WO2001070951A2 - Mittel zur diagnose und therapie viraler erkrankungen - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to an agent for the diagnosis and therapy of viral diseases.
- the inventive solution makes use of special properties of the cellular protein YB-1. Areas of application are medicine and the pharmaceutical industry.
- the protein YB-1 represents a member of the protein family of Y-box proteins in human cells. It is able to bind to a specific DNA sequence motif. This sequence motif, the so-called Y box, can be found in the promoter or enhancer area of various genes. An interaction of YB-I with the promoter / enhancer regions of different viral genes has been demonstrated. The binding of YB-1 to the enhancer region of HPV type 18 has been observed in various experiments (Spitkovsky et al., 1992). Furthermore, it was shown that YB-1 is responsible for the basal gene expression of HTLV type 1 (Kashanchi et al., 1994).
- YB-1 also activates both the transcription of the late genes of the JCV in glia cells (Kerr et al., 1994) and the transcription of HIV-1 (Sawaya et al., 1998). On the basis of these examples, it can be concluded that YB-1 is an important factor for controlling the gene expression of various viruses. In normal cells, YB-1 can only be found in the cytoplasm.
- the invention has for its object to use special properties of the cellular protein YB-1 to build up an agent for the diagnosis and therapy of viral diseases.
- Adenoviruses induce massive nuclear transport of YB-1 and 2. gene therapy vectors which are considered replication-efficient but still replicate in cells with YB-1 in the cell nucleus.
- YB-1 adenovirus type 5 YB-1
- This translocation of YB-1 is an important step for the replication of the adenoviruses.
- Adenoviruses that lack the genes E1A, E1B and E3 are considered to be replication-deficient and are therefore often used as vectors for gene therapy. However, it was found that these viruses are able to replicate in cells which contain YB-1 constitutively in the cell nucleus.
- YB-1 is an important factor for various viruses. An essential step for this is obviously the translocation of YB-1 into the cell nucleus.
- YB-1 could only be detected in the cytoplasm of normal, non-infected cells.
- the invention is based on the idea of inhibiting the replication of YB-1-dependent viruses by inhibiting the activity of YB-1.
- viruses include adenoviruses, HPV, HTLV, HIV and JCV. This list is not exhaustive, so that other viruses not mentioned here also form part of the inventive concept.
- One way of realizing this invention is to lower the cellular concentration of YB-1.
- the essence of the invention thus contains substances which inhibit the biosynthesis of YB-1 or accelerate the breakdown of YB-1. These include, among others, antisense oligonucleotides or ribozymes which are directed against the mRNA of YB-1. Natural, synthetic or recombinant polypeptides which lead to a breakdown of YB-1 also belong to the basic idea of the invention.
- a second way of realizing this invention is to inhibit the translocation of YB-1 into the cell nucleus.
- the exact mechanisms leading to the translocation of YB-1 into the cell nucleus are still unknown.
- the invention uses a cell cycle-dependent translocation of YB-1. It was found that YB-1 is transported from the cytoplasm into the cell nucleus when the cells transition from the Gl phase to the S phase of the cell cycle. In the course of the S phase there is a Observe the return transport of YB-1 to the cytoplasm. Furthermore, a stress-induced translocation of YB-1 into the cell nucleus of the examined cells is used because the translocation of YB-1 into the cell nucleus can be induced by specific signals.
- the essence of the invention thus includes agents containing substances which can specifically inhibit these signaling pathways with respect to YB-1.
- This protein is P32 / SF2 (also known under the name: P32 / TAP, hyaluronectin, gClqR). It was observed that YB-1 and P32 only interact with one another in the resistant MCF7 cells, which are characterized by a strong nuclear localization of YB-1, but not in the sensitive MCF7 cells. Furthermore, it was found that the interaction of YB-1 and P32 is strongest in the transition of HeLa cells from the Gl to the S phase. It follows that P32 is involved in the translocation of YB-1 into the cell nucleus.
- the invention therefore includes agents containing substances which partially or completely inhibit the interaction of YB-1 and P32.
- the basic idea of this invention also includes agents comprising substances which can influence the modification and thus the activation of YB-1. These include Inhibitors of kinases, phosphatases, methylases and other enzymes that can specifically modify YB-1. Furthermore, this invention also includes agents comprising substances which bind to domains of YB-1 and can thereby influence the function of this protein.
- Part of this invention is also the use of the detection of YB-1 for the diagnosis of viral diseases. Biopsies or smears are examined with the usual immunohistochemical methods with the help of specific antibodies against YB-1. The detection of a nuclear localization in tissues, in which YB-1 can otherwise only be found in the cytoplasm of the cells, gives indications of a possible viral infection. Appropriate antibodies have been established and are therefore available.
- a second way of using this invention in a Diagnosis consists of adding cell cultures to the samples to be examined. The detection of the translocation of YB-1 in the cell nucleus of the cultivated cells can then be used as an indication of viruses.
- the invention also includes the use of labeled YB-1 or also labeled parts of YB-1 (GFP, V5, HA, etc.) for the detection of a translocation in cell cultures. It is irrelevant by which methods the labeled polypeptide / protein gets into the cells (injection, transfection with plasmids, etc.).
- this invention also includes the use of the agents listed hitherto to reduce the risk of gene therapy with viral vectors.
- certain adenoviral vectors can replicate in cells that contain YB-1 in the nucleus. This replication usually leads to the destruction of the infected cells. In the context of gene therapy, this can lead to serious health problems and even death to the patient. It can be assumed that, in addition to the adenoviral vectors, other viral vectors also display this behavior. Therefore, this invention includes the use of all the above-mentioned agents in connection with gene therapy with viral vectors with the aim of preventing the activation of YB-1 and thus a possible replication of the viral vectors used.
- the basic idea of this invention is the use of the detection of a nuclear localization of YB-1 for the risk assessment of a gene therapy treatment with viral vectors. Biopsies of the target organ of gene therapy can be examined with the usual immunohistochemical methods using antibodies against YB-1. An increased nuclear localization of YB-1 indicates an increased risk in gene therapy treatment.
- YB-1 antisense oligos are used for lowering:
- Synthetically generated antisense oligonucleotides are used to inhibit the expression of P32. These oligonucleotides are derived from the antisense sequence of the P32 mRNA and lead to an inhibition of the biosynthesis of P32, which lowers the cellular concentration of this protein. The following oligonucleotides are used (enumeration is intended as an example and is not complete).
- Chemically modified oligonucleotides are used to reduce the breakdown in the organism (e.g. thioates etc.)
- a synthetic peptide (PPTFDGEEEPSQGQK) is bound to a support and used for the immunization of rabbits.
- the antibodies obtained from the serum of the animals are used for the immunohistochemical detection of P32 in tumor samples.
- the expression and distribution of P32 provides information on the intracellular regulation of YB-1 and thus enables a supplementary risk assessment of gene therapy with viral vectors.
- transcription factor YB-1 in human T-cell lymphotropic virus type 1 basal gene expression.
- HIV-1 human immunodeficiency virus type 1
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Diagnose und Therapie viraler Erkrankungen. Die erfinderische Lösung macht sich dabei spezielle Eigenschaften des zellulären Proteins YB-1 zu nutze. Anwendungsgebiete sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Description
Mittel zur Diagnose und Therapie viraler Erkrankungen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Diagnose und Therapie viraler Erkrankungen. Die erfinderische Lösung macht sich dabei spezielle Eigenschaften des zellulären Proteins YB- 1 zu nutze. Anwendungsgebiete sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Das Protein YB- 1 stellt einen Vertreter der Proteinfamilie der Y-Box-Proteine in humanen Zellen dar. Es ist in der Lage, an ein spezifisches DNA- Sequenzmotiv zu binden. Dieses Sequenzmotiv, die sog. Y-Box, ist im Promotor- bzw. Enhancerbereich verschiedener Gene zu finden. Eine Interaktion von YB-I mit den Promotor/ Enhancerregionen von verschiedenen viralen Genen konnte nachgewiesen werden. So wurde in verschiedenen Experimenten die Bindung von YB- 1 an die Enhancerregion des HPV Typ 18 beobachtet (Spitkovsky et al. , 1992). Des weiteren wurde gezeigt, daß YB- 1 für die basale Genexpression des HTLV Typ 1 verantwortlich ist (Kashanchi et al., 1994). Ebenfalls durch YB- 1 aktiviert wird sowohl die Transkription der späten Gene des JCV in Glia-Zellen (Kerr et al., 1994) als auch die Transkription von HIV- 1 (Sawaya et al., 1998) . Auf Grund dieser Beispiele kann geschlußfolgert werden, daß YB- 1 ein wichtiger Faktor für die Kontrolle der Genexpression verschiedener Viren ist. In normalen Zellen ist YB- 1 ausschließlich im Zytoplasma zu finden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, spezielle Eingenschaften des zellulären Proteins YB- 1 zum Aufbau eines Mittels zur Diagnose und Therapie viraler Erkrankungen zu nutzen.
Die Aufgabe der Erfindung konnte auf der Basis der überraschenden Erkenntnisse gelöst werden, daß
1. Adenoviren einen massiven Kerntransport von YB- 1 induzieren und
2. gentherapeutische Vektoren, die als replikationsdeffϊzient gelten, trotzdem in Zellen mit YB- 1 im Zellkern replizieren.
So wurde beobachtet, daß nach der Infektion von Zellen mit dem Adenovirus Typ 5 YB-1 aus dem Zytoplasma in den Zellkern transportiert wird. Diese Translokation von YB- 1 ist ein wichtiger Schritt für die Replikation der Adenoviren. Adenoviren, denen die Gene E1A, E1B und E3 fehlen, werden als replikationsdefizient angesehen und daher häufig als Vektoren für die Gentherapie genutzt. Es konnte jedoch festgestellt werden, daß diese Viren in Zellen, die konstitutiv YB- 1 im Zellkern enthalten, in der Lage sind, zu replizieren.
Auf Grund dieser Beobachtungen ergibt sich die Schlußfolgerung, daß YB- 1 ein wichtiger Faktor für verschiedene Viren darstellt. Ein essentieller Schritt dafür ist offensichtlich die Translokation von YB- 1 in den Zellkern. Bei ruhenden normalen, nicht infizierten Zellen konnte YB- 1 bisher nur im Zytoplasma nachgewiesen werden. Die Erfindung basiert auf der Idee, durch die Hemmung der Aktivität von YB- 1 auch die Replikation YB- 1 -abhängiger Viren zu hemmen. Zu diesen Viren gehören unter anderen Adenoviren, HPV, HTLV, HIV und JCV. Diese Aufzählung ist nicht vollständig, so daß auch weitere, hier nicht genannte Viren zum erfinderischen Grundgedanken gehören.
Ein Weg zur Realisierung dieser Erfindung ist die Absenkung der zellulären Konzentration von YB- 1. Die Erfindung beinhaltet in ihrem Wesen somit Substanzen, die die Biosynthese von YB- 1 hemmen bzw. den Abbau von YB- 1 beschleunigen. Dazu gehören unter anderem Antisense-Oligonukleotide oder Ribozyme, die gegen die mRNA von YB- 1 gerichtet sind. Ebenfalls zum erfinderischen Grundgedanken gehören natürliche, synthetische oder rekombinante Polypeptide, die zu einem Abbau von YB- 1 führen.
Ein zweite Möglichkeit der Realisierung dieser Erfindung ist die Hemmung der Translokation von YB-1 in den Zellkern. Bis jetzt sind die genauen Mechanismen, die zur Translokation von YB-1 in den Zellkern führen, noch unbekannt. Die Erfindung nutzt eine zellzyklusabhängige Translokation von YB-1 aus. Dabei konnte festgestellt werden, daß YB- 1 beim Übergang der Zellen von der Gl- in die S-Phase des Zellzyklus aus dem Zytoplasma in den Zellkern transportiert wird. Im Verlauf der S-Phase ist dann ein
Rücktransport von YB- 1 in das Zytoplasma zu beobachten. Desweiteren wird eine stressinduzierte Translokation von YB- 1 in den Zellkern der untersuchten Zellen ausgenutzt, weil die Translokation von YB- 1 in den Zellkern durch spezifische Signale induzierbar ist. Die Erfindung beinhaltet in ihrem Wesen somit Mittel, enthaltend Substanzen, die diese Signalwege in Bezug auf YB- 1 spezifisch inhibieren können.
Die Untersuchung von multidrug-resistenten MCF7-Zellen führte zu der Identifizierung eines Proteins, das mit YB- 1 spezifisch interagiert. Bei diesem Protein handelt es sich um P32/SF2 (auch bekannt unter dem Namen: P32/TAP, Hyaluronectin, gClqR). Es konnte beobachtet werden, daß YB- 1 und P32 nur in den resistenten MCF7-Zellen, die durch eine starke nukleare Lokalisation von YB- 1 gekennzeichnet sind, nicht jedoch in den sensitiven MCF7 -Zellen mit einander interagieren. Desweiteren konnte festgestellt werden, daß die Interaktion von YB- 1 und P32 beim Übergang von HeLa- Zellen von der Gl- in die S-Phase am stärksten ist. Daraus ergibt sich, daß P32 an der Translokation von YB- 1 in den Zellkern beteiligt ist. Die Erfindung beinhaltet daher Mittel, enthaltend Substanzen, die die Interaktion von YB- 1 und P32 teilweise oder vollständig hemmen.
Zum Grundgedanken dieser Erfindung gehören auch Mittel, umfassend Substanzen, die die Modifikation und damit die Aktivierung von YB- 1 beeinflussen können. Dazu zählen u.a. Inhibitoren für Kinasen, Phosphatasen, Methylasen und andere Enzyme, die spezifisch YB- 1 modifizieren können. Desweiteren beinhaltet diese Erfindung auch Mittel, umfassend Substanzen, die an Domänen von YB- 1 binden und dadurch die Funktion dieses Proteins beeinflussen können.
Bestandteil dieser Erfindung ist auch die Verwendung des Nachweises von YB-1 für die Diagnose viraler Erkrankungen. Dabei werden Biopsien oder Abstriche mit den gängigen immunhistochemischen Methoden mit Hilfe von spezifischen Antikörpern gegen YB- 1 untersucht. Der Nachweis einer Kernlokalisation in Geweben, in denen YB- 1 sonst nur im Zytoplasma der Zellen zu finden ist, gibt Hinweise auf eine mögliche virale Infektion. Entsprechende Antikörper wurden etabliert und stehen somit zur Verfügung. Eine zweite Möglichkeit der Verwendung dieser Erfindung im Rahmen einer
Diagnose besteht darin, die zu untersuchenden Proben Zellkulturen hinzu zufügen. Der Nachweis der Translokation von YB- 1 in den Zellkern der kultivierten Zellen kann dann als Hinweis auf Viren genutzt werden. Die Erfindung beinhaltet auch die Verwendung von markiertem YB- 1 oder auch markierten Teilen von YB- 1 (GFP, V5, HA usw.) für den Nachweis einer Translokation in Zellkulturen. Dabei ist es unerheblich, durch welche Methoden das markierte Polypeptid/ Protein in die Zellen gelangt (Injektion, Transfektion mit Plasmiden etc.).
Zum Wesen dieser Erfindung gehört auch die Verwendung der bisher aufgeführten Mittel, um das Risiko einer Gentherapie mit viralen Vektoren zu senken. Wie schon weiter oben erwähnt, können bestimmte adenovirale Vektoren in Zellen, die YB- 1 im Zellkern enthalten, replizieren. Diese Replikation führt in aller Regel zur Zerstörung der infizierten Zellen. Im Rahmen einer Gentherapie kann das zu schweren gesundheitlichen Beeinträchtigungen bis hin zum Tode des Patienten führen. Es ist davon auszugehen, das neben den adenoviralen auch andere virale Vektoren ein solches Verhalten zeigen. Daher beinhaltet diese Erfindung die Verwendung aller oben genannten Mittel im Zusammenhang mit einer Gentherapie mit viralen Vektoren mit dem Ziel, die Aktivierung von YB- 1 und damit eine mögliche Replikation der verwendeten viralen Vektoren zu verhindern. Zum Grundgedanken dieser Erfindung gehört die Verwendung des Nachweises einer nuklearen Lokalisation von YB- 1 für die Risikobeurteilung einer gentherapeutischen Behandlung mit viralen Vektoren. Dabei könne Biopsien des Zielorgans der Gentherapie mit den gängigen immunhistochemischen Methoden unter Verwendung von Antikörpern gegen YB- 1 untesuche werden. Eine verstärkte nukleare Lokalisation von YB- 1 deutet dabei auf ein erhöhtes Risiko bei der gentherapeutischen Behandlung hin.
Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Ausführungsbeispiele
1. Senkung des YB-1 Levels zur Aufhebung von Zytostatikaresistenz und Hemmung des Tumorwachstums
A. Senkung der zellulären YB- 1 -Konzentration mittels Antisense- Oligonukleotide gegen die YB- 1 mRNA
Zur Senkung werden folgende YB- 1 Antisense-Oligos eingesetzt:
asOligo 1 :600-619 5'-TAT TCT GGT AAT TTT GCT GG-3' asOligo 2: 1 140- 1 159 5'-TTC ATA TTT CTT CTT GTT GG-3' asOligo 3: 1 160-1 179 5'-TCA TTT CTT ATT GCT GGA AT-3' asOligo 4: 1390- 1409 5'-TAT TAC AAA TTA AAA ATG AA-3' asOligo 5: 5'-CTC GCT GCT CAT GGT TGC GGT-3'
Es existiert allerdings darüberhinaus ein Adenovirus mit der YB- 1 cDNA in antisense Orientierung (pHVad2c CMV/SV40 YB- 1 as), der ebenfalls die endogene YB-1 Konzentration in den infizierten Zellen reduziert.
B. Senkung der zellulären YB- 1 -Konzentration mittels Ribozyme gegen YB- 1 mRNA
Folgende Ribozyme werden eingesetzt:
1.5'-TGT ACA AA CTG ATG AGT CCG TGA GGA CGA AAC ATC TTC CT-3'
2.5-GTC TGG TG CTG ATG AGT CCG TGA GGA CGA ACC AAA TAC AT-3'
3.5'-TGC GTT GG CTG ATG AGT CCG TGA GGA CGA ACC TTC CTG GG-3'
4.5-CAA TCT CC CTG ATG AGT CCG TGA GGA CGA ACC ACT GCG AA-3'
5.5-ACC ACC AG CTG ATG AGT CCG TGA GGA CGA ACC CTG TAA CA-3'
2. Es werden synthetisch erzeugte Antisense-Oligonukleotide verwendet, um die Expression von P32 zu hemmen. Diese Oligonukleotide sind von der Antisense-Sequenz der mRNA von P32 abgeleitet, und führen zu
einer Hemmung der Biosynthese von P32, wodurch die zelluläre Konzentration dieses Proteins erniedrigt wird. Es werden u.a. folgende Oligonukleotide verwendet (Aufzählung ist als Beispiel gedacht und nicht vollzählig) .
- gca gca gag gca gca tcg egg
- cat caa atg ttg gtg gga tgc
Zur Reduktion des Abbaus im Organismus werden chemisch modifizierte Oligonukleotide verwendet (zum Beispiel Thioate u.a.)
3. Es wird ein Peptid, welches mit dem N-Terminus von YB- 1 übereinstimmt (Acetylierung-MSSEAETQQPPA-cys (das c-terminale cys entspricht nicht der YB- 1 Sequenz, sondern ist für eine vereinfachte Kopplung des Peptides an eine Träger verantwortlich)) für die Immunisierung von Kaninchen verwendet. Die aus dem Serum gewonnenen Antikörper werden in einer immunhistochemischen Analyse von Gewebeproben verwendet. Eine nukleare Expression von YB- 1 im Zielorgan einer Gentherapie deutet auf ein hohes Risiko hin, daß der verwendete virale Vektor (zum Beispiel adenovirale Vektoren) in den Zellen des Zielorgans replizieren kann. Da es durch die Replikation der viralen Vektoren zu schweren gesundheitlichen Schäden kommt, ist in einem solchen Fall die Therapie mit solchen Vektoren zu vermeiden und gegebenenfalls andere Systeme zu verwenden.
4. Es wird ein synthetisches Peptid (PPTFDGEEEPSQGQK) an einen Träger gebunden und für die Immunisierung von Kaninchen verwendet. Die aus dem Serum der Tiere gewonnenen Antikörper werden für den immunhistochemischen Nachweis von P32 in Tumorproben verwendet. Die Expression und Verteilung von P32 gibt Hinweise auf die intrazelluläre Regulation von YB-1 und ermöglicht damit eine ergänzende Risikobeurteilung der Gentherapie mit viralen Vektoren.
Literatur
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Tissue restricted expression and chromosomal localization of the YB- 1 gene encoding a 42 kD nuclear CCAAT binding protein.
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Claims
1. Mittel zur Therapie viraler Erkrankungen, die Substanzen zur Beeinflussung von Funktionen von YB- 1 enthalten.
2. Mittel zur Therapie viraler Erkrankungen nach Anspruch 1 , die Substanzen zur Senkung der zellulären Konzentration von YB- 1 enthalten.
3. Mittel zur Therapie viraler Erkrankungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Antisense-Oligonukleotid gegen die mRNA von YB- 1 enthält.
4. Mittel zur Therapie viraler Erkrankungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Ribozym gegen die mRNA von YB- 1 enthält.
5. Mittel zur Therapie viraler Erkrankungen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es natürliche, synthetische oder rekombinante Polypeptide, die zum Abbau von YB- 1 führen, enthält
6. Mittel zur Therapie viraler Erkrankungen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es Substanzen zur Hemmung der Translokation von YB-1 in den Zellkern enthält.
7. Mittel zur Therapie viraler Erkrankungen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es Substanzen, die die Interaktion von YB- 1 mit P32 hemmen, enthält.
8. Mittel zur Therapie viraler Erkrankungen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es synthetische oder rekombinante Peptide bzw. Polypeptide, die die jeweiligen Bindungsstellen von YB- 1 bzw. P32 blockieren, enthält.
9. Mittel zur Therapie viraler Erkrankungen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es Substanzen zur Absenkung der zellulären Konzentration von P32 enthält.
10. Mittel zur Therapie viraler Erkrankungen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es Antisense-Oligonukleotide gegen die mRNA von P32 enthält.
1 1. Mittel zur Therapie viraler Erkrankungen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Ribozym gegen die mRNA von P32 enthält.
12. Mittel zur Therapie viraler Erkrankungen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es Inhibitoren von Enzymen enthält, die YB- 1 modifizieren können.
13. Mittel zur Therapie viraler Erkrankungen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es Substanzen enthält, die an Domänen von YB- 1 oder P32 binden.
14. Mittel zur Therapie viraler Erkrankungen nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die aufgeführten Substanzen durch gentherapeutische Vektoren in die Tumorzellen eingebracht werden.
15. Mittel nach Anspruch 1 bis 14 zur Behandlung oder Vorbeugung möglicher Nebenwirkungen einer Gentherapie mit viralen Vektoren .
16 Mittel zur Diagnose viraler Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß es Antikörper gegen YB- 1 bzw. gegen P32 enthält.
17. Mittel zur diagnostische Risikobeurteilung einer Gentherapie mit viralen Vektoren dadurch gekennzeichnet, daß es Antikörper gegen YB- 1 bzw. P32 enthält.
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| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: JP |