KR20210144818A - 암을 치료하기 위한 다가 pd-l1 결합 화합물 - Google Patents

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본 발명은 암 치료를 위한 방법 및 물질을 제공한다. 본 발명은 암을 가진 포유동물을 치료하기 위해 포유동물에게 투여되는 프로그래밍된 사멸-리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물, 및/또는 하나 이상의 1가 또는 다가 프로그래밍된 사멸-리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물을 포함하는 조성물을 전달하기 위한 방법 및 물질을 포함한다. 일부 경우에, 다가 PD-L1 결합 화합물은 2개 이상의 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) 폴리펩티드 (및/또는 PD-L1에 결합하는 능력을 갖는 그의 단편)를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 다가 PD-L1 결합 화합물을 제조하기 위한 방법 및 물질, 및 PD-L1 결합 화합물을 코딩하는 핵산 분자를 제조하기 위한 방법 및 물질을 제공한다.

Description

암을 치료하기 위한 다가 PD-L1 결합 화합물
본 발명은 암을 치료하기 위한 방법 및 물질에 관한 것이다. 본 발명은 다가 PD-L1 결합 화합물을 제조하기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 본 발명은 또한 암을 가진 포유동물의 세포에서 PD-1 폴리펩티드를 발현시키기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 특히, 본 발명은 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이고, PD-1 폴리펩티드는 하나 이상의 다가 프로그래밍된 사멸-리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물의 형태일 수 있다. 일부 경우에, 다가 PD-L1 결합 화합물은 2개 이상의 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) 폴리펩티드 (및/또는 PD-L1에 결합하는 능력을 갖는 그의 단편)를 포함할 수 있다. PD-L1 결합 화합물을 포함하는 조성물은 암을 치료하는데 효과적인 양으로 암을 가진 포유동물에게 투여되고, 임의적으로 1종 이상의 암 요법과 조합되어 투여된다.
B7-H1로도 지칭되는 PD-L1은 PD-1 수용체와의 그의 결합을 통해 면역계를 조절하는 면역 체크포인트 단백질이다. 종양 미세환경에서, 종양 세포 상에서 PD-L1의 과발현은 항종양 면역의 억제에 도움이 된다 (Dong et al., Nat Med. 8:793-800, (2002); Hamanishi et al., Int. J. Clin. Oncol. 21:462-473 (2016); Dong et al., Nat. Med. 5:1365-1369 (1999); Chen et al., J. Clin. Invest. 125:3384-3391 (2015); He et al., Sci. Rep. 5:13110 (2015); Chen et al., Clin. Cancer Res. 18:6580-6587 (2012); Ohaegbulam et al., Trends Mol. Med. 21:24-33 (2015); 및 Postow et al., J. Clin. Oncol. 33:1974-1982 (2015)).
항원-제시 세포 (APC)는 암 세포로부터 방출된 항원을 흡수하고, 이들을 T 세포에 제시한다. 암 세포는 또한 주요 조직적합성 복합체의 맥락에서 활성화된 T 세포에 항원을 제시할 수 있다. T 세포 활성화시, PD-1 수용체가 T 세포 상에서 발현되고, APC 상의 PD-L1 및 PD-L2 리간드 및 암 세포 상의 PD-L1의 결속에 의해 면역 반응을 억제한다. 따라서, PD-1/PD-L1/PD-L2 경로의 모노클로날 항체 (mAb)-매개된 특이적인 차단은 항종양 면역을 증강시킬 수 있다. T 세포 및 APC 외에도, PD-1 및 PD-L1은 다른 면역 세포 상에서 유도될 수 있다.
암 질환 상태에서, PD-L1 양성 암 세포 상에 존재하는 PD-L1과 T-세포 상에 존재하는 PD-1 사이의 상호작용은 T-세포 기능 신호를 감소시켜, 면역계가 PD-L1 양성 암 세포를 공격하는 것을 감소시킬 수 있다. 가용성 PD-1 (sPD-1)은 PD-L1 양성 암 세포 상에 존재하는 PD-L1에 결합함으로써 미끼로서 작용할 수 있다. 예를 들어, sPD-1이 PD-L1 양성 암 세포 상에 존재하는 PD-L1에 결합할 때, PD-L1은 T-세포 상에 존재하는 PD-1과 자유롭게 상호작용하지 않아서, T-세포가 PD-L1 양성 암 세포를 공격함으로써 기능하게 한다.
본 발명은 하나 이상의 다가 PD-L1 결합 화합물을 제조하기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 본 발명은 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 PD-L1 결합 화합물을 포함하는 조성물을 제공하며, PD-1 폴리펩티드는 하나 이상의 다가 PD-L1 결합 화합물의 형태일 수 있다. PD-L1 결합 화합물은 PD-L1 양성 암 세포 상에 존재하는 PD-L1에 결합함으로써 미끼로서 작용할 수 있다.
본 발명은 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 방법 및 물질을 제공하며, PD-1 폴리펩티드는 암을 가진 포유동물을 치료하기 위해 포유동물에게 투여되는 하나 이상의 다가 PD-L1 결합 화합물의 형태일 수 있다. 일부 경우에, 다가 PD-L1 결합 화합물은 PD-L1 (예를 들어, PD-1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)에 결합할 수 있는 2개 이상의 아미노산 세그먼트를 포함한다. 다가 PD-L1 결합 화합물이 2개 이상의 PD-L1 폴리펩티드에 결합할 수 있도록, 화합물은 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드 (또는 PD-L1에 결합하는 능력을 갖는 그의 단편)를 포함한다. 본 발명은 또한 PD-L1 결합 화합물을 제조하는 방법, 및 본원에 기재된 PD-L1 결합 화합물 또는 다가 PD-L1 결합 화합물을 형성하는 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 아미노산 세그먼트를 포함하는 재조합 Ad를 포함하는 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 스캐폴드 폴리펩티드에 융합된 마우스 PD-1 폴리펩티드 및/또는 인간 PD-1 폴리펩티드는 폴리펩티드 접합체 (예를 들어, 복수개의 (예를 들어, 2개 이상의) 연관된 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체)를 형성할 수 있으며, 그에 따라 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드에 융합된 스캐폴드 폴리펩티드가 폴리펩티드 접합체에 있을 때, 폴리펩티드 접합체는 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 다가 PD-L1 결합 화합물을 형성할 수 있다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체는 3개의 아미노산 쇄를 포함할 수 있고, 스캐폴드 폴리펩티드는 포유동물 오르토레오바이러스(orthoreovirus) 3으로부터 유래된 시그마-1 폴리펩티드일 수 있고, 폴리펩티드 접합체는 3개의 PD-1 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체는 4개의 아미노산 쇄를 포함할 수 있고, 스캐폴드 폴리펩티드는 스트렙타비딘 폴리펩티드일 수 있고, 폴리펩티드 접합체는 4개의 PD-1 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 PD-L1에 결합하는 PD-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 Ad를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 마우스 PD-1 폴리펩티드 및/또는 인간 PD-1 폴리펩티드는 인자 X 단일-쇄 항체 폴리펩티드의 비타민 K-의존성 감마-카르복시글루탐산 도메인 (FX 폴리펩티드의 GLA 또는 GLA-EGF 도메인)에 융합되고, 아데노바이러스 헥손 폴리펩티드 상에 존재하여, 폴리펩티드가 바이러스 입자의 캡시드 상에 존재하는 2개 이상의 바이러스 헥손 폴리펩티드 상에 존재하는 경우, 바이러스 입자는 약 240 내지 약 720개의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 다가 PD-L1 결합 화합물을 형성할 수 있다.
본 발명은 PD-1 단백질 및/또는 PD-L1에 결합하는 아미노산 세그먼트 (예를 들어, PD-1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)를 발현하는 하나 이상의 재조합 아데노바이러스 (Ad)를 투여함으로써 암을 치료하기 위한 방법 및 물질을 제공한다. PD-1을 발현하는 재조합 Ad는 치료적 처리 요법에 따라 암 면역요법과 조합되어 투여될 수 있다.
다가 PD-L1 결합 화합물의 사용은 (예를 들어, 단량체성 PD-1 폴리펩티드와 비교하여) PD-L1 양성 암 세포 상에 존재하는 PD-L1을 중화시키는 PD-1의 효능을 증가시킬 수 있고, PD-L1 양성 암 세포가 면역계로부터 탈출하는 것을 방지하고/거나, 항암제 (예를 들어, 암 면역요법)가 PD-L1 양성 암 세포를 더욱 효과적으로 표적화할 수 있게 한다. 일부 경우에, PD-1 폴리펩티드의 아데노바이러스 제시를 이용하여, 핵산 전달을 위해 치료적 Ad를 세포 상의 PD-L1에 재표적화시킬 수 있거나, 또는 종양용해성 세포 사멸에 의해 PD-L1-발현 세포를 사멸시킬 수 있다.
한 실시양태에서, PD-L1 결합 화합물은 또한 표적화 분자를 포함할 수 있다. 표적화 및 세포 융합 분자는 바이러스 폴리펩티드, 예컨대 홍역 바이러스 (MV) 혈구응집소 (H) 폴리펩티드, MV 융합 (F) 폴리펩티드, 또는 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 당단백질 (G) 폴리펩티드일 수 있다.
PD-L1 결합 화합물은 또한 하나 이상의 치료 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 치료 폴리펩티드는 4-1BB 리간드 (4-1BBL) 폴리펩티드, OX40 리간드 (OX40L) 폴리펩티드, CD40 리간드 (CD40L) 폴리펩티드, 또는 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 폴리펩티드로부터 선택된다. 치료 폴리펩티드는 또한 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR)-관련된 단백질 (GITR) 신호전달을 활성화시키는 폴리펩티드일 수 있다.
PD-L1 결합 화합물은 또한 검출가능한 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 검출가능한 폴리펩티드는 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 루시페라제 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명은 PD-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 PD-L1 결합 화합물의 발현을 위해 재조합 벡터를 포함하고, PD-1 폴리펩티드는 하나 이상의 표적화 폴리펩티드, 및/또는 하나 이상의 치료 폴리펩티드, 및/또는 단백질 (예를 들어, 콜라겐, 엘라스틴, 라미닌, 및 피브리노겐)과 함께 발현될 수 있다. PD-1 폴리펩티드는 이종성 폴리펩티드를 갖는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. PD-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 뿐만 아니라 표적화 폴리펩티드, 치료 폴리펩티드 및 단백질을 코딩하는 핵산은 임의적으로 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터에 포함될 수 있고, 이는 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 폴리펩티드의 발현을 가능하게 한다. 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 Ad, 아데노-연관된 바이러스 (AAV), 또는 렌티바이러스일 수 있다. 바이러스 벡터는 Ad657, Ad6/57/6, 및 그의 변이체로부터 선택된 Ad일 수 있다. Ad는 조건부 복제 Ad (CRAd)일 수 있다. 바이러스 벡터는 종양용해성 바이러스 벡터일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 PD-1 폴리펩티드 및 스캐폴드 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 PD-L1 결합 화합물 (예를 들어, 복수개의 아미노산 쇄를 포함할 수 있는 폴리펩티드 접합체, 여기서 각각의 아미노산 쇄는 PD-1 폴리펩티드 및 스캐폴드 폴리펩티드를 포함하고; 복수개의 아미노산 쇄는 폴리펩티드 접합체를 형성할 수 있음)의 발현을 위한 바이러스 벡터를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암을 가진 포유동물을 치료하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 PD-L1 결합 화합물을 포함하는 조성물을 암을 가진 포유동물에게 투여하는 것을 포함할 수 있거나 또는 그로 본질적으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법은 본원에 기재된 PD-L1 결합 화합물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 결합 화합물은 1종 이상의 암 치료제와 조합되어 포유동물에게 투여되며, 그에 따라 포유동물에 존재하는 암 세포의 개수가 감소된다. 1종 이상의 암 치료제에는 PD-1 또는 PD-L1을 표적화하는 면역요법이 포함될 수 있다. 면역요법은 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 세미플리맙, 및 두르발루맙으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다가 PD-L1 결합 화합물을 포함하는 조성물을 암을 가진 포유동물에게 투여하는 것을 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진, 암을 가진 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 다가 PD-L1 결합 화합물은 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 (예를 들어, 복수개의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체, 여기서 각각의 아미노산 쇄는 PD-1 폴리펩티드 및 스캐폴드 폴리펩티드를 포함함)를 포함할 수 있다. 암은 전립선암, 유방암, 난소암, 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암), 간세포 암종, 췌장암, 신장암, 흑색종, 뇌암, 결장암, 림프종, 골수종, 림프구성 백혈병, 또는 골수성 백혈병일 수 있다. 투여에는 전신 또는 국소 투여 (예를 들어 정맥내, 종양내, 근육내, 기관내, 림프절내 투여)가 포함될 수 있다.
본 발명의 측면은 복수개의 아미노산 쇄를 포함하는 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물에 관한 것이며, 각각의 아미노산 쇄는 적어도 하나의 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 추가의 측면은 다가 PD-L1 결합 화합물이 Ig 폴리펩티드, 시그마-1 폴리펩티드 및 스트렙타비딘 폴리펩티드로부터 선택된 스캐폴드 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 접합체인 이러한 다가 PD-L1 결합 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 다가 PD-L1 결합 화합물이 1개 초과의 스캐폴드 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 접합체인 이러한 다가 PD-L1 결합 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 PD-1 폴리펩티드가 인간 PD-1 또는 뮤린 PD-1인 이러한 다가 PD-L1 결합 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 복수개의 아미노산 쇄가 치료 폴리펩티드, 표적화 폴리펩티드 또는 항원 폴리펩티드를 포함하는 것인 이러한 다가 PD-L1 결합 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 표적화 폴리펩티드가 홍역 바이러스 혈구응집소 (MVH) 폴리펩티드, 홍역 바이러스 융합 (MVF) 폴리펩티드, 및 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSVG) 폴리펩티드로부터 선택되는 것인 이러한 다가 PD-L1 결합 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 치료 폴리펩티드가 4-1BB 리간드 (4-1BBL) 폴리펩티드, OX40 리간드 (OX40L) 폴리펩티드, CD40 리간드 (CD40L) 폴리펩티드, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 폴리펩티드 및 GITR 효능제로부터 선택되는 것인 이러한 다가 PD-L1 결합 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 적어도 하나의 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) 폴리펩티드를 포함하는 각각의 아미노산 쇄가 재조합 아데노바이러스 (Ad)와 회합하고, 복수개의 아미노산 쇄가 재조합 Ad의 피막 폴리펩티드 상에 존재하는 것인 이러한 다가 PD-L1 결합 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 재조합 Ad가 Ad 균주 Ad6의 캡시드 헥손 폴리펩티드 및 Ad 균주 Ad57로부터의 적어도 하나의 캡시드 헥손 초가변 영역 (HVR) 폴리펩티드를 포함하는 것인 이러한 다가 PD-L1 결합 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 Ad 균주 Ad6의 캡시드 헥손 폴리펩티드가 Ad 균주 Ad57로부터의 HVR 폴리펩티드 1-7을 포함하는 것인 이러한 다가 PD-L1 결합 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 Ad 균주 Ad6의 캡시드 헥손 폴리펩티드가 Ad 균주 Ad57로부터의 HVR 폴리펩티드 2-6을 포함하는 것인 이러한 다가 PD-L1 결합 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) 폴리펩티드가 인간 PD-1인 이러한 다가 PD-L1 결합 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 PD-1 폴리펩티드가 인자 X 단일-쇄 항체 폴리펩티드의 비타민 K-의존성 감마-카르복시글루탐산 도메인 (FX 폴리펩티드의 GLA 도메인)에 융합된 것인 이러한 다가 PD-L1 결합 화합물이다.
본 발명의 추가의 측면은 각각의 아미노산 쇄가 홍역 바이러스 혈구응집소 (MVH) 폴리펩티드, 홍역 바이러스 융합 (MVF) 폴리펩티드, 및 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSVG) 폴리펩티드로부터 선택된 표적화 분자를 포함하는 것인 이러한 다가 PD-L1 결합 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 각각의 아미노산 쇄가 4-1BB 리간드 (4-1BBL) 폴리펩티드, OX40 리간드 (OX40L) 폴리펩티드, CD40 리간드 (CD40L) 폴리펩티드, 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 폴리펩티드로부터 선택된 하나 이상의 치료 폴리펩티드를 포함하는 것인 이러한 다가 PD-L1 결합 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 다가 PD-L1 결합 화합물 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 이러한 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 다가 PD-L1 결합 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 1종 이상의 암 치료제를 포유동물에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 이러한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 암 치료제가 PD-1을 표적화하는 면역요법인 이러한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 면역요법이 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 세미플리맙, 및 두르발루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 이러한 방법에 관한 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 발명을 실행하는 데 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에서 기술된다. 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 전문이 참고로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 추가적으로, 물질, 방법 및 예는 예시적일 뿐이고, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태의 상세사항이 하기의 첨부 도면 및 설명에서 기재된다. 본 발명의 다른 특색, 목표 및 장점이 설명 및 도면으로부터, 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1a는 예시적인 조작된 다가 PD-L1 결합 화합물의 개략도를 도시한다. 1개의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 2개의 아미노산 쇄를 포함하는 이량체 폴리펩티드 접합체인 Ig 폴리펩티드에 융합된 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 다가 PD-L1 결합 화합물. 시그마 폴리펩티드에 융합된 1개의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 3개의 아미노산 쇄를 포함하는 삼량체 폴리펩티드 접합체인 다가 PD-L1 결합 화합물. 사량체 폴리펩티드 접합체인 다가 PD-L1 결합 화합물은 스트렙타비딘 폴리펩티드에 융합된 1개의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 4개의 아미노산 쇄를 포함한다.
FX 폴리펩티드의 GLA 도메인에 융합된 1개의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄. 융합 단백질은 N-말단 또는 C-말단 상의 개체로 구축될 수 있다. 아데노바이러스 입자의 표면에 결합된 융합 단백질은 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성한다.
도 1b는 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴 또는 엘라스틴과 같은 천연 생체고분자에 PD-1 모티프를 도입함으로써 조작된 PD-L1 결합 화합물을 도시한다. PD-1과 단백질 단량체의 융합 및 세포에서의 발현은 여러 PD-L1-결합 모티프를 디스플레이하는 다가 중합체로 그들의 조립을 가능하게 할 것이다.
도 2a는 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성하기 위해 사용될 수 있는 아미노산 쇄를 코딩할 수 있는 핵산 벡터를 도시한다. 도 2a는 IgG 폴리펩티드에 융합된 1개의 뮤린 PD-1 (mPD-1) 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄를 코딩할 수 있는 핵산 벡터 (상단 좌측), IgG 폴리펩티드에 융합된 1개의 인간 PD-1 (hPD-1) 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄를 코딩할 수 있는 핵산 벡터 (상단 우측), 및 FX 폴리펩티드의 GLA 도메인에 융합된 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄를 코딩할 수 있는 핵산 벡터를 생성하기 위해 IgG를 코딩하는 핵산을 FX 폴리펩티드의 GLA 도메인을 코딩하는 핵산으로 대체하거나, 또는 시그마-1 폴리펩티드에 융합된 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄를 코딩할 수 있는 핵산 벡터를 생성하기 위해 IgG를 코딩하는 핵산을 시그마-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 대체하기 위한 예시적인 클로닝 전략 (하단)의 개략도를 도시한다.
도 2b는 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄의 발현을 도시하는 겔의 영상을 함유한다. 레인 1: 분자량 마커 (염기 쌍; bp); 레인 2: FX 폴리펩티드의 GLA 도메인에 융합된 PD-1 폴리펩티드; 레인 3: 분자량 마커 (bp); 레인 4: 시그마-1 폴리펩티드에 융합된 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄.
도 3은 FX 폴리펩티드의 GLA 도메인에 융합된 hPD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄를 코딩할 수 있는 핵산 벡터 (상단 좌측), 시그마-1 폴리펩티드에 융합된 hPD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄를 코딩할 수 있는 핵산 벡터 (상단 우측), 및 hPD-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 mPD-1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 대체하기 위한 예시적인 클로닝 전략 (하단)의 개략도를 도시한다.
도 4는 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성하기 위해 사용될 수 있는 아미노산 쇄를 코딩할 수 있는 예시적인 핵산 벡터의 개략도를 도시한다.
도 5는 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성하기 위해 사용될 수 있는 아미노산 쇄를 코딩할 수 있는 예시적인 아데노바이러스 (Ad) 벡터의 개략도를 도시한다.
도 6은 T 세포를 활성화시킬 수 있는 면역 체크포인트 폴리펩티드 (4-1BBL)를 코딩하는 핵산, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 (PD-1-X, 여기서 X는 이량체, 삼량체, 사량체 또는 중합체성 결합 스캐폴드)를 코딩하는 핵산, 및 항원, 예컨대 암 항원 또는 감염성 질환 항원 (HPV 에피토프)을 코딩하는 핵산을 갖는 Ad의 게놈의 개략도를 도시한다. Ad 게놈의 제한 부위 맵 또한 도시된다.
도 7은 헥손 및 E3 영역의 변이를 나타내는 Ad5, 6 및 57의 정렬을 도시한다. (A) Ad6 및 Ad57의 게놈의 푸스텔(Pustell) DNA 정렬. 박스는 두 바이러스 사이에서 변동이 가장 큰 헥손 및 E3 영역을 나타낸다. (B) Ad5, Ad6 및 Ad57로부터의 헥손 단백질에서 초가변 영역의 클러스털(Clustal)W 아미노산 정렬.
도 8은 Ad6 HVR을 Ad57 HVR로 대체함으로써 Ad657의 구축을 도시한다. 약어: HVR, 초가변 영역.
도 9는 E1 발현이 천연 E1 프로모터에 의해 제어되는 복제 적격성 Ad (RC-Ad); E1 발현이 전립선-특이적 프로바신 프로모터에 의해 제어되는 변이체 CRAd-프로바신-E1A (Ad-PB); p300 경로 결합이 제거되고, 정상 세포에서 IFN 경로에 대해 감수성인 CRAd-dl1101; 제거된 pRB 결합이 바이러스가 RB 경로가 파괴된 암 세포를 사멸시키게 허용하지만, RB+ 정상 세포에서는 억제되는 것인 CRAd-dl1107; p300 경로 결합이 제거되고, IFN 경로에 대해 감수성이며, 제거된 pRB 결합이 바이러스가 RB 경로가 파괴된 암 세포를 사멸시키게 허용하지만, RB+ 정상 세포에서는 억제되는 것인 CRAd-dl1101/07의 개략도이다.
도 10은 야생형 E1A 폴리펩티드의 N-말단 부분, 및 CRAd 변이체 dl1101, dl1107 및 dl1101/1107의 E1A N-말단의 아미노산 서열을 도시한다.
도 11은 C종 Ad의 예인 Ad6 및 D종 Ad의 예인 Ad26에서의 상이한 E3 면역 회피 유전자의 개략도를 도시한다. 두 Ad 모두가 E3 12.5K, 6.7K, 19K, 10.4K (RIDα), 14.5K (RIDβ), 및 14.7K 유전자의 크기 및 서열 변이체를 발현하고, 뿐만 아니라 이러한 E3 코딩 단백질의 기능을 도시한다.
도 12는 예를 들어 PEG화에 의해 또는 비오틴 어셉터 펩티드 (BAP)에 의한 "BAP화"에 의해 변형될 수 있는 Ad HVR 상의 부위를 도시한다.
도 13은 Ad 치료 사이클을 나타내는 개략도이다. A) Ad로의 혈청형-전환의 개략도. B) Ad6 및 Ad657이 공유결합 중합체 접합과 조합된 혈청형-전환에 의해 다중 라운드의 치료에 사용될 수 있는 예시적인 치료 사이클의 개략도.
도 14는 Ad657-HVR1-C로의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 접합을 도시한다. A) PEG화가 있거나 또는 없는 Ad 단백질의 SDS-PAGE. 화살표는 헥손으로의 PEG의 화학적 부착으로 인한 크기 증가를 나타낸다. B) 바이러스 감염에 대한 말레이미드-PEG에 의한 표적화된 PEG화 및 비-표적화 NHS-PEG의 효과.
도 15는 세포 및 혈액 인자와의 천연 상호작용을 조정하기 위해 상이한 Ad 혈청형으로부터의 상이한 HVR을 조합한 키메라 HVR 구축물이 세포 진입 및 세포 회피를 변화시키기 위한 상이한 HVR 내의 세포 결합 및 세포 탈표적화 펩티드의 삽입과 조합되어 약리학을 개선시킨다는 것을 나타낸다. 이러한 예에서, 단일 시스테인 아미노산이 Ad657의 HVR1 및 HVR5 내로 삽입되어, 약리학을 조정하고, 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 모이어티, 예컨대 영상화제, 예컨대 형광단의 표적화된 접합을 허용한다.
도 16은 대표적인 CRAd 및 펩티드 조합물에 대한 플라스미드 맵을 도시한다. 헥손 뿐만 아니라, 개별 HVR로의 세포 표적화 펩티드의 삽입이 도시된다.
도 17은 대표적인 CRAd 및 펩티드 조합물에 대한 플라스미드 맵을 도시한다. 헥손 뿐만 아니라, 개별 HVR로의 세포 표적화 펩티드의 삽입이 도시된다.
도 18은 대표적인 CRAd 및 펩티드 조합물에 대한 플라스미드 맵을 도시한다. 헥손 뿐만 아니라, 개별 HVR로의 세포 표적화 펩티드의 삽입이 도시된다.
도 19. PD-1 PD-L1 차단 검정 - 융합 단백질은 단백질 A 컬럼 상에서 pAd6/57/6-dl1107-DE3-RSV-hPD-1-HA-Ig-I로 감염된 세포로부터 정제되었다. 이 단백질은 양성 대조군인 프로메가(Promega) (미국 위스콘신주 매디슨)로부터의 항-PD-1 모노클로날 항체를 따라 적정되었다.
도 20. 종양 성장 평가 - B16-CAR 흑색종 세포를 C57BL/6 마우스에게 피하 주사하였고, 종양을 지정된 벡터의 3e11 바이러스 입자와 함께 주사하였다. CRAd+PD-L1 미끼는 pAd6/57/6-dl1107-ΔE3-RSV-hPD-1-HA-Ig-I이다. CRAd+PD-L1 미끼 + 면역 자극인자는 pAd6/57/6-dl1107-ΔE3-RSV-hPD-1-HA-Ig-I, 및 4-1BBL을 발현하는 제2 아데노바이러스와 공동 주사된 종양을 나타낸다.
본 발명은 PD-1 폴리펩티드를 포함하는, 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. PD-1 폴리펩티드는 다가 PD-L1 결합 화합물의 형태일 수 있다.
일부 경우에, 다가 PD-L1 결합 화합물은 PD-L1 (예를 들어, PD-1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)에 결합할 수 있는 2개 이상의 아미노산 세그먼트를 포함한다. 예를 들어, 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드 (및/또는 PD-L1에 결합하는 능력을 갖는 그의 단편)를 포함하는 다가 PD-L1 결합 화합물은 2개 이상의 PD-L1 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 다가 PD-L1 결합 화합물은 PD-L1에 결합할 수 있는 2개 이상의 아미노산 세그먼트를 포함하는 단일 아미노산 쇄를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 다가 PD-L1 결합 화합물은 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트를 각각 포함하는 복수개의 (예를 들어, 2개 이상의) 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트를 포함하는 아미노산 쇄는 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트를 포함하는 1개 이상의 다른 폴리펩티드와의 폴리펩티드 접합체 (예를 들어, 복수개의 연관된 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체)를 형성할 수 있는 스캐폴드 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드일 수 있다. 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드에 융합된 스캐폴드 폴리펩티드가 폴리펩티드 접합체에 있는 경우, 폴리펩티드 접합체는 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, PD-1 폴리펩티드를 포함하는 바이러스 입자는 다가 PD-L1 결합 화합물의 형태일 수 있고, 2개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드는 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된다.
한 실시양태에서, PD-L1 결합 화합물은 PD-1 폴리펩티드를 발현하도록 유전자 변형된 것인 재조합 바이러스를 포함하며, PD-1 폴리펩티드는 바이러스의 피막 상에 디스플레이된다. 추가의 실시양태에서, 재조합 바이러스는 재조합 바이러스 백본에 대해 이종성인 1개 이상의 폴리펩티드, 예를 들어 치료 폴리펩티드, 표적화 분자/폴리펩티드 및 항원 폴리펩티드와 조합되어 PD-1 폴리펩티드를 발현하도록 유전자 변형된다.
한 실시양태에서, PD-L1 결합 화합물은 바이러스 캡시드 단백질의 1개 이상의 헥손 초가변 영역 (HVR)에서 변형되고 적어도 1개의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 재조합 Ad (즉, Ad657, Ad6/57/6 및 그의 변이체)를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 Ad는 이종성 폴리펩티드, 예컨대 표적화 폴리펩티드, 치료 폴리펩티드 및/또는 항원을 포함하도록 추가로 변형된다. PD-1 폴리펩티드, 뿐만 아니라 이종성 폴리펩티드는 바이러스 복제시에 발현된다. 바이러스 조립시에, 발현된 폴리펩티드는 바이러스 캡시드 구조의 성분으로서 바이러스의 표면 상에 디스플레이될 수 있다.
추가의 실시양태에서, PD-L1 결합 화합물은 1개 이상의 이종성 폴리펩티드와의 융합 단백질로서 PD-1 폴리펩티드를 발현하도록 유전자 변형된 것인 재조합 Ad를 포함하고, 융합 단백질은 바이러스 입자의 캡시드 상에 디스플레이된다. 이종성 폴리펩티드는 FX 폴리펩티드, CAR 폴리펩티드, CD46 폴리펩티드, 데스모글레인 폴리펩티드, 인테그린 폴리펩티드, 단일-쇄 항체 폴리펩티드, 낙타과 항체 폴리펩티드, 캡시드 폴리펩티드, 및 외피 결합 폴리펩티드로부터의 GLA 도메인을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드일 수 있다. 한 실시양태에서, PD-1 및 이종성 폴리펩티드의 융합 단백질은 숙주 세포에서 발현되고, 정제되고, Ad와 혼합되어, 융합 단백질이 이종성 폴리펩티드와 Ad의 공유결합 부착을 통해 Ad의 표면에 결합하도록 할 수 있다. 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 제1 융합 폴리펩티드는 바이러스 입자 상의 제1 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합하고, 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 제2 융합 폴리펩티드는 해당 바이러스 입자의 제2 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 때, 바이러스 입자는 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함할 것이다.
일부 경우에, PD-L1 결합 화합물은 바이러스 입자를 포함할 수 있고, 1개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드는 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트 (예를 들어, PD-1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된다. PD-1 폴리펩티드는 바이러스 복제 및 조립 동안에 발현될 수 있고, 바이러스의 피막 상에 디스플레이될 수 있다. 한 실시양태에서, Ad (즉, Ad657, Ad6/57/6 및 그의 변이체)는 치료 폴리펩티드, 표적화 폴리펩티드 및 항원 폴리펩티드로부터 선택된 1개 이상의 이종성 폴리펩티드와 조합되어 PD-1 폴리펩티드를 발현하도록 HVR 영역에서 변형된다. PD-1 폴리펩티드는 1개 이상의 이종성 폴리펩티드와의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 입자는 적어도 1개의 PD-1 폴리펩티드 및 이종성 폴리펩티드를 각각 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄를 발현하도록 유전자 변형되며, 아미노산 쇄는 바이러스 캡시드의 성분으로서 바이러스 입자의 표면 상에 디스플레이되어 다가 PD-L1 결합 화합물을 형성한다. 일부 경우에, 바이러스 입자는 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄를 발현하도록 유전자 변형되고, 이종성 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 발현하도록 변형되며, 아미노산 쇄는 바이러스 캡시드의 성분으로서 바이러스 입자의 표면 상에 디스플레이되어 다가 PD-L1 결합 화합물을 형성한다. 일부 경우에, 아미노산 쇄는 바이러스 입자의 표면 상에 디스플레이된 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 이종성 폴리펩티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄는 이종성 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 이종성 폴리펩티드는 바이러스 입자를 코팅하도록 Ad의 표면에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 융합 단백질은 숙주 세포에서 발현되고, 정제되고, Ad와 혼합되어, 융합 단백질이 Ad 바이러스 입자의 표면을 코팅하여 다가 PD-L1 결합 화합물을 형성하도록 할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물은 (예를 들어, 단량체성 PD-1 폴리펩티드와 비교하여) PD-L1에 대해 증가된 친화도를 가질 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물은 (예를 들어, 단량체성 PD-1 폴리펩티드와 비교하여) PD-L1에 대해 증가된 결합력(avidity)을 가질 수 있다.
본 발명은 PD-1 폴리펩티드 및 다가 PD-L1 결합 화합물을 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법 및 물질, 뿐만 아니라 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성하기 위해 사용될 수 있는 아미노산 쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 바이러스를 제조하기 위한 방법 및 물질을 제공한다.
본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물 (예를 들어, 1개 또는 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체, 또는 바이러스 피막 단백질이 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하는 것인 바이러스 입자, 또는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드가 바이러스 입자의 표면에 결합된 것인 바이러스 입자)은 PD-L1에 결합할 수 있는 임의의 적절한 개수의 아미노산 세그먼트 (예를 들어, PD-L1에 결합할 수 있는 PD-1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물은 PD-L1에 결합할 수 있는 2개 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 240, 720개 또는 그 초과) 아미노산 세그먼트를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물은 PD-L1에 결합할 수 있는 약 2 내지 약 720개의 아미노산 세그먼트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물이 PD-L1에 결합할 수 있는 2개 이상의 아미노산 세그먼트를 포함하는 단일 아미노산 쇄인 경우, 다가 PD-L1 결합 화합물은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 PD-1 폴리펩티드 (또는 PD-L1에 결합하는 그의 단편)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물이 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트를 각각 포함하는 복수개의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체인 경우, 다가 PD-L1 결합 화합물은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 PD-1 폴리펩티드 (또는 PD-L1에 결합하는 그의 단편)를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물이 바이러스 입자이고, 2개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드 (예를 들어 캡시드 폴리펩티드)가 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된 경우, 다가 PD-L1 결합 화합물은 약 240개의 PD-1 폴리펩티드 내지 약 720개의 PD-1 폴리펩티드 (또는 PD-L1에 결합하는 그의 단편)를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물이 PD-L1에 결합할 수 있는 2개의 아미노산 세그먼트 (또는 1개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 PD-L1에 결합할 수 있는 2개 이상의 아미노산 세그먼트를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된 것인 바이러스 입자)를 포함하는 경우, 다가 PD-L1 결합 화합물은 이량체성 또는 2가 PD-L1 결합 화합물로 지칭될 수 있다. 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물이 PD-L1에 결합할 수 있는 3개의 아미노산 세그먼트를 포함하는 경우, 다가 PD-L1 결합 화합물은 삼량체성 또는 3가 PD-L1 결합 화합물로 지칭될 수 있다. 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물이 PD-L1에 결합할 수 있는 4개의 아미노산 세그먼트를 포함하는 경우, 다가 PD-L1 결합 화합물은 사량체성 또는 4가 PD-L1 결합 화합물로 지칭될 수 있다.
본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물은 PD-L1에 결합할 수 있는 임의의 적절한 아미노산 세그먼트(들)를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, PD-L1에 결합할 수 있는 아미노산 세그먼트는 PD-1 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, PD-L1에 결합할 수 있는 아미노산 세그먼트는 PD-1 폴리펩티드의 임의의 단편을 포함할 수 있되, 단, 상기 단편은 PD-L1에 결합하는 능력을 유지한다. 일부 경우에, PD-1 폴리펩티드는 sPD-1 폴리펩티드일 수 있다. PD-1 폴리펩티드는 임의의 적절한 동물로부터의 것일 수 있다. 일부 경우에, PD-1 폴리펩티드는 포유동물로부터의 것일 수 있다. 예를 들어, PD-1 폴리펩티드는 hPD-1 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, PD-1 폴리펩티드는 mPD-1 폴리펩티드일 수 있다. PD-1 폴리펩티드는 임의의 적절한 PD-1 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, PD-1 폴리펩티드는 (예를 들어, PD-L1과의 더 높은 친화도 상호작용을 위해) 변형될 수 있다. 예시적인 PD-1 폴리펩티드 서열 (및 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산)은 국립 생물정보 센터 (NCBI, National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스에서 예를 들어 수탁 번호 AI928135 (버전 AI928135.1), 수탁 번호 AY238517 (버전 AY238517.1), 및 수탁 번호 CR988122 (버전 CR988122.1), 수탁 번호 U64863 (버전 U64863.1), 수탁 번호 NM_008798 (버전 NM_008798.2), 및 수탁 번호 NP_032824 (버전 NP_032824.1)에 제시된 것일 수 있다. 일부 경우에, PD-1 폴리펩티드는 서열식별번호(SEQ ID NO):5에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에, PD-1 폴리펩티드는 서열식별번호:6에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 경우에, PD-L1에 결합할 수 있는 아미노산 세그먼트 (예를 들어, PD-1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)는 야생형 PD-1 폴리펩티드 서열 (예를 들어, 서열식별번호:5 또는 서열식별번호:6에 제시된 아미노산 서열을 갖는 야생형 PD-1 폴리펩티드)과는 상이한 서열 (이는 때때로 변이체 서열로 지칭됨)을 가질 수 있다. 예를 들어, PD-1 폴리펩티드 서열 (및/또는 PD-L1에 결합하는 능력을 갖는 그의 단편)은 서열식별번호:5 또는 서열식별번호:6과 적어도 80% 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, PD-L1에 결합할 수 있는 아미노산 세그먼트는 서열식별번호:5 또는 서열식별번호:6과 적어도 85% 서열 동일성, 90% 서열 동일성, 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. % 서열 동일성은 정렬된 폴리펩티드 서열에서 매칭된 위치의 개수를 결정하고, 매칭된 위치의 개수를 각각 정렬된 아미노산의 총 개수로 나누고, 100을 곱합으로써 계산된다. 매칭된 위치는 동일한 아미노산이 정렬된 서열의 동일한 위치에서 발생하는 것인 위치를 지칭한다. 정렬된 아미노산의 총 개수는 제2 서열을 정렬시키기 위해 필요한 PD-1 폴리펩티드의 아미노산의 최소 개수를 지칭하며, 비-PD-1 서열, 예컨대 PD-1 폴리펩티드에 융합된 것들 (예를 들어, PD-1 폴리펩티드에 융합된 IgG 폴리펩티드, 스트렙타비딘 폴리펩티드, 시그마-1 또는 FX 폴리펩티드의 GLA 도메인으로부터의 아미노산)과의 정렬 (예를 들어, 강제 정렬)은 포함하지 않는다. 정렬된 아미노산의 총 개수는 전체 PD-1 서열에 상응할 수 있거나 또는 전장 PD-1 서열의 단편에 상응할 수 있다. 서열은 월드 와이드 웹의 ncbi.nlm.nih.gov에서 이용가능한 BLAST (기본 국소 정렬 검색 도구, basic local alignment search tool) 프로그램에 통합된 [Altschul et al. (Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997))]에 기재된 알고리즘을 이용하여 정렬될 수 있다. BLAST 검색 또는 정렬은 Altschul 등의 알고리즘을 이용하여 PD-1 폴리펩티드와 임의의 다른 서열 또는 그의 일부분 사이의 % 서열 동일성을 결정하기 위해 수행될 수 있다. BLASTN은 핵산 서열을 정렬시키고 그들 사이의 동일성을 비교하기 위해 이용되는 프로그램인 반면에, BLASTP는 아미노산 서열을 정렬시키고 그들 사이의 동일성을 비교하기 위해 이용되는 프로그램이다. PD-1 서열과 또 다른 서열 사이의 % 동일성을 계산하기 위해 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터가 사용된다.
일부 경우에, 다가 PD-L1 결합 화합물은 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트 (예를 들어, PD-1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)를 각각 포함하는 복수개의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트를 각각 포함하는 복수개의 아미노산 쇄는 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트를 각각 포함하는 2개 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 초과) 아미노산 쇄를 지칭한다. 예를 들어, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄는 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트를 포함하는 1개 이상의 다른 폴리펩티드와의 폴리펩티드 접합체 (예를 들어, 복수개의 연관된 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체)를 형성할 수 있는 스캐폴드 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드일 수 있다. 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드에 융합된 스캐폴드 폴리펩티드가 폴리펩티드 접합체에 있을 때, 폴리펩티드 접합체는 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 복수개의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체는 동종결합체성 PD-1 폴리펩티드일 수 있다 (예를 들어, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 2개 이상의 동일한 아미노산 쇄를 포함할 수 있다). 일부 경우에, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 복수개의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체는 이종결합체성 PD-1 폴리펩티드일 수 있다 (예를 들어, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 2개 이상의 상이한 아미노산 쇄를 포함할 수 있다).
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 (예를 들어, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 복수개의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체)에 존재하는 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트 (예를 들어, PD-1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)를 포함하는 아미노산 쇄는 임의의 적절한 스캐폴드 폴리펩티드에 융합된 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체에 존재하는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄는 임의의 적절한 스캐폴드 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드일 수 있다. 일부 경우에, 스캐폴드 폴리펩티드는 폴리펩티드 접합체 (예를 들어, 복수개의 연관된 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체)를 형성하는 능력을 가질 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄는 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 접합체를 형성할 수 있다. 스캐폴드 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄가 폴리펩티드 접합체를 형성할 때, 2개 이상의 아미노산 쇄는 결합될 수 있다 (예를 들어, 공유 결합 또는 이온 결합에 의해). 스캐폴드 폴리펩티드는 또 다른 폴리펩티드와의 폴리펩티드 접합체를 형성할 수 있는 임의의 적절한 폴리펩티드일 수 있다. 스캐폴드 폴리펩티드는 천연적으로 폴리펩티드 접합체를 형성할 수 있거나, 또는 폴리펩티드 접합체를 형성하도록 조작될 수 있다. 폴리펩티드 접합체를 형성할 수 있는 스캐폴드 폴리펩티드의 예에는 비제한적으로 Ig 폴리펩티드 (예를 들어, IgG 폴리펩티드, 예컨대 IgG2 폴리펩티드), 시그마-1 폴리펩티드, 및 스트렙타비딘 폴리펩티드가 포함될 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 (예를 들어, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 복수개의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체)에 존재할 수 있는 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트 (예를 들어, PD-1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)를 포함하는 아미노산 쇄는 임의의 적절한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄는 임의의 적절한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 스캐폴드 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄의 예시적인 아미노산 서열에는 비제한적으로 서열식별번호: 7, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26 또는 27에 제시된 이들 아미노산 서열이 포함된다. 일부 경우에, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 스캐폴드 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호: 7, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26 또는 27에 제시된 아미노산 서열 중 하나와 상이한 서열 (때때로 변이체 서열로 지칭됨)을 가질 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 스캐폴드 폴리펩티드를 함유하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열식별번호: 7, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26 또는 27에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 스캐폴드 폴리펩티드를 함유하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열식별번호: 7, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26 또는 27에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 85% 서열 동일성, 90% 서열 동일성, 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. % 서열 동일성은 정렬된 폴리펩티드 서열에서 매칭된 위치의 개수를 결정하고, 매칭된 위치의 개수를 각각 정렬된 아미노산의 총 개수로 나누고, 100을 곱합으로써 계산된다. 매칭된 위치는 동일한 아미노산이 정렬된 서열의 동일한 위치에서 발생하는 것인 위치를 지칭한다. 서열은 월드 와이드 웹의 ncbi.nlm.nih.gov에서 이용가능한 BLAST (기본 국소 정렬 검색 도구) 프로그램에 통합된 [Altschul et al. (Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997))]에 기재된 알고리즘을 이용하여 정렬될 수 있다. BLAST 검색 또는 정렬은 Altschul 등의 알고리즘을 이용하여 폴리펩티드와 임의의 다른 서열 또는 그의 일부분 사이의 % 서열 동일성을 결정하기 위해 수행될 수 있다. BLASTN은 핵산 서열을 정렬시키고 그들 사이의 동일성을 비교하기 위해 이용되는 프로그램인 반면에, BLASTP는 아미노산 서열을 정렬시키고 그들 사이의 동일성을 비교하기 위해 이용되는 프로그램이다. 폴리펩티드 서열과 또 다른 서열 사이의 % 동일성을 계산하기 위해 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터가 사용된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 (예를 들어, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 복수개의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체)에 존재할 수 있는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄는 실시예 7에 제시된 것일 수 있다.
일부 경우에, PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트 (예를 들어, PD-1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)를 포함하는 아미노산 쇄는 2개의 연관된 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체를 형성할 수 있는 스캐폴드 폴리펩티드 (예를 들어, IgG 폴리펩티드, 예컨대 IgG2 폴리펩티드)에 융합될 수 있다. 예를 들어, IgG2 폴리펩티드에 융합된 1개의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 2개의 아미노산 쇄는 2개의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 접합체를 형성할 수 있다. IgG2 폴리펩티드에 융합된 1개의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄의 예시적인 아미노산 서열에는 비제한적으로 서열식별번호:7, 서열식별번호:13, 또는 서열식별번호:21에 제시된 이들 아미노산 서열이 포함된다.
일부 경우에, PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트 (예를 들어, PD-1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)를 포함하는 아미노산 쇄는 3개의 연관된 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체를 형성할 수 있는 스캐폴드 폴리펩티드 (예를 들어, 시그마-1 폴리펩티드)에 융합될 수 있다. 예를 들어, 시그마-1 폴리펩티드에 융합된 1개의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 3개의 아미노산 쇄는 3개의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 접합체를 형성할 수 있다. 시그마-1 폴리펩티드에 융합된 1개의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄의 예시적인 아미노산 서열에는 비제한적으로 서열식별번호:10, 서열식별번호:16, 또는 서열식별번호:24에 제시된 아미노산 서열이 포함된다.
일부 경우에, PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트 (예를 들어, PD-1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)를 포함하는 아미노산 쇄는 4개의 연관된 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체를 형성할 수 있는 스캐폴드 폴리펩티드 (예를 들어, 스트렙타비딘 폴리펩티드)에 융합될 수 있다. 예를 들어, 스트렙타비딘 폴리펩티드에 융합된 1개의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 4개의 아미노산 쇄는 4개의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 접합체를 형성할 수 있다. 스트렙타비딘 폴리펩티드에 융합된 1개의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄의 예시적인 아미노산 서열에는 비제한적으로 서열식별번호:11 또는 서열식별번호:17에 제시된 이들 아미노산 서열이 포함된다.
일부 경우에, 다가 PD-L1 결합 화합물은 바이러스 입자를 포함할 수 있고, 2개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드는 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트 (예를 들어, PD-1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된다. 예를 들어, 바이러스 입자는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 각각 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄로 바이러스 입자를 코팅함으로써 변형될 수 있다. 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성하도록 바이러스 입자를 코팅하기 위해 사용될 수 있는 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트 (예를 들어, PD-1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)를 포함하는 아미노산 쇄 (예를 들어, 2개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된 것인 바이러스 입자)는 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 임의의 적절한 폴리펩티드에 융합된 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 1개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드에 공유결합에 의해 결합할 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 높은 친화도 (예를 들어, 약 0.25 μM 내지 약 100 μM)로 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 바이러스 피막 폴리펩티드에 천연적으로 결합할 수 있거나, 또는 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합하도록 조작된다. 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 임의의 적절한 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있다.
바이러스 피막 폴리펩티드의 예에는 비제한적으로 캡시드 폴리펩티드 (예를 들어, 헥손 폴리펩티드, 섬유 폴리펩티드, 펜톤 폴리펩티드), 및 아데노바이러스 IX 폴리펩티드가 포함된다. 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드는 임의의 적절한 유형의 바이러스 입자 상에 존재하는 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 바이러스 입자는 복제 적격성 (RC) 바이러스 입자 (예를 들어, 헬퍼-의존성 (HD) 바이러스 입자 및 단일-사이클 (SC) 바이러스 입자)일 수 있거나, 바이러스 입자는 복제-결함성 (RD) 바이러스 입자일 수 있거나, 또는 바이러스는 조건부 복제 바이러스 입자 (CRAd)일 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 입자는 종양용해성 바이러스 입자일 수 있다.
일부 경우에, 바이러스 입자는 바이러스 벡터일 수 있다. 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄로 코팅될 수 있는 바이러스 입자의 예에는 비제한적으로 Ad, 아데노-연관된 바이러스 (AAV), 렌티바이러스, 엔테로바이러스, 레오바이러스, 수두 바이러스, 홍역 바이러스, 및 헤르페스 바이러스가 포함된다.
바이러스 피막 폴리펩티드 상에 존재할 수 있는 폴리펩티드의 예에는 비제한적으로 GLA 도메인 폴리펩티드 (예를 들어, FX 폴리펩티드로부터의 GLA 도메인), CAR 폴리펩티드, CD46 폴리펩티드, 데스모글레인 폴리펩티드, 인테그린 폴리펩티드, 단일-쇄 항체 폴리펩티드, 낙타과 항체 폴리펩티드, 캡시드 폴리펩티드, 및 외피 결합 폴리펩티드가 포함된다.
다가 PD-L1 결합 화합물을 생성하기 위해 바이러스 입자를 코팅하는데 사용될 수 있는 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트 (예를 들어, PD-1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)를 포함하는 아미노산 쇄 (예를 들어, 1개 또는 2개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된 것인 바이러스 입자)는 임의의 적절한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 입자는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드, 및 아미노산 쇄가 바이러스 입자를 코팅하도록 바이러스 피막 폴리펩티드에 공유결합에 의해 결합할 수 있는 폴리펩티드를 각각 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄를 포함하는 조성물과 접촉할 수 있다. 일부 경우에, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드일 수 있다. 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄는 임의의 적절한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄의 예시적인 아미노산 서열에는 비제한적으로 서열식별번호: 8, 9, 14, 15, 22 또는 23에 제시된 이들 아미노산 서열이 포함된다. 일부 경우에, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호: 8, 9, 14, 15, 22 또는 23에 제시된 아미노산 서열 중 하나와 상이한 서열 (때때로 변이체 서열로 지칭됨)을 가질 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 함유하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열식별번호: 8, 9, 14, 15, 22 또는 23에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 함유하는 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열식별번호: 8, 9, 14, 15, 22 또는 23에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 85% 서열 동일성, 90% 서열 동일성, 95% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. % 서열 동일성은 정렬된 폴리펩티드 서열에서 매칭된 위치의 개수를 결정하고, 매칭된 위치의 개수를 각각 정렬된 아미노산의 총 개수로 나누고, 100을 곱합으로써 계산된다. 매칭된 위치는 동일한 아미노산이 정렬된 서열의 동일한 위치에서 발생하는 것인 위치를 지칭한다. 서열은 BLAST (기본 국소 정렬 검색 도구) 프로그램에 통합된 [Altschul et al. (Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997))]에 기재된 알고리즘을 이용하여 정렬될 수 있다. 일부 경우에, 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄는 실시예에 제시된 것일 수 있다.
일부 경우에, 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드 (예를 들어, FX 폴리펩티드의 GLA 도메인)에 융합된 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트 (예를 들어, PD-1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)를 포함하는 아미노산 쇄를 사용하여 바이러스 입자를 코팅하여 (예를 들어, 1개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드를 변형시켜), 바이러스 입자의 표면 상에 존재하는 1개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합된 PD-L1에 결합할 수 있는 1개 이상의 아미노산 세그먼트를 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄를 갖는 코팅된 바이러스 입자를 형성할 수 있다.
예를 들어, FX 폴리펩티드의 GLA 도메인에 융합된 1개의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 2개 이상의 바이러스 헥손 폴리펩티드 및/또는 다른 바이러스 피막 단백질에 결합시켜, FX 폴리펩티드의 GLA 도메인에 융합된 1개의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄로 바이러스 입자를 코팅할 수 있다. 바이러스 입자가 Ad일 때, 240개의 헥손 폴리펩티드 동종삼량체 (예를 들어, 3개의 헥손 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 접합체)가 바이러스 입자 상에 존재할 수 있다 (예를 들어, [Chen et al., Human gene therapy,　21:739-749 (2010)] 참고). 일부 경우에, 1개의 PD-1 폴리펩티드 및 FX 폴리펩티드의 GLA 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 사용하여 Ad 입자를 코팅하여, 약 240개의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성할 수 있다. 예를 들어, FX 폴리펩티드의 GLA 도메인에 융합된 1개의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드가 Ad 바이러스 입자 상의 각각의 헥손 폴리펩티드 삼량체에 결합된 경우, 바이러스 입자는 240개의 PD-1 폴리펩티드를 포함할 것이다. 일부 경우에, 1개의 PD-1 폴리펩티드 및 FX 폴리펩티드의 GLA 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 사용하여 Ad 입자를 코팅하여, 약 240개의 PD-1 폴리펩티드 내지 약 720개의 PD-1 폴리펩티드를 포함할 수 있는 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성할 수 있다. 예를 들어, FX 폴리펩티드의 GLA 도메인에 융합된 1개의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드가 Ad 바이러스 입자 상의 각각의 헥손 폴리펩티드에 결합된 경우, 바이러스 입자는 720개의 PD-1 폴리펩티드를 포함할 것이다.
일부 경우에, 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물 (예를 들어, 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 1개 또는 2개 이상의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체, 또는 2개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하는 것인 바이러스 입자, 또는 1개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하는 것인 바이러스 입자) 또한 하나 이상의 추가의 분자/폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물에 포함될 수 있는 분자의 예에는 비제한적으로 표적화 분자 (예를 들어, 표적화 폴리펩티드 및 표적화 핵산 서열), 항원, 치료 분자, 및 검출가능한 폴리펩티드가 포함된다. 일부 경우에, 다가 PD-L1 결합 화합물이 PD-L1에 결합하는 능력을 갖는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및/또는 PD-1 폴리펩티드 단편을 각각 포함하는 복수개의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체이고, 폴리펩티드 접합체가 하나 이상의 추가의 분자를 포함하는 경우, 하나 이상의 추가의 분자는 폴리펩티드 접합체에 존재하는 PD-L1에 결합하는 능력을 갖는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및/또는 PD-1 폴리펩티드 단편을 포함하는 적어도 1개의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과) 아미노산 쇄에 포함될 수 있다. 예를 들어, 다가 PD-L1 결합 화합물이 PD-L1에 결합하는 능력을 갖는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및/또는 PD-1 폴리펩티드 단편을 각각 포함하는 복수개의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체이고, 폴리펩티드 접합체가 하나 이상의 추가의 분자를 포함하는 경우, 하나 이상의 추가의 분자는 폴리펩티드 접합체에 존재하는 PD-L1에 결합하는 능력을 갖는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및/또는 PD-1 폴리펩티드 단편을 포함하는 각각의 아미노산 쇄에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 다가 PD-L1 결합 화합물이 2개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 PD-L1에 결합하는 능력을 갖는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및/또는 PD-1 폴리펩티드 단편을 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된 것인 바이러스 입자 (또는 1개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 PD-L1에 결합하는 능력을 갖는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및/또는 PD-1 폴리펩티드 단편을 포함하는 2개 이상의 아미노산 세그먼트를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하는 것인 바이러스 입자)인 경우, 하나 이상의 추가의 분자는 바이러스 입자 상의 바이러스 피막 폴리펩티드를 변형시키기 위해 사용되는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및/또는 PD-1 폴리펩티드 단편을 포함하는 적어도 1개의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과) 아미노산 쇄에 포함될 수 있다. 예를 들어, 다가 PD-L1 결합 화합물이 2개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 PD-L1에 결합하는 능력을 갖는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및/또는 PD-1 폴리펩티드 단편을 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된 것인 바이러스 입자 (또는 1개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 PD-L1에 결합하는 능력을 갖는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및/또는 PD-1 폴리펩티드 단편을 포함하는 2개 이상의 아미노산 세그먼트를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된 것인 바이러스 입자)인 경우, 하나 이상의 추가의 분자는 바이러스 입자 상의 바이러스 피막 폴리펩티드를 변형시키기 위해 사용되는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및/또는 PD-1 폴리펩티드 단편을 포함하는 각각의 아미노산 쇄에 포함될 수 있다.
본원에 기재된 PD-L1 결합 화합물이 하나 이상의 표적화 분자 (예를 들어, 표적화 폴리펩티드 및 표적화 핵산 서열) 또한 포함하는 경우, 표적화 분자는 임의의 적절한 표적화 분자일 수 있다. 일부 경우에, 표적화 분자는 폴리펩티드 (예를 들어, 표적화 폴리펩티드)일 수 있다. 일부 경우에, 표적화 분자는 핵산 서열 (예를 들어, 표적화 핵산 서열)일 수 있다. 일부 경우에, 표적화 분자는 T-세포를 PD-L1 양성 세포 (예를 들어, PD-L1 양성 암 세포)에 유인할 수 있다. 예를 들어, 표적화 분자를 포함하는 다가 PD-L1 결합 화합물이 PD-L1 양성 세포 상의 PD-L1에 결합된 경우, 다가 PD-L1 결합 화합물 상의 표적화 분자는 T 세포를 PD-L1 양성 세포에 유인할 수 있다. 예를 들어, 다가 PD-L1 결합 화합물이 표적화 분자를 포함하는 경우, 다가 PD-L1 결합 화합물 상의 표적화 분자는 다가 PD-L1 결합 화합물을 포유동물 내의 표적 위치 (예를 들어, 표적 조직)로 지시할 수 있다. 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물에 포함될 수 있는 표적화 분자의 예에는 바이러스 폴리펩티드, 항원 (예를 들어, 펩티드 항원), miRNA 표적화 서열 (예를 들어, 조직-특이적 miRNA 표적화 서열), 항체, 성장 인자, 및 탄수화물이 포함된다. 표적화 폴리펩티드가 바이러스 폴리펩티드인 경우, 바이러스 폴리펩티드는 임의의 적절한 바이러스 (예를 들어, 홍역 바이러스 (MV), 개 홍역 바이러스 (CDV), 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 긴팔 원숭이 유인원 백혈병 바이러스 (GALV), 지카 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 및 인간 내인성 레트로바이러스 (HERV))로부터 유래될 수 있다. 표적화 폴리펩티드가 바이러스 폴리펩티드인 경우, 바이러스 폴리펩티드는 임의의 적절한 바이러스 폴리펩티드 (예를 들어, 혈구응집소 (H) 폴리펩티드, 예컨대 탈표적화된 H 폴리펩티드, 융합 (F) 폴리펩티드, 바이러스 당단백질 (G) 폴리펩티드, 외피 (env; 예를 들어, HERV env), 신시틴-1, 및 신시틴-2일 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 폴리펩티드는 MV H 폴리펩티드일 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 폴리펩티드는 MV F 폴리펩티드일 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 폴리펩티드는 VSV G 폴리펩티드일 수 있다.
본원에 기재된 PD-L1 결합 화합물이 하나 이상의 치료 분자를 또한 포함하는 경우, 치료 분자는 임의의 적절한 치료 분자일 수 있다. 일부 경우에, 치료 분자는 치료 폴리펩티드일 수 있다. 일부 경우에, 치료 분자는 하나 이상의 T 세포의 PD-L1 불활성화를 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 일부 경우에, 치료 분자는 하나 이상의 약제 (예를 들어, 항암 약물)를 활성화시키고/거나 축적시킬 수 있다. 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물에 포함될 수 있는 치료 분자의 예에는 4-1BB 리간드 (4-1BBL) 폴리펩티드, OX40 리간드 (OX40L) 폴리펩티드, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 폴리펩티드, 항-PD-1 항체, 항-PD-1 항체를 코딩하는 핵산, 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 및 아이오다이드 동시 수송체가 포함된다. 일부 경우에, 치료 분자는 치료 항체일 수 있다. 치료 항체는 GITR을 표적화하는 효능제 항체일 수 있다. GITR을 통한 신호전달은 T-세포 증식 및 이펙터 기능을 증강시키고, T 세포를 활성화-유도된 세포 사멸로부터 보호하고, 이는 기억 T 세포의 빈도를 증가시킨다. GITR 효능제와 본 발명의 PD-L1 결합 화합물의 조합은 강한 상승작용을 입증할 수 있다.
본원에 기재된 PD-L1 결합 화합물이 하나 이상의 검출가능한 폴리펩티드를 또한 포함하는 경우, 검출가능한 폴리펩티드는 임의의 적절한 검출가능한 폴리펩티드일 수 있다. 일부 경우에, 검출가능한 폴리펩티드는 본원에 기재된 하나 이상의 PD-L1 결합 화합물의 위치를 결정하기 위해 (예를 들어, 임상의에 의해) 검출될 수 있다. 일부 경우에, 검출가능한 폴리펩티드는 본원에 기재된 하나 이상의 다가 PD-L1 결합 화합물의 지속성을 모니터링하기 위해 (예를 들어, 임상의에 의해) 검출될 수 있다. 본원에 기재된 PD-L1 결합 화합물에 포함될 수 있는 검출가능한 폴리펩티드의 예는 형광 폴리펩티드 (예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP), 루시페라제 폴리펩티드, 펩티드 표지, 및 아이오딘화나트륨 동시 수송체로부터 선택된다.
이 문서는 또한 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물 (예를 들어, 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체, 또는 1개 또는 2개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된 것인 바이러스 입자, 또는 1개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된 것인 바이러스 입자)을 생성하기 위해 사용될 수 있는 본원에 기재된 아미노산 쇄 (예를 들어, 스캐폴드 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄, 또는 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄)를 코딩할 수 있는 핵산 (예를 들어, 핵산 벡터) 또한 제공한다. 일부 경우에, 핵산은 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 아미노산 쇄를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 스캐폴드 폴리펩티드를 포함하는 아미노 쇄를 코딩할 수 있다. 일부 경우에, 핵산은 1개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하는 것인 바이러스 입자를 생성하기 위해 사용될 수 있는 아미노산 쇄를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드 및 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 아미노 쇄를 코딩할 수 있다.
본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성하기 위해 사용될 수 있는 본원에 기재된 아미노산 쇄 (예를 들어, 스캐폴드 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄, 또는 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄)를 코딩하는 핵산 (예를 들어, 핵산 벡터)은 DNA (예를 들어, DNA 구축물), RNA (예를 들어, mRNA), 또는 이들의 조합물로부터 선택된 핵산일 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 아미노산 쇄를 코딩하는 핵산은 벡터 (예를 들어, 발현 벡터 또는 바이러스 벡터)일 수 있다. 벡터는 RC 벡터 (예를 들어, HD 벡터 및 SC 벡터)일 수 있거나, 또는 벡터는 RD 벡터일 수 있다. 벡터가 바이러스 벡터인 경우, 바이러스 벡터는 임의의 적절한 유형의 바이러스로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 종양용해성 바이러스로부터 유래될 수 있다. 바이러스 벡터가 유래될 수 있는 바이러스의 예에는 비제한적으로 Ad, 아데노-연관된 바이러스 (AAVs), 렌티바이러스, 엔테로바이러스, 레오바이러스, 수두 바이러스, 홍역 바이러스, 및 헤르페스 바이러스가 포함된다.
일부 경우에, 본원에 기재된 아미노산 쇄를 코딩하는 핵산은 하나 이상의 조절 요소 (예를 들어, 아미노산 쇄의 발현을 조절하기 위해)를 또한 포함할 수 있다. 본원에 기재된 아미노산 쇄를 코딩하는 핵산에 포함될 수 있는 조절 요소의 예에는 비제한적으로 프로모터 (예를 들어, 구성적 프로모터, 조직/세포-특이적 프로모터, 및 유도성 프로모터, 예컨대 화학적으로 활성화된 프로모터 및 빛에 의해 활성화된 프로모터), 인핸서, 발현이 아팝토시스, 괴사, 및 다른 형태의 세포 사멸을 유도할 수 있는 핵산 서열 (예를 들어, 자살 유전자)이 포함된다.
일부 경우에, 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물 (예를 들어, 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체, 또는 2개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된 것인 바이러스 입자, 또는 1개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된 것인 바이러스 입자)을 생성하기 위해 사용될 수 있는 본원에 기재된 아미노산 쇄 (예를 들어, 스캐폴드 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄, 또는 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄)를 코딩하는 핵산 (예를 들어, 핵산 벡터)은 2개 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과) 본원에 기재된 아미노산 쇄를 생성할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물 (예를 들어, 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체, 또는 2개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된 것인 바이러스 입자, 또는 1개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된 것인 바이러스 입자)을 생성하기 위해 사용될 수 있는 본원에 기재된 아미노산 쇄 (예를 들어, 스캐폴드 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄, 또는 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄)를 코딩하는 핵산 (예를 들어, 핵산 벡터)은 1개 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과) 본원에 기재된 아미노산 쇄를 연속해서 생성할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물 (예를 들어, 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체, 또는 2개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된 것인 바이러스 입자, 또는 1개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하도록 변형된 것인 바이러스 입자)을 생성하기 위해 사용될 수 있는 본원에 기재된 아미노산 쇄 (예를 들어, 스캐폴드 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄, 또는 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 쇄)를 코딩하는 핵산 (예를 들어, 핵산 벡터)은 핵산의 지속성 기간 동안에 (예를 들어, 핵산이 폐기될 때까지) 1개 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과) 본원에 기재된 아미노산 쇄를 생성할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 쇄를 이용하여 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성할 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄는 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체에 조립되어 (예를 들어, 자가 조립되어) 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체를 생성할 수 있다. 스캐폴드 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄가 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 2개 이상의 아미노산 쇄를 포함하는 폴리펩티드 접합체에 접합되어 폴리펩티드 접합체를 생성하는 경우, 아미노산 쇄는 생체내에서 또는 시험관내에서 조립할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄는 바이러스 입자의 표면 상에 존재하는 2개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합하여 코팅하여 본원에 기재된 코팅된 바이러스 입자를 생성할 수 있다. 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드에 융합된 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄가 바이러스 입자를 코팅하여 코팅된 바이러스 입자를 생성하는 경우, 바이러스 입자는 생체내에서 또는 시험관내에서 코팅될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물은 정제될 수 있다. "정제된" 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산은 성분들의 혼합물에서 주요 성분을 예를 들어 30 중량% 이상, 40 중량% 이상, 50 중량% 이상, 60 중량% 이상, 70 중량% 이상, 80 중량% 이상, 90 중량% 이상, 95 중량% 이상, 또는 99 중량% 이상 구성하는 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭한다. 예를 들어, 정제된 다가 PD-L1 결합 화합물은 하나 이상의 다가 PD-L1 결합 화합물을 함유하는 조성물의 약 30 중량% 이상을 구성할 수 있다. 폴리펩티드는 친화도 크로마토그래피 및 면역흡착 친화도 컬럼을 비롯하여 이로 제한되지 않는 방법에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성하기 위해 사용될 수 있는 아미노산 쇄를 코딩하는 정제된 핵산은 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성하기 위해 사용될 수 있는 1개 이상의 아미노산 쇄를 함유하는 조성물의 약 30 중량% 이상을 구성할 수 있다. 핵산은 페놀-클로로포름 추출 및 컬럼 정제 (예를 들어, 미니-컬럼 정제)를 비롯하여 이로 제한되지 않는 방법에 의해 정제될 수 있다.
대안적으로, 본 발명은 PD-1에 결합할 수 있는 2개 이상의 아미노산 세그먼트 (예를 들어, PD-L1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)를 포함하는 다가 PD-1 결합 화합물, 뿐만 아니라 PD-1에 결합할 수 있는 2개 이상의 아미노산 세그먼트 (예를 들어, PD-L1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)를 포함하는 다가 PD-1 결합 화합물의 제조 및 사용 방법 또한 제공한다. 일부 경우에, 다가 PD-1 결합 화합물은 PD-1에 결합할 수 있는 2개 이상의 아미노산 세그먼트 (예를 들어, PD-L1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 PD-L1 폴리펩티드 (및/또는 PD-1에 결합하는 능력을 갖는 그의 단편)을 포함하는 다가 PD-1 결합 화합물은 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 다가 PD-1 결합 화합물은 PD-1에 결합할 수 있는 2개 이상의 아미노산 세그먼트를 포함하는 단일 아미노산 쇄를 포함할 수 있다.
예를 들어 본원에 기재된 하나 이상의 다가 PD-L1 결합 화합물을 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하기 위한 방법 및 물질 또한 본원에 제공된다. 하나 이상의 다가 PD-L1 결합 화합물은 치료 폴리펩티드와 조합되어 대상체에게 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 다가 PD-L1 결합 화합물은 암 치료를 위해 대상체에게 투여되는 치료 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 다가 PD-L1 결합 화합물은 암을 치료하기 위해 대상체에게 치료 폴리펩티드를 발현하는 Ad와 공동 투여된다.
본 발명은 2개 이상의 바이러스 피막 폴리펩티드가 1개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하는 것인 바이러스 입자를 포함한다. 바이러스 입자는 바이러스 입자의 캡시드 단백질에서 PD-1 융합 단백질을 비롯하여 PD-1 폴리펩티드를 포함하는 재조합 바이러스 입자일 수 있다. 바이러스 입자는 PD-1 폴리펩티드, 예를 들어 PD-1 융합 단백질로 코팅된 바이러스 입자일 수 있다.
한 실시양태에서, PD-L1 결합 화합물이 재조합 바이러스를 포함하는 경우, 바이러스는 재조합 Ad, 예를 들어 Ad 균주 Ad657 또는 Ad 균주 Ad6/57/6, 및 그의 변이체이다. 재조합 Ad는 조건부 복제 Ad (CRAd)이도록 변형될 수 있다. 이러한 재조합 Ad는 미국 출원 일련 번호 16/690,733에 기재되어 있으며, 그의 개시내용은 전체가 본원에 제시된 것과 같이 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 1개 또는 2개 이상의 PD-1 폴리펩티드를 각각 포함하는 1개 이상의 아미노산 쇄를 포함하는 재조합의 조건부 복제 Ad 바이러스 입자, 또는 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성하기 위해 사용될 수 있는 아미노산 쇄를 코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 경우에, 본원에 기재된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해성 항암 활성을 갖는 재조합 Ad, 예컨대 재조합 Ad657)는 1개 이상의 핵산 결실을 함유하는 Ad 게놈을 포함할 수 있다. 핵산 결실은 전체 결실 (예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 결실) 또는 부분 결실 (예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 내의 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실)일 수 있다. 핵산 결실은 결실된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 전사 및 번역을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 일부 경우에, 감염성 자손의 생성과 연관된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 결실될 수 있다. 본원에 기재된 재조합 Ad에서 결실 및/또는 변형될 수 있는 핵산의 예는 E1 (예를 들어, E1A 및 E1B), E2, E3, E4, pIIIA, 섬유, E1B를 코딩할 수 있고, 바이러스 인핸서 및 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해성 항암 활성을 갖는 재조합 Ad, 예컨대 재조합 Ad657)는 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 내에 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 함유하는 Ad 게놈을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 재조합 Ad는 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 내에 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본원에 기재된 재조합 Ad는 예를 들어 서열식별번호:41의 핵산을 포함하는 프로바신 프로모터를 포함하도록 변형되고, E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에서 dl1101 결실을 포함하도록 변형되고; 본원에 기재된 재조합 Ad는 E1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에서 dl1107 결실을 포함하도록 변형되고; 본원에 기재된 재조합 Ad는 dl1101 결실 및 dl1107 결실을 포함하도록 변형된다. E1a에 대한 dl1101 변형은 p300에 결합하는 것을 방지하고, 바이러스가 인터페론 (INF) 억제에 대해 감수성이게 만든다. E1a에서 dl1107 돌연변이는 pRB에 대한 그의 결합을 방지하여 온전한 pRB 경로를 갖는 세포에서 바이러스 복제를 차단한다. E1A 폴리펩티드, 예를 들어 야생형 Ad E1A, 및 CRAd-657-dl1101, CRAd-657-dl1107 및 CRAd-657-dl1101/1107 변이체의 N-말단 아미노산 서열에 대해서는 도 10을 참고한다.
바이러스를 조건부 복제 Ad (CRAd)로 전환시키기 위해 E1 단백질에서 돌연변이를 수반하는 Ad6, Ad657 및 그의 변이체에서 돌연변이의 개략도가 도 9 및 도 10에 도시된다. 이들에는 각각 p300 및 pRB에 결합하는 것을 차단하는 dl1101 및/또는 dl1107이 포함된다.
도 10은 야생형 Ad의 E1A, 뿐만 아니라 Ad 변이체 E1A dl1101, E1A dl1107 및 E1A dl1101/1107의 N-말단 아미노산 서열을 도시한다.
CRAd인 Ad-PB를 생성하기 위해 Ad E1 프로모터를 전립선-특이적 프로모터 프로바신-E1 DNA 서열 (서열식별번호:41)로 대체하는 것 또한 도시된다 (도 9). 프로바신 프로모터는 안드로겐 의존성이어서, DU145와 같은 안드로겐-내성 종양에서가 아니라 LNCaP와 같은 안드로겐-민감성 종양에서 작동할 것이다.
본 발명의 복제 적격성 Ad, 뿐만 아니라 CRAd는 하나 이상의 치료 폴리펩티드를 발현하도록 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 방법에 의해 유전자 변형된다. 치료 폴리펩티드는 면역 자극 폴리펩티드, 예를 들어 CD40L, 4-1BBL, OX40, GM-CSF, 및 이들의 조합물일 수 있다.
더욱이, 한 실시양태에서, 본 발명의 복제 적격성 Ad, 뿐만 아니라 CRAd는 융합 단백질로서 PD-1 폴리펩티드 및 하나 이상의 치료 폴리펩티드 둘 다를 발현하도록 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 방법에 의해 유전자 변형된다.
본 발명의 복제 적격성 Ad, 뿐만 아니라 CRAd는 변형된 섬유/놉(knob) 캡시드 단백질을 포함하도록 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 방법에 의해 유전자 변형될 수 있다. Ad 섬유 단백질은 초기 부착 단계를 매개하는 3개의 외관상 동일한 서브유닛의 복합체이다. 천연 Ad6 섬유 단백질 (서열식별번호:35)은 CAR에 결합한다.
본 발명의 추가의 측면에서, 모체 Ad에 대해 천연이 아닌 섬유/놉 단백질에서 상이한 섬유 단백질 또는 변형을 갖는 섬유-변형된 재조합 Ad를 생성하였다. 상이한 Ad 균주로부터의 캡시드 단백질, 및 이종성 섬유/놉 단백질을 포함하는, CRAd를 비롯한 재조합 Ad, 예를 들어 이종성 Ad35 섬유 폴리펩티드 또는 침팬지 C68 섬유 폴리펩티드, +/- K7 펩티드를 포함하는 재조합 Ad를 생성하였다.
키메라 Ad인 AdF35 섬유 키메라는 서열식별번호:36의 아미노산 서열을 갖고, Ad5 및 Ad6 섬유 단백질보다 더 짧으며, 바이러스를 CD46에 대해 재표적화한다.
서열식별번호:37의 서열을 갖는 K7 섬유를 포함하는 섬유-변형된 재조합 Ad는 바이러스를 세포 상의 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 및 음전하에 대해 표적화한다.
서열식별번호:38의 서열을 포함하는 재조합 키메라 Ad인 6/FC68 섬유는 침팬지 아데노바이러스 C68로부터의 섬유 단백질을 갖는 키메라 Ad이다. 섬유 단백질이 Ad5 또는 Ad6 섬유 단백질보다 더 짧고, CAR에 결합한다.
서열식별번호:39의 서열을 포함하는 재조합 키메라 Ad인 6/FC68-K7 섬유는 침팬지 아데노바이러스 C68로부터의 섬유 단백질을 갖는 키메라 Ad이다. 섬유 단백질이 Ad5 또는 Ad6 섬유 단백질보다 짧다. 6/FC68-K7 섬유는 CAR에 결합하고, 헤파린 술페이트 및 음전하에 대해 재표적화된다.
서열식별번호:40의 서열을 포함하는 재조합 키메라 Ad인 6/FC68-HI-K7 섬유는 침팬지 아데노바이러스 C68로부터의 섬유 단백질을 갖는 키메라 Ad이다. 섬유 단백질이 Ad5 또는 Ad6 섬유 단백질보다 짧다. 6/FC68-HI-K7 섬유는 CAR에 결합하고, 헤파린 술페이트 및 음전하에 대해 재표적화된다.
일부 경우에, 본원에 기재된 재조합 Ad (예를 들어, 종양용해성 항암 활성을 갖는 재조합 Ad, 예컨대 재조합 Ad657)는 1개 이상의 핵산 삽입을 함유하는 Ad 게놈을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 삽입은 폴리펩티드, 예를 들어 치료 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 핵산은 본원에 기재된 재조합 Ad의 게놈 내의 임의의 적절한 위치에 삽입될 수 있다. 일부 경우에, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 본원에 기재된 재조합 Ad의 게놈의 HVR (예를 들어, HVR 5 루프)에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 본원에 기재된 재조합 Ad의 게놈의 HVR에 삽입될 때, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 1개 이상의 폴리펩티드를 발현할 수 있고, 발현된 폴리펩티드(들)는 재조합 Ad의 캡시드에 혼입될 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 본원에 기재된 재조합 Ad의 게놈의 HVR 영역에 삽입될 때, 재조합 Ad는 삽입된 핵산에 의해 코딩되는 약 1 내지 약 720개의 폴리펩티드를 그의 표면 상에 제시할 수 있다. 핵산 삽입은 임의의 적절한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산일 수 있다. 일부 경우에, 핵산 삽입은 치료 폴리펩티드, 폴리펩티드 항원 또는 시토카인을 코딩할 수 있다.
일반적으로, Ad는 본원에 기재된 CRAd 변형을 포함하도록 변형될 수 있다.
한 실시양태에서, 재조합 Ad는 p300에 결합하는 것을 방지하고 바이러스가 IFN 억제에 대해 감수성이게 만드는 E1a에 대한 dl1101 변형, 및 pRB에 대한 그의 결합을 방지하여 온전한 pRB 경로를 갖는 세포에서 바이러스 복제를 차단하는 E1a에서 dl1107 돌연변이, 및 E3A 결실을 갖는 조건부 복제 Ad이다. CRAd는 인간 면역글로불린에 융합된 인간 PD-1을 발현한다.
한 실시양태에서, 재조합 Ad (예를 들어 Ad657)는 p300에 결합하는 것을 방지하고 바이러스가 IFN 억제에 대해 감수성이게 만드는 E1a에 대한 dl1101 변형, 및 E3A 결실을 갖는 조건부 복제 Ad이다. CRAd는 바이러스 입자의 표면 상에서 인간 인자 X (GLA)에 융합된 인간 PD-1을 발현하고, CRAd는 세포의 표면 상에서 PD-L1을 발현하는 세포에 대해 재표적화된다.
한 실시양태에서, 재조합 Ad는 p300에 결합하는 것을 방지하고 바이러스가 IFN 억제에 대해 감수성이게 만드는 E1a에 대한 dl1101 변형, 및 pRB에 대한 그의 결합을 방지하여 온전한 pRB 경로를 갖는 세포에서 바이러스 복제를 차단하는 E1a에서 dl1107 돌연변이, 및 E3A 결실을 갖는 조건부 복제 Ad (예를 들어 Ad657)이다. CRAd는 바이러스 입자의 표면 상에서 인간 인자 X (GLA)에 융합된 인간 PD-1을 발현하고, CRAd는 세포 표면 상에서 PD-L1을 발현하는 세포에 대해 재표적화된다.
바이러스 입자의 표면에 결합된 PD-1 폴리펩티드를 갖는 바이러스 입자는 암 (예를 들어, 하나 이상의 PD-L1 양성 암 세포를 포함하는 암)을 가진 포유동물을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 바이러스 입자는 암 치료에 효과적인 양으로 대상체에게 투여될 수 있고, 임의적으로 면역요법 및 화학요법제를 비롯한 암 요법과 조합되어 투여될 수 있다.
본 발명의 측면에서, 하나 이상의 다가 PD-L1 결합 화합물 또는 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성하기 위해 사용될 수 있는 아미노산 쇄를 코딩하는 핵산, 및 임의적으로 1종 이상의 암 요법을 함유하는 조성물은 포유동물을 치료하기 위해 암을 가진 포유동물에게 투여될 수 있다. 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물은 PD-L1 양성 암 세포 상의 PD-L1에 결합할 수 있다. PD-1 폴리펩티드의 결합은 PD-L1 기능을 중화시킬 수 있고, 이로써 PD-L1 양성 세포 (예를 들어, PD-L1 양성 암 세포)가 면역계로부터 탈출하는 것을 방지할 수 있고/거나, 항암제 (예를 들어, 암 면역요법)가 더욱 효과적으로 PD-L1 양성 세포를 표적화할 수 있게 한다. 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물을 코딩하는 핵산이 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물을 코딩하는 종양용해성 Ad 벡터인 경우, 종양용해성 Ad는 세포를 감염시킬 수 있고, 감염된 세포에 대해 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 종양용해성 Ad는 임의의 적절한 유형의 세포를 감염시킬 수 있다. 일부 경우에, 종양용해성 Ad는 PD-L1 양성 세포 (예를 들어, PD-L1 양성 암 세포)를 감염시킬 수 있다. 일부 경우에, 종양용해성 Ad는 비-분열 세포 (예를 들어, 신장 세포)를 감염시킬 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 PD-L1 결합 화합물을 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 조성물은 암을 가진 포유동물 (예를 들어, 하나 이상의 PD-L1 양성 암 세포를 포함하는 암)을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 다가 PD-L1 결합 화합물 및 임의적으로 1종 이상의 암 치료제를 함유하는 조성물은 암을 가진 포유동물을 치료하기 위해 포유동물에게 투여될 수 있다.
대안적으로, 본원에 기재된 방법 및 물질은 PD-L1 양성 세포와 연관된 다른 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 PD-L1 결합 화합물을 함유하는 조성물은 감염성 질환 (예를 들어, 하나 이상의 PD-L1 양성 대식세포를 포함하는 감염성 질환, 예컨대 대식세포를 침윤시키는 암)을 가진 포유동물을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 하나 이상의 PD-L1 양성 세포를 포함할 수 있는 감염성 질환의 예에는 비제한적으로 HIV, 간염, 및 말라리아가 포함된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 PD-L1 결합 화합물을 함유하는 조성물은 자가면역 질환 (예를 들어, 하나 이상의 PD-L1 양성 대식세포를 포함하는 자가면역 질환, 예컨대 대식세포를 침윤시키는 암)을 가진 포유동물을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
암을 가진 임의의 적절한 포유동물은 본원에 기재된 바와 같이 치료될 수 있다. 예를 들어, 암을 가진 인간 및 다른 영장류, 예컨대 원숭이는 본원에 기재된 하나 이상의 PD-L1 결합 화합물을 함유하는 조성물에 의해 치료될 수 있고, 임의적으로 암의 중증도를 감소시키고, 암의 증상을 감소시키고/거나, 인간 또는 다른 영장류 내에서 포유동물에 존재하는 암 세포의 개수를 감소시키기 위해 1종 이상의 암 치료와 조합되어 치료될 수 있다. 일부 경우에, 암을 가진 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 마우스 및 래트는 본원에 기재된 하나 이상의 다가 PD-L1 결합 화합물, PD-L1 결합 화합물을 포함하는 바이러스, 또는 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성하기 위해 사용될 수 있는 아미노산 쇄를 코딩하는 핵산을 함유하는 조성물로 치료될 수 있고, 임의적으로 본원에 기재된 1종 이상의 암 치료로 치료될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 암을 가진 포유동물 (예를 들어, 인간)을 치료할 때, 암은 임의의 적절한 암일 수 있다. 암에는 하나 이상의 PD-L1 양성 암 세포가 포함된다. 암에는 하나 이상의 고형 종양이 포함된다. 암은 혈액 암일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 치료될 수 있는 암의 예에는 비제한적으로 유방암, 결장직장암, 신장암, 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암), 난소암, 흑색종, 뇌암, 육종, 전립선암, 췌장암, 두경부암, 간암, 망막모세포종, 림프종, 및 백혈병이 포함된다.
일부 경우에, 포유동물은 암 (예를 들어, 하나 이상의 PD-L1 양성 암 세포를 포함하는 암)을 가진 것으로 확인될 수 있다. 임의의 적절한 방법을 이용하여 암을 가진 포유동물을 확인할 수 있다. 예를 들어, 영상화 기술 및 생검 기술을 이용하여 암을 가진 포유동물 (예를 들어, 인간)을 확인할 수 있다.
암을 가진 것으로 확인되면, 포유동물은 본원에 기재된 하나 이상의 PD-L1 결합 화합물을 함유하는 조성물을 투여받을 수 있고, 임의적으로 1종 이상의 암 치료제 및/또는 암 치료로 치료될 수 있다. 1종 이상의 암 치료제에는 임의의 적절한 암 치료가 포함될 수 있다. 일부 경우에, 암 치료에는 수술이 포함될 수 있다. 일부 경우에, 암 치료에는 방사선 요법이 포함될 수 있다. 일부 경우에, 암 치료에는 약물요법, 예컨대 화학요법, 호르몬 요법, 표적화된 요법, 및/또는 세포독성 요법의 투여가 포함될 수 있다. 암 치료의 예에는 비제한적으로 1종 이상의 수용체 티로신 키나제 억제제 (예를 들어, 에를로티닙)의 투여, 1종 이상의 PD1/PD-L1 억제제 (예를 들어, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 세미플리맙, 및 두르발루맙)의 투여, 1종 이상의 면역요법, 예컨대 PD1/PD-L1을 표적화할 수 있는 면역요법 (예를 들어, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 세미플리맙, 두르발루맙, 알렘투주맙, 이필리무맙, 오파투무맙, 및 리툭시맙)의 투여, GITR을 표적화하는 1종 이상의 항체의 투여, 1종 이상의 백금 화합물 (예를 들어, 시스플라틴 또는 카르보플라틴)의 투여, 1종 이상의 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀, 도세탁셀, 또는 알부민 결합된 파클리탁셀, 예컨대 nab-파클리탁셀)의 투여, 알트레타민의 투여, 카페시타빈의 투여, 시클로포스파미드의 투여, 에토포시드 (vp-16)의 투여, 겜시타빈의 투여, 이포스파미드의 투여, 이리노테칸 (cpt-11)의 투여, 리포솜 독소루비신의 투여, 멜팔란의 투여, 페메트렉세드의 투여, 토포테칸의 투여, 비노렐빈의 투여, 1종 이상의 황체 형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효능제 (예컨대, 고세렐린 및 류프롤리드)의 투여, 1종 이상의 항-에스트로겐 치료제 (예컨대 타목시펜)의 투여, 1종 이상의 아로마타제 억제제 (예컨대 레트로졸, 아나스트로졸, 및 엑세메스탄)의 투여, 1종 이상의 혈관신생 억제제 (예컨대 베바시주맙)의 투여, 1종 이상의 폴리(ADP)-리보스 폴리머라제 (PARP) 억제제 (예컨대 올라파르빕, 루카파립, 및 니라파립)의 투여, 외부 빔 방사선 요법의 투여, 근접치료의 투여, 방사성 인의 투여, 및 임의의 이들의 조합물의 투여가 포함된다. 암을 가진 포유동물은 하나 이상의 다가 PD-L1 결합 화합물, 또는 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성하기 위해 사용될 수 있는 아미노산 쇄를 코딩하는 핵산을 함유하는 조성물로 치료될 수 있고, 1종 이상의 암 치료로 치료되고, 1종 이상의 암 치료를 함유하는 조성물은 동시에 또는 독립적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 다가 PD-L1 결합 화합물, 또는 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성하기 위해 사용될 수 있는 아미노산 쇄를 코딩하는 핵산을 함유하는 조성물이 먼저 투여될 수 있고, 1종 이상의 암 치료가 두번째로 투여될 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 PD-L1 결합 화합물을 포함하는 조성물은 암을 가진 포유동물에게 투여하기 위한 제약상 허용가능한 조성물로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 다가 PD-L1 결합 화합물, 또는 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성하기 위해 사용될 수 있는 아미노산 쇄를 코딩하는 핵산의 치료 유효량은 1종 이상의 제약상 허용가능한 담체 (첨가제) 및/또는 희석제와 함께 제형화될 수 있다. 제약 조성물은 치료 폴리펩티드 및/또는 치료 폴리펩티드를 발현하도록 유전자 변형된 재조합 바이러스를 추가로 포함할 수 있다. 다가 PD-L1 결합 화합물, 및 임의적으로 치료 폴리펩티드를 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 제약 조성물은 비제한적으로 멸균 용액, 현탁액, 서방성 제형, 정제, 캡슐, 알약, 분말, 나노-입자, 및 과립을 비롯한 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 본원에 기재된 제약 조성물에서 사용될 수 있는 제약상 허용가능한 담체, 충전제 및 비히클에는 비제한적으로 이온 교환제, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충제 물질, 예컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 술페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시폴리올렌-블럭 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모 지방이 포함된다.
본원에 기재된 하나 이상의 다가 PD-L1 결합 화합물, 및 임의적으로 치료 폴리펩티드를 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 제약 조성물은 경구 또는 비경구 (예컨대, 피하, 근육내, 정맥내, 종양내, 및 피내) 투여를 위해 제형화된다.
경구로 투여되는 경우, 하나 이상의 PD-L1 결합 화합물, 또는 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성하기 위해 사용될 수 있는 아미노산 쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 제약 조성물은 알약, 정제 또는 캡슐의 형태일 수 있다.
비경구 투여에 적합한 조성물에는 항산화제, 완충제, 정균제, 및 제형이 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액이 포함된다. 제형은 단일-용량 또는 다중-용량 용기, 예를 들어 밀봉됨 앰풀 및 바이알로 제시될 수 있고, 사용하기 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 냉동 건조된 (동결건조된) 상태로 보관될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 이러한 주사 용액은 예를 들어 멸균 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 예를 들어 적합한 분산화제 또는 습윤제 (예컨대, 예를 들어, 트윈(Tween) 80) 및 현탁화제를 사용하여 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능한 제제는 예를 들어 1,3-부탄디올 중의 용액으로서 무독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매의 예에는 비제한적으로 만니톨, 물, 링거액, 및 등장성 염화나트륨 용액이 포함된다. 추가로, 멸균의 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 사용될 수 있다. 일부 경우에, 완하성 고정유, 예컨대 합성 모노- 또는 디-글리세리드가 사용될 수 있다. 지방산, 예컨대 올레산 및 그의 글리세리드 유도체가 폴리옥시에틸화된 형태인 것들을 비롯하여 천연의 제약상 허용가능한 오일, 예컨대 올리브유 또는 피마자유와 마찬가지로 주사가능한 제제에서 사용될 수 있다. 일부 경우에, 이들 오일 용액 또는 현탁액은 장쇄 알콜 희석제 또는 분산제를 함유할 수 있다.
본원에 개시된 구체적인 실시양태는 "로 이루어지는" 또는 "로 본질적으로 이루어지는" 용어를 사용하여 청구항에서 추가로 제한될 수 있다. 청구항에서 사용될 때, 출원되었거나 또는 보정에 의해 추가되었는지 여부와 관계없이, 전환 용어 "로 이루어지는"은 청구항에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 제외한다. 전환 용어 "로 본질적으로 이루어지는"은 명시된 물질 또는 단계, 및 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적인 영향을 미치지 않는 것들로 청구범위를 제한한다.
일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 PD-L1 결합 화합물을 포함하는 제약상 허용가능한 조성물은 국소적으로 또는 전신으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 세포내 PD-L1 도메인의 기능을 억제하는 화합물을 함유하는 조성물은 포유동물 (예를 들어, 인간)에서 암 (예를 들어, 종양)으로 또는 그 근처로 주사에 의해 국소 투여될 수 있다. 예를 들어, 세포내 PD-L1 도메인의 기능을 억제하는 화합물을 함유하는 조성물은 경구 투여에 의해 또는 주사에 의해 전신으로 (예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내, 종양내, 및 피내 주사) 포유동물 (예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다.
유효 용량은 암의 중증도, 투여 경로, 대상체의 연령 및 전반적인 건강 상태, 부형제 사용, 다른 치료적 처리와의 공동 사용 가능성, 예컨대 다른 작용제의 사용, 및 치료하는 의사의 판단에 따라 달라질 수 있다.
본원에 기재된 하나 이상의 PD-L1 결합 화합물을 함유하는 조성물의 유효량은 포유동물에게 유의한 독성을 일으키지 않고 암의 중증도를 감소시키고, 암의 증상을 감소시키고/거나, 포유동물 내에 존재하는 암 세포의 개수를 감소시킬 수 있는 임의의 양일 수 있다. 유효량은 일정하게 유지될 수 있거나, 또는 치료에 대한 포유동물의 반응에 따라 슬라이딩 규모 또는 가변 용량으로 조정될 수 있다. 다양한 인자가 특정한 적용을 위해 사용되는 실제 유효량에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 투여 빈도, 투여 기간, 다중 치료제의 사용, 투여 경로, 및 상태 (예를 들어, 암)의 중증도는 투여되는 실제 유효량에서의 증가 또는 감소를 필요로 할 수 있다.
투여 빈도는 포유동물에게 유의한 독성을 일으키지 않고 1종 이상의 암 치료 (예를 들어, 1종 이상의 암 면역요법)에 대해 포유동물의 암 세포를 민감화시키는 임의의 빈도일 수 있다. 예를 들어, 투여 빈도는 약 주 1회 내지 약 1일 3회, 또는 약 월 2회 내지 약 1일 6회, 또는 약 주 2회 내지 약 1일 1회일 수 있다. 투여 빈도는 치료 기간 동안 일정하게 유지될 수 있거나 또는 변할 수 있다. 본원에 기재된 하나 이상의 PD-L1 결합 화합물을 함유하는 조성물에 의한 치료 과정은 휴식 기간을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 다가 PD-L1 결합 화합물, 또는 본원에 기재된 다가 PD-L1 결합 화합물을 생성하기 위해 사용될 수 있는 아미노산 쇄를 코딩하는 핵산을 함유하는 조성물은 2 주 기간에 걸쳐 매일 투여된 후, 2 주 휴식 기간이 있을 수 있고, 이러한 요법은 수회 반복될 수 있다. 유효량과 관련하여, 다양한 인자가 특정한 적용을 위해 이용되는 실제 투여 빈도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 유효량, 치료 기간, 다중 치료제의 사용, 투여 경로, 및 상태 (예를 들어, 암)의 중증도는 투여 빈도에서의 증가 또는 감소를 필요로 할 수 있다.
본원에 기재된 하나 이상의 PD-L1 결합 화합물을 함유하는 조성물을 투여하는데 유효한 기간은 포유동물에게 유의한 독성을 일으키지 않고 암의 중증도를 감소시키고, 암의 증상을 감소시키고/거나, 포유동물 내에 존재하는 암 세포의 개수를 감소시킬 수 있는 임의의 기간일 수 있다. 따라서, 유효한 기간은 수일 내지 수주, 수개월 또는 수년으로 달라질 수 있다. 일반적으로, 암 치료에 유효한 기간은 6 주 내지 1 년 기간의 범위일 수 있다. 여러 인자가 특정한 치료를 위해 이용되는 실제 유효한 기간에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 유효한 기간은 투여 빈도, 유효량, 다중 치료제의 사용, 투여 경로, 및 치료할 상태의 중증도에 따라 달라질 수 있다.
특정 예에서, 치료 과정, 및 치료할 상태 (예를 들어, 암)와 관련된 하나 이상의 증상의 중증도를 모니터링할 수 있다. 임의의 적절한 방법을 이용하여 1종 이상의 암 치료 (예를 들어, 1종 이상의 암 면역요법)에 대한 포유동물의 암 세포의 민감성이 증가하였는지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 암의 반응성 (예를 들어, 종양의 크기 및/또는 개수를 기반으로 함)은 상이한 시점에서 공식적인 영상화 기술을 이용하여 평가될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기재될 것이며, 이는 청구항에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1. 재조합 아데노바이러스의 구축: 세포 표적화/탈표적화 펩티드 또는 신규한 아미노산의 삽입에 의해 상이한 Ad 혈청형으로부터의 개별 HVR의 삽입.
재조합 아데노바이러스는 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 방법을 이용하여 재조합 DNA 기술에 의해 구축될 수 있다. 재조합 Ad (Ad657)는 제1 Ad 균주 Ad6으로부터 유래되고 (예를 들어, 제1 Ad 균주의 게놈을 포함할 수 있음), 제2 Ad 균주 Ad57로부터의 캡시드 헥손 HVR을 포함할 수 있으며, 도 8을 참고한다. 이들 실시양태는 일반적으로 상이한 Ad로부터의 상이한 캡시드 헥손 HVR (즉, 셔플링 HVR)을 조합한 Ad의 맥락에서 적용되었다. 도 7은 헥손 영역에서의 변형을 나타낸 Ad5, Ad6 및 Ad57의 정렬을 도시한다. 예를 들어, Ad 균주 Ad6의 HVR1과 Ad 균주 Ad57의 HVR 2-7 또는 Ad 균주 Ad6의 HVR1 및 7과 Ad 균주 Ad57의 HVR 2-6. 추가의 실시양태에서, Ad6/56/6 바이러스는 Ad 균주 Ad6으로부터의 HVR 1 및 7 및 Ad 균주 Ad657로부터의 HVR 2-6을 갖는다.
본 발명의 측면에서, Ad6 HVR1 및 Ad57 HVR 2-7을 갖는 키메라 Ad를 생성하였고, Ad6/57 HVR 키메라로 지칭되는 이러한 키메라는 서열식별번호:28의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
본 발명의 여전히 또 다른 측면에서, Ad6 HVR1 및 7 및 Ad57 HVR 2-6을 갖는 키메라 Ad를 생성하였고, Ad6/57/6 HVR 키메라로 지칭되는 이러한 키메라는 서열식별번호:29의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
재조합 Ad 균주 Ad657을 수득하기 위해, Ad57 HVR 1-7을 코딩하는 핵산을 합성하고, pVI와 헥손 사이에 FRT-제오신(Zeocin)®-FRT 카세트가 있는 플라스미드에서 Ad6 헥손 내로 삽입하였다. 이를 다양한 pAd6 플라스미드 내로 재조합하여, Ad657 및 그의 변이체가 생성되었다. Ad657 헥손의 아미노산 서열이 서열식별번호:30에 기재된다.
Ad657의 변이체와 관련하여, 시스테인, 가요성 아미노산, 및 다른 펩티드의 삽입을 허용하기 위한 제한 부위에 의해 변형된 HVR1로 Ad57 HVR 서열을 합성하였다. 이를 pVI와 헥손 사이에 FRT-제오신®-FRT 카세트가 있는 플라스미드에서 Ad6 헥손 내로 삽입하였다. 이를 다양한 pAd6 플라스미드 내로 재조합하여, HVR1 내에 시스테인이 있는 Ad657 변이체가 생성되었고, Ad657-HVR1-XXA로 지칭되는 이러한 변이체는 서열식별번호:42의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
Ad657의 변이체와 관련하여, 시스테인, 가요성 아미노산, 및 다른 펩티드의 삽입을 허용하기 위한 제한 부위에 의해 변형된 HVR5로 Ad57 HVR 서열을 합성하였다. 이를 pVI와 헥손 사이에 FRT-제오신®-FRT 카세트가 있는 플라스미드에서 Ad6 헥손 내로 삽입하였다. 이를 다양한 pAd6 플라스미드 내로 재조합하여, HVR5 내에 시스테인이 있는 Ad657 변이체가 생성되었고, Ad657-HVR5-XXA로 지칭되는 이러한 변이체는 서열식별번호:43의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
Ad657의 변이체와 관련하여, 시스테인, 가요성 아미노산, 및 다른 펩티드의 삽입을 허용하기 위한 제한 부위에 의해 변형된 HVR1로 Ad57 HVR 서열을 합성하였다. 이를 pVI와 헥손 사이에 FRT-제오신®-FRT 카세트가 있는 플라스미드에서 Ad6 헥손 내로 삽입하였다. 이를 다양한 pAd6 플라스미드 내로 재조합하여, HVR1 내에 시스테인이 없지만 HVR1 내로의 펩티드 삽입을 허용하는 제한 부위를 갖는 Ad657 변이체가 생성되었고, Ad657-HVR1-XA로 지칭되는 이러한 변이체는 서열식별번호:44의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
Ad657의 변이체와 관련하여, 시스테인, 가요성 아미노산, 및 다른 펩티드의 삽입을 허용하기 위한 제한 부위에 의해 변형된 HVR5로 Ad57 HVR 서열을 합성하였다. 이를 pVI와 헥손 사이에 FRT-제오신®-FRT 카세트가 있는 플라스미드에서 Ad6 헥손 내로 삽입하였다. 이를 다양한 pAd6 플라스미드 내로 재조합하여, HVR5 내에 시스테인이 없지만 HVR5 내로의 펩티드 삽입을 허용하는 제한 부위를 갖는 Ad657 변이체가 생성되었고, Ad657-HVR5-XA로 지칭되는 이러한 변이체는 서열식별번호:45의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
Ad657의 변이체와 관련하여, Ad657 HVR1-XA 서열을 HVR1 내로의 비오틴 어셉터 펩티드의 삽입에 의해 변형시켰다. 이를 다양한 pAd6 플라스미드 내로 재조합하여, HVR1 내에 BAP를 갖는 Ad657 변이체가 생성되었고, Ad657-HVR1-PSTCD로 지칭되는 이러한 변이체는 서열식별번호:46의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
비오틴 어셉터 펩티드의 삽입은 바이러스 변이체를 간으로부터 탈표적화시키고, 바이러스를 아비딘 또는 스트렙타비딘 또는 비오틴화 리간드에 대해 재표적화되도록 하고, 바이러스가 단량체성 아비딘 또는 스트렙타비딘 컬럼 상에서 정제되도록 한다.
Ad657의 변이체와 관련하여, Ad657 HVR1-XA 서열을 HVR1 내로의 비오틴 어셉터 펩티드 (BAP)의 삽입에 의해 변형시켰다. 이를 다양한 pAd6 플라스미드 내로 재조합하여, HVR1 내에 BAP를 갖는 Ad657 변이체가 생성되었고, Ad657-HVR5-PSTCD로 지칭되는 이러한 변이체는 서열식별번호:47의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
Ad657의 변이체와 관련하여, Ad657 HVR5-XA 서열을 HIV 외피로부터의 합성 V1/V2 루프의 HVR5 내로의 삽입에 의해 변형시켰고, Ad657-HVR5-V1/V2로 지칭되는 이러한 변이체는 서열식별번호:48의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
HIV 외피로부터의 합성 V1/V2 루프의 삽입은 이러한 항원을 백신으로서의 역할을 하도록 디스플레이하는 것을 허용할 뿐만 아니라, HIV 외피와 상호작용하는 단백질에 결합하는 것에 의한 재표적화를 허용한다.
Ad657의 변이체와 관련하여, Ad657 HVR5-XA 서열을 인간 유두종 바이러스 (HPV)로부터의 합성 펩티드의 HVR5 내로의 삽입에 의해 변형시켰고, Ad657-HVR5-HPV로 지칭되는 이러한 변이체는 서열식별번호:49의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
인간 유두종 바이러스로부터의 합성 펩티드의 삽입은 HPV 펩티드를 백신 목적을 위한 항원으로서 디스플레이하는 것을 허용할 뿐만 아니라, HPV 펩티드와 상호작용하는 단백질에 결합하는 것에 의한 재표적화를 허용한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, Ad6 HVR1 및 Ad57 HVR 2-7을 갖는 키메라 Ad가 생성되었고, Ad6/57 HVR 키메라로 지칭되는 이러한 키메라는 서열식별번호:50의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, Ad6 HVR1 및 7 및 Ad57 HVR 2-6을 갖는 키메라 Ad가 생성되었고, Ad6/57/6 HVR 키메라로 지칭되는 이러한 키메라는 서열식별번호:51의 아미노산 서열을 갖는 헥손을 포함한다.
도 16-18의 플라스미드 맵은 상이한 Ad 혈청형으로부터의 개별 HVR의 삽입과 표적화된 화학적 변형 및 차폐를 위한 헥손 내로의 세포 표적화/탈표적화 펩티드, 치료 폴리펩티드 또는 신규한 아미노산, 예컨대 시스테인의 삽입의 조합을 나타낸다.
특정한 실시양태에서, 세포 결합 펩티드는 HVR 1 또는 HVR 5에 삽입되고, 이러한 실시양태는 Ad의 임의의 HVR에서 이들 및 다른 펩티드를 삽입하는 예로서의 역할을 한다.
실시예 2. 시스테인-변형된 헥손-변형된 Ad657-HVR5C의 표적화된 화학적 접합
도 13은 상이한 Ad 혈청형으로부터의 개별 HVR의 삽입과 표적화된 화학적 변형 및 차폐를 위한 헥손 내로의 신규한 아미노산, 예컨대 시스테인의 삽입의 조합을 나타내는 Ad 변이체를 도시한다.
이 실시예는 중합체 및 다른 화학적 변형을 Ad 헥손 내로 삽입된 시스테인에 대해 표적화하는 능력을 입증한다 (도 15). 표적화되지 않은 PEG는 바이러스 감염을 불활성화시키는 반면에, 시스테인-표적화 PEG화는 바이러스 기능을 유지한다.
본 발명의 측면에서, 항체, 단백질, 세포로부터 탈표적화시키고, 재표적화시키고, 차폐하기 위해 중합체 또는 삽입된 펩티드/단백질을 사용하는 것이 구상된다. 도 12 및 14는 예를 들어 PEG화 또는 "BAP화"에 의해 변형될 수 있는 Ad HVR의 부위를 도시한다. 또 다른 예는 비오틴 어셉터 펩티드 (BAP)의 삽입이 이들 HVR 내로 삽입되어 아비딘 또는 스트렙타비딘 및 비오틴화 리간드로 또는 아비딘- 또는 스트렙타비딘 융합 단백질로의 벡터 재표적화를 가능하게 하는 것을 나타낸다. BAP 삽입은 또한 바이러스가 벡터 생성을 위한 단량체성 아비딘 또는 스트렙타비딘 컬럼 상에서 정제되도록 한다. 마찬가지로, Ad57-HVR1-XXA 및 XA는 시스테인을 이러한 부위 내로 삽입하여 말레이미드 또는 다른 시스테인-반응성 작용제로의 표적화된 화학적 변형을 가능하게 하는 예를 나타낸다.
한 실시양태에서, 상이한 Ad 혈청형 및/또는 변이체는 Ad6 및 Ad657 변이체의 다중 투약을 허용하도록 중합체 차폐를 포함한다. 공유결합 중합체 접합과 조합된 혈청형-전환에 의해 Ad6 및 Ad657이 다중 라운드의 치료에 사용될 수 있는 예시적인 치료 사이클이 제시된다 (도 13).
GFP루시퍼라제를 발현하는 Ad657-HVR1C를 세포로부터 생성하고, CsCl 구배 상에서 정제하였다. 바이러스를 5 kDa 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 공유결합으로 변형시켰다. 바이러스를 바이러스 단백질 상의 아민/리신과 무작위로 반응하는 NHS-PEG, 또는 XXA 셔틀 플라스미드를 사용하여 HVR1 내로 삽입된 시스테인과 특이적으로 반응하는 말레이미드 PEG로 처리하였다. 그 후, 이러한 미변형 또는 변형 바이러스를 최종 CsCl 스핀에 의해 정제하고, 이어서 탈염시켰다. 지정된 바이러스를 SDS-PAGE 겔 상에서 분리하고, 사이프로루비(SyproRuby)로 염색하고, 영상화에 의해 가시화하였다 (도 14). 이는 NHS-PEG화가 단백질의 겉보기 질량의 증가 (화살표로 지시됨)에 의해 입증된 바와 같이 여러 바이러스 단백질을 무작위로 변형시킨다는 것을 나타낸다. 대조적으로, HVR1에서 시스테인에 의한 표적화된 말레이미드 PEG 반응은 헥손만 변형시키고, 다른 바이러스 캡소머 단백질을 손상시키지 않는다. 바이러스 기능에 대한 PEG화의 효과를 평가한다.
실시예 3. 조건부 복제 Ad (CRAd).
바이러스를 조건부-복제 Ad (CRAd)로 전환시키기 위해 E1 단백질에서 돌연변이를 수반하는 Ad6, Ad657 및 그의 변이체에서의 돌연변이의 개략도가 도 9, 도 10 및 도 11에 도시된다. 이는 각각 p300 및 pRB에 결합하는 것을 차단하는 dl1101 및/또는 dl1107을 포함한다.
도 10은 야생형 Ad의 E1A, 뿐만 아니라 Ad 변이체 E1A dl1101, E1A dl1107 및 E1A dl1101/1107의 N-말단 아미노산 서열을 나타낸다.
CRAd인 Ad-PB를 생성하기 위해 Ad E1 프로모터를 서열식별번호:31의 전립선-특이적 프로모터 프로바신 및 E1 DNA 서열로 대체하는 것이 또한 도시된다 (도 9). 프로바신 프로모터는 안드로겐 의존성이어서, DU145와 같은 안드로겐-내성 종양에서가 아니라 LNCaP와 같은 안드로겐-민감성 종양에서 작동할 것이다.
한 실시양태에서, PD-L1 미끼 단백질로서 인간 면역글로불린에 융합된 인간 PD-1을 발현하도록 E1에 대한 dl1101 변형 및 E1a에서 dl1107 돌연변이 및 E3A 결실을 갖는 조건부 복제 Ad657 바이러스를 구축한다. 바이러스는 CMV 프로모터로부터의 GFP루시페라제 또한 발현한다. 이러한 조건부 복제 Ad657 바이러스 변이체는 CrAd6d1101/1107DE3ADP-hPD-1-Ig-GL로 지칭된다.
실시예 4. 재표적화된 및 탈표적화된 재조합 아데노바이러스.
시험관내에서, Ad는 그의 섬유 및 펜톤 염기 단백질과 세포 표면 수용체 사이의 조합된 상호작용을 통해 세포에 결합하여 그로 들어간다. 삼량체 섬유는 콕사키-아데노바이러스 수용체 (CAR)에 결합하고, CAR이 결여된 세포가 펜톤 염기 상의 RGD 모티프에 결합될 수 있는 αv 인테그린를 또한 발현하지 않는다면, 이들은 감염에 대해 비교적 내성이다.
Ad 섬유 단백질은 초기 부착 단계를 매개하는 3개의 외관상 동일한 서브유닛의 복합체이다. 천연 Ad6 섬유 단백질은 서열식별번호:35에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CAR에 결합한다.
본 발명의 추가의 측면에서, 모체 Ad에 대해 천연이 아닌 상이한 섬유 단백질을 갖는 섬유-변형된 재조합 Ad를 생성하였다. 상이한 Ad 균주로부터의 캡시드 단백질을 포함하는, CRAd를 포함하는 재조합 Ad, 예를 들어 이종성 Ad35 섬유 폴리펩티드 또는 침팬지 C68 섬유 폴리펩티드, +/- K7 펩티드를 포함하는 재조합 Ad를 생성하였다.
키메라 Ad인 AdF35 섬유 키메라는 서열식별번호:36의 아미노산 서열을 갖고, Ad5 및 Ad6 섬유 단백질보다 더 짧으며, 바이러스를 CD46에 대해 재표적화한다.
서열식별번호:37의 서열을 갖는 K7 섬유를 포함하는 섬유-변형된 재조합 Ad는 바이러스를 세포 상의 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 및 음전하에 대해 표적화한다.
서열식별번호:38의 서열을 포함하는 재조합 키메라 Ad인 6/FC68 섬유는 침팬지 아데노바이러스 C68로부터의 섬유 단백질을 갖는 키메라 Ad이다. 섬유 단백질이 Ad5 또는 Ad6 섬유 단백질보다 더 짧고, CAR에 결합한다.
서열식별번호:39의 서열을 포함하는 재조합 키메라 Ad인 6/FC68-K7 섬유는 침팬지 아데노바이러스 C68로부터의 섬유 단백질을 갖는 키메라 Ad이다. 섬유 단백질이 Ad5 또는 Ad6 섬유 단백질보다 짧다. 6/FC68-K7 섬유는 CAR에 결합하고, 헤파린 술페이트 및 음전하에 대해 재표적화된다.
서열식별번호:40의 서열을 포함하는 재조합 키메라 Ad인 6/FC68-HI-K7 섬유는 침팬지 아데노바이러스 C68로부터의 섬유 단백질을 갖는 키메라 Ad이다. 섬유 단백질이 Ad5 또는 Ad6 섬유 단백질보다 짧다. 6/FC68-HI-K7 섬유는 CAR에 결합하고, 헤파린 술페이트 및 음전하에 대해 재표적화된다.
혈액 인자 X (FX)는 나노몰 친화도로 C종 아데노바이러스의 헥손에 결합하고, 결과적으로 C종 아데노바이러스가 IV 주사 후에 간의 간세포를 효율적으로 형질도입할 수 있게 한다.
인간 PD-1에 융합된 인간 인자 X (GLA)를 발현하는 하기 CRAd 바이러스를 구축한다. 야생형 및 고친화도 마우스 및 인간 PD-1 도메인을 인간 FX GLA-EGF 도메인의 N- 또는 C-말단에 융합시키고, RSV 또는 CMV 프로모터에 의해 그들의 발현을 유도하였다. 일부 경우에, 이들 융합 단백질 발현 카세트를 지정된 바이러스의 E3 도메인에 삽입하였다. 다른 경우에는, 이들을 바이러스의 섬유와 E4 유전자 사이에 삽입하였다.
p300에 대한 그의 결합을 방지하고 IFN에 대해 감수성이게 하는 E1a에 대한 dl1101 변형, E3A 결실을 갖는 조건부 복제 Ad657이고, E3 결실에 삽입된 RSV 발현 카세트를 갖는다. 이 바이러스는 인간 PD-1에 융합된 인간 인자 X (GLA)를 발현하고, PD-L1+ 세포에 대한 아데노바이러스 재표적화 단백질이다 (즉, CrAd657d1101DE3ADP*hPD1-GLA-GL-L).
p300에 대한 그의 결합을 방지하고 바이러스가 IFN 억제에 대해 감수성이게 만드는 E1a에 대한 dl1101 변형 및 pRB에 대한 그의 결합을 방지하여 온전한 pRB 경로를 갖는 세포에서 바이러스 복제를 차단하는 E1a에서 dl1107 돌연변이를 갖고 E3이 결실된 조건부 복제 Ad657이고, E3 결실에 삽입된 RSV 발현 카세트를 포함한다. 이 바이러스는 인간 PD-1에 융합된 인간 인자 X (GLA)를 발현한다 (즉, CrAd657*1101/1107DE3BSTRSVhPD1-GLA*IgIZI). 바이러스 복제 동안에, PD-1은 세포로부터 방출될 때 PD-L1에 결합할 수 있는 단량체로서 세포에서 발현될 것이다. PD-1은 또한 Ad를 PD-L1-발현 세포에 대해 재표적화시키기 위해 Ad의 표면에 결합될 수 있다.
E1a에서 dl1107 돌연변이 및 E3A 결실을 갖고, E3 결실에 삽입된 RSV 발현 카세트를 갖는 조건부 복제 Ad6/57/6을 구축하여, PD-L1 미끼 단백질로서 인간 면역글로불린에 융합된 인간 PD-1을 발현시킨다 (즉, pAd/57/6-dl1107-ΔE3-RSV-hPD-1-HA-Ig-I). 도 16을 참고한다.
단백질 A 컬럼 상에서 pAd6/57/6-dl1107-DE3-RSV-hPD-1-HA-Ig-I로 감염된 세포로부터 융합 단백질을 정제하였다. 이 단백질은 프로메가 (미국 위스콘신주 매디슨)로부터의 PD-1/PD-L1 차단 검정에서 양성 대조군 항-PD-1 모노클로날 항체를 따라 적정되었다. 고친화도 인간 hPD-1-HA-Ig 융합 단백질은 PD-L1을 억제한다. 도 19를 참고한다.
실시예 5. 이종성 폴리펩티드와 조합되어 PD-L1 결합 화합물의 발현을 위한 재조합 Ad의 구축.
조건부 복제 Ad 바이러스 (CRAd657 또는 CRAd 6/57/6)는 1개 이상의 이종성 폴리펩티드 (예를 들어, 치료 폴리펩티드 및/또는 표적화 폴리펩티드)와 조합되어 PD-1 폴리펩티드를 발현하도록 변형된다. 한 실시양태에서, RSV-PD-1 융합 카세트는 바이러스의 E3 결실에 삽입되고, 치료 트랜스진은 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 방법에 따라 CMV 또는 MCMV 또는 RSV 발현 카세트로서 섬유와 E4 유전자 사이에 삽입된다. 도 17 및 도 18을 참고한다.
실시예 6. 고친화도 인간 hPD-1-HA-Ig 융합 단백질을 단독으로 또는 면역 요법 페이로드와 조합되어 발현하는 CRAd의 종양 성장 평가.
B16-CAR 흑색종 세포를 C57BL/6 마우스에서 피하 주사하고, 생성된 종양은 본 발명의 다가 PD-L1 결합 화합물의 3e11 바이러스 입자와 함께 주사된다. CRAd+PD-L1 미끼는 pAd6/57/6-dl1107-ΔE3-RSV-hPD-1-HA-Ig-I이다. CRAd+PD-L1 미끼 + 면역 자극인자는 pAd6/57/6-dl1107-ΔE3-RSV-hPD-1-HA-Ig-I, 및 4-1BBL을 발현하는 제2 아데노바이러스를 이용하여 종양에 공동 주사된다. 고친화도 인간 hPD-1-HA-Ig 융합 단백질을 발현하는 CRAd는 그 자체로 또는 면역 요법 페이로드와 조합되어 종양 성장을 지연시킨다. 도 20을 참고한다.
한 실시양태에서, CRAd657 또는 CRAd6/57/6은 하나 이상의 치료 폴리펩티드와 조합되어 PD-1 폴리펩티드를 발현하도록 변형된다. 치료 폴리펩티드는 GM-CSF, 4-1BBL, CD40L 및 OX40, 및 이들의 조합물로부터 선택될 수 있다. 한 측면에서, PD-1 폴리펩티드는 융합 단백질로서 치료 폴리펩티드와 함께 발현된다. 추가의 측면에서, RSV-PD-1 융합 카세트는 바이러스의 E3 결실에 삽입되고, 치료 트랜스진은 CMV 또는 MCMV 또는 RSV 발현 카세트로서 바이러스 섬유와 E4 유전자 사이에 삽입된다. 도 17 및 18을 참고한다.
실시예 7. 다가 PD-L1 결합 화합물의 구축.
PD-1 폴리펩티드, 및 스캐폴드 폴리펩티드 또는 FX 폴리펩티드의 GLA 도메인을 포함하는 융합 단백질을 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 방법에 따라 야생형, 돌연변이형 또는 합성 유전자로부터 돌연변이 및 융합 접합으로 PCR 클로닝된 유전자로부터 생성한다. 융합 단백질은 발현 벡터에서 클로닝하고, 단백질의 발현 및 조립을 가능하게 하는 조건하에 배양하고, 임의적으로 세포 환경으로부터 단백질을 정제함으로써 조립된다.
융합 단백질은 바이러스 피막 폴리펩티드에 결합할 수 있는 폴리펩티드에 융합된 PD-1 폴리펩티드 및/또는 그의 단편을 발현하는 벡터에 의해 세포를 플라스미드 트랜스펙션 또는 감염시킨 후에, 항체 컬럼 상에서 또는 PD-L1 컬럼 상에서 또는 비오틴 컬럼 상에서 PD-1 또는 융합 파트너에 의해 정제함으로써 생성될 수 있다.
한 실시양태에서, Ad는 Ad 표면을 융합 단백질로 코팅 가능하게 하는 조건하에 정제된 PD-1 융합 단백질과 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, PD-1이 세포의 표면 상의 PD-L1에 결합하기 위해 Ad의 표면 상에 노출되도록, FX 폴리펩티드의 GLA 도메인이 Ad의 표면에 결합한다. 융합 파트너가 Ad 표면에 결합되고, PD-1이 세포 상의 PD-L1에 자유롭게 결합하는 것인 아데노바이러스는 다량체성 PD-L1 결합 화합물을 제공한다.
한 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 삽입되거나, 또는 mRNA 생성 벡터에서 삽입되고, 이들은 시험관내에서 세포 배양물에 트랜스펙션 또는 감염되거나, 또는 동물의 생체내에서 감염된다. 샘플은 PD-1 및/또는 융합 단백질 파트너에 대한 항체에 의해 단백질 발현에 대해 검정된다.
융합 단백질을 코딩하는 핵산 (예를 들어, DNA, mRNA, 및 바이러스 벡터)은 정상 또는 암-보유 동물에게 전달되고, 말초 혈액 세포, 림프절 세포, 비장 세포 및 종양 세포 집단에서의 변화는 CD3, CD4, CD8, PD-1, PD-L1 및 T 세포 활성화 마커에 의한 염색에 의해 평가된다.
융합 단백질을 코딩하는 핵산 (예를 들어, DNA, mRNA) 또는 바이러스 벡터는 암-보유 동물에게 전달되고, 종양 크기, 전이, 전파 및 생존에 대한 효과가 평가되었다.
기타 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 상기 설명은 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 예시하도록, 그리고 이를 제한하지 않도록 의도된다는 것을 이해하여야 한다. 다른 측면, 장점 및 변형이 하기 청구범위의 범주 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> MAYO FOUNDATION FOR MEDICAL EDUCATION AND RESEARCH <120> MULTIVALENT PD-L1 BINDING COMPOUNDS FOR TREATING CANCER <130> ADZE 2 PCT SEQ <150> US 62/839,916 <151> 2019-04-29 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 465 <212> PRT <213> Human Adenovirus 6 <400> 1 Ala Tyr Asn Ala Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Ser Cys Glu Trp 1 5 10 15 Glu Gln Asn Glu Thr Ala Gln Val Asp Ala Gln Glu Leu Asp Glu Glu 20 25 30 Glu Asn Glu Ala Asn Glu Ala Gln Ala Arg Glu Gln Glu Gln Ala Lys 35 40 45 Lys Thr His Val Tyr Ala Gln Ala Pro Leu Ser Gly Ile Lys Ile Thr 50 55 60 Lys Glu Gly Leu Gln Ile Gly Thr Ala Asp Ala Thr Val Ala Gly Ala 65 70 75 80 Gly Lys Glu Ile Phe Ala Asp Lys Thr Phe Gln Pro Glu Pro Gln Val 85 90 95 Gly Glu Ser Gln Trp Asn Glu Ala Asp Ala Thr Ala Ala Gly Gly Arg 100 105 110 Val Leu Lys Lys Thr Thr Pro Met Lys Pro Cys Tyr Gly Ser Tyr Ala 115 120 125 Arg Pro Thr Asn Ser Asn Gly Gly Gln Gly Val Leu Trp Leu Thr Asn 130 135 140 Gly Lys Leu Glu Ser Gln Val Glu Met Gln 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Asp Asn Arg Val Leu Asp Met 85 90 95 Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Thr 100 105 110 Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Leu Ala Pro Lys Gly 115 120 125 Ala Pro Asn Ser Cys Glu Trp Asp Glu Asp Asp Thr Gln Val Gln Val 130 135 140 Ala Ala Glu Asp Asp Gln Asp Asp Asp Glu Glu Glu Glu Gln Leu Pro 145 150 155 160 Gln Gln Arg Asn Gly Lys Lys Thr His Val Tyr Ala Gln Ala Pro Phe 165 170 175 Ala Gly Glu Ala Ile Asn Lys Asn Gly Leu Gln Ile Gly Thr Asn Gly 180 185 190 Ala Ala Thr Glu Gly Asn Lys Glu Ile Tyr Ala Asp Lys Thr Tyr Gln 195 200 205 Pro Glu Pro Gln Ile Gly Glu Ser Gln Trp Asn Glu Ala Glu Ser Ser 210 215 220 Val Ala Gly Gly Arg Val Leu Lys Lys Thr Thr Pro Met Lys Pro Cys 225 230 235 240 Tyr Gly Ser Tyr Ala Arg Pro Thr Asn Ser Asn Gly Gly Gln Gly Val 245 250 255 Met Val Glu Gln Asn Gly Lys Leu Glu Ser Gln Val Glu Met Gln Phe 260 265 270 Phe Ser Thr Ser Val Asn Ala Met Asn Glu Ala Asn Ala Ile Gln Pro 275 280 285 Lys Leu Val Leu Tyr Ser Glu Asp Val Asn Met 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Gly Asn Met Gly 340 345 350 Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gln 355 360 365 Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Asp Ser Ile Gly 370 375 380 Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr 385 390 395 400 Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Thr Glu Asp Glu Leu 405 410 415 Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Gly Gly Ile Gly Val Thr Asp Thr Tyr 420 425 430 Gln Ala Ile Lys Ala Thr Asn Gly Asn Gly Gly Ala Thr Thr Trp Ala 435 440 445 Gln Asp Asn Thr Phe Ala Glu Arg Asn Glu Ile Gly Val Gly Asn Asn 450 455 460 Phe Ala Met Glu Ile Asn Leu Asn Ala Asn Leu Trp Arg Asn Phe Leu 465 470 475 480 Tyr Ser Asn Ile Ala Leu Tyr Leu Pro Asp Lys Leu Lys Tyr Asn Pro 485 490 495 Thr Asn Val Glu Ile Ser Asp Asn Pro Asn Thr Tyr Asp Tyr Met Asn 500 505 510 Lys Arg Val Val Ala Pro Gly Leu Val Asp Cys Tyr Ile Asn Leu Gly 515 520 525 Ala Arg Trp Ser Leu Asp Tyr Met Asp Asn Val Asn Pro Phe Asn His 530 535 540 His Arg Asn Ala Gly Leu Arg Tyr Arg Ser Met Leu Leu Gly Asn Gly 545 550 555 560 Arg Tyr Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro Gln Lys Phe Phe Ala Ile 565 570 575 Lys Asn Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Asn Phe 580 585 590 Arg Lys Asp Val Asn Met Val Leu Gln Ser Ser Leu Gly Asn Asp Leu 595 600 605 Arg Val Asp Gly Ala Ser Ile Lys Phe Asp Ser Ile Cys Leu Tyr Ala 610 615 620 Thr Phe Phe Pro Met Ala His Asn Thr Ala Ser Thr Leu Glu Ala Met 625 630 635 640 Leu Arg Asn Asp Thr Asn Asp Gln Ser Phe Asn Asp Tyr Leu Ser Ala 645 650 655 Ala Asn Met Leu Tyr Pro Ile Pro Ala Asn Ala Thr Asn Val Pro Ile 660 665 670 Ser Ile Pro Ser Arg Asn Trp Ala Ala Phe Arg Gly Trp Ala Phe Thr 675 680 685 Arg Leu Lys Thr Lys Glu Thr Pro Ser Leu Gly Ser Gly Tyr Asp Pro 690 695 700 Tyr Tyr Thr Tyr Ser Gly Ser Ile Pro Tyr Leu Asp Gly Thr Phe Tyr 705 710 715 720 Leu Asn His Thr Phe Lys Lys Val Ala Ile Thr Phe Asp Ser Ser Val 725 730 735 Ser Trp Pro Gly Asn Asp Arg Leu Leu Thr Pro Asn Glu Phe Glu Ile 740 745 750 Lys Arg Ser Val Asp Gly Glu Gly Tyr Asn Val Ala Gln Cys Asn Met 755 760 765 Thr Lys Asp Trp Phe Leu Val Gln Met Leu Ala Asn Tyr Asn Ile Gly 770 775 780 Tyr Gln Gly Phe Tyr Ile Pro Glu Ser Tyr Lys Asp Arg Met Tyr Ser 785 790 795 800 Phe Phe Arg Asn Phe Gln Pro Met Ser Arg Gln Val Val Asp Asp Thr 805 810 815 Lys Tyr Lys Asp Tyr Gln Gln Val Gly Ile Ile His Gln His Asn Asn 820 825 830 Ser Gly Phe Val Gly Tyr Leu Ala Pro Thr Met Arg Glu Gly Gln Ala 835 840 845 Tyr Pro Ala Asn Val Pro Tyr Pro Leu Ile Gly Lys Thr Ala Val Asp 850 855 860 Ser Ile Thr Gln Lys Lys Phe Leu Cys Asp Arg Thr Leu Trp Arg Ile 865 870 875 880 Pro Phe Ser Ser Asn Phe Met Ser Met Gly Ala Leu Thr Asp Leu Gly 885 890 895 Gln Asn Leu Leu Tyr Ala Asn Ser Ala His Ala Leu Asp Met Thr Phe 900 905 910 Glu Val Asp Pro Met Asp Glu Pro Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Glu 915 920 925 Val Phe Asp Val Val Arg Val His Gln Pro His Arg Gly Val Ile Glu 930 935 940 Thr Val Tyr Leu Arg Thr Pro Phe Ser Ala Gly Asn Ala Thr Thr 945 950 955 <210> 51 <211> 962 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hexon Polypeptide <400> 51 Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ser Tyr Met His Ile Ser 1 5 10 15 Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala 20 25 30 Arg Ala Thr Glu Thr Tyr Phe Ser Leu Asn Asn Lys Phe Arg Asn Pro 35 40 45 Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu 50 55 60 Thr Leu Arg Phe Ile Pro Val Asp Arg Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Ala Arg Phe Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met 85 90 95 Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Thr 100 105 110 Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Leu Ala Pro Lys Gly 115 120 125 Ala Pro Asn Ser Cys Glu Trp Glu Gln Asn Glu Thr Ala Gln Val Asp 130 135 140 Ala Gln Glu Leu Asp Glu Glu Glu Asn Glu Ala Asn Glu Ala Gln Ala 145 150 155 160 Arg Glu Gln Glu Gln Ala Lys Lys Thr His Val Tyr Ala Gln Ala Pro 165 170 175 Leu Ser Gly Glu Ala Ile Asn Lys Asn Gly Leu Gln Ile Gly Thr Asn 180 185 190 Gly Ala Ala Thr Glu Gly Asn Lys Glu Ile Tyr Ala Asp Lys Thr Tyr 195 200 205 Gln Pro Glu Pro Gln Ile Gly Glu Ser Gln Trp Asn Glu Ala Glu Ser 210 215 220 Ser Val Ala Gly Gly Arg Val Leu Lys Lys Thr Thr Pro Met Lys Pro 225 230 235 240 Cys Tyr Gly Ser Tyr Ala Arg Pro Thr Asn Ser Asn Gly Gly Gln Gly 245 250 255 Val Met Val Glu Gln Asn Gly Lys Leu Glu Ser Gln Val Glu Met Gln 260 265 270 Phe Phe Ser Thr Ser Val Asn Ala Met Asn Glu Ala Asn Ala Ile Gln 275 280 285 Pro Lys Leu Val Leu Tyr Ser Glu Asp Val Asn Met Glu Thr Pro Asp 290 295 300 Thr His Leu Ser Tyr Lys Pro Gly Lys Ser Asp Asp Asn Ser Lys Ala 305 310 315 320 Met Leu Gly Gln Gln Ser Met Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Ala Phe 325 330 335 Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met 340 345 350 Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn Ala Val Val Asp Leu 355 360 365 Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu Leu Leu Asp Ser Ile 370 375 380 Gly Asp Arg Thr Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser 385 390 395 400 Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Thr Glu Asp Glu 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825 830 His Asn Asn Ser Gly Phe Val Gly Tyr Leu Ala Pro Thr Met Arg Glu 835 840 845 Gly Gln Ala Tyr Pro Ala Asn Val Pro Tyr Pro Leu Ile Gly Lys Thr 850 855 860 Ala Val Asp Ser Ile Thr Gln Lys Lys Phe Leu Cys Asp Arg Thr Leu 865 870 875 880 Trp Arg Ile Pro Phe Ser Ser Asn Phe Met Ser Met Gly Ala Leu Thr 885 890 895 Asp Leu Gly Gln Asn Leu Leu Tyr Ala Asn Ser Ala His Ala Leu Asp 900 905 910 Met Thr Phe Glu Val Asp Pro Met Asp Glu Pro Thr Leu Leu Tyr Val 915 920 925 Leu Phe Glu Val Phe Asp Val Val Arg Val His Gln Pro His Arg Gly 930 935 940 Val Ile Glu Thr Val Tyr Leu Arg Thr Pro Phe Ser Ala Gly Asn Ala 945 950 955 960 Thr Thr

Claims (20)

  1. 복수개의 아미노산 쇄를 포함하는 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물이며, 각각의 아미노산 쇄는 적어도 하나의 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) 폴리펩티드를 포함하는 것인 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 다가 PD-L1 결합 화합물이 Ig 폴리펩티드, 시그마-1 폴리펩티드 및 스트렙타비딘 폴리펩티드로부터 선택된 스캐폴드 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 접합체인 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물.
  3. 제2항에 있어서, 다가 PD-L1 결합 화합물이 1개 초과의 스캐폴드 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 접합체인 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) 폴리펩티드가 인간 PD-1 또는 뮤린 PD-1인 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 아미노산 쇄가 치료 폴리펩티드, 표적화 폴리펩티드 또는 항원 폴리펩티드를 포함하는 것인 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 표적화 폴리펩티드가 홍역 바이러스 혈구응집소 (MVH) 폴리펩티드, 홍역 바이러스 융합 (MVF) 폴리펩티드, 및 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSVG) 폴리펩티드로부터 선택되는 것인 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물.
  7. 제5항에 있어서, 치료 폴리펩티드가 4-1BB 리간드 (4-1BBL) 폴리펩티드, OX40 리간드 (OX40L) 폴리펩티드, CD40 리간드 (CD40L) 폴리펩티드, 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 폴리펩티드로부터 선택되는 것인 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물.
  8. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) 폴리펩티드를 포함하는 각각의 아미노산 쇄가 재조합 아데노바이러스 (Ad)와 회합하고, 복수개의 아미노산 쇄가 재조합 Ad의 피막 폴리펩티드 상에 존재하는 것인 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물.
  9. 제8항에 있어서, 재조합 Ad가 Ad 균주 Ad6의 캡시드 헥손 폴리펩티드 및 Ad 균주 Ad57로부터의 적어도 하나의 캡시드 헥손 초가변 영역 (HVR) 폴리펩티드를 포함하는 것인 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물.
  10. 제9항에 있어서, Ad 균주 Ad6의 캡시드 헥손 폴리펩티드가 Ad 균주 Ad57로부터의 HVR 폴리펩티드 1-7을 포함하는 것인 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물.
  11. 제9항에 있어서, Ad 균주 Ad6의 캡시드 헥손 폴리펩티드가 Ad 균주 Ad57로부터의 HVR 폴리펩티드 2-6을 포함하는 것인 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물.
  12. 제8항에 있어서, 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) 폴리펩티드가 인간 PD-1인 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물.
  13. 제8항에 있어서, PD-1 폴리펩티드가 인자 X 단일-쇄 항체 폴리펩티드의 비타민 K-의존성 감마-카르복시글루탐산 도메인 (FX 폴리펩티드의 GLA 도메인)에 융합된 것인 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물.
  14. 제8항에 있어서, 각각의 아미노산 쇄가 홍역 바이러스 혈구응집소 (MVH) 폴리펩티드, 홍역 바이러스 융합 (MVF) 폴리펩티드, 및 수포성 구내염 바이러스 당단백질 (VSVG) 폴리펩티드로부터 선택된 표적화 분자를 포함하는 것인 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물.
  15. 제8항에 있어서, 각각의 아미노산 쇄가 4-1BB 리간드 (4-1BBL) 폴리펩티드, OX40 리간드 (OX40L) 폴리펩티드, CD40 리간드 (CD40L) 폴리펩티드, 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 폴리펩티드로부터 선택된 하나 이상의 치료 폴리펩티드를 포함하는 것인 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물.
  16. 제1항의 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
  17. 제8항의 다가 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 결합 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 1종 이상의 암 치료제를 포유동물에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 암 치료제가 PD-1을 표적화하는 면역요법인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 면역요법이 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 세미플리맙, 및 두르발루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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