratamiento de quimiorradiación, usando taxol, para determinar si una expresión incrementada de MT, MnSOD y/o \gamma-GTP protege contra el desarrollo de esofagitis resultante de la terapia por quimiorradiación. En este caso, los ratones reciben una sola dosis de 6 mg/kg de taxol o una dosis fraccionada de 1,5 mg/kg/día a lo largo de 5 días, por inyección intraperitoneal. El último día de inyección de taxol, los ratones experimentales reciben una inyección esofágica de complejo de MT, MnSOD o \gamma-GTP plásmido/liposoma. Los ratones experimentales y los de control se irradian con 1500, 1750 o 2000 cGy.

Se ha descrito anteriormente un modelo de ratón para esofagitis inducida por irradiación. Rozenzweig y otros, Nucl. Med. Biol., 21: 171-178 (1994). De acuerdo con el modelo, se usó LD50/30 para describir la mortalidad por muertes debidas a esofagitis producida en los 30 primeros días después de irradiación. Se observó que los ratones C3H/HeJ tenían LD50/30 de 1900 cGy, que disminuyó a 1252 o 1262 cGy cuando se administró adriamicina 1 o 7 días antes, respectivamente.

El modelo de ratón para la esofagitis se usa para estimar la mortalidad por esofagitis causada por cambios inducidos por radiaciones, comparando LD50/30 de control y ratones experimentales. Con el fin de determinar LD50/30, los ratones se irradian 24 horas después de inyectar el complejo de plásmido/liposoma con una única dosis de irradiación que varía de 1800 a 2500 cGy. Los ratones se protegen de manera que la irradiación esté restringida a la cavidad pulmonar. Los ratones se pesan antes de ser irradiados y al cabo de 7, 14, 21 y 28 días después de irradiación. Los ratones se observan diariamente y se sacrifican si pierden más de 20% de su peso corporal o tienen dificultades para respirar o moverse. Después de 30 días, se sacrifican los ratones restantes.

También se usa un programa de irradiación fraccionada. En este caso, los ratones reciben una inyección intraesofágea de complejo de plásmido/liposoma 24 horas antes de la primera dosis y cada 24 horas después. La dosis de irradiación se fracciona en 400 cGy x 5, 300 cGy x 10 o 250 cGy x 12.

La esofagitis se controla también siguiente su progresión histológica. Se sacrifican los ratones a tiempos seriales después del tratamiento y se extrae el esófago, se fija en formalina, se secciona y se tiñe con hematoxilina y eosina. Se examinan con el microscopio las secciones en cuanto a alteraciones de la capa mucosa, que se puntúan usando el soporte lógico Optimas Image Analysis para cuantificar el daño del esófago.

Los valores de LD50/30 son significativamente más bajos en ratones que recibieron inyecciones intraesofágeas de complejo de plásmido/liposoma que contiene MT, MnSOD o \gamma-GTP. Además, el examen histológico del esófago demuestra que los complejos evitan efectivamente el daño que se produce a la capa mucosa que está asociado con la esofagitis inducida por radiaciones.

Si bien la invención se ha descrito detalladamente con respecto a realizaciones particulares preferentes, debe entenderse que tal descripción se presenta a modo de ilustración y no de limitación.

Claims (20)

1. Uso de una composición farmacéutica que comprende (A) un polinucleótido que codifica una proteína que se expresa transitoriamente en un sujeto, en el que la mencionada proteína es capaz de neutralizar o eliminar especies tóxicas; y (B) un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mencionado polinucleótido, con el fin de preparar un medicamento para uso en la proteccción de la cavidad oral, la orofarínge, el esófago, el estómago, el intestino delgado y el colon en un paciente con cáncer, en el que el medicamento está adaptado para su administración in vivo en el sitio a proteger, y en el que sitio a proteger que está alejado del sitio del tumor a tratar con un agente, que induce la producción de una especie tóxica, especie tóxica seleccionada entre el grupo constituido por un radical libre, un anión superóxido y un catión de un metal pesado.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que el mencionado agente es una radiación ionizante.

3. El uso de la reivindicación 2, en el que la mencionada radiación ionizante es terapia de radiación clínica.

4. El uso de la reivindicación 1, en el que el mencionado agente es un fármaco quimiorerapéutico.

5. El uso de la reivindicación 3 o 4, en el que el mencionado polinucleótido es un cDNA y el mencionado vehículo es un liposoma.

6. El uso de la reivindicación 3 o 4, en el que el mencionado polinucleótido es un cDNA y el mencionado vehículo es un vector adenovirus.

7. El uso de la reivindicación 5 o 6, en el que la mencionada proteína se selecciona entre el grupo constituido por gamma-glutamil transpeptidasa, superóxido de manganeso dismutasa y metalotioneína.

8. El uso de la reivindicación 5 o 6, en el que la mencionada proteína es gamma-glutamil transpeptidasa.

9. El uso de la reivindicación 5 o 6, en el que la mencionada proteína es superóxido de manganeso dismutasa.

10. El uso de la reivindicación 5 o 6, en el que la mencionada proteína es metalotioneína.

11. El uso de la reivindicación 5 o 6, en el que la mencionada composición farmacéutica comprende una mezcla de polinucleótidos seleccionados entre los grupos constituidos por un polinucleótido que codifica gamma-glutamil transpeptidasa, un polinucleótido que codifica superóxido de manganeso dismutasa y un polinucleótido que codifica metalotioneína.

12. El uso de la reivindicación 8, 9, 10 u 11, en el que el mencionado polinucleótido está bajo control de una secuencia reguladora transcripcional inducible.

13. El uso de la reivindicación 12, en el que el mencionado polinucleótido está bajo control de una secuencia reguladora transcripcional radioinducible.

14. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el mencionado paciente de cáncer es un paciente de cáncer de pulmón que requiere protección de los tejidos de la cavidad oral, la orofarínge y el esófago.

15. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el mencionado paciente con cáncer es un paciente con cáncer en el abdomen inferior que requiere protección de los tejidos del colon e intestino delgado.

16. El uso de la reivindicación 15, en el que el mencionado cáncer es cáncer cervical.

17. El uso de la reivindicación 15, en el que el mencionado cáncer es cáncer de próstata.

18. El uso de la reivindicación 15, en el que el mencionado cáncer es cáncer endometrial.

19. El uso de la reivindicación 15, en el que el mencionado cáncer es cáncer de ovario.

20. El uso de la reivindicación 15, en el que el mencionado cáncer es cáncer de vejiga.