KR20150088841A - 피하 지방생성을 자극하는 펩타이드 - Google Patents

Abstract

표유동물에서 피하 지방생성을 자극하는 5 내지 14 개 길이의 아미노산의 펩타이드 및 그것의 용도가 제공된다.

Description

피하 지방생성을 자극하는 펩타이드{PEPTIDES THAT STIMULATE SUBCUTANEOUS ADIPOGENESIS}

관련 출원에 대한 참조

본원은 미국 가출원 시리즈 번호 61/778,084 (2013년 3월 12일 출원), 및 61/729,626 (2012년 11월 25일 출원)을 우선권으로 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 편입된 참고로 본원에 편입되어 있다.

본 발명은 일반적으로 피하 지방생성을 자극하는 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그와 같은 펩타이드를 함유하는 약제학적 및 화장용 조성물, 및 그와 같은 펩타이드를 사용하는 다양한 방법 및 흉터를 감소시키고, 피부의 외관을 개선하고, 조직 용적을 개선하고, 피부를 부드럽게 하고, 피하 지방의 형성에 줄기세포를 동원하고, 조직을 재건하고, 뒷꿈치 통증을 감소시키는 조성물에 관한 것이다.

RHAMM은 대부분의 정상적인 성인 조직에서 저조하게 발현되거나 발현되지 않지만 공격성 인간 종양에서 높게 발현되는 히알루로난(HA)-결합 단백질이다(Adamia 등 (2005) Curr . Drug Targets Cardiovasc . Haematol . Disord ., 5: 3-14; Tammi 등 (2002) J. Biol. Chem . 277: 4581-4584; Toole (2004) Nat. Rev. Cancer, 4: 528-539). RHAMM(유전자 이름 HMMR)은 히알루론산 매개된 운동성을 위한 수용체이며, CD168로도 알려져 있다. RHAMM은 비-내재성 세포 표면 단백질(CD168) 및 세포내 히알루로난 결합 단백질이다. 동물 모델의 분석은 종양형성 및관절염과 같은 다른 질환 과정에서의 RHAMM의 역할을 제시하는데, 이는 문헌에 의해 충분히 입증된 세포 이동과 증식 및 세포자멸사에서의 RHAMM의 시험관내 기능과 일치한다(Turley 등 (2002) J. Biol . Chem., 277: 4589-4592). 세포 이동과 증식 및 세포자멸사가 형태발생 및 조직 항상성을 위해 필수적인 기능들임에도 불구하고, RHAMM의 유전적 결실은 배아발생 또는 성인 항상성에 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다(Tolg 등 (2003) Oncogene 22: 6873-6882). 현재까지, RHAMM에 대한 주된 생리적 기능은 여전히 설명하기 힘들다.

RHAMM은 본래 시험관내에서 하부융합성(subconfluent) 이동성 섬유아세포로부터 분리되었고(Turley (1982) Biochem . Biophys . Res. Commun. 108: 1016-1024), 이후 간엽 세포로부터 클로닝되었다(예를 들면, Hardwick 등 (1992) J. Cell Biol., 117: 1343-1350). 탈락된(shed) 형태의 RHAMM에 대해 제조된 항체들이 HA-자극된-섬유아세포 운동성을 차단하였으므로, RHAMM은 원래 배양에서 미토겐 신호전달 경로를 변환할 수 있는 세포 표면 단백질로서 기술되었다(Turley 등 (2002) J. Biol. Chem. 277: 4589-4592). 그러나, HA-결합된 RHAMM은 방사선 및 미세소관 세포골격, 핵 및 세포질과 같은 세포내 구획에서 이후에 검출되었다(Adamia 등 (2005) Curr . Drug Targets Cardiovasc . Haematol . Disord ., 5: 3-14). 보다 최근에, RHAMM은 중심체 및 유사분열 방추체를 장식하는 것으로 나타났다. RHAMM은 배양에서 유사분열 방추체 형성을 위해 필요하며 유사분열 방추체 온전성을 조절하기 위해 BRCA1/BARD1 경로에 작용하는 것으로 보인다(Joukov 등 (2006) Cancer Cell, 127: 539-52). 총괄적으로, 이들 결과는 RHAMM이 세포외 및 세포내 기능 모두를 가질 수 있으며(Nickel (2005) Traffic 6: 607-614; Samuel 등 (1993) J. Cell Biol ., 123: 749-758; Zhang 등 (1998) J. Biol . Chem ., 273: 11342-11348), 따라서 RHAMM과 같이, 이들이 골지-ER 방출 펩타이드 및 막 관통 서열(membrane spanning sequence) 모두가 결여되어 있음에도 불구하고 세포막을 통해 신호를 전달하는 세포 표면에서 또한 발견되는 에피모르핀/신탁신-2, 및 자가분비 운동성 인자/포스포글루코오스 이소머라제를 포함하는 하나의 그룹의 단백질과 유사하다는 것을 제시한다(Nickel (2005) Traffic 6: 607-614; Samuel 등 (1993) J. Cell Biol ., 123: 749-758; Zhang 등 (1998) J. Biol . Chem ., 273: 11342-11348).

RHAMM의 세포내 대 세포외 기능이 아직 명확히 분석되지 않았음에도 불구하고, 축적된 데이터는 두 형태가 적어도 질환 중에, 간엽 표현형에 기여할 수 있음을 제시한다. 예를 들면, 배양에서 RHAMM 발현은 TGF-β와 같은 섬유형성 사이토카인에 의해 형질전환된 섬유아세포에서 증가한다(Samuel 등 (1993) J. Cell Biol., 123: 749-758). 세포 표면 RHAMM은 PDGF와 같은 섬유형성 사이토카인을 통한 활성화에 필요하다(Zhang 등 (1998) J. Biol . Chem ., 273: 11342-11348). RHAMM 발현은 임상적으로 공격성 간엽 종양(섬유종증 또는 유건종)에서 높은 것으로 또한 입증되었다(예를 들면, Tolg 등 (2003) Oncogene 22: 6873-6882 참고). 유건종 및 상부 장관 종양에 민감한 마우스 모델에서, RHAMM의 유전적 결실은 유건종 개시 및 침습을 크게 감소시키지만 상부 장관 종양은 그렇지 않다. 공격성 섬유종증과 같은 섬유증식성 과정은 창상 치유의 증식/이동 단계와 유사하다(Cheon 등 (2002) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 99: 6973-6978). 더욱이, RHAMM의 발현은 창상 동안 조절된다(Lovvorn 등 (1998) J. Pediatr . Surg ., 33: 1062-1069; discussion 1069-1070).

섬유아세포 기능을 조절하는 인자들이 창상 회복 및 종양형성에서 두 가지 역할을 하고(Bissell (2001) Exp . Mol . Med ., 33: 179-190; Park 등 (2000) Mol . Med . To일, 6: 324-329), 창상 부위로의 간엽 줄기세포 이동/분화는 연구 주제가 되어 왔다(예를 들면, Fu 등 (2006) Wound Repair Regen., 14: 325-35; Mansilla 등(2006) Transplant Proc. 38: 967-969; Shumakov (2003) Bull. Exp . Biol . Med ., 136: 192-195). 창상에서의 간엽 줄기세포 및 거주 섬유아세포는 면역조절 기능을 가져 창상 회복 동안 섬유증의 시기 및 정도에 영향을 미친다(Domaszewska and Oszewski (2006) Ann. Transplnt . 11: 45-52).

RHAMM의 유전적 손실 또는 그의 히알루로난 결합 서열을 모방하는 펩타이드를 이용한 RHAMM의 차단 또는 이 서열에 대한 항체가 피하 지방생성을 촉진하는 것으로 나타났다. 랜덤 파아지 라이브러리로부터 분리된 한 가지 그러한 펩타이드(STMMSRSHKTRSHHV(서열번호: 1), P-1 펩타이드, 본원에서 펩타이드 P15-1로도 지칭됨)는 히알루로난에 결합하고, 지방을 생성하며, 창상 회복에 관여하는 간엽 인자인 RHAMM의 히알루로난 결합 영역과 유사한 것으로 나타났다. RHAMM과 HA와의 상호작용에 필요한 몇 가지 핵심 잔기를 함유하는, 또 하나의 펩타이드인 펩타이드 B(KLKDENSQLKSEVSK(서열번호: 2))는 강하게 지방을 생성한다. RHAMM이 지방 조직 발달의 조절에서 효과를 나타낸다는 것이 PCT 공개 제WO 2008/140586호에서 보고되었다. 특히, RHAMM -/- 마우스의 상처를 입지 않은 피부를 통한 조직 절편의 조직학 분석은 피하 지방층이 야생형 한배 새끼(littermate) 피부에서보다 2 내지 3배 더 두꺼웠으며, RHAMM -/- 창상으로부터 성장한 섬유아세포가 높은 수준의 지방 소적 및 감소된 평활근 액틴을 포함하였음을 보여주었다. 더욱이, RHAMM -/- 진피 섬유아세포는 지방생성 배지에서 성장할 때 지방세포로 전환되었다. 반면, 야생형 창상과 일치하는 한배 새끼로부터 성장한 섬유아세포는 지방 소적을 나타내지 않았고, 풍부한 평활근 액틴을 발현하였다. RHAMM-구조된 진피 섬유아세포는 지방생성 배지에서 성장할 때 지방생성 전환을 겪지 않는다. 반대로, RHAMM -/- 마우스의 이미지 분석은 이들이 야생형 한배 새끼보다 유의하게 적은 내장 지방 및 더 낮은 골 밀도를 갖는다는 것을 보여주었다. 이들 데이터는 RHAMM이 내장 대 피하 지방생성에 대해 차별적인 효과를 갖는다는 것을 보여주었다.

또한 RHAMM은 피하 대 내장 지방의 조절에 있어 선택적이며, 골 밀도가 줄기세포 활성의 측정값을 제공하므로 이 조절이 골수 줄기세포에 대한 효과와 연관되는 것으로 여겨진다. 이는 RHAMM이 간엽 줄기세포 분화를 조절하는 그의 능력을 통해 피하 지방 축적에 영향을 미친다는 것을 가리키며, 결론은 또 하나의 간엽 줄기 세포 유형인 근섬유아세포에 대한 RHAMM 손실의 효과에 의해 입증되었다. 더욱이, HA 결합 펩타이드가 또한 지방생성을 촉진하므로 히알루로난/RHAMM 상호작용이 간엽 분화에 대한 이 효과에서 역할을 한다. 이들 생체내 효과 외에도, RHAMM -/- 진피 섬유아세포는 배양이 밀집될 때 자발적으로 지방세포로 발전하는 반면, 야생형 진피 섬유아세포는 그렇지 않다.

요약

피하 지방생성을 자극하기 위한 약제학적 또는 화장품 조성물이 제공된다. 본 조성물은 약제학적으로 또는 화장용으로 허용가능한 담체 및 펩타이드를 포함하고, 상기 펩타이드는 6 내지 31 개의 아미노산의 길이를 서열: X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶을 포함하고, 여기서 X¹ 및 X⁶ 중 적어도 하나는 양으로 하전된 아미노산 또는 알라닌 (A)이고; X¹ 및 X⁶ 중 다른 하나는 양으로 하전된 아미노산, 류신 (L), 또는 알라닌 (A)이고; X²는 세린 (S), 글루타민 (Q), 알라닌 (A), 글루타메이트 (E), 아스파라긴 (N), 프롤린 (P), 시스테인 (C), 라이신 (K), 아스파르테이트 (D), 트립토판 (W), 메티오닌 (M), 또는 트레오닌 (T)이고; X³는 음으로 하전된 아미노산, 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 세린 (S), 라이신 (K), 아스파라긴 (N), 또는 트레오닌 (T)이고; X⁴는 이소류신 (I), 발린 (V), 류신 (L), 아스파라긴 (N), 알라닌 (A), 세린 (S), 프롤린 (P), 트레오닌 (T), 또는 글루타민 (Q)이고; 및 X⁵는 세린 (S), 아스파르테이트 (D), 트레오닌 (T), 류신 (L), 알라닌 (A), 페닐알라닌 (F), 글루타메이트 (E), 아스파라긴 (N), 글리신 (G), 아르기닌 (R), 글루타민 (Q), 히스티딘 (H), 또는 이소류신 (I)이고; 단, X² 및 X⁵ 둘 모두는 글루타민 (Q)가 아니고, 단, X¹이 아르기닌 (R)일 때, X³은 라이신 (K)이 아니다.

바람직하게는, 펩타이드의 아미노산 서열은 하기로 이루어진다: KSEVSK (서열번호: 3), KQEVSK (서열번호: 4), KQEVDK (서열번호: 5), KQENTK (서열번호: 6), KSEVLK (서열번호: 7), KQDVSK (서열번호: 8), KQELDR (서열번호: 9), LEEIFK (서열번호: 10), LSELEK (서열번호: 11), KSEISK (서열번호: 12), KNEVSK (서열번호: 13), KSEVTK (서열번호: 14), KSEVNK (서열번호: 15), KSDVSK (서열번호: 16), KSQVSK (서열번호: 17), KPEVSK (서열번호: 18), KSEVGK (서열번호: 19), KSDSSK (서열번호: 20), KSSPSK (서열번호: 21), KSEASK (서열번호: 22), KSELRK (서열번호:23), KCEVSK (서열번호: 24), KSKPSK (서열번호: 25), KKEVSK (서열번호: 26), KEEVSK (서열번호: 27), KSETSK (서열번호: 28), KSNVSK (서열번호: 29), KDEVSK (서열번호: 30), KSEVEK (서열번호: 31), KSAVSK (서열번호: 32), KWEVSK (서열번호: 33), KMEVSK (서열번호: 34), KSEVQK (서열번호: 35), KSEVHK (서열번호: 36), KSSVSK (서열번호: 37), ASEVSK (서열번호: 38), KAEVSK (서열번호: 39), KSEVAK (서열번호: 40), KSEVSA (서열번호: 41), ASEVSA (서열번호: 93), KAEVAK (서열번호: 94), KSAASK (서열번호: 95), LKSEVSK (서열번호: 42), QLKSEVSK (서열번호: 43), SQLKSEVSK (서열번호: 44), NSQLKSEVSK (서열번호: 45), ENSQLKSEVSK (서열번호: 46), DENSQLKSEVSK (서열번호: 47), KDENSQLKSEVSK (서열번호: 48), LKDENSQLKSEVSK (서열번호: 49), 또는 KLKDENSQLKSEVSK (서열번호: 2).

피하 지방생성을 자극하기 위한 또 하나의 약제학적 또는 화장품 조성물이 또한 제공된다. 본 조성물은 약제학적으로 또는 화장용으로 허용가능한 담체 및 펩타이드를 포함하고, 상기 펩타이드는 5 내지 31 개의 아미노산의 길이를 가지며 서열: X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶을 포함하고, 여기서 X¹ 및 X⁶ 중 적어도 하나는 양으로 하전된 아미노산 또는 알라닌 (A)이고; X¹ 및 X⁶ 중 다른 하나는 a 양으로 하전된 아미노산, 류신 (L) 또는 그것을 위한 보존적 치환, 알라닌 (A) 또는 그것을 위한 보존적 치환이거나, 부재하고; 그리고 X²-X³-X⁴-X⁵는 아미노산 서열 SEVS (서열번호: 50)과 적어도 50% 서열 동일성을 가지며 4 내지 8 개의 아미노산의 길이를 갖는 아미소산 서열이다.

피하 지방생성을 자극하기 위한 또 하나의 약제학적 또는 화장품 조성물이 추가로 제공된다. 본 조성물은 약제학적으로 또는 화장용으로 허용가능한 담체 및 펩타이드를 포함하고, 상기 펩타이드는 6 내지 13 개의 아미노산의 길이를 가지며 서열: Z¹-Z²-Z³-Z⁴-Z⁵-Z⁶을 포함하고, 여기서 Z¹은 세린 (S) 또는 그것을 위한 보존적 치환이고; Z²는 소수성 아미노산이고; Z³은 임의의 아미노산이고; Z⁴는 소수성 아미노산이고; Z⁵는 세린 (S), 아르기닌 (R), 또는 그것을 위한 보존적 치환이고; 그리고 Z⁶은 하전된 아미노산 또는 세린 (S)이고; 단, Z¹, Z² 및 Z⁴ 모두는 글리신 (G)이 아니고, 단, Z¹은 글루타민 (Q)이 아니고, 그리고 단, Z²는 히스티딘 (H)이 아니다.

바람직하게는, 펩타이드의 아미노산 서열은 STMMSR (서열번호: 51), SIMMSR (서열번호: 52), STLMSR (서열번호: 53), STVMSR (서열번호: 54), STGLSR (서열번호: 55), STTMSR (서열번호: 56), STRMSR (서열번호: 57), STLMRR (서열번호: 58), STPVSR (서열번호: 59), STMMSRS (서열번호: 60), STMMSRSH (서열번호: 61), STMMSRSHK (서열번호: 62), STMMSRSHKT (서열번호: 63), STMMSRSHKTR (서열번호: 64), STMMSRSHKTRS (서열번호: 65), STMMSRSHKTRSH (서열번호: 66), STMMRS (서열번호: 96), 또는 STMMRSH (서열번호: 97)로 이루어진다.

피하 지방생성을 자극하기 위한 또 하나의 약제학적 또는 화장품 조성물이 추가로 제공된다. 본 조성물은 약제학적으로 또는 화장용으로 허용가능한 담체 및 펩타이드를 포함하고, 상기 펩타이드는 6 내지 13 개의 아미노산의 길이를 가지며 아래 서열을 포함한다: Z¹-Z²-Z³-Z⁴-Z⁵-Z⁶ 여기서 Z¹은 세린 (S) 또는 그것을 위한 보존적 치환이고; Z⁶은 하전된 아미노산 또는 세린 (S)이고; 그리고 Z²-Z³-Z⁴-Z⁵는 아미노산 서열 TMMS (서열번호: 67) 과 적어도 50% 서열 동일성을 가지며 2 내지 8 개의 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열이다.

흉터를 감소시키는 방법이 제공된다. 본 방법은 임의의 하나 이상의 상기 조성물을 대상체에게 흉터의 체표를 감소시키거나 흉터있는 체표의 외관을 개선하는데 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다.

피부의 외관을 개선하는 방법이 또한 제공된다. 본 방법은 임의의 하나 이상의 상기 조성물을 대상체에게 대상체의 체표에서 피부의 외관을 개선하는데 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다.

대상체의 체표에서 조직 용적을 개선하는 방법이 제공된다. 본 방법은 임의의 하나 이상의 상기 조성물을 상기 대상체에게 체표의 조직 용적을 증가시키는데 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다.

대상체의 체표에서 피부를 부드럽게 하는 방법이 또한 제공된다. 본 방법은 임의의 하나 이상의 상기 조성물을 상기 대상체에게 체표에서 피부를 부드럽게 하는데 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다.

대상체에서 피하 지방의 형성에 줄기세포를 동원하는 방법이 제공된다. 본 방법은 임의의 하나 이상의 상기 조성물을 상기 대상체에게 상기 대상체에서 피하 지방의 형성에 줄기세포를 동원하는데 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다.

대상체의 조직을 재건하는 방법이 또한 제공된다. 본 방법은 임의의 하나 이상의 상기 조성물을 상기 대상체의 조직에 조직 재건 절차 동안 또는 그 후에 조직의 용적을 증가시키는데 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다.

대상체에서 뒷꿈치 통증을 감소시키는 방법 방법이 또한 제공된다. 본 방법은 임의의 하나 이상의 상기 조성물을 상기 대상체에게 걷기 동안에 대상체에서 뒷꿈치 통증을 감소시키는데 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다.

피하 지방생성을 자극하는 펩타이드가 제공된다. 펩타이드는 6 내지 8 개의 아미노산의 길이를 가지며 서열 X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶,을 포함하고, 여기서 X¹ 및 X⁶ 중 적어도 하나는 양으로 하전된 아미노산 또는 알라닌 (A)이고; X¹ 및 X⁶ 중 다른 하나는 양으로 하전된 아미노산, 류신 (L), 또는 알라닌 (A)이고; X²는 세린 (S), 글루타민 (Q), 알라닌 (A), 글루타메이트 (E), 아스파라긴 (N), 프롤린 (P), 시스테인 (C), 라이신 (K), 아스파르테이트 (D), 트립토판 (W), 메티오닌 (M), 또는 트레오닌 (T)이고; X³는 음으로 하전된 아미노산, 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 세린 (S), 라이신 (K), 아스파라긴 (N), 또는 트레오닌 (T)이고; X⁴는 이소류신 (I), 발린 (V), 류신 (L), 아스파라긴 (N), 알라닌 (A), 세린 (S), 프롤린 (P), 트레오닌 (T), 또는 글루타민 (Q)이고; 및 X⁵는 세린 (S), 아스파르테이트 (D), 트레오닌 (T), 류신 (L), 알라닌 (A), 페닐알라닌 (F), 글루타메이트 (E), 아스파라긴 (N), 글리신 (G), 아르기닌 (R), 글루타민 (Q), 히스티딘 (H), 또는 이소류신 (I)이고; 단, X² 및 X⁵ 둘 모두는 글루타민 (Q)가 아니고; 그리고 단, X¹이 아르기닌 (R)일 때, X³은 라이신 (K)이 아니다.

또 하나의 피하 지방생성을 자극하는 펩타이드 방법이 또한 제공된다. 펩타이드는 5 내지 8 개의 아미노산의 길이를 가지며 서열 X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶을 포함하고, 여기서 X¹ 및 X⁶ 중 적어도 하나는 양으로 하전된 아미노산 또는 알라닌 (A)이고; X¹ 및 X⁶ 중 다른 하나는 양으로 하전된 아미노산, 류신 (L) 또는 그것을 위한 보존적 치환, 알라닌 (A) 또는 그것을 위한 보존적 치환이거나, 부재하고; 그리고 X²-X³-X⁴-X⁵는 아미노산 서열 SEVS와 적어도 50% 서열 동일성을 가지며 4 내지 8 개의 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열이다.

또 하나의 피하 지방생성을 자극하는 펩타이드 방법이 또한 제공된다. 펩타이드는 6 내지 13 개의 아미노산의 길이를 가지며 서열 Z¹-Z²-Z³-Z⁴-Z⁵-Z⁶을 포함하고, 여기서 Z¹은 세린 (S) 또는 그것을 위한 보존적 치환이고; Z²는 소수성 아미노산이고; Z³은 임의의 아미노산이고; Z⁴는 소수성 아미노산이고; Z⁵는 세린 (S), 아르기닌 (R), 또는 그것을 위한 보존적 치환이고; 그리고 Z⁶은 하전된 아미노산 또는 세린(S)이고; 단, Z¹, Z² 및 Z⁴ 모두는 글리신 (G)이 아니고; 단, Z¹은 글루타민 (Q)가 아니고; 그리고 단, Z²는 히스티딘 (H)이 아니다.

또 하나의 피하 지방생성을 자극하는 펩타이드 방법이 또한 제공된다. 펩타이드는 6 내지 13 개의 아미노산의 길이를 가지며 서열 Z¹-Z²-Z³-Z⁴-Z⁵-Z⁶을 포함하고, 여기서 Z¹은 세린 (S) 또는 그것을 위한 보존적 치환이고; Z⁶은 하전된 아미노산 또는 세린 (S)이고; 그리고 Z²-Z³-Z⁴-Z⁵는 아미노산 서열 TMMS와 적어도 50% 서열 동일성을 가지며 2 내지 8 개의 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열이다.

정의

용어 "펩타이드"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 그 길이가 전형적으로 약 5 내지 약 31 개 범위의 아미노산인 아미노산 잔기의 폴리머를 의미한다. 펩타이드의 아미노산 잔기는 "L-형" 아미노산 잔기, "D" 아미노산 잔기, 또는 이들의 조합일 수 있다. 펩타이드 서열의 L-, D-, 또는 β-아미노산 버전 뿐만 아니라 레트로, 인버소, 및 레트로-인버소 동형체가 포함된다. "β-펩타이드"는 "β 아미노산"을 포함하고, 이것은 20 개의 표준 생물학적 아미노산에서와 같이 α-탄소보다는 β 탄소에 결합된 그것의 아미노 그룹이다.

용어들 "표준" 및 "천연"은 본원의 펩타이드에 적용되는 바와 같이, 표준 천연 발생 아미노산: 알라닌 (Ala, A), 시스테인 (Cys, C), 아스파르테이트 (Asp, D), 글루타메이트 (Glu, E), 페닐알라닌 (Phe, F), 글리신 (Gly, G), 히스티딘 (His, H), 이소류신 (Ile, I), 라이신 (Lys, K), 류신 (Leu, L), 메티오닌 (Met, M), 아스파라긴 (Asn, N), 프롤린 (Pro, P), 글루타민 (Gln, Q), 아르기닌 (Arg, R), 세린 (Ser, S), 트레오닌 (Thr, T), 발린 (Val, V), 트립토판 (Trp, W), 및 티로신 (Tyr, Y)으로부터만 구성된 펩타이드를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는, 천연 발생 펩타이드의 생물학적 활성 및/또는 특이성과 관련된 생물학적 활성 (예를 들면, 지방생성 활성)을 유도한다면 천연 펩타이드에 "해당한다". 유발된 활성은 천연 펩타이드의 활성과 동일하거나, 더 크거나 그 미만일 수 있다.

용어들 "비-표준," 및 "비-천연," 및 "유사체"는 본원의 펩타이드에 적용된 바와 같이, 표준 아미노산이 아니고/거나 천연 발생 아미노산이 아닌 1 이상의 아미노산을 함유하는 펩타이드를 의미한다. 숙련가는 그와 같은 비-표준 및 비-천연 발생 아미노산에 친숙할 수 있고 본 발명의 펩타이드에 사용하기 위해 적합한 비-표준 및 비-천연 발생 아미노산을 선택할 수 있다. 아미노산 유사체는 비-표준이지만 자연에서 생성되는 아미노산 (예를 들면, 노르발린, 노르류신), 뿐만 아니라 자연에서 생성되지 않는 합성 아미노산을 포함한다. 예를 들면, 다양한 아미노산 유사체는, 비제한적으로 하기를 포함한다: 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, 베타-알라닌 (베타-아미노프로피온산), 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 피페리딘산, 6-아미노카프로산, 2-아미노헵탄산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜산, 2,4 디아미노부티르산, 데스모신, 2,2'-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, n-에틸글리신, n-에틸아스파라긴, 하이드록실리신, 알로-하이드록실리신, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, n-메틸글리신, 사르코신, n-메틸이소류신, 6-n-메틸라이신, n-메틸발린, 노르발린, 노르류신, 오르니틴, 등. 이들 변형된 아미노산은 예증적이고 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

용어 "보존적 치환"은 펩타이드의 활성(예를 들면, 지방생성 활성 및/또는 특이성)을 실질적으로 변화시키지 않는 아미노산 치환을 지칭하기 위해 사용된다. 종래 보존적 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및 화학적 특성(예를 들면, 전하 또는 소수성)을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 그러한 종래의 치환은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 1) 글리신 (G)/알라닌 (A), 2) 아르기닌 (R)/라이신 (K), 3) 세린 (S)/트레오닌 (T)/티로신 (Y), 4) 류신 (L)/이소류신 (I)/발린 (V), 5) 아스파르트산 (D)/글루탐산 (E), 6) 글루타민 (Q)/아스파라긴 (N), 및 7) 페닐알라닌 (F)/티로신 (Y)/트립토판 (W). 다른 기능적 보존적 치환은, 비제한적으로 8) 글리신 (G)/알라닌 (A)/프롤린 (P), 9) 티로신 (Y)/히스티딘 (H), 10) 아르기닌 (R)/라이신 (K)/히스티딘 (H), 11) 세린 (S)/트레오닌 (T)/시스테인 (C), 12) 류신 (L)/이소류신 (I)/발린 (V)/메티오닌 (M), 13) 알라닌 (A)/세린 (S)/트레오닌 (T)/ 메티오닌 (M)/글리신 (G), 및 14) 메티오닌 (M)/라이신 (K) (소수성 조건 하에)를 포함한다. 보존적 치환은 또한 표준 아미노산이 표준 아미노산과 최소한도로 상이한 비-표준(예를 들면, 드문, 합성, 등) 아미노산으로 대체된 "유사 치환"를 포함한다. 그러한 유사 치환은 표준 아미노산으로부터 합성적으로 유래될 수 있거나, 이성질체이거나, 또는 대사물 전구체이다. 그러한 "유사 치환"의 예는, 비제한적으로, 1) Lys→오르니틴 (Orn), 2) Leu→노르류신, 3) Lys→Lys[TFA], 4) Phe→페닐글리신, 및 5) δ-아미노 부틸글리신→ξ-아미노 헥실글리신(여기서 [TFA]는 트리플루오로아세틸을 지칭함)을 포함한다. 보존적 치환은 또한 하나의 아미노산을 도 1에 나타난 바와 같은 공통의 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함한다. 그러한 치환은 하기 하나의 그룹 중 하나의 아미노산을 동일한 그룹 내의 또 다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다: 1) 방향족 아미노산: 페닐알라닌 (F)/티로신 (Y)/히스티딘 (H)/ 트립토판 (W); 2) 지방족 아미노산: 이소류신 (I)/발린 (V)/류신(L)/알라닌 (A)/글리신 (G); 3) 양전하를 띠는 아미노산: 히스티딘 (H)/라이신 (K)/아르기닌 (R); 4) 음전하를 띠는 아미노산: 아스파르테이트 (D)/글루타메이트 (E); 및 5) 매우 작은 아미노산: 시스테인 (C)/알라닌 (A)/글리신 (G)/세린 (S). 보존적 치환은 또한 전하를 띠지 않는 극성 측쇄을 갖는 아미노산, 즉, 세린 (S)/트레오닌 (T)/아스파라긴 (N)/글루타민 (Q)/티로신 (Y)/시스테인(S)의 치환을 포함한다. 아미노산 서열이 본원에 개시되어 있는 경우, 상기 확인된 하나 이상의 보존적 치환을 포함하는 아미노산 서열들이 또한 고려된다.

용어 퍼센트 "동일성"은 표준 서열 비교 알고리즘을 이용하거나 육안 검사에 의해 측정된 바와 같이, 최대 관련성을 위해 비교되고 정렬될 때 특정 퍼센트의 동일한 아미노산 잔기를 갖는 둘 이상의 서열들을 지칭한다. 서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 참조 서열로서 작용하며, 시험 서열이 상기 참고 서열과 비교된다. 참조 아미노산 서열에 대해 적어도, 예를 들면 50% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는, 시험 서열 내의 아미노산 잔기의 최대 50%가 삽입되거나, 결실되거나, 또는 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있는 것으로 의도된다. 시험 서열의 이러한 변경은 참조 아미노산 서열의 아미노 또는 카복시 말단 위치에서 또는 참조 서열 내의 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 인접한 그룹 내의 잔기 사이에 개별적으로 배치된, 상기 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 시험 서열의 서열 동일성은 참조 펩타이드의 전장에 대해 또는 참조 펩타이드의 특정 부분에 대해 결정된다. 예를 들면, 전체 서열 STMMSR(서열번호: 51)의 참조 서열로서 아미노산 서열 TMMS(서열번호: 67)를 고려할 때, 아미노산 치환을 갖는 일부 시험 서열(예를 들면, TMAQ(서열번호: 68), TRMW(서열번호: 69), TVLS(서열번호: 70), IGMS(서열번호: 71), 및 KMTS(서열번호: 72))은, 아미노산 결실을 갖는 일부 시험 서열(예를 들면, MM, MS, TM, TS), 및 아미노산 삽입을 갖는 일부 시험 서열(예를 들면, TMMAAAAS(서열번호: 73), TAAMMSAA(서열번호: 74), TMAAAMAS(서열번호: 75))과 마찬가지로, 참조 서열과 50% 서열 동일성을 갖는다. 삽입, 결실, 및/또는 치환을 갖는 일부 시험 서열은 또한 참조 서열과 50% 서열 동일성을 가질 것이다. 예를 들면, 참조 서열로서 아미노산 서열 TMMS(서열번호: 67)를 다시 고려할 때, TCS 또는 AMS(참조 서열과 비교하여 1개의 결실 및 1개의 치환을 가짐), 또는 TLLMMT(서열번호: 76) 또는 AMLIMS(서열번호: 77)(참조 서열과 비교하여 2개의 삽입 및 1개의 치환을 가짐)와 같은 서열들은 하기 서열 정렬로부터 관찰될 수 있는 바와 같이, 참조 서열과 50% 동일성을 갖는다:

TMMS

T-CS

TMMS

-AMS

T--MMS

TLLMMT

TM--MS

AMLIMS

반면, TAAM(서열번호: 78) 또는 FTMA(서열번호: 79)(참조 서열과 비교하여 1개의 치환, 1개의 삽입, 및 1개의 결실을 가짐), TCCRS(서열번호: 80)(참조 서열과 비교하여 1개의 삽입 및 2개의 치환을 가짐), 또는 TLALM(서열번호: 81)(참조 서열과 비교하여 2개의 삽입, 1개의 치환, 및 1개의 결실을 가짐)과 같은 서열들은 하기 서열 정렬에서 관찰될 수 있는 바와 같이 참조 서열 TMMS(서열번호: 67)와 50% 미만의 서열 동일성을 갖는다:

TM-MS

TAAM- (40% 서열 동일성)

-TMMS

FTMA- (40% 서열 동일성)

TMM-S

TCCRS (40% 서열 동일성)

T-M-MS

TLALM- (33% 서열 동일성)

서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우, 하위서열 좌표들이 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 이후, 상기 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여, 참조 서열 대비 시험 서열(들)의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은, 예를 들면, 문헌[Smith & Waterman (1981) Adv . Appl . Math. 2: 482]의 국소적 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman & Wunsch (1970) J. Mol . Biol. 48: 443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson & Lipman (1988) Proc . Natl . Acad . Sci ., USA, 85: 2444]의 유사성 방법을 위한 탐색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행에 의해(위스컨신 유전학 소프트웨어 패키지, 유전학 컴퓨터 그룹, 575 Science Dr., Madison, WI에서 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 육안 검사에 의해 수행될 수 있다.

전체 서열 정렬을 결정하기 위한 하나의 예시적이지만 비제한적인 방법은 문헌[Brutlag 등 (1990) Comp. App . Biosci . 6: 237-245]의 알고리즘에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 이용하는 것이다. 그러한 정렬 알고리즘의 이용은 당해분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 만약 시험 서열이 내부 결실 때문이 아니라 N- 또는 C-말단 결실로 인해 참조 서열보다 짧다면, 상기 결과에 통상적으로 수작업 보정이 이루어진다. 이것은 FASTDB 프로그램이 전체 퍼센트 동일성을 계산할 때 시험 서열의 N- 및 C-말단 절단을 고려하지 않기 때문이다. 참조 서열과 비교하여, N- 및 C-말단에서 절단된 시험 서열의 경우, 참조 서열의 총 염기의 퍼센트로서, 상응하는 시험 잔기와 일치/정렬되지 않은, 시험 서열의 N- 및 C-말단에 있는 참조 서열의 잔기의 수를 계산함으로써 퍼센트 동일성은 보정된다. 잔기가 일치/정렬되는지 여부는 FASTDB 서열 정렬의 결과에 의해 결정된다. 이 퍼센트는 이후 특정 파라미터를 이용한 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 퍼센트 동일성으로부터 감산되어 최종 퍼센트 동일성 스코어에 도달한다. 이 최종 퍼센트 동일성 스코어는 본 발명의 목적을 위해 사용되는 것이다. 참조 서열과 일치/정렬되지 않은, 시험 서열의 N- 및 C-말단에 대한 잔기들만이 수작업으로 퍼센트 동일성 스코어를 조절하기 위한 목적으로 통상적으로 고려된다. 즉, 참조 잔기만이 시험 서열의 가장 먼 N- 및 C-말단 잔기 밖에 위치한다. 예를 들면, 3-아미노산 잔기 시험 서열은 퍼센트 동일성을 결정하기 위해 4-잔기 참조 서열과 정렬된다. 결실은 시험 서열의 N-말단에서 일어나며 따라서, FASTDB 정렬은 N-말단에서 제1 잔기의 일치/정렬을 나타내지 않는다. 쌍으로 되지 않은 된 잔기는 서열의 25%(일치하지 않은 N 및 C-말단에서의 잔기의 수 / 참조 서열 내의 잔기의 총 수)에 해당하므로 25%는 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 퍼센트 동일성 스코어로부터 감산된다. 만약 남아있는 3개의 잔기가 완벽하게 일치되면, 최종 퍼센트 동일성은 75%일 것이다. 또 하나의 예에서, 3개의 잔기 시험 서열은 4개의 잔기 참조 서열과 비교된다. 이때, 결실은 내부 결실이므로, 상기 참조와 일치/정렬되지 않은 시험 서열의 N- 또는 C-말단에는 잔기가 존재하지 않는다. 이 경우 FASTDB에 의해 계산된 퍼센트 동일성은 수작업으로 보정되지 않는다. 다시 한번, 참조 서열과 일치/정렬되지 않은, FASTDB 정렬에서 나타난 바와 같이, 시험 서열의 N- 및 C-말단 외부에 위치한 잔기만이 수작업으로 보정된다. 다른 수작업 보정은 통상 이뤄지지 않으며 필요하지도 않다.

용어 "변이체"는 본 발명의 펩타이드와 상이하지만, 이의 필수적인 특성(예를 들면, RHAMM 활성을 억제하는 능력 및/또는 피하 지방생성을 유도하는 능력)을 유지하는 펩타이드를 지칭한다. 일반적으로, 변이체는 전체적으로 아주 유사하고, 본 발명의 펩타이드 서열과 많은 영역에서 동일할 수 있다. 보존적 아미노산 치환 외에도, 변이체 펩타이드는 (i) 하나 이상의 비-보존된 아미노산 잔기를 이용한 치환(상기 치환된 아미노산 잔기는 표준 아미노산이거나 표준 아미노산이 아닐 수 있고 천연 발생 아미노산이거나 천연 발생 아미노산이 아닐 수 있음) 및/또는 (ii) 하나 이상의 비-표준 또는 비-천연 발생 아미노산 잔기를 이용한 보존적 치환, 및/또는 (iii) 펩타이드의 안정성 및/또는 용해도를 증가시키는 화합물(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜)과 같은, 또 다른 화합물과의 펩타이드의 융합, 및/또는 (iv) 예를 들면, IgG Fc 융합 영역 펩타이드, 또는 리더 또는 분비성 서열, 또는 정제를 촉진하는 서열과 같은, 부가적인 아미노산과의 펩타이드의 융합을 포함할 수 있다. 그러한 변이체 펩타이드를 만드는 방법은 당해분야의 숙련가의 기술 내에 속한다. 예를 들면, 전하를 띠는 아미노산을 다른 전하를 띠거나 중성인 아미노산과 아미노산으로 치환한 것을 함유하는 펩타이드 변이체는 개선된 특성, 예컨대 낮은 응집을 갖는 펩타이드를 생산할 수 있다. 약제학적 제형의 응집은 응집물의 면역원성 활성으로 인해 활성을 낮추고 소거능을 증가시킨다(예를 들면, Pinckard 등 (1967) Clin . Exp . Immunol . 2: 331-340; Robbins 등 (1987) Diabetes 36: 838-845; Cleland 등 (1993) Crit . Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 10: 307-377 참고).

용어들 "대상," "개인," 및 "환자"는 상호교환적으로 사용될 수 있고 포유동물, 바람직하게는 인간 또는 비-인간 영장류, 뿐만 아니라 가축(예를 들면, 갯과 또는 고양이), 실험실 포유동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 햄스터, 기니아 피그), 및 농업 포유동물(예를 들면, 말, 소, 돼지, 양, 카프라, 등)을 지칭한다. 대상은 의사, 간호사, 또는 병원 내의 다른 의료계 종사자의 보호 하에, 외래 환자로서, 또는 임상 문맥 내에서, 인간(예를 들면, 성인 남성, 성인 여성, 청소년 남성, 청소년 여성, 남성 어린이, 여성 어린이)일 수 있다. 대안적으로, 상기 대상은 의사, 간호사, 또는 다른 의료계 종사자의 보호 또는 처방 하에 없을 수 있다.

도 1은 다양한 천연 발생 표준 아미노산에 대한 본원에 사용된 분류를 예시한다. 비-표준 및/또는 비-천연 발생 아미노산이 또한 이 분류에 속할 수 있음이 인식될 것이다.
도 2는 RHAMM HA 결합 영역 및 지방생성 하부도메인을 예시한다.
도 3a-3c는 인슐린(도 3a) 및 펩타이드 B(서열번호: 2)(도 3b 및 3c)에 대한 예시적인 용량-반응 지방생성 데이터를 제공한다.
도 4는 펩타이드 B(서열번호: 2) 처리에 반응하여 세포에서의 지질 축적을 보여주는 예시적인 현미경사진을 나타낸다.
도 5a-5b는 지방생성의 랫트 진피 피부 모델에서 펩타이드 B(서열번호: 2; 25-50μg/주사 부위)(도 5b) 또는 지방생성 항체(도 5a)를 이용한 실험으로부터 예시적인 결과를 나타낸다.
도 6은 누드 기니아 피그에서 펩타이드 B(서열번호: 2)의 시험의 예시적인 결과를 나타낸다. 피하 지방 축적의 증가는 이들 동물의 상부 등 상에서 그리고 두 위치에 펩타이드 B를 주사한 후 귀 지방 패드에서 관찰되었다. 화살표는 피하 지방 층을 가리킨다.
도 7은 다양한 펩타이드의 지방생성 활성을 보여주는 예시적인 데이터를 제공한다.
도 8a 및 8b는 6-mer 펩타이드 KSEVSK(서열번호: 3)에 대한 예시적인 용량-반응 지방생성 데이터를 보여준다.
도 9는 9-, 7-, 및 6-mer(각각 서열번호: 44, 42, 및 3) 처리에 대한 반응으로 세포에서의 지질 축적을 보여주는 예시적인 현미경사진을 제공한다.
도 10은 지방생성 효과에 대한 6-mer KSEVSK(서열번호: 3)의 생체내 시험의 예시적인 결과를 보여준다.
도 11a, 11b, 12a, 및 12b는 랫트 골수 간엽 줄기세포에서 펩타이드 B(도 11a 및 12a) 및 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3)(도 11b 및 12b)의 지방생성 효과를 보여주는 예시적인 결과를 제공한다.
도 13은 다분화능 간엽 줄기세포의 분화에 대한 계층의 도시적 예시를 제공한다.
도 14는 인간 지방 유래 줄기세포(h-ADSC)에 대한 지방생성 칵테일의 효과를 보여주는 예시적인 현미경사진을 제공한다.
도 15a는 h-ADSC에서 KSEVSK 6-mer("6-mer RHAMM 펩타이드")의 지방생성 효과를 보여주는 예시적인 현미경사진을 제공한다. 도 15b는 h-ADSC에서 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3) 및 B 펩타이드(서열번호: 2)의 지방생성 효과를 보여주는 예시적인 결과를 제공한다.
도 16은 h-ADSC에서 B 펩타이드(서열번호: 2)의 지방생성 효과를 보여주는 예시적인 현미경사진을 제공한다.
도 17 및 18은 h-ADSC에서 KSEVSK 6-mer(서열번호:3)의 지방생성 효과를 보여주는 예시적인 현미경사진을 제공한다..
도 19는 h-ADSC에서 펩타이드 B(서열번호: 2) 및 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3)의 지방생성 효과의 정량화를 보여주는 예시적인 결과를 제공한다.
도 20은 인간 피하 지방전구세포에서 지방생성 칵테일의 지방생성 효과를 보여주는 예시적인 현미경사진을 제공한다.
도 21은 인간 피하 지방전구세포에서 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3) 및 B-펩타이드(서열번호: 2)의 지방생성 효과를 보여주는 예시적인 현미경사진을 제공한다.
도 22-24는 인간 피하 지방전구세포에서 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3) 및 B 펩타이드(서열번호: 2)의 지방생성 효과를 보여주는 예시적인 현미경사진을 제공한다..
도 25는 인간 피하 지방전구세포에서 펩타이드 B(서열번호: 2) 및 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3)의 지방생성 효과의 정량화를 보여주는 결과를 보여주는 예시적인 데이터를 제공한다.
도 26-28은 인간 망상 섬유아세포(HRF) 및 인간 유두상 섬유아세포(HPF)에서 펩타이드 B(서열번호: 2) 및 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3)의 효과를 보여주는 예시적인 현미경사진을 제공한다.
도 29는 다양한 인간 세포 유형에서 펩타이드 B(서열번호: 2) 및 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3)를 시험하는 실험의 결과를 요약하는 도시적인 예시이다.
도 30은 3D 배양 시스템에서 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3)의 지방생성 효과를 보여주는 예시적인 현미경사진을 제공한다.
도 31은 랫트 모델에서 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3)의 지방생성 효과를 보여주는 예시적인 현미경사진을 제공한다..
도 32는 랫트 모델에서 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3)의 지방생성 효과를 보여주는 예시적인 데이터를 제공한다..
도 33 및 34는 KSEVSK 6-mer의 하나 또는 2개의 잔기가 알라닌 잔기로 대체된 펩타이드에 대한 예시적인 지방생성 활성 데이터를 보여준다.
도 35a 및 35b는 2개의 5-mer 펩타이드(KSEVS(서열번호 82), 도 35a) 및 (SEVSK(서열번호: 83), 도 35b)의 지방생성 활성을 예시하는 예시적인 데이터를 제공한다.
도 36 및 37은 몇 가지 KSEVSK-유사 지방생성 서열의 지방생성 효과를 보여주는 예시적인 데이터를 제공한다.
도 38 및 39는 몇 가지 STMMSR-유사 지방생성 서열의 지방생성 효과를 보여주는 예시적인 데이터를 제공한다.

상세한 설명

원하지 않는 내장 지방생성을 유도하지 않으면서 피하 지방생성을 촉진하는 펩타이드 및 모방체가 확인된다. 이들 펩타이드들은 다양한 화장 및 치료 적용에 유용하다. 특정한 이론에 구속되지 않으면서, 본원에 기재된 펩타이드는 히알루로난에 대한 RHAMM 결합 및/또는 RHAMM 생물학적 활성(예를 들면, CD44에 대한 결합)을 (완전히 또는 부분적으로) 억제함으로써 지방생성 활성을 달성하는 것으로 여겨진다. 본 발명의 펩타이드는 길이가 짧으며 단지 약 5 내지 31개의 아미노산을 갖는다. 상기 펩타이드는 바람직하게는 5 내지 14개의 아미노산, 및 더욱더 바람직하게는 6 내지 8개의 아미노산의 길이를 갖는다. 따라서, 상기 펩타이드는 지방생성 활성을 갖는 본 기술분야에 공지된 다른 펩타이드, 예컨대 P-1 펩타이드(펩타이드 P15-1; 서열번호: 1)보다 더 짧다. "짧은" 펩타이드는 생산 비용 감소, 면역원성 감소, 활성 증가, 및 국소로 적용될 때 피부 내로의 침투 증가와 같은 소정의 이점을 제공한다.

펩타이드 P15-1(서열번호: 1)은 히알루로난(HA)에 결합하는 능력을 갖는 펩타이드에 대해 랜덤 파아지 라이브러리를 스크리닝함으로써 분리되었다. RHAMM의 HA-결합 영역으로부터 유래된 펩타이드인 펩타이드 B(서열번호: 2)에 대해 P15-1(서열번호: 1) 펩타이드의 유사성을 평가하기 위해 정렬을 수행하였다. 이들 펩타이드는 히알루로난에 결합하며 RHAMM 서열과 유사하고 지방을 생성하는 것으로 나타났으므로, 펩타이드의 지방생성 특성을 담당하는 것으로 여겨지는 보존된 모티프를 확인할 수 있었다.

또한 본원에 기재된 RHAMM-억제성 펩타이드의 사용은 지방세포로의 분화를 강요하는 신호를 제공하는 것으로 여겨진다. 또한, RHAMM -/- 진피 섬유아세포는 매우 낮은 수준의 평활근 액틴을 발현하는데 이는 RHAMM이 또한 이 간엽 줄기세포 계통의 발달을 조절한다는 것을 가리킨다.

간엽 및 다른 피부 줄기세포에 대해, 피하 지방을 증가시키기 위해 본원에 기재된 RHAMM-억제성 펩타이드를 이용하는 독특한 이점은 그것의 효과가 선택적이라는 점이다. 따라서, 신체 기관에의 축적 증가가 질환과 연관되어 있는 내장 지방은 줄어드는 반면, 피하 지방은 증가한다. 이것은 흔치않은 효과이며 RHAMM의 효과를 두 가지 유형의 지방세포의 축적에 영향을 미치는 렙틴과 같은 다른 지방세포 촉진 인자와 차별화시킨다. 따라서, 본원에서 기재된 펩타이드는 내장 지방을 증가시키지 않을 것으로 여겨진다.

RHAMM의 또 다른 특성은 성인 인간 조직에서의 그것의 매우 제한된 발현과 관련된다. RHAMM은 생리적으로 저조하게 발현되거나 발현되지 않지만 조직 손상 또는 신생물성 상태로의 전환 후에 증가한다. 따라서, 본원에서 기재된 RHAMM-억제성 펩타이드는 낮은 독성을 가질 것이다. 사실상, RHAMM은 종양 촉진성, 염증 촉진성 기능을 가지므로, RHAMM 기능을 차단하는 것은 종양 부하를 갖거나 관절염과 같은 염증 기반의 질환을 갖는 자에게 유익할 수 있다고 여겨진다.

RHAMM 자극 펩타이드 .

RHAMM 생물학적 활성을 억제하고 그렇게 함으로써 피하 지방생성을 유도하거나 자극하는 펩타이드가 제공된다. 6 내지 31 개의 아미노산의 길이를 가지며, 아래의 아미노산 서열을 포함하는, 피하 지방생성을 자극하는 펩타이드가 제공된다:

X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶

여기서 X¹ 및 X⁶ 중 적어도 하나는 양으로 하전된 아미노산 또는 알라닌 (A) 및 X¹ 및 X⁶ 중 다른 하나는 양으로 하전된 아미노산, 류신 (L), 또는 알라닌 (A). X²는 세린 (S), 글루타민 (Q), 알라닌 (A), 글루타메이트 (E), 아스파라긴 (N), 프롤린 (P), 시스테인 (C), 라이신 (K), 아스파르테이트 (D), 트립토판 (W), 메티오닌 (M), 또는 트레오닌 (T). X³은 음으로 하전된 아미노산, 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 세린 (S), 라이신 (K), 아스파라긴 (N), 또는 트레오닌 (T). X⁴는 이소류신 (I), 발린 (V), 류신 (L), 아스파라긴 (N), 알라닌 (A), 세린 (S), 프롤린 (P), 트레오닌 (T), 또는 글루타민 (Q)이고; 및 X⁵는 세린 (S), 아스파르테이트 (D), 트레오닌 (T), 류신 (L), 알라닌 (A), 페닐알라닌 (F), 글루타메이트 (E), 아스파라긴 (N), 글리신 (G), 아르기닌 (R), 글루타민 (Q), 히스티딘 (H), 또는 이소류신 (I)이고;

단, X² 및 X⁵ 둘 모두는 글루타민 (Q)가 아니고, 단, X¹이 아르기닌 (R)일 때, X³은 라이신 (K)이 아니다.

또 하나의 피하 지방생성을 자극하는 펩타이드 방법이 또한 제공된다. 펩타이드는 5 내지 31 개의 아미노산의 길이를 가지며 아래의 서열을 포함한다

X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶

여기서 X¹ 및 X⁶ 중 적어도 하나는 양으로 하전된 아미노산이고, 그리고 X¹ 및 X⁶ 중 다른 하나는 양으로 하전된 아미노산, 류신 (L) 또는 그것을 위한 보존적 치환, 알라닌 (A) 또는 그것을 위한 보존적 치환이거나, 부재이다. X²-X³-X⁴-X⁵는 아미노산 서열 SEVS (서열번호: 50)과 적어도 50% 서열 동일성을 가지며 4 내지 8 개의 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열이다. 펩타이드의 길이는 바람직하게는 적어도 6 개의 아미노산이다.

이들 펩타이드의 길이는 바람직하게는 21 개 이하의 아미노산이고, 더 바람직하게는 14 개 이하의 아미노산이고, 그리고가장 바람직하게는 8 개 이하의 아미노산이다. 예를 들면, 펩타이드의 길이는 13 개의 아미노산, 12 개의 아미노산, 11 개의 아미노산, 10 개의 아미노산, 9 개의 아미노산, 8 개의 아미노산, 7 개의 아미노산, 또는 6 개의 아미노산일 수 있다. 본원에서 기재된 펩타이드에 대한 바람직한 길이는 6 내지 8 개의 아미노산이다.

둘 모두의 X¹ 및 X⁶은 양으로 하전된 아미노산일 수 있다.

X¹는 바람직하게는 라이신 (K)이다.

X⁶은 바람직하게는 라이신 (K) 또는 아르기닌 (R)이고, 그리고 더 바람직하게는 라이신 (K)이다.

예를 들면, 둘 모두의 X¹ 및 X⁶은 라이신 (K)일 수 있다.

대안적으로, 둘 모두의 X¹ 및 X⁶은 알라닌 (A)일 수 있다.

X²는 바람직하게는 세린 (S), 글루타민 (Q), 알라닌 (A), 글루타메이트 (E), 아스파라긴 (N), 프롤린 (P), 시스테인 (C), 라이신 (K), 아스파르테이트 (D), 트립토판 (W), 또는 메티오닌 (M)이다. X²는 바람직하게는 세린 (S) 또는 글루타민 (Q)이다. 더 바람직하게는, X²는 세린 (S)이다.

X³은 음으로 하전된 아미노산, 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 세린 (S), 라이신 (K), 또는 아스파라긴 (N)일 수 있다. 예를 들면, X³은 음으로 하전된 아미노산 (예를 들면, 글루타민 (E), 아스파르테이트 (D))일 수 있다. X³은 바람직하게는 글루타민 (E)이다.

X⁴는 이소류신 (I), 발린 (V), 류신 (L), 아스파라긴 (N), 알라닌 (A), 세린 (S), 프롤린 (P), 또는 트레오닌 (T)일 수 있다. 예를 들면, X⁴는 이소류신 (I), 발린 (V), 또는 류신 (L)일 수 있다. X⁴는 바람직하게는 발린이다.

X⁵는 세린 (S), 아스파르테이트 (D), 트레오닌 (T), 류신 (L), 알라닌 (A), 페닐알라닌 (F), 글루타메이트 (E), 아스파라긴 (N), 글리신 (G), 아르기닌 (R), 글루타민 (Q), 또는 히스티딘 (H)일 수 있다. 예를 들면, X⁵는 세린 (S), 아스파르테이트 (D), 트레오닌 (T), 또는 글루타메이트 (E)일 수 있다. X⁵는 바람직하게는 세린 (S)이다.

예를 들면, X¹는 라이신 (K)일 수 있고, X²는 세린(S)일 수 있고, X³는 글루타민 (E)일 수 있고, X⁴는 발린 (V)일 수 있고, X⁵는 세린 (S)일 수 있고, 그리고 X⁶는 라이신 (K)일 수 있다.

예를 들면, 펩타이드의 아미노산 서열은 KSEVSK (서열번호: 3), KQEVSK (서열번호: 4), KQEVDK (서열번호: 5), KQENTK (서열번호: 6), KSEVLK (서열번호: 7), KQDVSK (서열번호: 8), KQELDR (서열번호: 9), LEEIFK (서열번호: 10), LSELEK (서열번호:11), KSEISK (서열번호: 12), KNEVSK (서열번호: 13), KSEVTK (서열번호: 14), KSEVNK (서열번호: 15), KSDVSK (서열번호:16), KSQVSK (서열번호: 17), KPEVSK (서열번호: 18), KSEVGK (서열번호: 19), KSDSSK (서열번호:20), KSSPSK (서열번호: 21), KSEASK (서열번호: 22), KSELRK (서열번호:23), KCEVSK (서열번호: 24), KSKPSK (서열번호:25), KKEVSK (서열번호: 26), KEEVSK (서열번호: 27), KSETSK (서열번호: 28), KSNVSK (서열번호: 29), KDEVSK (서열번호:30), KSEVEK (서열번호: 31), KSAVSK (서열번호: 32), KWEVSK (서열번호: 33), KMEVSK (서열번호: 34), KSEVQK (서열번호:35), KSEVHK (서열번호: 36), KSSVSK (서열번호: 37), ASEVSK (서열번호: 38), KAEVSK (서열번호: 39), KSEVAK (서열번호:40), KSEVSA (서열번호: 41), ASEVSA (서열번호: 93), KAEVAK (서열번호: 94), KSAASK (서열번호: 95), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 펩타이드의 아미노산 서열은 KSEVSK (서열번호: 3), ASEVSA (서열번호: 93), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

바람직하게는 , 펩타이드의 아미노산 서열은 RQKVLK (서열번호: 84) 및/또는 LQATQK (서열번호:85)를 포함하지 않는다.

펩타이드의 아미노산 서열은 하기로 이루어질 수 있다: KSEVSK (서열번호: 3), KQEVSK (서열번호:4), KQEVDK (서열번호: 5), KQENTK (서열번호: 6), KSEVLK (서열번호: 7), KQDVSK (서열번호: 8), KQELDR (서열번호: 9), LEEIFK (서열번호: 10), LSELEK (서열번호:11), KSEISK (서열번호: 12), KNEVSK (서열번호: 13), KSEVTK (서열번호: 14), KSEVNK (서열번호: 15), KSDVSK (서열번호:16), KSQVSK (서열번호: 17), KPEVSK (서열번호: 18), KSEVGK (서열번호: 19), KSDSSK (서열번호:20), KSSPSK (서열번호: 21), KSEASK (서열번호: 22), KSELRK (서열번호:23), KCEVSK (서열번호: 24), KSKPSK (서열번호:25), KKEVSK (서열번호: 26), KEEVSK (서열번호: 27), KSETSK (서열번호: 28), KSNVSK (서열번호: 29), KDEVSK (서열번호:30), KSEVEK (서열번호: 31), KSAVSK (서열번호: 32), KWEVSK (서열번호: 33), KMEVSK (서열번호: 34), KSEVQK (서열번호:35), KSEVHK (서열번호: 36), KSSVSK (서열번호: 37), ASEVSK (서열번호: 38), KAEVSK (서열번호: 39), KSEVAK (서열번호:40), KSEVSA (서열번호: 41), ASEVSA (서열번호: 93), KAEVAK (서열번호:94), KSAASK (서열번호: 95), LKSEVSK (서열번호: 42), QLKSEVSK (서열번호: 43), SQLKSEVSK (서열번호:44), NSQLKSEVSK (서열번호: 45), ENSQLKSEVSK (서열번호: 46), DENSQLKSEVSK (서열번호: 47), KDENSQLKSEVSK (서열번호:48), LKDENSQLKSEVSK (서열번호: 49), 또는 KLKDENSQLKSEVSK (서열번호: 2). 바람직하게는 , 펩타이드의 아미노산 서열은 하기로 이루어진다: KSEVSK(서열번호: 3), ASEVSA (서열번호: 93), LKSEVSK (서열번호: 42), QLKSEVSK (서열번호:43), SQLKSEVSK (서열번호: 44), 및 KLKDENSQLKSEVSK (서열번호: 2). 더 바람직하게는 , 펩타이드의 아미노산 서열은 하기로 이루어진다: KSEVSK(서열번호: 3).

임의의 상기 펩타이드에서, 펩타이드는 임의로 임의의 하나 이상의 하기 아미노산 서열을 포함하지 않는다: KLKDENSQLKSEVSK (서열번호: 2); QLKSEVSKL (서열번호: 100); KQKIKHVVKLKDENSQLKSEVSKLRCQLAKKK (서열번호: 101); KQKIKHVVKLKDENSQLKSEVSKLRSQLVKRK (서열번호: 102); KLKDENSQLKSEVSKLRSQLVK (서열번호: 103); 또는 KQKIKHVVKLKDENSQLKSEVSKLRSQLVKRKQNELRLQGELDKAL (서열번호: 104).

X²-X³-X⁴-X⁵의 길이는 4 내지 6 개의 아미노산일 수 있고, 그리고 바람직하게는 4 개의 아미노산이다.

X²-X³-X⁴-X⁵는 아미노산 서열 SEVS (서열번호: 50)와 적어도 약 75% 서열 동일성을 가질 수 있다.

피하 지방생성을 자극하는 추가의 펩타이드가 또한 제공된다. 피하 지방생성을 자극하는 펩타이드가 제공되고, 상기 펩타이드는 6 내지 13 개의 아미노산의 길이를 가지며 아래 서열을 포함한다:

Z¹-Z²-Z³-Z⁴-Z⁵-Z⁶

여기서 Z¹은 세린 (S) 또는 그것을 위한 보존적 치환이고 Z²는 소수성 아미노산이고 Z³은 임의의 아미노산이고 Z⁴는 소수성 아미노산이고 Z⁵는 세린 (S), 아르기닌 (R), 또는 그것을 위한 보존적 치환이고 그리고 Z⁶은 하전된 아미노산 또는 세린 (S)이고 단, Z¹, Z² 및 Z⁴ 모두는 글리신 (G)이 아니고, 단, Z¹은 글루타민 (Q)이 아니고, 그리고 단, Z²는 히스티딘 (H)이 아니다.

또 하나의 피하 지방생성을 자극하는 펩타이드가 또한 제공되고, 상기 펩타이드는 6 내지 13 개의 아미노산의 길이를 가지며 아래 서열을 포함한다

Z¹-Z²-Z³-Z⁴-Z⁵-Z⁶

여기서 Z¹는 세린 (S) 또는 그것을 위한 보존적 치환이고 Z⁶은 하전된 아미노산 또는 세린 (S)이다. Z²-Z³-Z⁴-Z⁵는 아미노산 서열 TMMS (서열번호: 67)과 적어도 50% 서열 동일성을 가지며 2 내지 8 개의 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열이다.

이들 펩타이드의 길이는 바람직하게는 8 개 이하의 아미노산이다. 펩타이드의 길이는 13 개의 아미노산, 12 개의 아미노산, 11 개의 아미노산, 10 개의 아미노산, 9 개의 아미노산, 8 개의 아미노산, 7 개의 아미노산, 또는 6 개의 아미노산일 수 있다. 본원에서 기재된 펩타이드에 대한 바람직한 길이는 6 내지 8 개의 아미노산이다.

Z¹는 세린 (S), 시스테인 (C), 알라닌 (A), 글리신 (G), 트레오닌 (T), 티로신 (Y), 또는 메티오닌 (M)일 수 있다. Z¹은 바람직하게는 세린 (S)이다.

Z²는 소수성 비방향족 아미노산일 수 있다. 예를 들면, Z²는 트레오닌 (T), 이소류신 (I), 발린 (V), 류신 (L), 알라닌 (A), 글리신 (G), 시스테인 (C), 또는 메티오닌 (M)일 수 있다. Z²은 바람직하게는 트레오닌 (T) 또는 이소류신 (I)이고, 그리고 더 바람직하게는 트레오닌 (T)이다.

Z³는 소수성 비방향족 아미노산, 소수성 극성 아미노산, 양으로 하전된 아미노산, 또는 프롤린 (P)일 수 있다. 예를 들면, Z³는 메티오닌 (M), 발린 (V), 글리신 (G), 트레오닌 (T), 아르기닌 (R), 류신 (L), 프롤린 (P), 또는 그것을 위한 보존적 치환일 수 있다. Z³은 바람직하게는 메티오닌 (M), 발린 (V), 글리신 (G), 트레오닌 (T), 아르기닌 (R), 류신 (L), 또는 프롤린 (P)이다. Z³은 더 바람직하게는 메티오닌 (M), 류신 (L), 또는 그것을 위한 보존적 치환이고, 그리고 더욱 더 바람직하게는 메티오닌(M)이다.

Z⁴는 소수성 비방향족 아미노산 또는 소수성 무극성 아미노산일 수 있다. 예를 들면, X⁴는 메티오닌(M), 류신 (L), 발린 (V), 또는 그것을 위한 보존적 치환일 수 있다. Z⁴은 바람직하게는 메티오닌 (M), 류신 (L), 또는 발린 (V)이고, 그리고 더 바람직하게는 메티오닌 (M)이다.

Z⁵는 아르기닌 (R) 또는 그것을 위한 보존적 치환일 수 있다. 대안적으로, X⁵는 세린 (S) 또는 그것을 위한 보존적 치환일 수 있다. X⁵은 바람직하게는 세린 (S)이다.

X⁶는 아르기닌 (R) 또는 그것을 위한 보존적 치환 또는 세린 (S)일 수 있다. X⁶은 바람직하게는 아르기닌 (R)이다.

펩타이드의 아미노산 서열은 STMMSR (서열번호: 51), SIMMSR (서열번호: 52), STLMSR (서열번호: 53), STVMSR (서열번호: 54), STGLSR (서열번호:55), STTMSR (서열번호: 56), STRMSR (서열번호: 57), STLMRR (서열번호: 58), STPVSR (서열번호: 59), STMMRS (서열번호: 96), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 펩타이드의 아미노산 서열은 STMMSR (서열번호: 51), STMMRS (서열번호: 96), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

펩타이드의 아미노산 서열 바람직하게는 QLVKRK (서열번호: 86), QKVLKR (서열번호: 87), GGRGRR (서열번호: 88), GGRGGR (서열번호: 89), GGGGGR (서열번호: 90), 및/또는 RSHKTRSHH (서열번호: 98)를 포함하지 않는다.

펩타이드의 아미노산 서열은 STMMSR (서열번호: 51), SIMMSR (서열번호: 52), STLMSR (서열번호:53), STVMSR (서열번호: 54), STGLSR (서열번호: 55), STTMSR (서열번호: 56), STRMSR (서열번호: 57), STLMRR (서열번호:58), STPVSR (서열번호: 59), STMMSRS (서열번호: 60), STMMSRSH (서열번호: 61), STMMSRSHK (서열번호: 62), STMMSRSHKT (서열번호:63), STMMSRSHKTR (서열번호: 64), STMMSRSHKTRS (서열번호: 65), STMMSRSHKTRSH (서열번호: 66), STMMRS (서열번호: 96), 또는 STMMRSH (서열번호: 97)로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 펩타이드의 아미노산 서열은 STMMSR (서열번호: 51), STMMSRSHK (서열번호: 62), 또는 STMMRSH (서열번호: 97)로 이루어질 수 있다.

펩타이드는 하기 아미노산 서열 중 임의의 하나 이상을 임의로 포함하지 않는다: STMMSRSHKTRSCHH (서열번호: 105); STMMSRSHKTRSHH (서열번호: 106); STMMSRSHKTRSHHV (서열번호: 107); STMMRSHKTRSHHV (서열번호: 108); 또는 CSTMMSRSHKTRSHHV (서열번호: 109).

Z²-Z³-Z⁴-Z⁵의 길이는 3 내지 7 개의 아미노산, 예를 들면 3 내지 6 개의 아미노산이고, 그리고 바람직하게는 4 개의 아미노산이다.

Z²-Z³-Z⁴-Z⁵는 아미노산 서열 TMMS와 적어도 약 75% 서열 동일성을 가질 수 있다.

임의의 상기-기재된 펩타이드에서, 펩타이드는 실질적으로 알파-나선 형태를 가질 수 있다.

임의의 상기-기재된 펩타이드는 베타-펩타이드일 수 있다.

임의의 상기-기재된 펩타이드는 레트로 형태이고, 인버소 형태, 또는 레트로-인버소 형태일 수 있다.

임의의 상기-기재된 펩타이드에서, 펩타이드 중 모든 아미노산은 l 개의 아미노산일 수 있다. 대안적으로, 펩타이드는 1 이상의 D 아미노산을 포함할 수 있거나, 펩타이드 중 모든 아미노산은 D 아미노산일 수 있다. 따라서, 펩타이드는 l 개의 아미노산 및 D 아미노산의 혼합물을 포함할 수 있다.

펩타이드 변이체

본원에서 기재된 펩타이드는 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 아미노산, 즉, 펩타이드 등배체로 구성될 수 있고, 20 개의 유전자-인코딩된 표준 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다. 펩타이드는 천연 과정, 예컨대 후번역 처리, 또는 당해기술에서 공지되어 있는 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 변형은 펩타이드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카복실 말단을 포함하는 펩타이드 어디에서도 일어날 수 있다. 동일한 유형의 변형은 펩타이드 중 몇 개의 표면에서 동일한 또는 가변 정도로 존재할 수 있다. 또한, 펩타이드는 많은 유형의 변형을 함유할 수 있다.

펩타이드는, 예를 들면, 유비퀴틴화의 결과로서 분지될 수 있고, 분지화 있거나 없는 고리형일 수 있다. 고리형, 분지된, 및 분지된 고리형 펩타이드는 후번역 자연적 과정으로부터 생길 수 있거나 합성 방법에 의해 만들어 질 수 있다. 변형은 하기를 포함한다: 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 결합, 헤미 모이어티의 공유 결합, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 포스포티딜이노시톨의 공유 결합, 가교결합, 고리화, 디설파이드 결합 형성, 데메틸화, 공유 교차-링크의 형성, 시스테인-시스테인 디설파이드 결합의 형성, 파이로글루타메이트의 형성, 프로밀화, 감마-카복실화, 당화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백분해 처리, 인산화, 프레닐화, 팔미토일화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아미노산의 단백질에의 전달-RNA 매개된 부가 예컨대 아르기닐화, 및 유비퀴틴화. (참고, 예를 들면, Creighton 등 (1993) Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York; Johnson, ed. (1983) Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, Academic Press, New York; Seifter 등 (1990) Meth . Enzymol., 182: 626-646; Rattan 등(1992) Ann. N.Y. Acad . Sci ., 663: 48-62; 등).

단백질 공학 및 재조합 DNA 기술의 공지된 방법을 사용하여, 변이체는 본원에서 기재된 펩타이드의 특성을 개선하거나 변경하기 위해 산출될 수 있다. 그와 같은 변이체는 활성에 대한 효과를 거의 갖지 않도록 당해기술에서 잘 알려진 일반적인 규칙에 따라 선택된 결실, 삽입, 반전, 반복체, 및 치환 (예를 들면, 보존적 치환)을 포함한다.

펩토이드가 또한 고려되고, 상기 펩토이드은 본질적으로 상응하는 모노머 서열을 가지며, 여기서 천연 아미노산은, N-치환된 글리신 유도체가 친수성, 소수성, 극성, 등에서 최초 아미노산을 닮았으면 N-치환된 글리신 유도체에 의해 대체된다. 하기는 예증적이지만 비제한적인 N-치환된 글리신 재배치이다: N-(l-메틸프로프-1-일)글리신→이소류신 (I), N-(프로프-2-일)글리신→발린 (V), N-벤질글리신→페닐알라닌 (F), N-(2-하이드록시에틸)글리신→세린 (S), 등. 본 발명의 어떤 측면에서, 치환은 "정확"할 필요는 없다. 따라서 예를 들면, 본 발명의 어떤 측면에서, N-(2-하이드록시에틸)글리신은 S, T, C, 및/또는 M을 대신할 수 있고; N-(2-메틸프로프-1-일)글리신은 V, L, 및/또는 I를 대신할 수 있고; N-(2-하이드록시에틸)글리신은 T 또는 S을 대신하도록 사용될 수 있다. 일반적으로, N-하이드록시알킬-치환된 글리신을 사용하여 임의의 극성 아미노산을 대신할 수 있고, N-벤질- 또는 N-아랄킬-치환된 글리신을 사용하여 임의의 방향족 아미노산을 대신할 수 있고, N-알킬-치환된 글리신 예컨대 N-부틸글리신을 사용하여 임의의 무극성 아미노산 (예를 들면, L, V, I, 등)을 대신할 수 있고, 그리고 N-(아미노알킬)글리신을 사용하여 임의의 염기성 극성 아미노산 (예를 들면, L 및 R)을 대신할 수 있다.

작용화 및 보호 그룹.

다양한 본원에서 기재된 펩타이드는 보호 그룹 없이 보져지지만, 1 이상의 보호 그룹을 보유할 수 있다. 보호 그룹은 펩타이드의 C- 및/또는 N-말단 및/또는 펩타이드의 1 이상의 내부 잔기에 커플링될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 본원에서 기재된 펩타이드의 임의의 것은, 예를 들면, 아미노 말단을 보호하는 아실 그룹 및/또는 카복실 말단을 보보하는 아미드 그룹을 보유할 수 있다. 이들 차단 그룹은 펩타이드의 나선-형성 경향을 향상시킨다.

특정한 이론엥 구속되지 않으면서, 특히 펩타이드의 아미노 및/또는 카복실 말단의 봉쇄는 생체외 및/또는 생체내 펩타이드 안정성을 개선할 수 있고/거나 국소로 투여될 때 피부 침투를 개선할 수 있는 것으로 믿는다.

적합한 보호 그룹은, 비제한적으로, 아세틸, 아미드, 및 알킬 그룹을 포함하고, 아세틸 및 알킬 그룹은 N-말단 보호에 대해 특히 바람직하고 아미드 그룹은 카복실 말단 보호에 대해 바람직하다. 알킬 보호 그룹은 지방산 예컨대 프로피오닐, 포르밀, 및 다른 것들에서와 같이 알킬 사슬을 비제한적으로 포함한다. 예를 들면, 알킬은 3- 내지 20-탄소 알킬일 수 있다. 카복실 보호 그룹은 include 아미드, 에스테르, 및 에테르-형성 보호 그룹을 포함한다. 그와 같은 차단 그룹은 다양한 길이의 알킬 그룹, 예를 들면, 식을 갖는 그룹: CH₃-(CH₂)_n-CO- (여기서 n은 약 1 내지 약 20, 바람직하게는 약 1 내지 약 16 또는 18, 더 바람직하게는 약 3 내지 약 13, 및 가장 바람직하게는 약 3 내지 약 10의 범위이다)을 포함한다.

다른 적합한 보호 그룹은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 플루오레닐메틸옥시카보닐 (FMOC), t-부톡시카보닐 ( t -BOC), 9-플루오렌아세틸, 1-플루오렌카복실, 9-플로렌카복실, 9-플루오레논-1-카복실, 벤질옥시카보닐, 크산틸 (Xan), 트리틸 (Trt), 4-메틸트리틸 (Mtt), 4-메톡시트리틸 (Mmt), 4-메톡시-2,3,6-트리메틸-벤젠설포닐 (Mtr), 메시틸렌-2-설포닐 (Mts), 4,4-디메톡시벤즈하이드릴 (Mbh), 토실 (Tos), 2,2,5,7,8-펜타메틸 크로만-6-설포닐 (Pmc), 4-메틸벤질 (MeBzl), 4-메톡시벤질 (MeOBzl), 벤질옥시 (BzlO), 벤질 (Bzl), 벤조일 (Bz), 3-니트로-2-피리딘ul페닐 (Npys), 1-(4,4-디멘틸-2,6-디악소사이클로헥실리덴)에틸 (Dde), 2,6-디클로로벤질 (2,6-DiCl-Bzl), 2-클로로벤질옥시카보닐 (2-Cl-Z), 2-브로모벤질옥시카보닐 (2-Br-Z), 벤질옥시메틸 (Bom), 사이클로헥실옥시 (cHxO),t-부톡시메틸 (Bum), t-부톡시 (tBuO), t-부틸 (tBu), 아세틸 (Ac), 및 트리플루오로아세틸 (TFA).

보호/차단 그룹은 그와 같은 그룹을 펩타이드의 적절한 잔기에 커플링하는 방법에서와 같이 당해분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다 (참고, 예를 들면, 그린 등, (1991) Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc. Somerset, N.J.). 예를 들면, 아세틸화는, 펩타이드가 아세트산 무수물을 사용하여 수지 상에 있을 때 합성 동안에 달성될 수 있다. 아미드 보호는 합성을 위해 적절한 수지의 선택에 의해 달성될 수 있다. 펩타이드의 합성 동안에, 링크 아미드 수지가 사용될 수 있다. 합성의 완료 후에, 산성 이작용성 아미노산 예컨대 Asp 및 Glu, 염기성 아미노산 Lys, 및 Tyr의 하이드록실에 대한 반영구적 보호 그룹 모두는 동시에 제거된다. 산성 처리를 사용하여 그와 같은 수지로부터 방출된 펩타이드는 모든 다른 보호 그룹의 동시의 제거와 함께 아세틸로 보호된 N-말단 및 NH₂로 보호된 카복시-말단을 갖는다.

펩타이드는 1 이상의 d-아미노산 (레보보다는 덱스트로)을 포함할 수 있다. 펩타이드의 모든 다른, 또는 심지어 모든 아미노산 (예를 들면, 모든 거울상이성질체 아미노산)는 d-아미노산일 수 있다. 예를 들면, 적어도 50%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 심지어 모든 거울상이성질체 아미노산은 d-아미노산일 수 있다.

펩타이드는 생체이용률을 증가시키기 위해 폴리머 (예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 셀룰로오스 또는 변형된 셀룰로오스)로 또한 작용화될 수 있다.

펩타이드 모방체 .

펩타이드 유사체는 템플레이트 펩타이드의 특성과 비숫한 특성을 갖는 비-펩타이드 약물로서 약제학적 산업에서 통상적으롤 사용된다. 이들 유형의 비-펩타이드 화합물은 "펩타이드 모방체" 또는 "펩타이드모사체" (Fauchere (1986) Adv . Drug Res. 15: 29; Veber 및 Freidinger (1985) TINS p.392; 및 Evans 등 (1987) J. Med . Chem . 30: 1229)라 칭하고 컴퓨터화된 분자 모델링의 도움으로 보통 발달된다. 본 발명의 펩타이드와 구조적으로 유사한 펩타이드 모방체는 동등한 치료 또는 예방 효과를 얻도록 사용될 수 있다.

펩타이드모사체는 펩타이드 (예를 들면, KSEVSK (서열번호: 3))와 구조적으로 유사하지만, 당해분야에서 공지되고 하기 참조에서 추가로 방법에 의해 연결에 의해 임의로 치환된 1 이상의 펩타이드 연결 예컨대 -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH- (시스 및 트랜스), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂-, 또는 -CH₂SO-을 갖는다: Spatola (1983) p. 267 in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York,; Spatola (1983) Vega Data 1(3) Peptide Backbone Modifications. (총평); Morley (1980) Trends Pharm Sci pp. 463-468 (총평); Hudson 등 (1979) Int J Pept Prot Res 14:177-185 (-CH₂NH-, -CH_2-CH₂-); Spatola 등 (1986) Life Sci 38:1243-1249 (-CH₂-S-); Hann, (1982) J Chem Soc Perkin Trans I 307-314 (-CH=CH-, 시스 및 트랜스); Almquist 등 (1980) J Med Chem . 23: 1392-1398 (-COCH₂-); Jennings-White 등 (1982) Tetrahedron Lett. 23: 2533 (-COCH₂-); Szelke 등 (1982) 유럽 출원 EP 45665 (-CH(OH)CH₂-); Holladay 등 (1983) Tetrahedron Lett 24:4401-4404 (-C(OH)CH₂-); 및 Hruby (1982) Life Sci ., 31:189-199 (-CH₂-S-)).

특히 유용한 비-펩타이드 연결은 -CH₂NH-이다. 그와 같은 펩타이드 모방체는 펩타이드에 대한 유의미한 이점, 예컨대 더 경제적 생산, 더 큰 화학적 안정성, 증대된 약리적 특성 (반감기, 흡수, 효력, 효능, 등), 및/또는 감소된 항원성을 가질 수 있다.

본원에서 기재된 모티프 또는 실질적으로 동일한 모티프를 포함하는 본원에서 기재된 펩타이드 또는 구속된 펩타이드 (고리화된 펩타이드 포함)의 순환 치환은, 예를 들면, 펩타이드를 고리화하는 분자내 디설파이드 브릿지를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 부가하여 당해분야에서 공지된 방법에 의해 산출될 수 있다 (Rizo 및 Gierasch (1992) Ann. Rev. Biochem. 61: 387).

펩타이드 제조.

본 발명의 다양한 측면에서, 본원에서 기재된 펩타이드는 표준 화학적 펩타이드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있거나, 특히 펩타이드가 d-아미노산 잔기를 포함하지 않는 경우, 펩타이드는 재조합으로 발현될 수 있다. 1 이상의 d-아미노산을 함유하는 폴리펩타이드가 재조합으로 발현되는 경우, 숙주 유기체 (예를 들면 박테리아, 식물, 진균 세포, 등)는 아미노산 중 하나 이상이 배타적으로 d-형태로 유기체에 제공되는 환경에서 배양될 수 있다. 이때 그와 같은 시스펨에서 재조합으로 발현된 펩타이드는 이들 d-아미노산들을 편입한다. 또한, d-아미노산은 d-아미노산을 인식하는 변형된 아미노 아실-tRNA 합성효소를 사용하여 재조합으로 발현된 펩타이드에 편입될 수 있다.

(d- 및/또는 l-아미노산을 함유하는) 펩타이드는 당해분야의 숙련가에게 공지된 다수의 유체 또는 고체상 펩타이드 합성 기술 중 어느 것에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 서열의 C-말단 아미노산이 불용성 지지체에 부착되고 그 다음 서열에 잔여 아미노산이 순차적으로 부가되는 고체상 합성이 본 발명의 폴리펩타이드의 화학적 합성을 위해 바람직한 방법이다. 고체상 합성을 위한 기술은 당해분야의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면, Barany 및 Merrifield (1963) Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A.; Merrifield 등 (1963) J. Am. Chem . Soc ., 85: 2149-2156, 및 Stewart 등 (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill에 기재되어 있다.

펩타이드는 고형 지지체로서 벤즈하이드릴아민 수지 (Beckman Bioproducts, 0.59 mmol의 NH₂/g 수지)를 사용하여 고체상 펩타이드 합성 절차에 의해 합성될 수 있다. 카복시 말단 아미노산 (예를 들면, t-부틸카보닐-Phe)은 4-(옥시메틸)펜아세틸 그룹을 통해 고형 지지체에 부착된다. 이것은 종래의 벤질 에스테르 연결보다 더 안정한 연결이지만, 완성된 펩타이드는 여전히 수소화에 의해 절단될 수 있다. 수소 공여체로서 포름산을 사용한 수소전이반응 (Transfer hydrogenation)이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다.

펩타이드, 특히 d-아미노산을 포함하는 펩타이드의 화학적 합성에서 상기 합성은 통상적으로 원하는 전장 생성물 이외에 수많은 끝이 잘린 펩타이드를 생산함이 주지된다. 따라서, 펩타이드는 전형적으로 예를 들면, HPLC를 사용하여 정제된다.

d-아미노산, 베타 아미노산, 비-천연 아미노산, 비-표준 아미노산, 등은 화학적 합성에서 적절하게 유도된 아미노산 잔기를 사용하여 간단히 펩타이드의 1 이상의 위치에 편입될 수 있다. 고체상 펩타이드 합성을 위한 변형된 잔기는 수많은 공급자 (참고, 예를 들면, Advanced Chem Tech, Louisville; Nova Biochem, San Diego; Sigma, St Louis; Bachem California Inc., Torrance, 등)로부터 상업적으로 이용가능하다. d-형 아미노산 및/또는 그렇지 않으면 변형된 아미노산은 완전히 생략되거나 바라던 대로 펩타이드의 임의의 위치에 편입될 수 있다.

펩타이드가 재조합 발현 시스템을 사용하여 합성되는 경우, 원하는 펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열이 전형적으로 생성되고, 숙주세포에서 프로모터의 제어 하에 펩타이드를 발현시키는 발현 카세트에 둔다. 발현된 펩타이드를 단리하고, 필요하다면, 재생한다. 본 발명의 펩타이드를 인코딩하는 DNA는 예를 들면, 적절한 서열의 클로닝 및 제한 또는 직접적인 화학적 합성을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이 핵산은 적절한 발현 대조군 서열 (예를 들면 프로모터, 인핸서, 등)을 함유하고, 임의로, 1 이상의 선별 마커 (예를 들면 항생제 내성 유전자)를 함유하는 적절한 벡터 내로 쉽게 결찰될 수 있다.

본원에서 기재된 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은, 비제한적으로, E. 콜라이, 다른 박테리아 숙주, 효모, 진균류, 및 다양한 고등 진핵 세포 예컨대 곤충 세포 (예를 들면 SF3), COS, CHO 및 HeLa 세포주 및 골수 세포주를 포함하는 다양한 숙주세포에서 발현될 수 있다. 재조합 단백질 유전자는 전형적으로 각 숙주에 대해 적절한 발현 대조군 서열에 작동가능하게 연결될 것이다. E. 콜라이의 경우, 이것은 프로모터 예컨대 T7, trp, 또는 람다 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 바람직하게는 전사 종료 신호를 포함할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 예증적인 대조군 서열은 프로모터, 및 종종 인핸서 (예를 들면, 면역글로불린 유전자, SV40, 사이토메갈로바이러스, 등으로부터 유도된 인핸서), 및 폴리아데닐화 서열, 및 스플라이스 공여체 및 수용체 서열을 포함할 수 있다.

플라스미드는 잘 알려진 방법 예컨대 E. 콜라이의 경우 염화칼슘 전환, 포유동물 세포의 경우 칼슘 포스페이트 처리 또는 전기천공에 의해 선택된 숙주세포로 이동될 수 있다. 플라스미드에 의해 형질전환된 세포는 플라스미드에 포함된 유전자, 예컨대 amp, gpt, neo 및 hyg 유전자에 의해 부여되는 항생제에 대한 내성에 의해 선택될 수 있다.

일단 발현되면, 재조합 펩타이드는 비제한적으로, 암모늄 설페이트 침전, 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 및 겔 전기영동을 포함하는 당해기술의 표준 절차에 따라서 정제될 수 있다 (참고, 일반적으로, R. Scopes, (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y.). 적어도 약 90 내지 95% 동질성을 갖는 실질적으로 순수한 조성물이 바람직하며, 98 내지 99% 또는 그 초과의 동질성이 가장 바람직하다.

당해분야의 숙련가는, 화학적 합성, 생물학적 발현, 또는 정제 후, 펩타이드가 원하는 원상태 형태와 실질적으로 상이한 형태를 가질 수 있음을 인식할 것이다. 이 경우에, 펩타이드를 변성시키고 환원시키고 그 다음 분자를 바람직한 형태로 리폴딩시키는 것이 필요할 수 있다. 단백질을 환원하고 변성시키고 리폴딩을 유도하는 방법은 당해분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다 (참고, 예를 들면, Debinski 등 (1993) J. Biol . Chem ., 268: 14065-14070; Kreitman 및 Pastan (1993) Bioconjug. Chem ., 4: 581-585; 및 Buchner, 등, (1992) Anal. Biochem ., 205: 263-270). Debinski 등은, 예를 들면, 구아니딘-DTE에서 포함체 단백질의 변성 및 환원을 기재한다. 이때 단백질은 산화된 글루타티온 및 L-아르기닌을 함유하는 산화환원 버퍼에서 리폴딩된다.

숙련가는 변형이 생물학적 활성을 감소시키지 않으면서 본 발명의 펩타이드에 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 일부 변형은 클로닝, 발현, 또는 융합 단백질에 표적 분자의 편입을 용이하게 하기 위해 이루어질 수 있다. 그와 같은 변형은 당해분야의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 시작 부위를 제공하기 위한 아미노 말단에 부가된 메티오닌, 또는 편리하게 위치한 제한 부위 또는 종료 코돈 또는 정제 서열을 생성하기 위해 양쪽 말단에 배치된 추가의 아미노산 (예를 들면, 폴리 His)을 포함한다.

약제학적 및 화장품 제형

본원에서 기재된 임의의 하나 이상의 펩타이드 및 약제학적으로 또는 화장용으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 및 화장품 조성물이 또한 제공된다. 예를 들면, 약제학적 또는 화장품 조성물은 임의의 하나 이상, 임의의 2 이상, 임의의 3 이상, 임의의 4 이상, 또는 임의의 5 이상의, 본원에서 기재된 펩타이드를 포함할 수 있다.

본원에서 기재된 펩타이드는, 예를 들면, 피하 지방세포 동원 또는 형성을 유도하거나 강력하게 하기 위해 (예를 들면, 피하 지방생성를 유도하기 위해), 이를 필요로 하는 대상체 (예를 들면, 포유동물)에게 투여된다.

이들 펩타이드는 "원상태" 형태 또는, 원한다면, 염, 에스테르, 아미드, 전구약물, 유도체, 등의 형태로 투여될 수 있으며, 단, 상기 염, 에스테르, 아미드, 전구약물 또는 유도체는 약리적으로 적합하고, 즉, 본 방법(들)에 효과적이다. 펩타이드의 염, 에스테르, 아미드, 전구약물 및 다른 유도체는 합성 유기 화학 분야의 숙련가에게 공지되고, 예를 들면, March (1992) Advanced Organic Chemistry; Reactions, Mechanisms and Structure, 4th Ed. N.Y. Wiley-Interscience에 기재된 표준 절차를 사용하여 제조될 수 있다.

그와 같은 유도체를 제형화하는 방법은 당해분야의 숙련가에게 공지된다. 예를 들면, 수많은 전달제의 디설파이드 염은 PCT 공보 WO 2000/059863에 기재된다. 유사하게, 치료적 펩타이드, 펩토이드, 또는 다른 모방체의 산 염은 전형적으로 적합한 산과의 반응을 수반하는 종래의 방법론을 사용하여 유리 염기로부터 제조될 수 있다. 일반적으로, 펩타이드의 염기성 형태를 극성 유기 용매 예컨대 메탄올 또는 에탄올에 용해시키고, 거기에 산을 부가한다. 수득한 염은 또한 침전되거나 덜 극성인 용매의 부가에 의해 용액이 생기게 할 수 있다. 산 부가 염을 제조하는데 적합한 산은, 비제한적으로, 유기산, 예를 들면, 아세트산, 프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 석신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 또는 살리실산, 뿐만 아니라 무기산, 예를 들면, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 또는 인산 둘 모두를 포함한다. 산 부가 염은 적합한 염기로 처리하여 유리 염기로 재전환될 수 있다. 본원에서 기재된 펩타이드의 어떤 특히 바람직한 산 부가 염은 할라이드 염을 포함하며, 예컨대 염산 또는 브롬화수소산을 사용하여 제조될 수 있다. 반대로, 본원에서 기재된 펩타이드의 염기성 염의 제조는 약제학적으로 허용가능한 염기 예컨대 나트륨 하이드록사이드, 칼륨 하이드록사이드, 암모늄 하이드록사이드, 칼슘 하이드록사이드, 또는 트리메틸아민을 사용하여 유사한 방식으로 제조된다. 염기성 염은 알칼리 금속 염, 예를 들면, 나트륨 염, 및 구리 염을 포함한다.

염 형태의 펩타이드를 제조하기 위해, 반대이온의 pKa는 바람직하게는 제제의 pKa보다 적어도 약 2 pH 더 낮다. 유사하게, 염 형태의 산성 제제를 제조하기 위해, 반대이온의 pKa는 바람직하게는 제제의 pKa보다 적어도 약 2 pH 더 높다. 이것은 반대이온이, 염의 용해도가 유리 산 또는 염기의 용해도를 압도하는, 염 안정기에 도달하는데 pH_max보다 더 낮은 수준으로 용액의 pH를 초래하도록 한다. 활성 약제학적 성분 (API) 및 산 또는 염기에서 이온화가능 그룹의 pKa 단위 차이의 일반화된 규칙은 양성자 이동을 역동적으로 호의적이게 함을 의미한다. API 및 반대이온의 pKa가 유의미하게 상이하지 않은 경우, 고체 복합체가 형성될 수 있지만 수성 환경에서 빠르게 불균화될 수 있다 (즉, 펩타이드 및 반대이온의 개별적인 독립체로 분해될 수 있다).

전형적으로, 반대이온은 약제학적으로 허용가능한 반대이온이다. 적합한 음이온성 염 형태는, 비제한적으로, 아세테이트, 벤조에이트, 벤질레이트, 바이타르트레이트, 브로마이드, 카보네이트, 클로라이드, 시트레이트, 에데테이트, 에디실레이트, 에스톨레이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 아이오다이드, 락테이트, 락토바이오네이트, 말레이트, 말레에이트, 만델레이트, 메실레이트, 메틸 브로마이드, 메틸 설페이트, 뮤케이트, 나프실레이트, 니트레이트, 파모네이트 (엠보네이트), 포스페이트 및 디포스페이트, 살리실레이트 및 디살리실레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리에티오다이드, 발레레이트, 등을 포함하고, 한편, 적합한 양이온성 염 형태는, 비제한적으로 알루미늄, 벤자틴, 칼슘, 에틸렌 디아민, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 칼륨, 프로카인, 나트륨, 트로메타민, 아연, 등을 포함한다.

펩타이드 에스테르의 제조는 전형적으로 펩타이드의 분자 구조 내에 존재하는 하이드록실 및/또는 카복실 그룹의 작용화를 수반한다. 예를 들면, 에스테르는 전형적으로 유리 알코올 그룹의 아실-치환된 유도체, 즉, 식 RCOOH(여기서 R은 알킬이고, 바람직하게는 저급 알킬이다)의 카복실산으로부터 유도된 모이어티이다. 에스테르는, 원한다면, 종래의 수소화분해 또는 가수분해 절차를 사용하여 유리 산으로 재전환될 수 있다.

펩타이드의 아미드는 또한 당해분야의 숙련가에게 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 아미드는 적합한 아민 반응물을 사용하여 에스테르로부터 제조될 수 있거나, 이들은 암모니아 또는 저급 알킬 아민과의 반응에 의해 무수물 또는 산 클로라이드로부터 제조될 수 있다.

펩타이드는 피하, 비경구, 국소, 경구, 코 (또는 그렇지 않으면 흡입된), 직장, 또는 국소 투여를 위해, 예컨대 에어로졸에 의해 또는 경피로 제형화될 수 있다. 조성물은 투여 방법에 따라서 다양한 단위 복용 형태로 투여될 수 있다. 적합한 단위 복용 형태는, 비제한적으로 분말, 정제, 알약, 캡슐, 로젠지, 좌약, 패치, 비강 스프레이, 주사제, 이식가능 지속 방출 제형, 지질 복합체, 등을 포함한다.

본원에서 기재된 펩타이드는 또한 약제학적으로 또는 화장용으로 허용가능한 담체와 조합되어 약리적 또는 화장품 조성물을 형성할 수 있다. 화장품 조성물은 추가로 하기를 포함할 수 있다: 충전제 (예를 들면, 히알루론 충전제 예컨대

XC, BELOTERO BALANCE, EMERVEL®, RESTYLANE, RADIESSE, 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA) 마이크로구형체 및 콜라겐 충전제 예컨대 ARTEFILL®, 칼슘 하이드록실인회석 (CaHA) 마이크로구형체 예컨대 RADIESSE®, 등).

본 조성물은 바람직하게는 국소, 피하, 또는 경피 투여용이다.

본 조성물은 주사용 조성물일 수 있다.

본 조성물은 콜라겐 (예를 들면, 소, 돼지, 또는 인간 콜라겐)을 추가로 포함할 수 있다. 콜라겐은 합성 콜라겐일 수 있다.

본 조성물은 마취제 (예를 들면, 리도카인)을 추가로 포함할 수 있다.

본 조성물은 피부 크림 (예를 들면, 얼굴 크림)일 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 담체는 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되거나 U.S. 약전 또는 동물, 더 상세하게는 인간에서 또는 동물, 더 상세하게는 인간에 대해 사용하기 위한 다른 일반적으로 인식된 약전에서 열거된 것을 포함한다. "담체"는, 예를 들면, 본원에서 기재된 1 이상의 펩타이드와 함께 투여되는 희석제, 아쥬반트, 부형제, 보조제 또는 비히클을 의미한다.

약제학적으로 허용가능한 담체는, 예를 들면, 조성물을 안정화시키거나 펩타이드의 흡수를 증가 또는 감소시키는 것으로 작용하는 1 이상의 생리적으로 허용가능한 화합물을 함유할 수 있다. 생리적으로 허용가능한 화합물은 하기를 포함할 수 있다: 예를 들면, 탄수화물, 예컨대 글루코오스, 수크로오스, 또는 덱스트란, 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 글루타티온, 킬레이트제, 저분자량 단백질, 보호 및 흡수 인핸서 예컨대 지질, 펩타이드의 청소능 또는 가수분해를 감소시키는 화합물, 또는 다른 부형제, 안정제 및/또는 버퍼.

특히 정제, 캡슐, 겔 캡, 등의 제조에서 사용되는 다른 생리적으로 허용가능한 화합물은, 비제한적으로 결합제, 희석제/충전제, 붕해제, 윤활유, 및 현탁화제를 포함한다.

경구 복용 형태 (예를 들면, 정제)를 제조하기 위해서, 부형제 (예를 들면, 락토오스, 수크로오스, 전분, 만니톨, 등), 임의의 붕해제 (예를 들면 칼슘 카보네이트, 카복시메틸셀룰로오스 칼슘, 나트륨 전분 글리콜레이트, 크로스포비돈 등), 결합제 (예를 들면 알파-전분, 아라비아검, 미세결정성 셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스, 사이클로덱스트린, 등), 및 임의의 윤활유 (예를 들면, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜 6000, 등)는, 예를 들면, 펩타이드에 부가되고 수득한 조성물은 압축된다. 필요한 경우, 압축된 생성물은 맛을 차단하거나 장의 용해 또는 지속 방출을 위해 공지된 방법을 사용하여 코팅된다. 적합한 코팅 물질은, 비제한적으로 하기를 포함한다: 에틸-셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트, 및 EUDRAGIT (Rohm & Haas, Germany; 메타크릴-아크릴 공중합체).

펩타이드와 제형화될 수 있는 다른 생리적으로 허용가능한 화합물은 미생물의 성장 또는 작용을 방지하는데 특히 유용한 습윤제, 유화제, 분산제 또는 보존제를 포함한다. 다양한 보존제는 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 페놀 및 아스코르브산을 포함한다. 당해분야의 숙련가는 약제학적으로 허용가능한 담체의 선택이, 예를 들면, 펩타이드의 투여 경로 및 펩타이드의 특정한 물리-화학적 특성에 좌우됨을 인식할 것이다.

바람직하게는, 부형제는 멸균되고 일반적으로 오염물질이 없다. 이들 조성물은 종래의, 잘 알려진 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 다양한 경구 복용 형태 부형제, 예컨대 정제 및 캡슐을 위해, 멸균 상태(sterility)가 요구되지 않으며; USP/NF 표준이 보통 충분하다.

나노에멀젼 제형 .

본원에서 기재된 펩타이드는 나노에멀젼으로 제형화될 수 있다. 나노에멀젼은, 비제한적으로, 수중유 (O/W) 나노에멀젼, 및 유중수 (W/O) 나노에멀젼을 포함한다. 나노에멀젼은 약 20 내지 약 1000 nm 범위의 평균 소적 직경을 갖는 에멀젼으로서 규정될 수 있다. 보통, 평균 소적 크기는 약 20 nm 또는 50 nm 내지 약 500 nm이다. 용어들 서브마이크론 에멀젼 (SME) 및 미니-에멀젼이 동의어로서 사용된다.

예증적인 수중유 (O/W) 나노에멀젼은, 비제한적으로 하기를 포함한다: (1) 주로 소수성 펩타이드에 적합한, 소분자, 계면활성제 또는 세제로 구성된 교질입자 (예를 들면, SDS/PBS/2-프로판올)인, 계면활성제 교질입자; (2) 주로 소수성 펩타이드에 적합한, 폴리머, 공중합체, 또는 블록 공중합체 계면활성제로 구성된 교질입자(예를 들면, 플루로닉 (Pluronic) L64/PBS/2-프로판올)인, 폴리머 교질입자; (3) 주로 소수성 펩타이드에 적합한, 1 초과의 계면활성제 구성성분이 존재하거나 액체상 (일반적으로 알코올 (예를 들면, 에탄올) 또는 지방산 화합물) 중 하나가 교질 입자의 형성에 참여하는 교질입자 (예를 들면, 옥탄산/PBS/EtOH)인, 블렌딩된 교질입자; (4) 양친매성 펩타이드에 적합한, 교질입자의 일체부를 형성하면서 펩타이드가 보조 계면활성제로서 작용하는 블렌딩된 교질입자 (예를 들면, 양친매성 펩타이드/PBS/미네랄 오일)인, 일체 펩타이드 교질입자; 및 (5) 양친매성 펩타이드에 적합한, 펩타이드가 고형 나노입자의 외부와 연관된 에멀젼 (예를 들면, 폴리스티렌 나노입자/PBS/오일상 없음)인, 피커링 (고체상) 에멀젼.

예증적인 유중수 (W/O) 나노에멀젼은, 비제한적으로 하기를 포함한다: (1) 주로 친수성 펩타이드에 적합한, 소분자 계면활성제 또는 세제로 구성된 교질입자 (예를 들면, 디옥틸 설포석시네이트/PBS/2-프로판올, 이소프로필미리스테이트/PBS/2-프로판올, 등)인, 계면활성제 교질입자; (2) 주로 친수성 펩타이드에 적합한, 폴리머, 공중합체, 또는 블록 공중합체 계면활성제로 구성된 교질입자 (예를 들면, PLURONIC® L121/PBS/2-프로판올)인, 폴리머 교질입자; (3) 주로 친수성 펩타이드에 적합한, 1 초과의 계면활성제 구성성분이 존재하거나 액체상 (일반적으로 알코올 (예를 들면, 에탄올) 또는 지방산 화합물) 중의 하나가 교질입자의 형성에 참여하는 교질입자 (예를 들면, 카프르/카프릴 디글리세라이드/PBS/EtOH)인, 블렌딩된 교질입자; (4) 양친매성 펩타이드에 적합한, 펩타이드가, 교질입자의 일체부를 형성하면서, 보조 계면활성제로서 작용하는 블렌딩된 교질입자 (예를 들면, 양친매성 펩타이드/PBS/폴리프로필렌 글리콜)인, 일체 펩타이드 교질입자; 및 (5) 양친매성 펩타이드에 적합한, 펩타이드가 고형 나노입자의 외부와 연관된 에멀젼 (예를 들면, 키토산 나노입자/수성상 없음/미네랄 오일)인, 피커링 (고체상) 에멀젼.

상기에서 명시된 바와 같이, 나노에멀젼은 1 이상의 계면활성제 또는 세제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 계면활성제는 비-음이온성 세제 (예를 들면, 폴리소르베이트 계면활성제 또는 폴리옥시에틸렌 에테르)일 수 있다. 본 발명에 사용되는 계면활성제는, 비제한적으로, 계면활성제 예컨대 화합물의 TWEEN®, TRITON®, 및 TYLOXAPOL® 패밀리를 포함한다. 바람직하게는, 계면활성제는 폴리소르베이트 계면활성제 (예를 들면, TWEEN 20®, TWEEN 40®, TWEEN 60®, 및 TWEEN 80®), 펜옥시폴리에톡시에탄올 (예를 들면, TRITON® X-100, X-301, X-165, X-102, 및 X-200, 및 TYLOXAPOL®), 또는 나트륨 도데실 설페이트이다.

나노에멀젼은 에멀젼의 형성을 돕기 위해 유화제를 추가로 포함할 수 있다. 유화제는 2개의 인접한 소적들 사이의 직접 접촉을 방지하는 일종의 연속적 막을 형성하기 위해 오일/물 계면에서 응집하는 화합물을 포함한다. 일부 수중유 에멀젼 조성물은 그것의 항-병원체 특성을 손상시키지 않으면서 원하는 농도가 되도록 물로 쉽게 희석할 수 있다.

수성상에 분산된 별개의 오일 소적 이외에, 수중유 에멀젼은 또한 다른 지질 구조, 예컨대 작은 지질 소포 (예를 들면, 수성상의 층들에 의해 서로 분리되는 몇 개의 실질적으로 동심원 지질 이중층으로 종종 이루어지는 지질 구형체), 교질입자 (예를 들면, 50-200 분자의 작은 클러스터에 양친매성 분자가 배열되어서 극성 헤드 그룹이 수성상 쪽으로 밖으로 향하게 하고 무극성 꼬리를 수성상을 피하려고 내부로 격리된다), 또는 라멜라 상 (각 입자가 물 박막에 의해 분리되는 평행한 양친매성 이중층들로 이루어진 지질 분산물)을 함유할 수 있다. 이들 지질 구조는 물을 피하려는 무극성 잔기 (예를 들면, 긴 탄화수소 사슬)를 구동시키는 소수성 작용의 결과로서 형성된다. 지질 제제는 일반적으로 계면활성제 지질 제제 (SLP)로 기재될 수 있다. SLP는 점막에 최소로 독성이고 소장 내에서 대사작용되는 것으로 여겨진다 (참고 예를 들면, Hamouda 등, (1998) J. Infect. Disease 180: 1939).

에멀젼은 수성상에서 분배된 불연속 오일상을 포함할 수 있고, 제 1 구성성분은 알코올 (예를 들면, 에탄올) 및/또는 글리세롤을 포함하고, 제 2 구성성분 계면활성제 또는 할로겐-함유 화합물을 포함한다. 수성상은 비제한적으로, 물 (예를 들면, 탈이온수, 증류수, 주사용 증류수, 수돗물) 및 용액 (예를 들면, 포스페이트 완충된 염수 용액, 또는 다른 완충계)을 비제한적으로 포함하는 임의의 유형의 수성상을 포함할 수 있다. 오일상은 임의의 유형의 오일을 포함할 수 있고, 이 오일은, 비제한적으로, 식물 오일 (예를 들면, 대두 오일, 아보카도 오일, 아마씨 오일, 코코넛 오일, 목화씨 오일, 스쿠알렌 오일, 올리브 오일, 카놀라 오일, 옥수수 오일, 평지씨 오일, 잇꽃 오일, 및 해바라기 오일), 동물 오일 (예를 들면, 물고기 오일), 풍미제 오일, 수불용성 비타민, 또는 미네랄 오일을 포함한다. 일반적으로, 오일상은 약 30 내지 약 90 용적 %의 수중유 에멀젼 (즉, 최종 에멀젼의 총 용적의 30-90%를 구성함), 더 바람직하게는 약 50 내지 약 80 용적 %의 에멀젼을 포함한다.

에멀젼은 또한 하기를 포함할 수 있다: 할로겐-함유 화합물 예컨대 클로라이드 염 (예를 들면, NaCl, KCl, 등), 세틸피리디늄 할라이드, 세틸트리메틸암모늄 할라이드, 세틸디메틸에틸암모늄 할라이드, 세틸디메틸벤질암모늄 할라이드, 세틸트리부틸포스포늄 할라이드, 도데실트리메틸암모늄 할라이드, 테트라데실트리메틸암모늄 할라이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 세틸트리메틸암모늄 클로라이드, 세틸벤질디메틸암모늄 클로라이드, 세틸피리디늄 브로마이드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 세틸디메틸에틸암모늄 브로마이드, 세틸트리부틸포스포늄 브로마이드, 도데실트리메틸암모늄 브로마이드, 또는 테트라데실트리메틸암모늄 브로마이드.

에멀젼은 하기를 또한 포함할 수 있다: 사급 암모늄 화합물 예컨대 N-알킬디메틸 벤질 암모늄 사카리네이트; 1,3,5-트리아진-1,3,5(2H,4H,6H)-트리에탄올; 1-데카나미늄, N-데실-N,N-디메틸-, 클로라이드 (또는) 디데실 디메틸 암모늄 클로라이드; 2-(2-(p-(디이소부틸)크레소슥시)에톡시)에틸 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드; 2-(2-(p-(디이소부틸)페녹시)에톡시)에틸 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드; 알킬-1- 또는 3-벤질-1-(2-하이드록스에틸)-2-이미다졸리늄 클로라이드; 알킬 비스(2-하이드록시에틸)벤질 암모늄 클로라이드; 알킬 데메틸 벤질 암모늄 클로라이드; 알킬 디메틸 3,4-디클로로벤질 암모늄 클로라이드 (100% C12); 알킬 디메틸 3,4-디클로로벤질 암모늄 클로라이드 (50% C14, 40% C12, 10% C16); 알킬 디메틸 3,4-디클로로벤질 암모늄 클로라이드 (55% C14, 23% C12, 20% C16); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드; 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (100% C14); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (100% C16); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (41% C14, 28% C12); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (47% C12, 18% C14); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (55% C16, 20% C14); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (58% C14, 28% C16); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (60% C14, 25% C12); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (61% C11, 23% C14); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (61% C12, 23% C14); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (65% C12, 25% C14); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (67% C12, 24% C14); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (67% C12, 25% C14); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (90% C14, 5% C12); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (93% C14, 4% C12); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (95% C16, 5% C18); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (및) 디데실 디메틸 암모늄 클로라이드; 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (지방산에서와 같이); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (C12-C16); 알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 (C12-C18); 알킬 디메틸 벤질 및 디알킬 디메틸 암모늄 클로라이드; 알킬 디메틸 디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 알킬 디메틸 에틸 암모늄 브로마이드 (90% C14, 5% C16, 5% C12); 알킬 디메틸 에틸 암모늄 브로마이드 (대두 오일의 지방산에서와 같은 혼합된 알킬 및 알케닐 그룹); 알킬 디메틸 에틸벤질 암모늄 클로라이드; 알킬 디메틸 에틸벤질 암모늄 클로라이드 (60% C14); 알킬 디메틸 이소프로필벤질 암모늄 클로라이드 (50% C12, 30% C14, 17% C16, 3% C18); 알킬 트리메틸 암모늄 클로라이드 (58% C18, 40% C16, 1% C14, 1% C12); 알킬 트리메틸 암모늄 클로라이드 (90% C18, 10% C16); 알킬디메틸(에틸벤질) 암모늄 클로라이드 (C12-18); 디-(C8-10)-알킬 디메틸 암모늄 클로라이드; 디알킬 디메틸 암모늄 클로라이드; 디알킬 디메틸 암모늄 클로라이드; 디알킬 디메틸 암모늄 클로라이드; 디알킬 메틸 벤질 암모늄 클로라이드; 디데실 디메틸 암모늄 클로라이드; 디이소데실 디메틸 암모늄 클로라이드; 디옥틸 디메틸 암모늄 클로라이드; 도데실 비스(2-하이드록시에틸) 옥틸 수소 암모늄 클로라이드; 도데실 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드; 도데실카바모일 메틸 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드; 헵타데실 하이드록시에틸이미다졸리늄 클로라이드; 헥사하이드로-1,3,5-트리(2-하이드록시에틸)-s-트리아진; 미리스트알코늄 클로라이드 및/또는 쿼터늄-14; N,N-디메틸-2-하이드록시프로필암모늄 클로라이드 폴리머; n-알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드; n-알킬 디메틸 에틸벤질 암모늄 클로라이드; n-테트라데실 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드 1수화물; 옥틸 데실 디메틸 암모늄 클로라이드; 옥틸 도데실 디메틸 암모늄 클로라이드; 옥틸페녹시에톡시에틸 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드; 옥시디에틸렌비스 (알킬 디메틸 암모늄 클로라이드); 디코코 알킬디메틸, 클로라이드; 트리메톡시실리 프로필 디메틸 옥타데실 암모늄 클로라이드; 트리메톡시실릴 쿼츠, 트리메틸 도데실벤질 암모늄 클로라이드; n-도데실 디메틸 에틸벤질 암모늄 클로라이드; n-헥사데실 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드; n-테트라데실 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드; n-테트라데실 디메틸 에틸벤질 암모늄 클로라이드; 또는 n-옥타데실 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드.

나노에멀젼 제형 및 이의 제조 방법은 당해분야의 숙련가에게 잘 알려져 있고 예를 들면 하기에서 기재되어 있다: U.S. 특허 번호: 7,476,393, 7,468,402, 7,314,624, 6,998,426, 6,902,737, 6,689,371, 6,541,018, 6,464,990, 6,461,625, 6,419,946, 6,413,527, 6,375,960, 6,335,022, 6,274,150, 6,120,778, 6,039,936, 5,925,341, 5,753,241, 5,698,219, d5,152,923 및 Fanun 등 (2009) Microemulsions : Properties and Applications (Surfactant Science), CRC Press, Boca Raton Fl.

화장품 제형.

본원에서 기재된 펩타이드의 1 이상은 화장품 용도를 위한 제형에 편입될 수 있다. 그와 같은 화장품 제형은 국소로 도포될 수 있고 피부 크림 (예를 들면, 얼굴 크림) 또는 바디 로션, 주름-제거 크림으로서 제형될 수 있거나 화장품, 햇볕차단제, 또는 보습제에 편입될 수 있다.

펩타이드는 충전제, 보습제, 비타민 (예를 들면, 비타민 E), 및/또는 착색제/염색약을 임의로 추가로 포함하는 제형에 편입될 수 있다.

적합한 주사가능 화장품 제형은 1 이상의 충전제 물질과 함께 1 이상의 펩타이드를 편입하는 제형을 비제한적으로 포함한다. 주사가능 화장품 주름 충전제로서 사용가능한 예시적인 물질은, 비제한적으로, 일시적 (흡수성) 충전제 예컨대 콜라겐 (예를 들면, 합성 콜라겐, 소 콜라겐, 돼지 콜라겐, 인간 콜라겐, 등), 히알루론산 겔, 칼슘 하이드록실인회석 (전형적으로 겔의 형태로 이식됨), 또는 폴리-L-락트산 (PLLA)을 포함한다. 펩타이드는 영구적 (비-흡수성) 충전제를 함유하는 주사가능 화장품 제형에 또한 편입될 수 있다. 예증적인 "영구적" 충전제는, 비제한적으로, 폴리메틸메타크릴레이트 비드 (PMMA 마이크로구형체)를 포함한다.

본원에서 기재된 펩타이드는 하기에 편입되거나 하기와 함께 투여될 수 있다: 상업적 진피 충전제 (예를 들면, RADIESSE® 볼류마이징 충전제 (나트륨 카복시메틸셀룰로오스 겔 담체에서 현탁된 약 30용적 % 칼슘 하이드록실인회석 (CaHA) 마이크로구형체 (25μm 내지 45μm의 직경)), JUVEDERM® 주사가능 겔 (생리적 버퍼에서 0.3% w/w 리도카인으로 24 mg/mL의 농도로 제형화된, 박테리아와 같은 스트렙토코쿠스에 의해 생산된 가교결합된 히알루론산), RESTYLANE® 진피 충전제 (BDDE으로 화학적으로 가교결합되고 포스페이트 완충된 염수에서 현탁된 박테리아의 스트렙토코쿠스 종으로 산출된 20 mg/mL 히알루론산의 겔), SCULPTRA® 미적 주사가능 임플란트 (마이크로입자의 폴리-L-락트산 (PLLA), 카복시메틸셀룰로오스, 비-발열원성 만니톨 및 주사용 멸균수를 함유하는 서스펜션).

그와 같은 주사가능 제형은 마취제 (예를 들면, 리도카인 또는 그것의 유사체)를 추가로 포함할 수 있다.

주사가능 제형은 실질적으로 멸균되거나 멸균되고/거나 피하 주사가능 충전제용 관리 기관 지침에 부합한다

용량/투여

본원에서 기재된 펩타이드는 당해기술에서 공지된 임의의 경로를 사용하여 대상체에게 투여될 수 있고, 그 경로는 예를 들면, 주사로 (예를 들면, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 또는 진피내), 흡입, 경피 적용, 직장 투여, 질 투여, 또는 경구 투여를 포함한다. 바람직한 투여 경로는 피하, 경피, 또는 국소 적용을 포함한다.

효과적인 양의 펩타이드는 국소 (즉, 비-전이신) 투여를 통해, 예컨대 말초 근육내, 선상내, 및 피하 투여를 비제한적으로 포함하는 말초 투여에 의해 투여될 수 있다.

펩타이드의 투여는 임의의 편리한 방식, 예를 들면, 주사로, 정맥내 및 동맥 스텐트 (용출 스텐트 포함), 카테터, 경구 투여, 흡입, 경피 적용, 직장 투여, 등일 수 있다.

펩타이드는 투여 전에 예를 들면, 상기에서 기재된 바와 같이, 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 투여될 특정한 조성물에 의해서, 뿐만 아니라 조성물을 투여하기 위해 사용된 특정한 방법에 의해서 부분적으로 결정된다. 따라서, 본원에서 기재된 펩타이드용 다양한 적합한 제형이 있다 (참고, 예를 들면, Remington' s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989).

대상체에서 투여된 용량은, 본워에서 기재된 방법의 맥락에서, 경시적으로 상기 대상체에서 유익한 치료적 반응 (예를 들면, 증가된 피하 지방생성)에 영향을 미치기에 충분해야 한다. 용량은 이용된 특정한 비히클/전달 방법의 효능, 투여 부위, 투여 경로, 및 상기 대상체의 상태, 뿐만 아니라 치료될 대상체의 체중 또는 표면적에 의해 결정될 것이다. 용량의 크기는 또한, 특정한 대상체에서 특정한 펩타이드의 투여를 동반하는 임의의 부정적인 부작용의 존재, 본성, 및 정도에 의해 결정될 것이다.

용어들 "효과적인 양" 또는 "에 효과적인 양" 또는 "치료적으로 효과적인 양"은 상기 대상체에서 검출가능한 치료적 (또는 화장적) 반응을 유도하는데 충부한 양 (예를 들면 지방생성을 유도하거나 강력하게 하는데 충분한 양)을 의미한다. 투여될 펩타이드의 효과적인 양을 결정할 때, 주치의는 다양한 인자, 예컨대 연령, 체중, 일반적인 건강, 다이어트, 성별, 투여될 펩타이드 및 제형, 투여 경로, 상기 대상체의 치료될 병태의 중증도 및 반응 및 임의의 역효과 (예를 들면, 자극 또는 알러지)를 고려하여 각 개별 환자를 치료하기 위해 복용량을 결정할 것이다. 본원에서 기재된 펩타이드는 상기 대상체의 질량 및 전체 건강에 적용되는 바와 같이, 다양한 농도로 펩타이드의 LD₅₀ 및/또는 펩타이드의 치료적 효능/활성, 및 펩타이드의 부작용에 의해 결정되는 속도에서 또한 투여될 수 있다.

펩타이드의 용량은 널리 변할 수 있고, 선택된 특정한 투여 방식 및 대상체의 필요에 따라 활성 성분의 활성 및 체중을 기반으로 주도 선택될 것이다. 그러나, 농도는 약 0.1 내지 약 50 mg/kg/1일 또는 그 초과 범위의 복용량을 제공하도록 전형적으로 선택될 것이다. 전형적인 복용량은 약 1 mg/kg/1일 내지 약 50 mg/kg/1일, 약 2 mg/kg/1일 내지 약 30 mg/kg/1일, 또는 약 3 mg/kg/1일 내지 약 20 mg/kg/1일, 예컨대 약 3 mg/kg/1일 내지 약 3.5 mg/kg/1일, 바람직하게는 약 3.5 mg/kg/1일 내지 약 7.2 mg/kg/1일, 더 바람직하게는 약 7.2 mg/kg/1일 내지 약 11.0 mg/kg/1일, 또는 가장 바람직하게는 약 11.0 mg/kg/1일 내지 약 15.0 mg/kg/1일의 범위이다. 펩타이드의 복용량은 약 10 mg/kg/1일 내지 약 50 mg/kg/1일의 범위일 수 있다. 대안적으로, 복용량은 1일 2회에 약 20 mg 내지 약 50 mg의 범위일 수 있다. 그와 같은 복용량은 특정한 대상체 또는 대상체의 그룹에서 치료적 및/또는 화장적 레지멘을 최적화하기 위해 변할 수 있는 것으로 인정될 것이다.

투여는 단일 또는 분할 용량을 통해 달성될 수 있고, 예를 들면, 용량은 일정 기간 동안(예를 들면, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 또는 1-3주 이상) 정기적으로(예를 들면, 1일 1회 또는 1일 2회) 투여된다.

본원에 기재된 펩타이드는 당해분야의 숙련가에게 잘 알려진 표준 방법에 따라 전신으로(예를 들면, 경구로, 또는 주사제로서) 투여될 수 있다. 펩타이드는 로젠지, 에어로졸 스프레이, 구강청결제, 코팅된 면봉 등과 같은 다양한 형태로 구강에 투여될 수 있다. 다양한 구강, 및 설하 제형 역시 고려된다. 상기 펩타이드는 일정 기간에 걸쳐 치료를 제공하기 위해 주사제로서 제형화될 때 데포(depot) 제형으로 투여될 수 있다.

상기 펩타이드는 예를 들면, 피부 표면에, 국소 병변 또는 창상에, 수술 부위 등에 국소로 투여될 수 있다.

상기 펩타이드는 종래의 경피 약물 전달 시스템, 즉, 경피 "패치"를 이용하여 피부를 통해 전달될 수 있고, 상기 펩타이드는 전형적으로 피부에 부착될 약물 전달 장치로서 제공되는 적층된 구조 내에 함유된다. 그러한 구조에서, 약물 조성물은 전형적으로 상부 후면층에 깔려 있는 층, 또는 "저장고" 내에 함유된다. 이 문맥에서 용어 "저장고"는 피부의 표면으로의 전달에 궁극적으로 이용될 수 있는 다량의 활성 성분을 가리킨다. 따라서, 예를 들면, "저장고"는 패치의 후면 층 위에 있는 접착제 내에, 또는 당해분야의 숙련가에게 공지된 다양한 상이한 매트릭스 제형 내에 활성 성분 펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 패치는 하나의 저장고를 함유할 수 있거나, 다수의 저장고를 함유할 수 있다. 예를 들면, 상기 저장고는 약물 전달 동안 상기 시스템을 피부에 붙이는 역할을 하는 약제학적으로 허용가능한 접촉 접착 물질의 폴리머 매트릭스를 포함할 수 있다. 적합한 피부 접촉 접착 물질의 예는, 비제한적으로, 폴리에틸렌, 폴리실록산, 폴리이소부틸렌, 폴리아크릴레이트, 폴리우레탄 등을 포함한다. 대안적으로, 예를 들면, 약물-함유 저장고 및 피부 접촉 접착제는 별개의 다른 층으로서 제공되며, 접착제는 상기 저장고 밑에 있는데, 이 경우 상기 저장고는 상기 기술된 폴리머 매트릭스일 수 있거나, 액체 또는 하이드로겔 저장고이거나, 일부 다른 형태를 취할 수 있다. 상기 디바이스의 상부 표면으로서 역할을 하는, 이들 라미네이트 내의 후면층은 바람직하게는 "패치"의 일차 구조 요소로서 기능하고 디바이스에 많은 가요성을 제공한다. 후면층을 위해 선택된 물질은 상기 펩타이드 및 존재하는 임의의 다른 물질들에 대해 바람직하게는 실질적으로 불투과성이다.

국소 전달을 위한 다른 제형은, 비제한적으로, 연고, 겔, 스프레이, 유체, 및 크림을 포함한다. 연고는 전형적으로 바셀린 또는 다른 석유 유도체에 기초한 반고형 조제물이다. 다른 담체 또는 비히클과 마찬가지로, 연고 기제는 불활성이고, 안정하고, 무자극이고 비감작이어야 한다. 선택된 펩타이드를 함유하는 크림은 전형적으로 점성 액체 또는 반고체 에멀젼, 종종 수중유 또는 유중수이다. 크림 기제는 전형적으로 수세척성이고, 오일상, 유화제 및 수성상을 함유한다. 때때로 "내부" 상으로도 불리는 오일상은, 일반적으로 바셀린 및 지방 알코올, 예컨대 세틸 또는 스테아릴 알코올을 포함하고; 수성상은 반드시 그런 것은 아니지만 일반적으로 부피가 오일상을 초과하고, 일반적으로 습윤제를 함유한다. 크림 제형 내의 유화제는 습윤제를 함유한다. 크림 제형 내의 유화제는 일반적으로 비이온성, 음이온성, 양이온성 또는 양쪽성 계면활성제이다. 사용될 특정 연고 또는 크림 기제는, 당해분야의 숙련가에게 의해 인정될 바와 같이, 최적의 약물 전달을 위해 제공될 기제이다.

본원에 기재된 하나 이상의 펩타이드는, 예를 들면, 희석을 위해 준비된 저장 용기(예를 들면, 미리측정된 부피로), 또는 다량의 물, 알코올, 과산화수소, 또는 다른 희석제에의 첨가를 위해 준비된 가용성 캡슐 내에, "농축물"로서 제공될 수 있다. 예를 들면, 상기 펩타이드는 추후 재구성을 위해 동결건조될 수 있다.

용도

본원에 기재된 지방생성 펩타이드(또는 이의 모방체)는 많은 적용에서 용도를 갖는다. 예를 들면, 피하 지방은 피부에 풍만함과 견고함을 제공하므로, 피하 지방의 형성을 향상시키는 것은 성형수술 절차에서 용도를 갖는다. 노화하는 피부는 적은 피하 지방을 함유한다. 따라서 본원에서 기재된 하나 이상의 펩타이드를 원하는 부위에 투여하여 피하 지방 형성을 촉진하는 것은 더 풍만하고 더 어려보이는 피부를 야기한다. 이 접근법은 종종 낮은 성공률을 나타내는 과정인, 신체의 다른 부위(예를 들면, 허벅지 또는 엉덩이)로부터 지방세포를 이식하는 현재의 방법을 대체할 수 있다.

본원에 기재된 펩타이드는 피하 지방 조직을 선택적으로 향상시키기 위해(예를 들면, 내장 지방 및/또는 다른 지방 조직을 실질적으로 증가시키지 않으면서 피하 지방 조직을 향상시키기 위해) 투여될 수 있다. 펩타이드의 투여에 반응하여, 지방세포 형성이 진피 섬유아세포에서 일어나고, 대상에서 선택된 피하 부위 안에서 부피가 추가된다.

본원에 기재된 펩타이드는 흉터를 줄이는데 사용될 수 있다. 이것은 하나 이상의 펩타이드를 흉터 부위를 줄이고/거나 흉터 부위의 외관을 개선하는데 충분한 양으로 투여함으로써 달성될 수 있다. 흉터는, 예를 들면, 화상에 의해 생성된 흉터, 수술에 의해 생성된 흉터, 여드름에 의해 생성된 흉터, 생검에 의해 생성된 흉터, 또는 부상으로 생긴 흉터일 수 있다.

본원에 기재된 펩타이드는, 예를 들면, 피부의 외관을 개선하기 위해, 다양한 화장 과정에서 사용될 수 있다. 이것은 하나 이상의 펩타이드를 대상의 부위에 피부의 외관을 개선하는데 충분한 양으로 투여함으로써 달성될 수 있다. 그러한 투여는 입술, 눈꺼풀, 뺨, 이마, 턱, 목 등과 같은 영역에의 피하 투여를 포함할 수 있다. 상기 펩타이드는 주름을 줄이고, 처지는 피부를 줄이고, 피부의 표면 질감을 개선하고, 주름을 줄이거나, 제거하거나, 메우고, 노인 반점을 제거하거나 줄이고, 및/또는 눈 아래의 다크써클을 제거하는 이들 방법 등에 사용될 수 있다. 이들 화장 적용은 예시적이며 제한하고자 하는 것이 아니다. 본원에 제공된 교시에 비추어, 다른 화장 적용이 당해분야의 숙련가에 의해 인식되고 이용가능할 것이다.

본원에 기재된 펩타이드는 대상의 부위에서 조직 부피를 개선하는데 사용될 수 있다. 이것은 본원에 기재된 하나 이상의 펩타이드를 대상의 부위에서 조직 부피를 증가시키는데 충분한 양으로 투여함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, 조직 부피의 증가는 유방 조직을 견고하게 하거나 증대시키는 것 및/또는 엉덩이 조직 또는 신체 또는 얼굴의 다른 부위를 견고하게 하거나 증대시키는 것을 포함할 수 있다.

상기 펩타이드는 또한 대상의 부위 내의 피부를 부드럽게 하는데 사용될 수 있다. 이것은 본원에 기재된 하나 이상의 펩타이드를 원하는 부위에서 피부를 부드럽게 하는데 충분한 양으로 투여함으로써 달성될 수 있다. 상기 부드럽게 하는 것은 여드름에 의해 흉터난 피부를 부드럽게 하는 것, 셀룰라이트의 부위를 부드럽게 하는 것, 임신선을 부드럽게 하거나 줄이는 것, 및/또는 주름을 펴는 것을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 펩타이드는 대상에서 줄기세포를 피하 지방의 형성으로 동원하는데 사용될 수 있다. 이것은 본원에 기재된 하나 이상의 펩타이드를 줄기세포를 피하 지방의 형성으로 동원하는데 충분한 양으로 투여함으로써 달성될 수 있다. 이는, 예를 들면, 다양한 재건 수술 과정 등에서 유용성을 갖는다.

본원에 기재된 펩타이드는 대상에서 조직을 재건하는데 사용될 수 있다. 그러한 재건은, 예를 들면, 유방재건(예를 들면 종양을 제거하는 수술 후), 또는 얼굴 또는 팔다리 재건(예를 들면 자동차 사고 또는 화상 후)을 포함할 수 있다. 이것은 본원에 기재된 하나 이상의 펩타이드를 조직 재건 과정 동안 또는 이후에 조직의 부피를 증가시키는 양으로 투여함으로써 달성될 수 있다. 상기 펩타이드는 조직 이식 물질 또는 ?은 피부 또는 부상된 조직의 치유를 향상시키는 다른 절차와 함께 임의로 사용된다.

상기 펩타이드는 또한 본원에 기재된 하나 이상의 펩타이드를 걸을 때 상기 대상에 의해 경험되는 뒷꿈치 통증을 감소시키는데 충분한 양으로 투여함으로써 대상에서 뒷꿈치 통증을 감소시키는데 사용될 수 있다.

본원에 기재된 펩타이드는 체온조절을 증가시키고/거나 면역 기능을 개선하기 위해 피하 지방의 확대를 위해 투여될 수 있다. 대상은 질환을 예방하거나, 비제한적으로 심혈관 질환을 포함하는 증가된 장기 지방과 연관된 진행중인 질환, 및 다른 비만 연관된 질환을 치료하기 위해 상기 펩타이드로 처리될 수 있다.

이들 방법 중 어느 것에서의 투여는 국소 또는 전신일 수 있고, 본원에 기재된 임의의 경로, 예컨대 국소, 피하, 경피, 경구, 코, 질, 및/또는 직장 투여에 의할 수 있다. 바람직하게는, 상기 펩타이드는 피하 주사에 의해 투여된다. 대안적으로, 상기 펩타이드는 바람직하게는 얼굴 크림과 같은 피부 크림의 형태로 국소 투여되거나, 또는 경피 패치를 통해 경피로 투여된다.

상기 용도 및 방법이 인간에서의 용도와 관련하여 기재되어 있음에도 불구하고, 이들은 또한 동물, 예를 들면, 수의적 용도에 적합하다. 따라서 어떤 바람직한 유기체는, 비제한적으로 인간, 비-인간 영장류, 갯과, 말, 고양이, 돼지, 유제류, 토끼류 등을 포함한다.

본 발명을 상세히 기술하였지만, 첨부된 청구항들에서 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 변형 및 변화가 가능할 것임이 분명할 것이다.

실시예

하기 그 예는 청구된 발명을 예시하기 위해 제공되지만, 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 지방생성을 측정하는 분석

하기 분석을 사용하여 실시예 2에서의 하기 기재된 실험에서 펩타이드의 지방생성 활성을 평가하였다.

분석 1

시약: (1) 3-이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX) 용액: DMSO 중의 0.5M; (2) 인슐린 용액: 10mg/mL 재조합 인간 인슐린; (3) 에탄올 중의 10 mM의 덱사메타존 용액; (4) 오일 레드 O(60% 이소프로판올 중의 0.36%) 또는 BODIPY 염료(4-10 μM에서 Invitrogen사의 BODIPY 493/503(4,4-디플루오로-1,3,5,7-테트라메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-8-프로피온산, 석신이미딜 에스테르)).

배지의 제조:

지방생성 개시 배지: 간엽 줄기세포 확장 배지 / 0.5 mM IBMX / 1μM 덱사메타존. 간엽 줄기세포 확장 배지는 밀리포어로부터 상업적으로 이용가능하다. IBMX 용액을 1:1000으로 희석하고 덱사메타존 용액을 항생제 및 항진균제를 함유하는 확장 배지에서 1:10,000으로 희석하였다. 상기 준비된 배지를 4℃에서 보관하였다.

양성 대조군을 위한 지방생성 진행 배지: 간엽 줄기세포 확장 배지 / 10 μg/mL 인슐린. 상기 인슐린 용액을 확장 배지에서 1:1000으로 희석하고 4℃에서 보관하였다.

실험적인 지방생성 진행 배지: 간엽 줄기세포 확장 배지/ 1-100μg/mL RHAMM 길항제 펩타이드.

지방생성 유지 배지: 항생제 및 항진균제를 함유하는 간엽 줄기세포 확장 배지.

음성 대조군 배지: DMEM/10% 정상 소 혈청.

분석 방법:

골수 간엽 줄기세포를 포함하는 지방전구세포 줄기세포 및 망상 및 유두상 진피 섬유아세포를 포함하는 섬유아세포를 표준 조직 배양 방법을 이용하여 증식시켰다. 세포를 트립신화하여 기층으로부터 세포를 제거하였다. 트립신을 중화하고 세포를 혈구계를 이용하여 계수하였다. 세포를 확장 배지에 30,000 세포/mL로 재현탁시켰다. 1 ml의 세포 현탁액을 24-웰 플레이트의 웰 당 도말하고, 몇 개의 웰들은 블랭크 웰 염색을 위해 비워 두었다.

세포를 밀집도에 도달할 때까지 1-2일간 배양하였다. 대략 1.8 ml의 배지를 각 웰에서 제거하고 2 mL 지방생성 개시 배지로 대체하였다. 음성 대조군 웰들의 경우, 확장 배지만을 이 단계에서 그리고 차후의 배지 변경을 위해 사용하였다. 모든 배지 변경을 위해, 단일층을 교란시키는 것을 피하기 위해 가능한 한 배지를 서서히 교체하였다.

세포를 37℃, 5% CO₂에서 48시간 동안 배양하였다. 각 웰로부터 2 mL 배지를 제거하고, 웰당 2 mL 양성 대조군 또는 실험적인 지방생성 진행 배지로 교체하였다. 세포를 37℃, 5% CO₂에서 48시간 동안 다시 배양하였다. 각 웰로부터 2 ml의 배지를 제거하고 웰 당 2 mL 지방생성 유지 배지로 교체하였다. 또한, 배지를 블랭크 웰 염색을 위해 마련해둔 비어있는 웰들에 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO₂에서 적어도 48시간 동안 배양하였다. 배지를 48-72시간마다 교체하였다. 세포내 지질 소적의 축적을 적어도 5일간 계속하였다.

지방생성의 정량화:

오일 레드 O 염색

오일 레드 O 염색의 정량화를 위해, 배지를 제거하고 PBS를 조심스레 첨가하기 위해 주의하여 PBS로 세포를 2회 세정하였다. 세포가 결여되어 있지만 배지를 함유하는 웰들을 포함하여, 24웰에 웰당 0.5 mL 오일 레드 O 용액을 부가하였다. 세포를 실온에서 15분 동안 배양하였다. 그리고 나서, 염색 용액을 제거하고 웰들을 1 ml의 포스페이트 완충된 염수(PBS)로 3회 세정하였다. 일부 실험에서, 마지막 세정의 제거 후, 염색된 플레이트를 스캐닝하거나 촬영하였다.

지방생성을 분광측정기 또는 형광광도계를 이용하여 정량화하였다. 0.25 mL 염료 추출 용액(이소프로필 알코올)을 웰 당 부가하고, 플레이트를 회전식 진탕기 또는 플랫폼 락커 위에 15-30분간 두었다. 추출된 염료를 큐벳으로 옮기고 흡광도를 오일 레드 O에 대한 가시광선 범위에서 분광측정기에서 판독하거나 또는 96-웰 플레이트로 옮겨 플레이트 리더에서 정량화하였다.

BODIPY 염색

BODIPY 염료 흡수의 정량화를 위해, 배지를 제거하고 PBS를 조심스레 첨가하기 위해 주의하여 PBS로 세포를 2회 세정하였다. 그리고 나서, 세포를 3% 파라포름알데하이드에 고정시키고, PBS로 세정한 다음 PBS 중에서 제조된 BODIPY 용액으로 1시간 동안 어둠 속에서 배양하였다. 단일층을 세정한 다음 형광광도계에서 염료의 측정을 위해 추출하거나 또는 슬라이드 상에 올려 공초점 형광 현미경에서 조사하였다.

블랭크 웰 염색

세포가 결여된 웰들로부터 추출된 염색은 염료의 플레이트에의 비-특이적 결합을 나타낸다. 특정 염색의 보다 정확한 평가를 얻기 위해 이 값을 실험적인 웰들의 흡광도로부터 감산하였다.

분석 2

시약: 덱사메타존, 인슐린, 및 오일 레드 O 용액은 분석 1에 대해 상기에 기재된 바와 동일하였다. 인도메타신 용액은 메탄올 중에 10 mM 인도메타신을 함유하였다. BODIPY 493/503 염료를 4 μM의 농도로 사용하였다.

배지의 제조:

지방생성 유지 배지를 상기에 기재된 바와 같이 제조하였다.

지방생성 유도 배지: 501 ml의 지방생성 유도 배지를 제조하기 위해, 덱사메타존의 10 mM 모액 50 μl, 인슐린의 10 mg/ml 모액 500 μl, 인도메타신의 10 mM 모액 5 ml, 및 페니실린 및 스트렙토마이신의 100x 모액 5 ml을 490 ml의 간엽 줄기세포 확장 배지에 첨가하였다.

분석 방법:

지방전구세포 줄기세포, 골수 간엽 줄기세포 및 섬유아세포, 예컨대 진피 망상 및 유두상 섬유아세포를 표준 조직 배양 방법을 이용하여 증식시켰다. 세포를 트립신화하여 기층으로부터 세포를 제거하고, 트립신을 중화하고, 세포를 혈구계를 이용하여 계수하였다. 세포를 10% 소 혈청을 함유하는 저 글루코오스 DMEM에 60,000 세포/ml로 재현탁시켰다. 웰당 1 ml의 세포 현탁액을 24-웰 플레이트에 도말하고, 몇 개의 웰들은 블랭크 웰 염색을 위해 비워두었다.

세포를 밤새 배양하였고 이 시점에 밀집도에 도달하였다. 각 웰로부터 대략 1.8 ml의 배지를 제거하고 2 ml 지방생성 유도 배지로 교체하였다. 음성 대조군 웰들의 경우, 이 단계에서 그리고 차후 배지 교환을 위해 확장 배지만을 사용하였다. 모든 배지 교환의 경우, 단일층을 교란시키는 것을 막기 위해 배지를 가능한 한 서서히 교체하였다.

세포를 37℃, 5% CO₂에서 3일간 배양하고, 배지를 신선한 지방생성 유도 배지로 교체하고, 세포를 추가 3일간 배양하였고, 이 시점에 약 5-10%의 세포에서 지방생성이 관측될 수 있었다. 배지를 제거하고 RHAMM 길항제 펩타이드(실험군) 또는 인슐린(양성 대조군으로서 사용된 유도 배지에서와 같은 농도) 중 하나를 함유하는 2 ml의 유지 배지로 교체하였다. 세포를 37℃, 5% CO₂에서 3일간 배양하였다.

배지를 제거하고 분석 1에 대해 상기에서 기재된 바와 같이 BODIPY 또는 오일 레드 O 염색을 수행하였다.

실시예 2: 지방생성 펩타이드의 확인 및 시험

RHAMM 발현의 제거는 지방생성을 촉진한다(Tolg 등, 2006, J Cell Biol). RHAMM 카복시-말단 서열[^AA681LDAFEAEKQA LLNEHGATQE QLNKIRDSYA QLLGHQNLKQ KIKHVVKLKD ENSQLKSEVS KLRSQLVKRK QNELRLQGEL DKALGIRHFD PSKAFCHASK ENFTPLKEGN PNCC^aa794 (서열번호: 91)]을 재조합 단백질로서 생산하였고, 이 단백질 단편에 대해 항체를 제조하였다. 상기 단백질 단편 및 항체는 상업적으로 이용가능한 간엽 줄기세포 키트를 이용하여 지방생성을 촉진한 것으로 나타났다. 상기 결과들은 이 114개의 아미노산 단백질 단편이 지방생성 활성을 함유한다는 것을 보여주었다.

본 발명자들은 상기 단편 및 항체가 각각 경쟁적 억제에 의해 그리고 RHAMM의 직접적인 결합/차단에 의해 RHAMM 기능을 차단하고 있는 것으로 가정하였다. 절단 분석을 이용하여, 상기 펩타이드의 크기를 32개의 아미노산(LKQKIKHVVKLKDENSQLKSEVSKLRSQLVKR(서열번호: 92))으로 더 줄였고, 도 2에 나타난 바와 같이 지방생성 활성이 15개의 아미노산 펩타이드(KLKDENSQLKSEVSK(서열번호: 2); 본원에서 "펩타이드 B" 또는 "B-1")에 국한된 것으로 나타났다. 이 펩타이드를 경쟁적 차단제로서 사용하기 위해 화학적으로 합성하였고, RHAMM 기능을 직접적으로 결합/차단하기 위해 키홀드(keyhold) 림프구 헤마시아닌(KLH)으로 태그된 이 서열에 대해 항체들을 제조하였다. 두 시약들은 RHAMM 기능을 효과적으로 차단하고 조직 배양 및 생체내에서 지방생성을 촉진한다.

지방생성 활성을 함유하는 RHAMM 서열은 또한 이 단백질의 히알루로난 결합 영역을 함유한다. 따라서, 히알루로난에 결합하는 펩타이드에 대한 랜덤 파아지 라이브러리의 비편향된 스크리닝을 수행하고, 조직 배양 및 생체내에서 지방세포 분화를 유사하게 촉진하는 히알루로난 결합 펩타이드(서열번호: 1, 펩타이드 P15-1, 또한 일명 P-1)를 확인하였다. 펩타이드 P15-1의 서열이 도 7에 나타나 있다.

RHAMM 길항제(펩타이드 B (서열번호: 2), 펩타이드 P15-1 (서열번호 1), 및 펩타이드 B에 대한 항체)의 지방생성 효과의 예가 표 1에 요약되어 있다. 펩타이드 P15-1, 펩타이드 B, 및 RHAMM 항체를 대상으로 배양에서 그리고 노화된 랫트의 진피 내로 주입될 때 지방전구세포 줄기세포에 대한 그것의 효과를 분석하였다. 시약을 0-5의 등급으로 순위를 매겼는데 5는 가장 높은 가능한 등급 및 완전히 충전된 하비 볼을 가리킨다. "2D"는 2차원 조직 배양을 지칭한다.

표 1. 펩타이드 및 항체 시약의 지방생성 잠재성.

모든 이들 시약들은 간엽 줄기세포 또는 유두상 섬유아세포에서 지방생성을 촉진하는 능력 면에서 인슐린을 대체할 수 있다. 그러나, 펩타이드 B(서열번호: 2)가 이들 시약 중 가장 높게 지방을 생성하였으므로(표 1), 이를 투여량 범위 활성을 위한 배양에서 그리고 생체내 몇몇 동물 모델에서 더 규명하였다.

도 3a는 골수 간엽 줄기세포에서의 분석 1 및 2에서 인슐린의 지방생성 효과를 보여준다. 이 실험에서의 음성 대조군은 유지 배지에서만 배양된 세포였다.

도 3b 및 3c, 및 도 4 내의 현미경사진에서 나타난 바와 같이, 골수 간엽 줄기세포에서, 최대 지방생성 효과는 사용된 스크리닝 분석에 따라, 1-5μg의 펩타이드 B(서열번호: 2)에서 얻어졌다. 도 4는 분석 1을 이용한 랫트 골수 간엽 줄기세포에서의 펩타이드 B의 지방생성 효과를 보여준다. 도 4에서 화살표는 지질 소적을 가리키고, "기폭 자극"은 덱사메타존 및 IBMX를 이용한 세포의 처리를 지칭한다.

생체내에서, 지방생성의 랫트 진피 피부 모델에서 주사 부위 당 25-50μg의 펩타이드 B(서열번호: 2)는 유의미한 지방 축적(도 10에 나타난 지방 패드)을 유도하였다. 생체내에서 두 유형의 지방생성 시약(항체 및 펩타이드 B) 사이에는 명백한 차이가 없었으며, 둘은 나이든 암컷에서 가장 효과적이었다(도 5a 및 5b 참조). 도 5a 및 5b에서, 데이터는 실험/대조군 값의 비율로서 표현된 지방 패드의 면적("표면적")의 비율로서 나타나 있다. 도 5a는 펩타이드 B에 대한 항체의 효과를 보여주며 도 5b는 펩타이드 B의 효과를 보여준다.

누드 기니아 피그의 피부 구조가 인간의 얼굴 피부와 유사하므로, 펩타이드 B(서열번호: 2)의 효과를 누드 기니아 피그에서 시험하였다. 특히, 그것은 털이 없고 케라틴생성세포층이 랫트 모델보다 더 두껍다는 점에서 이 동물 모델의 피부는 랫트 피부보다 인간 피부에 더 유사하다. 도 6에 나타난 바와 같이, H 및 E 염색은 피하 지방 축적이 두 위치에서 펩타이드 B의 주사 후 이들 동물의 상부 등에서 및 귀 지방 패드에서 관찰되었음을 밝혀내었다(대조군 동물에게는 콜라겐 겔 비히클 단독을 주입함). 따라서, 펩타이드 B는 이 누드 기니아 피그 모델에서 지방생성을 촉진하는데 효과적이었다.

추가의 지방생성 펩타이드를 확인하고 핵심 지방생성 서열을 확인하기 위해, 두 가지 접근법을 사용하였다. 첫 번째로, 15-mer 랜덤 파아지 라이브러리를 이용하여 히알루로난-결합 펩타이드를 확인하기 위해 비편향된 스크린을 수행하였다. 이 스크린에서 확인된 펩타이드 서열은 (a) RHAMM의 HA 결합 영역에 대한 이들의 정렬 및 (b) CD44의 HA 결합 영역에 대한 이들의 정렬의 부족에 대해 분류되었다. 펩타이드 P15-1을 이 방식으로 확인하였다. 펩타이드 P15-1은 서열 STMMSRSHKTRSHHV(서열번호: 1)를 갖는다.

두 번째 접근법에서, 가장 작은 활성 서열을 확인하기 위해 펩타이드 B(서열번호: 2)에 일련의 절단 및 알라닌 돌연변이유발을 수행하였다. 펩타이드 B의 단편을 제조하고 지방생성을 분석하였다. 먼저, 펩타이드 B의 2개의 등분에 상응하는 단편들을 제조하였다(KLKDENS(서열번호:93) 및 SQLKSEVSK(서열번호: 44)). SQLKSEVSK(서열번호: 44) 단편만이 지방생성인 것으로 확인되었다. 이 단편을 이후 LKSEVSK(서열번호: 42) 및 KSEVSK(서열번호: 3)로 더 줄였으며, 이 둘 모두 역시 지방을 생성하는 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 절단 실험은 지방생성 활성을 나타낸 9-mer(SQLKSEVSK(서열번호: 44)), 7-mer(LKSEVSK(서열번호: 42)) 및 6-mer(KSEVSK(서열번호: 3))를 확인하였다(도 7, 8, 및 9 참고). 도 7에서, 7-mer는 단편 A로서 지칭되고 9-mer는 단편 C로서 지칭된다. 도 8 및 9에서, "-ve 대조군"은 음성 대조군을 지칭하고, "+ve 대조군"은 양성 대조군을 지칭한다. 도 8은 분석 1 및 2에서 6-mer(KSEVSK(서열번호: 3))의 지방생성 효과를 보여준다. 도 9에서, 현미경사진의 상부 패널은 분석 1 및 2로부터의 결과를 보여주고, 현미경사진의 하부 패널은 분석 1로부터의 결과를 보여준다. 도 9의 상부 패널에서, "대조군"으로 표시된 패널은 양성 대조군(유도 및 인슐린)이다. 도 9의 하부 패널에서, 미처리된 대조군 내의 세포들은 유지 배지로만 처리되었다.

또한 펩타이드 P15-1(서열번호: 1)을 절단하여 서열 STMMSRSHK("단편 B"; 서열번호: 62)를 갖는 9-mer를 만들었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 이 9-mer는 또한 지방생성 활성을 갖는다.

도 7에 나타난 바와 같이, 이들 단편은 모두 대략 동일한 지방생성 활성을 가지고 있었고, 이는 비활성(중량 단위 당 활성)이 6-mer KSEVSK(서열번호: 3)에 대해 가장 높다는 것을 제시한다. 상기에서 기재된 바와 같이 분석 1 및 2에서 수득된 지방생성 데이터를 이용하여 펩타이드 B(서열번호: 2) 및 9-mer, 7-mer 및 6-mer 단편(서열번호: 44, 42, 및 3, 각각)에 대해 비활성(표 2)을 계산하였고, 예기치 않게 6-mer가 가장 높은 비활성을 가지는 것으로 밝혀졌다.

표 2. 랫트 간엽 줄기세포에서 펩타이드 B 및 9-, 7-, 및 6-mer의 비활성.

이들 결과는 놀라우며 예기치 못한 것이었고, 더 짧은 펩타이드가 더 긴 펩타이드보다 더 활성임을 보여준다. 특히, 펩타이드 B(서열번호: 2; 15-mer) 대비 6-mer(KSEVSK; 서열번호: 3)의 비활성 증가는 예상하지 못하였는데, 6-mer 및 펩타이드 B가 동일한 수의 핵심 히알루로난 결합 서열을 함유하기 때문이다.

상기 6-mer(KSEVSK; 서열번호: 3)를 대상으로 생체내에서 랫트 피부에서의 지방생성 효과를 시험하였다. 이 시험의 결과들이 도 10의 사진에 나타나 있다. 6-mer는 큰 지방 패드, 아마 펩타이드 B보다 더 큰 지방 패드를 유도할 수 있다.

실시예 3: 랫트 골수 간엽 줄기세포에서 펩타이드 B(서열번호: 2) 및 KSEVSK 6-mer (서열번호:3) 의 지방생성 활성

랫트 골수 간엽 줄기세포를 이용하여 펩타이드 B(서열번호: 2) 및 KSEVSK 6-mer(서열번호:3)의 지방생성 활성을 규명하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 도 11은 520 nm에서 오일 레드 O의 흡수에 의해 정량화된 0.1-25 μg의 펩타이드 B(도 11a) 및 KSEVSK 6-mer(도 11b)의 지방생성 효과를 보여준다. 결과는 음성 대조군 대비 배수 증가에 기초한다. 상기 데이터는 평균 ± 표준 오차(n=3)로 제시되어 있다. 상기 실시예 1에서 기술된 분석 1을 사용하여 도 11에 나타난 결과를 생성하였다. 펩타이드 B 및 KSEVSK 6-mer 둘 다 음성 대조군과 비교하여 지방생성을 유의하게 자극시켰다.

렛트 골수 간엽 줄기세포에서 펩타이드 B 및 KSEVSK 6-mer의 지방생성 효과를 또한 음성 대조군 대비 지방 소적의 이미지 분석 및 수 측정을 이용하여 정량화하였다. 이들 실험의 결과가 도 12a(펩타이드 B) 및 12b(KSEVSK 6-mer)에 나타나 있다. 펩타이드 B 및 KSEVSK 6-mer 둘 다 음성 대조군과 비교하여 지방생성을 유의미하게 자극시켰다. 결과는 음성 대조군 대비 배수 증가에 기초한다. 데이터는 평균 ± 표준 오차(n=3)로 제시되어 있다. 상기 실시예 1에서 기술된 분석 1을 사용하여 도 12에 나타난 결과를 생성하였다.

실시예 4: 인간 1차 세포에서 펩타이드 B(서열번호: 2) 및 KSEVSK 6-mer (서열 번호:3)의 지방생성 활성

상기 실시예들은 골수 간엽 줄기세포 같은 다분화능 줄기세포에서 펩타이드 B 및 KSEVSK 6-mer가 지방생성을 촉진한다는 것을 예시한다. 이들 세포는 피하 지방 패드에 대한 적은 기여자이다. 따라서, 펩타이드 B(서열번호: 2) 및 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3)의 지방생성 효과를 인간 피하 지방 또는 진피 조직으로부터 직접 분리된 인간 1차 세포에서 조사하였다 .

피하 지방 조직은 다양한 수준의 전구세포 능력을 갖는, 다분화능 줄기세포의 풍부한 공급원이다. 인간 지방 유래의 줄기세포(h-ADSC)는 지방세포, 골아세포 및 연골세포를 포함하는 다수의 간엽 표현형으로 분화할 수 있고, 지방 유래 줄기세포의 이러한 집단은 앞서 피하 지방 조직으로 이동한 골수 유래 간엽 줄기세포를 포함한다. 다른 지방 유래 줄기세포는 이들이 이들의 분화 레퍼토리에서 더 제한된다는 점에서 전구 세포이다. 따라서, 지방전구세포는 적절한 자극시 지방세포로 분화하는 것으로 제한된다. 섬유아세포, 특히 하부 진피 또는 피부의 망상 진피층으로부터 유래된 섬유아세포도 지방세포를 전환분화하는 것으로 보고되어 왔다. 이 계층이 도 13에 나타나 있다. 골수 간엽 줄기세포는 피부로 이동하며 다분화능이어서, 예정된 지방세포 전구세포 뿐만 아니라 다른 간엽 세포 유형을 생성한다. 지방전구세포 전구세포는 지방세포로 분화하는 것으로 예정되어 있다. 지방세포는 진피 섬유아세포를 생성할 수 있으며, 이는 지방세포로 되돌아가는 능력이 있다. 도 13에서의 삽입도는 피부에서의 피하 지방층을 보여주며, 이는 도 13에서 도표에 나타난 지방 세포(화살표), 액포 내 지질, 및 줄기 세포를 함유한다.

인간 지방 유래 줄기세포(h- ADSC )의 분화

인간 지방 유래 줄기세포(h-ADSC)를 24-웰 디쉬에서 배양하였고, 양성 지방생성 자극으로서 상업적인 지방생성 칵테일(지방세포 분화 배지 (ZenBio, Chapel Hill, NC, 카탈로그 번호 DM-2))을 이용하여 지방세포로 분화시켰다. 지방세포 분화 배지는 DMEM/Ham's F-12(1:1 v/v), HEPES pH 7.4, 우태아 혈청, 바이오틴, 페니실린, 스트렙토엠실린, 암포테리신 B, 판토테네이트, 인간 인슐린, 덱사메타존, 이소부틸메틸잔틴(IBMX) 및 PPARγ 작용제를 함유하였다. 이 양성 자극을 양성 대조군으로서 사용하였다. 도 14에 나타난 바와 같이, h-ASDC는 지방생성 칵테일에 대한 반응으로 지방세포로 분화된 반면(도 14의 양성 대조군 패널에서 어두운 염색 세포), 지방생성 자극을 받지 않았던 음성 대조군은 분화를 겪지 않았다. 도 14의 상부 우측 패널 및 하부 좌측 패널은 4X 배율로 지방생성 칵테일에 노출된 h-ASDC의 2개의 상이한 시야를 제공한다.

지방전구세포 배지(ZenBio 카탈로그 번호 PM-1, DMEM/Ham's F-12(1:1 v/v) , HEPES 7.4, 우태아 혈청, 페니실린, 스트렙토엠실린, 및 암포테리신 B를 함유함)에서만 유지된 단일층 또는 인슐린 및 PPARγ 작용제 없이 지방생성 칵테일에 노출된 단일층 모두 음성 대조군으로서 사용하였다. 이들 음성 대조군은 유사한 낮은 수준의 지방생성을 나타내었다. 도 15에 나타난 음성 대조군은 지방전구세포 배지에만 노출되었다. 양성 대조군은 음성 대조군과 지방생성 펩타이드 사이의 가장 중간값의 지방생성 수준을 야기하였다(도 15a). 지방생성 펩타이드(펩타이드 B 및 KSEVSK 6-mer)를 PPARγ 작용제 및/또는 인슐린이 결여된 지방생성 칵테일 내로 혼합하였고 실험 조건으로서 사용하였다.

지방생성 칵테일(양성 대조군)은 지방세포의 출현을 자극하였고, 이는 분석의 개시 2주 후에 h-ADSC 단일층에서 지질 소적의 존재에 의해 검출되었다(도 15a, 상부 우측 패널). 이 실험에서, 6-mer KSEVSK 펩타이드(서열번호: 3)가 양성 대조군보다 지방생성 촉진에 더 효과적이었다(도 15a, 하부 패널; "6-mer RHAMM 펩타이드").

KSEVSK 6-mer(서열번호: 3) 및 B 펩타이드(서열번호: 2)의 지방생성 활성을 정량화하기 위해, h-ADSC를 인슐린 및 PPARγ 작용제의 부재 하에 지방생성 칵테일 중의 5 μg/ml의 이들 펩타이드에 노출시켰다. 상기 실험을 지방생성 혼합물을 첨가 후 2주째에 종료하였다. 이때, 단일층의 사진을 촬영하고 지질 소적 축적을 오일 레드 O의 흡광도 측정에 의해 정량화하였다. 도 15b에 나타난 바와 같이, KSEVSK 6-mer(서열번호: 3) 및 B 펩타이드(서열번호: 2)는 음성 대조군과 비교하여 지방생성을 강하게 촉진하였다(p<0.05). 상기 펩타이드들은 PPARγ 작용제 단독 또는 PPARγ 작용제 및 인슐린이 지방생성 칵테일로부터 제거된 때와 비슷할 정도로 지방세포 분화를 자극시켰다(도시되지 않음). 이들 결과는 15-mer B 펩타이드 및 KSEVSK 6-mer 펩타이드가 PPARγ를 통해 작용하는 지방생성 자극을 대신할 수 있음을 보여준다(예를 들면 인슐린).

h-ADSC를 사용한 추가 연구에서, 2가지 상이한 프로토콜을 사용하였다. 이들 프로토콜 중 첫 번째에서, h-ADSC를 지방생성 칵테일 및 5 μg/ml 또는 20 μg/ml의 농도의 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3) 또는 B 펩타이드(서열번호: 2)에 노출시켰다. 결과를 칵테일 단독 및 지방생성 자극을 받지 않은 음성 대조군과 비교하였다. 이들 프로토콜 중 두 번째에서, h-ADSC를 PPARγ 작용제가 5 μg/ml 또는 20 μg/ml의 농도의 KSEVSK 6-mer 또는 B 펩타이드로 대체된 지방생성 칵테일에 노출시켰다. 도 16은 h-ADSC가 PPARγ 작용제의 존재(상부 패널) 또는 부재(하부 패널) 하에 5 μg/ml의 B 펩타이드에 반응하여 지방생성을 겪었음을 보여준다. 도 17은 h-ADSC가 PPARγ 작용제의 존재 하에 5 μg/ml(상부 패널) 또는 20 μg/ml(하부 패널)의 KSEVSK 6-mer 펩타이드(서열번호:3)에 반응하여 지방생성을 겪었음을 보여준다. 도 18은 h-ADSC가 PPARγ 작용제의 부재 하에 5 μg/ml(상부 패널) 또는 20 μg/ml(하부 패널)의 KSEVSK 6-mer 펩타이드(서열번호:3)에 반응하여 지방생성을 겪었음을 보여준다. 지방생성은 도 19에 나타난 바와 같이 520 nm에서 오일 레드 O의 흡수 검출에 의해 정량화하였다. 통계적 분석은 음성 대조군과 비교하여 수행하였다. 데이터는 평균 ± 표준 오차(n=3)로서 제시되어 있다.

인간 피하 지방전구세포의 분화

인간 피하 지방전구세포를 24-웰 디쉬에서 배양하고 양성 지방생성 자극으로서 상기 기재된 상업적 지방생성 칵테일(지방세포 분화 배지 (ZenBio 카탈로그 번호 DM-2))을 이용하여 지방세포로 분화시켰다. 상기에서 언급된 바와 같이, 이 지방생성 칵테일은 판토테네이트, 덱사메타존, 이소부틸메틸잔틴(IBMX), 인간 인슐린 및 PPARγ 작용제를 함유하였다. 이들 실험의 경우, 하기 조건들을 음성 대조군으로 사용하였다: (1) 지방전구세포 배지 단독; (2) PPARγ 작용제 없는 지방생성 칵테일(PPARγ-); 및 (3) PPARγ 작용제 또는 인간 인슐린 없는 지방생성 칵테일. 음성 및 양성 대조군 조건에 대한 오일 레드 O 염색이 도 20에 나타나 있다. 상기 세 가지 유형의 음성 대조군은 서로 유의하게 상이하지 않았고, 도 21은 음성 대조군으로서 지방전구세포 배지에서만 유지된 단일층에 대한 값을 사용한다.

도 21은 인간 피하 지방전구세포에서 B 펩타이드(서열번호: 2) 및 KSEVSK 6-mer(서열번호:3)의 지방생성 효과를 보여준다. 도 21에 대한 양성 대조군은 PPARγ 작용제 및 인슐린 모두를 함유하는 완전한 지방생성 배지였다. 실험 칵테일은 B 펩타이드 또는 KSEVSK 6-mer를 함유하였지만, PPARγ 작용제 및 인슐린이 결여되었다. 지방생성 수준은 추출된 오일 레드 O를 측정함으로써 정량화하였다. 지방전구세포 배지에서만 유지된 지방전구세포(음성 대조군)는 지방세포로 분화하지 않았다(도 21). 양성 대조군은 지질 소적의 출현을 자극하였고(데이터는 도시되지 않음), 이는 음성 대조군 대비 통계적으로 유의하였다(p<0.05). KSEVSK 6-mer 또는 B 펩타이드 중 하나의 부가는 모두 음성 대조군 수준을 초과하여 지방생성을 유의하게 증가시켰다(p<0.05).

도 22-24는 인간 일차 피하 지방전구세포에 대한 오일 레드 O 염색을 보여준다. 도 22는 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3)가 PPARγ 작용제의 부재 하에 인간 일차 피하 지방전구세포의 지방생성을 자극한다는 것을 보여준다. 도 23은 KSEVSK 6-mer가 또한 인슐린 및 PPARγ 작용제의 부재 하에 인간 일차 피하 지방전구세포의 지방생성을 자극한다는 것을 보여준다. 도 24는 B 펩타이드(서열번호: 2)가 인슐린 및 PPARγ 작용제의 부재 하에 인간 일차 피하 지방전구세포의 지방생성을 자극한다는 것을 보여준다.

도 25는 520 nm에서 오일 레드 O의 흡수 검출에 의해 정량화된 바와 같이, 인간 피하 지방전구세포에 대한 펩타이드 B(서열번호:2) 및 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3)의 지방생성 효과를 보여준다. 하기 조건들을 음성 대조군으로서 사용하였다: (Ctr no-γ) = PPARγ 작용제가 없는 지방생성 칵테일에서 배양된 단일층, (Ctr no-γ, no-Ins) = PPARγ 작용제 또는 인간 인슐린이 없는 지방생성 칵테일에서 배양된 단일층. KSEVSK 6-mer 및 B 펩타이드의 지방생성 활성을 시험하기 위해, 인간 지방전구세포를 음성 대조군 및 5 μg/ml 및 20 μg/ml의 농도의 KSEVSK 6-mer 또는 B 펩타이드 중 하나에 노출시켰다. 통계적 분석을 음성 대조군과 비교하여 수행하였다. 데이터는 평균 ± 표준 오차(n=3)로서 제시되어 있다.

인간 망상 섬유아세포의 분화

B 펩타이드 및 KSEVSK 6-mer를 대상으로 상부(유두상) 및 하부(망상) 진피층으 유래의 일차 인간 진피 섬유아세포에 대한 이들의 지방생성 효과를 또한 시험하였다. 일차 인간 섬유아세포는 인간 지원자 생검의 진피절(dermatome) 절편으로부터 수득하였다. 세포를 배양하고 지방생성 배지에 노출시켰다. 이들 실험에서, B 펩타이드 및 KSEVSK 6-mer는 지방생성 자극으로서 인슐린을 대체하였다. 펩타이드는 5 μg/ml의 농도로 사용하였다. 지방생성은 오일 레드 O 염색에 의해 평가하였다. B 펩타이드(서열번호: 2) 및 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3)는 인간 망상 섬유아세포(HRF)의 지방세포로의 전환분화를 유사하게 자극하였지만 인간 유두상 섬유아세포(HRF)에 영향을 미치지 않았다(도 26 및 27). 흰색 화살표는 지방 소적을 보여준다.

도 28은 HRF 및 B 펩타이드로 처리된 HPF에 대한 추가적인 오일 레드 O 염색 결과를 보여준다. B 펩타이드는 HRF의 지방세포로의 전환분화를 자극하였지만, HPF에는 영향을 미치지 않았다.

총괄적으로, 본 실시예에서 기재된 결과들은 길항제 RHAMM 펩타이드(B 펩타이드 및 KSEVSK 6-mer)로 RHAMM 기능을 차단하는 것이 피부에 거주하는 다분화능 줄기세포, 계통 제한된 지방전구세포 및 섬유아세포의 하위집단(예를 들면, 망상 섬유아세포)을 포함하는 적어도 3개의 표적 세포 집단에서 지방생성을 촉진한다는 것을 보여준다. 이들 결과는 도 29에 요약되어 있는데, 여기서 별의 크기는 펩타이드의 자극 효과의 상대적인 정도를 가리킨다. 상기 결과들은 RHAMM 펩타이드의 효과가 예정되거나 분화된 (섬유아세포) 피부 세포보다 다분화능 줄기세포에 대해 더 강하지만, 인간 피부에 이들 펩타이드를 위한 다수의 표적이 있다는 것을 제시한다.

실시예 5: 3D 배양에서 펩타이드 B의 지방생성 활성

펩타이드 B(서열번호:2)의 지방생성 활성을 또한 인간 피부를 모델링하는 3차원(3D) 배양 시스템을 이용하여 조사하였다.

인간 지방전구세포를 상기 기재된 지방생성 칵테일(지방세포 분화 배지 (ZenBio 카탈로그 번호 DM-2))의 존재 하에 3D 콜라겐 겔에서 배양하고 펩타이드 B(서열번호: 2)에 노출시켰다. 도 30에 나타난 바와 같이, 펩타이드 B는 가벼운 다루기 힘든 지방 소적의 출현에 의해 검출된 바와 같이 지방생성을 촉진하였다. 이러한 결과는 펩타이드 B가 보다 생리적인 조건 하에 인간 지방세포 전구 세포의 지방생성을 촉진한다는 것을 보여준다. 3D 결과는 생체내에서 지방생성을 촉진하는 B 펩타이드의 능력을 예측한다.

실시예 6: 렛트 모델에서 KSEVSK 6-mer의 생체내 지방생성 활성

KSEVSK 6-mer(서열번호: 3)의 지방생성 활성을 또한 암컷 은퇴 종축 랫트 모델에서 생체내에서 평가하였다. 암컷 피셔(Fisher) 은퇴 종축 랫트(> 9 개월)를 이들 연구에 사용하였다. 상기 랫트에게 KSEVSK 6-mer 펩타이드 1 ml의 콜라겐 비히클 중에 KSEVSK 6-mer 펩타이드의 100 μg 용량을 또는 콜라겐 비히클 단독을 피하로 주사하였다. 상기 콜라겐 비히클은 1 mg/ml의 랫트 꼬리 I형 콜라겐을 함유하였다. 도 31에 예시된 바와 같이, 각각의 랫트는 이들의 엉덩이의 네 개의 부위에 주사를 맞았다. 랫트에게 A 및 C 부위에 KSEVSK 6-mer 펩타이드 및 콜라겐 비히클을 주사하였고 B 및 D 부위에는 콜라겐 비히클만을 주사하였다. 동물들은 7일간 정규 식이에 유지한 다음, 안락사시켰다. 상기 주사된 부위 근처를 잘라 피부를 수확하여, 기저 지방 조직이 주사 부위에 있는 피부와 함께 유지되게 하였다. 이후, 상기 조직을 촬영하고 지방 축적을 평가하였다.

도 31은 콜라겐 단독 주사와 비교하여 1 ml의 콜라겐 비히클 중의 KSEVSK 6-mer 펩타이드의 100 μg 용량의 피하 주사 후 랫트에서 지방 패드 형성을 보여준다. 도 31의 상부 패널은 콜라겐 + KSEVSK 6-mer 펩타이드에 대한 주사 부위 및 콜라겐 비히클 단독에 대한 주사 부위를 보여준다. 도 31의 하부 패널은 콜라겐 비히클 단독("대조군")과 비교하여 KSEVSK 6-mer로 주사된 랫트에서의 피하 지방 형성을 보여준다. 도 31의 하부 패널에서의 점선은 지방 패드의 윤곽을 표시한다.

도 32는 랫트 모델에 KSEVSK 6-mer의 100 μg 용량의 피하 주사 후 지방 패드 표면적에 대한 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3)의 효과를 보여준다. KSEVSK 6-mer 펩타이드에 대한 노출로부터 생성된 지방 패드는 콜라겐 비히클 단독에 의해 유도된 것보다 유의하게 더 컸다. 도 32에서, "총 상부"는 주사 부위 A(콜라겐 + 펩타이드) 또는 B(콜라겐 단독)에서의 주사에 대한 평균 누적된 지방을 지칭하고, "총 하부"는 주사 부위 C(콜라겐 + 펩타이드) 또는 D(콜라겐 단독)에서의 주사에 대한 평균 누적된 지방을 지칭한다.

실시예 7: KSEVSK 6-mer (서열번호:3)의 알라닌 돌연변이유발

지방생성 효과에 필요한 핵심 아미노산을 확인하기 위해, KSEVSK 6-mer(서열번호: 3)의 알라닌 돌연변이유발을 수행하였다. KSEVSK 6-mer의 각 아미노산을 알라닌 잔기로 돌연변이시켜 하기 펩타이드를 만들었다: ASEVSK(서열번호: 38), KAEVSK(서열번호: 39), KSAVSK(서열번호: 32), KSEASK(서열번호: 22), KSEVAK(서열번호: 40), 및 KSEVSA(서열번호: 41). 이들 각각의 펩타이드의 지방생성효과를 상기 실시예 1에서 기재된 바와 같이 분석 1 및 2를 이용하여 랫트 간엽줄기 세포에서 평가하였다. 지방생성은 오일 레드 O 염색에 의해 정량화하였다. 각 펩타이드를 3주에 걸쳐 0.5, 5, 및 50 μg/ml의 농도로 시험하였다. 세포를 48-웰 배양 플레이트에 도말하였고, 펩타이드의 순도는 >95%였다. 모든 데이터는 음성 대조군(Ctr(-)) 대비 배수 변화 ± 표준 오차로서 제시되어 있다.

히알루로난 결합과 지방생성 사이에 연관성이 있는 것으로 보이므로, 그리고 히알루로난 결합이 염기성 잔기를 필요로 하므로, 측면의 라이신(K) 잔기들을 먼저 돌연변이시켰다. 이들 실험의 결과가 도 33(분석 1) 및 34(분석 2)에 나타나 있다. 도 33에 나타난 바와 같이, 분석 1에서, 예기치 못하게 측면 라이신 잔기들(위치 1 및 6)의 알라닌 잔기로의 치환은 지방생성 활성을 감소시키지 않았다. 위치 3에 있는 글루타메이트 잔기, 위치 4에 있는 발린 잔기, 및 위치 5에 있는 세린 잔기의 알라닌으로의 단일 아미노산 치환을 수행하였다. 위치 3 및 4에서의 치환, 및 보다 적게 위치 5에서의 치환은 분석 1에서 지방생성 활성의 감소를 야기하였고, 이는 이들 아미노산들이 펩타이드의 지방생성 효과에 기여한다는 것을 보여준다(도 33). 분석 2에서, 단일 알라닌 치환은 일반적으로 펩타이드의 지방생성 활성에 영향을 미치지 않았다(도 34).

KSEVSK 6-mer의 2개의 잔기가 알라닌으로 돌연변이된 펩타이드를 합성하고 지방생성 활성을 시험하였다. 특히, 위치 1 및 6, 2 및 5, 또는 3 및 4에 있는 아미노산이 알라닌 잔기로 대체된 펩타이드들을 합성하였다. 이들 연구의 결과가 도 33 및 34에서 나타나 있다. 도 33에 나타난 바와 같이, 분석 1에서, ASEVSA 이중 돌연변이체(서열번호: 93)는 예상외로 음성 대조군 및 KSEVSK 6-mer(서열번호: 3)와 비교하여 유의하게 증가된 지방생성 활성을 가지는 것으로 확인되었다. 반면, 분석 2에서, 이중 치환은 지방생성 활성을 감소시켰다(도 34).

실시예 1에서 앞서 기재된 바와 같이, 랫트 간엽 줄기세포에서 펩타이드의 지방생성 효과를 평가하기 위해 2개의 상이한 지방생성 분석을 사용하였다. 분석 1은 섬유아세포의 지방세포로의 전환분화를 촉진하는데 전형적으로 사용되는 분석인 반면, 분석 2는 다분화능 간엽 전구 세포의 지방세포로의 분화를 촉진하기 위해 전형적으로 사용된다. 두 분석을 위해 불멸화된 랫트 골수 간엽 줄기세포를 사용하였다. 이들 세포는 섬유아세포, 지방전구세포, 연골전구세포 및 골아전구세포를 포함하는 상이한 계통의 세포들을 함유한다. 따라서, 섬유아세포 계통의 지방세포로의 전환분화를 촉진하기 위해 분석 1을 사용하였고, 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 촉진하기 위해 분석 2를 사용하였다.

상기 실시예 1에 기재된 바와 같이, 분석 1을 위한 기폭 자극은 IBMX(3-이소부틸-1-메틸잔틴) 및 덱사메타존, 및 그 다음 최종 지방생성 자극으로서 인슐린을 포함한다. 분석 2를 위한 기폭 자극은 IBMX, 덱사메타존 및 인도메타신, 및 그 다음 최종 지방생성 자극으로서 인슐린을 포함한다.

KSEVSK 서열에서의 아미노산 요건이 섬유아세포의 지방세포로의 전환분화보다 지방전구세포의 지방세포로의 분화에 대해 훨씬 덜 엄격하다는 것이 예기치않게 확인되었다. 예를 들면, 위치 3, 4, 5, 및 6에 있는 아미노산들은 섬유아세포의 전환분화에 중요한 것으로 밝혀졌지만, 이들 위치에서의 단일 아미노산 변화들은 지방전구세포 분화에 단지 적은 영향을 미쳤다. 오히려, 지방전구세포 분석(분석 2)에서 KSEVSK 6-mer의 지방생성 활성을 제거하기 위해 이중 돌연변이가 필요하였다. 두 아미노산 1 및 6을 알라닌으로 돌연변이시키는 것은 전환분화 분석(분석 1)에서 KSEVSK 펩타이드 대비 지방생성 활성에 예기치 못한 증가를 야기하였지만, 이들 변형은 지방전구세포 분석(분석 2)에서 지방생성 활성을 제거하였다. 총괄적으로, 이들 결과는 지방세포로의 섬유아세포 분화를 촉진하는 조건에서 RHAMM 기능을 차단하는 효과가 지방세포로의 지방전구세포 분화를 촉진하는 것과 상이하다는 것을 가리킨다. 이들 결과는 특이적 세포 유형(예를 들면, 섬유아세포 대 전구 세포)을 선택적으로 표적화하여 지방생성을 매우 선택적으로 촉진할 펩타이드를 설계하는 것이 가능하다는 것을 보여준다.

실시예 8: KSEVSK 6-mer (서열번호:3)의 절단

또한, 더 짧은 서열을 또한 조사하였고, 펩타머가 또한 지방생성 효과를 나타내었음을 발견하였다. 각각 측면 라이신 잔기가 검출된 펩타머를 또한 합성하였다. 도 35에 나타난 바와 같이, 이들 펜타머(KSEVS(서열번호 82) 및 SEVSK(서열번호: 83))는 둘다 KSEVSK(서열번호: 3) 헥사머보다 활성이 더 낮았고, 이는 말단 라이신 잔기들의 중요성을 확인시켜준다. 그러나, 두 펜타머는 여전히 낮은 수준의 지방생성 활성을 보였다(도 13에서, A2-Ctrl(-)X10은 음성 대조군이고, A2-1X10은 1 μg의 용량이며, A2-5X10은 5 μg의 용량이고, A2-25X10은 25 μg의 용량이며; y-축은 520 nm에서 흡광도이다).

KSEVSK(서열번호: 3) 펩타이드의 펜타머 펩타이드로의 절단 및 알라닌 치환실험의 결과는 측면 라이신 잔기의 치환이 지방생성 활성을 제거하지 못한다는 것을 보여주며, 두 라이신 잔기의 알라닌과 같은 소수성 잔기로의 치환이 KSEVSK의 원래의 RHAMM 서열보다 더 높은 수준의 지방생성 활성을 갖는 펩타이드를 생성할 수 있음을 가리킨다.

실시예 9: KSEVSK -유사 지방생성 서열의 확인 및 특성규명

펩타이드에 지방생성 활성을 부여하는데 충분한 최소 모티프를 확인하기 위해, KSEVSK(서열번호: 3) 헥사머를 BLAST 데이터베이스를 문의하는데 사용하여 다른 유기체로부터 RHAMM 단백질에서의 진화론적으로 보존된 서열을 확인하였다. 이 문의의 결과가 표 3에 하기에 나타나 있다.

표 3. 다양한 종으로부터의 RHAMM 단백질에서의 KSEVSK(서열번호: 3) 서열의 진화론적 보존.

* BLAST 데이터베이스는 상기 3개의 열거된 서열 각각을 포함하는 다니오 레리오 RHAMM 단백질 서열을 포함한다.

또한, KSEVSK(서열번호: 3) 서열의 BLAST 문의는 지방생성 및 히알루로난과 관련된 다른 단백질에서 발견되는 많은 유사 서열, 예를 들면 Sox 2, Sox 21, 및 상류 결합 인자-1을 확인하였다. 이들 서열은 표 4에서 하기에 나타나 있다.

표 4. 지방생성 및 히알루로난과 관련된 단백질에서 발견되는 KSEVSK(서열번호: 3)-유사 서열.

표 3 및 4로부터의 서열들을 서로 정렬하고 본원에 기재된 모티프를 생성하는데 사용하였다. 이들 서열의 제2, 제3, 제4, 및 제5 위치에 있는 아미노산의 다양성에 비추어, 이들 위치에서의 알라닌 돌연변이유발은 적어도 일부 지방생성 활성을 갖는 펩타이드를 생성할 것으로 예상된다. 따라서, 본원에 논의된 가장 넓은 모티프를 생성하는데 있어서, 알라닌 잔기는 펩타이드의 제2, 제3, 제4, 또는 제5 위치에 존재할 수 있을 것으로 추정되었다.

펩타이드 KSELRK(서열번호: 23), KSEVGK(서열번호: 19), 및 LSELEK(서열번호: 11)를 대상으로 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 분석 1 및 2를 이용하여 랫트 간엽 줄기세포에서 지방생성 효과에 대해 시험하였다. 지방생성은 오일 레드 O 염색에 의해 정량화하였다. 각 펩타이드를 3주간에 걸쳐 0.5, 5, 및 50 μg/ml 농도에서 시험하였다. 세포를 48-웰 배양 플레이트에 도말하였고, 펩타이드의 순도는 >95%였다. 모든 데이터는 음성 대조군(Ctr(-)) 대비 배수 변화 ± 표준 오차로서 제시되어 있다. 이들 실험의 결과가 도 36(분석 1) 및 37(분석 2)에 나타나 있다. 분석 1에서, 위치 4(예를 들면, V로부터 L로) 또는 위치 1 또는 5에서의 보전적 변화는 지방생성 활성에 강하게 영향을 미치지 않았다. 이들 결과는 상기 기재된 알라닌 치환 실험과 일치한다. 분석 2에서, 데이터는 아미노산에서의 단일 치환이 분석 2를 위한 알라닌 치환 분석에 의해 예상되는 바와 같이 지방생성을 강하게 변형하지 않는 반면, 이중 치환은 더 강한 효과를 갖는다는 것(예를 들면, LSELEK에 대한 결과에 의해 나타난 바와 같이, 아미노산 1, 4, 및 5를 변화시키는 것은 지방생성을 증가시켰음)을 제시한다. 이들 결과는 KSEVSK 펩타이드가 특정 세포 유형 또는 분화 프로그램(예를 들면, 분석 1 대 분석 2)에 대한 지방생성 효과를 증가시키거나, 감소시키거나, 표적화하기 위해 변형될 수 있음을 가리킨다.

실시예 10: STMMSR -유사 지방생성 서열의 확인 및 특성규명

상기에 언급된 바와 같이, 펩타이드 P15-1(서열번호: 1)을 절단하여 서열 STMMSRSHK("단편 B"; 서열번호: 62)를 갖는 9-mer를 만들었고, 이 9-mer는 지방생성 활성을 갖는 것으로 나타났다. COBALT 및 MUSCLE 정렬 도구를 이용한 KSEVSK(서열번호: 3) 헥사머와의 펩타이드 P15-1의 정렬은 하기 나타난 바와 같이 서열 KSEVSK가 펩타이드 P15-1의 STMMSR 부분과 정렬한다는 것을 밝혀내었다:

KSEVSK---------

STMMSRSHKTRSHHV

따라서, 펩타이드 P15-1(서열번호: 1)의 더 짧은 단편, 및 특히 헥사머 서열 STMMSR(서열번호: 51)이 또한 지방생성 활성을 갖는 것으로 예상된다. STMMSR 서열의 BLAST 문의는 지방생성 및 히알루로난과 관련된 다른 단백질에서 발견되는 많은 유사 서열, 예를 들면 칼슘 결합 단백질 1, 리보뉴클레아제 P 단백질, ADP 리보실화 인자 단백질 5, 막통과 단백질 236, 혈장 세린 프로테아제 억제제, CD80, 라이소포스파티드산 수용체, 혈장 세린 프로테아제 억제제, 안지오포이에틴 2, ADP-리보실화 인자 결합 단백질, 유비퀴틴 단백질 2, 클라트린 중쇄 2, 전이 억제제 단백질 1, 폴리시스틴 2, 및 테트라트리코펩타이드 반복 단백질 17을 확인하였다. 이들 서열이 표 5에서 하기에 나타나 있다.

표 5. 지방생성 및 히알루로난과 관련된 단백질에서 발견되는 STMMSR-유사 서열.

표 5에서의 서열을 서로 그리고 STMMSR 서열(서열번호: 51)과 정렬하여 본원에 기재된 모티프를 생성하였다.

펩타이드 STRMSR(서열번호: 57) 및 STTMSR(서열번호: 56)을 대상으로 상기 실시예 1에 기재된 바와 같은 분석 1 및 2를 이용하여 랫트 간엽 줄기세포에서 지방생성 효과를 시험하였다. 지방생성은 오일 레드 O 염색에 의해 정량화하였다. 각 펩타이드를 3주간에 걸쳐 0.5, 5, 및 50 μg/ml의 농도에서 시험하였다. 세포를 48-웰 배양 플레이트에 도말하였고, 펩타이드의 순도는 >95% 였다. 모든 데이터는 음성 대조군(Ctr(-)) 대비 배수 변화 ± 표준 오차로서 제시되어 있다. 이들 실험의 결과가 도 38(분석 1) 및 39(분석 2)에 나타나 있다. 상기 데이터는 이 펩타이드 그룹이 분석 1 및 2에서 지방 생성이 약했음을 보여준다. 또한, 도 38 및 39에서 나타난 바와 같이, 펩타이드 STMMRSH(서열번호: 97)를 또한 시험하였고 이 분석에서 KSEVSK와 유사하게, 시험된 모든 농도에서 분석 1에서의 음성 대조군보다 유의하게 더 큰 지방생성 활성을 갖는 반면, 분석 2에서는 0.5 μg/ml 농도에서 활성인 것으로 나타났다. 펩타이드 SIMMSR(서열번호 52)을 또한 시험하였고 분석 1 및 2에서 지방 생성이 약한 것으로 확인되었다.

본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 설명을 위한 것이고 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당해분야의 숙련가에게 제안될 것이며, 이는 본원의 사상 및 범주 및 부가된 청구항들의 범위 안에 포함될 것임이 이해된다. 본원에 인용된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있다.

본원 또는 이의 바람직한 구현예(들)의 요소를 도입할 때, 관사, 및 "상기"는 상기 요소들 중 하나 이상이 존재한다는 것을 의미하고자 하는 것이다. 용어 "포함하는", "포함하다" 및 "갖는"은 포괄적인 것으로 의도되며, 열거된 요소 외에도 부가적인 요소가 있을 수 있음을 의미한다.

상기에 비추어, 본 발명의 몇 가지 목적들은 달성되며 다른 유리한 결과들이 달성된다는 것이 명백해질 것이다.

본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 상기 방법에 다양한 변화가 이뤄질 수 있기 때문에, 상기 명세서에 함유되고 첨부된 도면에 나타난 모든 사항은 예시적이며 제한하는 의미가 아닌 것으로 해석되어야 하는 것으로 의도된다. 본원에 인용된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로써 본원에 포함되어 있다.

SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California TURLEY, EVA BAHRAMI, SEYED BAHRAM BISSELL, MINA J <120> PEPTIDES THAT STIMULATE SUBCUTANEOUS ADIPOGENESIS <130> ALDM 3048.WO <150> US 61/778,084 <151> 2013-03-12 <150> US 61/729,626 <151> 2012-11-25 <160> 109 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Ser Thr Met Met Ser Arg Ser His Lys Thr Arg Ser His His Val 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 2 Lys Leu Lys Asp Glu Asn Ser Gln Leu Lys Ser Glu Val Ser Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 3 Lys Ser Glu Val Ser Lys 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 4 Lys Gln Glu Val Ser Lys 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 5 Lys Gln Glu Val Asp Lys 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 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<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 75 Thr Met Ala Ala Ala Met Ala Ser 1 5 <210> 76 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 76 Thr Leu Leu Met Met Thr 1 5 <210> 77 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 77 Ala Met Leu Ile Met Ser 1 5 <210> 78 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 78 Thr Ala Ala Met 1 <210> 79 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 79 Phe Thr Met Ala 1 <210> 80 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 80 Thr Cys Cys Arg Ser 1 5 <210> 81 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 81 Thr Leu Ala Leu Met 1 5 <210> 82 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 82 Lys Ser Glu Val Ser 1 5 <210> 83 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 83 Ser Glu Val Ser Lys 1 5 <210> 84 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 84 Arg Gln Lys Val Leu Lys 1 5 <210> 85 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 85 Leu Gln Ala Thr Gln Lys 1 5 <210> 86 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 86 Gln Leu Val Lys Arg Lys 1 5 <210> 87 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 87 Gln Lys Val Leu Lys Arg 1 5 <210> 88 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 88 Gly Gly Arg Gly Arg Arg 1 5 <210> 89 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 89 Gly Gly Arg Gly Gly Arg 1 5 <210> 90 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 90 Gly Gly Gly Gly Gly Arg 1 5 <210> 91 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 91 Leu Asp Ala Phe Glu Ala Glu Lys Gln Ala Leu Leu Asn Glu His Gly 1 5 10 15 Ala Thr Gln Glu Gln Leu Asn Lys Ile Arg Asp Ser Tyr Ala Gln Leu 20 25 30 Leu Gly His Gln Asn Leu Lys Gln Lys Ile Lys His Val Val Lys Leu 35 40 45 Lys Asp Glu Asn Ser Gln Leu Lys Ser Glu Val Ser Lys Leu Arg Ser 50 55 60 Gln Leu Val Lys Arg Lys Gln Asn Glu Leu Arg Leu Gln Gly Glu Leu 65 70 75 80 Asp Lys Ala Leu Gly Ile Arg His Phe Asp Pro Ser Lys Ala Phe Cys 85 90 95 His Ala Ser Lys Glu Asn Phe Thr Pro Leu Lys Glu Gly Asn Pro Asn 100 105 110 Cys Cys <210> 92 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 92 Leu Lys Gln Lys Ile Lys His Val Val Lys Leu Lys Asp Glu Asn Ser 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Glu Val Ser Lys Leu Arg Ser Gln Leu Val Lys Arg 20 25 30 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 93 Lys Leu Lys Asp Glu Asn Ser 1 5 <210> 94 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 94 Ala Ser Glu Val Ser Ala 1 5 <210> 95 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 95 Lys Ala Glu Val Ala Lys 1 5 <210> 96 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 96 Lys Ser Ala Ala Ser Lys 1 5 <210> 97 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 97 Ser Thr Met Met Arg Ser 1 5 <210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 98 Ser Thr Met Met Arg Ser His 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 99 Arg Ser His Lys Thr Arg Ser His His 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 100 Gln Leu Lys Ser Glu Val Ser Lys Leu 1 5 <210> 101 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 101 Lys Gln Lys Ile Lys His Val Val Lys Leu Lys Asp Glu Asn Ser Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Glu Val Ser Lys Leu Arg Cys Gln Leu Ala Lys Lys Lys 20 25 30 <210> 102 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 102 Lys Gln Lys Ile Lys His Val Val Lys Leu Lys Asp Glu Asn Ser Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Glu Val Ser Lys Leu Arg Ser Gln Leu Val Lys Arg Lys 20 25 30 <210> 103 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 103 Lys Leu Lys Asp Glu Asn Ser Gln Leu Lys Ser Glu Val Ser Lys Leu 1 5 10 15 Arg Ser Gln Leu Val Lys 20 <210> 104 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 104 Lys Gln Lys Ile Lys His Val Val Lys Leu Lys Asp Glu Asn Ser Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Glu Val Ser Lys Leu Arg Ser Gln Leu Val Lys Arg Lys 20 25 30 Gln Asn Glu Leu Arg Leu Gln Gly Glu Leu Asp Lys Ala Leu 35 40 45 <210> 105 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 105 Ser Thr Met Met Ser Arg Ser His Lys Thr Arg Ser Cys His His 1 5 10 15 <210> 106 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 106 Ser Thr Met Met Ser Arg Ser His Lys Thr Arg Ser His His 1 5 10 <210> 107 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 107 Ser Thr Met Met Ser Arg Ser His Lys Thr Arg Ser His His Val 1 5 10 15 <210> 108 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 108 Ser Thr Met Met Arg Ser His Lys Thr Arg Ser His His Val 1 5 10 <210> 109 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic construct <400> 109 Cys Ser Thr Met Met Ser Arg Ser His Lys Thr Arg Ser His His Val 1 5 10 15

Claims (88)

1. 피하 지방생성을 자극하기 위한, 약제학적으로 또는 화장용으로 허용가능한 담체 및 펩타이드를 포함하는 약제학적 또는 화장용 조성물로서, 상기 펩타이드는 6 내지 31 개의 아미노산의 길이를 가지며 아래 서열을 포함하는 조성물:
   X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶
   여기서
   X¹ 및 X⁶ 중 적어도 하나는 양으로 하전된 아미노산 또는 알라닌 (A)이고;
   X¹ 및 X⁶ 중 다른 하나는 양으로 하전된 아미노산, 류신 (L), 또는 알라닌 (A)이고;
   X²는 세린 (S), 글루타민 (Q), 알라닌 (A), 글루타메이트 (E), 아스파라긴 (N), 프롤린 (P), 시스테인 (C), 라이신 (K), 아스파르테이트 (D), 트립토판 (W), 메티오닌 (M), 또는 트레오닌 (T)이고;
   X³는 음으로 하전된 아미노산, 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 세린 (S), 라이신 (K), 아스파라긴 (N), 또는 트레오닌 (T)이고;
   X⁴는 이소류신 (I), 발린 (V), 류신 (L), 아스파라긴 (N), 알라닌 (A), 세린 (S), 프롤린 (P), 트레오닌 (T), 또는 글루타민 (Q)이고;
   그리고 X⁵는 세린 (S), 아스파르테이트 (D), 트레오닌 (T), 류신 (L), 알라닌 (A), 페닐알라닌 (F), 글루타메이트 (E), 아스파라긴 (N), 글리신 (G), 아르기닌 (R), 글루타민 (Q), 히스티딘 (H), 또는 이소류신 (I)이고;
   단, X² 및 X⁵ 둘 모두는 글루타민 (Q)가 아니고;
   그리고 단, X¹이 아르기닌 (R)일 때, X³은 라이신 (K)이 아니다.
2. 피하 지방생성을 자극하기 위한, 약제학적으로 또는 화장용으로 허용가능한 담체 및 펩타이드를 포함하는 약제학적 또는 화장용 조성물로서, 상기 펩타이드는 5 내지 31 개의 아미노산의 길이를 가지며 아래 서열을 포함하는 조성물:
   X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶
   여기서
   X¹ 및 X⁶ 중 적어도 하나는 양으로 하전된 아미노산 또는 알라닌 (A)이고;
   X¹ 및 X⁶ 중 다른 하나는 양으로 하전된 아미노산, 류신 (L) 또는 그것을 위한 보존적 치환, 알라닌 (A) 또는 그것을 위한 보존적 치환이거나, 부재하고; 그리고
   X²-X³-X⁴-X⁵는 아미노산 서열 SEVS와 적어도 50% 서열 동일성을 가지며 4 내지 8 개의 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열이다.
3. 피하 지방생성을 자극하기 위한, 약제학적으로 또는 화장용으로 허용가능한 담체 및 펩타이드를 포함하는 약제학적 또는 화장용 조성물로서, 상기 펩타이드는 6 내지 13 개의 아미노산의 길이를 가지며 아래 서열을 포함하는 조성물:
   Z¹-Z²-Z³-Z⁴-Z⁵-Z⁶
   여기서
   Z¹은 세린 (S) 또는 그것을 위한 보존적 치환이고;
   Z²는 소수성 아미노산이고;
   Z³은 임의의 아미노산이고;
   Z⁴는 소수성 아미노산이고;
   Z⁵는 세린 (S), 아르기닌 (R), 또는 그것을 위한 보존적 치환이고; 그리고
   Z⁶은 하전된 아미노산 또는 세린(S)이고;
   단, Z¹, Z² 및 Z⁴ 모두는 글리신 (G)이 아니고;
   단, Z¹은 글루타민 (Q)가 아니고; 그리고
   단, Z²는 히스티딘 (H)이 아니다.
4. 피하 지방생성을 자극하기 위한, 약제학적으로 또는 화장용으로 허용가능한 담체 및 펩타이드를 포함하는 약제학적 또는 화장용 조성물로서, 상기 펩타이드는 6 내지 13 개의 아미노산의 길이를 가지며 아래 서열을 포함하는 조성물:
   Z¹-Z²-Z³-Z⁴-Z⁵-Z⁶
   여기서
   Z¹은 세린 (S) 또는 그것을 위한 보존적 치환이고;
   Z⁶은 하전된 아미노산 또는 세린 (S)이고; 그리고
   Z²-Z³-Z⁴-Z⁵는 아미노산 서열 TMMS와 적어도 50% 서열 동일성을 가지며 2 내지 8 개의 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열이다.
5. 청구항 2에 있어서, 상기 펩타이드의 길이는 적어도 6 개의 아미노산인 조성물.
6. 청구항 1, 2, 및 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 길이는 21 개 이하의 아미노산인 조성물.
7. 청구항 1, 2, 및 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 길이는 14 개 이하의 아미노산인 조성물.
8. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항 있어서, 상기 펩타이드의 길이는 8 개 이하의 아미노산인 조성물.
9. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 길이는 13 개의 아미노산인 조성물.
10. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 길이는 12 개의 아미노산인 조성물.
11. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 길이는 11 개의 아미노산인 조성물.
12. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 길이는 10 개의 아미노산인 조성물.
13. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 길이는 9 개의 아미노산인 조성물.
14. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 길이는 8 개의 아미노산인 조성물.
15. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 길이는 7 개의 아미노산인 조성물.
16. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 길이는 6 개의 아미노산인 조성물.
17. 청구항 1, 2, 및 5 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 둘 모두의 X¹ 및 X⁶은 양으로 하전된 아미노산인 조성물.
18. 청구항 1, 2, 및 5 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, X⁶는 라이신 (K) 또는 아르기닌 (R)인 조성물.
19. 청구항 1, 2, 및 5 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, X¹은 라이신 (K)이고, X⁶은 라이신 (K)이거나, 또는 둘 모두의 X¹ 및 X⁶은 라이신인 조성물.
20. 청구항 1, 2, 및 5 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 둘 모두의 X¹ 및 X⁶은 알라닌 (A)인 조성물.
21. 청구항 1, 2, 및 5 내지 20 중 어느 한 항 에 있어서, X²는 세린 (S), 글루타민 (Q), 알라닌 (A), 글루타메이트 (E), 아스파라긴 (N), 프롤린 (P), 시스테인 (C), 라이신 (K), 아스파르테이트 (D), 트립토판 (W), 또는 메티오닌 (M)인 조성물.
22. 청구항 21에 있어서, X²는 세린 (S) 또는 글루타민 (Q)인 조성물.
23. 청구항 1, 2, 및 5 내지 22 중 어느 한 항 에 있어서, X³은 음으로 하전된 아미노산, 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 세린 (S), 라이신 (K), 또는 아스파라긴 (N)인 조성물.
24. 청구항 23에 있어서, X³은 글루타민 (E) 또는 아스파르테이트 (D)인 조성물.
25. 청구항 1, 2, 및 5 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, X⁴는 이소류신 (I), 발린 (V), 류신 (L), 아스파라긴 (N), 알라닌 (A), 세린 (S), 프롤린 (P), 또는 트레오닌 (T)인 조성물.
26. 청구항 25에 있어서, X⁴는 이소류신 (I), 발린 (V), 또는 류신 (L)인 조성물.
27. 청구항 1, 2, 및 5 내지 26 중 어느 한 항 에 있어서, X⁵는 세린 (S), 아스파르테이트 (D), 트레오닌 (T), 류신 (L), 알라닌 (A), 페닐알라닌 (F), 글루타메이트 (E), 아스파라긴 (N), 글리신 (G), 아르기닌 (R), 글루타민 (Q), 또는 히스티딘 (H)인 조성물.
28. 청구항 27에 있어서, X⁵는 세린 (S), 아스파르테이트 (D), 트레오닌 (T), 또는 글루타메이트 (E)인 조성물.
29. 청구항 1 및 5 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 RQKVLK (서열번호: 84) 및/또는 LQATQK(서열번호: 85)를 포함하지 않는 조성물.
30. 청구항 1, 2, 및 5 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 KSEVSK (서열번호: 3), KQEVSK (서열번호: 4), KQEVDK (서열번호: 5), KQENTK (서열번호: 6), KSEVLK (서열번호: 7), KQDVSK (서열번호: 8), KQELDR (서열번호: 9), LEEIFK (서열번호: 10), LSELEK (서열번호: 11), KSEISK (서열번호: 12), KNEVSK (서열번호: 13), KSEVTK (서열번호: 14), KSEVNK (서열번호: 15), KSDVSK (서열번호: 16), KSQVSK (서열번호: 17), KPEVSK (서열번호: 18), KSEVGK (서열번호: 19), KSDSSK (서열번호: 20), KSSPSK (서열번호: 21), KSEASK (서열번호: 22), KSELRK (서열번호: 23), KCEVSK (서열번호: 24), KSKPSK (서열번호: 25), KKEVSK (서열번호: 26), KEEVSK (서열번호: 27), KSETSK (서열번호: 28), KSNVSK (서열번호: 29), KDEVSK (서열번호: 30), KSEVEK (서열번호: 31), KSAVSK (서열번호: 32), KWEVSK (서열번호: 33), KMEVSK (서열번호: 34), KSEVQK (서열번호: 35), KSEVHK (서열번호: 36), KSSVSK (서열번호: 37), ASEVSK (서열번호: 38), KAEVSK (서열번호: 39), KSEVAK (서열번호: 40), KSEVSA (서열번호: 41), ASEVSA (서열번호: 93), KAEVAK (서열번호: 94), KSAASK (서열번호: 95), 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
31. 청구항 30에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 KSEVSK (서열번호: 3), ASEVSA (서열번호: 93), 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
32. 청구항 1, 2 및 5 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 KSEVSK (서열번호: 3), KQEVSK (서열번호: 4), KQEVDK (서열번호: 5), KQENTK (서열번호: 6), KSEVLK (서열번호: 7), KQDVSK (서열번호: 8), KQELDR (서열번호: 9), LEEIFK (서열번호: 10), LSELEK (서열번호: 11), KSEISK (서열번호: 12), KNEVSK (서열번호: 13), KSEVTK (서열번호: 14), KSEVNK (서열번호: 15), KSDVSK (서열번호: 16), KSQVSK (서열번호: 17), KPEVSK (서열번호: 18), KSEVGK (서열번호: 19), KSDSSK (서열번호: 20), KSSPSK (서열번호: 21), KSEASK (서열번호: 22), KSELRK (서열번호: 23), KCEVSK (서열번호: 24), KSKPSK (서열번호: 25), KKEVSK (서열번호: 26), KEEVSK (서열번호: 27), KSETSK (서열번호: 28), KSNVSK (서열번호: 29), KDEVSK (서열번호: 30), KSEVEK (서열번호: 31), KSAVSK (서열번호: 32), KWEVSK (서열번호: 33), KMEVSK (서열번호: 34), KSEVQK (서열번호: 35), KSEVHK (서열번호: 36), KSSVSK (서열번호: 37), ASEVSK (서열번호: 38), KAEVSK (서열번호: 39), KSEVAK (서열번호:40), KSEVSA (서열번호: 41), ASEVSA (서열번호: 93), KAEVAK (서열번호: 94), KSAASK (서열번호: 95), LKSEVSK (서열번호: 42), QLKSEVSK (서열번호: 43), SQLKSEVSK (서열번호: 44), NSQLKSEVSK (서열번호: 45), ENSQLKSEVSK (서열번호: 46), DENSQLKSEVSK (서열번호: 47), KDENSQLKSEVSK (서열번호: 48), LKDENSQLKSEVSK (서열번호: 49), 또는 KLKDENSQLKSEVSK (서열번호: 2)로 이루어진 조성물.
33. 청구항 1, 2, 및 5 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 KSEVSK (서열번호: 3), ASEVSA (서열번호: 93), LKSEVSK (서열번호: 42), QLKSEVSK (서열번호: 43), SQLKSEVSK (서열번호: 44), 또는 KLKDENSQLKSEVSK (서열번호: 2)로 이루어진 조성물.
34. 청구항 2, 5 내지 28, 및 30 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X²-X³-X⁴-X⁵의 길이는 4 내지 6 개의 아미노산인 조성물.
35. 청구항 34에 있어서, 상기 X²-X³-X⁴-X⁵의 길이는 4 개의 아미노산인 조성물.
36. 청구항 2, 5 내지 28, 및 30 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, X²-X³-X⁴-X⁵는 아미노산 서열 SEVS와 적어도 약 75% 서열 동일성을 갖는 조성물.
37. 청구항 3, 4, 및 8 내지 16 중 어느 항 항에 있어서, Z¹는 세린 (S), 시스테인 (C), 알라닌 (A), 글리신 (G), 트레오닌 (T), 티로신 (Y), 또는 메티오닌 (M)인 조성물.
38. 청구항 37에 있어서, Z¹는 세린 (S)인 조성물.
39. 청구항 3, 4, 8 내지 16, 37, 및 38 중 어느 한 항에 있어서, Z²는 소수성 비방향족 아미노산이다.
40. 청구항 39에 있어서, Z²는 트레오닌 (T), 이소류신 (I), 발린 (V), 류신 (L), 알라닌 (A), 글리신 (G), 시스테인 (C), 또는 메티오닌 (M)인 조성물.
41. 청구항 40에 있어서, Z²는 트레오닌 (T) 또는 이소류신 (I)인 조성물.
42. 청구항 3, 4, 8 내지 16, 및 37 내지 41 중 어느 한 항에 있어서, Z³은 소수성 비방향족 아미노산, 소수성 극성 아미노산, 양으로 하전된 아미노산, 또는 프롤린 (P)인 조성물.
43. 청구항 3, 4, 8 내지 16, 및 37 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, Z³은 메티오닌 (M), 발린 (V), 글리신 (G), 트레오닌 (T), 아르기닌 (R), 류신 (L), 프롤린 (P), 또는 그것을 위한 보존적 치환인 조성물.
44. 청구항 43에 있어서, Z³은 메티오닌 (M), 발린 (V), 글리신 (G), 트레오닌 (T), 아르기닌 (R), 류신 (L), 또는 프롤린 (P)인 조성물.
45. 청구항 3, 4, 8 내지 16 및 37 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, Z⁴은 소수성 비방향족 아미노산 또는 소수성 무극성 아미노산인 조성물.
46. 청구항 3, 4, 8 내지 16 및 37 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, Z⁴은 메티오닌 (M), 류신 (L), 발린 (V), 또는 그것을 위한 보존적 치환인 조성물.
47. 청구항 46에 있어서, Z⁴은 메티오닌 (M), 류신 (L), 또는 발린 (V)인 조성물.
48. 청구항 3, 4, 8 내지 16, 및 37 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, Z⁵는 아르기닌 (R) 또는 세린 (S) 또는 그것을 위한 보존적 치환인 조성물.
49. 청구항 48에 있어서, Z⁵는 세린 (S) 또는 아르기닌 (R)인 조성물.
50. 청구항 3,4, 8 내지 16, 및 37 내지 49 중 어느 한 항에 있어서, Z⁶는 아르기닌 (R) 또는 세린 (S)인 조성물.
51. 청구항 3, 8 내지 16, 및 37 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 QLVKRK (서열번호: 86), QKVLKR (서열번호: 87), GGRGRR (서열번호: 88), GGRGGR (서열번호: 89), GGGGGR (서열번호: 90), 및/또는 RSHKTRSHH (서열번호: 98)를 포함하지 않는 조성물.
52. 청구항 3, 4, 8 내지 16, 및 37 내지 51 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 STMMSR (서열번호: 51), SIMMSR (서열번호: 52), STLMSR (서열번호: 53), STVMSR (서열번호: 54), STGLSR (서열번호: 55), STTMSR (서열번호: 56), STRMSR (서열번호: 57), STLMRR (서열번호: 58), STPVSR (서열번호: 59), STMMRS (서열번호: 96), 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
53. 청구항 52에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 STMMSR (서열번호: 51) 또는 STMMRS (서열번호: 96), 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물.
54. 청구항 3, 4, 8 내지 16, 및 37 내지 53 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 STMMSR (서열번호: 51), SIMMSR (서열번호: 52), STLMSR (서열번호: 53), STVMSR (서열번호: 54), STGLSR (서열번호: 55), STTMSR (서열번호: 56), STRMSR (서열번호: 57), STLMRR (서열번호: 58), STPVSR (서열번호: 59), STMMSRS (서열번호: 60), STMMSRSH (서열번호: 61), STMMSRSHK (서열번호: 62), STMMSRSHKT (서열번호: 63), STMMSRSHKTR (서열번호: 64), STMMSRSHKTRS (서열번호: 65), STMMSRSHKTRSH (서열번호: 66), STMMRS (서열번호: 96), 또는 STMMRSH (서열번호: 97)으로 이루어진 조성물.
55. 청구항 54에 있어서, 상기 펩타이드의 아미노산 서열은 STMMSR (서열번호: 51), STMMSRSHK (서열번호: 62), 또는 STMMRSH (서열번호: 97)로 이루어진 조성물
56. 청구항 4, 8 내지 16, 37 내지 50, 및 52 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Z²-Z³-Z⁴-Z⁵의 길이는 3 내지 7 개의 아미노산인 조성물.
57. 청구항 56에 있어서, 상기 Z²-Z³-Z⁴-Z⁵의 길이는 3 내지 6 개의 아미노산인 조성물.
58. 청구항 57에 있어서, 상기 Z²-Z³-Z⁴-Z⁵의 길이는 4 개의 아미노산인 조성물.
59. 청구항 4, 8 내지 16, 37 내지 50, 및 52 내지 58 중 어느 한 항에 있어서, Z²-Z³-Z⁴-Z⁵는 아미노산 서열 TMMS과 적어도 약 75% 서열 동일성을 갖는 조성물.
60. 청구항 1 내지 59 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 실질적으로 알파-나선 형태를 갖는 조성물.
61. 청구항 1 내지 60 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 베타-펩타이드이고, 상기 펩타이드는 레트로 형태이고, 상기 펩타이드는 인버소 형태이고, 여기서 펩타이드 중 모든 아미노산은 L 아미노산이고, 상기 펩타이드는 1 이상의 D 아미노산을 포함하거나, 또는 상기 펩타이드는 생체이용률을 증가시키기 위해 폴리머로 작용화되는 조성물.
62. 청구항 61에 있어서, 상기 펩타이드는 생체이용률을 증가시키기 위해 폴리머로 작용화되고 상기 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 셀룰로오스 또는 변형된 셀룰로오스를 포함하는 조성물.
63. 청구항 1 내지 62 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 국소, 피하, 또는 경피 투여용인 조성물.
64. 청구항 1 내지 63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 주사용인 조성물.
65. 청구항 1 내지 64 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 추가로, 콜라겐을 포함하는 조성물.
66. 청구항 65에 있어서, 상기 콜라겐은 소 콜라겐, 돼지 콜라겐, 또는 인간 콜라겐인 조성물인 조성물.
67. 청구항 65 또는 66에 있어서, 상기 콜라겐은 합성 콜라겐인 조성물.
68. 청구항 1 내지 67 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 추가로, 마취제를 포함하는 조성물.
69. 청구항 68에 있어서, 상기 마취제는 리도카인을 포함한다.
70. 청구항 1 내지 69 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 피부 크림인 조성물.
71. 청구항 70에 있어서, 상기 피부 크림은 얼굴 크림인 조성물.
72. 청구항 1 내지 71 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 흉터의 체표를 감소시키거나 흉터있는 체표의 외관을 개선하는데 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 흉터를 감소시키는 방법.
73. 청구항 72에 있어서, 상기 흉터는 화상 흉터, 수술 흉터, 여드름 흉터, 생검 흉터, 또는 부상으로 생긴 흉터인 방법.
74. 청구항 1 내지 71 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 대상체의 체표에서 피부의 외관을 개선하는데 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 피부의 외관을 개선하는 방법.
75. 청구항 74에 있어서, 상기 조성물은 입술, 눈꺼풀, 볼, 이마, 턱, 또는 목에 피하로 투여되는 방법.
76. 청구항 74 또는 75에 있어서, 상기 조성물은 주름을 줄이고, 제거하거나 메우고, 처지는 피부를 감소시키고, 피부의 표면 질감을 개선하고, 노인 반점을 제거하거나 줄게 하거나, 또는 눈 아래의 다크써클을 줄이거나 제거하는 방법.
77. 대상체의 체표에서 조직 용적을 개선하는 방법으로서, 청구항 1 내지 71 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에게 체표의 조직 용적을 증가시키는데 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
78. 청구항 77에 있어서, 상기 조성물은 유방 조직 또는 엉덩이 조직을 단단하게 하거나 증가시키는 방법.
79. 대상체의 체표의 피부를 부드럽게 하는 방법으로서, 청구항 1 내지 71 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에게 체표에서 피부를 부드럽게 하는데 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
80. 청구항 79에 있어서, 상기 조성물 여드름에 의해 흉터있는 피부를 부드럽게 하고, 셀룰라이트의 면을 부드럽게 하고, 임신선을 부드럽게 하거나 줄이거나, 또는 주름을 펴는 방법.
81. 대상체에서 피하 지방의 형성에 줄기세포를 동원하는 방법으로서, 대상체에서 피하 지방의 형성에 줄기세포를 동원하는데 충분한 양으로 대상체에게 청구항 1 내지 71 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
82. 대상체에서 조직을 재건하는 방법으로서, 청구항 1 내지 71 중 어느 한 항의 조성물을 대상체의 조직에게 조직 재건 절차 동안 또는 그 후에 조직의 용적을 증가시키는데 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
83. 대상체에서 뒷꿈치 통증을 감소시키는 방법으로서, 청구항 1 내지 71 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에게 걷기 동안에 대상체에서 뒷꿈치 통증을 감소시키는데 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법.
84. 청구항 72 내지 83 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인 방법.
85. 피하 지방생성을 자극하는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 6 내지 8 개의 아미노산의 길이를 가지며 아래 서열을 포함하는 펩타이드:
    X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶
    여기서
    X¹ 및 X⁶ 중 적어도 하나는 양으로 하전된 아미노산 또는 알라닌 (A)이고;
    X¹ 및 X⁶ 중 다른 하나는 양으로 하전된 아미노산, 류신 (L), 또는 알라닌 (A)이고;
    X²는 세린 (S), 글루타민 (Q), 알라닌 (A), 글루타메이트 (E), 아스파라긴 (N), 프롤린 (P), 시스테인 (C), 라이신 (K), 아스파르테이트 (D), 트립토판 (W), 메티오닌 (M), 또는 트레오닌 (T)이고;
    X³는 음으로 하전된 아미노산, 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 세린 (S), 라이신 (K), 아스파라긴 (N), 또는 트레오닌 (T)이고;
    X⁴는 이소류신 (I), 발린 (V), 류신 (L), 아스파라긴 (N), 알라닌 (A), 세린 (S), 프롤린 (P), 트레오닌 (T), 또는 글루타민 (Q)이고;
    그리고 X⁵는 세린 (S), 아스파르테이트 (D), 트레오닌 (T), 류신 (L), 알라닌 (A), 페닐알라닌 (F), 글루타메이트 (E), 아스파라긴 (N), 글리신 (G), 아르기닌 (R), 글루타민 (Q), 히스티딘 (H), 또는 이소류신 (I)이고;
    단, X² 및 X⁵ 둘 모두는 글루타민 (Q)가 아니고;
    그리고 단, X¹이 아르기닌 (R)일 때, X³은 라이신 (K)이 아니다.
86. 피하 지방생성을 자극하는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 5 내지 8 개의 아미노산의 길이를 가지며 아래 서열을 포함하는 펩타이드:
    X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶
    여기서
    X¹ 및 X⁶ 중 적어도 하나는 양으로 하전된 아미노산 또는 알라닌 (A)이고;
    X¹ 및 X⁶ 중 다른 하나는 양으로 하전된 아미노산, 류신 (L) 또는 그것을 위한 보존적 치환, 알라닌 (A) 또는 그것을 위한 보존적 치환이거나, 부재하고; 그리고
    X²-X³-X⁴-X⁵는 아미노산 서열 SEVS와 적어도 50% 서열 동일성을 가지며 4 내지 8 개의 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열이다.
87. 피하 지방생성을 자극하는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 6 내지 13 개의 아미노산의 길이를 가지며 아래 서열을 포함하는 펩타이드:
    Z¹-Z²-Z³-Z⁴-Z⁵-Z⁶
    여기서
    Z¹은 세린 (S) 또는 그것을 위한 보존적 치환이고;
    Z²는 소수성 아미노산이고;
    Z³은 임의의 아미노산이고;
    Z⁴는 소수성 아미노산이고;
    Z⁵는 세린 (S), 아르기닌 (R), 또는 그것을 위한 보존적 치환이고; 그리고
    Z⁶은 하전된 아미노산 또는 세린(S)이고;
    단, Z¹, Z² 및 Z⁴ 모두는 글리신 (G)이 아니고;
    단, Z¹은 글루타민 (Q)가 아니고; 그리고
    단, Z²는 히스티딘 (H)이 아니다.
88. 피하 지방생성을 자극하는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 6 내지 13 개의 아미노산의 길이를 가지며 아래 서열을 포함하는 펩타이드:
    Z¹-Z²-Z³-Z⁴-Z⁵-Z⁶
    여기서
    Z¹은 세린 (S) 또는 그것을 위한 보존적 치환이고;
    Z⁶은 하전된 아미노산 또는 세린 (S)이고; 그리고
    Z²-Z³-Z⁴-Z⁵는 아미노산 서열 TMMS와 적어도 50% 서열 동일성을 가지며 2 내지 8 개의 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열이다.
    
    

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