JP3970771B2 - ヒト癌原遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質 - Google Patents
ヒト癌原遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、新規な癌原遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質に関するものであって、これらは、種々の癌の診断、形質転換動物の製造およびアンチセンス遺伝子の治療および抗癌剤の開発などに効果的に利用できる。
【０００２】
【発明の背景】
ヒトを含む高等動物は、約１００，０００個の遺伝子を有しているが、これらのうち約１５％のみが発現され、発生、分化、恒常性（homeostasis）、刺激に対する反応、細胞分裂周期の調節、老化およびアポトーシス（apoptosis; programmed cell death）などのような個人の生物学的過程の特性はどの遺伝子が発現するかによって決定される（Liang, P. and A. B. Pardee, Science, 257: 967-971(1992)参照）。
【０００３】
腫瘍形成のような病理学的現象は、遺伝子突然変異によって誘発され、遺伝子発現の変化をもたらす。したがって、種々の細胞における遺伝子発現の比較研究は多様な生物学的現象を理解する上で基本的で効果的な接近方法であるといえる。
【０００４】
腫瘍形成は、特定染色体部位の消失、癌原遺伝子の活性化およびｐ５３遺伝子を含む他の腫瘍抑制遺伝子の失活などのような種々の遺伝的変化によって誘発されると報告されている（Bishop, J. M., Cell, 64: 235-248(1991)；およびHunter, T., Cell, 64: 249-270(1991)参照））。さらに、ヒト癌の１０〜３０％は癌原遺伝子の増幅を通じて発癌遺伝子が活性化されることによって発病すると報告されている。
【０００５】
したがって、癌原遺伝子の活性化は多くの癌の病因学研究に重要な役割を果し、これを明らかにすることが要求されている。
【０００６】
そこで、本発明者は、子宮頸部癌の腫瘍形成に介入された機構を調査するために鋭意研究した結果、ヒト子宮頸部癌１（ＨＣＣＲ−１）（韓国特許出願第２０００−１６７５７号；２０００．３．３１）およびヒト子宮頸部癌２（ＨＣＣＲ−２）（韓国特許出願第２０００−７１２０２号；２０００．１１．２８）と命名された新規な癌原遺伝子が癌細胞中に特異に過発現されるという意外な事実を発見した。癌原遺伝子は、構造的な変異を通じて該当するタンパク質産物の質的、そして量的な発現の変化を引起こす（Weinberg, R. A., Cancer Research, 49: 3713-3721, 1989）。癌タンパク質は、細胞表面、細胞質または核において信号伝達経路（signal transduction pathway）を破壊するが、腫瘍抑制遺伝子産物がない場合、他の種類の癌タンパク質とともに細胞の増殖を促進し、細胞周期（cell cycle）を撹乱し、また、細胞死滅（アポトーシス）機構を取り崩す（Todd, R., Anticancer Research, 19: 4729-4746, 2000）。
【０００７】
このようなタンパク質とタンパク質の相互作用を糾明する酵母２ハイブリッド（Yeast two-hybrid）法は、1989年に考案されて以来（Fields, S. and Song, O., Nature, 340: 245-246 , 1989）、細胞死滅機構(Wallach, D. et al., Curr Opin Immuno l, 10: 131-136, 1998)と種々の遺伝体系を用いて生命現象を明らかにするのに利用されている(Pandey, A. and Mann, M., Natu re, 405: 837-846, 2000)。
【０００８】
本発明者は、酵母２ハイブリッド法を用いてＨＣＣＲ−１癌原遺伝子−由来タンパク質産物に対する新規結合タンパク質を開発するために鋭意研究した結果、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子だけでなくＨＣＣＲ−２に各々特異的に結合する新しいヒト癌原遺伝子ＫＧ−１９を明らかにした。前記癌原遺伝子ＫＧ−１９は、白血病、リンパ腫、大腸癌、乳房癌、腎臓癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、および子宮癌などのような様々な癌の診断、予防および治療に効果的に使用し得る。
【０００９】
【発明の要約】
したがって、本発明の目的は、新規な癌原遺伝子およびその断片を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記癌原遺伝子またはその断片を含む組換えベクターおよびそれによって形質転換された微生物；
前記癌原遺伝子によってコードされるタンパク質およびその断片；
前記癌原遺伝子またはその断片を含む癌診断用キット；
前記タンパク質またはその断片を含む癌診断用キット；
前記癌原遺伝子またはその断片から誘導されるｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有するアンチセンス遺伝子；
前記アンチセンス遺伝子を用いて癌を治療または予防する方法；および
前記癌原遺伝子またはその断片を用いて抗癌剤候補物質をスクリーニングする方法；を提供することである。
【００１１】
本発明の一実施態様によって、配列番号：１のヌクレオチド配列を有する新規な癌原遺伝子またはその断片が提供される。
本発明の他の実施態様によって、前記癌原遺伝子またはその断片を含む組換えベクターおよび該ベクターによって形質転換された微生物が提供される。
本発明のまた他の実施態様によって、前記癌原遺伝子またはその断片から誘導された配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片が提供される。
【００１２】
【発明の詳細な記述】
本発明の新規癌原遺伝子（protooncogene）はＫＧ−１９と命名されたものであって、７７２塩基対（ｂｐ）からなり、配列番号：１のＤＮＡ配列を有する。
【００１３】
特に、本発明のＫＧ−１９癌原遺伝子は、本出願人によって出願された韓国特許出願第２０００−１６７５７号に記載されたヒト子宮頸部癌１癌原遺伝子（human cervical cancer proto-oncogene 1、以下「ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子」と称する）および韓国特許出願第２０００−７１２０２号に記載されたＨＣＣＲ−２と特異的に結合する性質を有する。
【００１４】
配列番号：１の塩基配列において、塩基番号１３８〜６３８部位に該当するオープン・リーディング・フレーム（Open reading frame;ORF）は、全長タンパク質コーディング領域であり、それから誘導されるアミノ酸は配列番号：２に示される１６６個のアミノ酸からなっている（「ＫＧ−１９タンパク質」）。しかし、コドンの縮退性（degeneracy）および本発明の癌原遺伝子を発現させようとする特定生物において選好されるコドンを考慮するとき、配列番号：１のＤＮＡ配列の多様な変化および変形は、発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変えない範囲内のコーディング領域または癌原遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内の非−コーディング領域で行われることができる。したがって、本発明の癌原遺伝子と実質的に同様な塩基配列を有するポリヌクレオチドおよびその断片もまた本発明の範疇に含まれる。本願に用いられる「実質的に同様なポリヌクレオチド」とは、本発明の癌原遺伝子と塩基配列が８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００１５】
本発明の癌原遺伝子から発現されるタンパク質は、１６６個のアミノ酸からなり、配列番号：２のアミノ酸配列を有し、このタンパク質の分子量は約１９ｋｄである。しかし、タンパク質のアミノ酸残基の置換、付加および／または欠失をタンパク質の機能に影響を及ぼさない範囲内で行うことができる。また、目的に応じてタンパク質の一部のみが使用され得る。このような変形されたアミノ酸およびその断片もまた本発明の範囲に含まれる。したがって、本発明の範疇には、本発明の発癌遺伝子から誘導されたタンパク質と実質的に同様なアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその断片が含まれる。本願に用いられる「実質的に同様なポリペプチド」とは、配列番号：２のアミノ酸配列とアミノ酸配列が８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するポリペプチドを意味する。
【００１６】
本発明の癌原遺伝子またはタンパク質は、ヒト癌組織から得られるか、通常のＤＮＡまたはペプチド合成方法に従って合成することができる。また、このように製造された遺伝子を通常のベクターに挿入して発現ベクターを製造した後、これを適切な宿主、たとえば、大腸菌または酵母のような微生物、或はマウスのような動物細胞、またはヒト細胞に導入し得る。本願では、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子またはその断片を含有するベクターで形質転換された細胞を「ＫＧ−１９細胞」と称する。
【００１７】
形質転換された宿主を用いて本発明のＤＮＡまたはタンパク質を大量生産することができる。たとえば、ＫＧ−１９癌原遺伝子を含むｐＧＥＭ−Ｔ発現ベクター（Promega、米国）で大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換して得られた大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ／ｐＧＥＭ−Ｔ／ＫＧ−１９を、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定により、２０００年９月１８日付で韓国生命工学研究所遺伝子銀行（Korean Collection for Type Cultures (KCTC)；住所：大韓民国大田廣域市儒城區魚隠洞５２番地韓国生命工学研究所（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB)）に寄託番号第ＫＣＴＣ ０８６２ＢＰ号として寄託した。
【００１８】
ベクター製作の際には、プロモーター、ターミネーターのような発現調節配列、自家複製配列および分泌シグナルを宿主細胞の種類によって適宜選択し、結合することができる。
【００１９】
本発明の癌原遺伝子の過発現は、正常のヒト組織、たとえば、脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺および末梢血液においては起こらないが、白血病、リンパ腫、乳房癌、腎臓癌、卵巣癌、肺癌および胃腸癌、皮膚癌細胞株においては過発現が起こる。これから、本発明の癌原遺伝子は前述の癌を誘発させることが分かる。また、正常の２９３ヒト胎生期腎臓細胞（human embryonic kidney;HEK）が本発明の癌原遺伝子でトランスフェクトされると非正常細胞が生成する。光学顕微鏡と電子顕微鏡で観察した形態学的特定技術は非正常細胞が腫瘍細胞の形態を有することを示す。すなわち、ヘマトキシリン−エオシン染色法を用いて腫瘍細胞が癌にかかったことを確認できる。
【００２０】
また、本発明の癌原遺伝子でトランスフェクトされた正常２９３ＨＥＫ細胞をヌードマウスの背部に注射する場合、注射してから約１４日後に腫瘍形成が観察され、約３０日目には２．０ｃｍ×２．０ｃｍ大きさの腫瘍が観察される。
【００２１】
したがって、本発明の癌原遺伝子は種々の癌の発生に共通した因子であると判断され、種々の癌の診断および形質転換された動物の製造およびアンチセンス遺伝子の治療および抗癌剤薬物の開発に効果的に利用することができる。
【００２２】
本発明の癌原遺伝子を用いた診断方法は、たとえば、本発明の癌原遺伝子またはその断片を含有するプローブを用いて対象者の体液から分離した核酸をハイブリッド化する段階および当分野で公知の検出方法を用いてその物質が癌原遺伝子を有しているかを判断する段階を含む。前記プローブを放射線同位元素または酵素で標識することによって、癌原遺伝子の存在を容易に確認することができる。したがって、本発明の癌原遺伝子またはその断片を含む癌診断用キットもまた本発明の範疇に含まれる。
【００２３】
形質転換動物は、本発明の癌原遺伝子を哺乳動物、たとえば、ラットに導入することによって製造でき、これもまた本発明の範疇に含まれる。形質転換動物の製造に当たっては、本発明の癌原遺伝子を８細胞期以前の動物受精卵段階に導入することが好ましい。このように形質転換された動物は、発癌性物質、または抗酸化剤のような抗癌性物質の探索などに有用である。
【００２４】
また、本発明は、遺伝子治療に効果的なアンチ−センス遺伝子を提供する。本願において、「アンチセンス遺伝子（anti-sense gene）」とは、配列番号：１の塩基配列を有する癌原遺伝子またはその断片から転写されるｍＲＮＡ配列の全部または一部と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを意味し、前記ヌクレオチドはｍＲＮＡのタンパク質結合部位に結合することによって癌原遺伝子のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の発現を防止することができる。
【００２５】
本発明はまた、その範囲内に本発明のアンチセンス遺伝子の治療学的有効量を患者に投与することによって癌を治療または予防する方法を含む。
【００２６】
本発明のアンチセンス遺伝子の治療に当たっては、本発明のアンチセンス遺伝子は癌原遺伝子の発現を予防するために通常の方法で患者に投与される。たとえば、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を文献［J.S. Kim et al. J. Controlled Release, 53, 175-182(1998)］に開示された方法に従って、ポリ−Ｌ−リジン誘導体と静電気的引力によって混合し、この混合したアンチセンスＯＤＮを患者に静脈投与する。
【００２７】
本発明の範囲にはまた、薬剤学的に許容可能な担体、賦形剤または必要に応じて他の添加剤とともに本発明のアンチセンス遺伝子を活性成分として含む抗癌組成物が含まれる。本発明の薬剤学的組成物は注射剤に製剤化することが好ましい。
【００２８】
実際に投与されるアンチセンス遺伝子の量は治療する症状、選択された投与経路、患者の年齢および体重、症状の重症度を含む種々の関連因子を考慮して決定されなければならない。
【００２９】
本発明の癌原遺伝子から発現されるタンパク質は、診断道具として抗体を生産するのに有用である。本発明の抗体は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片を用いて当分野で公知の通常の方法に従ってモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の形態に製造できる。このような抗体を用いて当分野で公知の任意の方法、たとえば、酵素免疫測定法（enzyme linked immunosorbentassay(ELISA)）、放射線免疫測定法（radioimmunoassay(RIA)）、サンドイッチ分析法（sandwich assay）、免疫組織化学染色法、ポリアクリルゲル上ウエスタンブロットまたは免疫ブロット方法によって対象者の体液に当該タンパク質が発現されたかを確認することによって癌を診断することができる。したがって、本発明の範疇には、配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片を含む発癌診断キットが含まれる。
【００３０】
本発明の癌原遺伝子を用いて持続的に増殖し得る癌細胞株を確立することができ、このような細胞株は、たとえば、本発明の癌原遺伝子で形質転換された繊維芽細胞をヌードマウスに注射することによって背部に形成された腫瘍組織から得られる。このように製造された細胞株は、抗癌剤の探索に効果的に利用することができる。
【００３１】
また、本発明の範疇には、前記癌原遺伝子またはその断片を用いて抗癌剤候補物質をスクリーニングする方法が含まれる。
【００３２】
腫瘍形成において、本発明の癌原遺伝子およびそのタンパク質の特徴を糾明した後、これは前記遺伝子をターゲットとするアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドまたは前記タンパク質をターゲットとする抗体を投与することにより、前記遺伝子またはタンパク質を抑制するのに利用できる。このように糾明された本発明の癌原遺伝子の特徴を用いて、公知の癌原遺伝子と結合する関連分子を発見し、これから関連分子を分解できる抑制剤、すなわち、抗癌剤候補物質を考案できる。
【００３３】
下記の実施例および試験例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【００３４】
＜実施例１：酵母２ハイブリッド＞
ヒト癌原遺伝子であるＨＣＣＲ−１遺伝子（Genebank accession no.: AF195651）のタンパク質産物と結合するタンパク質を発見するために、マッチメーカーＬｅｘＡ２ハイブリッドシステム（MATCHMAKER LexA Two-Hybrid System; Clontech. Laboratories, Inc., USA）を用いて従来報告されている方法（Golemis, E. A., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. Chapters 20.0 and 20.1, 1996）に従って実験を行った。
【００３５】
次の実験に用いられた細胞株とベクターはクロンテック（Clontech）社のカタログ＃Ｋ１６０９−１キットに記載されているものである。
【００３６】
酵母菌株であるＥＧＹ４８にｐ８ｏｐ−ｌａｃＺベクターを導入して形質転換（transformation）した後、ウラシル（Uracil）のない合成ドロップアウト（dropout）培地であるＳＤ／−ウラシル／グルコースプレートで培養した。前記プレートで成長したコロニー（colony）を選別してＳＤ／−ウラシル／グルコース培地（media）で培養した後、ＨＣＣＲ−１遺伝子をｐＬｅｘＡベクターのＢａｍＨＩとＳａｌＩ部位に挿入して製造したベクターをバイトプラスミド（bait plasmid）としてこの酵母菌株で形質転換した。
【００３７】
ＰＬｅｘＡベクターにクローニングされたＨＣＣＲ−１遺伝子が発現されるかを確認するために、ＬｅｘＡ抗体を用いてウェスタンブロット（western blotting）を行った。その結果、６４〜６５ｋＤａでバンドが得られた。
【００３８】
ＨＣＣＲ−１遺伝子を発現するコロニーをＳＤ／−ウラシル、−ヒスチジン／グルコース培地で培養した後、ヒト胎児脳（fetal brain）由来ＡＤ融合ライブラリーであるｐＢＤ４２ＡＤベクターでさらに形質転換した。バイトとライブラリーが結合することを確認するために、コロニーリフト分析法（colony lifting assay; Breeden, L. & Nasmyth, K., Cold Spring Harbor Symposium Quant. Bio., 50: 643-650, 1985）を行った。バイトとライブラリーが結合すると、Ｘ−ｇａｌの入っているプレートで青色コロニーが形成する。酵母を培養した後、ガラスビーズ（glass bead）を用いてＤＮＡを抽出し、大腸菌（E. coli）ＫＣ８を電気穿孔法（electroporation）で形質転換した後、Ｍ９最少培地に展開して形質転換体を選別した。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、これで大腸菌ＤＨ５αをさらに形質転換した後、大腸菌形質転換体からＤＮＡを抽出してＨｉｎｄIIIを処理して約０．８ｋｂ ＤＮＡを有するクローンを得た。
【００３９】
＜実施例２：ＫＧ−１９癌原遺伝子の全体ｃＤＮＡ配列分析＞
実施例１で得られたクローンをシケナーゼバージョン２．０ＤＮＡ配列分析キット（Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA）を用いてジデオキシ鎖終結法（dideoxy chain termination）に従って配列分析を行った。その結果、配列番号：１に示される７７２ｂｐからなる新規な癌原遺伝子を確認し、これを「ＫＧ−１９」と称した。全長ＫＧ−１９ ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を登録番号第ＡＦ２８３６７１号としてジーンバンク（GenBank）に登録した。
【００４０】
配列番号：１の塩基配列において、本発明の癌原遺伝子ＫＧ−１９の完全オープン・リーディング・フレーム（open reading frame）は、塩基番号１３６〜６３８に該当し、配列番号：２の１６６個のアミノ酸からなるタンパク質をコードすると予測される。
【００４１】
前記全長ＫＧ−１９ｃＤＮＡをベクターｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙ（Promega, USA）の多重クローニング部位にＤＮＡリガーゼを用いて連結してＫＧ−１９遺伝子を発現する組換えベクターを得た。この組換えベクターで大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Stratagene, USA）を形質転換して大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ／ｐＧＥＭ−Ｔ／ＫＧ−１９と命名された形質転換された大腸菌を得、これを２０００年９月１８日付で韓国生命工学研究所遺伝子銀行（住所：大韓民国大田廣域市儒城區魚隠洞５２番地）に寄託番号第ＫＣＴＣ ０８６２ＢＰ号として寄託した。
【００４２】
＜実施例３：ノーザンブロット分析＞
正常の組織と癌細胞においてＫＧ−１９遺伝子が発現されたかを確認するために、米国クロンテック社（Clontech）から、１２種類の臓器から正常のＲＮＡを抽出してナイロン膜上にブロッティングした商用の正常のヒト１２−列多重組織（図１ａおよび１ｂ）と、８種類の癌細胞からＲＮＡを抽出して膜上にブロッティングした商用のヒト癌細胞８−列多重組織（図２ａおよび２ｂ）を購入して発現の差異を比較した。
【００４３】
ブロットを、レディプライム（rediprime）II無作為プライムラベリングシステム（Amersham, England）を用いて３２Ｐ−標識された無作為−プライムＫＧ−１９と６８℃で一晩ハイブリッド化した。ノーザンブロット分析結果を同様に２回繰り返して、デンシトメトリーで定量し、同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化してｍＲＮＡ総量を確認した。
【００４４】
図１ａは、ＫＧ−１９ ｃＤＮＡプローブを用いて正常のヒト１２列多重組織（Clontech）、すなわち、脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤および末梢血液白血球組織においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。図１ｂは、同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化して得られた結果である。
【００４５】
図１ａから分かるように、２種類のＫＧ−１９ｍＲＮＡ転写物（transcript）のうち、０．８ｋｂ転写物は種々の正常組織においては発現が確認されず、ＫＧ−１９癌原遺伝子を含むスプライシング前の転写物として推定される約７．５ｋｂ転写物は正常の腎臓組織においては弱く発現されたが、他の正常組織からは発現を確認できなかった。
【００４６】
図２ａは、ＫＧ−１９ ｃＤＮＡプローブを用いてヒト癌細胞株（前骨髄球性白血病細胞株であるＨＬ−６０、子宮癌細胞株であるＨｅＬａ細胞、慢性骨髄白血球細部株であるＫ−５６２、リンパ球白血病細胞株であるＭＯＬＴ−４、バーキット（Burkitt）リンパ腫細胞株であるＲａｊｉ、大腸癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９および黒色腫皮膚癌細胞株であるＧ３６１）においてＫＧ−１９遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。図２ｂは、図２ａと同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化して得られた結果である。図２ａから分かるように、ＫＧ−１９の０．８ｋｂ転写物はバーキットリンパ腫細胞株であるＲａｊｉと前骨髄球性白血病細胞株であるＨＬ−６０においては発現が確認され、また、約７．５ｋｂ転写物は前骨髄球性白血病細胞株であるＨＬ−６０、子宮癌細胞株であるＨｅＬａ細胞、慢性骨髄白血球細部株であるＫ−５６２、リンパ球白血病細胞株であるＭＯＬＴ−４、バーキットリンパ腫細胞株であるＲａｊｉ、大腸癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９および黒色腫皮膚癌細胞株であるＧ３６１においては高水準で発現され、特に、ＭＯＬＴ−４およびＲａｊｉは種々の癌の中でも著しく高い転写水準を示した。
【００４７】
さらに、卵巣癌、乳房癌および肺癌組織とそれらの正常対応組織においてＫＧ−１９ 遺伝子が発現されたかを確認するためにノーザンブロット分析を行った。ＲＮｅａｓｙ総ＲＮＡキット（Qiagen Inc.,ドイツ）を用いて健常人の卵巣、乳房および肺組織、および卵巣癌、乳房癌および肺癌患者から得た卵巣癌、乳房癌および肺癌組織から総ＲＮＡを抽出した。各々の組織および細胞株から抽出した変性された総ＲＮＡ２０μｇずつを１％ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動した後、ナイロン膜（Boehringer-Mannheim,ドイツ）に移した。レディプライム（rediprime）II無作為プライムラベリングシステム（Amersham, England）を用いて製造された３２Ｐ−標識された無作為−プライムＫＧ−１９全体ｃＤＮＡプローブで６８℃でブロットをハイブリッド化した。ノーザンブロット分析結果を同様に２回繰り返して、デンシトメトリーで定量し、同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化してｍＲＮＡ総量を確認した。
【００４８】
図３ａは、ＫＧ−１９ ｃＤＮＡプローブを用いて正常の卵巣組織および卵巣癌組織においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。図３ｂは、同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化して得られた結果を示す。図３ａから分かるように、卵巣癌組織においては０．８ｋｂ ＫＧ−１９ ｍＲＮＡ転写物の著しい遺伝子発現が観察されたが、正常の卵巣組織においては発現程度が低かった。図３ａおよび３ｂにおいて、正常の（Ｎ）列は正常の卵巣組織を、癌の（Ｃ）列は卵巣癌組織を各々示す。
【００４９】
図４ａは、ＫＧ−１９ ｃＤＮＡプローブを用いて正常の乳房組織および乳房癌組織においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。図４ｂは、同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化して得られた結果を示す。図４ａから分かるように、乳房癌組織においては０．８ｋｂ ＫＧ−１９ ｍＲＮＡ転写物の顕著な遺伝子発現が観察されたが、正常の乳房組織においては発現程度が低かった。図４ａおよび４ｂにおいて、正常の（Ｎ）は正常の乳房組織を、癌の（Ｃ）列は乳房癌組織を各々示す。
【００５０】
図５ａは、ＫＧ−１９ ｃＤＮＡプローブを用いて正常の肺組織および肺癌組織においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。図５ｂは、同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化して得られた結果である。図５ａから分かるように、肺癌組織においては０．８ｋｂ ＫＧ−１９ ｍＲＮＡ転写物と約７．５ｋｂ ＫＧ−１９ ｍＲＮＡ転写物の顕著な発現が観察されたが、正常の肺組織においては発現程度が低かった。図５ａおよび５ｂにおいて、正常の（Ｎ）列は正常の肺組織を、癌の（Ｃ）列は肺癌組織を各々示す。
【００５１】
＜実施例４：発現ベクターおよび形質転換された動物細胞の製造＞
（段階１）ＫＧ−１９を含むベクターの製造
ＫＧ−１９のコーディング部位を含有する発現ベクターを次の通り製造した。
【００５２】
まず、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen, USA）−グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（Glutathione-S Transferase, GST）はＧＳＴ遺伝子をｐＣＤＮＡ３真核細胞発現ベクターにＢａｍＨＩとＸｂａＩ処理によって挿入することにより製作した。全体コーディング配列を有するＫＧ−１９遺伝子（配列番号：１において１２１−６７４に該当する）をＢａｍＨＩとＸｂａＩで処理した後、全長ＫＧ−１９コーディング配列を含むＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ切片をＢａｍＨＩとＸｂａＩで処理されたｐＣＤＮＡ３に挿入した。生成したｐＣＤＮＡ３／ＧＳＴ／ＫＧ−１９発現ベクターをリポフェクタミン（Gibco BRL）を用いて２９３ヒト胎生期腎臓上皮細胞（ATCC CRL 1573）内に形質導入し、Ｇ４１８（Gibco）を含むＤＭＥＭ（Gibco, USA）培地で選別した。ＫＧ−１９遺伝子でトランスフェクトされた２９３細胞を「ＫＧ−１９細胞」と称した。
【００５３】
（段階２）ＫＧ−１９癌原遺伝子でトランスフェクトされた２９３ヒト胎生期腎臓上皮細胞
正常の野生型２９３細胞および段階１で得られたＫＧ−１９を発現する２９３細胞（ＫＧ−１９細胞）を１０％血清を含むＤＭＥＭ培地で単層培養した後、その成長様相を位相差顕微鏡（Phase contrast microscopy, Olympus, USA）で観察した。図６ａおよび６ｂは、単層培養された野生型２９３ヒト胎児腎臓細胞と多層培養されたＫＧ−１９でトランスフェクトされた２９３ヒト胎児腎臓細胞を位相差顕微鏡で観察した結果である。図６ａに示すように、分化された上皮細胞である野生型２９３細胞は、長くて細い核と貧弱な細胞質を有する紡錘形細胞である。ＫＧ−１９細胞の場合、細胞の形態は、図６ｂに示すように、卵形の核および多量の細胞質を有する多角形模様に変化する。
【００５４】
単層培養したＫＧ−１９細胞をヘマトキシリン−エオシン（hematoxylin-eosin, H & E）で染色した後観察した結果、核の多形成、明らかな核小体、および顆粒状染色質所見および腫瘍巨大細胞、並びに非定型類似分裂が観察された（図７参照）。
【００５５】
＜実施例５：動物におけるＫＧ−１９癌原遺伝子の腫瘍形成能＞
腫瘍形成能を分析するために、５×１０６ ＫＧ−１９細胞を９匹のヌードマウス（５週齢、ＢＡＬＢ／ｃ由来胸腺のないヌードマウス（athymic nu/nu on BALB/c background)）の背部に皮下注射した。ＫＧ−１９が注射されたすべてのマウスにおいて１４日経過後から触診できる（palpable）腫瘍を示し、腫瘍のサイズが３０日以内に２．０ｃｍ×２．０ｃｍになった（図８参照）。
【００５６】
＜実施例６：ＫＧ−１９癌原遺伝子を大腸菌にトランスフェクトした後発現されるタンパク質サイズの決定＞
配列番号：１のヌクレオチド番号１３８〜６３８に該当し、配列番号：２のアミノ酸番号１〜１６６をコードすると予測されるＫＧ−１９癌原遺伝子のコーディング領域全体をＧＳＴ遺伝子が融合されたｐＧＥＸ ４Ｔ−３ベクター（Amersham Pharmacia Biotech., 米国）の多重クローニング部位のＢａｍＨＩとＮｏｔＩ部位に挿入してｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＫＧ−１９ベクターを製造した後、これを大腸菌ＢＬ２１（ATCC 47092）にトランスフェクトした。トランスフェクトされた大腸菌をＬＢブロース培地で３７℃で１６時間振盪培養した後、培養液を１／１００に稀釈し、さらに３時間培養した。これに、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Isopropyl beta-D-thiogalacto-pyranoside, IPTG, Sigma）を加えてタンパク質生産を誘導した。
【００５７】
ＩＰＴＧ誘導前と誘導後に培養液試料を取って大腸菌細胞を超音波粉砕した後、１２％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。図９は、ｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＫＧ−１９ベクターでトランスフェクトされた大腸菌ＢＬ２１菌株のタンパク質の発現様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。ＩＰＴＧ誘導後、約４５ｋＤａのタンパク質バンドが明らかに観察された。この４５ｋＤａ融合タンパク質はｐＧＥＸ ４Ｔ−３ベクターの遺伝子から発現された約２６ｋＤａサイズのＧＳＴタンパク質を含有していた。
【００５８】
本発明を具体的な実施態様と関連させて記述したが、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形および変化させ得ると理解されなければならない。
【００５９】
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 図１ａは、正常のヒト１２列多重組織（脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺および末梢血液白血球）においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。
【図１ｂ】 図１ｂは、図１ａと同じサンプルをβ−アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図２ａ】 図２ａは、ヒト癌細胞株（前骨髄球性白血病細胞株であるＨＬ−６０、子宮癌細胞株であるＨｅＬａ細胞、慢性骨髄白血球細部株であるＫ−５６２、リンパ球白血病細胞株であるＭＯＬＴ−４、バーキット（Burkitt）リンパ腫細胞株であるＲａｊｉ、大腸癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９および黒色腫皮膚癌細胞株であるＧ３６１）においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。
【図２ｂ】 図２ｂは、図２ａと同じサンプルをβ−アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図３ａ】 図３ａは、卵巣癌組織においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。
【図３ｂ】 図３ｂは、図３ａと同じサンプルをβ−アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図４ａ】 図４ａは、乳房癌組織においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。
【図４ｂ】 図４ｂは、図４ａと同じサンプルをβ−アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図５ａ】 図５ａは、肺癌組織においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。
【図５ｂ】 図５ｂは、図５ａと同じサンプルをβ−アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図６ａ】 図６ａは、単層培養された野生型２９３ヒト胎生期腎臓細胞を位相差顕微鏡で観察した結果である。
【図６ｂ】 図６ｂは、単層培養されたＫＧ−１９癌原遺伝子でトランスフェクトされた２９３ヒト胎生期腎臓細胞を位相差顕微鏡で観察した結果である。
【図７】 図７は、単層培養されたＫＧ−１９癌原遺伝子でトランスフェクトされた２９３ヒト胎生期腎臓細胞をヘマトキシリン−エオシンで染色した結果である。
【図８】 図８は、ヌードマウスにおけるＫＧ−１９癌原遺伝子の腫瘍形成能を示す。
【図９】 図９は、ＫＧ−１９癌原遺伝子を大腸菌でトランスフェクトされた２９３ヒト胎生期腎臓細胞において、ＩＰＴＧ誘導前および誘導後に発現されるタンパク質発現パターンを示すドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）で電気泳動を行った結果である。
【発明の分野】
本発明は、新規な癌原遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質に関するものであって、これらは、種々の癌の診断、形質転換動物の製造およびアンチセンス遺伝子の治療および抗癌剤の開発などに効果的に利用できる。
【０００２】
【発明の背景】
ヒトを含む高等動物は、約１００，０００個の遺伝子を有しているが、これらのうち約１５％のみが発現され、発生、分化、恒常性（homeostasis）、刺激に対する反応、細胞分裂周期の調節、老化およびアポトーシス（apoptosis; programmed cell death）などのような個人の生物学的過程の特性はどの遺伝子が発現するかによって決定される（Liang, P. and A. B. Pardee, Science, 257: 967-971(1992)参照）。
【０００３】
腫瘍形成のような病理学的現象は、遺伝子突然変異によって誘発され、遺伝子発現の変化をもたらす。したがって、種々の細胞における遺伝子発現の比較研究は多様な生物学的現象を理解する上で基本的で効果的な接近方法であるといえる。
【０００４】
腫瘍形成は、特定染色体部位の消失、癌原遺伝子の活性化およびｐ５３遺伝子を含む他の腫瘍抑制遺伝子の失活などのような種々の遺伝的変化によって誘発されると報告されている（Bishop, J. M., Cell, 64: 235-248(1991)；およびHunter, T., Cell, 64: 249-270(1991)参照））。さらに、ヒト癌の１０〜３０％は癌原遺伝子の増幅を通じて発癌遺伝子が活性化されることによって発病すると報告されている。
【０００５】
したがって、癌原遺伝子の活性化は多くの癌の病因学研究に重要な役割を果し、これを明らかにすることが要求されている。
【０００６】
そこで、本発明者は、子宮頸部癌の腫瘍形成に介入された機構を調査するために鋭意研究した結果、ヒト子宮頸部癌１（ＨＣＣＲ−１）（韓国特許出願第２０００−１６７５７号；２０００．３．３１）およびヒト子宮頸部癌２（ＨＣＣＲ−２）（韓国特許出願第２０００−７１２０２号；２０００．１１．２８）と命名された新規な癌原遺伝子が癌細胞中に特異に過発現されるという意外な事実を発見した。癌原遺伝子は、構造的な変異を通じて該当するタンパク質産物の質的、そして量的な発現の変化を引起こす（Weinberg, R. A., Cancer Research, 49: 3713-3721, 1989）。癌タンパク質は、細胞表面、細胞質または核において信号伝達経路（signal transduction pathway）を破壊するが、腫瘍抑制遺伝子産物がない場合、他の種類の癌タンパク質とともに細胞の増殖を促進し、細胞周期（cell cycle）を撹乱し、また、細胞死滅（アポトーシス）機構を取り崩す（Todd, R., Anticancer Research, 19: 4729-4746, 2000）。
【０００７】
このようなタンパク質とタンパク質の相互作用を糾明する酵母２ハイブリッド（Yeast two-hybrid）法は、1989年に考案されて以来（Fields, S. and Song, O., Nature, 340: 245-246 , 1989）、細胞死滅機構(Wallach, D. et al., Curr Opin Immuno l, 10: 131-136, 1998)と種々の遺伝体系を用いて生命現象を明らかにするのに利用されている(Pandey, A. and Mann, M., Natu re, 405: 837-846, 2000)。
【０００８】
本発明者は、酵母２ハイブリッド法を用いてＨＣＣＲ−１癌原遺伝子−由来タンパク質産物に対する新規結合タンパク質を開発するために鋭意研究した結果、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子だけでなくＨＣＣＲ−２に各々特異的に結合する新しいヒト癌原遺伝子ＫＧ−１９を明らかにした。前記癌原遺伝子ＫＧ−１９は、白血病、リンパ腫、大腸癌、乳房癌、腎臓癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、および子宮癌などのような様々な癌の診断、予防および治療に効果的に使用し得る。
【０００９】
【発明の要約】
したがって、本発明の目的は、新規な癌原遺伝子およびその断片を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記癌原遺伝子またはその断片を含む組換えベクターおよびそれによって形質転換された微生物；
前記癌原遺伝子によってコードされるタンパク質およびその断片；
前記癌原遺伝子またはその断片を含む癌診断用キット；
前記タンパク質またはその断片を含む癌診断用キット；
前記癌原遺伝子またはその断片から誘導されるｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有するアンチセンス遺伝子；
前記アンチセンス遺伝子を用いて癌を治療または予防する方法；および
前記癌原遺伝子またはその断片を用いて抗癌剤候補物質をスクリーニングする方法；を提供することである。
【００１１】
本発明の一実施態様によって、配列番号：１のヌクレオチド配列を有する新規な癌原遺伝子またはその断片が提供される。
本発明の他の実施態様によって、前記癌原遺伝子またはその断片を含む組換えベクターおよび該ベクターによって形質転換された微生物が提供される。
本発明のまた他の実施態様によって、前記癌原遺伝子またはその断片から誘導された配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片が提供される。
【００１２】
【発明の詳細な記述】
本発明の新規癌原遺伝子（protooncogene）はＫＧ−１９と命名されたものであって、７７２塩基対（ｂｐ）からなり、配列番号：１のＤＮＡ配列を有する。
【００１３】
特に、本発明のＫＧ−１９癌原遺伝子は、本出願人によって出願された韓国特許出願第２０００−１６７５７号に記載されたヒト子宮頸部癌１癌原遺伝子（human cervical cancer proto-oncogene 1、以下「ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子」と称する）および韓国特許出願第２０００−７１２０２号に記載されたＨＣＣＲ−２と特異的に結合する性質を有する。
【００１４】
配列番号：１の塩基配列において、塩基番号１３８〜６３８部位に該当するオープン・リーディング・フレーム（Open reading frame;ORF）は、全長タンパク質コーディング領域であり、それから誘導されるアミノ酸は配列番号：２に示される１６６個のアミノ酸からなっている（「ＫＧ−１９タンパク質」）。しかし、コドンの縮退性（degeneracy）および本発明の癌原遺伝子を発現させようとする特定生物において選好されるコドンを考慮するとき、配列番号：１のＤＮＡ配列の多様な変化および変形は、発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変えない範囲内のコーディング領域または癌原遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内の非−コーディング領域で行われることができる。したがって、本発明の癌原遺伝子と実質的に同様な塩基配列を有するポリヌクレオチドおよびその断片もまた本発明の範疇に含まれる。本願に用いられる「実質的に同様なポリヌクレオチド」とは、本発明の癌原遺伝子と塩基配列が８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００１５】
本発明の癌原遺伝子から発現されるタンパク質は、１６６個のアミノ酸からなり、配列番号：２のアミノ酸配列を有し、このタンパク質の分子量は約１９ｋｄである。しかし、タンパク質のアミノ酸残基の置換、付加および／または欠失をタンパク質の機能に影響を及ぼさない範囲内で行うことができる。また、目的に応じてタンパク質の一部のみが使用され得る。このような変形されたアミノ酸およびその断片もまた本発明の範囲に含まれる。したがって、本発明の範疇には、本発明の発癌遺伝子から誘導されたタンパク質と実質的に同様なアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその断片が含まれる。本願に用いられる「実質的に同様なポリペプチド」とは、配列番号：２のアミノ酸配列とアミノ酸配列が８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するポリペプチドを意味する。
【００１６】
本発明の癌原遺伝子またはタンパク質は、ヒト癌組織から得られるか、通常のＤＮＡまたはペプチド合成方法に従って合成することができる。また、このように製造された遺伝子を通常のベクターに挿入して発現ベクターを製造した後、これを適切な宿主、たとえば、大腸菌または酵母のような微生物、或はマウスのような動物細胞、またはヒト細胞に導入し得る。本願では、ＨＣＣＲ−１癌原遺伝子またはその断片を含有するベクターで形質転換された細胞を「ＫＧ−１９細胞」と称する。
【００１７】
形質転換された宿主を用いて本発明のＤＮＡまたはタンパク質を大量生産することができる。たとえば、ＫＧ−１９癌原遺伝子を含むｐＧＥＭ−Ｔ発現ベクター（Promega、米国）で大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換して得られた大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ／ｐＧＥＭ−Ｔ／ＫＧ−１９を、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定により、２０００年９月１８日付で韓国生命工学研究所遺伝子銀行（Korean Collection for Type Cultures (KCTC)；住所：大韓民国大田廣域市儒城區魚隠洞５２番地韓国生命工学研究所（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB)）に寄託番号第ＫＣＴＣ ０８６２ＢＰ号として寄託した。
【００１８】
ベクター製作の際には、プロモーター、ターミネーターのような発現調節配列、自家複製配列および分泌シグナルを宿主細胞の種類によって適宜選択し、結合することができる。
【００１９】
本発明の癌原遺伝子の過発現は、正常のヒト組織、たとえば、脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺および末梢血液においては起こらないが、白血病、リンパ腫、乳房癌、腎臓癌、卵巣癌、肺癌および胃腸癌、皮膚癌細胞株においては過発現が起こる。これから、本発明の癌原遺伝子は前述の癌を誘発させることが分かる。また、正常の２９３ヒト胎生期腎臓細胞（human embryonic kidney;HEK）が本発明の癌原遺伝子でトランスフェクトされると非正常細胞が生成する。光学顕微鏡と電子顕微鏡で観察した形態学的特定技術は非正常細胞が腫瘍細胞の形態を有することを示す。すなわち、ヘマトキシリン−エオシン染色法を用いて腫瘍細胞が癌にかかったことを確認できる。
【００２０】
また、本発明の癌原遺伝子でトランスフェクトされた正常２９３ＨＥＫ細胞をヌードマウスの背部に注射する場合、注射してから約１４日後に腫瘍形成が観察され、約３０日目には２．０ｃｍ×２．０ｃｍ大きさの腫瘍が観察される。
【００２１】
したがって、本発明の癌原遺伝子は種々の癌の発生に共通した因子であると判断され、種々の癌の診断および形質転換された動物の製造およびアンチセンス遺伝子の治療および抗癌剤薬物の開発に効果的に利用することができる。
【００２２】
本発明の癌原遺伝子を用いた診断方法は、たとえば、本発明の癌原遺伝子またはその断片を含有するプローブを用いて対象者の体液から分離した核酸をハイブリッド化する段階および当分野で公知の検出方法を用いてその物質が癌原遺伝子を有しているかを判断する段階を含む。前記プローブを放射線同位元素または酵素で標識することによって、癌原遺伝子の存在を容易に確認することができる。したがって、本発明の癌原遺伝子またはその断片を含む癌診断用キットもまた本発明の範疇に含まれる。
【００２３】
形質転換動物は、本発明の癌原遺伝子を哺乳動物、たとえば、ラットに導入することによって製造でき、これもまた本発明の範疇に含まれる。形質転換動物の製造に当たっては、本発明の癌原遺伝子を８細胞期以前の動物受精卵段階に導入することが好ましい。このように形質転換された動物は、発癌性物質、または抗酸化剤のような抗癌性物質の探索などに有用である。
【００２４】
また、本発明は、遺伝子治療に効果的なアンチ−センス遺伝子を提供する。本願において、「アンチセンス遺伝子（anti-sense gene）」とは、配列番号：１の塩基配列を有する癌原遺伝子またはその断片から転写されるｍＲＮＡ配列の全部または一部と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを意味し、前記ヌクレオチドはｍＲＮＡのタンパク質結合部位に結合することによって癌原遺伝子のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の発現を防止することができる。
【００２５】
本発明はまた、その範囲内に本発明のアンチセンス遺伝子の治療学的有効量を患者に投与することによって癌を治療または予防する方法を含む。
【００２６】
本発明のアンチセンス遺伝子の治療に当たっては、本発明のアンチセンス遺伝子は癌原遺伝子の発現を予防するために通常の方法で患者に投与される。たとえば、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を文献［J.S. Kim et al. J. Controlled Release, 53, 175-182(1998)］に開示された方法に従って、ポリ−Ｌ−リジン誘導体と静電気的引力によって混合し、この混合したアンチセンスＯＤＮを患者に静脈投与する。
【００２７】
本発明の範囲にはまた、薬剤学的に許容可能な担体、賦形剤または必要に応じて他の添加剤とともに本発明のアンチセンス遺伝子を活性成分として含む抗癌組成物が含まれる。本発明の薬剤学的組成物は注射剤に製剤化することが好ましい。
【００２８】
実際に投与されるアンチセンス遺伝子の量は治療する症状、選択された投与経路、患者の年齢および体重、症状の重症度を含む種々の関連因子を考慮して決定されなければならない。
【００２９】
本発明の癌原遺伝子から発現されるタンパク質は、診断道具として抗体を生産するのに有用である。本発明の抗体は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片を用いて当分野で公知の通常の方法に従ってモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の形態に製造できる。このような抗体を用いて当分野で公知の任意の方法、たとえば、酵素免疫測定法（enzyme linked immunosorbentassay(ELISA)）、放射線免疫測定法（radioimmunoassay(RIA)）、サンドイッチ分析法（sandwich assay）、免疫組織化学染色法、ポリアクリルゲル上ウエスタンブロットまたは免疫ブロット方法によって対象者の体液に当該タンパク質が発現されたかを確認することによって癌を診断することができる。したがって、本発明の範疇には、配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片を含む発癌診断キットが含まれる。
【００３０】
本発明の癌原遺伝子を用いて持続的に増殖し得る癌細胞株を確立することができ、このような細胞株は、たとえば、本発明の癌原遺伝子で形質転換された繊維芽細胞をヌードマウスに注射することによって背部に形成された腫瘍組織から得られる。このように製造された細胞株は、抗癌剤の探索に効果的に利用することができる。
【００３１】
また、本発明の範疇には、前記癌原遺伝子またはその断片を用いて抗癌剤候補物質をスクリーニングする方法が含まれる。
【００３２】
腫瘍形成において、本発明の癌原遺伝子およびそのタンパク質の特徴を糾明した後、これは前記遺伝子をターゲットとするアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドまたは前記タンパク質をターゲットとする抗体を投与することにより、前記遺伝子またはタンパク質を抑制するのに利用できる。このように糾明された本発明の癌原遺伝子の特徴を用いて、公知の癌原遺伝子と結合する関連分子を発見し、これから関連分子を分解できる抑制剤、すなわち、抗癌剤候補物質を考案できる。
【００３３】
下記の実施例および試験例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【００３４】
＜実施例１：酵母２ハイブリッド＞
ヒト癌原遺伝子であるＨＣＣＲ−１遺伝子（Genebank accession no.: AF195651）のタンパク質産物と結合するタンパク質を発見するために、マッチメーカーＬｅｘＡ２ハイブリッドシステム（MATCHMAKER LexA Two-Hybrid System; Clontech. Laboratories, Inc., USA）を用いて従来報告されている方法（Golemis, E. A., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. Chapters 20.0 and 20.1, 1996）に従って実験を行った。
【００３５】
次の実験に用いられた細胞株とベクターはクロンテック（Clontech）社のカタログ＃Ｋ１６０９−１キットに記載されているものである。
【００３６】
酵母菌株であるＥＧＹ４８にｐ８ｏｐ−ｌａｃＺベクターを導入して形質転換（transformation）した後、ウラシル（Uracil）のない合成ドロップアウト（dropout）培地であるＳＤ／−ウラシル／グルコースプレートで培養した。前記プレートで成長したコロニー（colony）を選別してＳＤ／−ウラシル／グルコース培地（media）で培養した後、ＨＣＣＲ−１遺伝子をｐＬｅｘＡベクターのＢａｍＨＩとＳａｌＩ部位に挿入して製造したベクターをバイトプラスミド（bait plasmid）としてこの酵母菌株で形質転換した。
【００３７】
ＰＬｅｘＡベクターにクローニングされたＨＣＣＲ−１遺伝子が発現されるかを確認するために、ＬｅｘＡ抗体を用いてウェスタンブロット（western blotting）を行った。その結果、６４〜６５ｋＤａでバンドが得られた。
【００３８】
ＨＣＣＲ−１遺伝子を発現するコロニーをＳＤ／−ウラシル、−ヒスチジン／グルコース培地で培養した後、ヒト胎児脳（fetal brain）由来ＡＤ融合ライブラリーであるｐＢＤ４２ＡＤベクターでさらに形質転換した。バイトとライブラリーが結合することを確認するために、コロニーリフト分析法（colony lifting assay; Breeden, L. & Nasmyth, K., Cold Spring Harbor Symposium Quant. Bio., 50: 643-650, 1985）を行った。バイトとライブラリーが結合すると、Ｘ−ｇａｌの入っているプレートで青色コロニーが形成する。酵母を培養した後、ガラスビーズ（glass bead）を用いてＤＮＡを抽出し、大腸菌（E. coli）ＫＣ８を電気穿孔法（electroporation）で形質転換した後、Ｍ９最少培地に展開して形質転換体を選別した。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、これで大腸菌ＤＨ５αをさらに形質転換した後、大腸菌形質転換体からＤＮＡを抽出してＨｉｎｄIIIを処理して約０．８ｋｂ ＤＮＡを有するクローンを得た。
【００３９】
＜実施例２：ＫＧ−１９癌原遺伝子の全体ｃＤＮＡ配列分析＞
実施例１で得られたクローンをシケナーゼバージョン２．０ＤＮＡ配列分析キット（Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA）を用いてジデオキシ鎖終結法（dideoxy chain termination）に従って配列分析を行った。その結果、配列番号：１に示される７７２ｂｐからなる新規な癌原遺伝子を確認し、これを「ＫＧ−１９」と称した。全長ＫＧ−１９ ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を登録番号第ＡＦ２８３６７１号としてジーンバンク（GenBank）に登録した。
【００４０】
配列番号：１の塩基配列において、本発明の癌原遺伝子ＫＧ−１９の完全オープン・リーディング・フレーム（open reading frame）は、塩基番号１３６〜６３８に該当し、配列番号：２の１６６個のアミノ酸からなるタンパク質をコードすると予測される。
【００４１】
前記全長ＫＧ−１９ｃＤＮＡをベクターｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙ（Promega, USA）の多重クローニング部位にＤＮＡリガーゼを用いて連結してＫＧ−１９遺伝子を発現する組換えベクターを得た。この組換えベクターで大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ（Stratagene, USA）を形質転換して大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ／ｐＧＥＭ−Ｔ／ＫＧ−１９と命名された形質転換された大腸菌を得、これを２０００年９月１８日付で韓国生命工学研究所遺伝子銀行（住所：大韓民国大田廣域市儒城區魚隠洞５２番地）に寄託番号第ＫＣＴＣ ０８６２ＢＰ号として寄託した。
【００４２】
＜実施例３：ノーザンブロット分析＞
正常の組織と癌細胞においてＫＧ−１９遺伝子が発現されたかを確認するために、米国クロンテック社（Clontech）から、１２種類の臓器から正常のＲＮＡを抽出してナイロン膜上にブロッティングした商用の正常のヒト１２−列多重組織（図１ａおよび１ｂ）と、８種類の癌細胞からＲＮＡを抽出して膜上にブロッティングした商用のヒト癌細胞８−列多重組織（図２ａおよび２ｂ）を購入して発現の差異を比較した。
【００４３】
ブロットを、レディプライム（rediprime）II無作為プライムラベリングシステム（Amersham, England）を用いて３２Ｐ−標識された無作為−プライムＫＧ−１９と６８℃で一晩ハイブリッド化した。ノーザンブロット分析結果を同様に２回繰り返して、デンシトメトリーで定量し、同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化してｍＲＮＡ総量を確認した。
【００４４】
図１ａは、ＫＧ−１９ ｃＤＮＡプローブを用いて正常のヒト１２列多重組織（Clontech）、すなわち、脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤および末梢血液白血球組織においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。図１ｂは、同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化して得られた結果である。
【００４５】
図１ａから分かるように、２種類のＫＧ−１９ｍＲＮＡ転写物（transcript）のうち、０．８ｋｂ転写物は種々の正常組織においては発現が確認されず、ＫＧ−１９癌原遺伝子を含むスプライシング前の転写物として推定される約７．５ｋｂ転写物は正常の腎臓組織においては弱く発現されたが、他の正常組織からは発現を確認できなかった。
【００４６】
図２ａは、ＫＧ−１９ ｃＤＮＡプローブを用いてヒト癌細胞株（前骨髄球性白血病細胞株であるＨＬ−６０、子宮癌細胞株であるＨｅＬａ細胞、慢性骨髄白血球細部株であるＫ−５６２、リンパ球白血病細胞株であるＭＯＬＴ−４、バーキット（Burkitt）リンパ腫細胞株であるＲａｊｉ、大腸癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９および黒色腫皮膚癌細胞株であるＧ３６１）においてＫＧ−１９遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。図２ｂは、図２ａと同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化して得られた結果である。図２ａから分かるように、ＫＧ−１９の０．８ｋｂ転写物はバーキットリンパ腫細胞株であるＲａｊｉと前骨髄球性白血病細胞株であるＨＬ−６０においては発現が確認され、また、約７．５ｋｂ転写物は前骨髄球性白血病細胞株であるＨＬ−６０、子宮癌細胞株であるＨｅＬａ細胞、慢性骨髄白血球細部株であるＫ−５６２、リンパ球白血病細胞株であるＭＯＬＴ−４、バーキットリンパ腫細胞株であるＲａｊｉ、大腸癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９および黒色腫皮膚癌細胞株であるＧ３６１においては高水準で発現され、特に、ＭＯＬＴ−４およびＲａｊｉは種々の癌の中でも著しく高い転写水準を示した。
【００４７】
さらに、卵巣癌、乳房癌および肺癌組織とそれらの正常対応組織においてＫＧ−１９ 遺伝子が発現されたかを確認するためにノーザンブロット分析を行った。ＲＮｅａｓｙ総ＲＮＡキット（Qiagen Inc.,ドイツ）を用いて健常人の卵巣、乳房および肺組織、および卵巣癌、乳房癌および肺癌患者から得た卵巣癌、乳房癌および肺癌組織から総ＲＮＡを抽出した。各々の組織および細胞株から抽出した変性された総ＲＮＡ２０μｇずつを１％ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動した後、ナイロン膜（Boehringer-Mannheim,ドイツ）に移した。レディプライム（rediprime）II無作為プライムラベリングシステム（Amersham, England）を用いて製造された３２Ｐ−標識された無作為−プライムＫＧ−１９全体ｃＤＮＡプローブで６８℃でブロットをハイブリッド化した。ノーザンブロット分析結果を同様に２回繰り返して、デンシトメトリーで定量し、同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化してｍＲＮＡ総量を確認した。
【００４８】
図３ａは、ＫＧ−１９ ｃＤＮＡプローブを用いて正常の卵巣組織および卵巣癌組織においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。図３ｂは、同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化して得られた結果を示す。図３ａから分かるように、卵巣癌組織においては０．８ｋｂ ＫＧ−１９ ｍＲＮＡ転写物の著しい遺伝子発現が観察されたが、正常の卵巣組織においては発現程度が低かった。図３ａおよび３ｂにおいて、正常の（Ｎ）列は正常の卵巣組織を、癌の（Ｃ）列は卵巣癌組織を各々示す。
【００４９】
図４ａは、ＫＧ−１９ ｃＤＮＡプローブを用いて正常の乳房組織および乳房癌組織においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。図４ｂは、同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化して得られた結果を示す。図４ａから分かるように、乳房癌組織においては０．８ｋｂ ＫＧ−１９ ｍＲＮＡ転写物の顕著な遺伝子発現が観察されたが、正常の乳房組織においては発現程度が低かった。図４ａおよび４ｂにおいて、正常の（Ｎ）は正常の乳房組織を、癌の（Ｃ）列は乳房癌組織を各々示す。
【００５０】
図５ａは、ＫＧ−１９ ｃＤＮＡプローブを用いて正常の肺組織および肺癌組織においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。図５ｂは、同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化して得られた結果である。図５ａから分かるように、肺癌組織においては０．８ｋｂ ＫＧ−１９ ｍＲＮＡ転写物と約７．５ｋｂ ＫＧ−１９ ｍＲＮＡ転写物の顕著な発現が観察されたが、正常の肺組織においては発現程度が低かった。図５ａおよび５ｂにおいて、正常の（Ｎ）列は正常の肺組織を、癌の（Ｃ）列は肺癌組織を各々示す。
【００５１】
＜実施例４：発現ベクターおよび形質転換された動物細胞の製造＞
（段階１）ＫＧ−１９を含むベクターの製造
ＫＧ−１９のコーディング部位を含有する発現ベクターを次の通り製造した。
【００５２】
まず、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen, USA）−グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（Glutathione-S Transferase, GST）はＧＳＴ遺伝子をｐＣＤＮＡ３真核細胞発現ベクターにＢａｍＨＩとＸｂａＩ処理によって挿入することにより製作した。全体コーディング配列を有するＫＧ−１９遺伝子（配列番号：１において１２１−６７４に該当する）をＢａｍＨＩとＸｂａＩで処理した後、全長ＫＧ−１９コーディング配列を含むＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ切片をＢａｍＨＩとＸｂａＩで処理されたｐＣＤＮＡ３に挿入した。生成したｐＣＤＮＡ３／ＧＳＴ／ＫＧ−１９発現ベクターをリポフェクタミン（Gibco BRL）を用いて２９３ヒト胎生期腎臓上皮細胞（ATCC CRL 1573）内に形質導入し、Ｇ４１８（Gibco）を含むＤＭＥＭ（Gibco, USA）培地で選別した。ＫＧ−１９遺伝子でトランスフェクトされた２９３細胞を「ＫＧ−１９細胞」と称した。
【００５３】
（段階２）ＫＧ−１９癌原遺伝子でトランスフェクトされた２９３ヒト胎生期腎臓上皮細胞
正常の野生型２９３細胞および段階１で得られたＫＧ−１９を発現する２９３細胞（ＫＧ−１９細胞）を１０％血清を含むＤＭＥＭ培地で単層培養した後、その成長様相を位相差顕微鏡（Phase contrast microscopy, Olympus, USA）で観察した。図６ａおよび６ｂは、単層培養された野生型２９３ヒト胎児腎臓細胞と多層培養されたＫＧ−１９でトランスフェクトされた２９３ヒト胎児腎臓細胞を位相差顕微鏡で観察した結果である。図６ａに示すように、分化された上皮細胞である野生型２９３細胞は、長くて細い核と貧弱な細胞質を有する紡錘形細胞である。ＫＧ−１９細胞の場合、細胞の形態は、図６ｂに示すように、卵形の核および多量の細胞質を有する多角形模様に変化する。
【００５４】
単層培養したＫＧ−１９細胞をヘマトキシリン−エオシン（hematoxylin-eosin, H & E）で染色した後観察した結果、核の多形成、明らかな核小体、および顆粒状染色質所見および腫瘍巨大細胞、並びに非定型類似分裂が観察された（図７参照）。
【００５５】
＜実施例５：動物におけるＫＧ−１９癌原遺伝子の腫瘍形成能＞
腫瘍形成能を分析するために、５×１０６ ＫＧ−１９細胞を９匹のヌードマウス（５週齢、ＢＡＬＢ／ｃ由来胸腺のないヌードマウス（athymic nu/nu on BALB/c background)）の背部に皮下注射した。ＫＧ−１９が注射されたすべてのマウスにおいて１４日経過後から触診できる（palpable）腫瘍を示し、腫瘍のサイズが３０日以内に２．０ｃｍ×２．０ｃｍになった（図８参照）。
【００５６】
＜実施例６：ＫＧ−１９癌原遺伝子を大腸菌にトランスフェクトした後発現されるタンパク質サイズの決定＞
配列番号：１のヌクレオチド番号１３８〜６３８に該当し、配列番号：２のアミノ酸番号１〜１６６をコードすると予測されるＫＧ−１９癌原遺伝子のコーディング領域全体をＧＳＴ遺伝子が融合されたｐＧＥＸ ４Ｔ−３ベクター（Amersham Pharmacia Biotech., 米国）の多重クローニング部位のＢａｍＨＩとＮｏｔＩ部位に挿入してｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＫＧ−１９ベクターを製造した後、これを大腸菌ＢＬ２１（ATCC 47092）にトランスフェクトした。トランスフェクトされた大腸菌をＬＢブロース培地で３７℃で１６時間振盪培養した後、培養液を１／１００に稀釈し、さらに３時間培養した。これに、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Isopropyl beta-D-thiogalacto-pyranoside, IPTG, Sigma）を加えてタンパク質生産を誘導した。
【００５７】
ＩＰＴＧ誘導前と誘導後に培養液試料を取って大腸菌細胞を超音波粉砕した後、１２％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。図９は、ｐＧＥＸ ４Ｔ−３／ＫＧ−１９ベクターでトランスフェクトされた大腸菌ＢＬ２１菌株のタンパク質の発現様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。ＩＰＴＧ誘導後、約４５ｋＤａのタンパク質バンドが明らかに観察された。この４５ｋＤａ融合タンパク質はｐＧＥＸ ４Ｔ−３ベクターの遺伝子から発現された約２６ｋＤａサイズのＧＳＴタンパク質を含有していた。
【００５８】
本発明を具体的な実施態様と関連させて記述したが、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形および変化させ得ると理解されなければならない。
【００５９】
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 図１ａは、正常のヒト１２列多重組織（脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺および末梢血液白血球）においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。
【図１ｂ】 図１ｂは、図１ａと同じサンプルをβ−アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図２ａ】 図２ａは、ヒト癌細胞株（前骨髄球性白血病細胞株であるＨＬ−６０、子宮癌細胞株であるＨｅＬａ細胞、慢性骨髄白血球細部株であるＫ−５６２、リンパ球白血病細胞株であるＭＯＬＴ−４、バーキット（Burkitt）リンパ腫細胞株であるＲａｊｉ、大腸癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９および黒色腫皮膚癌細胞株であるＧ３６１）においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。
【図２ｂ】 図２ｂは、図２ａと同じサンプルをβ−アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図３ａ】 図３ａは、卵巣癌組織においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。
【図３ｂ】 図３ｂは、図３ａと同じサンプルをβ−アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図４ａ】 図４ａは、乳房癌組織においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。
【図４ｂ】 図４ｂは、図４ａと同じサンプルをβ−アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図５ａ】 図５ａは、肺癌組織においてＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。
【図５ｂ】 図５ｂは、図５ａと同じサンプルをβ−アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図６ａ】 図６ａは、単層培養された野生型２９３ヒト胎生期腎臓細胞を位相差顕微鏡で観察した結果である。
【図６ｂ】 図６ｂは、単層培養されたＫＧ−１９癌原遺伝子でトランスフェクトされた２９３ヒト胎生期腎臓細胞を位相差顕微鏡で観察した結果である。
【図７】 図７は、単層培養されたＫＧ−１９癌原遺伝子でトランスフェクトされた２９３ヒト胎生期腎臓細胞をヘマトキシリン−エオシンで染色した結果である。
【図８】 図８は、ヌードマウスにおけるＫＧ−１９癌原遺伝子の腫瘍形成能を示す。
【図９】 図９は、ＫＧ−１９癌原遺伝子を大腸菌でトランスフェクトされた２９３ヒト胎生期腎臓細胞において、ＩＰＴＧ誘導前および誘導後に発現されるタンパク質発現パターンを示すドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）で電気泳動を行った結果である。
Claims (8)
- 配列番号：１の塩基配列から成るヒトＫＧ−１９癌原遺伝子。
- 配列番号：１の塩基番号１３８〜６３８に該当する塩基配列から成る、請求項１記載のヒトＫＧ−１９癌原遺伝子。
- 配列番号：２のアミノ酸配列から成るタンパク質。
- 請求項１の癌原遺伝子を含むベクター。
- 請求項４のベクターで形質転換された微生物。
- 大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ／ｐＧＥＭ−Ｔ／ＫＧ−１９（寄託番号：ＫＣＴＣ ０８６２ＢＰ）である請求項５に記載の微生物。
- 請求項５または６の微生物を培養して配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質を製造する方法。
- 請求項１または２の癌原遺伝子を含む癌診断用キット。
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