JP2001517080A

JP2001517080A - キメラアデノウイルスコート蛋白質およびその使用方法

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Publication number: JP2001517080A
Application number: JP53987998A
Authority: JP
Inventors: ジー．クリスタル、ロナルド; ファルク−ペダーセン、エリック; ゴール、ジェイソン; コウヴェスディ、イムリ; ジェイ．ウィッカム、トーマス
Original assignee: コーネルリサーチファウンデーション、インコーポレイティッド; ジェンベク、インコーポレイティッド
Priority date: 1997-03-13
Filing date: 1998-03-13
Publication date: 2001-10-02
Also published as: WO1998040509A1; AU6465298A; EP0973927A1; US6153435A; US6127525A; AU745252B2; CA2283628A1

Abstract

(57)【要約】本発明はキメラアデノウイルスコート蛋白質（特に、キメラアデノウイルスヘキソン蛋白質）を提供する。該キメラアデノウイルスコート蛋白質は対応する野生型アデノウイルスコート蛋白質に指向性の中和抗体により認識される能力が低下しているか、あるいは認識され得ないものである。

Description

【発明の詳細な説明】キメラアデノウイルスコート蛋白質およびその使用方法発明の技術分野本発明は、キメラアデノウイルスコート蛋白質およびそれを含む組換えアデノウイルスに関する。特に、本発明は、キメラアデノウイルスヘキソン蛋白質およびキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質を含む組換えアデノウイルスを提供する。このような組換えアデノウイルスは、とりわけ遺伝子治療において使用することができる。発明の背景インビボ（In vivo）遺伝子治療は、核酸を−通常ＤＮＡの形態で−治療目的で投与して標的細胞の遺伝的な能力の範囲を改変する戦略である。これは、いわゆる「治療遺伝子」をコードするアデノウイルスベクターを用いて効率よく達成することができる。治療遺伝子は、所定の疾患もしくは症候群において、根元にある蛋白質欠損を修正もしくは補償する遺伝子か、あるいは特定の遺伝子をダウンレギュレーションし得るもしくはそれがコードする産物のネガティブな効果を打ち消し得る遺伝子であると、一般的に考えられている。治療を必要とする罹患した細胞もしくは組織に１または２以上の組換え遺伝子を導入するために、組換えアデノウイルスベクターが使用されている。Crystal，Science，270，404-410(1 995)に総説されるように、アデノウイルスベクターは高力価（すなわち、１０¹³ ウイルス粒子／ｍｌまで）で生産され得るし、また複製中の細胞だけでなく非複製細胞へ効率よく遺伝子を導入するので、このようなベクターは遺伝子治療に決まって用いられる他のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）よりも好ましい。その上、アデノウイルスベクターは、体細胞遺伝子治療の標的組織が肺である場合にはそれらが通常気道上皮指向性であるということで、並びに他の理由により、さらに好ましい（例えば、Straus，In Adenoviruses，Plenan Press，New York，NY，451-496(1984)) ；Horwitzら.，In Virology，2nd Ed.，Fieldsら.，eds.，Raven Press，New Yo rk，NY，1679-1721(1990);Berkner，BioTechniques，6，616(1988);Chanockら. ，JAMA，195，151(1966);Haj-Ahmadら.，J ．Virol.，57，267(1986);およびBall ayら.，EMBO，4，3861(1985)を参照)。４９のヒトアデノウイルス血清型があり、核酸の比較、ファイバー蛋白質の性質および生物学的特性に基づいて６つの亜属（ＡないしＦ）に類別されている(C rawford-Mikszaら.，J ．Virol.，70，1836-1844(1996))。Ｃ群ウイルス（例えば、血清型２および５、すなわちＡｄ２およびＡｄ５）は特徴がよく分かっている。ヒトの遺伝子治療試験を含めて遺伝子導入研究に現在用いられているのはこれらの血清型である(例えば、Rosenfeldら.，Science，252，431-434(1991);Rosen feldら.，Cell，68，143-155(1992);Zabner，Cell，75，207-216(1993);Crystal ら.，Nat ．Gen.，8，42-51(1994);Yeiら.，Gene Therapy，1，192-200(1994);Ch enら.，Proc ．Natl．Acad．Sci.，91，3054-3057(1994);Yangら.，Nat ．Gen.，7 ，362-369(1994);Zabnerら.，Nat ．Gen.，6，75-83(1994)を参照)。他の群および血清型としては、Ａ群(例えば、血清型１２および３１)、Ｂ群(例えば血清型３および７)、Ｄ群(例えば、血清型８および３０)、Ｅ群(例えば、血清型４）およびＦ群（例えば、血清型４０および４１）(Horwitzら.，上述)が挙げられるが、それらに限定されない。一般的な構造でいえば、現在までに調べられたアデノウイルスはすべて、非エンベロープ型で、直径約６５ないし８０ナノメートルの正二十面体である。アデノウイルスは、コア蛋白質と複合体を形成し、アデノウイルスキャプシドに囲まれた直鎖状の二本鎖ＤＮＡからなる。キャプシドは２５２のキャプソメアからなり、そのうち２４０がヘキソンであり１２がペントンである。ヘキソンキャプソメアはキャプシドに構造と形態を提供し(Pettersson，The Adenoviruses中，pp ．205-270，Ginsberg，ed.，(Plenum Press，New York，NY，1984))、ヘキソン蛋白質のホモ三量体である(Robertsら.，Science，232，1148-1151(1986))。ペントンは、他のヘキソンキャプソメアに結合したペントンベース、およびペントンベースに非共有的に結合しそこから突出しているファイバーからなる。ペントンファイバー蛋白質は３つの同一のポリペプチド（すなわち、ポリペプチドIV）からなる。Ａｄ２ペントンベース蛋白質は、各々５７１アミノ酸の５つの同一のポリペプチド（すなわち、ポリペプチドIII）からなる(Boudinら.，Virology，92，125-138(197 9))。アデノウイルスは細胞に治療遺伝子を導入するエレガントで且つ効率のよい手段を提供する。しかしながら、インビボでの遺伝子導入にアデノウイルスベクターを使用したときに直面する１つの問題は、アデノウイルスキャプシド蛋白質上の抗原性エピトープに対する抗体が生じることである。もし力価が十分であれば、該抗体は、２回以上使用されるベクターの、有効な遺伝子導入ビークルとしての能力を制限し得る。例えば、アデノウイルス２型もしくは５型遺伝子導入ベクターの静脈内投与もしくは（例えば、肺、心臓もしくは腹膜への）局所投与は、１ないし２週間後に投与される同じ血清型ベクターからの発現を妨げる、該ベクター指向性抗体の産生を結果として生じることが、動物研究により実証されている(例えば、Yeiら.，上述;Zabner(1994)，上述;Setoguchiら.，Am ．J．Respir． Cell．Mol．Biol. ，10，369-377(1994);Kass-Eislerら.，Gene Therapy，1，395 -402(1994)；Kass-Eislerら.，Gene Therapy 3，154-162(1996)を参照)。アデノウイルスベクターの使用の多く（例えば、長期の遺伝子治療）は、該ベクターが宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれないため反復投与を必要とするので、このことはアデノウイルスを介した遺伝子治療における欠点である。アデノウイルス指向性の抗体がアデノウイルスにコードされる遺伝子の発現を妨げるかあるいは減じる能力のメカニズムは不明である。しかしながら、該現象は漠然と「中和」と呼ばれ、原因となる抗体は「中和抗体」と呼ばれる。中和抗体を導き出す可能性のある３つのキャプシド構造：ファイバー、ペントンおよびヘキソンがある(Pettersson，上述)。ヘキソン蛋白質および、より程度は低いが、ファイバー蛋白質は、ウイルスの主要な抗原決定基を含み、またウイルスの血清型特異性を決定する(Watsonら.，J ．Gen．Virol.，69，525-535(1988 );Wolfortら.，J ．Virol.，62，2321-2328(1988);Wolfortら.，J ．Virol.，56， 896-903(1985);Crawford-Mikszaら.，上述)。研究者らは、中和抗体を導き出す該蛋白質の領域を明らかにしようと、様々なアデノウイルス血清型のこれらコート蛋白質の構造を調べて比較してきた。Ａｄ２ヘキソン三量体は偽六角形の基部と３つのタワーで形作られた三角形の頂部からなる(Robertsら.，上述;Athappillyら.，J ．Mol．Biol.，242，430-455 (1994))。基台は、２つのしっかりと束ねられた、内部ループで安定化された八本鎖の逆平行βバレルからなる。中和抗体が指向するヘキソン蛋白質の優性領域は、３つのタワーのうちの１つの中にあるループ１および２(すなわち、それぞれＬIもしくｌ１およびＬIIもしくはｌ２)の中にあるらしい。例えば、Kinloch ら（J ．Biol．Chem.，258，6431-6436(1984)）はアデノウイルスヘキソン配列を比較して、型特異的な配列の相違は主としてｌ１およびｌ２ループを包含するアミノ酸残基１２０ないし４７０に集中しているので、ヘキソン上の血清型特異的な抗原決定基はこの領域内に位置すると理論づけた。Toogoodら(J ．Gen．Virol ．73 ，1429-1435(1992))はこの領域由来のペプチドを用いて特異的な抗ループ抗血清を生じさせ、ｌ１の残基２８１〜２９２およびｌ２の残基４４１〜４５５に対する抗体が感染を十分に中和することを確認した。また、Cromptonら（J ．Gen ．Virol. ，75，133-139(1994)）は、これらのループをポリオウイルス由来の中和エピトープを受容するように改変し、得られたアデノウイルスベクターの感染によりポリオウイルスに対する中和免疫が生じることを実証した。さらに最近、ヘキソン蛋白質は、アデノウイルスの血清型間で長さおよび配列が変動する、ループ１および２中の７つの分離した超可変領域（ＨＶＲ１ないしＨＶＲ７）から構成されることがわかった(Crawford-Mikszaら.，上述)。中和抗体の指向可能性のあるファイバー蛋白質の領域に関してはあまり知られていない。しかしながら、ファイバー蛋白質の構造についてはたくさんのデータが入手可能である。三量体ファイバー蛋白質はテール、シャフトおよびノブからなる(Devauxら.，J ．Molec．Biol.，215，567-588(1990))。ファイバーシャフト領域は反復する１５アミノ酸モチーフからなり、２つのβ鎖とβベンドを交互に形作ると信じられている(Greenら.，EMBO J.，2，1357-1365(1983))。ファイバーシャフト領域の全長と１５アミノ酸反復の数はアデノウイルスの血清型間で異なる。ファイバー蛋白質の受容体結合ドメインおよびファイバーの三量体化に必要な配列は、該蛋白質の最後のおおよそ２００アミノ酸にコードされるノブ領域内に局在化し(Henryら.，J ．Virol.，68(8)，5239-5246(1994));Xiaら.，Struct ure ，2(12),1259-1270(1994))。さらに、すべてのアデノウイルス血清型がノブ領域内に位置する１つのタイプの特異的部分を有するらしい(Toogoodら.，上述) 。ヘキソン蛋白質およびファイバー蛋白質にこれらの可能性のあるエピトープが存在するので、遺伝子治療用のベクターとしてアデノウイルスを使用すると困難に遭遇する場合があることは理解できる。したがって、（中和抗体が予め存在し、最初の用量中のアデノウイルスにより命令される遺伝子発現を妨害する場合には）このような中和抗体から免れることができ、何用量も繰り返しアデノウイルスベクターを投与することを可能にする組換えアデノウイルスベクターは、現在の遺伝子治療の方法を顕著に前進させるだろう。したがって、本発明は、組換えアデノウイルス遺伝子治療に関する前記の問題点の少なくともいくつかを克服しようとするものである。特に、本発明の目的は、対応する野生型アデノウイルスコート蛋白質に指向性の抗体（即ち、中和抗体）により認識される能力が低下したか、あるいは認識され得ないキメラコート蛋白質を含む組換えアデノウイルスを提供することである。本発明のこれらのおよび他の目的、および本発明の利点、並びに本発明のさらなる特徴はここに提供された発明の詳細な説明から明らかとなるだろう。発明の簡単な要約本発明は、非天然の（nonnative）アミノ酸配列を含むキメラアデノウイルスコート蛋白質（特にキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質）を提供する。キメラアデノウイルスコート蛋白質は、対応する野生型（すなわち、天然の）コート蛋白質に指向性の中和抗体によって認識されないか、あるいは認識される能力が低下したものである。キメラアデノウイルスコート蛋白質は、対応する蛋白質を含むベクター（アデノウイルスなど）を、繰り返し投与すること、あるいは対応する野生型コート蛋白質を含むアデノウイルスベクターの投与後に投与することを可能にする。それはまた、野生型アデノウイルスコート蛋白質に指向性の中和抗体が予め存在する場合に、キメラ蛋白質を含むベクター（アデノウイルスなど）を投与して遺伝子発現をもたらすことを可能にする。本発明はまた、キメラアデノウイルスヘキソン蛋白質等のキメラアデノウイルスコート蛋白質を含む（および任意でキメラアデノウイルスファイバーおよび／またはペントンベース蛋白質をさらに含む）ベクター、特にアデノウイルスベクター、並びにそのようなベクターの構築方法および使用方法を提供する。図面の簡単な説明図１は、ベクターpAd70-100d1E3.fiber7を構築するのに用いた方法の一覧図である。図２は、ベクターpGBS.59-100(HSF:RGD)の部分的制限地図である。発明の詳細な説明本発明はとりわけ、キメラアデノウイルスコート蛋白質を提供する。キメラアデノウイルスコート蛋白質は非天然のアミノ酸配列を含み、そうして該キメラアデノウイルスコート蛋白質（または該キメラアデノウイルスコート蛋白質を含むベクター）は、対応する野生型アデノウイルスコート蛋白質に指向性の抗体（例えば、中和抗体）によって認識される能力が低下するか、あるいは認識され得ない。キメラアデノウイルスコート蛋白質本発明の「コート蛋白質」は、アデノウイルスペントンベース蛋白質、アデノウイルスヘキソン蛋白質またはアデノウイルスファイバー蛋白質のいずれかである。好ましくは、コート蛋白質は、アデノウイルスヘキソン蛋白質またはアデノウイルスファイバー蛋白質である。ヒトまたは非ヒトアデノウイルスのいかなる血清型もコート蛋白質、あるいはその遺伝子もしくはコード配列のソースとして使用することができる。しかしながら、最適には、アデノウイルスコート蛋白質はＢまたはＣ群アデノウイルスのそれであり、好ましくは、Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ５、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１またはＡｄ４８のそれである。キメラアデノウイルスコート蛋白質（またはキメラアデノウイルスコート蛋白質を含むベクター、例えばアデノウイルスベクター）は、対応する野生型アデノウイルスコート蛋白質に指向性の抗体（例えば、中和抗体）によって認識される能力が低下しているか、あるいは認識され得ない。「中和抗体」は血清から精製されるか、あるいは血清中に存在する抗体である。本明細書で用いる場合、抗体とは単一の抗体であっても複数の抗体であってもよい。もし抗体が野生型コート蛋白質を含むアデノウイルスの感染（すなわち、細胞侵入）またはそれによって命令される遺伝子発現を阻害するか、あるいは抗体が、例えば、アデノウイルスの他のいかなる特性に対するいかなる効果と比べても、野生型コート蛋白質を含むアデノウイルスの感染（すなわち、細胞侵入）またはそれによって命令される遺伝子発現に対して実質的に有害な効果を発揮する場合、抗体は「中和性」である。キメラアデノウイルスコート蛋白質が野生型アデノウイルスコート蛋白質に指向性の中和抗体「によって認識され」(すなわち、それと相互作用し)得るか、あるいはされ得ないことは、当業者に公知のさまざまな手段によって調べることができる。例えば、キメラアデノウイルスコート蛋白質を生じさせるために、野生型アデノウイルスコート蛋白質中に存在する、中和抗体に対する１または２以上のエピトープを除去すると、得られるキメラコート蛋白質は該中和抗体によって認識される能力が低下するか、あるいは認識され得なくなるだろう。また、野生型コート蛋白質指向性の中和抗体との相互作用のこのような能力低下または能力がないことは、中和テスト（例えば、Toogoodら，上述;Crawford-Mikszaら，上述; Mastrangeliら，Human Gene Therapy，7，79-87(1996)を参照）により、あるいは本明細書でさらに説明するようにして実証することができる。一般に、キメラアデノウイルスコート蛋白質（またはキメラアデノウイルスコート蛋白質を含むベクター）が野生型アデノウイルスコート蛋白質指向性の中和抗体によって認識される「能力がない」とは、そのような抗体が該キメラコート蛋白質と相互作用しない、および／またはそのような抗体が、例えばアデノウイルスの他のいかなる特性に対するいかなる効果と比較しても、野生型コート蛋白質を含むアデノウイルスの感染またはそれによって命令される遺伝子発現に対して実質的に有害な効果を示さないことを意味する。野生型アデノウイルスコート蛋白質指向性の中和抗体によって認識される「能力の低下」とは、キメラアデノウイルスコート蛋白質（またはキメラコート蛋白質を含むベクター）が対応する野生型アデノウイルスコート蛋白質に指向性の抗体によって認識される能力が、野生型アデノウイルスコート蛋白質に比べて少しでも低下していることをいう。そのような能力／能力がないことは、特に中和テストによって調べられ、好ましくは、野生型アデノウイルスコート蛋白質指向性の中和抗体によって認識される「能力の低下」は、該中和抗体の存在下で、キメラコート蛋白質を含む組換えアデノウイルスがＡ５４９細胞やＣＯＳ−１細胞（または中和アッセイに適当な他のそのような細胞）などの細胞内で可視的な細胞変性効果（c.p.e.）を引き起こす能力が、該中和抗体が指向する野生型コート蛋白質を含むアデノウイルスに比べて約１０％〜約９９％増大することによって示される。さらに、キメラアデノウイルスコート蛋白質（またはキメラアデノウイルスコート蛋白質を含むベクター）が中和抗体と相互作用する能力が低下しているか、あるいは相互作用し得ないことは、キメラコート蛋白質を含む組換えベクター（例えば、アデノウイルスベクター）による細胞感染性の阻害が、野生型蛋白質を含む組換えベクターと比較して低下するか（約１０％〜約９９％）または全く阻害されないことにより示すことができる。また、アデノウイルスキメラコート蛋白質（またはキメラアデノウイルスコート蛋白質を含むベクター）が中和抗体と相互作用する能力が低下しているか、あるいは相互作用し得ないことは、キメラコート蛋白質を含む組換えベクター（例えば、アデノウイルスベクター）によって命令される遺伝子発現の阻害が、野生型コート蛋白質を含む組換えベクターと比較して低下するか（約１０％〜約９９％）または全く阻害されないことにより示すことができる。これらのテストは、野生型コート蛋白質を含むアデノウイルスの投与後にキメラコート蛋白質を含む組換えベクターを投与したとき、あるいは以前アデノウイルスに遭遇したことがない、もしくはそれを内部移行したことがない宿主（すなわち、未投与の宿主）に該組換えベクターを投与したときに実施することができる。これらの方法は、例えば、後記実施例およびMastrangeli ら，上述，に記載されている。当業者に知られているような他の手段も使用することができる。コート蛋白質は、それが、いわゆる天然のコート蛋白質、すなわち「野生型コート蛋白質」を含む野生型アデノウイルスから単離されるか、あるいはその中で同定されるような蛋白質において通常見出されないアミノ酸残基の配列を含むので、「キメラ」である。したがって、キメラコート蛋白質は「非天然のアミノ酸配列」を含む(または有する)。「非天然のアミノ酸配列」とは、所定の血清型のアデノウイルスの天然コート蛋白質には見出されないいかなるアミノ酸配列（すなわち、成分残基またはその順序のいずれか）も意味し、それは遺伝子発現（すなわち、非天然アミノ酸配列をコードする核酸配列の産生）のレベルでコート蛋白質中に導入されるのが好ましい。一般に、非天然アミノ酸配列は、アミノ酸配列の一部を欠失させる、アミノ酸配列の一部を欠失させて該欠失したアミノ配列をいわゆる「スペーサー領域」で置換する、あるいは未改変のコート蛋白質中にスペーサー領域を導入することによって得ることができる。そのような操作の結果として、対応する野生型アデノウイルスコート蛋白質の機能を実行し得る(あるいは、少なくとも、アデノウイルスに組み込まれた際には適当なビリオン形成を可能とし、且つアデノウイルスを介した細胞侵入を妨げないだろう)、最適には正しいフォールディングを妨げられない、本発明のキメラアデノウイルスコート蛋白質が生じるのが好ましい。また、該操作の結果、異なる抗体に対する新しいエピトープが創製されないことが望ましいが、もちろん、そのようなエピトープがインビボでの遺伝子導入ビークルとしてのキメラコート蛋白質を含むアデノウイルスの使用を妨げない場合を除く。特に、本発明の非天然アミノ酸配列は、野生型アデノウイルスコート蛋白質、特にアデノウイルスヘキソンまたはファイバー蛋白質の領域の欠失を含むことが好ましい。最適には、得られる非天然アミノ酸配列は、対応する野生型アデノウイルスコート蛋白質指向性の中和抗体に対して存在するエピトープの１または２以上が非免疫原性になっているようなものである。望ましくは、欠失する領域は約１〜約７５０アミノ酸、好ましくは約１〜約５００アミノ酸、最適には約１〜約３００アミノ酸を含む。欠失する領域が約２００アミノ酸未満、好ましくは約１００アミノ酸未満、最適には約５０アミノ酸未満のより小さな領域を含むこともまた望ましい。キメラコート蛋白質が複数のそのような欠失を含むこともまた望ましい。したがって、本発明によれば、キメラアデノウイルスコート蛋白質は１または２以上のアミノ酸の改変を含み、そのような改変は１または２以上の領域においてなされる。本発明の好ましい態様においては、非天然アミノ酸配列は野生型アデノウイルスヘキソン蛋白質の１または２以上の領域の欠失を含み、ここでヘキソン蛋白質は、ンク受託番号Ｕ２０８２１の配列によりコードされる)、またはＡｄ５ヘキソン蛋受託番号ｘ７６５５１）である。あるいは、ヘキソン蛋白質は、好ましくはCraw ford-Mikszaらによって報告された蛋白質配列（Ａｄ２ヘキソン[配列番号５２] 、Ａｄ５ヘキソン配列番号５４]）である。特に、Crawford-Mikszaらの配列は、 Crawford-Mikszaらの配列において最初の残基として報告されたアミノ酸残基がＭｅｔではない点、およびＡｄ５ヘキソン配列が「ＴｈｒＴｈｒ」の代わりに「Ｇたものとは異なる。本明細書において使用する際は、アデノウイルスヘキソンアミノ酸残基の番号付けはCrawford-Mikszaらにおけるそれに対応する。望ましくは、欠失の領域は、内部ヘキソン蛋白質配列(「内部」とは蛋白質のＣ −もしくはＮ−末端およびその付近ではないことを意味し、「付近」とは５００アミノ酸以下の距離をいう)、好ましくは、例えばCrawford-Mikszaらに報告されるように超可変領域を含む。特に、キメラヘキソン蛋白質を生じさせるために欠失させる野生型ヘキソン蛋白質の内部領域は、最適にはｌ１ループ全体、好ましくはＡｄ２ヘキソン蛋白質の約第１３１残基〜約第３３１残基［配列番号６］（配列番号５の配列によりコードされる)、または別のアデノウイルス血清型由来の対応領域、例えば、特にＡｄ１、Ａｄ５［配列番号８］（配列番号７の配列によりコードされる)、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ８、Ａｄ１２、Ａｄ１６、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、ＢＡＶ３またはＭＡＶ１由来の対応領域、とりわけCraw ford-Mikszaら，上述，に報告されるようなものを含む。あるいは、キメラヘキソン蛋白質を製造するために欠失させる野生型ヘキソン蛋白質の内部領域は、好ましくはｌ１ループの１または２以上の領域（例えば、より小さな領域）である。最適には、欠失させる領域は超可変領域を含む。望ましくは、欠失させるｌ１ループの１または２以上の領域は、ＨＶＲ１領域、ＨＶＲ２領域、ＨＶＲ３領域、ＨＶＲ４領域、ＨＶＲ５領域およびＨＶＲ６領域からなるこの群より選択される領域（すなわち、超可変領域）である。さらに、欠失させる（あるいは、そうでなければ本明細書に記載するように操作される）野生型蛋白質の領域は、好ましくはヘキソン蛋白質の外表面上に存在する。したがって、ＨＶＲ２領域、ＨＶＲ３領域、ＨＶＲ４領域およびＨＶＲ５領域−それらはそれぞれヘキソン蛋白質の外部に位置する--は欠失または改変のために特に好適である。「ＨＶＲ１領域」は、好ましくはＡｄ２ヘキソン蛋白質の約第１３７アミノ酸〜約第１８８［配列番号１０］(配列番号９の配列によりコードされる)、または別のアデノウイルス血清型由来の対応領域、例えば、特にＡｄ１、Ａｄ３、Ａｄ５［配列番号１２］(配列番号１１の配列によりコードされる)、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ８、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、ＢＡＶ３またはＭＡＶ１由来の対応領域、とりわけCrawford-Mikszaら，上述，に報告されるようなものを含む。「ＨＶＲ２領域」は、好ましくはＡｄ２ヘキソン蛋白質の約第１９４アミノ酸〜約第２０４アミノ酸［配列番号１４］(配列番号１３の配列によりコードされる)、または別のアデノウイルス血清型由来の対応領域、例えば、特にＡｄ１、Ａｄ３、Ａｄ５［配列番号１６］(配列番号１５の配列によりコードされる)、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ８、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、ＢＡＶ３またはＭＡＶ１由来の対応領域、とりわけCrawford-Mikszaら，上述，に報告されるようなものを含む。「ＨＶＲ３領域」は、好ましくはＡｄ２ヘキソン蛋白質の約第２２２アミノ酸〜約第２２９アミノ酸［配列番号１８］(配列番号１７の配列によりコードされる)、または別のアデノウイルス血清型由来の対応領域、例えば、特にＡｄ１、Ａｄ３、Ａｄ５［配列番号２０］(配列番号１９の配列によりコードされる)、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ８、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、ＢＡＶ３またはＭＡＶ１由来の対応領域、とりわけCrawford-Mikszaら，上述，に報告されるようなものを含む。「ＨＶＲ４領域」は、好ましくはＡｄ２ヘキソン蛋白質の約第２５８アミノ酸〜約第２７１アミノ酸［配列番号２２］(配列番号２１の配列によりコードされる) 、または別のアデノウイルス血清型由来の対応領域、例えば、特にＡｄ１、Ａｄ３、Ａｄ５［配列番号２４］(配列番号２３の配列によりコードされる)、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ８、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、ＢＡＶ３またはＭＡＶ１由来の対応領域、とりわけCrawford-Mikszaら，上述，に報告されるようなものを含む。「ＨＶＲ５領域」は、好ましくはＡｄ２ヘキソン蛋白質の約第２７８アミノ酸〜約第２９４アミノ酸［配列番号２６］(配列番号２５の配列によりコードされる)、または別のアデノウイルス血清型由来の対応領域、例えば、特にＡｄ１、Ａｄ３、Ａｄ５［配列番号２８］(配列番号２７の配列によりコードされる)、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ８、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、ＢＡＶ３またはＭＡＶ１由来の対応領域、とりわけCrawford-Mikszaら，上述，に報告されるようなものを含む。特に、欠失させる領域は、Ａｄ２ヘキソン蛋白質のＨＶＲ５領域のちょうど外側の約第２９７アミノ酸〜約第３０４アミノ酸［配列番号３０］(配列番号２９の配列によりコードされる)、または別のアデノウイルス血清型由来の対応領域、例えば、特にAd１、Ａｄ３、Ａｄ５［配列番号３２］(配列番号３１の配列によりコードされる)、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ８、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、ＢＡＶ３また１まＭＡＶ１由来の対応領域、とりわけCrawford-Mikszaら，上述，に報告されるようなものを含むことが好ましい。「ＨＶＲ６領域」は、好ましくはＡｄ２ヘキソン蛋白質の約第３１６アミノ酸〜約第３２７アミノ酸［配列番号３４］(配列番号３３の配列によりコードされる)、または別のアデノウイルス血清型由来の対応領域、例えば、特にＡｄ１、Ａｄ３、Ａｄ５［配列番号３６］(配列番号３５の配列によりコードされる)、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ８、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、ＢＡＶ３またはＭＡＶ１由来の対応領域、とりわけCrawford-Mikszaら，上述，に報告されるようなものを含む。本発明の別の好ましい態様においては、キメラヘキソン蛋白質を生じさせるために欠失させる野生型ヘキソン蛋白質の内部領域は、ｌ２ループ全体、好ましくはＡｄ２ヘキソン蛋白質の約第４２３アミノ酸〜約第４７７アミノ酸［配列番号３８］(配列番号３７の配列によりコードされる)、または別のアデノウイルス血清型由来の対応領域、例えば、特にＡｄ１、Ａｄ３、Ａｄ５［配列番号４０］( 配列番号３９の配列によりコードされる)、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ８、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、ＢＡＶ３またはＭＡＶ１由来の対応領域、とりわけCrawfo rd-Mikszaら，上述，に報告されるようなものを含む。あるいは、キメラヘキソン蛋白質を製造するために欠失させる野生型ヘキソン蛋白質の内部領域は、ｌ２ループの１または２以上のより小さな領域（例えば、超可変領域）を含むことが好ましい。特に、ｌ２ループのより小さな領域はＨＶＲ７領域を含むことが好ましい。「ＨＶＲ７領域」は、好ましくはＡｄ２ヘキソン蛋白質の約第４３３アミノ酸〜約第４６５アミノ酸［配列番号４２］(配列番号４１の配列によりコードされる)、または別のアデノウイルス血清型由来の対応領域、例えば、特にＡｄｌ、Ａｄ３、Ａｄ５［配列番号４４］(配列番号４３の配列によりコードされる)、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ８、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、ＢＡＶ３またはＭＡＶ１由来の対応領域、とりわけCrawford-Mikszaら，上述，に報告されるようなものを含む。特に、欠失させる領域は、Ａｄ２ヘキソン蛋白質のＨＶＲ７領域の約第４６０アミノ酸〜約第４６６アミノ酸（すなわち、この領域の外側に１塩基対延長している）[配列番号４６](配列番号４５の配列によりコードされる)、または別のアデノウイルス血清型由来の対応領域、例えば、特にＡｄ１、Ａｄ３、Ａｄ５［配列番号４８］(配列番号４７の配列によりコードされる)、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ８、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、ＢＡＶ３またはＭＡＶ１由来の対応領域、とりわけCrawford-Mik szaら，上述，に報告されるようなものを含むことが好ましい。同じ考え方で、キメラアデノウィルスヘキソン蛋白質は、望ましくは前記領域の１つまたは両方に欠失を含み(すなわち、ヘキソン蛋白質はｌ１およびｌ２ループの１つまたは両方に欠失を含み)、その欠失はループの全体を構成してもよいし、あるいはヘキソンループの１つまたは両方の中の１または２以上のより小さな領域（例えば、超可変領域）の欠失を含んでもよい。特に、欠失させる領域は、好ましくは配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８、並びに配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８の均等物および保存性の変種からなる群より選択される。「均等物」とは、例えば、アデノウイルスの異なる株で観察されるような、アミノ酸または核酸配列の天然に存在する変種である。保存性の変種とは、結果として１または２以上の保存性のアミノ酸置換を生じるアミノ酸配列の変種である。「保存性のアミノ酸置換」とは、電荷密度、親水性／疎水性、サイズおよび／または立体配置が類似した代替のアミノ酸(例えば、塩基性、すなわちＡｒｇおよびＬｙｓ；脂肪族、すなわちＡｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＭｅｔおよびＶａｌ；芳香族、すなわちＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＨｉｓ；親水性、すなわちＧｌｕ、Ｇｌｎ、ＡｓｎおよびＡｓｐ；ヒドロキシル、すなわちＳｅｒおよびＴｈｒ）によって置換されたアミノ酸である。別の好ましい態様においては、キメラアデノウイルスコート蛋白質（すなわち、特にキメラアデノウイルスファイバーまたはヘキソン蛋白質）の非天然アミノ酸配列は、先に記載したように、野生型アデノウイルスコート蛋白質の１または２以上の領域（特に、野生型アデノウイルスヘキソン蛋白質のｌ１および／またはｌ２ループ、就中、ＨＶＲ１、ＨＶＲ２、ＨＶＲ３、ＨＶＲ４、ＨＶＲ５、ＨＶＲ６および／またはＨＶＲ７領域）の欠失を含み、さらに、該領域が、好ましくは約１〜約７５０アミノ酸、特に約１〜約５００アミノ酸、就中約１〜約３００アミノ酸のスペーサー領域で置換されているものも含む。欠失させ、置換させる領域が約２００アミノ酸未満、好ましくは約１００アミノ酸未満、最適には約５０アミノ酸未満の、より小さな領域を含むこともまた望ましい。キメラコート蛋白質はまた、複数のそのような置換を含んでいることも望ましい。したがって、本発明によれば、キメラアデノウイルスコート蛋白質は、１または２以上のアミノ酸の改変を含み、そのような改変はより小さな領域であってもよい１または２以上の領域においてなされる。前記サイズのスペーサー領域は、例えば、中和抗体がキメラ蛋白質のその特定部位と相互作用する能力を破壊することによって (例えば、中和抗体が相互作用する重大なアミノ酸の空間的並置を変化させることによって)、得られるキメラ蛋白質を非免疫原性にするいかなる欠失もなしに、前記の領域（特に、アデノウイルスヘキソン蛋白質の、ｌ１および／またはｌ２ループあるいは前記ＨＶＲ１、ＨＶＲ２、ＨＶＲ３、ＨＶＲ４、ＨＶＲ５、ＨＶＲ６およびＨＶＲ７領域の１または２以上）の１つに単に挿入することができるのがまた好ましい。最適には、スペーサー領域は、中和抗体に対するエピトープを含む野生型アデノウイルスコート蛋白質（特に野生型アデノウイルスヘキソン蛋白質）アミノ酸配列−それはスペーサー配列の挿入の際に欠失してもしなくてもよい−の非保存性の変種を含む。「非保存性の変種」とは、野生型アデノウイルスコート蛋白質指向性の中和抗体に対するエピトープがキメラアデノウイルスコート蛋白質中に結果として創製または再創製されない、このアミノ酸配列の変種であり、特に、この領域内に１または２以上の非保存性のアミノ酸挿入または置換を結果として生じる、スペーサー領域の変種である。「非保存性のアミノ酸置換」とは、電荷密度、親水性／疎水性、サイズおよび／または立体配置が異なる（例えば、塩基性アミノ酸の酸性アミノ酸への変化、親水性アミノ酸の疎水性アミノ酸への変化など）代替のアミノ酸によって置換されたアミノ酸である。望ましくは、スペーサー領域はキメラアデノウイルスコート蛋白質、特にキメラアデノウイルスヘキソンまたはファイバー蛋白質の機能性、例えば、ヘキソン蛋白質がペントンベース蛋白質または他のヘキソンキャプソメアに結合する能力、あるいはペントンファイバーがペントンベースおよび／または細胞表面受容体に結合する能力を妨げない。そのような機能性はウイルスの生存性によって調べることができる。同様に、野生型コート（例えば、ヘキソンおよび／またはファイバー）蛋白質指向性の中和抗体に対するエピトープが創製および再創製されないことは、後記実施例に記載されるような技術を用いて（例えば、血清や他の液体のようなキャリアー流体中にあってもよい該抗体が、野生型アデノウイルスコート蛋白質には結合するが、キメラアデノウイルスコート蛋白質には結合しないことを確かめることによって）確認することができる。好ましくは、アデノウイルスコート蛋白質中に（すなわち、野生型コート蛋白質への挿入として、あるいは野生型アデノウイルスコート蛋白質の１または２以上の欠失領域を置換するために）組み込まれるスペーサー領域は、一連の極性および／または荷電アミノ酸(例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ等)、あるいは中間の極性を有するアミノ酸（例えば、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ等）を含む。特に、スペーサー領域は配列番号５０の配列(配列番号４９の配列によりコードされる)、並びに配列番号５０の均等物および保存性の変種を含むことが望ましい。あるいは、スペーサー領域は得られるキメラ蛋白質の機能性を妨げないであろう配列番号５０のＦＬＡＧオクタペプチド配列様の他のいかなる配列を含んでもよい。本発明のさらにまた別の好ましい態様においては、野生型アデノウイルスコート蛋白質（特にアデノウイルスヘキソンおよび／またはファイバー蛋白質）の領域が欠失し、別のアデノウイルス血清型の対応するコート蛋白質を含むスペーサー領域で置換される。この態様においては、スペーサー領域は異なるアデノウイルス群のものであることが好ましい。例えば、好ましくはＡｄ２コート蛋白質の領域をＡｄ５またはＡｄ７コート蛋白質（または上記したような他のいかなるアデノウイルス血清型も）で置換することができ、その逆もまた可能である。別のアデノウイルス血清型のコート蛋白質領域を含むそのようなスペーサー領域を、キメラコート蛋白質の対応するコート蛋白質領域に単に挿入することもまた好ましい。この場合、そのような挿入の結果生じる超可変ドメインのサイズを公知の超可変ドメインのサイズに確実に近づけることによって、機能的なキメラヘキソン蛋白質が得られる見込みを増大させることができる。例えば、Ａｄ４０のＨＶＲ１領域はＡｄ２（およびＡｄ５、Ａｄ８等の他のアデノウイルス）のＨＶＲ１領域よりも約３０アミノ酸小さい。したがって、約３０アミノ酸のスペーサー領域をＡｄ４０のＨＶＲ１領域に組み込んでキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質を製造することが好ましい。特に、Ａｄ４０中に存在しないＡｄ２（または他のアデノウイルス）の領域（すなわち、おおよそ第１３８〜第１７４アミノ酸残基）またはその一部をＡｄ４０に導入してキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質を製造することが望ましい。本発明によれば、キメラコート蛋白質の非天然アミノ酸配列は、複数のそのような置換または挿入を含むことが望ましい。アデノウイルスベクターにコート蛋白質を組み込む場合、本明細書においてさらに記載するように、好ましくはあるアデノウイルス血清型のコート蛋白質全体を別のアデノウイルス血清型のコート蛋白質全体で置換することができる。欠失してスペーサー領域で置換されるか、あるいはその中にスペーサー領域が挿入される野生型アデノウイルスヘキソン蛋白質の１または２以上の領域は、いかなる適切な領域であってもよく、望ましくは、ヘキソン蛋白質の欠失に関して上記で記載そた領域の１または２以上を含む。例えば、スペーサー領域が挿入されるか、あるいはスペーサー領域が置き換わる１または２以上の領域は、好ましくはｌ１および／またはｌ２ループの全体、あるいは配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８、並びに配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８の均等物および保存性の変種からなる群より選択される配列を含む。同様に、スペーサー領域自体が（すなわち、挿入および置換のどちらについても）ｌ１および／またはｌ２ループの全体、あるいは配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８、並びに配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８の均等物および保存性の変種からなる群より選択される配列を含むことが好ましい。ファイバー蛋白質もまた、野生型アデノウイルスファイバー蛋白質指向性の抗体から逃れるための、ヘキソン蛋白質の改変について記載したのと同様のやり方で変化させることが好ましい。ファイバー蛋白質の配列およびファイバー蛋白質の改変方法は当業者に知られている(例えば、Xiaら，上述;Novelliら，Virology，18 5 ，365-376(1991)を参照)。ファイバーの操作はアデノウイルスヘキソン蛋白質の改変なしに、あるいはそれと一緒に行うことができる。特に、ファイバー蛋白質は、好ましくはその全体または一部を異なる血清型のアデノウイルス由来のファイバー蛋白質配列で置換することができる。また、好ましくは、中和抗体に対するエピトープを構成するファイバー部位を欠失させる、および／または当該部位に挿入を行って該蛋白質が該抗体と相互作用する能力を破壊することもできる。キメラアデノウイルスコート蛋白質をコードする核酸キメラアデノウイルスコート蛋白質（特にキメラアデノウイルスヘキソンまたはファイバー蛋白質）は、好ましくはＤＮＡレベルで改変がなされた非天然アミノ酸配列を含む。したがって、本発明は、好ましくは、キメラアデノウイルスコート蛋白質をコードする単離および精製された核酸を提供するものである。望ましくは、本明細書で定義されるようなキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質をコードする単離および精製された核酸を提供するものであり、該核酸配列は野生型アデノウイルスコート蛋白質の約１〜約７５０アミノ酸、好ましくは約１〜約５００アミノ酸、最適には約１〜約３００アミノ酸をコードする領域の欠失（または複数のそのような欠失）を含む。欠失する領域が、約２００アミノ酸未満、好ましくは約１００アミノ酸未満、最適には約５０アミノ酸未満をコードする小さな領域であることもまた望ましい。特に、（例えば、アデノウイルスヘキソン蛋白質の）欠失は、最適にはｌ１および／またはｌ２ループの全体、あるいは配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５および配列番号４７からなる群より選択される配列、あるいはＡｄ１、Ａｄ３、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ８、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、ＢＡＶ３またはＭＡＶ１由来の対応領域を含む配列、特にCrawfo rd-Mikszaら，上述，に記載されるようなものを含む。本発明はまた、好ましくは、本明細書で定義されるようなキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質をコードする単離および精製された核酸を提供するものであり、該核酸配列はｌ１および／またはｌ２ループの全体をコードする配列、あるいは配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５および配列番号４７、あるいはＡｄ１、Ａｄ３、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ８、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、ＢＡＶ３またはＭＡＶ１由来の対応領域を含む配列、特にCrawford-Mikszaら，上述，に報告されるようなもの、の均等物および保存性のあるように改変された変種からなる群より選択される１または２以上の配列の欠失を含む。核酸配列に関して、「均等物」とは、アデノウイルスの異なる株に存在するような核酸配列における変種であり、それは結果としてアミノ酸レベルでの変種を生じることもあれば生じないこともある。アミノ酸レベルでの変種を結果として生じないのは、例えば、トリプレットコードにおける縮重によることがあり得る。「保存性のあるように改変された変種」とは、１または２以上の保存性のあるアミノ酸置換を結果として生じる核酸配列における変種である。これと比較して、「保存性のないように改変された変種」とは、１または２以上の保存性のないアミノ酸置換を結果として生じる核酸配列における変種である。別の好適な態様においては、本発明はキメラアデノウイルスコート蛋白質をコードする単離および精製された核酸を提供するものであり、該核酸配列は、野生型アデノウイルスコート蛋白質の約１〜約７５０アミノ酸、好ましくは約１〜約５００アミノ酸、最適には約１〜約３００アミノ酸をコードする欠失領域の、スペーサー核酸領域（すなわち、前記「スペーサー領域」をコードする核酸配列）による置換（または複数のそのような置換）をさらに含む。欠失し、置換される領域が、約２００アミノ酸未満、好ましくは約１００アミノ酸未満、最適には約５０アミノ酸未満をコードする小さな領域を含むこともまた望ましい。好ましくは、スペーサー核酸領域は、ＦＬＡＧオクタペプチドコード配列[配列番号４９]、並びに配列番号４９の均等物および保存性のあるように改変された変種を含む。同様に、特定のアデノウイルス血清型の１または２以上のコート蛋白質コード領域（特にヘキソン蛋白質コード領域）を、別のアデノウイルス血清型のコート蛋白質コード領域（特にヘキソン蛋白質コード領域）で置換するスペーサー核酸領域を用いることができる。したがって、キメラアデノウイルスヘキソン蛋白質中に存在するスペーサー核酸領域は、好ましくはｌ１および／またはｌ２ループの全体をコードする配列、あるいは配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５および配列番号４７、あるいはＡｄ１、Ａｄ３、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ８、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４０、Ａｄ４１、Ａｄ４８、ＢＡＶ３またはＭＡＶ１由来の対応領域を含む配列、特にCrawford-Mikszaら，上述，に報告されるようなもの、並びにこれらの配列の均等物および保存性のあるように改変された変種からなる群より選択される。キメラアデノウイルスコート蛋白質に関して上記したように、スペーサー核酸領域（または複数の該領域）をいかなる欠失もなしに単にコート蛋白質に組み込むことができる。上記のキメラアデノウイルスコート蛋白質を製造するためにこれらの操作を行うことができる。そのようなキメラアデノウイルスコート蛋白質の作製手段（すなわち、ＤＮＡレベルまたは蛋白質レベルで保存性または非保存性の変種を導入することによる）は当該技術分野で知られ、後記実施例に記載され、また、種々の市販のキットおよびベクター（例えば、New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA;Clontech ，Palo Alto，CA;Stratagene，LaJolla，CA，等）によって達成することができる。特に、Stratagene社のExSite^TMＰＣＲに基づく部位特異的変異誘発キットおよびChameleon^TM二本鎖部位特的変異誘発キットをそのような変異を導入するのに使用することができる。さらに、そのような変異を評価する手段（例えば、野生型ヘキソン蛋白質指向性の抗体によって中和されない能力に及ぼす効果に関して）は、本明細書の実施例に記載されている。したがって、本発明は、野生型アデノウイルスコート蛋白質（例えば、野生型アデノウイルスヘキソン蛋白質）をコードするアデノウイルスゲノムを取得し、約１〜約７５０アミノ酸を含むキメラアデノウイルスコート蛋白質（特にキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質）の１または２以上の領域を、対応する核酸コード配列を改変することにより欠失させることを含む、キメラアデノウイルスコート蛋白質、特にキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質の好適な作製手段を提供する。同様に、本発明は、野生型アデノウイルスコート蛋白質をコードするアデノウイルスゲノムを取得し、約１〜約７５０アミノ酸を含むキメラアデノウイルスコート蛋白質の１または２以上の領域を、対応するコード配列を改変することにより欠失させ、約１〜約３００アミノ酸を含むスペーサー領域で該欠失領域を、該スペーサー領域をコードする核酸領域（すなわち「スペーサー核酸領域」）を導入することによって置換することを含む、キメラアデノウイルスコート蛋白質（特にキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質）の作製方法を提供する。あるいは、スペーサー領域をいかなる欠失もなしにコート蛋白質（特にヘキソン蛋白質）に単に組み込むことも好ましい。最適には、スペーサー核酸領域は野生型アデノウイルスコート蛋白質のアミノ酸配列の非保存性の変種をコードする。天然のコート蛋白質コード配列を置換するのに用いられるＤＮＡのサイズは、例えば、コート蛋白質のフォールディングの妨害または複合体（例えば、ペントンベース／ヘキソン複合体）もしくはビリオンへのコート蛋白質の正しくないアッセンブリによって束縛されるかもしれない。１５０以下のアミノ酸をコードするＤＮＡがキメラコート蛋白質遺伝子配列における挿入／置換に特に好ましく、５０アミノ酸以下をコードするＤＮＡがいっそう好ましい。簡単に言えば、変異誘発方法は、アデノウイルスコート蛋白質の１または２以上の領域を欠失させる、および／またはアデノウイルスコート蛋白質中に異なるアミノ酸配列を有する１または２以上の領域を、特にＤＮＡ配列を操作することによって、挿入することを含む。アデノウイルスコート蛋白質ＤＮＡ配列のそのような操作を行うのにいくつかの方法を利用することができ、さらにこれらの方法を組み合わせて使用することもできる。選択の方法は当業者に公知の要素、例えば、操作されるＤＮＡ領域のサイズに依る。例えば、（さらに配列中に導入することができる）便利な制限部位を用いてＤＮＡのセグメント、あるいは遺伝子もしくはコード配列全体を導入または除去することができる。あるいは、他の変異誘発方法は、一本鎖の標的ＤＮＡの領域にミスマッチを有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、例えばＴ７ＤＮＡポリメラーゼまたは二本鎖のヘテロ二重鎖を製造する他のそのような手段を用いてプライマー伸長を行い、ミスマッチを有するオリゴヌクレオチドが組み込まれた変異鎖を、鋳型として、またさらなる操作において使用するために、親の非変異鎖から単離することを含む。変異鎖は当業者に公知の種々の選択手段（例えば、Kunkelら，Methods Enzymol.，204 ，125-139(1991)，およびChameleon^TMキットに使用されている基礎をなす方法論を参照）を用いて親鎖から分離することができる。あるいは、例えば、半メチル化ＤＮＡ分子の非メチル化鎖にニックを入れる酵素（例えば、HpaII，MapI およびSau3AI）を用い、且つ５−メチル−ｄＣＴＰを用いて変異鎖を伸長させて該鎖をこれらの酵素による開裂に耐性にすることにより、親鎖を選択的に分解することができる。同じ考え方で、例えば、ExSite^TMキットに包含されるアプローチのような、完全にＰＣＲに基づくアプローチを変異作製に使用することができる（例えば、Kunkel，Proc ．Natl．Ac ad．Sci. ，82，488-492(1985);Costaら，Nucleic Acids Res.，22，2423(1994) を参照)。より一般的には、アミノ酸の置換または欠失は、一方または両方のプライマーに適当なミスマッチを組み込むことによってＰＣＲの間に導入することができる。いったんキメラコート蛋白質配列が作られると、例えば５’および３ ’プライマーを用いたＰＣＲ増幅により、あるいは便利な制限部位を使用して、該配列をコードする核酸断片をさらに単離することができる。キメラヘキソン蛋白質を含むベクター本発明において「ベクター」とは、その用語が当業者に理解されている通り遺伝子導入のための乗り物（ビークル）であり、ウイルス、プラスミド等を含む。好適なベクターはアデノウイルス、特にアデノウイルス科のウイルス、望ましくはマストアデノウイルス属（例えば、哺乳類のアデノウイルスから構成される）またはアビアデノウイルス属（例えば、鳥類のアデノウイルスから構成される）のウイルスである。このようなアデノウイルス（または他のウイルスベクター）は、細胞侵入をもたらすそれ自身の手段によって（例えば、受容体を介したエンドサイトーシスによって）導入されるか、あるいはプラスミドと同様に、すなわちその核酸の形態で、例えばリポソームを用いて核酸を導入したり、細胞内にＤＮＡをマイクロインジェクションもしくは形質転換することにより、細胞に導入することができる。本明細書では、遺伝子導入に使用することができる核酸ベクター、特にアデノウイルス核酸ベクターを「導入ベクター」という。そのような核酸ベクターには、例えばアデノウイルスベクターの構築において使用される中間的プラスミドベクターもまた含まれる。他のいかなる血清型のアデノウイルスベクター（例えば、血清型１２および３１を含むＡ群、血清型３および７を含むＢ群、血清型８および３０を含むＤ群、血清型４を含むＥ群、並びに血清型４０および４１を含むＦ群、並びに前述した他のＡｄベクター）も使用することができるが、望ましくは、アデノウイルスベクターは血清型Ｃ群アデノウイルス、好ましくはＡｄ２またはＡｄ５ベクターである。遺伝子導入に使用されるアデノウイルスベクターは複製能力があってもよい。あるいは、アデノウイルスベクターはウイルス複製を欠損させる少なくとも１つの改変をその中に有する遺伝的材料を含むことができる。アデノウイルスの該改変としては、ＤＮＡセグメントの付加、ＤＮＡセグメントの再構成、ＤＮＡセグメントの欠失、ＤＮＡセグメントの置換、あるいはＤＮＡ損傷の導入が挙げられるがそれらに限定されない。ＤＮＡセグメントは小さくて１ヌクレオチド、大きくて３６キロ塩基対(すなわち、アデノウイルスゲノムのおよその大きさ)、あるいはアデノウイルスビリオンにパッケージングすることができる最大量（すなわち、約３８ｋｂ）と同等であってよい。Ｃ群アデノウイルスゲノムの好適な改変としては、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３および／またはＥ４領域における改変が挙げられる。同様に、アデノウイルスベクターは、例えば原核もしくは真核の発現ベクターを含むように、共組込み体、すなわち、アデノウイルス配列と他のウイルス配列、特にバキュロウイルス配列、あるいはプラスミド配列のような他の配列との連結であってもよい。アデノウイルスベクター（特に複製欠損アデノウイルスベクター）に関して、そのようなベクターは完全なキャプシド（すなわち、アデノウイルスゲノムのようなウイルスゲノムを含む）または空のキャプシド（すなわち、ウイルスゲノムがないか、あるいは、例えば物理的もしくは化学的手段によって分解された）を含むことができる。キャプシドはさらに当該分野で公知の手段（例えば、Curiel ら，Human Gene Therapy，3，147-154(1992)）によりその表面に結合させた核酸を含むことができ、あるいは、例えばバイスタンダー核酸のアデノウイルスを介した取り込み（例えば、ＰＣＴ国際出願ＷＯ９５／２１２５９号）により非結合性の核酸を導入することができる。同じ考え方で、アデノウイルスをその核酸配列（すなわち、ＤＮＡ）の形態で導入する方法が利用できるので、ベクター（すなわち、導入ベクター）も同様に、キャプシド蛋白質のようないかなる付随の蛋白質もなしに、またいかなるエンベロープ脂質もなしに、ＤＮＡを含むことができる。ＤＮＡのＲＮＡコピーを作る技術（例えば、インビトロ（in vitro）転写）が利用できるので、また、ＲＮＡウイルスもベクターもしくは導入ベクターとして使用することができるので、導入ベクターはまたＲＮＡを含むことができる。したがって、本発明によれば、ベクターはキメラアデノウイルスコート蛋白質を含む（および、さらにコードしてもよい）が、導入ベクターは通常キメラアデノウイルスコート蛋白質（特にキメラアデノウイルスへキソンおよび／またはファイバー蛋白質）をコードする。これに基づけば、本発明は、本発明のキメラコート蛋白質（特にキメラヘキソンおよび／またはファイバー蛋白質）を含むアデノウイルスベクターを提供する。好ましくは、そのようなベクターは上述のようなキメラアデノウイルスコート蛋白質（特にキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質および／またはキメラアデノウイルスファイバー蛋白質）を含む。あるいは、ベクターは好ましくは野生型ファイバー蛋白質を欠き、例えば、ベクターは、切り詰めた、すなわち機能的でないファイバー蛋白質をコードするか、あるいはファイバー蛋白質を翻訳することができない。そのようなファイバーの変異およびファイバーの変異を導入する手段は当業者に知られている(例えば、Falgoutら，J ．Virol.，62，622-625(1988) を参照)。もちろん、キメラアデノウイルスコート蛋白質は、得られるアデノウイルスベクターが対応する野生型コート蛋白質指向性の中和抗体によって認識される能力が低下するか認識され得ないように、あるアデノウイルスベクターの天然の（すなわち、野生型）ヘキソンおよび／またはファイバー蛋白質が、異なるアデノウイルス血清型のヘキソンおよびまたはファイバーアミノ酸配列で置換されたコート蛋白質を含む。この置換は、上述のように、ヘキソンおよび／またはファイバーアミノ酸配列の全体を含んでもよいし、一部だけを含んでもよい。両方の蛋白質（例えば、単一のアデノウイルスにおいて）を操作してもよいし、単一のキメラアデノウイルスコート蛋白質のみを使用して、残りのコート蛋白質は野生型であってもよい。本発明のベクター（導入ベクターを含む）は、さらなる配列および変異、例えばコート蛋白質コード配列自体の中に生じ得るものを含むことが好ましい。特に、本発明のベクターは、パッセンジャー遺伝子またはパッセンジャーコード配列をコードする核酸を含むことがさらに好ましい。「核酸」とはポリヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。「遺伝子」とは蛋白質またはＲＮＡ分子をコードするあらゆる核酸配列である。遺伝子はコード配列に加えて任意のいかなる非コード配列を含むが、「コード配列」はいかなる非コード（すなわち、調節）ＤＮＡも含まない。「パッセンジャー遺伝子」または「パッセンジャーコード配列」は、通常はベクター（例えば、導入ベクター）中に存在せず、本発明によりベクター中にサブクローニングされ、且つ宿主細胞へ導入すると、細胞内環境において識別できる変化（例えば、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、リボ核酸 (ＲＮＡ)、ペプチドまたは蛋白質のレベルの増加、あるいはそれらの生産または分解速度の変化）を伴うあらゆる遺伝子である。「遺伝子産物」とは、所定の遺伝子またはコード配列から転写された、未だ翻訳されていないＲＮＡ分子(例えば、ｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ)、あるいは所定の遺伝子またはコード配列より転写された、ｍＲＮＡ分子から翻訳されたポリペプチド鎖（すなわち、蛋白質またはペプチド）のいずれかである。遺伝子あるいはコード配列は、もし該分子に沿う塩基配列が天然に見出される遺伝子あるいはコード配列を有する配列から変化していれば、すなわち、該塩基配列が天然に通常見出されないものであれば、「組換え体」である。本発明によれば、遺伝子またはコード配列は天然のものであってもよく、または全体または部分的に合成で作ることができ、ゲノムＤＮＡあるいは相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を含むことができ、ＤＮＡあるいはＲＮＡのどちらか一方の形態で提供され得る。非コード配列あるいは調節配列にはプロモーター配列が包含される。「プロモーター」はＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、それによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列である。「エンハンサー」は近傍の遺伝子の転写を刺激または阻害するＤＮＡのシス作動性エレメントである。転写を阻害するエンハンサーはまた、「サイレンサー」とも呼ばれる。エンハンサーは、それがいずれの方向においても、数キロ塩基対までならその距離を越えて、転写される領域の下流の位置からでさえも機能し得るという点で、プロモーター中にのみ見出される配列特異的ＤＮＡ結合蛋白質のためのＤＮＡ結合部位（「プロモーターエレメント」とも呼ばれる）とは異なる。本発明によれば、プロモーターがコード配列の転写を指示することが可能な場合には、該コード配列は該プロモーターに「機能的に連結している」(例えばコード配列およびプロモーターの両方がパッセンジャー遺伝子を構成している場合)。従って、「パッセンジャー遺伝子」はいかなる遺伝子であってもよく、望ましくは治療遺伝子もしくはリポーター遺伝子のどちらかである。好ましくは、パッセンジャー遺伝子はベクターがインターナリゼーションされた細胞内で発現し得る。例えば、該パッセンジャー遺伝子はリポーター遺伝子、すなわち何らかのやり方で細胞内で検出することができる蛋白質をコードする核酸配列を包含し得る。該パッセンジャー遺伝子はまた、治療遺伝子、例えばＲＮＡまたは蛋白質のレベルでその効果を発揮する治療遺伝子を包含し得る。同様に、例えば嚢胞性繊維症の治療のための嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス調節因子ｃＤＮＡのように、導入される治療遺伝子によってコードされる蛋白質を遺伝病の治療に使用することができる。治療遺伝子によってコードされる蛋白質は、結果的に細胞を殺すことによってその治療効果を発揮することができる。例えば、ジフテリア毒素Ａ遺伝子の発現のように、遺伝子発現そのものが殺細胞に導くか、あるいは遺伝子発現により、細胞をある特定の薬物の殺作用に選択的に感受性となるようにすることができる(例えばＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子の発現により、細胞はアシクロビル、ガンシクロビルおよびＦＩＡＵ（１−（２-デオキシ−２−フルオロ −β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル）を含めた抗ウイルス性化合物に感受性となる)。さらに、治療遺伝子は、例えばアンチセンスメッセージもしくはリボザイムをコードすることによつて、スプライシングや３’プロセッシング（例えばポリアデニル化）に影響することによって、あるいは細胞内での別の遺伝子発現レベルに影響することで作用する蛋白質をコードすることによって( すなわち、ここでは遺伝子発現は、転写開始からプロセスされた蛋白質の生産までの全ての工程を含めるものと広く解釈されている)、おそらくはとりわけｍＲＮＡ蓄積速度の変化、ｍＲＮＡ輸送の変化、および／または転写後調節の変化を仲介することによって、ＲＮＡレベルでその効果を発揮させることができる。従って、「治療遺伝子」なる語の使用はこれらの、ならびに遺伝子治療としてより普通に言及され当業者に知られている他のいかなる態様をも包含すべく意図されるものである。同様に、該組換えアデノウイルスは、遺伝子治療に、または所定の細胞あるいは組織におけるインビトロまたはインビボでの遺伝子（例えばリポーター遺伝子）の発現の効果を調べるために、あるいは診断目的に使用することができる。また、パッセンジャーコード配列をベクターに使用することができる。そのようなコード配列は、たとえ機能的な遺伝子産物がベクター配列から翻訳され得なくとも、さまざまな目的に用いることができる。例えば、該コード配列は、組換え反応の基質として、例えば該配列を宿主細胞ゲノムまたは細胞内にあるベクターと組み換えるのに使用することができる。該コード配列はまた、アンチセンスアプローチに適当なように「アンチコード配列」であってもよい。該コード配列を用いる他の手段は当業者に知られているだろう。したがって、本発明はキメラヘキソン蛋白質および／またはキメラファイバー蛋白質を含む組換えアデノウイルス、好ましくは特定の細胞内で発現し得る１または２以上のパッセンジャー遺伝子をさらに含む組換えアデノウイルスを提供する。該組換えアデノウイルスは、本発明に従ってベクター、特に導入ベクター、好ましくはウイルス（とりわけアデノウイルス）またはプラスミド導入ベクターを用いて作製することができる。そのような導入ベクターは、前述の通りキメラアデノウイルスヘキソンおよび／またはファイバー遺伝子配列を含むことが好ましい。同様に、そのような導入ベクターの構築手段は当業者に知られている。例えば、便利な制限部位を用いてベクター内にキメラアデノウイルスコート蛋白質遺伝子配列を簡単に連結することができる。あるいは、野生型アデノウイルス遺伝子配列をベクターにサブクローニングした後に、該配列に変異を誘発してキメラコート蛋白質配列を創製してもよい。同様に、発現並びにペントンベースの結合および他の生化学的性質の評価のために、キメラコート蛋白質遺伝子配列を、標準的な分子的・遺伝学的技法によって導入ベクターからバキュロウイルスまたは適切な原核もしくは真核発現ベクター（例えば、ウイルスもしくはプラスミドベクター）に移すことができる。したがって、本発明はまた、前記キメラアデノウイルスコート蛋白質遺伝子配列を含む組換えバキュロウイルス並びに原核および真核発現ベクターを提供するが、それらは、アデノウイルスベクターの核酸形態（すなわち、アデノウイルス導入ベクター）とともに、本発明書において定義されるような「導入ベクター」である。アデノウイルスベクターからバキュロウイルスまたは原核もしくは真核発現ベクターへキメラ遺伝子を移すことによって、高い蛋白質発現を達成することができる(全蛋白質のおよそ５〜５０％がキメラ蛋白質である)。同様に、アデノウイルスベクター（例えば、ビリオンすなわちウイルス粒子）は導入ベクターを用いて製造される。例えば、本発明のキメラコート蛋白質を含むアデノウイルスベクターは、アデノウイルスのレフトアーム由来の配列を含むベクターとアデノウイルスのライトアーム由来の配列を含むベクター（ここで、それらの配列間にはオーバーラップする領域がある）とを、細胞、例えば２９３細胞に導入することにより構築することができる。後記実施例に記載するように、この方法論の結果、該配列間での組換えが起こり、それぞれのベクターの一部、特にキメラコート蛋白質配列を含む領域を含有するベクターが生じる。したがって、本発明はまた、好ましくは野生型アデノウイルスヘキソンおよび／またはファイバー蛋白質指向性の中和抗体により認識される能力が低下するか、あるいは認識され得ないアデノウイルスベクターの構築方法を提供する。この方法は、ベクターのコート蛋白質（すなわち、野生型アデノウイルスヘキソンおよび／またはファイバー蛋白質）を対応する本発明のキメラアデノウイルスコート蛋白質で置換して組換えアデノウイルスベクターを製造することを含む。コート蛋白質キメラ含有粒子は標準的な細胞株、例えば、現在アデノウイルス用に使用されている細胞株内で製造される。ファイバー遺伝子を欠くかあるいは短縮されたバージョンのファイバー蛋白質を有する欠失変異株、例えばH2dl802 、H2dl807、H2dl1021（Falgoutら，上述）を、他のファイバー変異株がそうであるように、ベクター構築に同様に使用することができる。無ファイバー粒子は安定で且つ細胞に結合して感染させる能力があることがわかっている(Falgoutら，上述)。使用例および利点本発明は対応する野生型コート蛋白質指向性の中和抗体により認識される能力が低下するか、あるいは認識され得ないキメラコート蛋白質、並びにそれを含有するベクター（導入ベクターを含む）を提供する。（キメラヘキソンおよび／またはファイバー蛋白質などの）キメラコート蛋白質は多くの用途、例えば、キャプシドの構造およびアッセンブリ、並びにキャプソメアの他の蛋白質との結合をインビトロで研究するための道具としての用途を有する。キメラコート蛋白質を含むベクター（例えば、導入ベクター）を株の製造、例えばアデノウイルスの組換え株の製造に使用することができる。同様に、そのようなベクター、特にアデノウイルスベクターを遺伝子治療に使用することができる。特に、本発明のベクターは、矯正ＤＮＡ、すなわち欠損するか損なわれた機能をコードするＤＮＡ、あるいは、例えば細胞内でのみ活性のある細胞毒素をコードするＤＮＡのような慎重な殺傷剤を標的細胞に送達することによって、数多くの疾患のいずれでも治療するのに用いることができる。このような治療の対象となり得る疾患としては、癌(例えば、黒色腫、膠腫または肺癌)、遺伝病(例えば、嚢胞性線維症、血友病または筋ジストロフィー)、病原性の感染(例えば、ヒト免疫不全ウイルス、結核または肝炎)、心臓病（例えば、壊死組織に再灌流させるための血管形成術または血管新生促進の後の妨害的再狭窄）および自己免疫疾患（例えば、クローン病、大腸炎または関節リウマチ）が挙げられるがそれらに限定されない。特に、矯正ＤＮＡおよび／またはアデノウイルスベクターの反復投与を必要とする、したがって現在のアデノウイルスを介した遺伝子治療へのアプローチでは最適とはいえない疾患、障害または病態を治療するのに遺伝子治療を行うことができる。さらに、そのようなベクター、特にアデノウイルスベクターを、遺伝子治療の方法としてではなく診断または調査目的で細胞に材料を送達するのに使用することができる。特に、本発明のキメラアデノウイルスコート蛋白質を含むベクターは、調査および／または診断を目的としてインビトロまたはインビボで遺伝子を送達するのに用いることができる。例えば、いわゆる治療遺伝子を導入する代わりに、リポーター遺伝子またはある種のマーカー遺伝子を導入することができる。マーカー遺伝子およびリポーター遺伝子は、例えば細胞分化および細胞死の研究において有用であり、また、診断目的でも有用となる可能性がある。さらに、β−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子、グリーン・フルオレセント・プロテイン（ＧＦＰ）をコードする遺伝子またはβ−グルクロニダーゼ遺伝子などの標準的なリポーター遺伝子を、例えば生存する宿主内でのアッセイの手段として、あるいは、例えばターゲッティングされた細胞除去の手段として、インビボで使用することができる(例えば、Minde nら，BioTechniques，20，122-129(1996);Youvan，Science，268，264(1995);合衆国特許第5,432,081号;Deonarainら，Br ．J．Cancer，70，786-794(1994)を参照)。同様に、特定の蛋白質をインビボで生産する手段として宿主を基本的に使用するのに、遺伝子を導入することが望ましいだろう。このような方針に沿って、トランスジェニック動物が、例えばトランスジェニックウシ種の牛乳中の組換えポリペプチド生産に使用されている(例えば、ＰＣＴ国際出願WO 93/25567号)。インビボでの蛋白質生産のために行われる遺伝子導入に本発明のアデノウイルスを使用することは、そのような使用が野生型アデノウイルスベクターを使用するのに比べて免疫応答を(ないわけではないとしても)低減させるという点でさらに有利である。遺伝子導入のための他の「非治療的」理由として、動物モデルを用いたヒト疾患の研究（例えば、それぞれ、腫瘍発生研究のための、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子のノックアウトを含むトランスジェニックマウスまたは他のトランスジェニック動物の使用、グルコース寛容を損なわせるためのトランスジェニックモデル並びにグルコース代謝の研究およびアルツハイマー病の病原論のためのヒトアルツハイマーアミロイド前駆体蛋白質モデルの使用など）が挙げられる。さらに、キメラアデノウイルスコート蛋白質を含み、上記のように使用されるアデノウイルスベクターは、慣用の手段により単離精製することができる点で有利である。例えば、キメラコート蛋白質を含むアデノウイルスを増殖させるために特殊な細胞株を作製する必要はおそらくないだろう。前記の使用例および利点の列挙は決して包括的なものではなく、本発明が、本明細書の開示中には明白に挙げてはいないが、そこから必然的に生み出されるようなさらなる用途をも包含することを意図するものである。投与手段本発明のベクターおよび導入ベクターは、インビトロあるいはインビボのどちらにおいても細胞と接触すべく使用することができる。本発明によれば、「接触させること」は、それによってベクターが細胞内に導入される任意の手段を包含する；該方法はいかなる特定の導入手段にも依存するものではなく、またそのように解釈されるものでもない。導入手段は当業者にはよく知られたものであり、また本明細書に例示されるものである。したがって、例えば、インビトロ(例えばエクスビボ（ex vivo）型の遺伝子治療方法、または組織培養研究において)、あるいはインビボ（エレクトロポレーション、形質転換、形質導入、接合、三親交配(triparental mating)、（共）トランスフェクション、（共）感染、ＤＮＡをコーティングしたマイクロプロジェクタイルの高速射撃、リン酸カルシウムとのインキュベーション−ＤＮＡ沈澱、単細胞への直接マイクロインジェクション等による）において導入することができる。同様に、該ベクターをカチオン性脂質（例えばリポソーム）を用いて膜融合により導入することができる。そのようなリポソームは商業的に入手可能である(例 Gaithersburg，MDより供給される)。さらに、インビボでの導入能力が増大した、および／または毒性が減ぜられたリポソーム（例えばＰＣＴ国際出願WO 95/21 259号およびそこで論評された文献を参照）を、本発明に使用することができる。他の方法もまた利用でき、当業者には公知である。本発明によれば「宿主」は本発明のベクターが導入し得る任意の宿主を包含するものであり、すなわち両生類、鳥類、昆虫類、爬虫類、または哺乳類を含む（これらに限定はされない）動物を包含するものである。最適には宿主は哺乳類であり、例えばげっ歯類、チンパンジー、尾のあるサル、尾なしサル、ゴリラ、オラウータンまたはテナガザルのような霊長類、ネコ科動物、イヌ科動物、反芻動物あるいはブタのような有蹄類および特にヒトである。同様に、「細胞」はアデノウイルスベクターを宿主から導入することができる任意の細胞(または細胞の集合)、例えば上皮細胞を包含する。任意の器官または組織または成分細胞をベクター送達のためにターゲッティングすることができる。好ましくは、使用される器官／組織／細胞は、循環器系(例えば、心臓、血管または血液)、呼吸器系(例えば、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支、肺 )、消化器系(例えば、口、咽頭、食道、胃、腸、唾液腺、膵臓、肝臓、胆嚢)、泌尿器系(例えば、腎臓、尿管、膀胱、尿道)、神経系（例えば、脳および脊髄、眼などの特殊な感覚器官）および外皮系（例えば、皮膚）のものである。いつそう好ましくは、ターゲッティングされる細胞は心細胞、血管細胞、肺細胞、肝細胞、胆嚢細胞、膀胱細胞および眼細胞からなる群より選択される。したがって、本発明はまた、好ましくは細胞を遺伝学的に改変する方法を提供する。この方法は、好ましくは、細胞にキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質および／またはキメラアデノウイルスファイバー蛋白質を含むベクターを接触させることを含み、ここで該ベクターはアデノウイルスベクターであることが望ましい。好ましくは、該方法により本発明のベクターを含む宿主細胞が生産される。さらに、細胞を遺伝学的に改変する本発明の方法は、遺伝子治療や診断もしくは研究のための投与に使用することができる。インビボでのこの方法の適用は、最適には、遺伝子治療を必要とする患者（例えば、疾患、病態または障害に苦しむ患者）に治療上有効な量の本発明の組換えアデノウイルスベクターを投与することを含む。好ましくは、この方法は、進行中の遺伝子治療法の一部として使用することができ、例えば、キメラアデノウイルスコート蛋白質を含むベクター（例えば、組換えアデノウイルスベクター）は、対応する野生型コート蛋白質もしくは異なるアデノウイルス血清型のコート蛋白質を含む治療上有効な量のベクターを投与した後に（例えば、約１週間〜約２ヶ月後に）投与される。あるいは、キメラアデノウイルスコート蛋白質を含むベクターを遺伝子送達における最初の試みとして使用することもできる。当業者には本発明のベクター（特にアデノウイルスベクター）を遺伝子治療( 例えば、Rosenfeldら(1991)，上述;Jaffeら，Clin ．Res.，39(2)，302A(1991)； Rosenfeldら，Clin ．Res.，39(2)，311A(1991a);Berkner，上述を参照)、化学療法、ワクチン接種、診断および／またはさらなる研究の目的で動物に投与するのに適切な方法を利用することができることがわかるだろう。２つ以上の経路が投与に使用できるが、ある特定の経路が別の経路よりも迅速でより効果的な反応を提供し得る。例えば、局所または全身送達は、体腔への製剤の適用または点滴、エアロゾルの吸入または噴霧を含む投与により、あるいは筋肉内、静脈内、腹膜、皮下、皮内および局所投与を含む非経口的導入によって達成することができる。インビボでの遺伝子治療ベクターの使用に関する臨床試験が進行中である。そのような臨床試験に使用される方法論および当業者に公知の付加的技術は、調査、診断および／または遺伝子治療の目的で本発明のベクターを投与するのに用いることができる。医薬上許容され得る賦形剤もまた当業者によく知られており、容易に入手可能である。賦形剤の選択は組換えベクターの投与に使用される特定の方法によって部分的に決定されるであろう。したがって、本発明において用いる適切な製剤には非常に多様なものがある。以下の方法および賦形剤は単なる例示であって何ら限定するものではない。経口投与に好適な製剤は、（ａ）液剤、例えば水、食塩水、オレンジジュースのような希釈剤に溶解された有効量の化合物；ｂ）それぞれ予め決められた量の有効成分を固形剤または顆粒剤として含むカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、（ｃ）適当な液体を用いた懸濁液剤、および（ｄ）適当な乳液剤がある。錠剤型は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、微晶質セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド性二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、着香剤、並びに薬理学的に適合する賦形剤のうちの１つまたはそれ以上を含み得る。ロゼンジ型は、有効成分を香味成分、通常はシュクロースおよびアカシアまたはトラガカントゴム中に含み得るし、また、香錠剤は有効成分をゼラチンおよびグリセリン、またはシュクロースおよびアカシアのような不活性な基剤中に含み、乳化剤、ゲル剤等は有効成分に加えて、当技術分野において知られているような賦形剤を含有する。本発明のベクター（アデノウイルスベクターおよび導入ベクターを含む）は単独で、あるいは他の適当な成分と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることができる。このようなエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容され得る推進ガス中におくことができる。それらはまた、ネブライザー噴霧器やアトマイザー噴霧器のような非加圧製剤用の医薬として製剤化され得る。非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および意図する受容者の血液と製剤とを等張にする溶質を含み得る水性および非水性の等張滅菌注射溶液剤、並びに懸濁化剤、溶解補助剤、増粘剤、安定化剤および保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁化剤が挙げられる。当該製剤はアンプルやバイアルのような単位用量または複数回用量を封入した容器で提供され、注射用に、使用直前に滅菌した液状賦形剤、例えば水を添加すればよいだけのフリーズドライ（凍結乾燥）された状態で保存することができる。即席の注射溶液剤および懸濁液剤は、以前に記載された種類の滅菌した散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。さらに、本発明のベクターは、乳化用基剤や水溶性基剤のような種々の基剤と混合することにより坐薬としてもよい。膣投与に適した製剤は、有効成分に加えて当技術分野において適当であると知られているような担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー剤として提供され得る。本発明によれば、動物、特にヒトに投与される用量は目的の遺伝子、使用される組成物、投与方法、投与を受ける特定部位および生物、並びに投与理由（例えば、遺伝子治療、診断、蛋白質の生産手段、さらなる研究など）によって変化する。一般に、組成物の「有効量」は、当業者に公知のいくつかのエンドポイント法を用いてモニタリングすることができる、宿主における所望の効果を生じるような量である。例えば、所望の効果は宿主細胞への効果的な核酸導入であるかもしれない。そのような導入は、治療効果の面で(例えば、治療中の疾患や症候群に付随するある症状の緩和)、あるいは宿主内での導入された遺伝子またはコード配列の存在またはその発現のさらなる証拠によって（例えば、宿主細胞内の核酸を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応、ノーザンもしくはサザンハイブリダイゼーションまたは転写アッセイを用いて、あるいは導入された核酸にコードされるか、そのような導入によりレベルもしくは機能に影響を受ける蛋白質もしくはポリペプチドを検出するためのイムノブロット分析、抗体を介した検出または特殊化されたアッセイを用いて）モニタリングすることができる。後記実施例に記載される特殊化されたアッセイとして、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼリポーター遺伝子の発現アッセイが挙げられる。一般に、本発明のベクターの効果的な導入を確実にするためには、所定の投与経路に顧みて接触させる細胞の概数に基づいて、接触させる細胞あたり約１〜約５，０００コピーのベクターを使用することが好ましい。約１〜約３００プラーク形成単位（ｐｆｕ）が各細胞に入ることがいっそう好ましい。しかしながら、これはあくまで一般的なガイドラインであって、インビトロまたはインビボでの特定の適用において正当化される、より高い量またはより低い量の成分の使用を決して排除するものではない。例えば、実際の用量とスケジュールは組成物が他の医薬組成物と組み合わせて投与されるかどうかにより、あるいは薬物動態、薬剤との相性および代謝における個人差によって変化させることができる。同様に、インビトロでの適用において、量は使用される特定の細胞種またはベクターを導入する手段によって変化させることができる。当業者は特定の状況の必要に応じて、いかなる必要な調節も容易に行うことができる。以下の実施例により本発明をさらに説明するが、もちろんこれらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。実施例１本実施例ではアデノウイルス抗ベクター中和免疫を調べる実験について記載する。中和免疫現象を明確にするために、あるアデノウイルスベクター種に対する循環抗体を有する動物に別の血清型のアデノウイルスベクターを気管内投与して、第二のベクターにより命令される遺伝子発現をモニタリングした。詳細には、Ａｄ４またはＡｄ５野生型ベクターをSprague-Dawleyラットの肺に投与した。１０日後、Ａｄ５リポーターベクターを同じ動物の肺に投与した。このリポーターベクター−ここで「ｐｕｒｅ５」ベクターという−は、サイトメガロウイルス初期／移行期プロモーター／エンハンサー（ＣＭＶ）により駆動されるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を発現する、Ｅ１^-Ｅ３^-の５型アデノウイルスベクター（すなわち、Kass-Eislerら，Proc ．Natl．Acad．S ci. ，15,11498-11502(1993)に記載されるAdCMVCATgD）を含む。「ｐｕｒｅ５」ベクターの投与から約２４時間後に、以前に記載されたような（Kass Eislerら(1993)，上述）ＣＡＴアッセイを用いてホモジナイズした肺組織におけるＣＡＴ活性を測定した。ＣＡＴ活性は、その後「ｐｕｒｅ５」ベクター導入後１０日までさまざまな時間にモニタリングした。ＣＡＴ活性は、未投与の動物に投与された「ｐｕｒｅ５」ベクター（すなわち、この条件下での発現を１００％とみなした）に対して相対的に測定した。これらの研究の結果を表１に示すが、これについてはMastrangeliら，Human Gene Therapy，1，79-87(1996) においてさらに報告されている。これらの結果から、あるアデノウイルス群に対して（例えば、Ｅ群、血清型４に対して）誘導される中和抗体の存在下に、別の群由来の（例えば、Ｃ群、血清型５由来の）アデノウイルスベクターを用いてインビボで効率よく遺伝子を導入し発現させることができることが確認された。ある血清型群に対して誘起される中和免疫は別の群のアデノウイルスによる感染を防御しない。これらのデータは、抗アデノウイルス体液性免疫を回避する戦略として、異なる亜群由来のアデノウイルスベクターに変化させるというパラダイムを裏付けるものである。実施例２中和免疫を誘起する優性なエピトープはファイバーおよびヘキソン上に位置するが、主としてヘキソン上に位置する。これに基づいて、ファイバー蛋白質を交換する効果を調べた。ファイバー遺伝子を血清型５、Ｃ群のファイバーから血清型７Ｂ群のファイバーに交換した以外は「ｐｕｒｅ５」ベクターと同じであるベクターを構築した。得られたベクターをここでは「５ベース／７ファイバー」ベクターという。図１に示すようにしてＡｄ５／Ａｄ７ファイバーコンストラクトを作製した。 pAd70-100中の約２．７ｋｂ断片（Ａｄ５２８６８９−３１３１７ｂｐ）をPac Iリンカーで置換した(pAd70-1001E3.Pac)。図２に示すようにMunI部位にBumHIリンカーを挿入してpAd70-100d1E3.Pac.Bamを作製した。Ａｄ７ファイバー遺伝子を含む約１．１ｋｂのＰＣＲ増幅したPacI-BamHI断片をpAd70-100dlE3.Pac.Bam に挿入してpAd70-100dlE3.fiber7を作製した。Ａｄ７ファイバーを有するＡｄ５ウイルスがインビトロおよびインビボで細胞を感染させる能力を調べるために、リポーター遺伝子アッセイを行った。AdCMV- CATNeoと名付けた複製欠損組換えアデノウイルスリポーターベクターをリポーター遺伝子アッセイに用いた。該リポーターベクターは、アデノウイルスの複製起点およびウイルスパッケージング配列、強力な真核プロモーター（サイトメガロウイルス、すなわちＣＭＶ−１）およびスプライシングエレメント、細菌クロラムフェニコールアヤチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子配列、マウスβ^ma ^j −グロビンポリ（Ａ）部位、ネオマイシン遺伝子配列(Ｎｅｏ)、並びに重複組換えを可能にするのに十分なアデノウイルスＤＮＡからなる。該リポーターベクターを用いてAdCMV-CATNeo、AdCMV-CATNeo-dlE3(AdCMV-CATN eo＋pAd70-100dlE3)およびAdCMV-CATNeo-dlE3-Fiber7（AdCMV-CATNeo＋pAd70-10 01E3.Fiber7）ウイルスを作製した。各ウイルスをラージスケールで、すなわちヒト胚腎２９３細胞の１リットル懸濁液中で増殖させ、ウイルスを１０¹²粒子／ｍ１の濃度で得た。計算上１００、３００または１，０００粒子／細胞の、３ウイルスのうちの１つにＡ５４９細胞を感染させた。４８時間後、細胞を集めてKa ss-Eislerら(1993)，上述，に記載されるようにしてライセートを調製した。各ライセート５０μｌを用いてＣＡＴアッセイを行い、アセチル化クロラムフェニコール生成物をクロロホルム：メタノール（９５：５）を用いた薄層クロマトグラフィーにより分離した。アッセイの結果から、各ウイルスは適当なレベルで感染し、遺伝子産物を発現させることができることが確認された。すなわち、天然のファイバーを非天然のファイバーに置換したウイルスは、親ウイルスと同様、細胞を感染させ遺伝子を発現させることができた。この研究に続いて、Kass-Eislerら(1993)，上述，に記載されるようにして、成体Sprague-Dawleyラットを直接心筋注射により１０⁸ウイルス粒子で感染させた。５日後、該ラットを殺して心筋ライセートを調製し、ＣＡＴアッセイを行った。産生されたＣＡＴ遺伝子産物の量をdlE3ウイルスとdlE3-Fiber7ウイルスとの間で比較した。その結果、どちらのウイルスもインビボで細胞を感染させ得ることがわかった。野生型Ａｄ５ファイバー遺伝子をＡｄ７のそれに置換してもウイルスの細胞感染能を損なわなかった。すなわち、天然のファイバーを非天然のファイバーに置換したウイルスは、インビボでも、親ウイルスと同様、細胞を感染させ遺伝子を発現させることができた。これらの結果はキメラファイバーを有するアデノウイルスの遺伝子治療における利用性を裏付けるものである。実施例３本実施例では、アデノウイルスのファイバー蛋白質をある血清型から別の血清型に交換することが及ぼす中和免疫への効果について述べる。前記実施例に記載される「ｐｕｒｅ５」および「５ベース／７ファイバー」ベクターを、未投与または野生型Ａｄ５にあらかじめ感作させたSprague-Dawleyラットに投与した。これらの実験に関して、初回接種として野生型Ａｄ５または野生型Ａｄ７（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中６×１０⁹粒子）を腹膜内投与した。１７日後、血清サンプルを採取し、ＰＢＳ５０μｌ中約６×１０⁹粒子を注射した。注射から約１２０時間後に動物を殺して血清および心組織を回収し、心組織を以前に記載されるようにして(Kass-Eislerら(1993)，上述)、ＣＡＴアッセイのために処理した。「ｐｕｒｅ５」ベクターまたは「５ベース／７ファイバー」ベクターのみに感染させたラット心臓の心ライセートについてもＣＡＴアッセイを行った。未投与の動物にいずれかのベクターを投与すると、心組織内に比較に値するレベルのＣＡＴを生じた。これに比べて、あらかじめ「ｐｕｒｅ５」ベクターに感作させた動物に「ｐｕｒｅ５」ベクターまたは「５ベース／７ファイバー」ベクターを投与すると、モック（mock）感染させたコントロールに比べて２オーダーを越える倍率でＣＡＴレベルが低下した。これらの、およびさらなる結果についてはGallら，J ．Virol.，70，2116-2163(1996)において報告されている。これらの結果から、ファイバーをアデノウイルス血清型５Ｃ群ベクターのそれからアデノウイルス血清型７Ｂ群ベクターのと交換しても、それ自体では、ベクターをＡｄ５ファイバーを含むアデノウイルスベクターに対して生じた中和抗体から逃れ得るようにするには不十分であることが確認された。これらの結果は、ファイバー以外のアデノウイルス構造に対する抗体もまた、中和免疫のプロセスにおいて重要であることを示唆している。さらに、ファイバーの血清型を別の血清型に交換しても、それ自体ではアデノウイルスが免疫による検出から逃れるようにするには不十分であるかもしれないが、このような交換は、他のエピトープの除去と組み合わせて行えば、免疫応答を低減するには望ましいかもしれない。実施例４本実施例では、中和抗体を誘起するエピトープが改変されたアデノウイルスベクターの構築について述べる。特に、本実施例では、ヘキソン中和免疫を誘起するエピトープが改変されたキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質を含むベクターについて記載する。先の実施例の結果は、遺伝子治療における反復投与用のベクターを非Ｃ群アデノウイルスから開発することができ、そうして予め存在する中和免疫を回避できることを示している。別の戦略として、存在するＣ群ベクター上の、中和免疫を誘起する優性なエピトープを改変して、ベクターを、存在する中和免疫に影響を受けにくくする（すなわち「忍ばせる」）ことができる。例えば、予め存在する抗５型中和免疫により認識されないキメラヘキソンをコードする遺伝子を有する以外は上記の「ｐｕｒｅ５」および「５ベース／７ファイバー」ベクターと同じ遺伝学的組成を有する、アデノウイルス５型を基にするＥ１^-Ｅ３^-のＣＡＴ発現ベクターを構築することができる。該ベクターを誘導するために、「ｐｕｒｅ５」親ベクター中に存在するキメラヘキソン遺伝子を改変する、特に、ｌ１および／またはｌ２を変化させることができる。「ｐｕｒｅ５」ＣＡＴベクター、または他のアデノウイルスベクター（任意の他のアデノウイルス血清型ベクター等）上になし得るヘキソンの改変としては、（１）ｌ１の全体が欠失したヘキソン、（２）ｌ２の全体が欠失したヘキソン、（３）ｌ１とｌ２の両方が欠失したヘキソン、（４）ＨＶＲ１、ＨＶＲ２、ＨＶＲ３、ＨＶＲ４、ＨＶＲ５、ＨＶＲ６またはＨＶＲ７の任意の１つまたは２つ以上が欠失したヘキソン、（５）〜（８）ｌ１、ｌ２、またはｌ１とｌ２の両方、またはＨＶＲ１、ＨＶＲ２、ＨＶＲ３、ＨＶＲ４、ＨＶＲ５、ＨＶＲ６またはＨＶＲ７の任意の１つまたは２つ以上がＦＬＡＧオクタマーエピトープ（すなわち、Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys［配列番号５０］;Hoppら，Biotechnology，6，1205-1210(1988 )）で置換されたヘキソン、（９）〜（１２）ｌ１、ｌ２、またはｌ１とｌ２の両方にＦＬＡＧオクタマーエピトープ［配列番号５０］が挿入されたヘキソン、（１３）〜（１６）ｌ１、ｌ２、ｌ１とｌ２の両方がそれぞれ、あるいはＨＶＲ１、ＨＶＲ２、ＨＶＲ３、ＨＶＲ４、ＨＶＲ５、ＨＶＲ６またはＨＶＲ７の任意の１つまたは託番号ｘ７６５５１、Ａｄ５ヘキソンについては番号Ｍ７３２６０）またはＡｄ２、あるいは任意の他のアデノウイルス血清型由来の同等のエピトープで置換されたヘキソン、（１７）〜（２０）ｌ１、ｌ２、ｌ１とｌ２の両方にそれぞれ、あるいはＨＶＲ１、ＨＶＲ２、ＨＶＲ３、ＨＶＲ４、ＨＶＲ５、ＨＶＲ６またはＨＶＲ７の任意の１つまたは２つ以上に、Ａｄ７（Ｂ群）(Ａｄ７ヘキソンについては７３２６０）またはＡｄ２、あるいは任意の他のアデノウイルス血清型由来の同等のエピトープが挿入されたヘキソン、並びに（２１）Ａｄ５ヘキソンをＡｄ２または別のアデノウイルス血清型に完全に置換することが挙げられるが、それらに限定されない。ＦＬＡＧオクタマーエピトープの使用は、Ａｄ５ヘキソンループ配列とは異なる、キメラヘキソン蛋白質に組み込むための配列を提供し、また、入手可能な特異的抗ＦＬＡＧ抗体（Hoppら，上述）を用いたポジティブコントロールを提供する。これらのキメラヘキソン蛋白質（およびそれらを含むベクター）はいくつかの段階で使用することができる。「ｐｕｒｅ５」ベクター中のヘキソンを改変するために、容易に改変することができるカセット内に５型ヘキソンコード配列を含むウイルスまたはプラスミドベクターを構築することができる。ヘキソンは約２．９ｋｂの領域を含むＬ３転写ユニットのｌ鎖、すなわちマップ単位５１．６〜５９．７から隔たって読まれる。やはりＬ３によりコードされる他の２つの転写産物−すなわち、ポリペプチドVIと２３ｋＤａ蛋白質−はヘキソンコード配列にオーバーラップしない。さらに、ヘキソンコード配列の改変によって変化するであろうｒ鎖上には他のコード配列はない。したがって、５型ヘキソンの改変はすべて、「ｐｕｒｅ５」ＣＡＴベクターの約６．７ｋｂのSfiI-SfiI断片からなる「ヘキソン５カセット」用いて行うことができる。SfiIはＡｄ５を３つの断片にカットするが、そのうちの真ん中の６．７ｋｂ断片（すなわち、アガロースゲル電気泳動により同定されるように、約１６，２８２〜２２，９９２塩基対を含む）は、Ｌ３領域のすべてに加えていくらかオーバーラップを含む。「ヘキソン５カセット」は、サブクローニングされた配列の改変および回収に関して、ベクターを容易に操作し得るようにする制限部位などを有する市販のベクターにサブクローニングすることができる。サブクローニングに適当な CA)のＳＫまたはＫＳバージョンである。「ヘキソン５カセット」に変異を誘発して、クローニングしたＤＮＡセグメント内に部位特異的変異を生じさせることができる。部位特異的変異誘発を行うのにいくつかの方法が利用できる。ｌ１およびｌ２の欠失、挿入または置換（あるいはその中に含まれるＨＶＲ１、ＨＶＲ２、ＨＶＲ３、ＨＶＲ４、ＨＶＲ５、ＨＶＲ６またはＨＶＲ７領域における欠失、挿入または置換）は、ベクターインサートの内部でユニークに切断する制限酵素を用いて問題となる配列を欠失させるか、他の類似の手段、例えば、末端がすり減るかさもなくば改変されたＰＣＲ産物にライゲーションすることによって作製することができる。あるいは、ヘキソン５カセット内に含まれるヘキソン配列は、例えば、M13mp8またはある種の他の便利なベクターにおける一本鎖変異誘発を用いて、また、Cromptonら，上述，に記載されるように、プラークを同定するためのフランキング配列を包含する適当なオリゴヌクレオチドを用いて改変することができる。あるいは、Stratagene社によるExSite^TMＰＣＲに基づく部位特異的変異誘発キットやChameleon^TM二本鎖部位特異的変異誘発キット等の市販のキットを用いて、Ｍ１３または他の特殊なベクターにサブクローニングする必要も全くなく、キメラヘキソン配列中に挿入、点変異または欠失を導入することができる。同様に、ＦＬＡＧオクタペプチド配列（Hoppら，上述）は、相当する２４塩基対配列（GAY TAY AAR GAY GAY GAY GAY AAR［配列番号５０］;配列中、YはＣまたはT/U、RはAまたはGである）を挿入することによって、（いかなる欠失の存在下または非存在下においても）ベクター中に導入することができる。Ａｄ５ヘキソンループのエピトープをＡｄ７、Ａｄ２または任意の他のアデノウイルス血清型の同等の配列で置換するか、あるいはいかなる欠失もなくこれらの配列を組み込むことは、ユニークな制限部位を用いて、あるいは前記変異誘発手段の１つを用いて達成することができる。これにより、通常、新たな血清型のアデノウイルスベクターが創製される。例えば、Ａｄ５の野生型ヘキソン蛋白質をＡｄ７ヘキソンのループ１および２を含むキメラＡｄ５ヘキソンに置換すると、Ａｄ７中和抗体（すなわち、未投与の動物のＡｄ７接種に応答して生じる中和抗体）により効果的に中和されるが、Ａｄ５中和抗体によっては中和されないアデノウイルスベクターが生じる。さらに、血清型５または別の血清型のアデノウイルスベクターから超可変ループ１および２の両方を欠失させることもできる。このような欠失を含むアデノウイルスベクターおよびそのゲノムは、ループの置換を有する他のアデノウイルスベクターを創るための出発点として、ヘキソンの構造と機能の関係を研究するための道具として、並びにいくつかの状況下では、適応する免疫系に対して限られた弱みしか持たない遺伝子導入ベクターとして有用である。実施例５本実施例では、ある血清型のアデノウイルスベクターのヘキソン蛋白質を別の血清型のアデノウイルスベクターのヘキソン蛋白質で置換して組換えアデノウイルスを作製する方法について記載する。この方法の代表例として、Ａｄ５ベクターのヘキソン蛋白質をＡｄ２ベクターのヘキソン蛋白質で置換した。また、本実施例では、前記実施例のキメラヘキソン蛋白質をベクターに組み込んで組換えアデノウイルスを作製する方法について記載する。標準的な分子生物学的技法を用いて、ヘキソン遺伝子の上流および下流に正しいＡｄ５配列が維持されるようなやり方で、Ａｄ５ヘキソン遺伝子オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＡｄ２ヘキソン遺伝子ＯＲＦで置換した。改変すなわちキメラヘキソン蛋白質を含むアデノウイルスベクターは、標準的技法とヒト胚腎２９３細胞を用いた相同組換え（例えば、Rosenfeldら(1991)，上述;Rose nfeldら(1992)，上述を参照）によって構築することができる。例えば、dlAd5NC AT（Gallら，上述）のマップ単位０〜５７．３はBus36I消化により単離することができ、dlAd5NCATのマップ単位５８．４〜１００はDrdI消化により単離することができる。これらのＤＮＡ断片をpH5-2と一緒に２９３細胞にトランスフェクトすることができる。親ベクターに指向性の中和抗体を用いて、ヘキソンが置換されたコンストラクトの作製を容易にすることができる。例えば、Ａｄ５ベクターのループ１および２領域をＡｄ７のループ配列で置換する場合、（Ａｄ５ヘキソンのループ１および２指向性の）抗Ａｄ５ポリクローナルまたはモノクローナル中和抗体を、キメラベクターを増殖させる細胞の培地に添加することができる。Ａｄ５中和抗体の存在により、キメラベクターは影響を受けないが、望ましくない野生型Ａｄ５ベクターの増殖は実質的にブロックされる。さらに、キメラヘキソンＯＲＦを含む組換えベクターは、該キメラすなわち新規ヘキソンＯＲＦの近傍に(例えば、ファイバー遺伝子とヘキソン遺伝子の間に)、グリーン・フルオレセント・プロテイン（ＧＦＰ）等のマーカー遺伝子を担持するプラスミドを用いた相同組換えにより作製することができる。このように、キメラヘキソン遺伝子を担持し得るゲノムはマーカー遺伝子も担持するはずである。そして、マーカー遺伝子は後期蛋白質として発現し、所望のアデノウイルスゲノムを含む可能性のある細胞が容易に同定されるようになるだろう。同様に、前記ヘキソンの改変を有し、且つ、例えばアデノウイルスファイバーコード配列中にさらに改変を有するベクター（特にアデノウイルスベクター）を構築することができる。これは、上記ヘキソンの改変を行ない、且つ相同組換え用の異なる親プラスミド、例えばファイバーコード配列中に変異を含む親プラスミドを用いることにより達成することができる。特に、「５ベース／７ファイバー」ベクターをベクター構築の出発ベクターとして使用することができる。本実施例にしたがって調製されるすべてのウイルスベクターは、プラーク精製、増幅、および標準的な方法（Rosenfeldら(1991)，上述;Rosenfeldら(1992)，上述）を用いてさらに精製することができる。実施例６本実施例では、前記実施例に記載されたベクターのインビトロおよびインビボでの活性のキャラクタリゼーションについて記載する。以前に記載され(例えば、Kass-Eislerら，上述)、また、本明細書において以下に示すような標準的な方法を用いて、前記実施例に記載されるようにして調製されたそれぞれのウイルスを、インビトロおよびインビボで評価することができる。特に、インビトロ研究については、コントロールベクター（例えば、「ｐｕｒｅ５」および「５ベース／７ファイバー」ベクター、並びにＡｄ５野生型ベクター）とともに種々のベクターを、単独で、あるいはＡｄ５、Ａｄ７、「ｐｕｒｅ５」ＣＡＴベクターもしくは「５ベース／７ファイバー」ＣＡＴベクターで感染させた宿主由来の血清または抗ＦＬＡＧエピトープ血清の希釈液の存在下で、ヒト肺癌Ａ５４９細胞に添加することができる。次いで、血清中に存在する抗体が遺伝子発現をブロックする能力を持つかどうかを測定するために、ＣＡＴ活性について細胞を評価する。インビボ研究はSprague-Dawleyラットで行うことができる。Sprague-Dawleyラットは複製を許容せず、野生型アデノウイルスはこの宿主内で複製できないので、このラットは、マウスやコットンラットとは反対にこのような実験に好適である。したがって、免疫感作は、野生型ウイルス(例えば、野生型Ａｄ５またはＡｄ７)、「ｐｕｒｅ５」ＣＡＴベクターおよび「５ベース／７ファイバー」ＣＡＴベクターを用いて、静脈内注射（例えば、Kass-Eislerら，上述）により行うことができる。約１〜４週間後の範囲の様々な時間に目的のベクターを、宿主の静脈内または直接気道内に投与することができる。静脈内投与では「最悪の場合のシナリオ」(すなわち、この場合ベクターは循環体液性免疫系に直接接触するので、最も強力な免疫応答が予測される)を評価できるのに対し、宿主の気道内への導入では区画化された粘膜の体液性免疫応答の評価が可能となる。すべての関連する器官、例えば静脈内投与については肝臓、心臓および肺、気道投与については肺のみにおいて、以前に記載したようにしてＣＡＴ活性を定量することができる。適当な標準を用いてＣＡＴ活性の器官発現におけるバリエーションを補正することができる(例えば、Kass-Eislerら，Gene Therapy，2 395- 402(1994)を参照)。標準的な統計学的方法を用いて、インビトロとインビボでの結果を比較・評価することができる。用によりその全体がここに組み入れられるものである。本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の請求の範囲の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年４月３０日（１９９９．４．３０）【補正内容】ていない。しかしながら、ファイバー蛋白質の構造についてはたくさんのデータが入手可能である。三量体ファイバー蛋白質はテール、シャフトおよびノブからなる(Devauxら.，J ．Molec．Biol.，215，567-588(1990))。ファイバーシャフト領域は反復する１５アミノ酸モチーフからなり、２つのβ鎖とβベンドを交互に形作ると信じられている(Greenら.，EMBO J.，2，1357-1365(1983))。ファイバーシャフト領域の全長と１５アミノ酸反復の数はアデノウイルスの血清型間で異なる。ファイバー蛋白質の受容体結合ドメインおよびファイバーの三量体化に必要な配列は、該蛋白質の最後のおおよそ２００アミノ酸にコードされるノブ領域内に局在化し(Henryら.，J ．Virol.，68(8)，5239−5246(1994));Xiaら.，Struc ture ，2(12)，1259-1270(1994))。さらに、すべてのアデノウイルス血清型がノブ領域内に位置する１つのタイプの特異的部分を有するらしい(Toogoodら.，上述)。ヘキソン蛋白質およびファイバー蛋白質にこれらの可能性のあるエピトープが存在するので、遺伝子治療用のベクターとしてアデノウイルスを使用すると困難に遭遇する場合があることは理解できる。したがって、（中和抗体が予め存在し、最初の用量中のアデノウイルスにより命令される遺伝子発現を妨害する場合には）このような中和抗体から免れることができ、何用量も繰り返しアデノウイルスベクターを投与することを可能にする組換えアデノウイルスベクターは、現在の遺伝子治療の方法を顕著に前進させるだろう。したがって、本発明は、組換えアデノウイルス遺伝子治療に関する前記の問題点の少なくともいくつかを克服しようとするものである。特に、本発明の一面においては、対応する野生型アデノウイルスコート蛋白質に指向性の抗体（即ち、中和抗体）により認識される能力が低下したか、あるいは認識され得ないキメラコート蛋白質を含む組換えアデノウイルスが提供される。本発明のこれらのおよび他の目的、および本発明の利点、並びに本発明のさらなる特徴はここに提供された発明の詳細な説明から明らかとなるだろう。請求の範囲１．野生型アデノウイルスヘキソン蛋白質の約１〜約７５０アミノ酸の領域の欠失、挿入または置換を含むキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質であって、野生型アデノウイルスコート蛋白質指向性の中和抗体により認識され得ないか、あるいは認識される能力が低下した該キメラアデノウイルスヘキソン蛋白質。２．複数の欠失、挿入および／または置換を含む、請求の範囲１のキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質。３．該欠失または置換された領域がｌ１ループまたはｌ２ループ内の超可変領域を含む、請求の範囲１または２のキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質。４．該超可変領域がＨＶＲ１、ＨＶＲ２、ＨＶＲ３、ＨＶＲ４、ＨＶＲ５、ＨＶＲ６およびＨＶＲ７からなる群より選択される、請求の範囲３のキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質。５．配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８からなる群より選択される配列を含む、請求の範囲１〜４のいずれかのキメラアデノウイルスコヘキソン蛋白質。６．配列番号５０の配列を含む、請求の範囲１〜５のいずれかのキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質。７．別の血清型のアデノウイルスのヘキソン蛋白質のアミノ酸配列を含む、請求の範囲１〜６のいずれかのキメラアデノウイルスコート蛋白質。８．請求の範囲１〜７のいずれかのキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質をコードする単離または精製された核酸。９．配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５および配列番号４７からなる群より選択される配列を含む、請求の範囲８の単離または精製された核酸。１０．配列番号４９の配列を含む、請求の範囲８または９の単離または精製された核酸。１１．請求の範囲１〜７のいずれかのキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質を含むアデノウイルスベクター。１２．非天然ファイバー蛋白質をさらに含む、請求の範囲１１のアデノウイルスベクター１３．該非天然ファイバー蛋白質が、該アデノウイルスベクター以外のアデノウイルス血清型由来である、請求の範囲１２のアデノウイルスベクター。１４．該非天然ファイバー蛋白質が、野生型アデノウイルスファイバー蛋白質の約１〜約７５０アミノ酸の領域の欠失、挿入または置換を含む、請求の範囲１２または１３のアデノウイルスベクター。１５．請求の範囲１１〜１４のいずれかのアデノウイルスベクターに細胞を接触させることを含む、該細胞を遺伝学的に改変する方法。１６．請求の範囲１〜７のいずれかのキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質を含む宿主細胞。１７．請求の範囲８〜１０のいずれかの核酸を含む宿主細胞。１８．請求の範囲１１〜１４のいずれかのベクターを含む宿主細胞。１９．野生型アデノウイルスヘキソン蛋白質指向性の中和抗体により認識される能力が低下しているか、あるいは認識され得ないアデノウイルスベクターの構築方法であって、野生型アデノウイルスヘキソン蛋白質を含むアデノウイルスベクターを取得し、該野生型アデノウイルスヘキソン蛋白質を請求の範囲１〜７のいずれかのキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質で置換することを含む方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者クリスタル、ロナルドジー. アメリカ合衆国、メリーランド州 20854、ポトマック、キャナルヴィスタコート 13712 (72)発明者ファルク−ペダーセン、エリックアメリカ合衆国、ニューヨーク州 10522、ドッブズフェリー、ブエナヴィスタドライヴ 8714 (72)発明者ゴール、ジェイソンアメリカ合衆国、カリフォルニア州 92121、サンディエゴ、ジェネシーアヴェニュー 9505、ナンバー512 (72)発明者コウヴェスディ、イムリアメリカ合衆国、メリーランド州 20855、ロックヴィル、ウォーブラーレイン 7713 (72)発明者ウィッカム、トーマスジェイ. アメリカ合衆国、ヴァージニア州 22043、フォールズチャーチ、ハッチソングロウヴコート 2106

Claims

【特許請求の範囲】１．非天然アミノ酸配列を含むキメラアデノウイルスコート蛋白質であって、野生型アデノウイルスコート蛋白質指向性の中和抗体により認識される能力が低下しているか、あるいは認識され得ない該キメラアデノウイルスコート蛋白質。２．該非天然アミノ酸配列が、野生型アデノウイルスコート蛋白質の約１〜約７５０アミノ酸の領域の欠失、挿入または置換を含む、請求の範囲１のキメラアデノウイルスコート蛋白質。３．該非天然アミノ酸配列が複数の欠失、挿入および／または置換を含む、請求の範囲１または２のキメラアデノウイルスコート蛋白質。４．該コート蛋白質がキメラアデノウイルスヘキソン蛋白質である、請求の範囲１〜３のいずれかのキメラアデノウイルスコート蛋白質。５．該欠失または置換された領域が１１ループまたは１２ループ内の超可変領域を含む、請求の範囲４のキメラアデノウイルスコート蛋白質。６．該超可変領域がＨＶＲ１、ＨＶＲ２、ＨＶＲ３、ＨＶＲ４、ＨＶＲ５、ＨＶＲ６およびＨＶＲ７からなる群より選択される、請求の範囲５のキメラアデノウイルスコート蛋白質。７．配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８からなる群より選択される配列を含む、請求の範囲１〜６のいずれかのキメラアデノウイルスコート蛋白質。８．該非天然アミノ酸配列が約１〜約７５０アミノ酸のスペーサーを含む、請求の範囲１〜７のいずれかのキメラアデノウイルスコート蛋白質。９．該スペーサーが配列番号５０の配列を含む、請求の範囲８のキメラコートアデノウイルス蛋白質。１０．別の血清型のアデノウイルスのコート蛋白質のアミノ酸配列を含む、請求の範囲１〜９のいずれかのキメラアデノウイルスコート蛋白質。１１．該別の血清型のコート蛋白質がヘキソン蛋白質である、請求の範囲１０のキメラアデノウイルスコート蛋白質。１２．請求の範囲１〜１１のいずれかのキメラアデノウイルスコート蛋白質をコードする単離または精製された核酸。１３．配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５および配列番号４７からなる群より選択される配列を含む、請求の範囲１２の単離または精製された核酸。１４．配列番号４９の配列を含む、請求の範囲１２または１３の単離または精製された核酸。１５．請求の範囲１〜１１のいずれかのキメラアデノウイルスコート蛋白質を含むアデノウイルスベクター。１６．請求の範囲１５のアデノウイルスベクターに細胞を接触させることを含む、該細胞を遺伝学的に改変する方法。１７．請求の範囲１〜１１のいずれかのキメラアデノウイルスコート蛋白質を含む宿主細胞。１８．野生型アデノウイルスコート蛋白質指向性の中和抗体により認識される能力が低下しているか、あるいは認識され得ないアデノウイルスベクターの構築方法であって、野生型アデノウイルスコート蛋白質を含むアデノウイルスベクターを取得し、該野生型アデノウイルスコート蛋白質を請求の範囲１〜１１のいずれかのキメラアデノウイルスコート蛋白質で置換することを含む方法。