DE60114231T2

DE60114231T2 - Menschliches protoonkogen und darin codiertes protein

Info

Publication number: DE60114231T2
Application number: DE60114231T
Authority: DE
Inventors: Jin Woo Kim
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-11-28
Filing date: 2001-11-28
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2021-11-29
Also published as: ATE307202T1; JP3970771B2; EP1346045B1; EP1346045A1; EP1346045A4; JP2004514447A; CN1219881C; US20040077029A1; ES2247202T3; DE60114231D1; KR20020041553A; AU2002221159A1; KR100426454B1; CA2430351A1; CN1476479A; WO2002044371A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Protoonkogene und darin codiertes Protein, welche in der Diagnose von verschiedenen Krebsarten, der Herstellung eines trangenen Tiers, Antisinn-Gentherapie und Anti-Krebs-Arzneistoffentwicklung verwendet werden können
Hintergrund der Erfindung
Höhere Tiere, einschließlich des Menschen, tragen jeweils ungefähr 100 000 Gene, aber nur etwa 15 % davon werden exprimiert, und die Charakteristika des biologischen Prozesses eines Individuums, z. B. Zeugung, Differenzierung, Homöostase, Antworten auf Reize, Steuerung des Zellteilungszyklus, Altern und Apoptose (programmierter Zelltod) werden in Abhängigkeit davon bestimmt, welche Gene exprimiert werden (Liang, P., und A.B. Pardee, Science 257: 967–971, 1992).
Pathogene Phänomene, wie Tumorentstehung, werden durch Genmutation verursacht, welche zu Änderungen im Modus der Genexpression führt. Deshalb sind vergleichende Untersuchungen von Genexpressionen in verschiedenen Zellen durchgeführt worden, um Grundlagen für die Etablierung brauchbarer Vorgehensweisen für das Verständnis diverser biologischer Phänomene vorzusehen.
Es ist berichtet worden, dass Tumorentstehung durch verschiedene genetische Veränderungen verursacht wird, wie den Verlust der chromosomalen Heterozygotie, Aktivierung von Onkogenen und Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen, z. B. des p53-Gens (Bishop, J.M., Cell 64:235–248, 1991; und Hunter, T., Cell 64: 249–270, 1991). Ferner ist berichtet worden, dass 10 bis 30 % des Krebs beim Menschen aus der Onkogenaktivierung durch Amplifikation von Protoonkogenen entstehen.
Deshalb spielt die Aktivierung von Protoonkogenen eine wichtige Rolle in der Ätiologie vieler Tumoren und es bestand eine Notwendigkeit, Protoonkogene zu identifizieren.
Die Anmelder der vorliegenden Erfindung strebten an, den Mechanismus zu enthüllen, der bei der Tumorentstehnung von Gebärmutterhals-Krebs beteiligt ist, und haben unerwartet festgestellt, dass neue Protoonkogene, humanes Cervix-Carcinom-Protoonkogen 1 (HCCR-1) (Koreanische Patentanmeldung Nr. 2000-16757 (31. März 2000)) und HCCR-2 (Koreanische Patentanmeldung Nr. 2000-71202 (28. November 2000)) in Krebszellen spezifisch überexprimiert ist. Ein Protoonkogen verursacht quantitative und qualitative Änderungen des entsprechenden Proteinprodukts über eine Konformationsänderung (Weinberg, R.A., Cancer Research 49: 3713–3721, 1989). Das konformationsmäßig geänderte Krebsprotein zerstört Signaltranduktions-Wege in der Zelloberfläche, dem Zytoplasma oder dem Zellkern; während es in Abwesenheit von Tumorsuppressor-Genprodukt die Zellproliferation zusammen mit anderen Krebsproteinen stimuliert, den Zellzyklus stört und den Mechanismus des Zelltodes (Apoptose) zerstört (Todd, R., Anticancer Research 19: 4729–4746, 2000).
Das im Jahre 1989 von Fields et al. (Fields, S., und Song, O., Nature, 340: 245–246, 1989) entwickelte Hefe-Zwei-Hybrid-Verfahren zur Untersuchung solcher Protein-Protein-Wechselwirkungen ist in weitem Umfang angewandt worden, um den Zelltod-Mechanismus (Wallach, D., et al., Curr. Opin. Immunol. 10: 131–136, 1989) sowie andere biologisch Prozesse unter Verwendung verschiedener genetischer Werkzeuge aufzuklären (Pandey, A., und Mann, M., Nature 405: 837–846, 2000).
Die vorliegende Erfindung hatte es zum Ziel, ein neues Bindungsprotein für von HCCR-1-Protoonkogen stammendes Proteinprodukt unter Anwendung des Hefe-Zwei-Hybrid-Verfahrens zu entwickeln, und fand ein neues humanes Protoonkogen KG-19, welches ein Protein exprimiert, das spezifisch jeweils an Protoonkogen HCCR-2 wie auch HCCR-1 bindet. Dieses Protoonkogen KG-19 kann vorteilhaft in Diagnose, Prävention und Behandlung von verschiedenen Krebsarten eingesetzt werden, z. B. Leukämie, Lymphom, Colon-, Brust-, Nieren-, Magen-, Lungen-, Eierstock- und Uterus-Krebs.
Zusammenfassung der Erfindung
Folglich ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein neues Protoonkogen und ein biologisch aktives Fragment davon vorzusehen.
Andere Ziele der vorliegenden Erfindung bestehen in der Bereitstellung von:
einem rekombinanten Vektor, der das Protoonkogen oder ein biologisch aktives Fragment davon enthält, und einem damit transformierten Mikroorganismus;
einem Protein, codiert in dem Protoonkogen und einem biologisch aktiven Fragment davon;
einem Kit zum Diagnostizieren von Krebs, welches das Protoonkogen oder ein biologisch aktives Fragment davon umfasst;
einem Kit zum Diagnostizieren von Krebs, welches das Protein oder ein biologisch aktives Fragment davon umfasst;
einem Antisinn-Gen mit einer Basensequenz, welche komplementär zu derjenigen des Protoonkogens oder eines Fragments davon ist;
einem Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von Krebs durch Verwendung des Antisinn-Gens; und
einem Verfahren zum Screenen nach Antikrebs-Arzneistoffkandidaten durch Verwendung des Protoonkogens oder eines Fragments davon.
Gemäß eines Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein neues Protoonkogen mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr.: 1 oder ein biologisch aktives Fragment davon vorgesehen.
Gemäß eines anderen Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter Vektor, der das Protoonkogen oder ein biologisch aktives Fragment davon enthält, und ein mit dem Vektor transformierter Mikroorganismus, vorgesehen.
Gemäß noch eines anderen Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 oder ein biologisch aktives Fragment davon vorgesehen, abgeleitet aus dem Protoonkogen oder einem Fragment davon.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die obenstehenden und andere Ziele und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der Erfindung offensichtlich werden, wenn diese im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen betrachtet wird, welche jeweils folgendes zeigen;
1a: Die Ergebnisse von Northern-Blot-Analysen für das KG-19-Protoonkogen, welches in 12 Spuren mehrer normaler humaner Gewebe exprimiert wurde (Gehirn, Herz, Skelettmusku latur, Colon, Thymus, Milz, Niere, Leber, Dünndarm, Plazenta, Lunge und periphere Blut-Leukozyten);
1b: Die Ergebnisse, die nach Hybridisieren derselben Probe von 1a, die mit β-Actin hybridisiert wurde, erhalten werden;
2a: Die Ergebnisse von Northern-Blot-Analysen für das KG-19-Protoonkogen, das in humanen Krebs-Zelllinien exprimiert wurde (promyelocytische-Leukämie-HL-60-Zellen, HeLa-Gebärmutterhalskrebszellen, Zellen der chronischen myelogenen Leukämie K-562, Zellen der lymphoblastischen Leukämie MOLT-4, Burkitt-Lymphom-Raji-Zellen, SW480-Colon-Krebszellen, A549-Lungenkrebszellen und G361-Melanomzellen);
2b: Die Ergebnisse, die nach Hybridisieren derselben Probe von 2a mit β-Actin erhalten werden;
3a: Die Ergebnisse von Northern-Blot-Analysen hinsichtlich KG-19-Protoonkogen, welches in Eierstockkrebsgeweben exprimiert wird;
3b: Die Ergebnisse, die nach Hybridisieren derselben Probe von 3a mit β-Actin erhalten werden;
4a: Die Ergebnisse von Northern-Blot-Analysen hinsichtlich KG-19-Protoonkogen, welches in Brustkrebsgeweben exprimiert wird;
4b: Die Ergebnisse, die nach Hybridisieren derselben Probe von 4a mit β-Actin erhalten werden;
5a: Die Ergebnisse von Northern-Blot-Analysen hinsichtlich KG-19-Protoonkogen, welches in Lungenkrebsgeweben exprimiert wird;
5b: Die Ergebnisse, die nach Hybridisieren der gleichen Probe von 4a mit β-Actin erhalten werden;
6a: Phasenkontrast-Charakteristik von in Monoschicht kultivierten humanen Wildtyp-293-Embryo-Nierenzellen;
6b: Phasenkontrast-Charakteristik von in Monoschicht kultivierten humanen, mit KG-19 transfizierten, 293-Embryo-Nierenzellen;
7: Hämatoxylin-Eosin-Färbung von in Monoschicht kultivierten humanen, mit KG-19 transfizierten, 293-Embryo-Nierenzellen;
8: Tumorigenität von KG-19-Zellen in der Nacktmaus;
9: Ergebnisse einer Natriumdodecylsulfat(SDS)-PAGE, welche Proteinexpressionsmuster vor und nach der IPTG-Induktion in humanen, mit KG-19 transfizierten, 293-Embryo-Nierenzellen zeigt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Das neue Protoonkogen der vorliegenden Erfindung, welches als KG-19 bezeichnet wird, besteht aus 772 Basenpaaren und besitzt die DNA-Sequenz von SEQ ID Nr.: 1. Dieses KG-19-Protoonkogen bindet spezifisch an das humane Cervical-Carcinom-Protoonkogen 1 (hierin nachstehend "HCCR-1-Protoonkogen"), welches in der Koreanischen Patentanmeldung Nr. 2000-16757 beschrieben wird, und das HCCR-2-Protoonkogen, welches in der Koreanischen Patentanmeldung Nr. 2000-71202 beschrieben wird.
In der SEQ ID Nr.: 1 ist das offene Leseraster, welches den Basen Nr. 138 bis 638 entspricht, eine Volllängenprotein-codierende Region, und die daraus abgeleitete, vorhergesagte Aminosäuresequenz wird in SEQ ID Nr.: 2 gezeigt, welche aus 166 Aminosäuren besteht ("KG-19-Protein"). Unter Berücksichtigung der Degeneriertheit von Codons und der bevorzugten Codons in einem spezifischen Tier, in welchem das Protoonkogen der vorliegenden Erfindung exprimiert werden soll, können jedoch verschiedene Änderungen und Modifikationen der DNA-Sequenzen von SEQ ID Nr.: 1, z. B. in dem codierenden Bereich davon, vorgenommen werden, ohne die Aminosäuresequenz des exprimierten Proteins nachteilig zu ändern, oder im nicht-codierenden Bereich vorgenommen werden, ohne die Expression des Protoonkogens nachteilig zu beeinflussen. Deshalb schließt die vorliegende Erfindung, in ihrem Umfang, ebenfalls ein Polynukleotid, aufweisend im wesentlichen dieselbe Basensequenz wie das erfindungsgemäße Protoonkogen, und ein biologisch aktives Fragment davon ein. Wie hierin verwendet, bezieht sich "im wesentlichen dasselbe Polynukleotid" auf ein Polynukleotid, dessen Basensequenz 80 % oder mehr, vorzugsweise 90 % oder mehr, am stärksten bevorzugt 95 % oder mehr Homologie zu dem Protoonkogen der vorliegenden Erfindung zeigt.
Das von dem Protoonkogen der vorliegenden Erfindung exprimierte Protein besteht aus 166 Aminosäuren und besitzt die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2. Das Molekulargewicht dieses Proteins beläuft sich auf etwa 19 kDa. Allerdings können verschiedentliche Substitution, Addition und/oder Deletion der Aminosäurereste des Proteins durchgeführt werden, ohne die Funktion des Proteins nachteilig zu beeinflussen. Ferner kann ein Teil des Proteins verwendet werden, wenn ein spezifischer Zweck erfüllt werden soll. Diese modifizierten Aminosäuren und Fragmente davon sind ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Deshalb schließt die vorliegende Erfindung, in ihrem Umfang, ein Polypeptid mit im wesentlichen derselben Aminosäuresequenz, wie das von dem Onkogen der vorliegenden Erfindung abgeleitete Protein, und ein biologisch aktives Fragment davon ein. Wie hierin verwendet, bezieht sich "im wesentlichen dasselbe Polypeptid" auf ein Polypeptid, dessen Ami nosäuresequenz 80 % oder mehr, vorzugsweise 90 % oder mehr, am stärksten bevorzugt 95 oder mehr Homologie zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 zeigt.
Das Protoonkogen, oder das Protein, der vorliegenden Erfindung kann aus humanen Krebsgeweben erhalten oder unter Verwendung eines herkömmlichen DNA- oder Peptid-Syntheseverfahrens synthetisiert werden. Ferner kann das so hergestellte Gen in einen herkömmlichen Vektor inseriert werden, wodurch man einen Expressionsvektor erhält, der seinerseits in einen geeigneten Wirt, z. B. einen Mikroorganismus, wie E. coli oder Hefe, oder eine Tierzelle, wie eine Maus- oder Menschenzelle, eingebracht werden kann. Mit KG-19-Protoonkogen oder einem Fragment davon transformierte Zellen werden als "KG-19-Zellen" bezeichnet.
Ein transformierter Wirt kann dann in der Herstellung der DNA oder des Proteins der Erfindung im Großmaßstab eingesetzt werden. Beispielsweise wird E.coli XL1-Blue mit dem Expressionsvektor pGEM-T (Promega, USA), enthaltend das erfindungsgemäße KG-19-Gen, transformiert, um eine als XL1-Blue MRA/pGEM-T/KG-19 bezeichnete E. coli-Transformante zu erhalten, welche am 18. September 2000 bei der "Korean Collection for Type Cultures" (KCTC) (Adresse: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), #52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon, 305–333, Republik Korea) unter der Zugangsnummer KCTC 0826BP, nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke des Patentverfahrens hinterlegt worden ist.
Bei der Herstellung eines Vektors werden Expressions-Steuerungssequenzen, z. B. Promotor, Terminator, Selbst-Replikations-Sequenz und Sekretionssignal, in geeigneter Weise, abhängig von der verwendeten Wirtszelle, ausgewählt und kombiniert.
Die Überexpression des Protoonkogens der vorliegenden Erfindung findet in normalen menschlichen Geweben, z. B. Hirn, Herz, Skelettmuskulatur, Colon, Thymus, Milz, Niere, Leber, Dünndarm, Plazenta, Lunge und periphere Blutleukozyten, nicht statt, jedoch schon in Krebsgeweben, z. B. Zelllinien von Leukämie, Lymphom, Brust-, Nieren-, Eierstock-, Lungen- und Magen- sowie Hautkrebs. Dies legt nahe, daß das Protoonkogen der vorliegenden Erfindung die obenstehend erwähnten Krebsarten induziert. Wenn eine normale humane 293-Embryo-Nieren(HEK)-Zelle mit dem Protoonkogen der vorliegenden Erfindung transfiziert wird, wird ferner eine abnormale Zelle erzeugt. Die morphologischen Charakterisierungen mit optischen und Elektronenmikroskopen zeigen, daß die abnormale Zelle die Gestalt einer Tu morzelle besitzt. Durch Verwendung des Hämatoxylin-Eosin-Farbstoffverfahrens kann es bestätigt werden, daß die Tumorzelle krebsartig ist (Karzinom).
Wenn die normalen 293 HEK-Zellen, welche mit dem Protoonkogen der vorliegenden Erfindung transfiziert sind, in den Rücken von Nacktmäusen injiziert werden, wird eine Tumorentstehung nach etwa 14 Tagen ab der Injektion beobachtet, wobei die Tumorgröße in 30 Tagen auf 2,0 cm × 2,0 cm anwächst.
Deshalb wird angenommen, daß das Protoonkogen der vorliegenden Erfindung ein allen Formen von verschiedenen Krebsarten gemeinsamer Faktor ist, und es vorteilhaft in der Diagnose von verschiedenen Krebsarten und der Herstellung eines transgenen Tieres sowie in einer Antisinn-Gentherapie und der Antikrebs-Arzneimittel-Entwicklung verwendet werden kann.
Ein diagnostisches Verfahren, welches unter Verwendung des Protoonkogens der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden kann, kann zum Beispiel die Schritte des Hybridisierens von Nukleinsäuren, welche aus der Körperflüssigkeit eines Subjekts separiert worden sind, mit einer Sonde, die das Protoonkogen der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon enthält, und des Bestimmens, ob das Subjekt das Protoonkogen aufweist, durch Anwendung eines herkömmlichen Nachweisverfahrens auf dem Fachgebiet umfassen. Das Vorhandensein des Protoonkogens kann leicht durch Markieren der Sonde mit einem radioaktiven Isotop oder einem Enzym nachgewiesen werden. Deshalb ist auch ein Krebs-Diagnose-Kit, welches das Protoonkogen der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon enthält, im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Ein transgenes Tier, welches durch Einführung des Protoonkogens der vorliegenden Erfindung in einen Säuger, z. B. eine Ratte, hergestellt wird, ist ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Bei der Herstellung eines solchen transgenen Tieres wird es bevorzugt, das erfindungsgemäße Protoonkogen in ein befruchtetes Ei eines Tieres vor dem 8. Zellzyklus-Stadium einzubringen. Das transgene Tier kann vorteilhafterweise beim Screening nach Karzinogenen oder Antikrebsmitteln, wie Antioxidationsmitteln, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls ein Antisinn-Gen vor, welches in einer Gentherapie nützlich ist. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "ein Antisinn-Gen" ein Polynukleotid, umfassend eine Basensequenz, welche vollständig oder teilweise komplementär zu der Sequenz der mRNA ist, welche von dem Protoonkogen, das die Basensequenz von SEQ ID Nr.: 1 aufweist, oder einem Fragment davon transkribiert wird, wobei das Nukleotid in der Lage ist, die Expression des offenen Leserasters (ORF) des Protoonkogens zu verhindern, indem es sich selbst an die Protein-Bindungsstelle der mRNA anlagert.
Die vorliegende Erfindung schließt innerhalb ihres Umfangs ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von Krebs in einem Subjekt auf dem Wege der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des Antisinn-Gens der Erfindung an dieses ein.
In der erfindungsgemäßen Antisinn-Gentherapie wird das Antisinn-Gen der vorliegenden Erfindung auf eine herkömmliche Weise an ein Subjekt verabreicht, um die Expression des Protoonkogens zu verhindern. Beispielsweise wird das Antisinn-Oligodesoxynukleotid (ODN) mit einem hydrophobierten Poly-L-lysin-Derivat durch elektrostatische Wechselwirkung gemäß des Verfahrens gemischt, welches von Kim, J. S., et al. (J. Controlled Release 53: 175–182, 1998) offenbart wurde, und das resultierende gemischte Antisinn-ODN wird intravenös an ein Subjekt verabreicht.
Die vorliegende Erfindung schließt innerhalb ihres Umfangs ebenfalls eine Antikrebs-Zusammensetzung ein, umfassend das Antisinn-Gen der vorliegenden Erfindung als einen aktiven Bestandteil in Assoziation mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder anderen Additiven, falls notwendig. Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise für eine Verabreichung mittels Injektion formuliert.
Die Menge des tatsächlich verabreichten Antisinn-Gens sollte im Hinblick auf verschiedene relevante Faktoren bestimmt werden, einschließlich dem zu behandelnden Zustand, dem gewählten Verabreichungsweg, dem Alter und Gewicht des individuellen Patienten und der Schwere der Symptome des Patienten.
Das von dem Protoonkogen der Erfindung exprimierte Protein kann bei der Herstellung eines als diagnostisches Werkzeug nützlichen Antikörpers verwendet werden. Der Antikörper der vorliegenden Erfindung kann in der Form eines monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers gemäß jedes der Verfahren, welche im Fachgebiet gut bekannt sind, unter Verwendung eines Proteins mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 oder eines Fragmentes davon hergestellt werden. Eine Krebsdiagnose kann unter Anwendung von jedem der im Fachgebiet bekannten Verfahren ausgeführt werden, z. B. Enzyme-linked Immunosorbent-Assay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA), Sandwich-Assay, immunohistochemische Färbung, Western-Blot oder Immunoassay-Blot auf Polyacrylgel, um zu überprüfen, ob das Protein in der Körperflüssigkeit des Subjekts exprimiert ist. Deshalb ist ein Krebsdiagnose-Kit, welches das Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 oder ein Fragment davon enthält, ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Eine kontinuierlich lebensfähige Krebs-Zelllinie kann unter Verwendung des Protoonkogens der vorliegenden Erfindung etabliert werden, und eine solche Zelllinie kann beispielsweise aus Tumorgeweben erhalten werden, die auf dem Rücken einer Nacktmaus gebildet werden durch Injizieren von Fibroblastenzellen, welche mit dem Protoonkogen der vorliegenden Erfindung transformiert worden sind. Die so hergestellten Zelllinien können vorteilhaft in der Suche nach Anti-Krebs-Mitteln eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung schließt innerhalb ihres Umfangs ebenfalls ein Verfahren zum Screening nach Anti-Krebs-Arzneistoffkandidaten durch Verwenden des Protoonkogens oder eines Fragmentes davon ein.
Nach einer Charakterisierung der Rolle des Protoonkogens der Erfindung und seines Proteinproduktes in der Tumorentstehung können diese für die Inhibierung des Onkogens oder Onkoproteins durch Verabreichen von Antisinn-Oligodesoxynukleotid, welches auf die Gene abzielt, oder Antikörpern, welche auf die Proteine abzielen, verwendet werden. Unter Nutzung der charakterisierten Rolle des Protoonkogens der Erfindung können auch die wechselwirkenden Moleküle gefunden werden, welche an bekannte Onkoproteine binden, und dann kann man Inhibitoren, Antikrebs-Arzneistofikandidaten, entwerfen, welche die wechselwirkenden Moleküle zerstören bzw. aufspalten können.
Die folgenden Beispiele und Testbeispiele sind lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung angegeben, und mit ihnen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung einzuschränken.
Beispiel 1: Hefe-Zwei-Hybrid-Assay
Um ein Bindungsprotein für das Proteinprodukt von humanem Protoonkogen HCCR-1 (Genebank Zugangs-Nr.: AF195651) zu finden, wurde ein Hefe-Zwei-Hybrid-Assay unter Verwendung des MATCHMAKER LexA Zwei-Hybrid-Systems (Clontech Laboratories, Inc., USA) gemäß der früher berichteten Vorgehensweise (Golemis, E. A., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Kapitel 20.0 und 20.1, 1996) durchgeführt.
Die im folgenden Experiment verwendeten Zelllinien und Vektoren sind im Katalog Nr. K1609-1-Kit von Clontech Laboratories, Inc., aufgelistet.
Der Hefestamm EGY48 wurde mit dem Vektor p8op-lacZ transformiert und in einer SD/-Uracil/Glucose-Platte, einem synthetischen "Dropout"-Medium ohne Uracil, kultiviert. Die Kolonie, welche auf dieser Platte wuchs, wurde selektiert, in einem SD/-Uracil/Glucose-Medium kultiviert und mit einem Vektor, der durch Inserieren des HCCR-1-Gens in die Bam-HI- und SalI-Stellen von Vektor pLexA hergestellt worden war, als ein "Köder-Plasmid" transformiert.
Um die Expression des HCCR-1-Gens, welches im Vektor pLexA kloniert worden war, zu untersuchen, wurde ein Western-Blotting unter Verwendung von LexA-Antikörper durchgeführt. Das Ergebnis zeigte eine jeweils 64 ~ 65 kDa große Bande.
Die HCCR-1-Gen exprimierende Kolonie wurde in einem SD/-Uracil,-Histidin/Glucose-Medium kultiviert und mit dem Vektor pBD42AD transformiert, welcher eine humane fötale Hirn-abgeleitete AD (Aktivierungsdomänen)-Fusionsbibliothek ist. Um die Bindung des Köders mit der Bibliothek zu bestätigen, wurde ein "Kolonie-Lifting"-Assay (Breeden, L. und Nasmyth, K., Cold Spring Harbor Symposium Quant. Bio. 50: 643–650, 1985) durchgeführt. Wenn der Köder mit der Bibliothek wechselwirkt, wird sich eine blaue Kolonie auf einer Xgal-Platte bilden. DNA wurde aus der kultivierten Hefe unter Verwendung von Glaskügelchen gereinigt, und es erfolgte eine Transformation von E. coli KC8 mit der gereinigten DNA durch Elektroporation und Ausstreichen auf einem M9-Minimalmedium zum Selektieren von Transformanten.
Die Nukleotidsequenz des Volllängen-KG-19-cDNA-Klons wurde bei GenBank unter der Zugangs-Nr.: AF283671 registriert.
In SEQ ID Nr.: 1 ist das vollständige offene Leseraster von KG-19, entsprechend Base Nr. 136 bis 638, eine Protein-codierende Region, und die daraus abgeleitete vorhergesagte Aminosäuresequenz wird in SEQ ID Nr.: 2 gezeigt, welche aus 166 Aminosäuren besteht.
Die Volllängen-KG-19-cDNA wurde in die Mehrfachklonierungsstelle des Vektors pGEM-T-easy (Promega, USA) unter Verwendung von DNA-Ligase inseriert, um einen rekombinanten Vektor zu erhalten, welcher das KG-19-Gen exprimiert. E.coli XL1-Blue MRA (Stratagene, USA) wurde mit dem rekombinanten Vektor transformiert, um einen transformierten E. coli zu erhalten, welcher als XL1-Blue MRA/pGEM-T-easy KG-19 bezeichnet wurde, welcher bei der "Korean Collection for Type Cultures" (Adresse: #52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon 305–333, Republik Korea) am 18. September 2000 unter der Zugangs-Nr. KCTC0862BP hinterlegt wurde.
Beispiel 3: Northern-Blot-Analyse
Um den Expressionsspiegel des KG-19-Gens in verschiedenen normalen Geweben und Krebsgeweben zu bestimmen, wurden auch Northern-Blot-Analysen, wie vom Hersteller (Clontech) empfohlen, unter Verwendung einer kommerziellen Probe, enthaltend gereinigte DNAs von 12 Spuren mehrer normaler humaner Gewebe, geblottet auf einer Nylon-Membran (1a und 1b), und ebenfalls unter Verwendung einer Probe einer humanen Krebszelllinie, enthaltend gereinigte RNAs von 8 Arten von Krebszellen, geblottet auf einer Nylon-Membran (2a und 2b), durchgeführt.
Die Blots wurden über Nacht bei 68°C mit ³²P-markierter statistisch geprimter KG-19-cDNA-Sonde hybridisiert, welche unter Verwendung eines "Rediprime II"-Zufallspriming-Markierungssystems (Amersham, England) hergestellt worden war. Die Northern-Blot-Analyse wurde zweimal wiederholt, und die Ergebnisse wurden mittels Densitometrie quantifiziert. Dieselben Blots wurden mit einer β-Actin-Sonde hybridisiert, um die mRNA-Integrität zu bestätigen.
Die 1a zeigt das Northern-Blot-Analyseergebnis von normalen humanen 12-Spur-Mehrfach-Geweben, d. h. Hirn, Herz, Skelettmuskulatur, Colon, Thymus, Milz, Niere, Leber, Dünndarm, Plazenta, Lunge und peripheren Blutleukozyten, unter Verwendung der KG-19-cDNA-Sonde; und 1b zeigt denselben Blot, hybridisiert mit einer β-Actin-Sonde. Wie in 1a ersehen werden kann, wird das 0,8 kb große Transkript der zwei KG-19-mRNA-Transkripte nicht in irgendeinem der normalen Gewebe nachgewiesen, wohingegen das 7,5-kb-Transkript, welches als ein KG-19-Protoonkogen enthaltendes Transkript vor dem Spleißen angesehen wird, nur in normalem Nierengewebe schwach exprimiert wird.
2a zeigt die Northern-Blot-Analyse für das KG-19-Gen, exprimiert in humanen Krebszelllinien, d. h. promyelocytischen Leukämie-HL-60-Zellen, HeLa-Gebärmutterhalskrebszellen, Zellen der chronischen myelogenen Leukämie K-562, Zellen der lymphoblastischen Leukämie MOLT-4, Burkitt-Lymphom-Raji-Zellen, SW480-Colon-Krebszellen, A549-Lungenkrebszellen und G361-Melanomzellen, unter Verwendung der KG-19-cDNA-Sonde; und die 2b zeigt denselben Blot, welcher mit einer β-Actin-Sonde hybridisiert wurde. Wie in 2a ersehen werden kann, wird das 0,8 kb große Transkript von KG-19 bei Burkitt-Lymphom Raji und promyelocytischer Leukämie HL-60 nachgewiesen, und das 7,5 kb große Transkript wird ebenfalls bei einem hohen Spiegel bei der promyelocytischen Leukämie HL-60, HeLa-Gebärmutterhalskrebszellen, chronischer myelogener Leukämie K-562, lymphoblastischer Leukämie MOLT-4, Burkitt-Lymphom Raji, SW480-Colon-Krebszellen, A549- Lungenkrebszellen und G361-Melanomzellen exprimiert. Insbesondere MOLT-4 und Raji zeigen höhere Transkriptionsspiegel im Vergleich zu anderen Krebszellen.
Ferner wurden Northern-Blotting-Analysen der Eierstock-, Brust- und Lungenkrebsgewebe und ihrer normalen Gegenstücke durchgeführt, um die Expression des KG-19-Gens zu bestätigen. Gesamt-RNAs wurden aus Eierstock-, Brust- und Lungengeweben von gesunden normalen Menschen und aus Eierstockkrebs-, Brustkrebs- und Lungenkrebsgeweben von Krebspatienten unter Verwendung des "RNeasy total RNA"-Kits (Qiagen Inc., Deutschland) gereinigt. Jeweils 20 μg der Gesamt-RNAs wurden denaturiert und dann durch 1 %-Formaldehyd-Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nylon-Membranen (Boehringer-Mannheim, Deutschland) überführt. Die Blots wurden bei 68°C mit ³²P-markierter, statistisch geprimter KG-19-Gesamt-cDNA-Sonde hybridisiert, welche unter Verwendung eines "Rediprime II"-Zufallspriming-Markierungssystems (Amersham, England) hergestellt worden war. Die Northern-Blot-Analyse wurde zweimal konsistent wiederholt, und das Ergebnis wurde mittels Densitometrie quantifiziert. Die gleichen Blots wurden mit einer β-Actin-Sonde hybridisiert, um die mRNA-Integrität zu bestätigen.
3a zeigt das Northern-Blot-Analyseergebnis von normalem Eierstockgewebe und Eierstockkrebsgewebe unter Verwendung der KG-19-cDNA-Sonde; und 3b zeigt denselben Blot, der mit einer β-Actin-Sonde hybridisiert wurde. Wie in der 3a gezeigt, wird das 0,8 kb große Transkript von KG-19 bei einem hohen Spiegel in den Eierstockkrebsgeweben exprimiert, wohingegen die Expression von KG-19-Gen in den normalen Eierstockgeweben kaum zu beobachten ist. In 3a und 3b repräsentieren die N-Spur bzw. C-Spur normales Eierstockgewebe bzw. Eierstockkrebsgewebe.
Die 4a zeigt das Northern-Blot-Analyseergebnis von normalem Brustgewebe und Brustkrebsgewebe unter Verwendung von KG-19-cDNA-Sonde; und die 4b zeigt denselben Blot, der mit einer β-Actin-Sonde hybridisiert wurde. Wie in der 4a gezeigt, wird das 0,8 kb große Transkript von KG-19 bei einem hohen Spiegel in dem Eierstockkrebsgewebe [Brustkrebsgewebe] exprimiert, wohingegen die Expression von KG-19-Gen in dem normalen Brustgewebe kaum zu beobachten ist. In 4a und 4b repräsentieren die N-Spur bzw. C-Spur normales Brustgewebe bzw. Brustkrebsgewebe.
Die 5a zeigt das Northern-Blot-Analyseergebnis von normalem Lungengewebe und Lungenkrebsgewebe unter Verwendung von KG-19-cDNA-Sonde; und die 5b zeigt denselben Blot, der mit einer β-Actin-Sonde hybridisiert wurde. Wie in der 5a gezeigt, werden das 0,8 kb große und das 7,5 kb große Transkript von KG-19 bei hohen Spiegeln in dem Lun genkrebsgewebe exprimiert, wohingegen die Expression von KG-19-Gen in dem normalen Lungengewebe kaum zu beobachten ist. In 5a und 5b repräsentieren die N-Spur bzw. C-Spur normales Lungengewebe bzw. Lungenkrebsgewebe.
Beispiel 4: Konstruktion von Expressionsvektoren und Transformation von Tierzellen
(Schritt 1) Herstellung eines Vektors, der KG-19 enthält
Ein Expressionsvektor, enthaltend die codierende Region von KG-19, wurde wie folgend konstruiert.
Zuerst wurde der Fusionsvektor pCDNA3 (Invitrogen, USA) – Glutathion-S-Transferase (GST) durch Insertion des GST-Gens in den eukaryotischen Expressionsvektor pcDNA3 mittels HindIII/KpnI-Verdau konstruiert. Das KG-19-Gen, welches die gesamte codierende Sequenz (entsprechend Base Nr. 121–674 in SEQ ID Nr.:1) aufweist, wurde mit BamHI/XbaI verdaut, und dann wurde das BamHI/XhaI-Fragment mit der codierenden Volllängen-KG-19-Sequenz in den BamHI/XbaI-verdauten pcDNA3 inseriert. Lipofectamin (Gibco BRL) wurde verwendet, um den resultierenden Vektor pCDNA3/GST/KG-19 in embryonale menschliche 293-Nierenepithelzellen (ACTC CRL 1753, USA) einzubringen, worauf eine Selektion in einem Medium erfolgte, das mit G418 (Gibco, USA) ergänzt war. Die resultierenden, mit KG-19 transfizierten, 293-Zellen wurden als "KG-19-Zellen" bezeichnet.
(Schritt 2) Mit dem KG-19-Protoonkogen transfizierte embryonale menschliche 293-Nierenepithelzellen
Die normalen Wildtyp-293-Zellen und die in Schritt 1 erhaltenen 293-Zellen wurden in einer Monoschicht in 10% Serum enthaltenden DMEM-Medien kultiviert und ihre Wachstumsmerkmale wurden mit einem Phasenkontrast-Mikroskop (Olympus, USA) beobachtet. Die 6a und 6b zeigen die Phasenkontrast-Merkmale von in Monoschicht kultivierten embryonalen menschlichen Wildtyp-293-Nierenzellen und KG-19-transfizierten embryonalen menschlichen 293-Nierenzellen. Wie in der 6a gezeigt, besitzen die als Epithelzellen proliferierten Wildtyp-293-Zellen jeweils eine Spindelform mit einem langen feinen Zellkern und schlankem Cytoplasma. Im Fall der KG-19-Zellen ändert sich die Zellform zu einer polygonalen Form mit einem eiförmigen Zellkern und plumpem Cytoplasma, wie in der 6b gezeigt.
In Monoschicht kultivierte KG-19-Zellen, welche mit Hämatoxylin-Eosin (H & E) gefärbt werden, zeigen einen Zellkern-Pleiomorphismus, distinkte Nucleoli, granuläre Chromatin-Muster, Tumor-Riesenzellen und atypische mitotische Figuren, wie gezeigt in der 7.
Beispiel 5: Tumorigenität von KG-19-Protoonkogen in Tieren
Um die Tumorigenität zu analysieren, wurden 5 × 10⁶ KG-19-Zellen subkutan in den Rücken des Rumpfes von 9 Nacktmäusen (5 Wochen alte athymische nu/nu auf BALB/c-Hintergrund) injiziert. Alle 9 mit KG-19-Zellen injizierten Mäuse zeigten eindeutige Tumoren nach 14 Tagen, wobei die Tumorgröße in 30 Tagen auf 2,0 cm × 2,0 cm anwuchs, wie in der 8 gezeigt wird.
Beispiel 6: Bestimmung der Größe des Proteins, welches nach der Transfektion von E.coli mit KG-19-Protoonkogen exprimiert wird
Die codierende Volllängen-Sequenz-Region des KG-19-Protoonkogens, entsprechend Base Nr. 138 bis 638 von SEQ ID Nr.:1, und codierend Aminosäure Nr. 1 bis 166 von SEQ ID Nr.:2, wurde in die BamHI/NotI-Erkennungsstelle der Mehrfachklonierungsstelle des Vektors pGEX 4T-3 (Amersham Pharmacia Biotech, USA), fusioniert mit dem GST-Gen, inseriert und der resultierende Vektor pGEX 4T-3/KG-19 wurde in E. coli BL21 (ATCC 47092) transfiziert. Der transfizierte E. coli wurde unter Verwendung eines LB-Nährmediums in einem Rotations-Schüttelinkubator 16 Stunden lang bei 37°C inkubiert, 1/100 verdünnt und 3 Stunden lang inkubiert. 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG, Sigma) wurde dazugegeben, um die Proteinsynthese zu induzieren.
Die E. coli-Zellen in der Kultur wurden durch Schallbehandlung aufgebrochen und einer Gelelektrophorese unter Verwendung von 12 % Natriumdodecylsulfat (SDS) vor und nach der IPTG-Induktion unterzogen. Die 9 zeigt die SDS-PAGE-Ergebnisse, welche ein Proteinexpressionsmuster des E. coli-Stammes BL21, der mit dem Vektor pGEX 4T-3/KG-19 transfiziert war, aufzeigen. Nach der IPTG-Induktion wurde eine signifikante Proteinbande bei etwa 45 kDa beobachtet. Dieses fusionierte 45-kDa-Protein enthielt ein etwa 26 kDa großes GST-Protein, welches von dem Gen des Vektors pGEX 4T-3 exprimiert worden war.
Während die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben und veranschaulicht worden sind, ist es offensichtlich, dass verschiedene Änderungen und Modifikationen daran vorgenomen werden können, ohne vom Sinn der vorliegenden Erfindung abzuweichen, welche lediglich durch den Umfang der beiliegenden Patentansprüche eingeschränkt sein sollte.
Sequenz-Auflistungen

Claims

Humanes KG-19-Protoonkogen mit der Basensequenz von SEQ ID Nr.: 1 oder ein biologisch aktives Fragment davon, wobei letzteres die Protoonkogen-Aktivität der Vollängenform aufweist.
Protoonkogen oder ein biologisch aktives Fragment von Anspruch 1, welches ein Fragment mit einer Basensequenz, entsprechend Base Nr. 138 bis 638 von SEQ ID Nr.: 1, ist
Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.: 2 oder ein biologisch aktives Fragment davon.
Vektor, umfassend das Protoonkogen oder ein biologisch aktives Fragment von Anspruch 1.
Mikroorganismus, transformiert mit dem Vektor von Anspruch 4.
Mikroorganismus von Anspruch 5, bei dem es sich um E. coli XL1-Blue MRA/pGEM-T/KG-19 (Zugangs-Nr.: KCTC 0862BP) handelt.
Verfahren zur Herstellung des Proteins oder eines biologisch aktiven Fragmentes von Anspruch 3, umfassend das Kultivieren des Mikroorganismus von Anspruch 5 oder 6.
Kit zum Diagnostizieren von Krebs, welches das Protoonkogen oder Fragment von Anspruch 1 oder 2 umfasst.
Kit zum Diagnostizieren von Krebs, welches das Protein oder biologisch aktive Fragment von Anspruch 3 umfasst.
Antisense-Gen mit einer Basensequenz, welche komplementär zu der Sequenz der vollständigen oder teilweisen mRNA ist, die von dem Protoonkogen oder biologisch aktiven Fragment von Anspruch 1 oder 2 transkribiert wird, und zur Bindung der mRNA zur Inhibierung der Expression des Protoonkogens oder Fragmentes in der Lage ist.
Zusammensetzung zur Verhinderung oder Behandlung von Krebs, welche eine therapeutisch wirksame Menge des Antisense-Gens von Anspruch 10 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.