JPH0928378A - 神経細胞特異的に発現するアデノウイルスベクター - Google Patents
神経細胞特異的に発現するアデノウイルスベクターInfo
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- JPH0928378A JPH0928378A JP7203838A JP20383895A JPH0928378A JP H0928378 A JPH0928378 A JP H0928378A JP 7203838 A JP7203838 A JP 7203838A JP 20383895 A JP20383895 A JP 20383895A JP H0928378 A JPH0928378 A JP H0928378A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 神経細胞への遺伝子導入に利用されるアデノ
ウイルスベクターを提供することを目的とする。 【構成】 本発明は、小脳プルキンエ細胞又はオリゴデ
ンドロサイト特異的に発現する非増殖型アデノウイルス
ベクター及びそれを用いた神経特異的遺伝子導入法であ
る。本発明のアデノウイルスベクターは神経細胞特異的
な遺伝子発現システムに有用である。特に、顕著な毒性
なく、成熟した神経細胞に機能のある分子を効率的に発
現でき、遺伝子の機能研究、脳障害の治療などに利用で
きる。
ウイルスベクターを提供することを目的とする。 【構成】 本発明は、小脳プルキンエ細胞又はオリゴデ
ンドロサイト特異的に発現する非増殖型アデノウイルス
ベクター及びそれを用いた神経特異的遺伝子導入法であ
る。本発明のアデノウイルスベクターは神経細胞特異的
な遺伝子発現システムに有用である。特に、顕著な毒性
なく、成熟した神経細胞に機能のある分子を効率的に発
現でき、遺伝子の機能研究、脳障害の治療などに利用で
きる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はアデノウイスルベク
ターに関する。より詳細には、遺伝子の機能研究、遺伝
子産物の細胞による生産、ヒトに対する遺伝子治療等の
目的で、細胞に遺伝子を導入する非増殖アデノウイルス
産生に関する。
ターに関する。より詳細には、遺伝子の機能研究、遺伝
子産物の細胞による生産、ヒトに対する遺伝子治療等の
目的で、細胞に遺伝子を導入する非増殖アデノウイルス
産生に関する。
【０００２】
【従来の技術】アデノウイルスベクターは将来実用的な
遺伝子治療技術として、また神経系等の高度に分化した
細胞での発現研究の面で急速に普及してきている。既
に、いくつかのウイルスベクターは外部遺伝子を神経細
胞に運ぶ方法として確立しつつあり、その中でＨＳＶ１
やレトロウイルスによる遺伝子の導入は脳機能の研究の
上で有用性を示してきている。しかしながら、顕著なダ
メージを与えることなく、増殖が休止した神経組織への
効率的な遺伝子の運搬には未だ困難な側面を有する。こ
の観点から、最近、アデノウイルスを用いた方法が静止
期の神経細胞への遺伝子導入方法として有益であるとい
われており、その特長として、以下の点が挙げられてい
る。 １）数ｋｂまでのＤＮＡでコードされる外来遺伝子を導
入できる。 ２）幅広い生物種の様々なタイプの細胞に導入できる(L
e Gal La Salle et al.Science 259, 988-990, 1993; D
avison et al. Nature Genet. 3, 219-223, 1993; Akli
et al. Nature Genet. 3, 224-228, 1993. Bajocchi C
aillaud et al.Nature Genet. 3, 229-234, 1993)。 ３）濃い濃度のウイルス液を調製できる。 ４）細胞毒性が他のベクターに比較して相対的に低い。 これらの特長は、成熟した神経細胞における試験管内及
び生体内における研究に遺伝子治療を含めて有用であ
る。
遺伝子治療技術として、また神経系等の高度に分化した
細胞での発現研究の面で急速に普及してきている。既
に、いくつかのウイルスベクターは外部遺伝子を神経細
胞に運ぶ方法として確立しつつあり、その中でＨＳＶ１
やレトロウイルスによる遺伝子の導入は脳機能の研究の
上で有用性を示してきている。しかしながら、顕著なダ
メージを与えることなく、増殖が休止した神経組織への
効率的な遺伝子の運搬には未だ困難な側面を有する。こ
の観点から、最近、アデノウイルスを用いた方法が静止
期の神経細胞への遺伝子導入方法として有益であるとい
われており、その特長として、以下の点が挙げられてい
る。 １）数ｋｂまでのＤＮＡでコードされる外来遺伝子を導
入できる。 ２）幅広い生物種の様々なタイプの細胞に導入できる(L
e Gal La Salle et al.Science 259, 988-990, 1993; D
avison et al. Nature Genet. 3, 219-223, 1993; Akli
et al. Nature Genet. 3, 224-228, 1993. Bajocchi C
aillaud et al.Nature Genet. 3, 229-234, 1993)。 ３）濃い濃度のウイルス液を調製できる。 ４）細胞毒性が他のベクターに比較して相対的に低い。 これらの特長は、成熟した神経細胞における試験管内及
び生体内における研究に遺伝子治療を含めて有用であ
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上述の如く、アデノウ
イルスベクターにより静止細胞への遺伝子導入が可能で
あり、分化した細胞や特に神経系への遺伝子導入方法と
して、初代培養や動物個体への遺伝子導入実験が注目さ
れている。多種多様な細胞により構成される哺乳類の中
枢神経系における研究においては、特定の神経細胞に特
定の分子を発現することが望まれている。これは、多く
の場合、神経機能に重要な遺伝子は細胞のタイプ特異的
に発現するからである。本発明者等も従来より、遺伝子
導入法としてレトロウイルスベクターの研究を行ってき
ているが、上述のアデノウイルスベクターの研究も併せ
て行ってきており、脳細胞特異的に発現する遺伝子導入
法を研究した結果、その哺乳類小脳において神経細胞特
異的に目的とする遺伝子の発現を行うことができること
を確認し、本発明を完成した。本発明はかかる知見に基
づいてなされたもので、本発明は神経細胞に特異的に遺
伝子を導入することができ且つ細胞障害性の低いアデノ
ウイルスベクター及びそれを用いた神経細胞への遺伝子
導入法を提供することを目的とする。
イルスベクターにより静止細胞への遺伝子導入が可能で
あり、分化した細胞や特に神経系への遺伝子導入方法と
して、初代培養や動物個体への遺伝子導入実験が注目さ
れている。多種多様な細胞により構成される哺乳類の中
枢神経系における研究においては、特定の神経細胞に特
定の分子を発現することが望まれている。これは、多く
の場合、神経機能に重要な遺伝子は細胞のタイプ特異的
に発現するからである。本発明者等も従来より、遺伝子
導入法としてレトロウイルスベクターの研究を行ってき
ているが、上述のアデノウイルスベクターの研究も併せ
て行ってきており、脳細胞特異的に発現する遺伝子導入
法を研究した結果、その哺乳類小脳において神経細胞特
異的に目的とする遺伝子の発現を行うことができること
を確認し、本発明を完成した。本発明はかかる知見に基
づいてなされたもので、本発明は神経細胞に特異的に遺
伝子を導入することができ且つ細胞障害性の低いアデノ
ウイルスベクター及びそれを用いた神経細胞への遺伝子
導入法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明は、 小脳プルキンエ細胞特異的に発現する非増殖型アデノ
ウイルスベクター； オリゴデンドロサイト特異的に発現する非増殖型アデ
ノウイルスベクター； 上記及びで規定された非増殖型アデノウイルスベ
クターを用いた神経特異的遺伝子導入法である。
めになされた本発明は、 小脳プルキンエ細胞特異的に発現する非増殖型アデノ
ウイルスベクター； オリゴデンドロサイト特異的に発現する非増殖型アデ
ノウイルスベクター； 上記及びで規定された非増殖型アデノウイルスベ
クターを用いた神経特異的遺伝子導入法である。
【０００５】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
上述の如く、神経系の高次機能発現機構、発生、分化機
構の解析には、神経系への効率よい遺伝子導入法を確立
することが必要となる。本発明者等は、神経細胞並びに
小脳初代培養系において、アデノウイルスベクターが成
熟した神経細胞への効率よい遺伝子導入法であることを
明らかにすること、また神経細胞は多種多様に分化して
おりその発生分化機構も細胞型によって異なっているた
め、成熟した神経細胞の細胞型特異的に遺伝子を発現さ
せる方法を試みた。
上述の如く、神経系の高次機能発現機構、発生、分化機
構の解析には、神経系への効率よい遺伝子導入法を確立
することが必要となる。本発明者等は、神経細胞並びに
小脳初代培養系において、アデノウイルスベクターが成
熟した神経細胞への効率よい遺伝子導入法であることを
明らかにすること、また神経細胞は多種多様に分化して
おりその発生分化機構も細胞型によって異なっているた
め、成熟した神経細胞の細胞型特異的に遺伝子を発現さ
せる方法を試みた。
【０００６】前述のように、本発明のアデノウイルスベ
クターは、小脳プルキンエ細胞特異的に発現する非増
殖型アデノウイルスベクター；及びオリゴデンドロサ
イト特異的に発現する非増殖型アデノウイルスベクター
である。上記の本発明のウイルスベクターは、それぞ
れ、小脳のプルキンエ細胞特異的に発現しているプロモ
ーターの支配下に所望する発現遺伝子を融合させた遺伝
子を有する非増殖型アデノウイルス；オリゴデンドロサ
イト特異的に発現しているプロモーターの支配下に所望
する発現遺伝子を融合させた遺伝子を有する非増殖型ア
デノウイルスで特徴付けられる。本発明で利用される非
増殖型アデノウイルスとしては、例えば、アデノウイル
スのＣ〜Ｅ群に属する非造腫瘍性のアデノウイルスが例
示される。
クターは、小脳プルキンエ細胞特異的に発現する非増
殖型アデノウイルスベクター；及びオリゴデンドロサ
イト特異的に発現する非増殖型アデノウイルスベクター
である。上記の本発明のウイルスベクターは、それぞ
れ、小脳のプルキンエ細胞特異的に発現しているプロモ
ーターの支配下に所望する発現遺伝子を融合させた遺伝
子を有する非増殖型アデノウイルス；オリゴデンドロサ
イト特異的に発現しているプロモーターの支配下に所望
する発現遺伝子を融合させた遺伝子を有する非増殖型ア
デノウイルスで特徴付けられる。本発明で利用される非
増殖型アデノウイルスとしては、例えば、アデノウイル
スのＣ〜Ｅ群に属する非造腫瘍性のアデノウイルスが例
示される。
【０００７】より具体的な例としては、詳細は後述する
ように、小脳のプルキンエ細胞特異的に発現しているＬ
７／ＰＣＰ２のプロモーター、そしてオリゴデンドロサ
イト特異的に発現しているミエリン塩基性蛋白質(myeli
n basic protein, 以下、ＭＢＰという)のプロモーター
支配下にｌａｃＺ遺伝子を発現させるアデノウイルス、
即ち、それぞれ、ＡｄｅｘＬ７−ＬａｃＺ、Ａｄｅｘ−
ＭＢＰ−ＬａｃＺというアデノウイルスが例示される。
これらのアデノウイルスを作製し、インビトロにおける
細胞型特異性を検討したところ、ＡｄｅｘＬ７−Ｌａｃ
Ｚは小脳初代培養細胞系においてプルキンエ細胞特異的
に、Ａｄｅｘ−ＭＢＰ−ＬａｃＺはオリゴデンドロサイ
ト特異的にＬａｃＺ遺伝子を発現させた。インビボの系
として脳定位固定装置を用い、アデノウイルスのラット
小脳への直接注入を行ったところ、ｌａｃＺ陽性細胞が
ＡｄｅｘＬ７−ＬａｃＺではプルキンエ細胞層のプルキ
ンエ細胞に、Ａｄｅｘ−ＭＢＰ−ＬａｃＺでは白質に局
在するオリゴデンドログリアにその発現を確認すること
ができた。このように、小脳において、細胞型特異的に
成熟した神経細胞やグリア細胞へ遺伝子を導入すること
ができ本発明を完成するに至った。
ように、小脳のプルキンエ細胞特異的に発現しているＬ
７／ＰＣＰ２のプロモーター、そしてオリゴデンドロサ
イト特異的に発現しているミエリン塩基性蛋白質(myeli
n basic protein, 以下、ＭＢＰという)のプロモーター
支配下にｌａｃＺ遺伝子を発現させるアデノウイルス、
即ち、それぞれ、ＡｄｅｘＬ７−ＬａｃＺ、Ａｄｅｘ−
ＭＢＰ−ＬａｃＺというアデノウイルスが例示される。
これらのアデノウイルスを作製し、インビトロにおける
細胞型特異性を検討したところ、ＡｄｅｘＬ７−Ｌａｃ
Ｚは小脳初代培養細胞系においてプルキンエ細胞特異的
に、Ａｄｅｘ−ＭＢＰ−ＬａｃＺはオリゴデンドロサイ
ト特異的にＬａｃＺ遺伝子を発現させた。インビボの系
として脳定位固定装置を用い、アデノウイルスのラット
小脳への直接注入を行ったところ、ｌａｃＺ陽性細胞が
ＡｄｅｘＬ７−ＬａｃＺではプルキンエ細胞層のプルキ
ンエ細胞に、Ａｄｅｘ−ＭＢＰ−ＬａｃＺでは白質に局
在するオリゴデンドログリアにその発現を確認すること
ができた。このように、小脳において、細胞型特異的に
成熟した神経細胞やグリア細胞へ遺伝子を導入すること
ができ本発明を完成するに至った。
【０００８】まず、組換アデノウイルスベクターの作製
については、三宅等の確立したＤＮＡ-終止蛋白複合体
(DNA-terminal protein complex 1)であるＡｄ５−ｄ１
ｘ（Saito et al. J. Virol. 54, 711-719, 1985)の非
増殖性のヒトアデノウイルスタイプ５を有するコスミド
を用いた。図１に示すように、本発明者等は上記の方法
を用いて８種類のアデノウイルスの遺伝子を遺伝子工学
的に作製した。これらの構築物は基本的にｐＡｄｅｘ１
ｃｗとよばれるコスミドベクター由来であり、Ｅ１Ａ、
Ｅ１Ｂ及びＥ３を欠くＡｄ５ゲノムを有している。この
欠損している領域(Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ)に、外来の遺伝子
を挿入している。さらに遺伝子の導入の効果を見る上
で、E. coli lacZ 遺伝子を、組織化学的リポーター遺
伝子として導入して用いている。このｌａｃＺは、シス
-アクチング制御エレメント(cis-acting regulatory el
ement)のコントロール下に挿入されている。
については、三宅等の確立したＤＮＡ-終止蛋白複合体
(DNA-terminal protein complex 1)であるＡｄ５−ｄ１
ｘ（Saito et al. J. Virol. 54, 711-719, 1985)の非
増殖性のヒトアデノウイルスタイプ５を有するコスミド
を用いた。図１に示すように、本発明者等は上記の方法
を用いて８種類のアデノウイルスの遺伝子を遺伝子工学
的に作製した。これらの構築物は基本的にｐＡｄｅｘ１
ｃｗとよばれるコスミドベクター由来であり、Ｅ１Ａ、
Ｅ１Ｂ及びＥ３を欠くＡｄ５ゲノムを有している。この
欠損している領域(Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ)に、外来の遺伝子
を挿入している。さらに遺伝子の導入の効果を見る上
で、E. coli lacZ 遺伝子を、組織化学的リポーター遺
伝子として導入して用いている。このｌａｃＺは、シス
-アクチング制御エレメント(cis-acting regulatory el
ement)のコントロール下に挿入されている。
【０００９】こうして調製した組換アデノウイルスベク
ターは、基本的に２種のカテゴリーに分けることが可能
である。一種は広い範囲の組織で遍く強いプロモーター
活性を持つアデノウイルスであるＡｄｅｘ１ＳＲＬａｃ
ＺＬ、Ａｄｅｘ１ＥＦＬａｃＺＬ、Ａｄｅｘ１ＣＡＬａ
ｃＺ、ＡｄｅｘＣＡＧ−ＮＬ−ＬａｃＺである。上記の
うち２種のアデノウイルスはＣＡＧプロモーターを有し
ており、ＡｄｅｘＣＡＧ−ＮＬ−ＬａｃＺは核局在シグ
ナル（ＮＬ）を有しているが、Ａｄｅｘ１ＣＡＬａｃＺ
は有していない。
ターは、基本的に２種のカテゴリーに分けることが可能
である。一種は広い範囲の組織で遍く強いプロモーター
活性を持つアデノウイルスであるＡｄｅｘ１ＳＲＬａｃ
ＺＬ、Ａｄｅｘ１ＥＦＬａｃＺＬ、Ａｄｅｘ１ＣＡＬａ
ｃＺ、ＡｄｅｘＣＡＧ−ＮＬ−ＬａｃＺである。上記の
うち２種のアデノウイルスはＣＡＧプロモーターを有し
ており、ＡｄｅｘＣＡＧ−ＮＬ−ＬａｃＺは核局在シグ
ナル（ＮＬ）を有しているが、Ａｄｅｘ１ＣＡＬａｃＺ
は有していない。
【００１０】その他は、ＡｄｅｘＬ７−ＮＬ−ＬａｃＺ
とＡｄｅｘＭＢＰ−ＮＬ−ＬａｃＺであり、それぞれマ
ウスＬ７／ＰＣＰ２遺伝子(Oberdick et al. Science 2
48,223-248, 1990; Vandaele et al. Genes Dev. 5, 11
36-1148, 1991)やマウスＭＢＰ遺伝子(Kimura et al. P
ro. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5661-5665, 1989)から
得た神経細胞特異的なプロモーターをそれぞれ有してい
る。上記のＬ７／ＰＣＰ２は、元々小脳のプルキンエ細
胞や網膜のバイポーラー細胞に見出されたものであり(O
berdick et al. Neuron 1, 367-376, 1988)、トランス
ジェニック マウスを用いた研究から、小脳において大
変限局したトランスジーン(trans gene)の発現を示した
(Oberdick et al. Science 248, 223-248, 1990; Vanda
ele et al. Genes Dev. 5, 1136-1148, 1991)。Ａｄｅ
ｘＬ７−ＮＬ−ＬａｃＺにおいては、０．８ｋｂのＬ７
／ＰＣＰ２遺伝子配列、即ち、０．４ｋｂの5'フランキ
ング(flanking)と最初のエクソン及びイントロンを持
ち、Ｌ７／ＰＣＰ２のポリＡ配列を合わせ持つＮＬｌａ
ｃＺユニットの上流に位置する。
とＡｄｅｘＭＢＰ−ＮＬ−ＬａｃＺであり、それぞれマ
ウスＬ７／ＰＣＰ２遺伝子(Oberdick et al. Science 2
48,223-248, 1990; Vandaele et al. Genes Dev. 5, 11
36-1148, 1991)やマウスＭＢＰ遺伝子(Kimura et al. P
ro. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5661-5665, 1989)から
得た神経細胞特異的なプロモーターをそれぞれ有してい
る。上記のＬ７／ＰＣＰ２は、元々小脳のプルキンエ細
胞や網膜のバイポーラー細胞に見出されたものであり(O
berdick et al. Neuron 1, 367-376, 1988)、トランス
ジェニック マウスを用いた研究から、小脳において大
変限局したトランスジーン(trans gene)の発現を示した
(Oberdick et al. Science 248, 223-248, 1990; Vanda
ele et al. Genes Dev. 5, 1136-1148, 1991)。Ａｄｅ
ｘＬ７−ＮＬ−ＬａｃＺにおいては、０．８ｋｂのＬ７
／ＰＣＰ２遺伝子配列、即ち、０．４ｋｂの5'フランキ
ング(flanking)と最初のエクソン及びイントロンを持
ち、Ｌ７／ＰＣＰ２のポリＡ配列を合わせ持つＮＬｌａ
ｃＺユニットの上流に位置する。
【００１１】マウスＭＢＰ遺伝子の１．３ｋｂの5'フラ
ンキング配列は、中枢神経系においてオリゴデンドロサ
イトでトランスジーンを発現できるが(Kimura et al. P
ro.Natl. Acad. Sci. USA 86, 5661-5665, 1989)、シュ
ワン細胞では発現しないこと(Gow et al. J. Cell Bio
l. 119, 605-616, 1992)がトランスジェニックマウスの
研究で明らかになっている。このオリゴデンドロサイト
特異的な発現はレトロウイルスを用いたアッセイにおい
ても示されている(Ikenaka et al. New Biol. 4, 53-6
0, 1992)。一方、ＡｄｅｘＭＢＰ−ＮＬ−ＬａｃＺにお
いて、ＭＢＰプロモーター(1.3 kb)はＮＬｌａｃＺＩＶ
ＳｐＡユニットの上流に位置している。対照として、外
部遺伝子を含まないＡｄｅｘ１Ｗ及びＮＬｌａｃＺＩＶ
ＳｐＡユニットを含むＡｄｅｘΔＰ−ＮＬ−ＬａｃＺを
用いた。
ンキング配列は、中枢神経系においてオリゴデンドロサ
イトでトランスジーンを発現できるが(Kimura et al. P
ro.Natl. Acad. Sci. USA 86, 5661-5665, 1989)、シュ
ワン細胞では発現しないこと(Gow et al. J. Cell Bio
l. 119, 605-616, 1992)がトランスジェニックマウスの
研究で明らかになっている。このオリゴデンドロサイト
特異的な発現はレトロウイルスを用いたアッセイにおい
ても示されている(Ikenaka et al. New Biol. 4, 53-6
0, 1992)。一方、ＡｄｅｘＭＢＰ−ＮＬ−ＬａｃＺにお
いて、ＭＢＰプロモーター(1.3 kb)はＮＬｌａｃＺＩＶ
ＳｐＡユニットの上流に位置している。対照として、外
部遺伝子を含まないＡｄｅｘ１Ｗ及びＮＬｌａｃＺＩＶ
ＳｐＡユニットを含むＡｄｅｘΔＰ−ＮＬ−ＬａｃＺを
用いた。
【００１２】神経細胞への遺伝子導入 こうして、調製したアデノウイルスを用いて、まず数種
の株化神経細胞（例えば、Ｂ１０４，Ｃ６やＮｅｕｒｏ
２ａなど）への感染実験を行った。その際、これらの細
胞は、ＡｄｅｘｌＣＡＬａｃＺ、ＡｄｅｘＥＦＬａｃＺ
ＬやＡｄｅｘｌＳＲＬａｃＺなどにより感染多重度
（ｍ．ｏ．ｉ．）２０と１００で効率的に感染された。
ｍ．ｏ．ｉ．２０であった細胞の７０％及び１００であ
った細胞の１００％は顕著な毒性なく、β−ガラクトシ
ダーゼ活性を示した。
の株化神経細胞（例えば、Ｂ１０４，Ｃ６やＮｅｕｒｏ
２ａなど）への感染実験を行った。その際、これらの細
胞は、ＡｄｅｘｌＣＡＬａｃＺ、ＡｄｅｘＥＦＬａｃＺ
ＬやＡｄｅｘｌＳＲＬａｃＺなどにより感染多重度
（ｍ．ｏ．ｉ．）２０と１００で効率的に感染された。
ｍ．ｏ．ｉ．２０であった細胞の７０％及び１００であ
った細胞の１００％は顕著な毒性なく、β−ガラクトシ
ダーゼ活性を示した。
【００１３】次に成熟した神経組織のモデルとして本発
明者等は、ゲッ歯類の小脳を選択した。これは、容易に
組織内の神経細胞の種類を同定できることと神経機能の
研究に適しているからである。マウスの小脳から得た標
本はそれぞれ特異的に反応するモノクローナル抗体を用
いてプルキンエ細胞、顆粒細胞、アストサイト、オリゴ
デンドロサイトが同定できる。Ａｄｅｘ１ＣＡＬａｃＺ
とＡｄｅｘ１ＳＲＬａｃＺＬ並びにＡｄｅｘ１ｗ（対
照）を、小脳の初代培養細胞に神経細胞が成熟する２０
日目に接種した。その結果を図２Ａ〜Ｃに示す。図中、
ＡはＡｄｅｘ１ＣＡＬａｃＺ、ＢはＡｄｅｘ１ＳＲＬａ
ｃＺＬ、ＣはＡｄｅｘ１ｗを接種した結果を示す。Ａｄ
ｅｘ１ＣＡＬａｃＺ感染後２日（ｍ．ｏ．ｉ．１００）
で、β−ガラクトシダーゼ活性を、１００％のプルキン
エ細胞に、８０％の顆粒細胞に、１００％のアストサイ
トに確認した。プルキンエ細胞においては体幹(soma)と
樹状突起(dendrite)に確認できた。Ａｄｅｘ１ＳＲＬａ
ｃＺＬで感染させた方がＡｄｅｘ１ＣＡＬａｃＺで感染
させたものより弱かった（図２Ａ，Ｂ参照）。特に、顆
粒細胞ではほとんどβ−ガラクトシダーゼ活性は検出で
きなかった（図２Ｂ）。この差は、ＣＡＧプロモーター
とＳＲαプロモーターの差に起因するものと考えられ
た。即ち、小脳初代培養においては、ＣＡＧプロモータ
ーはＳＲαプロモーターに比較して、小脳組織における
神経細胞やグリア細胞において安定であることによると
推察される。一方、コントロールとして用いたＡｄｅｘ
１ｗでは、ラベルされた細胞は検出できなかった（図２
Ｃ）。
明者等は、ゲッ歯類の小脳を選択した。これは、容易に
組織内の神経細胞の種類を同定できることと神経機能の
研究に適しているからである。マウスの小脳から得た標
本はそれぞれ特異的に反応するモノクローナル抗体を用
いてプルキンエ細胞、顆粒細胞、アストサイト、オリゴ
デンドロサイトが同定できる。Ａｄｅｘ１ＣＡＬａｃＺ
とＡｄｅｘ１ＳＲＬａｃＺＬ並びにＡｄｅｘ１ｗ（対
照）を、小脳の初代培養細胞に神経細胞が成熟する２０
日目に接種した。その結果を図２Ａ〜Ｃに示す。図中、
ＡはＡｄｅｘ１ＣＡＬａｃＺ、ＢはＡｄｅｘ１ＳＲＬａ
ｃＺＬ、ＣはＡｄｅｘ１ｗを接種した結果を示す。Ａｄ
ｅｘ１ＣＡＬａｃＺ感染後２日（ｍ．ｏ．ｉ．１００）
で、β−ガラクトシダーゼ活性を、１００％のプルキン
エ細胞に、８０％の顆粒細胞に、１００％のアストサイ
トに確認した。プルキンエ細胞においては体幹(soma)と
樹状突起(dendrite)に確認できた。Ａｄｅｘ１ＳＲＬａ
ｃＺＬで感染させた方がＡｄｅｘ１ＣＡＬａｃＺで感染
させたものより弱かった（図２Ａ，Ｂ参照）。特に、顆
粒細胞ではほとんどβ−ガラクトシダーゼ活性は検出で
きなかった（図２Ｂ）。この差は、ＣＡＧプロモーター
とＳＲαプロモーターの差に起因するものと考えられ
た。即ち、小脳初代培養においては、ＣＡＧプロモータ
ーはＳＲαプロモーターに比較して、小脳組織における
神経細胞やグリア細胞において安定であることによると
推察される。一方、コントロールとして用いたＡｄｅｘ
１ｗでは、ラベルされた細胞は検出できなかった（図２
Ｃ）。
【００１４】神経細胞特異的な発現 本発明者等は、上記のようにインビトロにおいて神経細
胞に感染することを確認した後、次に、ＡｄｅｘＬ７−
ＮＬ−ＬａｃＺとＡｄｅｘＭＢＰ−ＮＬ−ＬａｃＺを用
いて細胞特異的な発現の検討を行った。まず最初に、Ａ
ｄｅｘＬ７−ＮＬ−ＬａｃＺを用いてプルキンエ細胞特
異的にβ−ガラクトシダーゼ活性が発現するかどうかを
検討した。その結果を図２Ｄ及びＥに示す。ｍ．ｏ．
ｉ．１００での分離して培養されたマウス小脳細胞への
感染において、インビトロにおいてプルキンエ細胞に顕
著な形態である木の葉状に数多くの突起をもった大きな
細胞としての核移行シグナルをつけることにより核で発
現したβ−ガラクトシダーゼ活性を確認できた。形態的
な同定と共に、４Ｃｌｌモノクローナル抗体を用いた二
重染色によっても確認した。その結果、ほぼ１００％の
プルキンエ細胞でβ−ガラクトシダーゼ活性が確認でき
たが、顆粒細胞やアストサイト等、その他の細胞ではほ
とんど陰性であった。図２Ｄや図２Ｅに示すように、本
ＡｄｅｘＬ７−ＮＬ−ＬａｃＺは未成熟、成熟を問わ
ず、形態的変化を伴わず、プルキンエ細胞に感染しβ−
ガラクトシダーゼ活性を示した。
胞に感染することを確認した後、次に、ＡｄｅｘＬ７−
ＮＬ−ＬａｃＺとＡｄｅｘＭＢＰ−ＮＬ−ＬａｃＺを用
いて細胞特異的な発現の検討を行った。まず最初に、Ａ
ｄｅｘＬ７−ＮＬ−ＬａｃＺを用いてプルキンエ細胞特
異的にβ−ガラクトシダーゼ活性が発現するかどうかを
検討した。その結果を図２Ｄ及びＥに示す。ｍ．ｏ．
ｉ．１００での分離して培養されたマウス小脳細胞への
感染において、インビトロにおいてプルキンエ細胞に顕
著な形態である木の葉状に数多くの突起をもった大きな
細胞としての核移行シグナルをつけることにより核で発
現したβ−ガラクトシダーゼ活性を確認できた。形態的
な同定と共に、４Ｃｌｌモノクローナル抗体を用いた二
重染色によっても確認した。その結果、ほぼ１００％の
プルキンエ細胞でβ−ガラクトシダーゼ活性が確認でき
たが、顆粒細胞やアストサイト等、その他の細胞ではほ
とんど陰性であった。図２Ｄや図２Ｅに示すように、本
ＡｄｅｘＬ７−ＮＬ−ＬａｃＺは未成熟、成熟を問わ
ず、形態的変化を伴わず、プルキンエ細胞に感染しβ−
ガラクトシダーゼ活性を示した。
【００１５】ひきつづき、本発明者等は、インビボにお
いて細胞特異的に感染が起こり、発現するか試みた。ま
ず、ＡｄｅｘＣＡＧ−ＮＬ−ＬａｃＺ及びＡｄｅｘΔＰ
−ＮＬ−ＬａｘＺ（対照）を脳定位固定装置を用いてラ
ットの小脳に注入した。即ち、１μｇのＡｄｅｘＣＡＧ
−ＮＬ−ＬａｃＺ及びＡｄｅｘΔＰ−ＮＬ−ＬａｘＺ
（それぞれ、１ｘ１０11p.f.u./ml)をラット小脳に注入
した。注入後、３日(ＡｄｅｘＣＡＧ−ＮＬ−ＬａｃＺ)
もしくは７日(ＡｄｅｘΔＰ−ＮＬ−ＬａｘＺ)で、組織
を固定し、ブルオガル(Bluo-gal)溶液にて染色した。そ
の結果を図３に示す。図中、Ａ〜ＤはＡｄｅｘＣＡＧ−
ＮＬ−ＬａｃＺを、Ｅ及びＦはＡｄｅｘΔＰ−ＮＬ−Ｌ
ａｘＺを注入した結果である。なお、Ｂ及びＤは、それ
ぞれＡ及びＣの高倍率写真であり、またＢ及びＣの白点
線は針の跡を示す。
いて細胞特異的に感染が起こり、発現するか試みた。ま
ず、ＡｄｅｘＣＡＧ−ＮＬ−ＬａｃＺ及びＡｄｅｘΔＰ
−ＮＬ−ＬａｘＺ（対照）を脳定位固定装置を用いてラ
ットの小脳に注入した。即ち、１μｇのＡｄｅｘＣＡＧ
−ＮＬ−ＬａｃＺ及びＡｄｅｘΔＰ−ＮＬ−ＬａｘＺ
（それぞれ、１ｘ１０11p.f.u./ml)をラット小脳に注入
した。注入後、３日(ＡｄｅｘＣＡＧ−ＮＬ−ＬａｃＺ)
もしくは７日(ＡｄｅｘΔＰ−ＮＬ−ＬａｘＺ)で、組織
を固定し、ブルオガル(Bluo-gal)溶液にて染色した。そ
の結果を図３に示す。図中、Ａ〜ＤはＡｄｅｘＣＡＧ−
ＮＬ−ＬａｃＺを、Ｅ及びＦはＡｄｅｘΔＰ−ＮＬ−Ｌ
ａｘＺを注入した結果である。なお、Ｂ及びＤは、それ
ぞれＡ及びＣの高倍率写真であり、またＢ及びＣの白点
線は針の跡を示す。
【００１６】ＡｄｅｘＣＡＧ−ＮＬ−ＬａｃＺにおいて
は、強いβ−ガラクトシダーゼ活性が、注射針及び小脳
の裂け目に沿う細胞で見られた(図３Ａの矢印）。切片
の顕微鏡による観察により、小脳の皮質層に青く染色さ
れた細胞が見られた（図３Ｃ，Ｄ）。小脳の皮質の表面
にあるプルキンエ細胞の樹状突起と細胞体が染まってい
たが、これはアデノウイルスがあたかも樹状突起から神
経細胞体へ逆方向に感染したかのように染色された（図
３Ｂ−Ｄの矢印）。同様に青色の蛍光色素（マーカー）
であるファストブルー(Fast Blue)と混合したＡｄｅｘ
ΔＰ−ＮＬ−ＬａｃＺをラットの小脳に注入した（図３
Ｅ，Ｆ）。その結果、β−ガラクトシダーゼ活性細胞は
観察されず（図３Ｅ）、注入部位は紫外線により蛍光発
色した（図３Ｆ、白点線は小脳のアウトラインを示
す）。
は、強いβ−ガラクトシダーゼ活性が、注射針及び小脳
の裂け目に沿う細胞で見られた(図３Ａの矢印）。切片
の顕微鏡による観察により、小脳の皮質層に青く染色さ
れた細胞が見られた（図３Ｃ，Ｄ）。小脳の皮質の表面
にあるプルキンエ細胞の樹状突起と細胞体が染まってい
たが、これはアデノウイルスがあたかも樹状突起から神
経細胞体へ逆方向に感染したかのように染色された（図
３Ｂ−Ｄの矢印）。同様に青色の蛍光色素（マーカー）
であるファストブルー(Fast Blue)と混合したＡｄｅｘ
ΔＰ−ＮＬ−ＬａｃＺをラットの小脳に注入した（図３
Ｅ，Ｆ）。その結果、β−ガラクトシダーゼ活性細胞は
観察されず（図３Ｅ）、注入部位は紫外線により蛍光発
色した（図３Ｆ、白点線は小脳のアウトラインを示
す）。
【００１７】次に、本発明者等は、ラットの小脳にＡｄ
ｅｘＬ７−ＮＬ−ＬａｃＺやＡｄｅｘＭＢＰ−ＮＬ−Ｌ
ａｃＺを注入した。即ち、１μｇのＡｄｅｘＬ７−ＮＬ
−ＬａｃＺ又はＡｄｅｘＭＢＰ−ＮＬ−ＬａｃＺ（それ
ぞれ、１ｘ１０11p.f.u./ml)をラット小脳に注入し、７
日後に脳組織を染色した。その結果を図４及び図５に示
す。図４において、ＢはＡの暗視野写真、ＣはＡの高倍
率写真（ＷＭは白質、ＧＬは顆粒細胞層、ＭＬは分子
層、ＰＬはプルキンエ細胞層、黒点線は小脳裂を示
す）、Ｄ及びＥは注入部近傍の矢状切片であり、これら
はモノクローナル抗体で免疫的組織化学法にも染色され
ている。また、図５において、Ａの白点線にそって注入
を行ったことを示し、Ｂ及びＣは注入部近傍の矢状切片
であり、これらはモノクローナル抗体で免疫的組織化学
法にも染色されている。
ｅｘＬ７−ＮＬ−ＬａｃＺやＡｄｅｘＭＢＰ−ＮＬ−Ｌ
ａｃＺを注入した。即ち、１μｇのＡｄｅｘＬ７−ＮＬ
−ＬａｃＺ又はＡｄｅｘＭＢＰ−ＮＬ−ＬａｃＺ（それ
ぞれ、１ｘ１０11p.f.u./ml)をラット小脳に注入し、７
日後に脳組織を染色した。その結果を図４及び図５に示
す。図４において、ＢはＡの暗視野写真、ＣはＡの高倍
率写真（ＷＭは白質、ＧＬは顆粒細胞層、ＭＬは分子
層、ＰＬはプルキンエ細胞層、黒点線は小脳裂を示
す）、Ｄ及びＥは注入部近傍の矢状切片であり、これら
はモノクローナル抗体で免疫的組織化学法にも染色され
ている。また、図５において、Ａの白点線にそって注入
を行ったことを示し、Ｂ及びＣは注入部近傍の矢状切片
であり、これらはモノクローナル抗体で免疫的組織化学
法にも染色されている。
【００１８】図に示されるように、β−ガラクトシダー
ゼ活性は、注入部位に限局されたが（図４Ｂの矢印及び
図５Ａ）、明らかにプルキンエ細胞層（図４Ｃ−Ｅ）と
白質（図５Ｂ，Ｃ）がＡｄｅｘＬ７−ＬａｃＺもしくは
ＡｄｅｘＭＢＰ−ＮＬ−ＬａｃＺの注入によって青色に
染色された。この青く染色された細胞はモノクローナル
抗体４Ｃｌ１（図４Ｄ，Ｅ）や抗ＭＢＰ抗体（図５Ｂ，
Ｃ）にて免疫染色することにより確認できた。その結
果、プルキンエ細胞の核及びオリゴデンドロサイトに特
異的なβ−ガラクトシダーゼ活性が見られ、プルキンエ
細胞特異性及びオリゴデンドロサイト特異性はインビボ
でも保持されていた。
ゼ活性は、注入部位に限局されたが（図４Ｂの矢印及び
図５Ａ）、明らかにプルキンエ細胞層（図４Ｃ−Ｅ）と
白質（図５Ｂ，Ｃ）がＡｄｅｘＬ７−ＬａｃＺもしくは
ＡｄｅｘＭＢＰ−ＮＬ−ＬａｃＺの注入によって青色に
染色された。この青く染色された細胞はモノクローナル
抗体４Ｃｌ１（図４Ｄ，Ｅ）や抗ＭＢＰ抗体（図５Ｂ，
Ｃ）にて免疫染色することにより確認できた。その結
果、プルキンエ細胞の核及びオリゴデンドロサイトに特
異的なβ−ガラクトシダーゼ活性が見られ、プルキンエ
細胞特異性及びオリゴデンドロサイト特異性はインビボ
でも保持されていた。
【００１９】以上のように、本発明者等はインビボにて
プルキンエ細胞やオリゴデンドロサイト特異的に外部遺
伝子の発現を確認した。同時に、今回のアデノウイルス
を投与されたラットでは、異常な行動や震えは観察しな
かった。また、腎臓、肝臓、脾臓においてβ−ガラクト
シダーゼ活性は検出できなかった。なお、本発明は上記
の例に限定されるものではなく、適宜変更して実施する
ことができる。例えば、上記の例では、発現遺伝子とし
てｌａｃＺ遺伝子を用いているが、その代りに所望する
遺伝子を用いれば、当該遺伝子を神経細胞に導入するこ
とができる。
プルキンエ細胞やオリゴデンドロサイト特異的に外部遺
伝子の発現を確認した。同時に、今回のアデノウイルス
を投与されたラットでは、異常な行動や震えは観察しな
かった。また、腎臓、肝臓、脾臓においてβ−ガラクト
シダーゼ活性は検出できなかった。なお、本発明は上記
の例に限定されるものではなく、適宜変更して実施する
ことができる。例えば、上記の例では、発現遺伝子とし
てｌａｃＺ遺伝子を用いているが、その代りに所望する
遺伝子を用いれば、当該遺伝子を神経細胞に導入するこ
とができる。
【００２０】
【発明の効果】本発明のアデノウイルスベクターは神経
細胞特異的な遺伝子発現システムとして有用である。従
来までに組織選択的なプロモーターを用いたウイルスベ
クターの報告がいくつかなされている(Ikenaka et al.
New Biol. 4, 53-60, 1992; Andersen et al. Hum. Gen
e Ther. 3, 487-499, 1992)。これらのベクターに比較
して本発明のベクターは以下の利点を持つ。第１点目
は、神経系を構成する細胞のサブタイプを決定するのに
重要なシス-アクチング エレメント(cis-acting elemen
t)の解析にアデノウイルスベクターは有益である。慣用
の方法として、プロモータ-ｌａｃＺ構築物を持つトラ
ンスジェニックマウスを作製することがあるが、発生の
初期に活性のあるプロモターを解析することはトランス
ジーン産物の過剰発現に伴う毒性のため大変困難であ
る。この点アデノウイルスを用いた方法では、効率的で
あり、従来の方法に置き換わることも可能である。次の
利点として、顕著な毒性なく成熟した神経細胞に機能の
ある分子が発現できる点がある。従来までに、成熟した
静止細胞とりわけ神経細胞への遺伝子の導入は効率が悪
く困難であると考えられてきたが、本発明のアデノウイ
ルスベクター係る困難性を解決することができる。ま
た、ＨＳＶによる遺伝子の導入と比較しても細胞毒性が
低く且つ炎症性が低い。レトロウイルスベクターは外部
遺伝子の発現に干渉を示すことが知られている。しか
し、この外来遺伝子の発現は、外部遺伝子の上流にある
プロモーターの強度と細胞特異性に依存している。本発
明のアデノウイルスによる発現システムはdominant Neg
ative Knock outや機能分子の過剰発現を伴う神経機能
のインビトロ及びインビボの試験法として大変有用であ
る。また、小脳変性症、大脳白質萎縮症(Leukodystroph
y)、多発性硬化症(Multiple Sclerosis)等の病因や治療
についても有用である。
細胞特異的な遺伝子発現システムとして有用である。従
来までに組織選択的なプロモーターを用いたウイルスベ
クターの報告がいくつかなされている(Ikenaka et al.
New Biol. 4, 53-60, 1992; Andersen et al. Hum. Gen
e Ther. 3, 487-499, 1992)。これらのベクターに比較
して本発明のベクターは以下の利点を持つ。第１点目
は、神経系を構成する細胞のサブタイプを決定するのに
重要なシス-アクチング エレメント(cis-acting elemen
t)の解析にアデノウイルスベクターは有益である。慣用
の方法として、プロモータ-ｌａｃＺ構築物を持つトラ
ンスジェニックマウスを作製することがあるが、発生の
初期に活性のあるプロモターを解析することはトランス
ジーン産物の過剰発現に伴う毒性のため大変困難であ
る。この点アデノウイルスを用いた方法では、効率的で
あり、従来の方法に置き換わることも可能である。次の
利点として、顕著な毒性なく成熟した神経細胞に機能の
ある分子が発現できる点がある。従来までに、成熟した
静止細胞とりわけ神経細胞への遺伝子の導入は効率が悪
く困難であると考えられてきたが、本発明のアデノウイ
ルスベクター係る困難性を解決することができる。ま
た、ＨＳＶによる遺伝子の導入と比較しても細胞毒性が
低く且つ炎症性が低い。レトロウイルスベクターは外部
遺伝子の発現に干渉を示すことが知られている。しか
し、この外来遺伝子の発現は、外部遺伝子の上流にある
プロモーターの強度と細胞特異性に依存している。本発
明のアデノウイルスによる発現システムはdominant Neg
ative Knock outや機能分子の過剰発現を伴う神経機能
のインビトロ及びインビボの試験法として大変有用であ
る。また、小脳変性症、大脳白質萎縮症(Leukodystroph
y)、多発性硬化症(Multiple Sclerosis)等の病因や治療
についても有用である。
【００２１】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。 実施例１ウイルスゲノムの構築 Ａｄｅｘ１ＳＲＬａｃＺＬ、Ａｄｅｘ１ＥＦＬａｃＺ
Ｌ、Ａｄｅｘ１ＣＡＬａｃＺはそれぞれ文献に記載され
ており、その方法に準じて調製した(Kanegae etal. Jp
n. J. Med. Sci. Biol. 47, 157-166, 1994; Chang et
al. Kidney International 47, 322-326, 1995; Nakamu
ra et al. Cancer Res. 54, 5757-5760, 1994)。Ａｄｅ
ｘ１ＳＲＬａｃＺＬは、ＳＲαプロモーターとＳＶ４０
ポリアデニレーション シグナル(Polyadenylation sig
nal)との間にｌａｃＺを持つように挿入した。
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。 実施例１ウイルスゲノムの構築 Ａｄｅｘ１ＳＲＬａｃＺＬ、Ａｄｅｘ１ＥＦＬａｃＺ
Ｌ、Ａｄｅｘ１ＣＡＬａｃＺはそれぞれ文献に記載され
ており、その方法に準じて調製した(Kanegae etal. Jp
n. J. Med. Sci. Biol. 47, 157-166, 1994; Chang et
al. Kidney International 47, 322-326, 1995; Nakamu
ra et al. Cancer Res. 54, 5757-5760, 1994)。Ａｄｅ
ｘ１ＳＲＬａｃＺＬは、ＳＲαプロモーターとＳＶ４０
ポリアデニレーション シグナル(Polyadenylation sig
nal)との間にｌａｃＺを持つように挿入した。
【００２２】Ａｄｅｘ１ＥＦＬａｃＺＬは、伸長因子(e
longation factor)１αプロモーター、ＬａｃＺとＰｏ
ｌｙＡ配列を含む発現ユニットを持つ。Ａｄｅｘ１ＣＡ
ＬａｃＺＬでは、ｌａｃＺ遺伝子は、別途調製したｐＡ
ｄｅｘ１ｐＣＡｗベクターに挿入され、サイトメガロウ
イルス エンハンサーと鶏βアクチン プロモター及び兎
のβ-グロビン ポリアデニレーション シグナルからな
るＣＡＧプロモーターを含む発現ユニットを有する。
longation factor)１αプロモーター、ＬａｃＺとＰｏ
ｌｙＡ配列を含む発現ユニットを持つ。Ａｄｅｘ１ＣＡ
ＬａｃＺＬでは、ｌａｃＺ遺伝子は、別途調製したｐＡ
ｄｅｘ１ｐＣＡｗベクターに挿入され、サイトメガロウ
イルス エンハンサーと鶏βアクチン プロモター及び兎
のβ-グロビン ポリアデニレーション シグナルからな
るＣＡＧプロモーターを含む発現ユニットを有する。
【００２３】ＡｄｅｘＣＡＧ−ＮＬ−ＬａｃＺ 本構築は次のように行った。ＮＬｌａｃＺを有する平滑
末端断片をｐＡｄｅｘ１ｐＣＡｗベクターのSwal サイ
トに挿入して構築した。上記ＮＬｌａｃＺユニットには
５’非翻訳領域と融合させたｌａｃＺとグルココルチコ
イド受容体からの核局在シグナル（ＮＬ）に続く単純ヘ
ルペスウイルス チミジンキナーゼ(Herpes simplex vir
us thimidine kinase)遺伝子からの開始コドンからな
る。
末端断片をｐＡｄｅｘ１ｐＣＡｗベクターのSwal サイ
トに挿入して構築した。上記ＮＬｌａｃＺユニットには
５’非翻訳領域と融合させたｌａｃＺとグルココルチコ
イド受容体からの核局在シグナル（ＮＬ）に続く単純ヘ
ルペスウイルス チミジンキナーゼ(Herpes simplex vir
us thimidine kinase)遺伝子からの開始コドンからな
る。
【００２４】ＡｄｅｘＬ７−ＮＬ−ＬａｃＺ Ｌ７／ＰＣＰプロモーター（０．８ｋｂｐ）とＰＣＲ法
により増幅したＬ７／ＰＣＰ２遺伝子 ポリアデニレー
ション シグナル Ｌ７ ｐＡ（０．５ｋｂｐ）を含むｐ
ＰＣＰ２Ｓを用いた。上記の２断片の間には、ＳａｌＩ
−ＢａｍＨＩ リンカーを挿入した。その末端にＳａｌ
ＩとＢａｍＨＩを持つように修飾したＮＬｌａｃＺユニ
ットを、ｐＰＣＰ２Ｓベクターに挿入した。生成した発
現ユニットは平滑末端化し、ｐＡｄｅｘ１ｃｗのＣｌａ
Ｉサイトに挿入した。それは４２ｋｂのコスミドベクタ
ーであり、ヒトアデノウイルスタイプ５ゲノムのＥ１
Ａ、Ｅ１Ｂ領域（１．３−９．３ｍ．ｕ．)及びＥ３領
域（７９．５−８４．８ｍ．ｕ．）を欠くものである。
挿入の方向性は発現を高くするためＥ１Ａ、Ｅ１Ｂと逆
の方向である。
により増幅したＬ７／ＰＣＰ２遺伝子 ポリアデニレー
ション シグナル Ｌ７ ｐＡ（０．５ｋｂｐ）を含むｐ
ＰＣＰ２Ｓを用いた。上記の２断片の間には、ＳａｌＩ
−ＢａｍＨＩ リンカーを挿入した。その末端にＳａｌ
ＩとＢａｍＨＩを持つように修飾したＮＬｌａｃＺユニ
ットを、ｐＰＣＰ２Ｓベクターに挿入した。生成した発
現ユニットは平滑末端化し、ｐＡｄｅｘ１ｃｗのＣｌａ
Ｉサイトに挿入した。それは４２ｋｂのコスミドベクタ
ーであり、ヒトアデノウイルスタイプ５ゲノムのＥ１
Ａ、Ｅ１Ｂ領域（１．３−９．３ｍ．ｕ．)及びＥ３領
域（７９．５−８４．８ｍ．ｕ．）を欠くものである。
挿入の方向性は発現を高くするためＥ１Ａ、Ｅ１Ｂと逆
の方向である。
【００２５】ＡｄｅｘＭＢＰ−ＮＬ−ＬａｃＺ マウスＭＢＰ遺伝子の転写開始サイトからの５’１２９
７ｂｐ配列を含むＢｇｌＩＩ／ＭｒｏＩ １．３ｋｂ断
片のプロモーターを、ｃｏｓＢＪＡＢ５(J. Neurochem.
56, 560-567, 1991)よりサブクローンした。この断片
は、リンカーの挿入より両末端にＳｐｅＩサイトを持つ
ように修飾した。これにより得られたＳｐｅＩ断片は、
４９７−５２４ｚからのＨｉｎｄIII断片（５.５ｋｂ
ｐ）を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ(−)に挿入
した(以下、ＮＬｌａｃＺＩＶＳｐＡユニットと称す
る）。これは、兎β−グロビン遺伝子からのポリアデニ
レーション サイトに続くＮＬｌａｃＺユニットを含ん
でいる(Paabo et al. Cell 35, 445-453, 1983)。ＮＬ
ｌａｃＺＩＶＳｐＡに続くＭＢＰプロモーターを有して
いる当該ユニットは、平滑末端化し、ｐＡｄｅｘ１ｃｗ
ベクターのＳｗａＩに挿入した。
７ｂｐ配列を含むＢｇｌＩＩ／ＭｒｏＩ １．３ｋｂ断
片のプロモーターを、ｃｏｓＢＪＡＢ５(J. Neurochem.
56, 560-567, 1991)よりサブクローンした。この断片
は、リンカーの挿入より両末端にＳｐｅＩサイトを持つ
ように修飾した。これにより得られたＳｐｅＩ断片は、
４９７−５２４ｚからのＨｉｎｄIII断片（５.５ｋｂ
ｐ）を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ(−)に挿入
した(以下、ＮＬｌａｃＺＩＶＳｐＡユニットと称す
る）。これは、兎β−グロビン遺伝子からのポリアデニ
レーション サイトに続くＮＬｌａｃＺユニットを含ん
でいる(Paabo et al. Cell 35, 445-453, 1983)。ＮＬ
ｌａｃＺＩＶＳｐＡに続くＭＢＰプロモーターを有して
いる当該ユニットは、平滑末端化し、ｐＡｄｅｘ１ｃｗ
ベクターのＳｗａＩに挿入した。
【００２６】ＡｄｅｘΔＰ−ＮＬ−ＬａｃＺ ＮＬｌａｃＺＩＶＳｐＡユニットをｐＡｄｅｘ１ｃｗの
ＳｗａＩサイトに挿入することによって構築した。
ＳｗａＩサイトに挿入することによって構築した。
【００２７】実施例２アデノウイルスの調製 遺伝子工学的なアデノウイルスの調製は既に公知の方法
を用いて行った(Saitoet al. J. Virol. 54, 711-719,
1985)。その概要を簡単に記せば以下の通りである。発
現コスミドベクターとＥ３領域の欠落したヒトタイプ５
アデノウイルスであるＡｄ５−ｄ１ｘのＤＮＡ-終止蛋
白複合体とを、２９３細胞(ATCC; CRL1573)にリン酸カ
ルシウム共沈法により共トランスフェクションした。単
離したアデノウイルスへの発現カッセトの導入とその構
築は、適当な制限酵素によるウイルスゲノムの消化にて
確認した。このアデノウイルスは２９３細胞の中でさら
に増殖させ、またウイルス溶液は−８０℃にて保存し
た。それぞれのベクターは、ダブル セシウム勾配精製
法により、単一の高い感染能を有するストックに調製し
た（１×１０11 p.f.u./ml, (Kanegae et al. Jpn.J. M
ed. Sci. Biol. 47, 157-166, 1994）。なお、このスト
ックは、常法通り２９３細胞のプラークアッセイにて確
認した。コントロールとして発現ユニットを持たないＡ
ｄｅｘ１ｗを用いた。
を用いて行った(Saitoet al. J. Virol. 54, 711-719,
1985)。その概要を簡単に記せば以下の通りである。発
現コスミドベクターとＥ３領域の欠落したヒトタイプ５
アデノウイルスであるＡｄ５−ｄ１ｘのＤＮＡ-終止蛋
白複合体とを、２９３細胞(ATCC; CRL1573)にリン酸カ
ルシウム共沈法により共トランスフェクションした。単
離したアデノウイルスへの発現カッセトの導入とその構
築は、適当な制限酵素によるウイルスゲノムの消化にて
確認した。このアデノウイルスは２９３細胞の中でさら
に増殖させ、またウイルス溶液は−８０℃にて保存し
た。それぞれのベクターは、ダブル セシウム勾配精製
法により、単一の高い感染能を有するストックに調製し
た（１×１０11 p.f.u./ml, (Kanegae et al. Jpn.J. M
ed. Sci. Biol. 47, 157-166, 1994）。なお、このスト
ックは、常法通り２９３細胞のプラークアッセイにて確
認した。コントロールとして発現ユニットを持たないＡ
ｄｅｘ１ｗを用いた。
【００２８】実施例３マウス小脳の初代培養 無血清培地での生後０日のＩＣＲ系マウス小脳の初代培
養は、Weberらの方法(Brain Res. 311, 119-130, 1984)
によった。上記のアデノウイルスを３７℃で１時間感染
させた。感染後２日で、細胞を２％パラホルムアルデヒ
ドと０．１％グルタルアルデヒドにて１０分間固定し
た。
養は、Weberらの方法(Brain Res. 311, 119-130, 1984)
によった。上記のアデノウイルスを３７℃で１時間感染
させた。感染後２日で、細胞を２％パラホルムアルデヒ
ドと０．１％グルタルアルデヒドにて１０分間固定し
た。
【００２９】実施例４インビボ感染実験 スプラギュドウリー(Sprague-Dawley)雌ラット(体重150
g; 7-8週齢)をペントバルビタール５０ｍｇ／ｋｇで麻
酔をかけ、ラット定位固定装置に固定した。次に無菌的
に頭骨を露出させ、高速ドリルを用いてラムダ縫合から
尾側４ｍｍのポイントに２ｍｍの穿孔をあけた。次に、
別途調整した１μｌのアデノウイルス１０％スクロース
・ＰＢＳ−（１×１０11ｐ．ｆ．ｕ．）を１μｌのハミ
ルトン シリンジ(Hamilton syringe)と２６Ｓゲージ針
を用いて小脳に注入した。針は、硬膜から４ｍｍのとこ
ろまで注入し、溶液の注入速度は０．１２５μｌ／０．
５ｍｍで行った。針はそのまま１０分間保持した。感染
させた動物は毎日異常行動及び震えの観察を行った。
g; 7-8週齢)をペントバルビタール５０ｍｇ／ｋｇで麻
酔をかけ、ラット定位固定装置に固定した。次に無菌的
に頭骨を露出させ、高速ドリルを用いてラムダ縫合から
尾側４ｍｍのポイントに２ｍｍの穿孔をあけた。次に、
別途調整した１μｌのアデノウイルス１０％スクロース
・ＰＢＳ−（１×１０11ｐ．ｆ．ｕ．）を１μｌのハミ
ルトン シリンジ(Hamilton syringe)と２６Ｓゲージ針
を用いて小脳に注入した。針は、硬膜から４ｍｍのとこ
ろまで注入し、溶液の注入速度は０．１２５μｌ／０．
５ｍｍで行った。針はそのまま１０分間保持した。感染
させた動物は毎日異常行動及び震えの観察を行った。
【００３０】感染後３日及び７日して、動物に麻酔をか
け、２％のパラホルムアルデヒド−０．１％グルタルア
ルデヒドを含むＰＢＳ（−）の心臓内投与により屠殺し
た。屠殺した動物の脳は除去し、４℃にて一晩固定し
た。次に、この標本をブルオガル溶液にて３７℃一晩染
色した。次に、この脳を、３日間、スクロース溶液（１
０％、１５％及び２０％スクロース、４℃、２４時間）
での連続平衡化（serial equilibration）によってクリ
オプロテクト（cryoprotect）した。次に、脳をＯＣＴ
化合物により凍結し、低温槽を用いて１０μｍの幅で矢
状に切開した。この切開した標本はゼラチンでコートし
たスライドに置き、風乾し、後記する免疫的組織化学方
法にて染色を行った。
け、２％のパラホルムアルデヒド−０．１％グルタルア
ルデヒドを含むＰＢＳ（−）の心臓内投与により屠殺し
た。屠殺した動物の脳は除去し、４℃にて一晩固定し
た。次に、この標本をブルオガル溶液にて３７℃一晩染
色した。次に、この脳を、３日間、スクロース溶液（１
０％、１５％及び２０％スクロース、４℃、２４時間）
での連続平衡化（serial equilibration）によってクリ
オプロテクト（cryoprotect）した。次に、脳をＯＣＴ
化合物により凍結し、低温槽を用いて１０μｍの幅で矢
状に切開した。この切開した標本はゼラチンでコートし
たスライドに置き、風乾し、後記する免疫的組織化学方
法にて染色を行った。
【００３１】実施例５β−ガラクトシダーゼ検出 固定された細胞や脳組織はＰＢＳにて簡単に洗浄した
後、５ｍＭ Ｋ4Ｆｅ（ＣＮ）6、５ｍＭ Ｋ3Ｆｅ（Ｃ
Ｎ）6、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％ デオキシコール
酸ナトリウム(Sodium deoxycholate)、０．０２％Nonid
et p-40、０．０１％ハロゲン化インドイル(Halogenate
d indoyl)-β-ガラクトシダーゼ(bluo-gal;Gibco)が含
むＰＢＳ溶液（Bluo-gal溶液）にて３７℃１２時間染色
した。
後、５ｍＭ Ｋ4Ｆｅ（ＣＮ）6、５ｍＭ Ｋ3Ｆｅ（Ｃ
Ｎ）6、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％ デオキシコール
酸ナトリウム(Sodium deoxycholate)、０．０２％Nonid
et p-40、０．０１％ハロゲン化インドイル(Halogenate
d indoyl)-β-ガラクトシダーゼ(bluo-gal;Gibco)が含
むＰＢＳ溶液（Bluo-gal溶液）にて３７℃１２時間染色
した。
【００３２】実施例６免疫的組織化学法(Immunohistochemistry) 組織標本及び凍結標本(cryo-section)は、細胞特異的に
反応する下記のモノクローナル抗体によって、それぞれ
免疫染色を行った。即ち、プルキンエ細胞はイノシトー
ル-１，４，５-トリホスフェートに作用する４Ｃｌｌで
同定した。このモノクローナル抗体はプルキンエ細胞に
局在するタイプ１受容体を認識する。次にオリゴデンド
ロサイトは、ＭＢＰに対する抗体にて同定した。二次抗
体としては、抗ラットＩｇＧ結合のフルオレセイン イ
ソチオシアナート(fluorescein isothiocyanate，ＦＩ
ＴＣ）と抗ウサギＩｇＧ抗体結合のＦＩＴＣを用いた。
反応する下記のモノクローナル抗体によって、それぞれ
免疫染色を行った。即ち、プルキンエ細胞はイノシトー
ル-１，４，５-トリホスフェートに作用する４Ｃｌｌで
同定した。このモノクローナル抗体はプルキンエ細胞に
局在するタイプ１受容体を認識する。次にオリゴデンド
ロサイトは、ＭＢＰに対する抗体にて同定した。二次抗
体としては、抗ラットＩｇＧ結合のフルオレセイン イ
ソチオシアナート(fluorescein isothiocyanate，ＦＩ
ＴＣ）と抗ウサギＩｇＧ抗体結合のＦＩＴＣを用いた。
【図１】組換アデノウイルスの遺伝子構造を示す図であ
る。図中、Ａｄｅｘは、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ及びＥ３領域が
欠損したヒトタイプ５アデノウイルスゲノムを示す。図
中、ｌａｃＺはE.coli β-ガラクトシダーゼ遺伝子、Ｓ
ＲαはＳＲαプロモーター、ＰＡはＳＶ４０ポリアデニ
レーション シグナル、ＥＦ１αは伸長因子１αプロモ
ーター、ＣＡＧはＣＡＧプロモーター、Ｇ ＰＡは兎β
−グロビン ポリアデニレーション シグナル、ＮＬ１は
核局在シグナル、Ｌ７はＬ７／ＰＣＰ２由来プロモータ
ー、Ｌ７ ＰＡはＬ７／ＰＣＰ２由来ポリアデニレーシ
ョン シグナル、ＭＢＰはＭＢＰプロモーターを示す。
る。図中、Ａｄｅｘは、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ及びＥ３領域が
欠損したヒトタイプ５アデノウイルスゲノムを示す。図
中、ｌａｃＺはE.coli β-ガラクトシダーゼ遺伝子、Ｓ
ＲαはＳＲαプロモーター、ＰＡはＳＶ４０ポリアデニ
レーション シグナル、ＥＦ１αは伸長因子１αプロモ
ーター、ＣＡＧはＣＡＧプロモーター、Ｇ ＰＡは兎β
−グロビン ポリアデニレーション シグナル、ＮＬ１は
核局在シグナル、Ｌ７はＬ７／ＰＣＰ２由来プロモータ
ー、Ｌ７ ＰＡはＬ７／ＰＣＰ２由来ポリアデニレーシ
ョン シグナル、ＭＢＰはＭＢＰプロモーターを示す。
【図２】アデノウイルスを接種したマウス小脳初代培養
細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ組織化学的染色の結
果を示す顕微鏡写真（生物の形態）である。図中、Ａは
Ａｄｅｘ１ＣＡＬａｃＺ、ＢはＡｄｅｘ１ＳＲＬａｃＺ
Ｌ、ＣはＡｄｅｘ１ｗ、Ｄ及びＥはＡｄｅｘＬ７−ＮＬ
−ＬａｃＺを接種した結果を示す。なお、Ａ〜Ｄは培養
２０日後、Ｅは培養８日後に接種した。
細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ組織化学的染色の結
果を示す顕微鏡写真（生物の形態）である。図中、Ａは
Ａｄｅｘ１ＣＡＬａｃＺ、ＢはＡｄｅｘ１ＳＲＬａｃＺ
Ｌ、ＣはＡｄｅｘ１ｗ、Ｄ及びＥはＡｄｅｘＬ７−ＮＬ
−ＬａｃＺを接種した結果を示す。なお、Ａ〜Ｄは培養
２０日後、Ｅは培養８日後に接種した。
【図３】アデノウイルスを注入したラット小脳における
発現β−ガラクトシダーゼ活性を示す顕微鏡写真（生物
の形態）である。図中、図中、Ａ〜ＤはＡｄｅｘＣＡＧ
−ＮＬ−ＬａｃＺを、Ｅ及びＦはＡｄｅｘΔＰ−ＮＬ−
ＬａｘＺを注入した結果である。なお、Ｂ及びＤは、そ
れぞれＡ及びＣの高倍率写真である。また、Ｄにおい
て、ＦＩは小脳裂、ＭＬは分子層、ＰＬはプルキンエ細
胞層を示す(以下、同様)。
発現β−ガラクトシダーゼ活性を示す顕微鏡写真（生物
の形態）である。図中、図中、Ａ〜ＤはＡｄｅｘＣＡＧ
−ＮＬ−ＬａｃＺを、Ｅ及びＦはＡｄｅｘΔＰ−ＮＬ−
ＬａｘＺを注入した結果である。なお、Ｂ及びＤは、そ
れぞれＡ及びＣの高倍率写真である。また、Ｄにおい
て、ＦＩは小脳裂、ＭＬは分子層、ＰＬはプルキンエ細
胞層を示す(以下、同様)。
【図４】本発明のアデノウイルスを注入したラット小脳
におけるプルキンエ細胞特異的遺伝子発現を示す顕微鏡
写真（生物の形態）である。図中、ＢはＡの暗視野写
真、ＣはＡの高倍率写真（ＷＭは白質、ＧＬは顆粒細胞
層、黒点線は小脳裂を示す）、Ｄ及びＥは注入部近傍の
矢状切片であり、これらはモノクローナル抗体で免疫的
組織化学法にも染色されている。
におけるプルキンエ細胞特異的遺伝子発現を示す顕微鏡
写真（生物の形態）である。図中、ＢはＡの暗視野写
真、ＣはＡの高倍率写真（ＷＭは白質、ＧＬは顆粒細胞
層、黒点線は小脳裂を示す）、Ｄ及びＥは注入部近傍の
矢状切片であり、これらはモノクローナル抗体で免疫的
組織化学法にも染色されている。
【図５】本発明のアデノウイルスを注入したラット小脳
におけるオリゴデンドロサイト特異的遺伝子発現を示す
顕微鏡写真（生物の形態）である。図中、Ａの白点線に
そって注入を行ったことを示し、Ｂ及びＣは注入部近傍
の矢状切片であり、これらはモノクローナル抗体で免疫
的組織化学法にも染色されている。
におけるオリゴデンドロサイト特異的遺伝子発現を示す
顕微鏡写真（生物の形態）である。図中、Ａの白点線に
そって注入を行ったことを示し、Ｂ及びＣは注入部近傍
の矢状切片であり、これらはモノクローナル抗体で免疫
的組織化学法にも染色されている。
Claims (3)
- 【請求項１】 小脳プルキンエ細胞特異的に発現する
非増殖型アデノウイルスベクター。 - 【請求項２】 オリゴデンドロサイト特異的に発現す
る非増殖型アデノウイルスベクター。 - 【請求項３】 請求項１又は２で規定された非増殖型
アデノウイルスベクターを用いた神経特異的遺伝子導入
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7203838A JPH0928378A (ja) | 1995-07-17 | 1995-07-17 | 神経細胞特異的に発現するアデノウイルスベクター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7203838A JPH0928378A (ja) | 1995-07-17 | 1995-07-17 | 神経細胞特異的に発現するアデノウイルスベクター |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0928378A true JPH0928378A (ja) | 1997-02-04 |
Family
ID=16480544
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7203838A Withdrawn JPH0928378A (ja) | 1995-07-17 | 1995-07-17 | 神経細胞特異的に発現するアデノウイルスベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0928378A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6815430B1 (en) | 1999-04-02 | 2004-11-09 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Gene expression base sequences for therapeutic use and drugs for gene therapy |
-
1995
- 1995-07-17 JP JP7203838A patent/JPH0928378A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6815430B1 (en) | 1999-04-02 | 2004-11-09 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Gene expression base sequences for therapeutic use and drugs for gene therapy |
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Legal Events
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