DE60013586T2

DE60013586T2 - Genexpressions-basensequenzen zur therapeutischen anwendung und heilmittel zur gentherapie

Info

Publication number: DE60013586T2
Application number: DE60013586T
Authority: DE
Inventors: Kazuhiro Tsukuba-shi YUDA; Katsuhiko Tsukuba-shi Akiyama; Takeshi Tsukuba-shi Goto; Katsuyuki Matsuyama-shi HAMADA
Original assignee: Hisamitsu Pharmaceutical Co Inc
Current assignee: Hisamitsu Pharmaceutical Co Inc
Priority date: 1999-04-02
Filing date: 2000-03-31
Publication date: 2005-02-03
Anticipated expiration: 2020-04-01
Also published as: EP1174501A4; WO2000060068A1; CA2365545A1; KR100636578B1; EP1174501B1; EP1174501A1; US6815430B1; DE60013586D1; ATE275629T1; KR20010112930A

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung bezieht sich auf Basensequenzen, die in der Lage sind, die Expression von therapeutischen Genen spezifisch auf Schuppenepithelien zu richten, und auf Medikamente zur Gentherapie, die in der Lage sind, die Expression von therapeutischen Genen spezifisch auf Schuppenepithel durch die Verwendung der Basensequenzen zu richten.
Technischer Hintergrund
Die Gentherapie ist ein therapeutisches Verfahren, durch welches Gene oder Zellen mit den eingeführten Genen in den menschlichen Körper zum Zwecke der Behandlung von Krankheiten verabreicht werden und sie hat Aufmerksamkeit als ein neuer Ansatz erregt, der die derzeitig verwendeten ersetzen könnte. 1990 wurde die Gentherapie mit zwei Kindern in den USA durchgeführt, die eine kongeniale schwere kombinierte Immunschwäche hatten, die aus einem Adenosindeaminase (ADA)-Mangel resultierte. Seitdem wurden weltweit bis Ende 1996 über 2100 Fälle von Gentherapie durchgeführt. In diesem Land wurde die erste Gentherapie an einem ADA-defizitären Patienten im August 1995 begonnen.
In der Forschung der Gentherapie ist es eine unverzichtbare Technik, eine Verbesserung in der Sicherheit von Medikamenten zur Gentherapie zu entwickeln; z. B. erhöht das Zielen, bei dem therapeutische Gene nur in Zellen eingeführt (transferiert) werden, die Gegenstand der Behandlung sind, nicht nur die Wirksamkeit durch die Verhinderung, dass der verabreichte Vektor zur Gentherapie nutzlos diffundiert, sondern verringert auch die Expression der exogenen Gene in unerwünschten Organen und Geweben, was diese dann zu einer unverzichtbaren Technik macht.
Genauer gesagt, es gibt u.a. folgende offenbarte Techniken: ein HIV-Vektor, der dem menschlichen Immuninschwächevirus (HIV) nachempfunden ist, nutzt die Neigung sei nes Hüllproteins (das auf der Oberfläche existiert) spezifisch an das CD4-Protein zu binden und kann Gene nur in CD4-positive Zellen transferieren (Shimada T. et al., J. Clin. Invest., 88, 1043, 1991); ein rekombinanter viraler Vektor, der durch Abänderung der Hülle des murinen Moloney-Leukämievirus mit Heregulin abgeleitet wurde, kann Gene nur in solche Zellen wie Lungenkrebszellen transferieren, die den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor überexprimieren (EGFR) (Han X.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 21, 9747, 1995); ein mit Poly-L-Lysin konjugiertes Folat mit verbesserter Affinität für Krebszellen, die auf der Tatsache basiert, dass der Folatrezeptor in Krebszellen überexprimiert wird (Gottschalk S., et al., Gene Ther., 1, 3, 185, 1994; Lee R. J., Jung L., J. Biol. Chem., 271, 14, 8481, 1996).
In der Zwischenzeit ist die Entwicklung eines Systems auf dem Wege, das in der Lage ist, die Expression eines Gens spezifisch auf ein Gewebe zu richten, das Gegenstand der Behandlung ist (gewebespezifisches Expressionssystem). Das gewebespezifische Expressionssystem ist eine Technik, die auf ein Protein fokussiert, das nur in einem bestimmten Organ oder Gewebe exprimiert wird und das eine Gensequenz verwendet, die die Expression eines Gens wie ein Promotor und/oder ein Verstärker für das Gen reguliert, das dieses Protein kodiert.
Diese Technik wurde in Zusammenfassungen veröffentlicht, die bereits öffentliches Wissen darstellen (z. B. Gabi U. Dachs et al., Oncology Res., 9, 313, 1997). Die gewebespezifischen Promotoren/Verstärker, die bekannt sind, umfassen den Promotor/Verstärker für α-Fetoprotein (AFP), dessen spezifische Expression in heptazellulären Karzinomen zu sehen ist, die Promotorregion des Prostata-spezifischen Antigens (PSA), dessen Expression in Prostatakrebs erhöht ist, den von Willebrand-Faktor (vWf) und den tie-2/tek-Promoter, von denen beide endothelspezifisch sind, den DF3-Promotor, dessen erhöhte Expression in Brustkrebs zu sehen ist, den Albuminverstärker, der spezifisch in Leber exprimiert wird, den Tyrosinase-Promotor, der spezifisch in Melanomzellen exprimiert werden kann, den Myellin-Basisprotein-(MBP)Promotor, der für Gliomzellen spezifisch ist, den Osteocalcin-Promotor, der spezifisch für Osteosarcomazellen ist und ähnliche.
Die krankheitsspezifischen Promotoren/Verstärker umfassen den Promotor für das karzinoembryone Antigen (CEA), dessen erhöhte Expression in vielen Karzinomen zu beo bachten ist, den HER/neu-Promotor, der eine erhöhte Expression in Brust- und Pankreaskrebsarten aufzeigt und das Myc-Max-Reaktionselement, das die Transkription durch die Wirkung des Myc-Proteinfamilie/Max-Proteinkomplexes aktiviert, der in der Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose impliziert wird. Es wurde auch von den Promotoren/Verstärkern berichtet, deren Expression durch eine ganze Reihe von Bedingungen gesteuert wird, einschließlich des Promotors für das frühe Wachstumsreaktions-1-Gen (Egr-1) nach Bestrahlung, des Gewebetyp-Plasminogen-Aktivators (t-PA), des GRP78/BiP-Proteinpromotors, der durch tumorspezifische Bedingungen wie Glucoseentzug und Anoxie induziert wird, das Hypoxie-Reaktionselement (HRE), das eine spezifische Expression unter hypoxischen Bedingungen aufzeigt, und ähnliche.
Jedoch ist gegen Schuppenzell-Karzinome wie den zervikalen Uteruskrebs, Hautkrebs, Kopf- und Nackenkrebs, Speiseröhrenkrebs und Lungenkrebs, von denen berichtet wird, dass sie für über 60 % aller Karzinome verantwortlich sind, kein System bekannt, das in der Lage ist, die Expression von Genen spezifisch auf derartige Karzinome zu richten: es gibt kein System zur Durchführung einer wirksamen Gentherapie für Schuppenzell-Karzinome.
Offenbarung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, eine Basensequenz zur Verfügung zu stellen, die in der Lage ist, die Expression eines therapeutischen Gens spezifisch auf Schuppenepithel zu richten. Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung, ein Medikament zur Gentherapie zur Verfügung zu stellen, das in der Lage ist, die Expression eines therapeutischen Gens spezifisch auf Schuppenepithel durch Verwendung besagter Basensequenz zu richten.
Als ein Ergebnis der Durchführung notwendiger Untersuchungen der oben genannten Probleme haben die vorliegenden Erfinder neue Basensequenzen aufgefunden, die in der Lage sind, die Expression von therapeutischen Genen spezifisch auf Schuppenepithelien zu richten. Zudem wurde herausgefunden, dass diese neuen Basensequenzen eine verbesserte Fähigkeit zur Genexpression in Schuppenzell-Karzinomen wie SKG IIIa-Zellen als in normalen Schuppenepithelien hatten; und dieses führte zur Vervollständigung dieser Erfindung.
Genauer gesagt, diese Erfindung betrifft eine Basensequenz zur Expression eines therapeutischen Gens, wobei besagtes Gen in der Lage ist, die Expression des therapeutischen Gens spezifisch auf Schuppenepithel zu richten.
Genauer gesagt, sie betrifft eine Basensequenz zur Expression eines therapeutischen Gens, wobei besagte Sequenz in einer der Sequenzen (a) bis (d) gezeigt wird und in der Lage ist, die Expression eines therapeutischen Gens spezifisch auf Schuppenepithel zu richten:

(a) die Basensequenz, die in SEQ ID NO: 1 in der Sequenzauflistung gezeigt wird;
(b) die Basensequenz, die in SEQ ID NO: 18 in der Sequenzauflistung gezeigt wird;
(c) die Basensequenz, die in SEQ ID NO: 17 in der Sequenzauflistung gezeigt wird;
(d) die Basensequenz, die in SEQ ID NO: 16 in der Sequenzauflistung gezeigt wird.

Des Weiteren betrifft diese Erfindung ein Medikament zur Gentherapie mit der Basensequenz für die Expression eines therapeutischen Gens wie sie oben beschrieben wird und des therapeutischen Gens stromabwärts davon, wobei besagtes Medikament in der Lage ist, die Expression eines therapeutischen Gens spezifisch auf Schuppenepithel zu richten. Des Weiteren umfasst sie ein Verfahren zur Ausrichtung der Expression eines therapeutischen Gens, das wünschenswerterweise in bestimmtem Schuppenepithel exprimiert wird, durch die Verwendung des Medikaments.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Grafik, die die Unterschiede in der Länge unter den eingefügten Fragmenten stromaufwärts des SCC-A1-Gens für die Zellspezies-spezifischen Expressionsplasmide gemäß dieser Erfindung zeigt, wobei der Pfeil die Cap-Stelle zeigt und die Zahlen solche sind, die auf den Basenpositionen in SEQ ID NO: 5 basieren.
2 ist eine Grafik, die einen Vergleich der Mengen der Genexpression für Zellspezies-spezifische Expressionsplasmide gemäß dieser Erfindung in verschiedenen Zellen zeigt.
3 ist eine Grafik, die einen Vergleich der Mengen der Genexpression für Zellspezies-spezifische Expressionsplasmide gemäß dieser Erfindung in Schuppenepithel zeigt.
4 ist eine Grafik, die einen Vergleich der Mengen der Genexpression für Zellspezies-spezifische Expressionsplasmide gemäß dieser Erfindung in Schuppenzell-Karzinomen zeigt.
5 ist eine Grafik, die einen Vergleich der Mengen der Genexpression für Zellspezies-spezifische Expressionsplasmide gemäß dieser Erfindung in ovariellen Krebszellen zeigt.
Bester Modus zur Durchführung der Erfindung
Diese Erfindung wird im Folgenden im Detail durch Bezugnahme auf Ausführungsformen beschrieben.
(Basensequenzen)
Die Basensequenzen, die in der Lage sind, die Expression von therapeutischen Genen spezifisch auf Schuppenepithel gemäß dieser Erfindung zu richten (hiernach als "Basensequenz(en) dieser Erfindung" bezeichnet), sind aufeinanderfolgende Basensequenzen stromaufwärts des strukturellen Gens gelegen, die die Aminosäuresequenz des Schuppenzell-Karzinom-Antigens 1 definieren (hiernach als "SCC-A1" bezeichnet).
Dieses SSC-A ist ein Protein, das als Tumormarker von Schuppenzell-Karzinomen wie dem zervikalen Uteruskrebs weithin bekannt ist, für den SCC-A1 und SCC-A2 existiert, die ungefähr 95 % homolog in ihrer Gensequenz sind. Diese sind beide auf Chromosom 18q21.3 lokalisiert (S. S. Schneider et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 3147, 1995). Sakaguchi et al. analysierten den SCC-A2-Promotor und berichteten, dass die stärkste transkriptionelle Aktivität der Genexpression in SKG IIIa (Schuppenzell-Karzinom)-Zellen erhalten wurde, wenn ein DNA-Fragment mit einer Länge zwischen der transkriptionellen Startposition und 500 Bp stromaufwärts verwendet wurde. (Sakaguchi Y., Bio chemica et Biophysica Acta, 1444, 111–116, 1999). Shirato et al. bestimmten die Serummenge von SCC-A in Patienten mit Schuppenzell-Karzinom, die sich einer Radiotherapie unterzogen hatten, und fanden schließlich heraus, dass die SCC-A-Menge in den Patienten mit cervikalem Uteruskrebs mit seiner Prognose korrelierte; und sie berichteten, dass die SCC-A-Proteinmenge zur Nachbehandlungsbeobachtung nützlich ist. (Shirato H., et al., Acta Oncologica 32, 6, 663, 1993). Die Aminosäuresequenz von SSC-A und die Gensequenz, die das Protein kodiert, werden in der ungeprüften japanischen Anmeldung mit der Publikationsnummer JP 4-200387 A offenbart.
Eine Basensequenz dieser Erfindung umfasst einen Teil oder das Ganze der aufeinanderfolgenden Basensequenz von 4324 Bp, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt wird, und ist eine Basensequenz, die in der Lage ist, die Expression eines therapeutischen Gens spezifisch auf Schuppenepithel zu richten. Des Weiteren umfasst sie einen Teil oder das Ganze der aufeinanderfolgenden Basensequenz von 1000 Bp, die in SEQ D NO: 18 gezeigt wird, und ist eine Basensequenz, die in der Lage ist, die Expression eines therapeutischen Gens spezifisch auf Schuppenepithel zu richten. Des Weiteren umfasst sie einen Teil oder das Ganze der aufeinanderfolgenden Basensequenz von 500 Bp, die in SEQ ID NO: 17 gezeigt wird, und ist eine Basensequenz, die in der Lage ist, die Expression eines therapeutischen Gens spezifisch auf Schuppenepithel zu richten. Noch weiter umfasst sie einen Teil oder das Ganze der aufeinanderfolgenden Basensequenz von 1250 Bp, die in SEQ ID NO: 16 gezeigt wird, und ist eine Basensequenz, die in der Lage ist, die Expression eines therapeutischen Gens spezifisch auf Schuppenepithel zu richten.
Es gibt keinerlei Einschränkungen zum Verfahren zur Gewinnung der Basensequenzen dieser Erfindung. Auf der Basis der hierin offenbarten Basensequenzen sind Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, vorzugsweise anwendbar. Genauer gesagt, sie können durch konventionelle PCR in einem Puffer hergestellt werden, der Salze enthält wie Magnesiumionen mit geeignet anpassten Konzentrationen, unter Verwendung der stromaufwärts gelegenen Genomregion des SCC-A1-Gens als Template und Primer, die entwickelt werden, um die Amplifikation der gezielten Region der Template-DNA-Sequenz zusätzlich zur thermostabilen DNA-Polymerase zu ermöglichen.
Die thermostabilen DNA-Polymerasen, die zu verwenden sind, umfassen Taq DNA-Polymerase, die aus Themus aquaticus abgeleitet ist, Pfu DNA-Polymeriase, die aus Pyrococcus furiosus abgeleitet ist, thermostabile DNA-Polymerase-Spezies der E. coli rekombinanten Art und ähnliche. PCR kann in einer PCR-Vorrichtung durchgeführt werden, die kommerziell erhältlich ist.
Die Basensequenz dieser Erfindung kann 100 Basen oder weniger sein, da sie einen Teil der Basensequenz umfassen kann, die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 17 oder SEQ ID NO: 16 gezeigt wird. In diesem Fall ist es möglich, die Basensequenzen dieser Erfindung als Nukleinsäureverbindungen zu synthetisieren.
Die Nukleinsäureverbindungen umfassen Oligodeoxyribonukleotide des natürlichen Typs, Oligodeoxyribonukleotide des Phosphorthioattyps, Oligodeoxyribonukleotide des Methylphosphonattyps, Oligodeoxyribonukleotide des Phosphoramidattyps, Oligodeoxyribonukleotide des N-Phosphonattyps, Oligodeoxyribonukleotide des Triestertyps und ähnliche.
Zusätzlich zu den oben genannten Verfahren kann die Synthese gemäß dem Phosphoramidatverfahren durch Verwendung einer DNA/RNA-Synthetisiervorrichtung durchgeführt werden, wenn die Nukleinsauresynthese eingesetzt wird.
Das Phosphoamidatverfahren ist ein synthetisches Verfahren, das auf dem Folgenden basiert: ein mit einer Cyanoethylgruppe geschütztes Phosphoamidit oder ähnliches wird an das 3'-Ende eines modifizierten Deoxyribonukleotids gebunden, um ein Reagenz auszubilden; das Reagenz wird zur Kondensation an das 5'-Ende eines weiteren verschiedenen modifizierten Deoxyribonukleotids oder Oligo-modifizierten Deoxyribonukleotids verwendet. Die Synthese ist in dem Stadium vollständig, in dem die geschützte Gruppe der Zuckerhydroxylbereiche an dem 5'-Ende in einer Bindung im letzten Zyclus ist. Nachdem ein synthetisiertes Oligomer von dem Träger abgespalten wird, werden basische Anteile und Phosphorsäureanteile entschützt, um grob gereinigte Produkte zu ergeben. Das grob gereinigte Produkt wird unter Verwendung eines konventionellen Aufreinigungsverfahrens wie der Ethanolfällung aufgereinigt oder alternativ dazu durch eine Reihe von Verfahren aufgereinigt, wie die Umkehrphasen-Chromatografie, Ionenaustauschchromatografie, Hochdurchflüssigkeitschromatografie, die auf dem Prinzip der Gelfiltrations-Chromatografie basiert und superkritische Chromatografie.
(Therapeutische Gene)
Die Basensequenzen dieser Erfindung sind als Promotoren zum Dirigieren der Expression von therapeutischen Genen spezifisch auf Schuppenepithel nützlich.
Genauer gesagt, ein wünschenswerterweise spezifisch in Schuppenepithel zu exprimierendes therapeutisches Gen kann stromabwärts der Basensequenz dieser Erfindung platziert werden und kann z. B. durch das Einfügen in einen Teil der vitalen Genomsequenz eines vitalen Vektors verwendet werden.
Die therapeutischen Gene sind dahingehend nicht sonderlich eingeschränkt, da sie solche sind, von denen ausgegangen wird, dass sie therapeutische Wirkungen haben. Solche Gene umfassen z. B. XPA-XPG-Gene, Keratingene, Kollagengene, Thyrosinasegene, NF1-Gene, CTLA4Ig-Gene, ATM-Gene, PLP-Gene, DM20-Gene, GCH-Gene, Superoxidddismutase-1-Gene, ALD-Gene, Proteolipidproteingene, KCNA1-Gene, Fibroblasten-Wachstumsfaktor-3, COMP-Gene, DSDST-Gene, Fribrillin-1-Gene, Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor, Monoaminoxidase A- oder B-Gene, ADMLX-Gene, Androgenrezeptorgene, Gene der schweren Kette von myocardischem β-Myosin, myocardische Troponin-T-Gene, α-Tropomyosin-Gene, myocardische Myosin-bindende Protein-C-Gene, Gene der ventrikulären Myosin-alkalischen leichten Kette, Gene der ventrikularen Myosin-regulierenden leichten Kette, myocardische Tropinin-1-Gene, LQT1-4-Gene, Elastin-Gene, PKD1- und PKD2-Gene, Phosphatidylinositol-Klasse A-Gene, 1,25-(OH)-2D3-Rezeptorgene, CLCN5-Gene, Erythrozytenankyrin-Gene, CFTR-Gene, Holocarboxylase-Synthetase-Gene, ATP8A- und ATP8B-Gene, PAX-3-Gene, MITF-Gene, PAX6-Gene, Kristallin-Gene, SLC3A1-Gene, WAS-Gene, Interleukin-2-Rezeptor-γ-Kettengene, Adenosindeaminase-Gene, OCRL-1-Gene, RET-Gene, Endothelin-B-Gene, BLM-Gene, Angiotensinogen-Gene, Angiotensin-veränderndes Enzym-Gene, Angiotensin II Typ I Rezeptor-Gene, Lipoprotein-Lipase-Ggene, apoC-II-Gene, Gene des Lipoproteinrezeptors geringer Dichte, Leptin-Gene, Crowsaw-Gene, Leptin-Rezeptor-Gene, Gehirnglycogen-Phosphorylase-Gene, fas-Gene, fas-Liganden-Gene, Gene des menschlichen Leukozyten-Antigens, p53-Gene, p15-Gene, p16-Gene, Tyrosin-verwandte Protein 1- und Tyrosin-verwandte Protein 2-Gene, VEGF-Gene, Faktor VIII-Gene, Faktor-IX-Gene, apoE-Gene, apoB-Gene und apoB-100-Gene. Ein oder mehrere Spezies von diesen kann zur Verwendung miteinander kombiniert werden.
Die therapeutischen Gene müssen nicht diejenigen sein, die vom Menschen abgeleitet sind, wenn von ihnen erwartet wird, dass sie therapeutische Wirkungen aufweisen. Solche Beispiele umfassen Thymidinkinase-Gene, die aus menschlichem Herpex simplex-Virus abgeleitet sind, virale Viroide, wie der menschliche Hepatisisvirus vom Typ δ und Ribozyme, die von Protozoenziliaten (z. B. Tetrahymena) abgeleitet sind.
Unter den oben genannten umfassen die repräsentativen Gene, von denen zu erwarten ist, dass sie besonders wirksam für Schuppen-Epithelien sind, z. B. jegliche Gene von XPA bis XPG, die in dem Nukleotid-Ausschneide-Reparaturmechanismus in Bezug auf Xeroderma-Pigmentosum involviert sind, Keratingene oder VII-Typ-Kollagen-Gene in Bezug auf Epidermolyse bullosa, Thyrosinase-Gene in Bezug auf Thyrosinase-negativen-Typ-Albinismus und NF1-Gene in Bezug auf Neurofibrom Typ 1.
Die repräsentativen Gene, von denen angenommen wird, dass sie besonders wirksam für Schuppenzell-Karzinome sind, umfassen z. B. Suizidgene wie Thymidinkinase-Gene, die aus dem menschlichen Herpes Simplex Virus abgeleitet sind, Gene, die krebsspezifische Antigene kodieren, wie Gehirnglycogenphosphorylase-Gene, Gene, die die Apoptose des fas-Gens und Ähnliches unterstützen, Gene, die die Immunogenizität von Krebszellen verstärken, wie menschliche Leukozyten-Antigen-Gene, Krebs- unterdrückende Gene wie das p53-Gen, Gene, die in einer antagonistischen Weise auf Schuppenzell-Karzinome wirken (z. B. Antisense und Ribozyme).
Diese Erfindung ist auch in einer Behandlung für ästhetische Zwecke anwendbar einschließlich der Hemmung der Faltenbildung, verbesserte Durchfeuchtung, die Hemmung der Choasma- oder Ephelidesbildung und die Hemmung des Fettigseins und der Aknebildung. Insbesondere können eine oder mehrere Spezies des Keratingens oder des Kollagengens zur Verwendung in der Hemmung der Faltenbildung sowie zur Verbesserung der Durchfeuchtung kombiniert werden. Um Choasma- und Ephelides-Bildung zu hemmen, können eine oder mehrere Arten von Antisense oder Ribozym mit einer Reihe von Enzymen zur Verwendung kombiniert werden, die in die Melaninbildung involviert sind.
Die therapeutischen Gene dieser Erfindung umfassen auch Markergene. Als Markergen können CAT, GUS, β-gal, GFP, EGFP und Ähnliche verwendet werden.
Ein Poly-A-Signal kann stromabwärts des therapeutischen Gens eingefügt werden, um die Stabilität des exprimierten therapeutischen Gens innerhalb der Zelle zu regulieren.
(Verfahren zur Einführung von therapeutischen Genen) Ein therapeutisches Gen wird stromabwärts der Basensequenz dieser Erfindung eingeführt und das therapeutische Gen wird an normales Schuppenepithel, Schuppenzell-Karzinome und Ähnliche abgeliefert: eine solche Technik ist nicht sonderlich beschränkt und es können z. B. virale Vektoren verwendet werden oder alternativ dazu nicht-virale Vektoren wie synthetische Polyaminosäuren und kationische Lipide.
Wenn virale Vektoren verwendet werden sollen, dann können Virus-abgeleitete Vektoren wie ein retroviraler Vektor, ein Adeno-assoziierter Vektor, ein rekombinanter HIV-Vektor und ein Herpes Simplex-Vektor eingesetzt werden. In dem viralen Vektor wird die Basensequenz dieser Erfindung dadurch verwendet, dass sie in einem Teil der viralen Genomsequenz eingefügt wird. Zum Beispiel kann innerhalb des viralen Vektors, wenn ein viraler Leukämie-Vektor verwendet wird, ein rekombinantes virales Genom, basierend auf einem solchen Design, konstruiert werden, bei dem das Long Terminal Repeat (LTR) aus dem viralen Leukämie-Vektor abgeleitet ist, die Basensequenz dieser Erfindung, das therapeutische Gen, das Poly-A-Signal und das LTR liegen vom 5'-Ende des viralen Genoms hintereinander liegen. Die so konstruierten viralen Vektoren können in Viruspartikel durch Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, verpackt werden.
Träger für nicht-virale Vektoren wie synthetische Polyaminosäuren oder kationische Lipide sind in dem Fall einer synthetischen Polyaminosäure, eines Trägers, der eine Aminosäure umfasst (z. B. Polylysin oder Serin) als grundsätzliches Mittel zu verwenden, während in dem Fall eines kationischen Lipids ein Liposom oder Ähnliches verwendet werden kann. Im Falle eines nicht-viralen Vektors können die Basensequenz dieser Er findung, das therapeutische Gen und das Poly-A-Signal (beide stromabwärts der Basensequenz) in ein Plasmid zur Verwendung eingefügt werden.
(Medikamente zur Gentherapie)
Die Medikamente zur Gentherapie gemäß dieser Erfindung setzen die Basensequenzen dieser Erfindung ein, die oben beschrieben werden, und die in der Lage sind, die Expression bestimmter therapeutischer Gene spezifisch auf Schuppenzellepithelien zu richten. Dieses Medikament zur Gentherapie kann durch die Verwendung der Basensequenz dieser Erfindung als Promotor und die Einführung des therapeutischen Gens stromabwärts davon erhalten werden.
Wenn das Medikament zur Gentherapie an eine Zelle durch das oben genannte Verfahren geliefert wird, kann die Basensequenz dieser Erfindung die Expression des therapeutischen Gens spezifisch auf Schuppenepithel richten. Des Weiteren kann gemäß dieser Erfindung dem therapeutischen Gen seine starke Expression speziell in krebsartigem Schuppenepithel gestattet werden.
Eine solche Wirkung wird mit der aufeinanderfolgenden Sequenz von 4324 Basen, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt wird, beobachtet; innerhalb dieser Sequenz wird dieses deutlich in der aufeinanderfolgenden Sequenz von 1000 Basen beobachtet, die in SEQ ID NO: 18 gezeigt wird, mit der aufeinanderfolgenden Sequenz von 500 Basen, die in SEQ ID NO: 17 gezeigt wird, und mit der aufeinanderfolgenden Sequenz von 250 Basen, die in SEQ ID NO: 16 gezeigt wird.
Die therapeutischen Wirkungen des Medikaments zur Gentherapie gemäß dieser Erfindung werden in den genetischen Erkrankungen aller Gewebe und Organe verwendet, einschließlich Schuppenepithelien der Haut, Lunge, Esophagus und Uterus. Genauer gesagt, sie sind in der Behandlung von genetischen Hauterkrankungen wie Xeroderma pigmentosum, Epidermolyse bullosa, Ichthyose, Albinismus, Thyrosinase-negativer Typ Albinismus und Neurofibrom Typ 1 nützlich.
Sie sind auch in der Behandlung für ästhetische Zwecke nützlich, einschließlich der Hemmung der Faltenbildung auf der Haut, der Verbesserung der Durchfeuchtung, der Hemmung von Choasma- und Ephelidesbildung und der Hemmung vom Fettigseins und der Aknebildung.
Die Medikamente zur Gentherapie gemäß dieser Erfindung sind nicht nur in der Behandlung von Erkrankungen von Schuppenepithelien nützlich, sondern auch in der Gentherapie von Schuppenzell-Karzinomen; sie sind besonders wirksam für zervikalen Uteruskrebs, Hautkrebs, Kopf- und Nackenkrebs, Esophaguskrebs und Lungenkrebs.
Verfahren zur Verabreichung des Medikaments zur Gentherapie gemäß dieser Erfindung können diese durch orale Verabreichung oder parenterale Verabreichung einsetzen, zusätzlich zu denen durch direkte Verabreichung an das gezielte Gewebe und Organ. Die orale Verabreichung umfasst die sublinguale Verabreichung. Die parenterale Verabreichung umfasst Injektionen, deren Verabreichungswege subkutan, intramuskulär, durch die Vene, arteriell sowie durch Tropfeninfusion sind, Zäpfchen, Salben und Pflaster.
Die Dosierungen für das Medikament zur Gentherapie gemäß dieser Erfindung unterscheiden sich abhängig vom Alter, dem Verabreichungsweg und der Häufigkeit der Verabreichung und können in geeigneter Weise geändert werden. In diesem Fall bilden eine wirksame Menge des Medikaments zur Gentherapie gemäß dieser Erfindung, ein geeignetes Verdünnungsmittel und ein pharmakologisch einsetzbares Trägermittel eine Zusammensetzung, die normal verabreicht wird: die wirksame Menge liegt im Bereich von 1 bis 100000 μg/kg und wird kontinuierlich verabreicht oder in einer getrennten Dosierung von einem Mal bis mehrere Male täglich oder einmal alle paar Tage.
Wenn das Medikament zur Gentherapie gemäß dieser Erfindung oral verabreicht wird, sind Tabletten, Körner, feine Körrner, Pulver, Kapseln oder Ähnliches anwendbar. Diese Zusammensetzungen können Bindemittel, Einschlussmittel, Füllmittel, Hilfsstoffe, Detergentien und Ähnliches enthalten; und sie können in jeglichem Lösungszustand zur internen Verwendung, Suspension, Emulsion, Sirup und anderem vorliegen. Wenn eine parenterale Verabreichung verwendet wird, dann kann die Zusammensetzung dafür einen Stabilisator, einen Puffer, ein Konservierungsmittel, ein isotonisches Mittel und Ähnliches umfassen und sie wird in einem solchen Zustand zur Verfügung gestellt, der zur Einheitsdosierung, für einen Behälter für Mehrfachdosierung oder einen Schlauch geeignet ist.
Die Ausführungsformen dieser Erfindung werden konkret durch Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben, jedoch soll die Erfindung nicht durch die folgenden Beispiele eingeschränkt werden.
BEISPIELE
(BEISPIEL 1)
Herstellung von Membranen zum Screenen
Die menschliche Genom-DNA-Bibliothek (EMBL3 SP6/T7, Conetech #HL2067j, Sau3A I Teilverdau; Clontech Laboratories Inc.) wurde mit einem Phagen-Verdünnungspuffer [50 mM Tris-HCl (GIBCO Inc.) verdünnt, der 100 mM NaCl (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und 100 mM MgSO₄ (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), pH 7,5, 0,01 % Gelatine] enthält, um eine Phagen-Plaque-Anzahl von 1 × 10⁴ Pfu (Plaque forming unit, Plaque-bildende Einheiten) pro 100 μl zu ergeben, wobei eine Platte zum primären Screenen derart hergestellt wurde, dass die Platten darauf einheitlich ausgebildet waren. Das Screenen wurde somit mit der Gesamtzahl von 1,5 × 10⁵ Plaques durchgeführt. Die Phagenzubereitung, die positive Phagenklone aus dem primären Screenen enthält, wurde mit dem Phagen-Verdünnungspuffer verdünnt, um eine Phagen-Plaqueanzahl von 3000 Pfu pro 100 μl zu ergeben, wodurch eine Platte für das sekundäre Screening derart hergestellt wurde, dass die isolierten Plaques darauf ausgebildet wurden.
Der E. coli K802-Stamm wurde einen Tag bevor er ausgesät wurde, in 5 ml LB-Medium (DIFCO Inc.) wachsen gelassen und 1 ml der Kultur wurde in einem 5 ml LB-Medium inokuliert, das 0,2 % Maltose und 10 mM MgSO₄ enthält. Dann wurde die Kultivierung weitergeführt bis die OD600 nm den Wert von 0,6 erreichte; dadurch wurde E. coli hergestellt, um einen Phagen zu transfizieren.
Die oben beschriebene E. coli-Zubereitung (300 μl) wurde mit einer Phagen-Verdünnung vermischt und bei 37 °C für 15 Minuten inkubiert. Nachdem sie dem Autoklaven ausgesetzt worden war, wurde sie zu einem LB-Medium hinzugefügt, das 6 ml 0,75 % Bacto-Agar (DIVCO Inc.) enthält, bei 48 °C inkubiert und die gesamte Menge wurde zu dem LB-Agarmedium hinzugegeben. Nachdem sie für ungefähr 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde, wurde sie bei 37 °C über Nacht inkubiert.
Die Platte wurde bei 4 °C für eine Stunde aufbewahrt. Hybond-N+ (Amersham Pharmacia Biotech) wurde in engen Kontakt mit dem LB-Agarmedium gebracht, das für eine Minute stehengelassen wurde. Die Membran wurde luftgetrocknet und nacheinander in einen Denaturierungspuffer (0,4 M NaON-Lösung) für 5 Minuten, für 5 Minuten in einen Neutralisierungspuffer (0,5 M Tris-HCl-Lösung, die 1 mM NaCl, pH 7,5 enthält) und für 5 Minuten hintereinander in 2 x SSC eingetaucht. Die Membran wurde mit einem UV-Quervernetzungsmittel (UV Strata-Linker; Stratagene) behandelt und in einem HYBRIBAG (Cosmo Bio Co., Ltd.) gelagert.
(BEISPIEL 2)
Synthese der DNA-Sonde
Eine aus dem SCC-A2-Gen abgeleitete DNA-Sonde, die zum Screenen verwendet wurde, wurde in der folgenden Weise hergestellt. Genauer gesagt, cDNA wurde aus mRNA der menschlichen zervikalen Uterus-Krebszellinie HAT-III (American Type Cell Collection oder ATCC) unter Verwendung einer M-MLV reversen Transkriptase (GIBCO Inc.) hergestellt. PCR-Primer (SEQ ID NO: 3 und 4) wurden in einer PCR (GeneAmp PCR System 2400; Perkin Elmers Inc.) verwendet, um ein 165 Bp PCR-Produkt zu synthetisieren. Die Aufreinigung wurde unter Verwendung eines QIAquick PCR-Aufreinigungskits (QUIAGEN Inc.) durchgeführt, um die DNA-Sonde zu ergeben.
(BEISPIEL 3)
Herstellung einer ³²P-markierten DNA-Sonde
Für die Markierung der im Beispiel 2 hergestellten DNA-Sonde mit einem Radioisotop wurde ein Random-Primer-DNA-Labeling-Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet, um die ³²P-Markierung durchzuführen. Die Aufreinigung wurde durch Verwendung eines QIAquick-Nukleotid-Entfernungs-Kits (QIAGEN Inc.) durchgeführt.
(BEISPIEL 4)
Screenen durch Plaque-Hybridisierung
Zu der in Beispiel 1 hergestellten Membran wurde eine Vorhybridisierungslösung (GIBCO Inc.) bei 20 ml pro Blatt hinzugefügt, welche bei 42 °C für 2 Stunden inkubiert wurde.
Nachdem die Vorhybridisierungslösung verworfen wurde, wurden 20 ml der Hybridisierungslösung (GIBCO Inc.), die die in Beispiel 3 hergestellte DNA-Sonde (1 × 10⁷ cpm/ml) enthält, zu der Membran hinzugefügt und sie wurde bei 42 °C über Nacht inkubiert. Die Membran wurde dreimal mit 1 l 6 × SSC, das 0,1 % SDS enthält, bei 42 °C für 30 Minuten gewaschen und zweimal mit 1 l 2 × SSC, das 0,1 % SDS bei 65 °C für 30 Minuten. Die Membran wurde in ein HYBRIBAG (Cosmo Bio Co., Ltd.) eingeschlossen und einem Röntgenfilm (Fuji Film Co., Ltd.) zur Entwicklung bei –80 °C für 3 Tage ausgesetzt. Der entwickelte Film und die Platte wurden übereinandergelegt und dann wurden die Positionen der positiven Plaques identifiziert. Die Positionen der positiven Plaques wurden ausgeschnitten und korrespondierend zu ihren Agarflächen gesammelt, zu denen 500 μl des Phagen-Verdünnungspuffers und 5 μl Chloroform (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) hinzugefügt wurden. Nach dem Rühren mit einem Vortex und Fällung von Gelfragmenten nach Zentrifugation wurde der Überstand, der die positiven Phagenpartikel enthält, gesammelt. Um weitere positive Phagen zu isolieren, wurde ein sekundäres Screening gemäß den in den Beispielen 1, 3 und dem vorliegenden Beispiel durchgeführten Verfahren durchgeführt. Somit wurden zwei Arten positiver Phagen-Klone (B612 und C618) aus den isolierten Plaques isoliert.
(BEISPIEL 5)
Herstellung von Phagen-DNA in großem Maßstab
Der E. coli K802-Stamm wurde einen Tag wachsen gelassen, bevor er ausgesät wurde bis die OD600 nm den Wert 0,6 erreichte.
Die in Beispiel 4 erhaltene Phasen-Zubereitung wurde mit einem Phagen-Verdünnungspuffer verdünnt, um B612 und C618 auf jeweils 10¹⁰ Pfu/ml anzupassen. Nach Kultivierung bei 37 °C wurden Chloroform und NaCl zu der Phagenzubereitung hinzugefügt, die bei 37 °C für 30 Minuten geschüttelt wurde. Zentrifugation bei 5000 × g für 30 Minuten wurde durchgeführt und ein Überstand, der die Phagen enthält, wurde gesammelt. Extraktion der Phagen-DNAs wurde in der folgenden Weise durchgeführt. Nach Zugabe von 100 g Polyethylenglycol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und Fällung über Nacht wurde eine Super-Zentrifugation bei 35000 Upm für 18 Stunden durch Verwendung von 0,75 g/ml CsCl (GIBCO Inc.) durchgeführt. Dann wurde die Dialyse über Nacht gegen einen SM-Puffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgSO₄, 0,01 % Gelatine] durchgeführt. Nachdem dieses dem Schütteln mit einer Phenollösung, die 0,02 % SDS enthält, für eine Stunde ausgesetzt wurde, wurde die Aufreinigung durch Dialyse mit TE-Puffer durchgeführt. Dieses resultierte in dem Sammeln von 800 μg der Phagen-DNA für B612 sowie in dem Sammeln von 910 μg der Phagen-DNA für C618.
(BEISPIEL 6)
Sequenzierung der stromaufwärts gelegenen Sequenz des SCC-A-Gens
In sowohl den B612- wie auch C618-Klonen wurde das Sequenzieren stromaufwärts der in SEQ ID: 2 gezeigten Sequenz durchgeführt.
Dieses resultierte in der DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 5 für C618 gezeigt wird und der DNA-Sequenz, die für B612 in der SEQ ID NO: 6 gezeigt wird. Die Ergebnisse der Homologiesuche zeigte, dass die 3'-Endregion von SEQ ID NO: 5 zu den Exon 1- und Exon 2-Sequenzen des menschlichen Schuppenzell-Karzinomantigens 1 (SCC-A1) hoch homolog war und dass die 3'-Endregion von SEQ ID NO: 6 zu den Exon 1- und Exon 2-Sequenzen des menschlichen Schuppenzell-Karzinom-Antigens 1 (SCC-A2) hoch homolog waren. Dieses offenbarte, dass SEQ ID NO: 5 eine Sequenz war, die den stromaufwärts gelegenen Teil des SCC-A1-Genom-Gens enthält und einen Teil des SCC-A1-Gens und dass SEQ ID NO: 6 eine Sequenz war, die den stromaufwärts gelegenen Teil des SCC-A2-Genomgens und einen Teil des SCC-A2-Gens enthält.
(BEISPIEL 7)
Bestimmung der Cap-Stelle
Gesamt-mRNA wurde aus SKG IIIa-Zellen (Human Science Research Resource Bank Co., Ltd.; vormals Japan Cancer Research Resource Bank Co., Ltd.) durch Verwendung von ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd.) hergestellt. Die reverse Transkription setzte einen SMART PCR cDNA SYNTHESIS Kit (Contech Laboratories Inc.) und die Superscript II Rnase H Reverse Transkriptase (GIBCO Inc.) ein. Dieses stellte eine cDNA her, bei der die in SEQ ID NO: 7 gezeigte Sequenz an ihr 5'-Ende gebunden war. Dieses reverse Transkript wurde als Template in einer PCR verwendet, welche unter Verwendung von PCR-Primern der SEQ ID NO: 8 (an den SMART PCR cDNA SYNTHESIS-Kit angehängt) und der SEQ ID NO: 9 (Sawady Technology Co., Ltd.) durchgeführt wurde.
Nach der Reaktion wurde die vermischte Lösung einer 0,8 % Agarose-Elektrophorese ausgesetzt und das spezifisch amplifizierte PCR-Produkt wurde als Gelfragment gesammelt. Das Gelfragment wurde unter Verwendung eines QIAquick-Gel-Extraktionskits (QUIAGEN Inc.) extrahiert.
Das aufgereinigte PCR-Produkt wurde mit 0,1 μg des Bluescript II T-Vektors (Toyobo Co., Ltd.) vermischt und die Ligation wurde unter Verwendung einer T4 DNA-Ligase (GIBCO Inc.) bei 4 °C über Nacht durchgeführt.
200 μl kompetente E. coli XLI-blue (Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden in Eis aufgelöst und sie wurden zur oben beschriebenen Ligationsreaktionslösung hinzugefügt und für 30 Minuten stehengelassen.
Nach Inkubation bei 42 °C für 60 Sekunden wurde sie wiederum für 5 Minuten in Eis gestellt. Hierzu wurden 800 μl eines SOC-Mediums (GIBCO Inc.) hinzugefügt und bei 37 °C für eine Stunde inkubiert. Die Zellen (100 μl) wurden in einem LB-Agarmedium, das 50 μg/ml Ampicilin (Waco Pure Chemical Industries, Co., Ltd.) enthält, inokuliert und bei 37 °C über Nacht inkubiert. Einzelne Kolonien (fünf Klone) wurde ausgewählt und zu einem LB-Flüssigkeitsmedium hinzugefügt, das 50 μg/ml Ampicillin enthält, das weiter bei 37 °C über Nacht inkubiert wurde.
Die fünf Plasmidklone, die ausgewählt wurden, wurden mit einem QIAGEN-Plasmid MINI-Kit (QIAGEN Inc.) aufgereinigt.
Die stromaufwärts gelegene Sequenz der fünf aufgereinigten Klone wurde mit einem DNA-Sequenziergerät vom Typ 310 (ABI Inc.) identifiziert.
Das Ergebnis zeigte, dass die Cap-Stelle des SCC-A1-Gens die 4296te Base in SEQ ID NO: 5 war.
(BEISPIEL 8)
Konstruktion (I) von Expressionsplasmiden
Die in Beispiel 5 erhaltene Phagen-DNA (C618) wurde als Template in einer PCR verwendet, welche unter Verwendung der in Tabelle 1 gezeigten Kombinationen von PCR-Primern durchgeführt wurde, um fünf DNA-Fragmente im stromaufwärts gelegenen Bereich des SCC-A1-Gens mit variierenden Längen herzustellen (in SEQ ID NO: 16–18 gezeigt). Nach der Reaktion wurden die gemischten Lösungen einer 0,8 % Agarose-Gelelektrophorese ausgesetzt und die spezifisch amplifizierten PCR-Produkte wurden gesammelt. Die Gele wurden unter Verwendung eines QIAquick Gel Extractions-Kit (QIAGEN Inc.) extrahiert. Die Ergebnisse werden zusammen in Tabelle 1 gezeigt.
PCR-Produkte Tabelle 1
0,1 μg des Basisvektors (Nippon Gene Co., Ltd.), 0,1 μg) wurden einer Restriktionsenzym-Behandlung durch M1u I (Takara Shuzo Co., Ltd.) und Bg1 II (Takara Shuzo Co., Ltd.) ausgesetzt. Der Vektor wurde mit den jeweiligen PCR-Produkten vermischt und eine Ligation wurde bei 16 °C über Nacht unter Verwendung eines DNA-Ligationskits durchgeführt (Takara Shuzo Co., Ltd.).
Durch Verwendung der in Beispiel 7 gezeigten Technik wurde die Transformation durchgeführt und die Plasmide wurden mit einem QIAGEN MINI-Kit aufgereinigt.
Die Gensequenzen der Plasmide, in welche die Sequenzen, die in SEQ ID NO: 16–20 gezeigt werden eingefügt wurden, wurden mit einem DNA-Sequenziergerät vom Typ 310 (ABI Inc.) identifiziert. Nach den zuvor genannten Manipulationen wurden Expressionsvektoren mit stromaufwärts von dem SCC-A1-Gen gelegenen Teilen mit variierenden Längen (SEQ ID NO: 16–18, wie in 1 gezeigt wird) hergestellt.
(BEISPIEL 9)
Genexpressionstest 1
Normale menschliche epidermale Keratinocyten (normale Schuppenepithelien) (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), SKG IIIa-Zellen (Schuppenzell-Karzinom) und ovarielle Krebszellen (SKOV3) (ATCC), die nicht Schuppenzell-Karzinomzellen sind, wurden in Platten mit 12 Vertiefungen bei 1,0 × 10⁶ Zellen/Vertiefung inokuliert und über Nacht wachsen gelassen.
Fünf Plasmidarten mit den SEQ ID NO: 16–20, ein Kontrollvektor mit einem SV40-Promotor als positive Kontrolle (Nippon Gene Co., Ltd.) und ein Basisvektor ohne Promotorsequenz als negative Kontrolle wurden in den jeweiligen Tests verwendet. Zu jedem Plasmid (1 μg) wurden 6 μg DOTAP liposomale Transfektionsreagenzlösung (Boehringer-Mannheim Inc.) hinzugefügt und sie wurde bei Raumtemperatur für 15 Minuten stehengelassen, um eine gemischte Transfektionslösung zu ergeben. Für die Zugabegruppe der epidermalen Keratinocyten wurde die gemischte Lösung zu 1 ml eines Serum-freien Mediums für normale menschliche epidermale Keratinocyten (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) hinzugefügt, während für die Zugabegruppe der SKG IIIa-Zellen und SKOV3-Zellen die gemischte Lösung zu 1 ml eines RPMI 1649-Mediums (GIBCO Inc.) hinzugefügt wurde, das 10 % FCS (GIBCO Inc.) enthält. Diese wurden zu den Platten mit 12 Vertiefungen hinzugefügt, auf denen die jeweiligen Zellen inokuliert worden waren und sie wurden bei 37 °C unter 5 % CO₂-Atmosphäre inkubiert. 6 Stunden später wurden die jeweiligen Wachstumsmedien ausgetauscht und weiterhin bei 37 °C unter 5 % CO₂-Atmosphäre für 48 Stunden inkubiert.
48 Stunden später wurde ein PicaGene-Zellkultur-Lysereagenz Luc (Nippon Gene Co., Ltd.), das mit PBS(–)-Lösung verdünnt worden war, bei 200 μl pro Vertiefung hinzugefügt, um die Zellen zu lysieren. Die Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung eines PicaGene Lumineszenzkits (Nippon Gene Co., Ltd.) bestimmt. Ein Lumicounter 700 (Microtech Inc.) wurde als Luminometer verwendet.
Die Ergebnisse werden in 2 gezeigt. In Bezug auf die fünf Arten von Plasmiden mit den in SEQ ID NO: 16–20 gezeigten Sequenzen wurde eine Erhöhung in der Luciferase-Aktivität mit epidermalen Keratinocyten und mit SKG IIIa-Zellen beobachtet. Auf der anderen Seite wurde fast keinerlei Luciferase-Aktivität in SKOV3-Zellen beobachtet: in der gleichen Menge wie beidem Basisvektor ohne Promotor. In Bezug auf den Kontrollvektor mit einem SV40-Promotor wurde die gleiche hohe Menge an Luciferase-Aktivität in allen Zellen ohne Zellspezies-Spezifität nachgewiesen. Dieses zeigte, dass die fünf Arten von Plasmiden mit SEQ ID NO: 16–20 die Genexpressionsaktivität aufwiesen, die für Schuppenepithel spezifisch ist. Insbesondere wurde offenbart, dass unter den fünf Arten von Plasmiden mit den SEQ ID NO: 16–20 die Plasmide mit den Sequenzen, die in SEQ ID NO: 16–18 gezeigt werden, eine starke Genexpressionsaktivität aufwiesen. Zudem wurde herausgefunden, dass das Plasmid mit der in SEQ ID NO: 17 gezeigten Sequenz die stärkste Genexpressionsaktivität zeigte.
(BEISPIEL 10)
Konstruktion (II) von Expressionsplasmiden
Um die Spezifität von SEQ ID NO: 17 weiter zu untersuchen, die die stärkste Genexpressions-Aktivität in Beispiel 9 zeigte, wurden jeweils DNA-Fragmente mit den in SEQ ID NO: 24 – 26 gezeigten Sequenzen aus dem stromaufwärts des SCC-A1-Gens (SEQ ID NO: 5) gelegenen Teil hergestellt und die Expressionsplasmide wurden hergestellt. Genauer gesagt, die Expressionsplasmide wurden unter Verwendung der Kombination der Primer, die in Tabelle 2 gezeigt werden, gemäß dem Verfahren, das dem von Beispiel 8 ähnelt, hergestellt. In gleicher Weise wurde der stromaufwärts gelegene Teil des SCC-A2-Gens (SEQ ID NO: 6) als Template zur Herstellung von DNA-Fragmenten (SEQ ID NO: 27–32) mit den gleichen Längen verwendet wie diejenigen der DNA-Fragmente mit den Sequenzen, die in SEQ ID NO: 16–18 und SEQ ID NO: 24–26 gezeigt werden. Die Ergebnisse werden jeweils in den Tabelle 2 und 3 gezeigt.
PCR-Produkte (abgeleitet aus dem stromaufwärts gelegenen Teil des SCC-A1-Gens) Tabelle 2
PCR-Produkte (abgeleitet aus dem stromaufwärts gelegenen Teil des SCC-A2-Gens) Tabelle 3
(BEISPIEL 11)
Gen-Expressionstest II
Die Expressionsplasmide mit DNA-Fragmenten (SEQ ID NO: 16–18), die aus dem stromaufwärts gelegenen Teil des SCC-A1-Gens abgeleitet wurden, die in Beispiel 9 hergestellt wurden, sowie die Expressionsplasmide mit DNA-Fragmenten (SEQ ID NO: 24–26), die aus dem stromaufwärts gelegenen Teil des SCC-A1-Gens abgeleitet wurden, und die Expressionsplasmide mit DNA-Fragmenten (SEQ ID NO: 27–32), die aus dem stromaufwärts gelegenen Teil des SCC-A2-Gens abgeleitet wurden, die in Beispiel 10 hergestellt wurden, wurden auf ihre Gen-Expressionsaktivität hin bestimmt.
Die Ergebnisse werden in 3–5 gezeigt. 3 zeigt die Genexpressionsaktivität von jedem der Expressionsplasmide in epidermalen Keratinocyten; 4 zeigt jeweils die Genexpressionsaktivität von jedem Expressionsplasmid in SKG IIIa-Zellen; und 5 zeigt die Gen-Expressionsaktivität von jedem Expressionsplasmid in ovariellen Krebszellen.
In Bezug auf die sechs Arten von Plasmiden mit den DNA-Fragmenten, die aus dem stromaufwärts gelegenen Teil des SCC-A1-Gens abgeleitet sind (mit den in SEQ ID NO: 16–18 und 24–26 gezeigten Sequenzen) und die sechs Arten von Plasmiden mit den DNA-Fragmenten, die aus dem stromaufwärts gelegenen Teil des SCC-A2-Gens abge leitet wurden (mit den in SEQ ID NO: 27–32 gezeigten Sequenzen) wurde unverändert fast keinerlei Luciferase-Aktivität in SKOV3-Zellen nachgewiesen: in der gleichen Menge, wie bei dem Basisvektor ohne Promotor (5). In Bezug auf alle oben beschriebenen Expressionsplasmide wurde eine Erhöhung in der Liciferase-Aktivität mit epidermalen Keratinocyten und mit SKG IIIa-Zellen im Vergleich zu dem Basisvektor (3 und 4) beobachtet. Zudem wurde in Bezug auf das Expressionsplasmid mit SEQ ID NO: 17 die gleiche hohe Menge an Luciferase-Aktivität wie bei dem Kontrollvektor mit einem SV40-Promotor ohne nachgewiesene Zellspezifität in SKG IIIa-Zellen nachgewiesen.
Somit wurde herausgefunden, dass die 12 Arten von Plasmiden mit den DNA-Fragmenten, die aus dem stromaufwärts gelegenen Bereich des SCC-A1-Gens und dem stromaufwärts gelegenen Bereich des SCC-A2-Gens abgeleitet wurden, alle eine Zellspezies-spezifische, insbesondere Schuppenepithel-spezifische Genexpressionsaktivität besitzen. Wenn beide Expressionsplasmidgruppen verglichen werden, zeigte die vorangegangene Expressionsgruppe (d. h. diejenige, die die Basensequenzen enthält, die stromaufwärts vom SCC-A1-Gen abgeleitet wurden) eine höhere Gen-Expressionsaktivität. Es wurde des Weiteren bestätigt, dass das Plasmid mit einer DNA-Fragmenteinfügung, die aus dem stromaufwärts gelegenen Bereich des SCC-A1-Gens abgeleitet ist (mit der in SEQ ID NO: 17 gezeigten Sequenz) die stärkste Gen-Expressionsaktivität im Vergleich zu den anderen Plasmiden aufweist, die DNA-Fragmente haben, die nicht stromaufwärts vom SCC-A1-Gen abgeleitet wurden, und zu allen Plasmiden, die DNA-Fragmente haben, die stromaufwärts des SCC-A2-Gens abgeleitet wurden.
Industrielle Anwendbarkeit
Die Basensequenzen zur Expression der therapeutischen Gene gemäß dieser Erfindung sind solche, die stromaufwärts des SCC-A-Gens liegen und die Promotorfunktion haben, um die Expression bestimmter Gene spezifisch auf Schuppenepithelien zu richten.
Gemäß dieser Erfindung können die therapeutischen Gene spezifisch in Schuppenepithelien durch das Einführen der therapeutischen Gene stromabwärts dieser Basensequenzen, wie sie oben erwähnt sind, exprimiert werden.
Zudem können gemäß dieser Erfindung die Medikamente zur Gentherapie, bei der therapeutische Gene stromabwärts der oben genannten Basensequenzen eingeführt werden, erhalten werden, die in der Lage sind, die Expression der therapeutischen Gene spezifisch auf Schuppenepithelien zu richten.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Eine Basensequenz zur Expression eines therapeutischen Gens, wobei diese Sequenz in einer der Sequenzen (a) bis (d) gezeigt wird und in der Lage ist, die Expression des therapeutischen Gens spezifisch auf Schuppenepithel zu richten: (a) die Basensequenz, die in SEQ ID NO: 1 in der Sequenzauflistung gezeigt wird; (b) die Basensequenz, die in SEQ ID NO: 18 in der Sequenzauflistung gezeigt wird; (c) die Basensequenz, die in SEQ ID NO: 17 in der Sequenzauflistung gezeigt wird; (d) die Basensequenz, die in SEQ ID NO: 16 in der Sequenzauflistung gezeigt wird.
Ein Medikament zur Gentherapie, das die Basensequenz gemäß Anspruch 1 umfasst und ein davon stromabwärts gelegenes therapeutisches Gen, wobei besagtes Medikament in der Lage ist, die Expression des therapeutischen Gens spezifisch auf Schuppenepithel zu richten.