JP5858601B2 - シミ関連遺伝子 - Google Patents
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近年、慢性的色素沈着の機構解明の重要性が指摘され、老人性色素斑における網羅的遺伝子発現解析(非特許文献5)や、ヒトシミ組織を用いた関与因子の同定(特許文献1)が行われている。
さらに、老人性色素斑は加齢により増加することが知られており、過度の日光暴露部位以外の部位でも観察される場合もあることから、他の何らかの因子が発症に寄与している可能性も指摘されている(非特許文献7)。
斯様に、シミにおける生理機能は未だ未解明な点が多く、シミの本質に関与する新たな因子の解明が求められている。
(1)C19orf28、TRIM63、PI15、KCNE4、HOXD8、IGFBP7、LPL、LOC375295、NLRP2、CRTAC1、DOCK8、PFTK2、C2orf88、TRIM9、HMCN1、AEBP1、FLT1、MAPKBP1及びMKL2から選択され、チロシナーゼ活性の制御に関わることを特徴とする、シミ関連遺伝子。
(2)C19orf28、TRIM63、PI15、KCNE4、HOXD8、IGFBP7、LPL、LOC375295、NLRP2、CRTAC1、DOCK8、PFTK2、C2orf88、TRIM9、HMCN1、AEBP1及びFLT1から選択され、発現によってチロシナーゼ活性が増強する、上記(1)の遺伝子。
(3)細胞に被験物質を投与する工程と、当該細胞におけるC19orf28、TRIM63、PI15、KCNE4、HOXD8、IGFBP7、LPL、LOC375295、NLRP2、CRTAC1、DOCK8、PFTK2、C2orf88、TRIM9、HMCN1、AEBP1、FLT1、MAPKBP1及びMKL2から選択される遺伝子の発現量、又は当該遺伝子の発現産物の発現量又は活性を測定する工程を含む、シミ予防又は改善剤の評価又は選択方法。
(4)ヒト表皮組織におけるC19orf28、TRIM63、PI15、KCNE4、HOXD8、IGFBP7、LPL、LOC375295、NLRP2、CRTAC1、DOCK8、PFTK2、C2orf88、TRIM9、HMCN1、AEBP1、FLT1、MAPKBP1及びMKL2から選択される遺伝子の発現量、又は当該遺伝子の発現産物の量又は活性を指標とし、対照部位の同遺伝子の発現量、又は同遺伝子の発現産物の発現量又は活性と比較することにより、当該皮膚のシミ形成の進行度若しくは改善度を把握することを特徴とする皮膚のシミ状況分析方法。
本発明のシミ関連遺伝子は、C19orf28、TRIM63、PI15、KCNE4、HOXD8、IGFBP7、LPL、LOC375295、NLRP2、CRTAC1、DOCK8、PFTK2、C2orf88、TRIM9、HMCN1、AEBP1、FLT1、MAPKBP1及びMKL2から選択されるものである。
斯かる遺伝子の情報は表1に示すとおりであり、何れもNCBIデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)に登録されている。
チロシナーゼは、細胞におけるチロシンからのドーパの生合成にチロシンハイドロオキシラーゼとして作用し、またドーパオキシダーゼとしてドーパからのドーパキノンの生合成に働く酵素である。生合成されたドーパキノンは、中間物質を介した後、メラニンへと生合成される。すなわち、チロシナーゼの活性は、細胞のメラニン合成に深く寄与している。
従って、上記遺伝子は、その発現によって細胞のチロシナーゼ活性が増強又は低下し、結果としてメラニン産生が促進又は抑制する、チロシナーゼ活性の制御或いはメラノサイト活性化の制御に関わる遺伝子であり、シミ形成関連遺伝子と云える。
本発明のシミ予防又は改善剤の評価又は選択方法は、C19orf28、TRIM63、PI15、KCNE4、HOXD8、IGFBP7、LPL、LOC375295、NLRP2、CRTAC1、DOCK8、PFTK2、C2orf88、TRIM9、HMCN1、AEBP1、FLT1、MAPKBP1及びMKL2から選択される遺伝子(「シミ関連遺伝子」ともいう)の発現量、又は当該遺伝子の発現産物の発現量又は活性を変化させる物質を候補として選択するものである。
被験物質を接触させる細胞は、本発明のシミ関連遺伝子が発現しているかその発現物の活性が存在する動物由来の細胞、好ましくは表皮細胞であればよいが、当該遺伝子又は蛋白質の発現量が正常細胞に比べて増加したものが好ましく、より好ましくはメラノサイトであり、さらに好ましくはヒト由来培養メラノサイトである。
当該細胞の由来動物としては、非ヒト動物、例えばマウス、ラット、モルモット等げっ歯類でもよいが、ヒトであるのが好ましい。また、表皮細胞の由来組織としては、生体から外科的に切除した皮膚組織、それを免疫不全マウス等に移植した皮膚組織や、表皮細胞及びその他の皮膚構成細胞から作成した培養皮膚モデルや免疫不全マウス等を用いて作製した再構成皮膚等を使用できる。
被験物質の種類は特に限定されず、天然物でも合成物でもよく、また単一物質であっても組成物若しくは混合物であってもよい。また、細胞への接触の形態は、被験物質に依存して、任意の形態であり得る。
また、本発明のシミ関連遺伝子の発現量を減少(又は増加)させる物質とは、当該遺伝子を構成するポリヌクレオチドに相補性のmRNAの発現を抑制(又は促進)する又は分解を促進(又は抑制)する物質をいい、当該遺伝子の発現産物の発現量を変化させる物質とは、当該遺伝子の発現産物の発現を抑制(又は促進)又は発現産物の分解を促進(又は抑制)し、その発現量を減少(又は増加)させる物質をいう。
(1a)C19orf28、TRIM63、PI15、KCNE4、HOXD8、IGFBP7、LPL、LOC375295、NLRP2、CRTAC1、DOCK8、PFTK2、C2orf88、TRIM9、HMCN1、AEBP1、FLT1、MAPKBP1及びMKL2から選択される遺伝子が発現している細胞に、被験物質を接触させる工程、
(2a)被験物質を接触させた細胞における、同遺伝子の発現量を測定する工程、
(3a)(2a)で測定された発現量を被験物質に接触させない対照細胞の同遺伝子の発現量と比較する工程、
(4a)(3a)の結果に基づいて、同遺伝子の発現量を減少又は増加させる被験物質をシミ予防又は改善剤として選択する工程。
(1b)C19orf28、TRIM63、PI15、KCNE4、HOXD8、IGFBP7、LPL、LOC375295、NLRP2、CRTAC1、DOCK8、PFTK2、C2orf88、TRIM9、HMCN1、AEBP1、FLT1、MAPKBP1及びMKL2から選択される遺伝子の発現産物が発現している細胞に、被験物質を接触させる工程、
(2b)当該細胞中の同遺伝子発現産物の発現量を測定する工程、
(3b)(2b)で測定された発現量を被験物質に接触させない対照細胞の同遺伝子発現産物の発現量と比較する工程、
(4b)(3b)の結果に基づいて、同遺伝子発現産物の発現量を減少又は増加させる被験物質をシミ予防又は改善剤として選択する工程。
ウェスタンブロット法は、一次抗体として当該発現産物を認識する抗体を用いた後、二次抗体として125Iなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)等の酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器などで測定することによって実施できる。
抗体は、当該発現産物を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またモノクローナル抗体であってもよい。また、抗体は当該発現産物を認識することが保証されている市販の製品を使用すればよいが、ウサギやマウスなどを免疫動物として作製してもよい。
(1c)C19orf28、TRIM63、PI15、KCNE4、HOXD8、IGFBP7、LPL、LOC375295、NLRP2、CRTAC1、DOCK8、PFTK2、C2orf88、TRIM9、HMCN1、AEBP1、FLT1、MAPKBP1及びMKL2から選択される遺伝子の発現産物の活性が存在する細胞に、被験物質を接触させる工程、
(2c)当該細胞中の前記遺伝子発現産物の活性を測定する工程、
(3c)(2c)で測定された活性を被験物質に接触させない対照細胞の同活性と比較する工程、
(4c)(3c)の結果に基づいて、同活性を抑制又は増強させる被験物質をシミ予防又は改善剤として選択する工程。
抗体は、当該修飾部位を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またモノクローナル抗体であってもよい。また、抗体は当該修飾部位を認識することが保証されている市販の製品を使用すればよいが、ウサギやマウスなどを免疫動物として作製してもよい。
C19orf28、TRIM63、PI15、KCNE4、HOXD8、IGFBP7、LPL、LOC375295、NLRP2、CRTAC1、DOCK8、PFTK2、C2orf88、TRIM9、HMCN1、AEBP1及びFLT1から選択される遺伝子を指標とする場合、その発現量又は活性が、対照の細胞での発現量又は活性と比較して統計的に有意に低ければ、該被験物質をシミ予防又は改善剤として評価又は選択でき、MAPKBP1及びMKL2から選択される遺伝子を指標とする場合、その発現量又は活性が、対照の細胞での発現量又は活性と比較して統計的に有意に高ければ、該被験物質をシミ予防又は改善剤として評価又は選択することができる。
本発明のシミ状況分析方法は、例えばシミが観察される部位の表皮組織におけるシミ関連遺伝子の発現量、又は当該遺伝子の発現産物の発現量又は活性が、正常な表皮細胞に比べて亢進しているかどうかを調べることにより行うことができる。コントロールとして用いる正常部位としては、シミ周辺部位を比較対照としてよいが、シミが比較的できにくい非露光部位であってもよい。
すなわち、シミ部の表皮組織における、C19orf28、TRIM63、PI15、KCNE4、HOXD8、IGFBP7、LPL、LOC375295、NLRP2、CRTAC1、DOCK8、PFTK2、C2orf88、TRIM9、HMCN1、AEBP1、FLT1、MAPKBP1及びMKL2から選択される遺伝子の発現量、又は当該遺伝子の発現産物の発現量又は活性が、コントロールである正常部の表皮細胞と比較して亢進又は減少している場合、当該皮膚のシミ形成の進行度若しくは改善度を把握でき、皮膚のシミ状況分析が可能となる。
ここで、測定対象としては、パンチバイオプシーなどの皮膚生検により採取した皮膚組織でもよいし、サクションブリスター法などにより採取した表皮組織であってもよい。また、採取した皮膚組織に酵素処理或いは熱処理などを施して分離した表皮組織であってもよい。また、採取した皮膚又は表皮組織を器官培養したものでもよい。さらに、皮膚又は表皮組織から分離した表皮細胞を用いてもよく、適宜培養を行ったものでもよい。
実施例1 siRNAによる遺伝子ノックダウン細胞におけるドーパオキシダーゼ活性の測定
1.siRNAによる遺伝子ノックダウン
96ウェルプレートにヒト新生児包皮由来のメラノサイト100μLを1×104個/ウェルの細胞密度となるように各ウェルに播種した。培地はMedium 254にPMAを除くHMGS(Human Melanocyte Growth Supplement)(いずれもCascade Biologics社製)を添加したものを用いた。
24時間の培養後、TransIT-TKO(登録商標)Transfection Reagent(Mirus社製)を用いて、メラノサイトに各種siRNAを終濃度20nMになるよう導入した(N=6)。前掲の表1に示した各遺伝子に対するsiRNAはいずれもInvitrogen社 Stealth Select RNAiを用いた。トランスフェクション翌日、新しい培地添加し、全量を200μLとした。
bFGF(塩基性線維芽細胞成長因子) 3ng/mL
BPE(ウシ脳下垂体抽出液) 0.4体積%
FBS(ウシ胎児血清) 0.5体積%
ハイドロコーチゾン 5×10-7mol/L
インスリン 5μg/mL
トランスフェリン 5μg/mL
ヘパリン 3μg/mL
ドーパオキシダーゼ活性(チロシナーゼ活性)を指標として遺伝子発現のメラニン産生への関与を調べた。ドーパオキシターゼ活性測定は、MBTH法(例えば、Winder A.J., Harris H., Eur. J. Biochem., 198:317-326, 1991)を参考に、以下のように行った。
1.siRNAによる遺伝子ノックダウン
6ウェルプレートにヒト新生児包皮由来のメラノサイトを1×105個/ウェルの細胞密度となるように各ウェルに播種した。培地はMedium 254にPMAを除くHMGS(Human Melanocyte Growth Supplement)(いずれもCascade Biologics社製)を添加したものを用いた(1mL/ウェル)。
24時間培養後、TransIT-TKO(登録商標)Transfection Reagent(Mirus社製)を用いて、メラノサイトに各種siRNAを終濃度20nMになるよう導入した。前掲の表1に示した各遺伝子に対するsiRNAはいずれもInvitrogen社 Stealth Select RNAiを用いた。トランスフェクション翌日、培地交換を行った。
siRNAを導入してから5日間培養した後、メラノサイトをCa2+及びMg2+を除去したPhosphate-buffered saline(PBS)で洗浄し、RIPA buffer (Santacruz社製)0.1mLで回収し、超音波処理により細胞を破砕した。その後、15,000rpmで15分間遠心分離し、その上清についてタンパク定量を行った後、定法に従ってSDS−PAGE(7.5% gel)に供した。一次抗体はanti-Tyrosinase antibody(Zymed, 1:1000)を用いた。二次抗体はanti-mouse IgG peroxidase linked F(AB`)2 fragment(GE healthcare bioscience)を5000倍に希釈して用いた。その後、ECL plus western blotting detection reagents(GE healthcare bioscience社製)を用いて発色させ、LAS4000(GE healthcare bioscience)を用いてイメージングした。内部標準としてβ−actinについて、Sigma-Aldrich社製のmonoclonal antibody specific forβ−actinを用いた発現確認を行った。
Claims (2)
- 細胞に被験物質を接触させる工程と、当該細胞におけるC19orf28、TRIM63、PI15、KCNE4、HOXD8、IGFBP7、LPL、LOC375295、NLRP2、CRTAC1、DOCK8、PFTK2、C2orf88、TRIM9、HMCN1、AEBP1、FLT1、MAPKBP1及びMKL2から選択される遺伝子の発現量、又は当該遺伝子の発現産物の発現量を測定する工程を含む、シミ予防又は改善剤の評価又は選択方法。
- 被検対象より採取したヒト表皮組織におけるC19orf28、TRIM63、PI15、KCNE4、HOXD8、IGFBP7、LPL、LOC375295、NLRP2、CRTAC1、DOCK8、PFTK2、C2orf88、TRIM9、HMCN1、AEBP1、FLT1、MAPKBP1及びMKL2から選択される遺伝子の発現量、又は当該遺伝子の発現産物の量を指標とし、被検対象より採取した対照部位の同遺伝子の発現量、又は同遺伝子の発現産物の発現量と比較することにより、当該皮膚のシミ形成の進行度若しくは改善度を把握することを特徴とする皮膚のシミ状況分析方法。
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