JP2022530892A - 癌を治療するための多価ｐｄ－ｌ１結合化合物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、癌を治療するための方法および材料を提供する。本発明は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物および／または癌を有する哺乳動物を治療するために該哺乳動物に投与される１つもしくは複数の一価もしくは多価プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物を含有する組成物を送達するための方法および材料を包含する。一部の場合において、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、２つまたはそれより多くのプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）ポリペプチド（および／またはＰＤ－Ｌ１に結合する能力を有するその断片）を含むことができる。本発明はまた、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を作製するための方法および材料ならびにＰＤ－Ｌ１結合化合物をコードする核酸分子を作製するための方法および材料を提供する。

Description

本発明は、癌を治療するための方法および材料に関する。本発明は、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を作製するための方法および材料を提供する。本発明はまた、癌を有する哺乳動物の細胞中でＰＤ－１ポリペプチドを発現させるための方法および材料を提供する。特に、本発明は、ＰＤ－１ポリペプチドを含む組成物に関し、ＰＤ－１ポリペプチドは、１つまたは複数の多価プログラム細胞死リガンド１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １：ＰＤ－Ｌ１）結合化合物の形態であってもよい。一部の場合において、多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、２つまたはそれより多くのプログラム細胞死タンパク質１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ １：ＰＤ－１）ポリペプチド（および／またはＰＤ－Ｌ１に結合する能力を有するその断片）を含むことができる。ＰＤ－Ｌ１結合化合物を含む組成物は、癌を治療するために有効な量で癌を有する哺乳動物に投与され、および任意選択的に、１つまたは複数の癌療法と組み合わせて投与される。
Ｂ７－Ｈ１とも呼ばれるＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－１受容体へのその結合を通じて免疫系を調節する免疫チェックポイントタンパク質である。腫瘍微環境において、腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１の過剰発現は抗腫瘍免疫を抑制するのを助ける（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｍｅｄ． ８：７９３～８００頁、（２００２）（非特許文献１）；Ｈａｍａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２１：４６２～４７３頁（２０１６）（非特許文献２）；Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５：１３６５～１３６９頁（１９９９）（非特許文献３）；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １２５：３３８４～３３９１頁（２０１５）（非特許文献４）；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． ５：１３１１０頁（２０１５）（非特許文献５）；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １８：６５８０～６５８７頁（２０１２）（非特許文献６）；Ｏｈａｅｇｂｕｌａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ２１：２４～３３頁（２０１５）（非特許文献７）；およびＰｏｓｔｏｗ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ３３：１９７４～１９８２頁（２０１５）（非特許文献８））。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、癌細胞から放出された抗原を受け取り、それらをＴ細胞に提示する。癌細胞はまた、主要組織適合複合体の状況において活性化Ｔ細胞に抗原を提示することができる。Ｔ細胞活性化でＰＤ－１受容体はＴ細胞上に発現され、ＡＰＣ上のＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２リガンドならびに癌細胞上のＰＤ－Ｌ１のエンゲージメントにより免疫応答を阻害する。したがって、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）媒介性特異的遮断は抗腫瘍免疫を増強することができる。Ｔ細胞およびＡＰＣに加えて、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１は他の免疫細胞上で誘導され得る。
癌疾患状態において、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞上に存在するＰＤ－Ｌ１の、Ｔ細胞上に存在するＰＤ－１との相互作用は、Ｔ細胞機能シグナルを低減させて、免疫系がＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞を攻撃することを予防することができる。可溶性ＰＤ－１（ｓＰＤ－１）は、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞上に存在するＰＤ－Ｌ１に結合することによりデコイとして作用することができる。例えば、ｓＰＤ－１が、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞上に存在するＰＤ－Ｌ１に結合している場合、ＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞上に存在するＰＤ－１と自由に相互作用できず、それにより、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞を攻撃することによりＴ細胞が機能することを可能とする。
Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｍｅｄ． ８：７９３～８００頁、（２００２） Ｈａｍａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２１：４６２～４７３頁（２０１６） Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５：１３６５～１３６９頁（１９９９） Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １２５：３３８４～３３９１頁（２０１５） Ｈｅ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． ５：１３１１０頁（２０１５） Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １８：６５８０～６５８７頁（２０１２） Ｏｈａｅｇｂｕｌａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ２１：２４～３３頁（２０１５） Ｐｏｓｔｏｗ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ３３：１９７４～１９８２頁（２０１５）
本発明は、１つまたは複数の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を作製するための方法および材料を提供する。本発明は、ＰＤ－１ポリペプチドを含むＰＤ－Ｌ１結合化合物を含む組成物を提供し、ＰＤ－１ポリペプチドは１つまたは複数の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物の形態であってもよい。ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞上に存在するＰＤ－Ｌ１に結合することによりデコイとして作用することができる。
本発明は、ＰＤ－１ポリペプチドを含む方法および材料を提供し、ＰＤ－１ポリペプチドは、癌を有する哺乳動物に投与されて哺乳動物を治療する１つまたは複数の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物の形態であってもよい。一部の場合において、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる２つまたはそれより多くのアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）を含む。多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、２つまたはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチド（またはＰＤ－Ｌ１に結合する能力を有するそれらの断片）を含み、その結果、化合物は２つまたはそれより多くのＰＤ－Ｌ１ポリペプチドに結合することができる。本発明はまた、ＰＤ－Ｌ１結合化合物、および本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合化合物または多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を形成するＰＤ－１ポリペプチドを含む少なくとも１つのアミノ酸セグメントを含む組換えＡｄを含む組成物を作製方法を提供する。
１つの実施態様において、スキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）ポリペプチドに融合したマウスＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはヒトＰＤ－１ポリペプチドは、ポリペプチドコンジュゲート（例えば、複数（例えば、２つまたはそれより多く）の会合したアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲート）を形成することができ、その結果、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドに融合したスキャフォールドポリペプチドがポリペプチドコンジュゲート中にある場合、ポリペプチドコンジュゲートは、２つまたはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドを含む多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を形成することができる。
１つの実施態様において、ポリペプチドコンジュゲートは３つのアミノ酸鎖を含むことができ、スキャフォールドポリペプチドは、哺乳動物オルトレオウイルス３（Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓ ３）に由来するシグマ－１ポリペプチドであることができ、かつポリペプチドコンジュゲートは３つのＰＤ－１ポリペプチドを含むことができる。
１つの実施態様において、ポリペプチドコンジュゲートは４つのアミノ酸鎖を含むことができ、スキャフォールドポリペプチドはストレプトアビジンポリペプチドであることができ、かつポリペプチドコンジュゲートは４つのＰＤ－１ポリペプチドを含むことができる。
本発明はまた、ＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－１ポリペプチドをコードする核酸を含む組換えＡｄを含む組成物を提供する。１つの実施態様において、マウスＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはヒトＰＤ－１ポリペプチドは、第Ｘ因子単鎖抗体ポリペプチドのビタミンＫ依存性ガンマ－カルボキシグルタミン酸ドメイン（Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇａｍｍａ－ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃ ｄｏｍａｉｎ）（ＦＸポリペプチドのＧＬＡまたはＧＬＡ－ＥＧＦドメイン）に融合しており、かつアデノウイルスヘキソンポリペプチド上に存在し、その結果、ポリペプチドが、ウイルス粒子のカプシド上に存在する２つまたはそれより多くのウイルスヘキソンポリペプチド上に存在する場合、ウイルス粒子は、約２４０～約７２０個のＰＤ－１ポリペプチドを含む多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を形成することができる。
本発明は、ＰＤ－１タンパク質および／またはＰＤ－Ｌ１に結合するアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）を発現する１種または複数の組換えアデノウイルス（Ａｄ）を投与することにより癌を治療するための方法および材料を提供する。ＰＤ－１を発現する組換えＡｄは、治療的処置レジーム（ｒｅｇｉｍｅ）にしたがって癌免疫療法と組み合わせて投与されてもよい。
多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物の使用は、（例えば、単量体ＰＤ－１ポリペプチドと比較して、）ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞上に存在するＰＤ－Ｌ１を中和するＰＤ－１の有効性を増加させることができ、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞が免疫系を回避することを予防することができ、かつ／または抗癌剤（例えば、癌免疫療法）をＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞により有効に標的化することを可能とすることができる。一部の場合において、ＰＤ－１ポリペプチドのアデノウイルス提示は、核酸送達のために細胞上のＰＤ－Ｌ１に治療用Ａｄを再標的化するためまたは腫瘍溶解性細胞死によりＰＤ－Ｌ１発現細胞を殺すために使用することができる。
１つの実施態様において、ＰＤ－Ｌ１結合化合物はまた、標的化分子を含むことができる。標的化および細胞融合分子は、ウイルスポリペプチド、例えば麻疹ウイルス（ＭＶ）ヘマグルチニン（Ｈ）ポリペプチド、ＭＶ融合（Ｆ）ポリペプチド、または水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）糖タンパク質（Ｇ）ポリペプチドであることができる。
ＰＤ－Ｌ１結合化合物はまた、１つまたは複数の治療ポリペプチドを含むことができる。治療ポリペプチドは、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）ポリペプチド、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）ポリペプチドから選択される。治療ポリペプチドはまた、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）関連タンパク質（ＧＩＴＲ）シグナル伝達を活性化させるポリペプチドであってもよい。
ＰＤ－Ｌ１結合化合物はまた、検出可能なポリペプチドを含むことができる。検出可能なポリペプチドは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼポリペプチドであることができる。
本発明は、ＰＤ－１ポリペプチドをコードする核酸を含むＰＤ－Ｌ１結合化合物の発現用の組換えベクターを包含し、ＰＤ－１ポリペプチドは、１つもしくは複数の標的化ポリペプチド、ならびに／または１つもしくは複数の治療ポリペプチド、ならびに／またはタンパク質（例えば、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、およびフィブリノーゲン）と共に発現されてもよい。ＰＤ－１ポリペプチドは、異種ポリペプチドとの融合タンパク質として発現されてもよい。ＰＤ－１ポリペプチドをコードする核酸、ならびに、標的化ポリペプチド、治療ポリペプチドおよびタンパク質をコードする核酸が、発現ベクター中に含まれてもよく、発現ベクターは任意選択的に、原核または真核細胞中でのポリペプチドの発現を可能とする発現カセットを含む。ベクターはウイルスベクターであることができる。ウイルスベクターは、Ａｄ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、またはレンチウイルスであることができる。ウイルスベクターは、Ａｄ６５７、Ａｄ６／５７／６、およびこれらのバリアントから選択されるＡｄであってもよい。Ａｄは制限増殖型Ａｄ（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ Ａｄ；ＣＲＡｄ）であってもよい。ウイルスベクターは腫瘍溶解性ウイルスベクターであることができる。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるようなＰＤ－１ポリペプチドおよびスキャフォールドポリペプチドを含むアミノ酸鎖をコードする核酸を含むＰＤ－Ｌ１結合化合物（例えば、複数のアミノ酸鎖を含むことができるポリペプチドコンジュゲートであって、各アミノ酸鎖がＰＤ－１ポリペプチドおよびスキャフォールドポリペプチドを含み、かつ当該複数のアミノ酸鎖がポリペプチドコンジュゲートを形成することができる、ポリペプチドコンジュゲート）の発現用のウイルスベクターを包含する。
別の態様において、本発明は、癌を有する哺乳動物を治療する方法を包含する。当該方法は、ＰＤ－Ｌ１結合化合物を含む組成物を癌を有する哺乳動物に投与することを含む、またはから本質的になることができる。
本発明の方法は、本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合化合物を含む有効量の組成物を投与することを含む。１つの実施態様において、ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、１つまたは複数の癌治療法と組み合わせて哺乳動物に投与され、それにより、哺乳動物中に存在する癌細胞の数は低減される。１つまたは複数の癌治療法は、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１を標的化する免疫療法を含んでもよい。免疫療法は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、セミプリマブ、およびデュルバルマブから選択されてもよい。
別の態様において、本発明は、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を含む組成物を癌を有する哺乳動物に投与することを含む、またはから本質的になる、癌を有する哺乳動物を治療する方法に関する。多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、本明細書に記載のポリペプチドコンジュゲート（例えば、複数のアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲートであって、各アミノ酸鎖がＰＤ－１ポリペプチドおよびスキャフォールドポリペプチドを含む、ポリペプチドコンジュゲート）を含んでもよい。癌は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、肝細胞癌、膵臓癌、腎臓癌、黒色腫、脳腫瘍、結腸癌、リンパ腫、骨髄腫、リンパ球性白血病、または骨髄性白血病であってもよい。投与することは全身または局所投与（例えば静脈内、腫瘍内、筋肉内、器官内、リンパ節内投与）を含むことができる。
本発明の一態様は、複数のアミノ酸鎖を含む多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物であって、各アミノ酸鎖が少なくとも１つのプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）ポリペプチドを含む、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物に関する。
本発明のさらなる態様は、Ｉｇポリペプチド、シグマ－１ポリペプチドおよびストレプトアビジンポリペプチドから選択されるスキャフォールドポリペプチドを含むポリペプチドコンジュゲートであるような多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物に関する。
本発明のさらなる態様は、１つより多くのスキャフォールドポリペプチドを含むポリペプチドコンジュゲートであるような多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物に関する。
本発明のさらなる態様は、ＰＤ－１ポリペプチドがヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１であるような多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物に関する。
本発明のさらなる態様は、複数のアミノ酸鎖が、治療ポリペプチド、標的化ポリペプチドまたは抗原性ポリペプチドを含むような多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物に関する。
本発明のさらなる態様は、標的化ポリペプチドが、麻疹ウイルスヘマグルチニン（ＭＶＨ）ポリペプチド、麻疹ウイルス融合（ＭＶＦ）ポリペプチド、および水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶＧ）ポリペプチドから選択されるような多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物に関する。
本発明のさらなる態様は、治療ポリペプチドが、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）ポリペプチド、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）ポリペプチドおよびＧＩＴＲアゴニストから選択されるような多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物に関する。
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つのプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）ポリペプチドを含む各アミノ酸鎖が組換えアデノウイルス（Ａｄ）と会合しており、かつ複数のアミノ酸鎖が組換えＡｄのコートポリペプチド上に存在するような多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物に関する。
本発明のさらなる態様は、組換えＡｄがＡｄ株Ａｄ６のカプシドヘキソンポリペプチドおよびＡｄ株Ａｄ５７からの少なくとも１つのカプシドヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）ポリペプチドを含むような多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物に関する。
本発明のさらなる態様は、Ａｄ株Ａｄ６のカプシドヘキソンポリペプチドがＡｄ株Ａｄ５７からのＨＶＲポリペプチド１～７を含むような多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物に関する。
本発明のさらなる態様は、Ａｄ株Ａｄ６のカプシドヘキソンポリペプチドがＡｄ株Ａｄ５７からのＨＶＲポリペプチド２～６を含むような多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物に関する。
本発明のさらなる態様は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）ポリペプチドがヒトＰＤ－１であるような多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物に関する。
本発明のさらなる態様は、ＰＤ－１ポリペプチドが第Ｘ因子単鎖抗体ポリペプチドのビタミンＫ依存性ガンマ－カルボキシグルタミン酸ドメイン（ＦＸポリペプチドのＧＬＡドメイン）に融合しているような多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物に関する。
本発明のさらなる態様は、各アミノ酸鎖が、麻疹ウイルスヘマグルチニン（ＭＶＨ）ポリペプチド、麻疹ウイルス融合（ＭＶＦ）ポリペプチド、および水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶＧ）ポリペプチドから選択される標的化分子を含むような多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物に関する。
本発明のさらなる態様は、各アミノ酸鎖が、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）ポリペプチド、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）ポリペプチドから選択される１つまたは複数の治療ポリペプチドを含むような多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物に関する。
本発明のさらなる態様は、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物および薬学的に許容可能な担体を含むような医薬組成物に関する。
本発明のさらなる態様は、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を投与することを含む、それを必要とする対象において癌を治療する方法に関する。
本発明のさらなる態様は、１つまたは複数の癌治療法を哺乳動物に投与することをさらに含むような方法に関する。
本発明のさらなる態様は、癌治療法が、ＰＤ－１を標的化する免疫療法であるような方法に関する。
本発明のさらなる態様は、免疫療法が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、セミプリマブ、およびデュルバルマブからなる群から選択されるような方法に関する。
他に定義されなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本発明が関連する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を使用して本発明を実施することができるが、好適な方法および材料が以下に記載される。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は参照によりそれらの全体が組み込まれる。矛盾がある場合、定義を含めて、本明細書が優先される。追加的に、材料、方法、および例は実例的なものに過ぎず、限定的であることは意図されない。
本発明の１つまたは複数の実施態様の詳細が、添付の図面および以下の説明において記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、該説明および図面、ならびに請求項から明らかであろう。
図１Ａは、例示的な操作された多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物の図式を示す。１つのＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む２つのアミノ酸鎖を含む二量体ポリペプチドコンジュゲートであるＩｇポリペプチドに融合したＰＤ－１ポリペプチドを含む多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物。シグマポリペプチドに融合した１つのＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む３つのアミノ酸鎖を含む三量体ポリペプチドコンジュゲートである多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物。四量体ポリペプチドコンジュゲートである多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、ストレプトアビジンポリペプチドに融合した１つのＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む４つのアミノ酸鎖を含む。ＦＸポリペプチドのＧＬＡドメインに融合した１つのＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖。Ｎ末端またはＣ末端上の実体のいずれかを用いて融合タンパク質を構築することができる。アデノウイルス粒子の表面に結合した融合タンパク質は多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成する。 図１Ｂは、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、またはエラスチンのような天然バイオポリマーへのＰＤ－１モチーフの導入による操作されたＰＤ－Ｌ１結合化合物を示す。タンパク質単量体へのＰＤ－１の融合および細胞中での発現は、多くのＰＤ－Ｌ１結合性モチーフを提示する多価ポリマーへのそれらのアセンブリーを可能とする。 図２Ａは、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができるアミノ酸鎖をコードすることができる核酸ベクターを示す。図２Ａは、ＩｇＧポリペプチドに融合した１つのマウスＰＤ－１（ｍＰＤ－１）ポリペプチドを含むアミノ酸鎖をコードすることができる核酸ベクター（左上）、ＩｇＧポリペプチドに融合した１つのヒトＰＤ－１（ｈＰＤ－１）ポリペプチドを含むアミノ酸鎖をコードすることができる核酸ベクター（右上）、およびＦＸポリペプチドのＧＬＡドメインに融合したＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖をコードすることができる核酸ベクターを生成するためにＩｇＧをコードする核酸をＦＸポリペプチドのＧＬＡドメインをコードする核酸で置き換えるため、またはシグマ－１ポリペプチドに融合したＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖をコードすることができる核酸ベクターを生成するためにＩｇＧをコードする核酸をシグマ－１ポリペプチドをコードする核酸で置き換えるための例示的なクローニング戦略（下）の図式を示す。 図２Ｂは、ＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖の発現を示すゲルの画像を含む。レーン１：分子量マーカー（塩基対；ｂｐ）；レーン２：ＦＸポリペプチドのＧＬＡドメインに融合したＰＤ－１ポリペプチド；レーン３：分子量マーカー（ｂｐ）；レーン４：シグマ－１ポリペプチドに融合したＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖。 図３は、ＦＸポリペプチドのＧＬＡドメインに融合したｈＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖をコードすることができる核酸ベクター（左上）、シグマ－１ポリペプチドに融合したｈＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖をコードすることができる核酸ベクター（右上）、およびｈＰＤ－１ポリペプチドをコードする核酸をｍＰＤ－１ポリペプチドをコードする核酸で置き換えるための例示的なクローニング戦略（下）の図式を示す。 図４は、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができるアミノ酸鎖をコードすることができる例示的な核酸ベクターの図式を示す。 図５は、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができるアミノ酸鎖をコードすることができる例示的なアデノウイルス（Ａｄ）ベクターの図式を示す。 図６は、Ｔ細胞を活性化させることができる免疫チェックポイントポリペプチド（４－１ＢＢＬ）をコードする核酸、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチド（ＰＤ－１－Ｘ、ここでＸは二量体、三量体、四量体、または多量体の結合性スキャフォールドである）をコードする核酸、および抗原、例えば癌抗原または感染性疾患抗原（ＨＰＶエピトープ）をコードする核酸を有するＡｄのゲノムの図式を示す。Ａｄゲノムの制限部位マップもまた示される。 図７は、ヘキソンおよびＥ３領域中のバリエーションを示すＡｄ５、６、および５７のアライメントを示す。（Ａ）Ａｄ６およびＡｄ５７のゲノムのＰｕｓｔｅｌｌ ＤＮＡアライメント。ボックスは、バリエーションが２つのウイルスの間で最も高いヘキソンおよびＥ３領域を指し示す。（Ｂ）Ａｄ５、Ａｄ６、およびＡｄ５７からのヘキソンタンパク質中の超可変領域のＣｌｕｓｔａｌＷアミノ酸アライメント。 図８は、Ａｄ６ ＨＶＲのＡｄ５７ ＨＶＲでの置き換えによるＡｄ６５７の構築を示す。略語：ＨＶＲ、超可変領域。 図９は、Ｅ１発現がネイティブなＥ１プロモーターにより制御される、複製能を有するＡｄ（ＲＣ－Ａｄ）；Ｅ１発現が前立腺特異的プロバシンプロモーターにより制御されるバリアントＣＲＡｄ－プロバシン－Ｅ１Ａ（Ａｄ－ＰＢ）；正常細胞におけるＩＦＮ経路に感受性の、ｐ３００経路との結合能が除去された、ＣＲＡｄ－ｄｌ１１０１；ｐＲＢ結合との結合能が、ウイルスがＲＢ経路途絶を有する癌細胞を殺すことを可能とするが、ＲＢ＋正常細胞において抑制される、ＣＲＡｄ－ｄｌ１１０７；ｐ３００経路との結合能が除去され、ＩＦＮ経路に感受性の、ｐＲＢとの結合能が除去されることによってウイルスがＲＢ経路途絶を有する癌細胞を殺すことを可能とするが、ＲＢ＋正常細胞においては抑制される、ＣＲＡｄ－ｄｌ１１０１／０７の図式である。 図１０は、野生型Ｅ１ＡポリペプチドのＮ末端部分、ならびにＣＲＡｄバリアント、ｄｌ１１０１、ｄｌ１１０７およびｄｌ１１０１／１１０７のＥ１Ａ Ｎ末端のアミノ酸配列を示す。 図１１は、Ａｄ種Ｃの例としてのＡｄ６およびＡｄ種Ｄの例としてのＡｄ２６における異なるＥ３免疫回避遺伝子の図式を示す。両方のＡｄは、Ｅ３ １２．５Ｋ、６．７Ｋ、１９Ｋ、１０．４Ｋ（ＲＩＤα）、１４．５Ｋ（ＲＩＤβ）、および１４．７Ｋ遺伝子のサイズおよび配列バリアントを発現し、これらのＥ３によりコードされるタンパク質の機能も描写している。 図１２は、例えば、ＰＥＧ化またはビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）を用いる「ＢＡＰ化（ＢＡＰｙｌａｔｉｏｎ）」により、修飾され得るＡｄ ＨＶＲ上の部位を描写する。 図１３は、Ａｄ治療サイクルを示す図式である。Ａ）Ａｄを用いる血清型スイッチング（ｓｅｒｏｔｙｐｅ－ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）の図式。Ｂ）共有結合性ポリマー連絡と組み合わせた血清型スイッチングによる処理の複数のラウンドのためにＡｄ６およびＡｄ６５７を使用することができる例示的な治療サイクルの図式。 図１４は、Ａｄ６５７－ＨＶＲ１－Ｃへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の連結を示す。Ａ）ＰＥＧ化を伴うおよび伴わないＡｄタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。矢印は、ヘキソンへのＰＥＧの化学的取付けに起因するサイズ増加を示す。Ｂ）ウイルス感染に対するマレイミド－ＰＥＧおよび非標的化ＮＨＳ－ＰＥＧによる標的化されたＰＥＧ化の効果。 図１５は、細胞および血液因子との天然の相互作用をモジュレートするための異なるＡｄ血清型からの異なるＨＶＲを組み合わせたキメラＨＶＲ構築物は、細胞侵入および細胞回避を変化させるための異なるＨＶＲにおける細胞結合性および細胞脱標的化ペプチドの挿入と組み合わせて薬理を向上させることを示す。この例において、薬理をモジュレートするため、およびポリエチレングリコールのようなポリマーまたはフルオロフォアのようなイメージング剤のような他の部分の標的化された連結を可能とするために単一のシステインアミノ酸がＡｄ６５７のＨＶＲ１およびＨＶＲ５に挿入されている。 図１６は、代表的なＣＲＡｄおよびペプチドの組み合わせのプラスミドマップを示す。ヘキソン、ならびに、個々のＨＶＲへの細胞標的化ペプチドの挿入が示される。 図１７は、代表的なＣＲＡｄおよびペプチドの組み合わせのプラスミドマップを示す。ヘキソン、ならびに、個々のＨＶＲへの細胞標的化ペプチドの挿入が示される。 図１８は、代表的なＣＲＡｄおよびペプチドの組み合わせのプラスミドマップを示す。ヘキソン、ならびに、個々のＨＶＲへの細胞標的化ペプチドの挿入が示される。 ＰＤ－１ ＰＤ－Ｌ１遮断アッセイ － ｐＡｄ６／５７／６－ｄｌ１１０７－ＤＥ３－ＲＳＶ－ｈＰＤ－１－ＨＡ－Ｉｇ－Ｉを感染させた細胞から融合タンパク質をプロテインＡカラム上で精製した。このタンパク質を陽性対照、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）からの抗ＰＤ－１モノクローナル抗体と共に滴定した。 腫瘍成長評価 － Ｂ１６－ＣＡＲ黒色腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に注射し、指し示されるベクターの３ｅ１１ウイルス粒子を腫瘍に注射した。ＣＲＡｄ＋ＰＤ－Ｌ１デコイはｐＡｄ６／５７／６－ｄｌ１１０７－ΔＥ３－ＲＳＶ－ｈＰＤ－１－ＨＡ－Ｉｇ－Ｉである。ＣＲＡｄ＋ＰＤ－Ｌ１デコイ＋免疫刺激剤は、ｐＡｄ６／５７／６－ｄｌ１１０７－ΔＥ３－ＲＳＶ－ｈＰＤ－１－ＨＡ－Ｉｇ－Ｉおよび４－１ＢＢＬを発現する第２のアデノウイルスを併用注射された腫瘍を表す。
発明の詳細な説明
本発明は、ＰＤ－１ポリペプチドを含む癌を治療するための方法および組成物を提供する。ＰＤ－１ポリペプチドは多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物の形態であってもよい。
一部の場合において、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる２つまたはそれより多くのアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）を含む。例えば、２つまたはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチド（および／またはＰＤ－Ｌ１に結合する能力を有するそれらの断片）を含む多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、２つまたはそれより多くのＰＤ－Ｌ１ポリペプチドに結合することができる。一部の場合において、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる２つまたはそれより多くのアミノ酸セグメントを含む単一のアミノ酸鎖を含むことができる。
一部の場合において、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメントをそれぞれが含む複数（例えば、２つまたはそれより多く）のアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲートを含むことができる。例えば、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメントを含むアミノ酸鎖は、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメントを含む１つまたは複数の他のポリペプチドとポリペプチドコンジュゲート（例えば、複数の会合したアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲート）を形成することができるスキャフォールドポリペプチドに融合した１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む融合ポリペプチドであることができる。１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドに融合したスキャフォールドポリペプチドがポリペプチドコンジュゲート中にある場合、ポリペプチドコンジュゲートは２つまたはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドを含むことができる。
１つの実施態様において、ＰＤ－１ポリペプチドを含むウイルス粒子は、２つまたはそれより多くのウイルスコートポリペプチドが、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメントを含む１つまたは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されている、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物の形態であってもよい。
１つの実施態様において、ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、ウイルスのコート上に提示されるＰＤ－１ポリペプチドを発現するように遺伝子改変された組換えウイルスを含む。さらなる実施態様において、組換えウイルスは、組換えウイルス骨格にとって異種の１つまたは複数のポリペプチド、例えば、治療ポリペプチド、標的化分子／ポリペプチドおよび抗原性ポリペプチドと組み合わせてＰＤ－１ポリペプチドを発現するように遺伝子改変されている。
１つの実施態様において、ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、ウイルスカプシドタンパク質の１つまたは複数のヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）において改変されている組換えＡｄ（すなわち、Ａｄ６５７、Ａｄ６／５７／６およびこれらのバリアント）を含み、かつ少なくとも１つのＰＤ－１ポリペプチドを含む。１つの実施態様において、組換えＡｄは、異種ポリペプチド、例えば標的化ポリペプチド、治療ポリペプチドおよび／または抗原を含むようにさらに改変されている。ＰＤ－１ポリペプチドならびに異種ポリペプチドはウイルス複製で発現される。ウイルスアセンブリーで、発現されたポリペプチドは、ウイルスカプシド構造の成分としてウイルスの表面上に提示されてもよい。
さらなる実施態様において、ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、ウイルス粒子のカプシド上に提示される１つまたは複数の異種ポリペプチドとの融合タンパク質としてＰＤ－１ポリペプチドを発現するように遺伝子改変された組換えＡｄを含む。異種ポリペプチドは、ＦＸポリペプチド、ＣＡＲポリペプチド、ＣＤ４６ポリペプチド、デスモグレインポリペプチド、インテグリンポリペプチド、単鎖抗体ポリペプチド、ラクダ科動物抗体ポリペプチド、カプシドポリペプチド、およびエンベロープ結合性ポリペプチドからのＧＬＡドメインを含んでもよい。
一部の場合において、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドを含むアミノ酸鎖は、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドを含む融合ポリペプチドであることができる。１つの実施態様において、ＰＤ－１および異種ポリペプチドの融合タンパク質は、宿主細胞中で発現され、精製され、かつＡｄと混合されて、その結果、融合タンパク質が、Ａｄへの異種ポリペプチドの共有結合を介してＡｄの表面に結合しているようにされてもよい。ウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドに融合した１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む第１の融合ポリペプチドがウイルス粒子上の第１のウイルスコートポリペプチドに結合しており、かつウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドに融合した１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む第２の融合ポリペプチドがそのウイルス粒子上の第２のウイルスコートポリペプチドに結合している場合、ウイルス粒子は２つまたはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドを含む。
一部の場合において、ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、１つまたは複数のウイルスコートポリペプチドが、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）を含む１つまたは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されている、ウイルス粒子を含むことができる。ＰＤ－１ポリペプチドは、ウイルス複製およびアセンブリーの間に発現され、かつウイルスのコート上に提示されてもよい。１つの実施態様において、Ａｄ（すなわち、Ａｄ６５７、Ａｄ６／５７／６およびこれらのバリアント）は、治療ポリペプチド、標的化ポリペプチドおよび抗原性ポリペプチドから選択される１つまたは複数の異種ポリペプチドと組み合わせてＰＤ－１ポリペプチドを発現するようにＨＶＲ領域において改変されている。ＰＤ－１ポリペプチドは、１つまたは複数の異種ポリペプチドとの融合タンパク質として発現されてもよい。例えば、ウイルス粒子は、少なくとも１つのＰＤ－１ポリペプチドおよび異種ポリペプチドをそれぞれが含む２つまたはそれより多くのアミノ酸鎖を発現するように遺伝子改変されており、該アミノ酸鎖はウイルスカプシドの成分としてウイルス粒子の表面上に提示され、それにより多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を形成する。一部の場合において、ウイルス粒子は、ＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む２つまたはそれより多くのアミノ酸鎖を発現するように遺伝子改変されており、かつ異種ポリペプチドを含む１つまたは複数のアミノ酸鎖を発現するように改変されており、該アミノ酸鎖はウイルスカプシドの成分としてウイルス粒子の表面上に提示され、それにより多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を形成する。一部の場合において、アミノ酸鎖は、ウイルス粒子の表面上に提示される２つまたはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドおよび異種ポリペプチドを含む。
１つの実施態様において、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖は、異種ポリペプチドに融合した１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む融合タンパク質であることができる。異種ポリペプチドは、Ａｄの表面に結合してウイルス粒子をコートしていてもよい。１つの実施態様において、融合タンパク質は、宿主細胞中で発現され、精製され、かつＡｄと混合され、その結果、融合タンパク質はＡｄウイルス粒子の表面をコートし、それにより多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を形成する。
一部の場合において、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、（例えば、単量体ＰＤ－１ポリペプチドと比較して）ＰＤ－Ｌ１に対する増加した親和性を有することができる。一部の場合において、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、（例えば、単量体ＰＤ－１ポリペプチドと比較して）ＰＤ－Ｌ１に対する増加したアビディティを有することができる。
本発明は、ＰＤ－１ポリペプチドおよび多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を含む組成物を作製するための方法および材料、ならびに、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができるアミノ酸鎖をコードする核酸分子を含む組換えウイルスを作製するための方法および材料を提供する。
本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物（例えば、１つもしくは２つもしくはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、または１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む２つもしくはそれより多くのアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲート、またはウイルスコートタンパク質が、１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む１つもしくは複数のアミノ酸鎖を含む、ウイルス粒子、または１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドがウイルス粒子の表面に結合しているウイルス粒子）は、任意の適切な数の、ＰＤ－Ｌ１に結合することができるアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはＰＤ－Ｌ１に結合することができるそれらの断片）を含むことができる。
一部の場合において、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる２つまたはそれより多く（例えば、２、３、４、５、６、２４０、７２０、またはそれより多く）のアミノ酸セグメントを含むことができる。一部の場合において、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる約２～約７２０個のアミノ酸セグメントを含むことができる。例えば、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物が、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる２つまたはそれより多くのアミノ酸セグメントを含む単一のアミノ酸鎖である場合、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、約２、３、４、５、６、７、または８つのＰＤ－１ポリペプチド（またはＰＤ－Ｌ１に結合するそれらの断片）を含むことができる。例えば、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物が、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメントをそれぞれが含む複数のアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲートである場合、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、約２、３、４、５、６、７、または８つのＰＤ－１ポリペプチド（またはＰＤ－Ｌ１に結合するそれらの断片）を含むことができる。
例えば、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物が、２つまたはそれより多くのウイルスコートポリペプチド（例えばカプシドポリペプチド）が、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメントを含む１つまたは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されたウイルス粒子である場合、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、約２４０個のＰＤ－１ポリペプチド～約７２０個のＰＤ－１ポリペプチド（またはＰＤ－Ｌ１に結合するそれらの断片）を含むことができる。本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物が、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる２つのアミノ酸セグメント（または１つもしくは複数のウイルスコートポリペプチドが、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる２つもしくはそれより多くのアミノ酸セグメントを含む１つもしくは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されている、ウイルス粒子）を含む場合、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は二量体または二価ＰＤ－Ｌ１結合化合物と称することができる。本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物が、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる３つのアミノ酸セグメントを含む場合、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は三量体または三価ＰＤ－Ｌ１結合化合物と称することができる。本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物が、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる４つのアミノ酸セグメントを含む場合、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は四量体または四価ＰＤ－Ｌ１結合化合物と称することができる。
本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる任意の適切なアミノ酸セグメント（複数可）を含むことができる。
１つの実施態様において、ＰＤ－Ｌ１に結合することができるアミノ酸セグメントはＰＤ－１ポリペプチドを含むことができる。一部の場合において、ＰＤ－Ｌ１に結合することができるアミノ酸セグメントは、断片がＰＤ－Ｌ１に結合する能力を保持する限り、ＰＤ－１ポリペプチドの任意の断片を含むことができる。一部の場合において、ＰＤ－１ポリペプチドはｓＰＤ－１ポリペプチドであることができる。ＰＤ－１ポリペプチドは任意の適切な動物からのものであることができる。一部の場合において、ＰＤ－１ポリペプチドは哺乳動物からのものであることができる。例えば、ＰＤ－１ポリペプチドはｈＰＤ－１ポリペプチドであることができる。例えば、ＰＤ－１ポリペプチドはｍＰＤ－１ポリペプチドであることができる。ＰＤ－１ポリペプチドは任意の適切なＰＤ－１ポリペプチド配列を含むことができる。一部の場合において、ＰＤ－１ポリペプチドは（例えば、ＰＤ－Ｌ１とのより高い親和性相互作用のために）改変されることができる。例示的なＰＤ－１ポリペプチド配列（およびそのようなポリペプチドをコードする核酸）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースにおいて、例えば、アクセッション番号ＡＩ９２８１３５（バージョンＡＩ９２８１３５．１）、アクセッション番号ＡＹ２３８５１７（バージョンＡＹ２３８５１７．１）、およびアクセッション番号ＣＲ９８８１２２（バージョンＣＲ９８８１２２．１）、アクセッション番号Ｕ６４８６３（バージョンＵ６４８６３．１）、アクセッション番号ＮＭ＿００８７９８（バージョンＮＭ＿００８７９８．２）、およびアクセッション番号ＮＰ＿０３２８２４（バージョンＮＰ＿０３２８２４．１）で記載された通りであり得る。一部の場合において、ＰＤ－１ポリペプチドは配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む。一部の場合において、ＰＤ－１ポリペプチドは配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む。
一部の場合において、ＰＤ－Ｌ１に結合することができるアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）は、バリアント配列と称されることがある、野生型ＰＤ－１ポリペプチド配列（例えば、配列番号５または配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する野生型ＰＤ－１ポリペプチド）から逸脱した配列を有することができる。例えば、ＰＤ－１ポリペプチド配列（および／またはＰＤ－Ｌ１に結合する能力を有するそれらの断片）は、配列番号５または配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有することができる。一部の実施態様において、ＰＤ－Ｌ１に結合することができるアミノ酸セグメントは、配列番号５または配列番号６に対して少なくとも８５％の配列同一性、９０％の配列同一性、９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有することができる。配列同一性パーセントは、アライメントされたポリペプチド配列中のマッチした位置の数を決定し、マッチした位置の数を、アライメントされたアミノ酸の総数でそれぞれ割り、１００を掛けることにより算出される。マッチした位置は、同一のアミノ酸が、アライメントされた配列中の同じ位置において生じる位置を指す。アライメントされたアミノ酸の総数は、第２の配列をアライメントするために必要なＰＤ－１ポリペプチド中のアミノ酸の最小数を指し、非ＰＤ－１配列、例えばＰＤ－１ポリペプチドに融合した非ＰＤ－１配列（例えば、ＰＤ－１ポリペプチドに融合したＩｇＧポリペプチド、ストレプトアビジンポリペプチド、シグマ－１、またはＦＸポリペプチドのＧＬＡドメインからのアミノ酸）とのアライメント（例えば、強制的なアライメント）を含まない。アライメントされたアミノ酸の総数は、ＰＤ－１配列全体に対応してもよく、または全長ＰＤ－１配列の断片に対応してもよい。配列は、ワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいて利用可能な、ＢＬＡＳＴ（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）プログラムに組み込まれた、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、 ２５：３３８９～３４０２頁（１９９７））により記載されたアルゴリズムを使用してアライメントすることができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．のアルゴリズムを使用してＰＤ－１ポリペプチドおよび任意の他の配列またはその部分の間の配列同一性パーセントを決定するためにＢＬＡＳＴサーチまたはアライメントを行うことができる。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列の間でアライメントを行い、同一性を比較するために使用されるプログラムであり、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列の間でアライメントを行い、同一性を比較するために使用されるプログラムである。ＰＤ－１配列および別の配列の間の同一性パーセントを算出するためにＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各々のプログラムのデフォルトのパラメーターが使用される。
一部の場合において、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）をそれぞれが含む複数のアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲートを含むことができる。本明細書において使用される場合、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメントをそれぞれが含む複数のアミノ酸鎖は、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメントをそれぞれが含む２つまたはそれより多く（例えば、２、３、４、５、６、７、８、またはそれより多く）のアミノ酸鎖を指す。例えば、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖は、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメントを含む１つまたは複数の他のポリペプチドとポリペプチドコンジュゲート（例えば、複数の会合したアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲート）を形成することができるスキャフォールドポリペプチドに融合した１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む融合ポリペプチドであることができる。１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドに融合したスキャフォールドポリペプチドがポリペプチドコンジュゲート中にある場合、ポリペプチドコンジュゲートは２つまたはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドを含むことができる。一部の場合において、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む複数のアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲートは、ホモマーＰＤ－１ポリペプチドであることができる（例えば、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む２つまたはそれより多くの同じアミノ酸鎖を含むことができる）。一部の場合において、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む複数のアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲートは、ヘテロマーＰＤ－１ポリペプチドであることができる（例えば、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む２つまたはそれより多くの異なるアミノ酸鎖を含むことができる）。
本明細書に記載のポリペプチドコンジュゲート（例えば、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む複数のアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲート）中に存在するＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）を含むアミノ酸鎖は、任意の適切なスキャフォールドポリペプチドに融合したＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメントを含むことができる。例えば、本明細書に記載のポリペプチドコンジュゲート中に存在する１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖は、任意の適切なスキャフォールドポリペプチドに融合した１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む融合ポリペプチドであることができる。一部の場合において、スキャフォールドポリペプチドは、ポリペプチドコンジュゲート（例えば、複数の会合したアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲート）を形成する能力を有することができる。例えば、スキャフォールドポリペプチドに融合した１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む２つまたはそれより多くのアミノ酸鎖は、２つまたはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドを含むポリペプチドコンジュゲートを形成することができる。スキャフォールドポリペプチドに融合した１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む２つまたはそれより多くのアミノ酸鎖がポリペプチドコンジュゲートを形成する場合、２つまたはそれより多くのアミノ酸鎖は（例えば、共有結合またはイオン結合により）結合することができる。スキャフォールドポリペプチドは、別のポリペプチドとポリペプチドコンジュゲートを形成することができる任意の適切なポリペプチドであることができる。スキャフォールドポリペプチドは、ポリペプチドコンジュゲートを天然に形成することができ、またはポリペプチドコンジュゲートを形成するように操作されることができる。ポリペプチドコンジュゲートを形成することができるスキャフォールドポリペプチドの例は、非限定的に、Ｉｇポリペプチド（例えば、ＩｇＧポリペプチド、例えばＩｇＧ２ポリペプチド）、シグマ－１ポリペプチド、およびストレプトアビジンポリペプチドを含むことができる。
本明細書に記載のポリペプチドコンジュゲート（例えば、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む複数のアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲート）中に存在することができるＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）を含むアミノ酸鎖は任意の適切なアミノ酸配列を含むことができる。例えば、スキャフォールドポリペプチドに融合した１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖は任意の適切なアミノ酸配列を含むことができる。１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびスキャフォールドポリペプチドを含むアミノ酸鎖の例示的なアミノ酸配列としては、非限定的に、配列番号７、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２５、２６、または２７に記載のアミノ酸配列が挙げられる。一部の場合において、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびスキャフォールドポリペプチドを含むアミノ酸鎖のアミノ酸配列は、バリアント配列と称されることがある、配列番号７、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２５、２６、または２７に記載のアミノ酸配列のうちの１つから逸脱した配列を有することができる。例えば、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびスキャフォールドポリペプチドを含有する融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２５、２６、または２７に記載のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有することができる。一部の実施態様において、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびスキャフォールドポリペプチドを含有する融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７、１０、１１、１２、１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２５、２６、または２７に記載のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性、９０％の配列同一性、９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有することができる。配列同一性パーセントは、アライメントされたポリペプチド配列中のマッチした位置の数を決定し、マッチした位置の数を、アライメントされたアミノ酸の総数でそれぞれ割り、１００を掛けることにより算出される。マッチした位置は、同一のアミノ酸が、アライメントされた配列中の同じ位置において生じる位置を指す。配列は、ワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいて利用可能な、ＢＬＡＳＴ（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）プログラムに組み込まれた、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、 ２５：３３８９～３４０２頁（１９９７））により記載されたアルゴリズムを使用してアライメントすることができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．のアルゴリズムを使用してポリペプチドおよび任意の他の配列またはその部分の間の配列同一性パーセントを決定するためにＢＬＡＳＴサーチまたはアライメントを行うことができる。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列の間でアライメントを行い、同一性を比較するために使用されるプログラムであり、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列の間でアライメントを行い、同一性を比較するために使用されるプログラムである。ポリペプチド配列および別の配列の間の同一性パーセントを算出するためにＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各々のプログラムのデフォルトのパラメーターが使用される。一部の場合において、本明細書に記載のポリペプチドコンジュゲート（例えば、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む複数のアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲート）中に存在することができる１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖は、例７に記載の通りであることができる。
一部の場合において、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）を含むアミノ酸鎖は、２つの会合したアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲートを形成することができるスキャフォールドポリペプチド（例えば、ＩｇＧポリペプチド、例えばＩｇＧ２ポリペプチド）に融合していることができる。例えば、ＩｇＧ２ポリペプチドに融合した１つのＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む２つのアミノ酸鎖は、２つのＰＤ－１ポリペプチドを含むポリペプチドコンジュゲートを形成することができる。ＩｇＧ２ポリペプチドに融合した１つのＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖の例示的なアミノ酸配列としては、非限定的に、配列番号７、配列番号１３、または配列番号２１に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
一部の場合において、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）を含むアミノ酸鎖は、３つの会合したアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲートを形成することができるスキャフォールドポリペプチド（例えば、シグマ－１ポリペプチド）に融合していることができる。例えば、シグマ－１ポリペプチドに融合した１つのＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む３つのアミノ酸鎖は、３つのＰＤ－１ポリペプチドを含むポリペプチドコンジュゲートを形成することができる。シグマ－１ポリペプチドに融合した１つのＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖の例示的なアミノ酸配列としては、非限定的に、配列番号１０、配列番号１６、または配列番号２４に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
一部の場合において、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）を含むアミノ酸鎖は、４つの会合したアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲートを形成することができるスキャフォールドポリペプチド（例えば、ストレプトアビジンポリペプチド）に融合していることができる。例えば、ストレプトアビジンポリペプチドに融合した１つのＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む４つのアミノ酸鎖は、４つのＰＤ－１ポリペプチドを含むポリペプチドコンジュゲートを形成することができる。ストレプトアビジンポリペプチドに融合した１つのＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖の例示的なアミノ酸配列としては、非限定的に、配列番号１１または配列番号１７に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
一部の場合において、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、２つまたはそれより多くのウイルスコートポリペプチドが、ＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）を含む１つまたは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されている、ウイルス粒子を含むことができる。例えば、ウイルス粒子は、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドをそれぞれが含む２つまたはそれより多くのアミノ酸鎖を用いてウイルス粒子をコーティングすることにより改変されることができる。ウイルス粒子をコートして多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物（例えば、２つまたはそれより多くのウイルスコートポリペプチドが、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む１つまたは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されている、ウイルス粒子）を生成するために使用することができるＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）を含むアミノ酸鎖は、ウイルスコートポリペプチドに結合することができる任意の適切なポリペプチドに融合したＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメントを含むことができる。一部の場合において、ウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドは１つまたは複数のウイルスコートポリペプチドに共有結合することができる。一部の場合において、ウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドは、高い親和性（例えば、約０．２５μＭ～約１００μＭ）でウイルスコートポリペプチドに結合することができる。ウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドは、ウイルスコートポリペプチドに天然に結合することができ、またはウイルスコートポリペプチドに結合するように操作されている。ウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドは任意の適切なウイルスコートポリペプチドに結合することができる。
ウイルスコートポリペプチドの例としては、非限定的に、カプシドポリペプチド（例えば、ヘキソンポリペプチド、ファイバーポリペプチド、ペントンポリペプチド）、およびアデノウイルスＩＸポリペプチドが挙げられる。ウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドは、任意の適切な種類のウイルス粒子上に存在するウイルスコートポリペプチドに結合することができる。ウイルス粒子は複製能を有する（ＲＣ：ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ウイルス粒子（例えば、ヘルパー依存性（ＨＤ）ウイルス粒子および単一サイクル（ＳＣ：ｓｉｎｇｌｅ－ｃｙｃｌｅ）ウイルス粒子）であることができ、ウイルス粒子は複製欠損（ＲＤ：ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）ウイルス粒子であることができ、またはウイルスは制限増殖型ウイルス粒子（ＣＲＡｄ：ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅ）であることができる。一部の場合において、ウイルス粒子は腫瘍溶解性ウイルス粒子であることができる。
一部の場合において、ウイルス粒子はウイルスベクターであることができる。１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドを含む１つまたは複数のアミノ酸鎖でコートすることができるウイルス粒子の例としては、非限定的に、Ａｄ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、エンテロウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、麻疹ウイルス、およびヘルペスウイルスが挙げられる。
ウイルスコートポリペプチド上に存在してもよいポリペプチドの例としては、非限定的に、ＧＬＡドメインポリペプチド（例えば、ＦＸポリペプチドからのＧＬＡドメイン）、ＣＡＲポリペプチド、ＣＤ４６ポリペプチド、デスモグレインポリペプチド、インテグリンポリペプチド、単鎖抗体ポリペプチド、ラクダ科動物抗体ポリペプチド、カプシドポリペプチド、およびエンベロープ結合性ポリペプチドが挙げられる。
ウイルス粒子をコートして多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物（例えば、１つまたは２つまたはそれより多くのウイルスコートポリペプチドが、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む１つまたは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されている、ウイルス粒子）を生成するために使用することができるＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）を含むアミノ酸鎖は任意の適切なアミノ酸配列を含むことができる。例えば、ウイルス粒子は、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびウイルスコートポリペプチドに共有結合することができるポリペプチドをそれぞれが含む２つまたはそれより多くのアミノ酸鎖を含み、その結果、アミノ酸鎖がウイルス粒子をコートする、組成物と接触させることができる。一部の場合において、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドを含むアミノ酸鎖は、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドを含む融合ポリペプチドであることができる。１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドを含むアミノ酸鎖は任意の適切なアミノ酸配列を含むことができる。１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドを含むアミノ酸鎖の例示的なアミノ酸配列としては、非限定的に、配列番号８、９、１４、１５、２２、または２３に記載のアミノ酸配列が挙げられる。一部の場合において、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドを含むアミノ酸鎖のアミノ酸配列は、バリアント配列と称されることがある、配列番号８、９、１４、１５、２２、または２３に記載のアミノ酸配列のうちの１つから逸脱した配列を有することができる。例えば、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドを含有する融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号８、９、１４、１５、２２、または２３に記載のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有することができる。一部の実施態様において、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドを含有する融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号８、９、１４、１５、２２、または２３に記載のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性、９０％の配列同一性、９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有することができる。配列同一性パーセントは、アライメントされたポリペプチド配列中のマッチした位置の数を決定し、マッチした位置の数を、アライメントされたアミノ酸の総数でそれぞれ割り、１００を掛けることにより算出される。マッチした位置は、同一のアミノ酸が、アライメントされた配列中の同じ位置において生じる位置を指す。配列は、ＢＬＡＳＴ（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）プログラムに組み込まれた、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、 ２５：３３８９～３４０２頁（１９９７））により記載されたアルゴリズムを使用してアライメントすることができる。一部の場合において、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドを含むアミノ酸鎖は例に記載の通りであることができる。
一部の場合において、ウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチド（例えば、ＦＸポリペプチドのＧＬＡドメイン）に融合したＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）を含むアミノ酸鎖は、（例えば、１つまたは複数のウイルスコートポリペプチドを改変するために）ウイルス粒子をコートして、ウイルス粒子の表面上に存在する１つまたは複数のウイルスコートポリペプチドに結合したＰＤ－Ｌ１に結合することができる１つまたは複数のアミノ酸セグメントを含む２つまたはそれより多くのアミノ酸鎖を有するコートされたウイルス粒子を形成するために使用することができる。
例えば、ＦＸポリペプチドのＧＬＡドメインに融合した１つのＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む１つまたは複数のアミノ酸鎖は、２つもしくはそれより多くのウイルスヘキソンポリペプチドおよび／または他のウイルスコートタンパク質に結合して、ＦＸポリペプチドのＧＬＡドメインに融合した１つのＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む２つまたはそれより多くのアミノ酸鎖でウイルス粒子をコートすることができる。ウイルス粒子がＡｄである場合、２４０個のヘキソンポリペプチドホモ三量体（例えば、３つのヘキソンポリペプチドを含むポリペプチドコンジュゲート）がウイルス粒子上に存在することができる（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ、 ２１：７３９～７４９頁（２０１０）を参照）。一部の場合において、１つのＰＤ－１ポリペプチドおよびＦＸポリペプチドのＧＬＡドメインを含む融合ポリペプチドは、Ａｄ粒子をコートして、約２４０個のＰＤ－１ポリペプチドを含む多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができる。例えば、ＦＸポリペプチドのＧＬＡドメインに融合した１つのＰＤ－１ポリペプチドを含む融合ポリペプチドがＡｄウイルス粒子上の各ヘキソンポリペプチド三量体に結合している場合、ウイルス粒子は２４０個のＰＤ－１ポリペプチドを含む。一部の場合において、１つのＰＤ－１ポリペプチドおよびＦＸポリペプチドのＧＬＡドメインを含む融合ポリペプチドは、Ａｄ粒子をコートして、約２４０個のＰＤ－１ポリペプチド～約７２０個のＰＤ－１ポリペプチドを含んでもよい多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができる。例えば、ＦＸポリペプチドのＧＬＡドメインに融合した１つのＰＤ－１ポリペプチドを含む融合ポリペプチドがＡｄウイルス粒子上の各ヘキソンポリペプチドに結合している場合、ウイルス粒子は７２０個のＰＤ－１ポリペプチドを含む。
一部の場合において、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物（例えば、２つもしくはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、または１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む１つもしくは２つもしくはそれより多くのアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲート、または２つもしくはそれより多くのウイルスコートポリペプチドが、１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む１つもしくは複数のアミノ酸鎖を含む、ウイルス粒子、または１つもしくは複数のウイルスコートポリペプチドが、２つもしくはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドを含む１つもしくは複数のアミノ酸鎖を含む、ウイルス粒子）はまた、１つまたは複数の追加の分子／ポリペプチドを含むことができる。
本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物中に含まれることができる分子の例としては、非限定的に、標的化分子（例えば、標的化ポリペプチドおよび標的化核酸配列）、抗原、治療用分子、ならびに検出可能なポリペプチドが挙げられる。一部の場合において、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物が、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはＰＤ－Ｌ１に結合する能力を有するＰＤ－１ポリペプチド断片をそれぞれが含む複数のアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲートであり、かつポリペプチドコンジュゲートが１つまたは複数の追加の分子を含む場合、１つまたは複数の追加の分子は、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはポリペプチドコンジュゲート中に存在するＰＤ－Ｌ１に結合する能力を有するＰＤ－１ポリペプチド断片を含む少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、またはそれより多く）のアミノ酸鎖中に含まれることができる。例えば、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物が、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはＰＤ－Ｌ１に結合する能力を有するＰＤ－１ポリペプチド断片をそれぞれが含む複数のアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲートであり、かつポリペプチドコンジュゲートが１つまたは複数の追加の分子を含む場合、１つまたは複数の追加の分子は、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはポリペプチドコンジュゲート中に存在するＰＤ－Ｌ１に結合する能力を有するＰＤ－１ポリペプチド断片を含む各アミノ酸鎖中に含まれることができる。一部の場合において、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物が、２つもしくはそれより多くのウイルスコートポリペプチドが、１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよび／もしくはＰＤ－Ｌ１に結合する能力を有するＰＤ－１ポリペプチド断片を含む１つもしくは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されている、ウイルス粒子（または１つもしくは複数のウイルスコートポリペプチドが、１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよび／もしくはＰＤ－Ｌ１に結合する能力を有するＰＤ－１ポリペプチド断片を含む２つもしくはそれより多くのアミノ酸セグメントを含む１つもしくは複数のアミノ酸鎖を含む、ウイルス粒子）である場合、１つまたは複数の追加の分子は、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはウイルス粒子上のウイルスコートポリペプチドを改変するために使用されるＰＤ－１ポリペプチド断片を含む少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、またはそれより多く）のアミノ酸鎖中に含まれることができる。例えば、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物が、２つもしくはそれより多くのウイルスコートポリペプチドが、１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよび／もしくはＰＤ－Ｌ１に結合する能力を有するＰＤ－１ポリペプチド断片を含む１つもしくは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されている、ウイルス粒子（または１つもしくは複数のウイルスコートポリペプチドが、１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよび／もしくはＰＤ－Ｌ１に結合する能力を有するＰＤ－１ポリペプチド断片を含む２つもしくはそれより多くのアミノ酸セグメントを含む１つもしくは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されている、ウイルス粒子）である場合、１つまたは複数の追加の分子は、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはウイルス粒子上のウイルスコートポリペプチドを改変するために使用されるＰＤ－１ポリペプチド断片を含む各アミノ酸鎖中に含まれることができる。
本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合化合物が１つまたは複数の標的化分子（例えば、標的化ポリペプチドおよび標的化核酸配列）も含む場合、標的化分子は任意の適切な標的化分子であることができる。一部の場合において、標的化分子はポリペプチド（例えば、標的化ポリペプチド）であることができる。一部の場合において、標的化分子は核酸配列（例えば、標的化核酸配列）であることができる。一部の場合において、標的化分子はＴ細胞をＰＤ－Ｌ１陽性細胞（例えば、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞）に誘引することができる。例えば、標的化分子を含む多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物がＰＤ－Ｌ１陽性細胞上のＰＤ－Ｌ１に結合している場合、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物上の標的化分子はＴ細胞をＰＤ－Ｌ１陽性細胞に誘引することができる。例えば、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物が標的化分子を含む場合、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物上の標的化分子は多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を哺乳動物内の標的位置（例えば、標的組織）に方向付けることができる。本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物中に含まれることができる標的化分子の例としては、ウイルスポリペプチド、抗原（例えば、ペプチド抗原）、ｍｉＲＮＡ標的化配列（例えば、組織特異的ｍｉＲＮＡ標的化配列）、抗体、増殖因子、および炭水化物が挙げられる。標的化ポリペプチドがウイルスポリペプチドである場合、ウイルスポリペプチドは任意の適切なウイルス（例えば、麻疹ウイルス（ＭＶ）、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ジカウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ））に由来することができる。標的化ポリペプチドがウイルスポリペプチドである場合、ウイルスポリペプチドは任意の適切なウイルスポリペプチド（例えば、ヘマグルチニン（Ｈ）ポリペプチド、例えば脱標的化Ｈポリペプチド、融合（Ｆ）ポリペプチド、ウイルス糖タンパク質（Ｇ）ポリペプチド、エンベロープ（ｅｎｖ；例えば、ＨＥＲＶ ｅｎｖ）、シンシチン－１、およびシンシチン－２であることができる。一部の場合において、ウイルスポリペプチドはＭＶ Ｈポリペプチドであることができる。一部の場合において、ウイルスポリペプチドはＭＶ Ｆポリペプチドであることができる。一部の場合において、ウイルスポリペプチドはＶＳＶ Ｇポリペプチドであることができる。
本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合化合物が１つまたは複数の治療用分子も含む場合、治療用分子は任意の適切な治療用分子であることができる。一部の場合において、治療用分子は治療ポリペプチドであることができる。一部の場合において、治療用分子は１つまたは複数のＴ細胞のＰＤ－Ｌ１不活性化を低減させまたは排除することができる。一部の場合において、治療用分子は１つまたは複数の医薬剤（例えば、抗癌薬物）を活性化および／または蓄積させることができる。本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物中に含まれることができる治療用分子の例としては、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）ポリペプチド、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）ポリペプチド、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）ポリペプチド、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－１抗体をコードする核酸、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、およびヨード共輸送体（ｉｏｄｉｄｅ ｓｙｍｐｏｒｔｅｒ）が挙げられる。一部の場合において、治療用分子は治療用抗体であることができる。治療用抗体は、ＧＩＴＲを標的化するアゴニスト抗体であってもよい。ＧＩＴＲを通じたシグナル伝達は、Ｔ細胞増殖およびエフェクター機能を増強し、活性化誘導性細胞死からＴ細胞を保護し、次いでそれはメモリーＴ細胞の頻度を増加させる。ＧＩＴＲアゴニストを本発明のＰＤ－Ｌ１結合化合物と組み合わせることは強い相乗作用を実証し得る。
本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合化合物が１つまたは複数の検出可能なポリペプチドも含む場合、検出可能なポリペプチドは任意の適切な検出可能なポリペプチドであることができる。一部の場合において、検出可能なポリペプチドは、１つまたは複数の本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合化合物の位置を決定するために（例えば、臨床医により）検出されることができる。一部の場合において、検出可能なポリペプチドは、１つまたは複数の本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物の持続をモニターするために（例えば、臨床医により）検出されることができる。本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合化合物中に含まれることができる検出可能なポリペプチドの例は、蛍光ポリペプチド（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼポリペプチド、ペプチド標識、およびナトリウム・ヨード共輸送体（ｓｏｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ ｓｙｍｐｏｒｔｅｒ）から選択される。
本書はまた、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物（例えば、２つもしくはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、または１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む２つもしくはそれより多くのアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲート、または１つもしくは２つもしくはそれより多くのウイルスコートポリペプチドが、１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む１つもしくは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されている、ウイルス粒子、または１つもしくは複数のウイルスコートポリペプチドが、２つもしくはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドを含む１つもしくは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されている、ウイルス粒子）を生成するために使用することができる本明細書に記載のアミノ酸鎖（例えば、スキャフォールドポリペプチドに融合した１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖、またはウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドに融合した１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖）をコードすることができる核酸（例えば、核酸ベクター）を提供する。一部の場合において、核酸は、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む２つまたはそれより多くのアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲートを生成するために使用することができるアミノ酸鎖をコードすることができる。例えば、核酸は、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびスキャフォールドポリペプチドを含むアミノ鎖をコードすることができる。一部の場合において、核酸は、１つまたは複数のウイルスコートポリペプチドが、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む１つまたは複数のアミノ酸鎖を含む、ウイルス粒子を生成するために使用することができるアミノ酸鎖をコードすることができる。例えば、核酸は、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドおよびウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドを含むアミノ鎖をコードすることができる。
本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができる本明細書に記載のアミノ酸鎖（例えば、スキャフォールドポリペプチドに融合した１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖、またはウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドに融合した１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖）をコードする核酸（例えば、核酸ベクター）は、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ構築物）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、またはこれらの組み合わせから選択される核酸であることができる。一部の場合において、本明細書に記載のアミノ酸鎖をコードする核酸はベクター（例えば、発現ベクターまたはウイルスベクター）であることができる。ベクターはＲＣベクター（例えば、ＨＤベクターおよびＳＣベクター）であることができ、またはベクターはＲＤベクターであることができる。ベクターがウイルスベクターである場合、ウイルスベクターは任意の適切な種類のウイルスに由来することができる。一部の場合において、ウイルスベクターは腫瘍溶解性ウイルスに由来することができる。ウイルスベクターが由来することができるウイルスの例としては、非限定的に、Ａｄ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、エンテロウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、麻疹ウイルス、およびヘルペスウイルスが挙げられる。
一部の場合において、本明細書に記載のアミノ酸鎖をコードする核酸はまた、（例えば、アミノ酸鎖の発現を調節するための）１つまたは複数の調節エレメントを含むことができる。本明細書に記載のアミノ酸鎖をコードする核酸中に含まれることができる調節エレメントの例としては、非限定的に、プロモーター（例えば、構成的プロモーター、組織／細胞特異的プロモーター、および誘導性プロモーター、例えば化学的に活性化されるプロモーターおよび光活性化プロモーター）、エンハンサー、その発現がアポトーシス、ネクローシス、および細胞死の他の形態を誘導することができる核酸配列（例えば、自殺遺伝子）が挙げられる。
一部の場合において、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物（例えば、２つもしくはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、または１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む２つもしくはそれより多くのアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲート、または２つもしくはそれより多くのウイルスコートポリペプチドが、１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む１つもしくは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されている、ウイルス粒子、または１つもしくは複数のウイルスコートポリペプチドが、２つもしくはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドを含む１つもしくは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されている、ウイルス粒子）を生成するために使用することができる本明細書に記載のアミノ酸鎖（例えば、スキャフォールドポリペプチドに融合した１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖、またはウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドに融合した１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖）をコードする核酸（例えば、核酸ベクター）は、２つまたはそれより多く（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多く）の本明細書に記載のアミノ酸鎖を生成することができる。
一部の場合において、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物（例えば、２つもしくはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、または１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む２つもしくはそれより多くのアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲート、または２つもしくはそれより多くのウイルスコートポリペプチドが、１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む１つもしくは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されている、ウイルス粒子、または１つもしくは複数のウイルスコートポリペプチドが、２つもしくはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドを含む１つもしくは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されている、ウイルス粒子）を生成するために使用することができる本明細書に記載のアミノ酸鎖（例えば、スキャフォールドポリペプチドに融合した１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖、またはウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドに融合した１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖）をコードする核酸（例えば、核酸ベクター）は、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多く）の本明細書に記載のアミノ酸鎖を連続的に生成することができる。
一部の場合において、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物（例えば、２つもしくはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、または１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む２つもしくはそれより多くのアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲート、または２つもしくはそれより多くのウイルスコートポリペプチドが、１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む１つもしくは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されている、ウイルス粒子、または１つもしくは複数のウイルスコートポリペプチドが、２つもしくはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドを含む１つもしくは複数のアミノ酸鎖を含むように改変されている、ウイルス粒子）を生成するために使用することができる本明細書に記載のアミノ酸鎖（例えば、スキャフォールドポリペプチドに融合した１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖、またはウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドに融合した１つもしくは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含むアミノ酸鎖）をコードする核酸（例えば、核酸ベクター）は、核酸の持続の継続期間にわたり（例えば、核酸が分解されるまで）１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多く）の本明細書に記載のアミノ酸鎖を生成することができる。
一部の場合において、本明細書に記載の核酸によりコードされるアミノ酸鎖は、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができる。例えば、スキャフォールドポリペプチドに融合した１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む２つまたはそれより多くのアミノ酸鎖は、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む２つまたはそれより多くのアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲートにアセンブル（例えば、自己アセンブル）して、本明細書に記載のポリペプチドコンジュゲートを生成することができる。スキャフォールドポリペプチドに融合した１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む２つまたはそれより多くのアミノ酸鎖が、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む２つまたはそれより多くのアミノ酸鎖を含むポリペプチドコンジュゲートにアセンブルしてポリペプチドコンジュゲートを生成する場合、アミノ酸鎖はｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでアセンブルすることができる。例えば、ウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドに融合した１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む１つまたは複数のアミノ酸鎖は、ウイルス粒子の表面上に存在する２つまたはそれより多くのウイルスコートポリペプチドに結合してコートし、本明細書に記載のコートされたウイルス粒子を生成することができる。ウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドに融合した１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む１つまたは複数のアミノ酸鎖がウイルス粒子をコートして、コートされたウイルス粒子を生成する場合、ウイルス粒子はｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでコートされることができる。
一部の場合において、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は精製されることができる。「精製された」ポリペプチド、タンパク質または核酸は、成分の混合物中で主成分、例えば、３０％もしくはより高い、４０％もしくはより高い、５０％もしくはより高い、６０％もしくはより高い、７０％もしくはより高い、８０％もしくはより高い、９０％もしくはより高い、９５％もしくはより高い、または９９％もしくはより高い重量を構成する、ポリペプチドまたは核酸を指す。例えば、精製された多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、１つまたは複数の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を含有する組成物の約３０％またはより高い重量を構成することができる。ポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーおよび免疫吸着アフィニティーカラムが挙げられるがこれらに限定されない方法により精製されてもよい。例えば、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができるアミノ酸鎖をコードする精製された核酸は、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができる１つまたは複数のアミノ酸鎖を含有する組成物の約３０％またはより高い重量を構成することができる。核酸は、フェノール－クロロホルム抽出およびカラム精製（例えば、ミニカラム精製）が挙げられるがこれらに限定されない方法により精製されてもよい。
代替的に、本発明はまた、ＰＤ－１に結合することができる２つまたはそれより多くのアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）を含む多価ＰＤ－１結合化合物、ならびに、ＰＤ－１に結合することができる２つまたはそれより多くのアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）を含む多価ＰＤ－１結合化合物の作製および使用方法を提供する。一部の場合において、多価ＰＤ－１結合化合物は、ＰＤ－１に結合することができる２つまたはそれより多くのアミノ酸セグメント（例えば、ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片）を含むことができる。例えば、２つまたはそれより多くのＰＤ－Ｌ１ポリペプチド（および／またはＰＤ－１に結合する能力を有するそれらの断片）を含む多価ＰＤ－１結合化合物は、２つまたはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドに結合することができる。一部の場合において、多価ＰＤ－１結合化合物は、ＰＤ－１に結合することができる２つまたはそれより多くのアミノ酸セグメントを含む単一のアミノ酸鎖を含むことができる。
ここでは、癌を治療する、例えば、１つまたは複数の本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を含有する組成物を投与するための方法および材料もまた提供される。１つまたは複数の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、治療ポリペプチドと組み合わせて対象に投与されてもよい。１つの実施態様において、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、癌を治療するために対象に投与される治療ポリペプチドを含む。別の実施態様において、多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、癌を治療するために対象に治療ポリペプチドを発現するＡｄと併用投与される。
本発明は、２つまたはそれより多くのウイルスコートポリペプチドが、１つまたは複数のＰＤ－１ポリペプチドを含む１つまたは複数のアミノ酸鎖を含む、ウイルス粒子を包含する。ウイルス粒子は、ウイルス粒子のカプシドタンパク質中に、ＰＤ－１融合タンパク質を含めて、ＰＤ－１ポリペプチドを含む組換えウイルス粒子であってもよい。ウイルス粒子は、ＰＤ－１ポリペプチド、例えば、ＰＤ－１融合タンパク質でコートされたウイルス粒子であってもよい。
１つの実施態様において、ＰＤ－Ｌ１結合化合物が組換えウイルスを含む場合、ウイルスは組換えＡｄ、例えば、Ａｄ株Ａｄ６５７またはＡｄ株Ａｄ６／５７／６、およびこれらのバリアントである。組換えＡｄは、制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）となるように改変されてもよい。そのような組換えＡｄは、米国特許出願第１６／６９０，７３３号（特許文献１）に記載されており、その開示は、本明細書に全体が記載されたかのように参照により全体が本明細書に組み込まれる。
１つの実施態様において、本発明は、１つもしくは２つもしくはそれより多くのＰＤ－１ポリペプチドをそれぞれが含む１つもしくは複数のアミノ酸鎖、または多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができるアミノ酸鎖をコードする核酸を含む、組換えの制限増殖型Ａｄウイルス粒子を包含する。
一部の場合において、本明細書に記載の組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば組換えＡｄ６５７）は、１つまたは複数の核酸欠失を含有するＡｄゲノムを含むことができる。核酸欠失は完全欠失（例えば、ポリペプチドをコードする核酸の欠失）または部分欠失（例えば、ポリペプチドをコードする核酸内の１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失）であることができる。核酸欠失は、欠失された核酸によりコードされるポリペプチドの転写および翻訳を低減させまたは排除することができる。一部の場合において、感染性子孫の生成と関連付けられるポリペプチドをコードする核酸は欠失されることができる。本明細書に記載の組換えＡｄ中で欠失および／または改変されることができる核酸の例は、Ｅ１（例えば、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、ｐＩＩＩＡ、ファイバー、Ｅ１Ｂをコードしてもよく、ウイルスエンハンサーおよびプロモーターを含んでもよい。例えば、本明細書に記載の組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば組換えＡｄ６５７）は、Ｅ１ポリペプチドをコードする核酸内の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含有するＡｄゲノムを含むことができる。一部の場合において、本明細書に記載の組換えＡｄは、Ｅ１ポリペプチドをコードする核酸中の１つまたは複数の置換を含むことができる。
特定の実施態様において、本明細書に記載の組換えＡｄは、例えば、配列番号４１の核酸を含む、プロバシンプロモーターを含むように改変されており、Ｅ１ポリペプチドをコードする核酸中のｄｌ１１０１欠失を含むように改変されており、本明細書に記載の組換えＡｄは、Ｅ１ポリペプチドをコードする核酸中のｄｌ１１０７欠失を含むように改変されており、本明細書に記載の組換えＡｄは、ｄｌ１１０１欠失およびｄｌ１１０７欠失を含むように改変されている。Ｅ１ａに対するｄｌ１１０１改変はｐ３００への結合を予防し、ウイルスをインターフェロン（ＩＮＦ）抑制に対して感受性にする。Ｅ１ａにおけるｄｌ１１０７突然変異は、ｐＲＢへのその結合を予防して、インタクトなｐＲＢ経路を有する細胞においてウイルス複製を遮断する。Ｅ１Ａポリペプチド、例えば、野生型Ａｄ Ｅ１Ａ、ならびにＣＲＡｄ－６５７－ｄｌ１１０１、ＣＲＡｄ－６５７－ｄｌ１１０７およびＣＲＡｄ－６５７－ｄｌ１１０１／１１０７バリアントのＮ末端アミノ酸配列について図１０を参照。
ウイルスを制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）に変換するためのＥ１タンパク質中の突然変異を伴うＡｄ６、Ａｄ６５７およびこれらのバリアントにおける突然変異の図式は図９および図１０に示される。これらは、それぞれｐ３００およびｐＲＢへの結合を遮断するｄｌ１１０１および／またはｄｌ１１０７を含む。
図１０は、野生型Ａｄ、ならびに、ＡｄバリアントＥ１Ａ ｄｌ１１０１、Ｅ１Ａ ｄｌ１１０７およびＥ１Ａ ｄｌ１１０１／１１０７におけるＥ１ＡのＮ末端アミノ酸配列を示す。
ＣＲＡｄ、Ａｄ－ＰＢを生成するための前立腺特異的プロモータープロバシン－Ｅ１ ＤＮＡ配列（配列番号４１）でのＡｄ Ｅ１プロモーターの置き換えもまた示される（図９）。プロバシンプロモーターはアンドロゲン依存性であるため、ＬＮＣａＰのようなアンドロゲン感受性腫瘍において機能するが、ＤＵ１４５のようなアンドロゲン耐性腫瘍においては機能しない。
本発明の複製能を有するＡｄならびにＣＲＡｄは、１つまたは複数の治療ポリペプチドを発現させるために当業者に公知の方法により遺伝子改変される。治療ポリペプチドは、免疫刺激性ポリペプチド、例えば、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０、ＧＭ－ＣＳＦ、およびこれらの組み合わせであってもよい。
さらに、１つの実施態様において、本発明の複製能を有するＡｄならびにＣＲＡｄは、ＰＤ－１ポリペプチドおよび１つまたは複数の治療ポリペプチドの両方を融合タンパク質として発現させるために当業者に公知の方法により遺伝子改変される。
本発明の複製能を有するＡｄならびにＣＲＡｄは、改変されたファイバー／ノブカプシドタンパク質を含むために当業者に公知の方法により遺伝子改変されてもよい。Ａｄファイバータンパク質は、初期付着ステップを媒介する３つの見かけ上同一のサブユニットの複合体である。ネイティブなＡｄ６ファイバータンパク質（配列番号３５）はＣＡＲに結合する。
本発明のさらなる態様において、異なるファイバータンパク質または親Ａｄにとってネイティブでないファイバー／ノブタンパク質中の改変を有するファイバー改変組換えＡｄを生成した。異なるＡｄ株からのカプシドタンパク質および異種ファイバー／ノブタンパク質を含む、ＣＲＡｄを含めて、組換えＡｄ、例えば、異種Ａｄ３５ファイバーポリペプチドまたはチンパンジーＣ６８ファイバーポリペプチド、＋／－Ｋ７ペプチドを含む組換えＡｄを生成した。
キメラＡｄであるＡｄＦ３５ファイバーキメラは配列番号３６のアミノ酸配列を有し、Ａｄ５およびＡｄ６ファイバータンパク質よりも短く、ウイルスをＣＤ４６に再標的化する。
配列番号３７の配列を有するＫ７ファイバーを含むファイバー改変組換えＡｄは、ウイルスを細胞上のヘパリン硫酸プロテオグリカンおよび負電荷に標的化する。
配列番号３８の配列を含む組換えキメラＡｄである６／ＦＣ６８ファイバーは、チンパンジーアデノウイルスＣ６８からのファイバータンパク質を有するキメラＡｄである。ファイバータンパク質はＡｄ５またはＡｄ６ファイバータンパク質よりも短く、ＣＡＲに結合する。
配列番号３９の配列を含む組換えキメラＡｄである６／ＦＣ６８－Ｋ７ファイバーは、チンパンジーアデノウイルスＣ６８からのファイバータンパク質を有するキメラＡｄである。ファイバータンパク質はＡｄ５またはＡｄ６ファイバータンパク質よりも短い。６／ＦＣ６８－Ｋ７ファイバーはＣＡＲに結合し、ヘパリン硫酸および負電荷に再標的化される。
配列番号４０の配列を含む組換えキメラＡｄである６／ＦＣ６８－ＨＩ－Ｋ７ファイバーは、チンパンジーアデノウイルスＣ６８からのファイバータンパク質を有するキメラＡｄである。ファイバータンパク質はＡｄ５またはＡｄ６ファイバータンパク質よりも短い。６／ＦＣ６８－ＨＩ－Ｋ７ファイバーはＣＡＲに結合し、ヘパリン硫酸および負電荷に再標的化される。
一部の場合において、本明細書に記載の組換えＡｄ（例えば、腫瘍溶解性抗癌活性を有する組換えＡｄ、例えば組換えＡｄ６５７）は、１つまたは複数の核酸挿入を含有するＡｄゲノムを含むことができる。例えば、核酸挿入は、ポリペプチド、例えば治療ポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。核酸は、本明細書に記載の組換えＡｄのゲノム内の任意の適切な位置に挿入されることができる。一部の場合において、ポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に記載の組換えＡｄのゲノムのＨＶＲ（例えば、ＨＶＲ ５ループ）に挿入されることができる。例えば、ポリペプチドをコードする核酸が本明細書に記載の組換えＡｄのゲノムのＨＶＲに挿入される場合、ポリペプチドをコードする核酸は１つまたは複数のポリペプチドを発現することができ、かつ発現されたポリペプチド（複数可）は組換えＡｄのカプシドに組み込まれることができる。ポリペプチドをコードする核酸が本明細書に記載の組換えＡｄのゲノムのＨＶＲ領域に挿入される場合、組換えＡｄは、挿入された核酸によりコードされる約１～約７２０個のポリペプチドをその表面上に提示することができる。核酸挿入は、任意の適切なポリペプチドをコードする核酸であることができる。一部の場合において、核酸挿入は、治療ポリペプチド、ポリペプチド抗原またはサイトカインをコードすることができる。
一般に、Ａｄは、本明細書に記載のＣＲＡｄ改変を含むように改変されてもよい。
１つの実施態様において、組換えＡｄは、ｐ３００への結合を予防し、ウイルスをＩＦＮ抑制に対して感受性にする、Ｅ１ａに対するｄｌ１１０１改変、およびｐＲＢへのその結合を予防して、インタクトなｐＲＢ経路を有する細胞においてウイルス複製を遮断する、Ｅ１ａにおけるｄｌ１１０７突然変異、およびＥ３Ａ欠失を有する制限増殖型Ａｄである。前記ＣＲＡｄは、ヒト免疫グロブリンに融合したヒトＰＤ－１を発現する。
１つの実施態様において、組換えＡｄ（例えば Ａｄ６５７）は、ｐ３００への結合を予防し、ウイルスをＩＦＮ抑制に対して感受性にする、Ｅ１ａに対するｄｌ１１０１改変、およびＥ３Ａ欠失を有する制限増殖型Ａｄである。前記ＣＲＡｄは、ヒト第Ｘ因子（ＧＬＡ）に融合したヒトＰＤ－１をウイルス粒子の表面上に発現し、該ＣＲＡｄは、細胞の表面上にＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に再標的化される。
１つの実施態様において、組換えＡｄは、ｐ３００への結合を予防し、ウイルスをＩＦＮ抑制に対して感受性にする、Ｅ１ａに対するｄｌ１１０１改変、およびｐＲＢへのその結合を予防して、インタクトなｐＲＢ経路を有する細胞においてウイルス複製を遮断する、Ｅ１ａにおけるｄｌ１１０７突然変異、およびＥ３Ａ欠失を有する制限増殖型Ａｄ（例えばＡｄ６５７）である。前記ＣＲＡｄは、ヒト第Ｘ因子（ＧＬＡ）に融合したヒトＰＤ－１をウイルス粒子の表面上に発現し、該ＣＲＡｄは、細胞表面上にＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に再標的化される。
ウイルス粒子の表面に結合したＰＤ－１ポリペプチドを有するウイルス粒子は、癌（例えば、１つまたは複数のＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞を含む癌）を有する哺乳動物を治療するために使用することができる。ウイルス粒子は、癌の治療のために有効な量で対象に投与されてもよく、任意選択的に、免疫療法および化学療法剤を含めて、癌療法と組み合わせて投与されてもよい。
本発明の一態様において、１つまたは複数の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物または本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができるアミノ酸鎖をコードする核酸、および任意選択的に、１つまたは複数の癌療法を含有する組成物は、癌を有する哺乳動物を治療するために該哺乳動物に投与されることができる。本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物は、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞上のＰＤ－Ｌ１に結合することができる。ＰＤ－１ポリペプチドの結合は、ＰＤ－Ｌ１機能を中和することができ、かつそれにより、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞（例えば、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞）が免疫系を回避することを予防することができかつ／または抗癌剤（例えば、癌免疫療法）がＰＤ－Ｌ１陽性細胞をより有効に標的化することを可能とすることができる。本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物をコードする核酸が、本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物をコードする腫瘍溶解性Ａｄベクターである場合、腫瘍溶解性Ａｄは細胞に感染することができ、かつ感染細胞に方向付けられたＴ細胞応答を駆動することができる。腫瘍溶解性Ａｄは任意の適切な種類の細胞に感染することができる。一部の場合において、腫瘍溶解性ＡｄはＰＤ－Ｌ１陽性細胞（例えば、ＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞）に感染することができる。一部の場合において、腫瘍溶解性Ａｄは非分裂細胞（例えば、腎臓細胞）に感染することができる。
一部の場合において、１つまたは複数の本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合化合物を含むまたはから本質的になる組成物は、癌（例えば、１つまたは複数のＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞を含む癌）を有する哺乳動物を治療するために使用することができる。例えば、１つまたは複数の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物、および任意選択的に、１つまたは複数の癌治療法を含有する組成物は、癌を有する哺乳動物を治療するために該哺乳動物に投与されることができる。
代替的に、本明細書に記載の方法および材料は、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞と関連付けられる他の疾患または障害を治療するために使用することができる。一部の場合において、１つまたは複数の本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合化合物を含有する組成物は、感染性疾患（例えば、１つまたは複数のＰＤ－Ｌ１陽性マクロファージ、例えば癌浸潤性マクロファージを含む感染性疾患）を有する哺乳動物を治療するために使用することができる。１つまたは複数のＰＤ－Ｌ１陽性細胞を含み得る感染性疾患の例としては、非限定的に、ＨＩＶ、肝炎、およびマラリアが挙げられる。一部の場合において、１つまたは複数の本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合化合物を含有する組成物は、自己免疫疾患（例えば、１つまたは複数のＰＤ－Ｌ１陽性マクロファージ、例えば癌浸潤性マクロファージを含む自己免疫疾患）を有する哺乳動物を治療するために使用することができる。
癌を有する任意の適切な哺乳動物は、本明細書に記載されるように治療されることができる。例えば、癌を有するヒトおよび他の霊長類、例えばサルは、１つまたは複数の本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合化合物を含有する組成物を用いて治療されることができ、かつ任意選択的に、癌の重症度を低減させるため、癌の症状を低減させるため、および／または哺乳動物内、ヒトまたは他の霊長類内に存在する癌細胞の数を低減させるために１つまたは複数の癌治療と組み合わせて治療されることができる。一部の場合において、癌を有するイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、およびラットは、１つもしくは複数の本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物、ＰＤ－Ｌ１結合化合物を含むウイルス、または本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができるアミノ酸鎖をコードする核酸を含有する組成物を用いて治療されることができ、かつ任意選択的に、本明細書に記載されるような１つまたは複数の癌治療を用いて治療されることができる。
癌を有する哺乳動物（例えば、ヒト）を本明細書に記載されるように治療する場合、癌は任意の適切な癌であることができる。癌は１つまたは複数のＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞を含むことができる。癌は１つまたは複数の固形腫瘍を含むことができる。癌は血液癌であることができる。本明細書に記載されるように治療されることができる癌の例としては、非限定的に、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、卵巣癌、黒色腫、脳腫瘍、肉腫、前立腺癌、膵臓癌、頭頸部癌、肝臓癌、網膜芽腫、リンパ腫、および白血病が挙げられる。
一部の場合において、哺乳動物は、癌（例えば、１つまたは複数のＰＤ－Ｌ１陽性癌細胞を含む癌）を有するとして同定され得る。癌を有する哺乳動物を同定するために任意の適切な方法を使用することができる。例えば、癌を有する哺乳動物（例えば、ヒト）を同定するためにイメージング技術および生検技術を使用することができる。
癌を有すると同定されると、哺乳動物は、１つまたは複数の本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合化合物を含有する組成物を投与されることができ、任意選択的に、１つまたは複数の癌治療法および／または癌治療を用いて治療されることができる。１つまたは複数の癌治療法は任意の適切な癌治療を含むことができる。一部の場合において、癌治療は手術を含むことができる。一部の場合において、癌治療は放射線療法を含むことができる。一部の場合において、癌治療は、薬物療法、例えば化学療法、ホルモン療法、標的化療法、および／または細胞傷害性療法の投与を含むことができる。癌治療の例としては、非限定的に、１つまたは複数の受容体チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、エルロチニブ）の投与、１つまたは複数のＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤（例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、セミプリマブ、およびデュルバルマブ）の投与、１つまたは複数の免疫療法、例えばＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１を標的化することができる免疫療法（例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、セミプリマブ、デュルバルマブ、アレムツズマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、およびリツキシマブ）の投与、ＧＩＴＲを標的化する１つまたは複数の抗体の投与、１つまたは複数の白金化合物（例えば、シスプラチンまたはカルボプラチン）の投与、１つまたは複数のタキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、またはアルブミン結合パクリタキセル、例えばｎａｂ－パクリタキセル）の投与、アルトレタミンの投与、カペシタビンの投与、シクロホスファミドの投与、エトポシド（ｖｐ－１６）の投与、ゲムシタビンの投与、イホスファミドの投与、イリノテカン（ｃｐｔ－１１）の投与、リポソームドキソルビシンの投与、メルファランの投与、ペメトレキセドの投与、トポテカンの投与、ビノレルビンの投与、１つまたは複数の黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト（例えばゴセレリンおよびロイプロリド）の投与、１つまたは複数の抗エストロゲン療法（例えばタモキシフェン）の投与、１つまたは複数のアロマターゼ阻害剤（例えばレトロゾール、アナストロゾール、およびエキセメスタン）の投与、１つまたは複数の血管新生阻害剤（例えばベバシズマブ）の投与、１つまたは複数のポリ（ＡＤＰ）－リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤（例えばオラパリブ、ルカパリブ、およびニラパリブ）の投与、外部ビーム放射線療法の投与、小線源療法の投与、放射性リンの投与、ならびにこれらの任意の組み合わせの投与が挙げられる。癌を有する哺乳動物が、１つまたは複数の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物または本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができるアミノ酸鎖をコードする核酸を含有する組成物を用いて治療され、かつ１つまたは複数の癌治療を用いて治療される場合、１つまたは複数の癌治療を含有する組成物は同時にまたは独立して投与されることができる。例えば、１つもしくは複数の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物または本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができるアミノ酸鎖をコードする核酸を含有する組成物が１番目に投与され、かつ１つまたは複数の癌治療が２番目に投与される、またはその逆であることができる。
一部の場合において、１つまたは複数の本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合化合物を含む組成物は、癌を有する哺乳動物への投与のための薬学的に許容可能な組成物に製剤化されることができる。例えば、治療有効量の１つまたは複数の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物または本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができるアミノ酸鎖をコードする核酸は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体（添加剤）および／または希釈剤と共に製剤化されることができる。医薬組成物は、治療ポリペプチドおよび／または治療ポリペプチドを発現するように遺伝子改変された組換えウイルスをさらに含んでもよい。多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物、および任意選択的に治療ポリペプチドを含む、またはから本質的になる医薬組成物は、固体または液体形態での投与のために製剤化されることができ、該形態としては、非限定的に、無菌溶液、懸濁液、持続放出製剤、錠剤、カプセル、丸剤、粉末、ナノ粒子、および顆粒が挙げられる。本明細書に記載の医薬組成物において使用されてもよい薬学的に許容可能な担体、充填剤、およびビヒクルとしては、非限定的に、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベース物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
本明細書に記載されるような１つまたは複数の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物、および任意選択的に治療ポリペプチドを含むまたはから本質的になる医薬組成物は、経口または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、腫瘍内、および皮内を含む）投与のために製剤化される。
経口的に投与される場合、１つまたは複数のＰＤ－Ｌ１結合化合物または本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができるアミノ酸鎖をコードする核酸を含む医薬組成物は、丸剤、錠剤、またはカプセルの形態であることができる。
非経口投与のために好適な組成物としては、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および意図されるレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有することができる水性および非水性無菌注射溶液；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含んでもよい水性および非水性無菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位用量または複数用量容器、例えば、密閉されたアンプルおよびバイアル中に提示されることができ、使用直前に無菌液体担体、例えば注射用水の追加のみを要求するフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵されてもよい。即席注射溶液および懸濁液が無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製されてもよい。そのような注射溶液は、例えば、無菌注射用水性または油性懸濁液の形態であることができる。この懸濁液は、例えば、好適な分散または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０など）および懸濁化剤を使用して製剤化されてもよい。無菌注射用調製物は、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液としての、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液または懸濁液であることができる。使用することができる許容可能なビヒクルおよび溶媒の例としては、非限定的に、マンニトール、水、リンゲル溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。追加的に、溶媒または懸濁媒体として無菌固定油を使用することができる。一部の場合において、無菌性の（ｂｌａｎｄ）固定油、例えば合成モノ－またはジ－グリセリドを使用することができる。脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体を注射剤の調製において使用することができ、それらのポリオキシエチル化バージョンのものを含めて、天然の薬学的に許容可能な油、例えばオリーブ油またはヒマシ油も使用が可能である。一部の場合において、これらの油溶液または懸濁液は長鎖アルコール希釈剤または分散剤を含有することができる。
本明細書に開示される特有の実施態様は、「からなる」または「から本質的になる」の言い回しを使用して請求項においてさらに限定されることがある。請求項において使用される場合、出願時のものであれ、補正で追加されたものであれ、「からなる」という移行句は、請求項中で指定されないあらゆる要素、ステップ、または成分を除外する。「から本質的になる」という移行句は、指定された材料またはステップおよび基本的かつ新規の特徴に実質的に影響しないものに請求項の範囲を限定する。
一部の場合において、１つまたは複数の本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合化合物を含む薬学的に許容可能な組成物は局所的または全身的に投与されることができる。例えば、細胞内ＰＤ－Ｌ１ドメインの機能を阻害する化合物を含有する組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）中の癌（例えば、腫瘍）の中またはその近くに注射により局所的に投与されることができる。例えば、細胞内ＰＤ－Ｌ１ドメインの機能を阻害する化合物を含有する組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）に経口投与により全身的にまたは注射（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、腫瘍内、および皮内注射）により投与されることができる。
有効な用量は、癌の重症度、投与の経路、対象の年齢および全般的健康状態、賦形剤の使用、他の治療的処置との併用、例えば他の剤の使用の可能性、ならびに治療医の判断に依存して変動することができる。
１つまたは複数の本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合化合物を含有する組成物の有効量は、哺乳動物に対する有意な毒性を生成することなく癌の重症度を低減させ、癌の症状を低減させ、かつ／または哺乳動物内に存在する癌細胞の数を低減させることができる任意の量であることができる。有効量は、一定のままであることができ、または治療に対する哺乳動物の応答に依存して変動スケールまたは可変用量として調整されることができる。様々な要因が、特定の適用のために使用される実際の有効量に影響を及ぼし得る。例えば、投与の頻度、治療の継続期間、複数の治療剤の使用、投与の経路、および状態（例えば、癌）の重症度は、投与される実際の有効量における増加または減少を要求することがある。
投与の頻度は、哺乳動物に対する有意な毒性を生成することなく１つまたは複数の癌治療（例えば、１つまたは複数の癌免疫療法）に対して哺乳動物中の癌細胞を感作する任意の頻度であることができる。例えば、投与の頻度は、おおよそ週に１回～おおよそ日に３回、またはおおよそ月に２回～おおよそ日に６回、またはおおよそ週に２回～おおよそ日に１回であることができる。投与の頻度は一定のままであることができ、または治療の継続期間の間に可変であることができる。１つまたは複数の本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合化合物を含有する組成物を用いる治療の過程は休息期間を含むことができる。例えば、１つまたは複数の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物または本明細書に記載の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物を生成するために使用することができるアミノ酸鎖をコードする核酸を含有する組成物は、２週の期間にかけて毎日投与され、続いて２週の休息期間とすることができ、そのようなレジメンを複数回繰り返すことができる。有効量と同様に、様々な要因が、特定の適用のために使用される投与の実際の頻度に影響を及ぼし得る。例えば、有効量、治療の継続期間、複数の治療剤の使用、投与の経路、および状態（例えば、癌）の重症度は、投与頻度における増加または減少を要求することがある。
１つまたは複数の本明細書に記載のＰＤ－Ｌ１結合化合物を含有する組成物を投与するための有効な継続期間は、哺乳動物に対する有意な毒性を生成することなく癌の重症度を低減させ、癌の症状を低減させ、かつ／または哺乳動物内に存在する癌細胞の数を低減させることができる任意の継続期間であることができる。そのため、有効な継続期間は、数日から数週、月または年までで変動することができる。一般に、癌の治療のための有効な継続期間は、６か月～１年の継続期間の範囲内であることができる。複数の要因が、特定の治療のために使用される実際の有効な継続期間に影響を及ぼし得る。例えば、有効な継続期間は、投与の頻度、有効量、複数の治療剤の使用、投与の経路、および治療されている状態の重症度と共に変動し得る。
ある特定の事例において、治療の過程および治療されている状態（例えば、癌）に関する１つまたは複数の症状の重症度をモニターすることができる。任意の適切な方法を使用して、１つまたは複数の癌治療（例えば、１つまたは複数の癌免疫療法）に対する哺乳動物中の癌細胞の感受性が増加しているか否かを決定することができる。例えば、（例えば、腫瘍のサイズおよび／または数に基づく）癌の応答性は、異なる時点にオフィスイメージング技術を使用して評価されることができる。
本発明は以下の例においてさらに記載され、これらの例は請求項に記載の発明の範囲を限定しない。
例
例１
組換えアデノウイルスの構築：細胞標的化／脱標的化ペプチドまたは新規のアミノ酸の挿入を伴う異なるＡｄ血清型からの個々のＨＶＲの挿入。
当業者に公知の方法を利用する組換えＤＮＡ技術により組換えアデノウイルスを構築した。組換えＡｄ（Ａｄ６５７）は、第１のＡｄ株Ａｄ６に由来し（例えば、第１のＡｄ株のゲノムを含むことができる）、第２のＡｄ株であるＡｄ５７からのカプシドヘキソンＨＶＲを含んでもよい。図８を参照。これらの実施態様は一般に、異なるＡｄからの異なるカプシドヘキソンＨＶＲを組み合わせる（すなわち、シャッフリングＨＶＲ）Ａｄの文脈において適用された。図７は、ヘキソン領域中のバリエーションを示すＡｄ５、Ａｄ６、およびＡｄ５７のアライメントを示す。例えば、Ａｄ株Ａｄ５７のＨＶＲ２～７を伴うＡｄ株Ａｄ６のＨＶＲ１またはＡｄ株Ａｄ５７のＨＶＲ２～６を伴うＡｄ株Ａｄ６のＨＶＲ１および７。さらなる実施態様において、Ａｄ６／５６／６ウイルスは、Ａｄ株Ａｄ６からのＨＶＲ １および７ならびにＡｄ株Ａｄ６５７からのＨＶＲ２～６を有する。
本発明の一態様において、Ａｄ６ ＨＶＲ１およびＡｄ５７ ＨＶＲ２～７を有するキメラＡｄを生成し、Ａｄ６／５７ ＨＶＲキメラと称される該キメラは配列番号２８のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
本発明のさらに別の態様において、Ａｄ６ ＨＶＲ１および７ならびにＡｄ５７ ＨＶＲ２～６を有するキメラＡｄを生成し、Ａｄ６／５７／６ ＨＶＲキメラと称される該キメラは配列番号２９のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
組換えＡｄ株Ａｄ６５７を得るために、Ａｄ５７ ＨＶＲ１～７をコードする核酸を合成し、ｐＶＩおよびヘキソンの間にＦＲＴ－Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）－ＦＲＴカセットを有するプラスミドにおいてＡｄ６ヘキソン中に挿入した。これを様々なｐＡｄ６プラスミド中に組換えてＡｄ６５７およびそのバリアントを生成した。Ａｄ６５７ヘキソンのアミノ酸配列は配列番号３０に記載される。
Ａｄ６５７のバリアントに関して、システイン、柔軟性アミノ酸、および他のペプチドの挿入を可能とするための制限部位を用いて改変されたＨＶＲ１を用いてＡｄ５７ ＨＶＲ配列を合成した。これをｐＶＩおよびヘキソンの間にＦＲＴ－Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）－ＦＲＴカセットを有するプラスミドにおいてＡｄ６ヘキソン中に挿入した。これを様々なｐＡｄ６プラスミドに組換えて、ＨＶＲ１中にシステインを有するＡｄ６５７バリアントを生成し、Ａｄ６５７－ＨＶＲ１－ＸＸＡと称される該バリアントは配列番号４２のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
Ａｄ６５７のバリアントに関して、システイン、柔軟性アミノ酸、および他のペプチドの挿入を可能とするための制限部位を用いて改変されたＨＶＲ５を用いてＡｄ５７ ＨＶＲ配列を合成した。これをｐＶＩおよびヘキソンの間にＦＲＴ－Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）－ＦＲＴカセットを有するプラスミドにおいてＡｄ６ヘキソン中に挿入した。これを様々なｐＡｄ６プラスミドに組換えて、ＨＶＲ５中にシステインを有するＡｄ６５７バリアントを生成し、Ａｄ６５７－ＨＶＲ５－ＸＸＡと称される該バリアントは配列番号４３のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
Ａｄ６５７のバリアントに関して、システイン、柔軟性アミノ酸、および他のペプチドの挿入を可能とするための制限部位を用いて改変されたＨＶＲ１を用いてＡｄ５７ ＨＶＲ配列を合成した。これをｐＶＩおよびヘキソンの間にＦＲＴ－Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）－ＦＲＴカセットを有するプラスミドにおいてＡｄ６ヘキソン中に挿入した。これを様々なｐＡｄ６プラスミドに組換えて、ＨＶＲ１中のシステインを有しないが、ＨＶＲ１へのペプチド挿入を可能とするための制限部位を有するＡｄ６５７バリアントを生成し、Ａｄ６５７－ＨＶＲ１－ＸＡと称される該バリアントは配列番号４４のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
Ａｄ６５７のバリアントに関して、システイン、柔軟性アミノ酸、および他のペプチドの挿入を可能とするための制限部位を用いて改変されたＨＶＲ５を用いてＡｄ５７ ＨＶＲ配列を合成した。これをｐＶＩおよびヘキソンの間にＦＲＴ－Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）－ＦＲＴカセットを有するプラスミドにおいてＡｄ６ヘキソン中に挿入した。これを様々なｐＡｄ６プラスミドに組換えて、ＨＶＲ５中のシステインを有しないが、ＨＶＲ５へのペプチド挿入を可能とするための制限部位を有するＡｄ６５７バリアントを生成し、Ａｄ６５７－ＨＶＲ５－ＸＡと称される該バリアントは配列番号４５のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
Ａｄ６５７のバリアントに関して、ビオチンアクセプターペプチドのＨＶＲ１への挿入によりＡｄ６５７ ＨＶＲ１－ＸＡ配列を改変した。これを様々なｐＡｄ６プラスミドに組換えて、ＨＶＲ１中のＢＡＰのＡｄ６５７バリアントを生成し、Ａｄ６５７－ＨＶＲ１－ＰＳＴＣＤと称される該バリアントは配列番号４６のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
ビオチンアクセプターペプチドの挿入はウイルスバリアントを肝臓から脱標的化し、ウイルスがアビジンまたはストレプトアビジンおよびビオチン化されたリガンドを用いて再標的化されることを可能とし、ウイルスが単量体アビジンまたはストレプトアビジンカラム上で精製されることを可能とする。
Ａｄ６５７のバリアントに関して、ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）のＨＶＲ１への挿入によりＡｄ６５７ ＨＶＲ１－ＸＡ配列を改変した。これを様々なｐＡｄ６プラスミドに組換えて、ＨＶＲ１中にＢＡＰを有するＡｄ６５７バリアントを生成し、Ａｄ６５７－ＨＶＲ５－ＰＳＴＣＤと称される該バリアントは配列番号４７のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
Ａｄ６５７のバリアントに関して、ＨＩＶエンベロープからの合成Ｖ１／Ｖ２ループのＨＶＲ５への挿入によりＡｄ６５７ ＨＶＲ５－ＸＡ配列を改変し、Ａｄ６５７－ＨＶＲ５－Ｖ１／Ｖ２と称される該バリアントは配列番号４８のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
ＨＩＶエンベロープからの合成Ｖ１／Ｖ２ループの挿入は、ワクチンとして役立つためのこの抗原の提示、ならびに、ＨＩＶエンベロープと相互作用するタンパク質への結合による再標的化を可能とする。
Ａｄ６５７のバリアントに関して、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）からの合成ペプチドのＨＶＲ５への挿入によりＡｄ６５７ ＨＶＲ５－ＸＡ配列を改変し、Ａｄ６５７－ＨＶＲ５－ＨＰＶと称される該バリアントは配列番号４９のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
ヒトパピローマウイルスからの合成ペプチドの挿入は、ワクチン目的のため、ならびに、ＨＰＶペプチドと相互作用するタンパク質への結合による再標的化のための抗原としてのＨＰＶペプチドの提示を可能とする。
本発明の別の態様において、Ａｄ６ ＨＶＲ１およびＡｄ５７ ＨＶＲ ２～７を有するキメラＡｄを生成し、Ａｄ６／５７ ＨＶＲキメラと称される該キメラは配列番号５０のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
本発明のさらに別の態様において、Ａｄ６ ＨＶＲ１および７ならびにＡｄ５７ ＨＶＲ ２～６を有するキメラＡｄを生成し、Ａｄ６／５７／６ ＨＶＲキメラと称される該キメラは配列番号５１のアミノ酸配列を有するヘキソンを含む。
図１６～１８のプラスミドマップは、異なるＡｄ血清型からの個々のＨＶＲの挿入と、標的化された化学修飾および遮蔽のための細胞標的化／脱標的化ペプチド、治療ポリペプチド、または新規のアミノ酸、例えばシステインのヘキソンへの挿入との組み合わせを示す。
特定の実施態様において、細胞結合性ペプチドはＨＶＲ １またはＨＶＲ ５に挿入され、この実施態様はＡｄのＨＶＲのいずれかにおいてこれらおよび他のペプチドを挿入する例として役立つ。
例２
システイン修飾ヘキソン改変Ａｄ６５７－ＨＶＲ５Ｃの標的化された化学的連結。
図１３は、異なるＡｄ血清型からの個々のＨＶＲの挿入と、標的化された化学修飾および遮蔽のための新規のアミノ酸、例えばシステインのヘキソンへの挿入との組み合わせを示すＡｄバリアントの描写である。
この例は、Ａｄヘキソンに挿入されたシステインにポリマーおよび他の化学修飾を標的化する能力を実証する（図１５）。標的化されていないＰＥＧはウイルス感染を不活性化する一方、システイン標的化ＰＥＧ化はウイルス機能を保持する。
本発明の一態様において、抗体、タンパク質、細胞の脱標的化、再標的化、および遮蔽のためのポリマーまたは挿入されたペプチド／タンパク質の使用が想定される。図１２および図１４は、例えば、ＰＥＧ化または「ＢＡＰ化」により、修飾され得るＡｄ ＨＶＲの部位を描写する。別の例は、ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）の挿入はこれらのＨＶＲに挿入されて、アビジンもしくはストレプトアビジンおよびビオチン化されたリガンドまたはアビジンもしくはストレプトアビジン融合タンパク質を用いるベクター再標的化を可能とすることを示す。ＢＡＰ挿入はまた、ベクター製造のためにウイルスが単量体アビジンまたはストレプトアビジンカラム上で精製されることを可能とする。同様に、Ａｄ５７－ＨＶＲ１－ＸＸＡおよびＸＡは、マレイミドまたは他のシステイン反応性剤を用いる標的化された化学修飾を可能とするためにこの部位にシステインを挿入する例を示す。
１つの実施態様において、異なるＡｄ血清型および／またはバリアントは、Ａｄ６およびＡｄ６５７バリアントの複数投与（ｍｕｌｔｉ ｄｏｓｉｎｇ）を可能とするためのポリマー遮蔽を含む。Ａｄ６およびＡｄ６５７が、共有結合ポリマー連結と組み合わせて血清型スイッチングによる処理の複数のラウンドのために使用することができる例示的な治療サイクルが示される（図１３）。
ＧＦＰルシフェラーゼを発現するＡｄ６５７－ＨＶＲ１Ｃを細胞から産生させ、ＣｓＣｌ勾配で精製した。５ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてウイルスを共有結合的に修飾した。ウイルスタンパク質上のアミン／リジンとランダムに反応するＮＨＳ－ＰＥＧまたはＸＸＡシャトルプラスミドを使用してＨＶＲ１に挿入されたシステインと特異的に反応するマレイミドＰＥＧのいずれかを用いてウイルスを処理した。これらの修飾されていないまたは修飾されたウイルスを次に、最終のＣｓＣｌスピン、続いて脱塩により精製した。指し示されるウイルスをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＳｙｐｒｏＲｕｂｙを用いて染色し、イメージングにより可視化した（図１４）。タンパク質の見かけ質量（矢印により指し示される）における増加により実証されるように、ＮＨＳ－ＰＥＧ化は多くのウイルスタンパク質をランダムに修飾することをこれは示す。対照的に、ＨＶＲ１中のシステインとの標的化マレイミドＰＥＧ反応はヘキソンのみを修飾し、他のウイルスカプソマータンパク質を損傷しない。ウイルス機能に対するＰＥＧ化の効果を評価する。
例３
制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）。
ウイルスを制限増殖型Ａｄ（ＣＲＡｄ）に変換するためのＥ１タンパク質中の突然変異を伴うＡｄ６、Ａｄ６５７およびこれらのバリアントにおける突然変異の図式を図９、図１０および図１１に示す。これらは、それぞれｐ３００およびｐＲＢへの結合を遮断するｄｌ１１０１および／またはｄｌ１１０７を含む。
図１０は、野生型Ａｄ、ならびに、ＡｄバリアントＥ１Ａ ｄｌ１１０１、Ｅ１Ａ ｄｌ１１０７およびＥ１Ａ ｄｌ１１０１／１１０７におけるＥ１ＡのＮ末端アミノ酸配列を示す。
ＣＲＡｄ、Ａｄ－ＰＢを生成するための前立腺特異的プロモータープロバシンおよび配列番号３１のＥ１ ＤＮＡ配列でのＡｄ Ｅ１プロモーターの置き換えもまた示される（図９）。プロバシンプロモーターはアンドロゲン依存性であるため、ＬＮＣａＰのようなアンドロゲン感受性腫瘍において機能するが、ＤＵ１４５のようなアンドロゲン耐性腫瘍においては機能しない。
１つの実施態様において、Ｅ１に対するｄｌ１１０１改変、およびＥ１ａにおけるｄｌ１１０７突然変異、およびＥ３Ａ欠失を有する制限増殖型Ａｄ６５７ウイルスを構築して、ＰＤ－Ｌ１デコイタンパク質としてのヒト免疫グロブリンに融合したヒトＰＤ－１を発現させる。前記ウイルスはまた、ＣＭＶプロモーターからＧＦＰルシフェラーゼを発現する。そのような制限増殖型Ａｄ６５７ウイルスバリアントはＣｒＡｄ６ｄ１１０１／１１０７ＤＥ３ＡＤＰ－ｈＰＤ－１－Ｉｇ－ＧＬと称される。
例４
再標的化および脱標的化された組換えアデノウイルス。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ａｄは細胞表面受容体とのそのファイバーおよびペントンベースタンパク質（ｐｅｎｔｏｎ ｂａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の組み合わせた相互作用を通じて細胞に結合し、進入する。三量体ファイバーはコクサッキー－アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）に結合し、ＣＡＲを欠いた細胞は、ペントンベース上のＲＧＤモチーフにより結合されることができるαｖインテグリンも発現しない限り、感染に対して比較的抵抗性である。
Ａｄファイバータンパク質は、初期付着ステップを媒介する３つの見かけ上同一のサブユニットの複合体である。ネイティブなＡｄ６ファイバータンパク質は配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含み、ＣＡＲに結合する。
本発明のさらなる態様において、親Ａｄにとってネイティブでない異なるファイバータンパク質を有するファイバー改変組換えＡｄを生成した。異なるＡｄ株からのカプシドタンパク質を含む、ＣＲＡｄを含めて、組換えＡｄ、例えば、異種Ａｄ３５ファイバーポリペプチドまたはチンパンジーＣ６８ファイバーポリペプチド、＋／－Ｋ７ペプチドを含む組換えＡｄを生成した。
キメラＡｄであるＡｄＦ３５ファイバーキメラは配列番号３６のアミノ酸配列を有し、Ａｄ５およびＡｄ６ファイバータンパク質よりも短く、ウイルスをＣＤ４６に再標的化する。
配列番号３７の配列を有するＫ７ファイバーを含むファイバー改変組換えＡｄは、ウイルスを細胞上のヘパリン硫酸プロテオグリカンおよび負電荷に標的化する。
配列番号３８の配列を含む組換えキメラＡｄである６／ＦＣ６８ファイバーは、チンパンジーアデノウイルスＣ６８からのファイバータンパク質を有するキメラＡｄである。ファイバータンパク質はＡｄ５またはＡｄ６ファイバータンパク質よりも短く、ＣＡＲに結合する。
配列番号３９の配列を含む組換えキメラＡｄである６／ＦＣ６８－Ｋ７ファイバーは、チンパンジーアデノウイルスＣ６８からのファイバータンパク質を有するキメラＡｄである。ファイバータンパク質はＡｄ５またはＡｄ６ファイバータンパク質よりも短い。６／ＦＣ６８－Ｋ７ファイバーはＣＡＲに結合し、ヘパリン硫酸および負電荷に再標的化される。
配列番号４０の配列を含む組換えキメラＡｄである６／ＦＣ６８－ＨＩ－Ｋ７ファイバーは、チンパンジーアデノウイルスＣ６８からのファイバータンパク質を有するキメラＡｄである。ファイバータンパク質はＡｄ５またはＡｄ６ファイバータンパク質よりも短い。６／ＦＣ６８－ＨＩ－Ｋ７ファイバーはＣＡＲに結合し、ヘパリン硫酸および負電荷に再標的化される。
血液第Ｘ因子（ＦＸ）はナノモルの親和性で種Ｃアデノウイルスのヘキソンに結合し、結果として、ＩＶ注射後に種Ｃアデノウイルスが肝臓の肝細胞に効率的に形質導入することを可能にする。
ヒトＰＤ－１に融合したヒト第Ｘ因子（ＧＬＡ）を発現する以下のＣＲＡｄウイルスを構築する。野生型および高親和性マウスおよびヒトＰＤ－１ドメインをヒトＦＸ ＧＬＡ－ＥＧＦドメインのＮまたはＣ末端に融合し、それらの発現をＲＳＶまたはＣＭＶのいずれかのプロモーターにより駆動した。一部の場合において、これらの融合タンパク質発現カセットを、指し示されるウイルスのＥ３ドメインに挿入した。他の場合において、それらをウイルスのファイバーおよびＥ４遺伝子の間に挿入した。
制限増殖型Ａｄ６５７は、ｐ３００へのその結合を予防し、ＩＦＮに対して感受性となるためのＥ１ａに対するｄｌ１１０１改変、Ｅ３Ａ欠失、Ｅ３欠失に挿入されたＲＳＶ発現カセットを有する。このウイルスは、ヒトＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１＋細胞へのアデノウイルス再標的化タンパク質に融合したヒト第Ｘ因子（ＧＬＡ）を発現する（すなわち、ＣｒＡｄ６５７ｄ１１０１ＤＥ３ＡＤＰ＊ｈＰＤ１－ＧＬＡ－ＧＬ－Ｌ）。
制限増殖型Ａｄ６５７は、ｐ３００へのその結合を予防し、ウイルスをＩＦＮ抑制に対して感受性にするためのＥ１ａに対するｄｌ１１０１改変、およびｐＲＢへのその結合を予防して、インタクトなｐＲＢ経路を有する細胞においてウイルス複製を遮断するためのＥ１ａにおけるｄｌ１１０７突然変異、欠失されたＥ３を有し、かつＥ３欠失に挿入されたＲＳＶ発現カセットを含む。このウイルスは、ヒトＰＤ－１に融合したヒト第Ｘ因子（ＧＬＡ）を発現する（すなわち、ＣｒＡｄ６５７＊１１０１／１１０７ＤＥ３ＢＳＴＲＳＶｈＰＤ１－ＧＬＡ＊ＩｇＩＺＩ）。ウイルス複製の間に、ＰＤ－１は、細胞から放出された場合にＰＤ－Ｌ１に結合することができる単量体として細胞中で発現される。ＰＤ－１はまた、Ａｄの表面に結合して、ＡｄをＰＤ－Ｌ１発現細胞に再標的化することができる。
Ｅ１ａにおけるｄｌ１１０７突然変異、およびＥ３Ａ欠失、Ｅ３欠失に挿入されたＲＳＶ発現カセットを有する、制限増殖型Ａｄ６／５７／６を構築して、ＰＤ－Ｌ１デコイタンパク質としてヒト免疫グロブリンに融合したヒトＰＤ－１を発現させる（すなわち、ｐＡｄ／５７／６－ｄｌ１１０７－ΔＥ３－ＲＳＶ－ｈＰＤ－１－ＨＡ－Ｉｇ－Ｉ）。図１６を参照。
ｐＡｄ６／５７／６－ｄｌ１１０７－ＤＥ３－ＲＳＶ－ｈＰＤ－１－ＨＡ－Ｉｇ－Ｉを感染させた細胞から融合タンパク質をプロテインＡカラム上で精製した。このタンパク質をＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）からのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ａｓｓａｙにおいて陽性対照抗ＰＤ－１モノクローナル抗体と共に滴定した。高親和性ヒトｈＰＤ－１－ＨＡ－Ｉｇ融合タンパク質はＰＤ－Ｌ１を阻害する。図１９を参照。
例５
異種ポリペプチドと組み合わせたＰＤ－Ｌ１結合化合物の発現用の組換えＡｄの構築。
制限増殖型Ａｄウイルス（ＣＲＡｄ６５７またはＣＲＡｄ ６／５７／６）を改変して、１つまたは複数の異種ポリペプチド（例えば、治療ポリペプチドおよび／または標的化ポリペプチド）と組み合わせてＰＤ－１ポリペプチドを発現させる。１つの実施態様において、当業者に公知の方法にしたがってＲＳＶ－ＰＤ－１融合カセットをウイルスのＥ３欠失に挿入し、かつ治療用導入遺伝子をファイバーおよびＥ４遺伝子の間にＣＭＶまたはＭＣＭＶまたはＲＳＶ発現カセットとして挿入する。図１７および図１８を参照。
例６
高親和性ヒトｈＰＤ－１－ＨＡ－Ｉｇ融合タンパク質を単独でまたは免疫療法ペイロードと組み合わせて発現するＣＲＡｄの腫瘍成長評価。
Ｂ１６－ＣＡＲ黒色腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に注射し、結果としてもたらされた腫瘍に本発明の多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物の３ｅ１１ウイルス粒子を注射する。ＣＲＡｄ＋ＰＤ－Ｌ１デコイはｐＡｄ６／５７／６－ｄｌ１１０７－ΔＥ３－ＲＳＶ－ｈＰＤ－１－ＨＡ－Ｉｇ－Ｉである。ｐＡｄ６／５７／６－ｄｌ１１０７－ΔＥ３－ＲＳＶ－ｈＰＤ－１－ＨＡ－Ｉｇ－Ｉおよび４－１ＢＢＬを発現する第２のアデノウイルスを使用してＣＲＡｄ＋ＰＤ－Ｌ１デコイ＋免疫刺激剤を腫瘍に併用注射する。高親和性ヒトｈＰＤ－１－ＨＡ－Ｉｇ融合タンパク質を発現するＣＲＡｄは単独でまたは免疫療法ペイロードと組み合わせて腫瘍成長を遅延させる。図２０を参照。
１つの実施態様において、１つまたは複数の治療ポリペプチドと組み合わせてＰＤ－１ポリペプチドを発現するようにＣＲＡｄ６５７またはＣＲＡｄ６／５７／６を改変する。治療ポリペプチドは、ＧＭ－ＣＳＦ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０ＬおよびＯＸ４０、ならびにこれらの組み合わせから選択されてもよい。１つの態様において、ＰＤ－１ポリペプチドは、融合タンパク質として治療ポリペプチドと共に発現される。さらなる態様において、ＲＳＶ－ＰＤ－１融合カセットをウイルスのＥ３欠失に挿入し、治療用導入遺伝子をウイルスファイバーおよびＥ４遺伝子の間にＣＭＶまたはＭＣＭＶまたはＲＳＶ発現カセットとして挿入する。図１７および図１８を参照。
例７
多価ＰＤ－Ｌ１結合化合物の構築。
当業者に公知の方法にしたがって、ＰＤ－１ポリペプチドおよびスキャフォールドポリペプチドまたはＦＸポリペプチドのＧＬＡドメインのいずれかを含む融合タンパク質を、野生型、突然変異体、または合成遺伝子からの突然変異および融合ジャンクションと共にＰＣＲクローニングされた遺伝子から生成する。発現ベクターにクローニングし、タンパク質の発現およびアセンブリーを可能とする条件下で培養し、かつ任意選択的に、細胞環境からタンパク質を精製することにより、融合タンパク質をアセンブルさせる。
融合タンパク質は、ウイルスコートポリペプチドに結合することができるポリペプチドに融合したＰＤ－１ポリペプチドおよび／またはそれらの断片を発現するベクターを用いる細胞のプラスミドトランスフェクションまたは感染、続いて抗体カラム上またはＰＤ－Ｌ１カラム上またはビオチンカラム上でのＰＤ－１または融合パートナーを用いる精製により製造されてもよい。
１つの実施態様において、Ａｄは、融合タンパク質でのＡｄ表面のコーティングを可能とする条件下で、精製されたＰＤ－１融合タンパク質と接触させられてもよい。例えば、ＦＸポリペプチドのＧＬＡドメインはＡｄの表面に結合し、その結果、ＰＤ－１はＡｄの表面上で曝露されて細胞の表面上のＰＤ－Ｌ１に結合する。融合パートナーがＡｄ表面に結合しており、かつＰＤ－１が細胞上のＰＤ－Ｌ１に自由に結合するアデノウイルスはマルチマーＰＤ－Ｌ１結合化合物を提供する。
１つの実施態様において、融合タンパク質をコードする核酸をプラスミドもしくはウイルスベクターに挿入し、またはｍＲＮＡ生成ベクターに挿入し、これらをｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞培養物にトランスフェクトもしくは感染させ、またはｉｎ ｖｉｖｏで動物に感染させる。ＰＤ－１および／または融合タンパク質パートナーに対する抗体を用いてタンパク質発現について試料をアッセイする。
融合タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびウイルスベクター）を正常または癌保有動物に送達し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＴ細胞活性化マーカーを用いる染色により末梢血細胞、リンパ節細胞、脾臓細胞、および腫瘍細胞集団における変化を評価する。
融合タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ）またはウイルスベクターを癌保有動物に送達し、腫瘍サイズ、転移、播種、および生存に対する効果を評価した。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と組み合わせて記載したが、以上の記載は、本発明を実例と共に説明することを意図しており、その範囲を限定することは意図されず、該範囲は添付の請求項の範囲により定義されることが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は以下の請求項の範囲内である。

Claims (20)

  1. 複数のアミノ酸鎖を含み、各アミノ酸鎖が少なくとも１つのプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）ポリペプチドを含む、多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物。
  2. Ｉｇポリペプチド、シグマ－１ポリペプチドおよびストレプトアビジンポリペプチドから選択されるスキャフォールドポリペプチドを含むポリペプチドコンジュゲートである、請求項１に記載の多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物。
  3. １を超えるスキャフォールドポリペプチドを含むポリペプチドコンジュゲートである、請求項２に記載の多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物。
  4. 前記プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）ポリペプチドがヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１である、請求項１に記載の多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物。
  5. 前記アミノ酸鎖が、治療ポリペプチド、標的化ポリペプチドまたは抗原性ポリペプチドを含む、請求項１に記載の多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物。
  6. 前記標的化ポリペプチドが、麻疹ウイルスヘマグルチニン（ＭＶＨ）ポリペプチド、麻疹ウイルス融合（ＭＶＦ）ポリペプチドおよび水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶＧ）ポリペプチドから選択される、請求項５に記載の多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物。
  7. 前記治療ポリペプチドが、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）ポリペプチド、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチドおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）ポリペプチドから選択される、請求項５に記載の多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物。
  8. 少なくとも１つのプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）ポリペプチドを含む各アミノ酸鎖が組換えアデノウイルス（Ａｄ）と会合しており、かつ前記複数のアミノ酸鎖が前記組換えＡｄのコートポリペプチド上に存在する、請求項１に記載の多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物。
  9. 前記組換えＡｄが、Ａｄ株Ａｄ６のカプシドヘキソンポリペプチドおよびＡｄ株Ａｄ５７からの少なくとも１つのカプシドヘキソン超可変領域（ＨＶＲ）ポリペプチドを含む、請求項８に記載の多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物。
  10. Ａｄ株Ａｄ６の前記カプシドヘキソンポリペプチドがＡｄ株Ａｄ５７からのＨＶＲポリペプチド１～７を含む、請求項９に記載の多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物。
  11. Ａｄ株Ａｄ６の前記カプシドヘキソンポリペプチドがＡｄ株Ａｄ５７からのＨＶＲポリペプチド２～６を含む、請求項９に記載の多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物。
  12. 前記プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）ポリペプチドがヒトＰＤ－１である、請求項８に記載の多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物。
  13. 前記ＰＤ－１ポリペプチドが第Ｘ因子単鎖抗体ポリペプチドのビタミンＫ依存性ガンマ－カルボキシグルタミン酸ドメイン（ＦＸポリペプチドのＧＬＡドメイン）に融合している、請求項８に記載の多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物。
  14. 各アミノ酸鎖が、麻疹ウイルスヘマグルチニン（ＭＶＨ）ポリペプチド、麻疹ウイルス融合（ＭＶＦ）ポリペプチドおよび水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶＧ）ポリペプチドから選択される標的化分子を含む、請求項８に記載の多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物。
  15. 各アミノ酸鎖が、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）ポリペプチド、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）ポリペプチド、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）ポリペプチド、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）ポリペプチドから選択される１つまたは複数の治療ポリペプチドを含む、請求項８に記載の多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物。
  16. 請求項１に記載の多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物および薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
  17. 請求項８に記載の多価プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合化合物を投与することを含む、癌の治療を必要とする対象において癌を治療する方法。
  18. １つまたは複数の癌治療法を哺乳動物に投与することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記癌治療法が、ＰＤ－１を標的化する免疫療法である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記免疫療法が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、セミプリマブおよびデュルバルマブからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
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