WO2003103719A2 - Verfahren zur auslösung von apoptose in zellen durch erhöhung des c1d-spiegels und hemmung des abbaus von c1d - Google Patents

Verfahren zur auslösung von apoptose in zellen durch erhöhung des c1d-spiegels und hemmung des abbaus von c1d Download PDF

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WO2003103719A2
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing apoptosis in a cell, preferably a tumor cell, which is characterized in that the concentration of CID in the cell is increased above a critical threshold value and in addition the breakdown of CID is inhibited.
  • Apoptosis is programmed cell death. This is subject to precise regulation, whereby apoptosis can be induced or inhibited. Apoptosis can be induced, for example, via a number of so-called death receptors, ie receptors which contain a "death domain" (DD), such as CD95, TNF-RI, DR3, DR4 or DR5, which bind their ligands to apoptosis Signal paths.
  • DD death domain
  • the CD95 receptor interacts with the adapter protein FADD / MORTl, thereby inducing the "recruitment” and activation of the protease FLICE / Caspase-8 at the DISC "Death Inducing Signaling Complex” ' .
  • FADD and FLICE each contain "Death Effector Domains” (DED).
  • DED Death Effector Domains
  • apoptosis can also be triggered by other processes are, for example by overexpression of a defined gene, whereby another signal chain is activated, which leads to programmed cell death.
  • DNA-PK DNA-dependent protein kinase
  • apoptotic cell death Rostotic cell death
  • German patent DE 198 24 811 C2 describes that a protein (CID) is present in animals which is suitable for inducing apoptosis.
  • This has a size of approximately 16 kD and has so far been characterized as a DNA-binding protein (Nehls et al., Nucleic Acids Research 26, pp. 1160-1166 (1998)). It was recognized that CID is suitable for inducing apoptosis and is present in every cell, including tumor cells, and is expressed there in an amount predetermined by the organism. If the ClD gene product is overexpressed, apoptosis is triggered in the overexpressing cells, which is therapeutically desirable in the case of tumor cells, since this overexpression per se can kill the tumor cells.
  • Cells can activate a cryptic rescue mechanism. There is a threshold, and apoptosis is only triggered if the intracellular concentration of the ClD gene product exceeds this threshold. If the initial intracellular concentration of the ClD gene product is increased, but is below this threshold, the cell can activate this rescue mechanism.
  • the disadvantage in the previously used method is that the treatments e.g. must be repeated until all target cells have been killed. This disadvantage is important because the cells that are not killed in the first treatment multiply until further treatment. If the rate of cells fatally treated during treatment remains below the rate of growth, the entire population of tumor cells will not be able to be killed.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method by means of which the initial C1D gene product level in as many cells, in particular tumor cells, as possible can be increased in such a way that the threshold value and thus the “point of no return” in as many cells as possible "is achieved.
  • the invention is based on the identification of the "rescue” process, which is based on a rapid breakdown of the cryptically cytotoxic ClD gene product.
  • the ClD gene product is degraded by proteasomes.
  • Proteasomes represent a cellular monitoring system which among other things regulatory proteins can degrade rapidly when a certain level is reached of the apoptosis-inducing ClD gene product is inhibited by avoiding this proteasome-dependent degradation and thus its intracellular concentration and thus its effect on inducing apoptosis in as many as possible
  • the present invention thus relates to a method for inducing apoptosis in a cell, which is characterized by the following steps:
  • Various measures can be used to increase the intracellular ClD concentration above a critical threshold. This can be done, for example, by overexpressing a nucleic acid sequence encoding the CID gene product in the cell or by introducing CID protein into the cell.
  • CID gene product encompasses a protein with the amino acid sequence shown in FIGS. 1 and 2 of German patent specification DE 198 24 811 C2 or an amino acid sequence different therefrom by one or more amino acids, in which case the protein still has apoptotic activity owns and to the sequences shown in the figures there has at least 70%, preferably 80%, very preferably 90 or 95% homology.
  • an amino acid sequence different from one or more amino acids encompasses any amino acid sequence of a CID (related) protein, the corresponding DNA sequence hybridizing with the DNA of these figures.
  • hybridized reference is made to the definition in German patent DE 198 24 811 C2.
  • a nucleic acid sequence coding for CID in the form of a DNA, in particular cDNA, is particularly suitable for carrying out the method according to the invention.
  • CID gene product encompasses the (native) protein and also a fragment of the original protein, which still has the apoptosis-inducing properties of CID.
  • the person skilled in the art is also able to determine whether a CID gene product that is differs from the original, still has the biological activity of apoptosis induction, eg by detecting apoptosis-typical cell death characterized by eg morphology, multicenter chromatin condensation, typical membrane changes and endogenous DNA degradation.
  • the CID overexpressing cell is a tumor cell.
  • the ClD-encoding nucleic acid sequence is inserted into a vector or expression vector, for example pBlueScript, pQE8, pUC or pBR322 derivatives.
  • the nucleic acid sequence in the vector is functionally linked to regulatory elements which allow their expression in eukaryotic host cells.
  • regulatory elements for example a promoter
  • such vectors typically contain an origin of replication and specific ones Genes that allow phenotypic selection of a transformed host cell.
  • the regulatory elements for expression in eukaryotes include the CMV, SV40, RVS-40 promoter, and CMV or SV 0 enhancers. Further examples of suitable promoters are the metallothionein I and the polyhedrin promoter.
  • the vector containing the ClD-DNA is a virus, for example an adenovirus, vaccinia virus or adeno-dependent parvovirus (AAV).
  • Retroviruses are particularly preferred. Examples of suitable retroviruses are MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV or GaLV.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can also be transported to the target cells in the form of colloidal dispersions. These include, for example, lipososms or lipoplexes (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).
  • the above-mentioned expression vectors into host cells include animal cells, preferably mammalian cells, both in culture and in the living organism.
  • host cells include animal cells, preferably mammalian cells, both in culture and in the living organism.
  • Prefers are the animal cells L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero and HeLa. Methods for transforming these host cells, for recognizing the transformation and expression of the nucleic acid molecules according to the invention using the vectors described above are known in the art.
  • the ClD-DNA is inserted into an expression vector, in particular a gene therapy vector, and introduced into cells, preferably tumor cells.
  • an expression vector in particular a gene therapy vector
  • cells preferably tumor cells.
  • the vectors are introduced into the cells under the conditions known to the person skilled in the art.
  • in vivo gene therapy reference is made in particular to "KW Culver, Gene Therapy, A Handbook for Physicans, Mary Ann Libert, Inc., New York, 1994” and "PL Chang, Sonatic Gene Therapy, CRC Press, London, 1995” ,
  • the cell's own ClD gene is stimulated to an increased expression, for example by exogenous stimulation of the endogenous ClD promoter.
  • 5 'neighboring sequences of a gene which serve as starting points for RNA polymerase II, which, in cooperation with transcription factors, bring about the expression of the gene, are referred to as promoters.
  • this process can be induced or stimulated by exogenous factors.
  • Factors that cause the specific expression of a gene are very numerous and range from physical factors (such as light, heat, cold), to low molecular weight inorganic substances (such as salts, metal ions) and low molecular weight organic substances (peptides, nucleic acid building blocks, biogenic amines, steroids) up to higher molecular weight substances (serum, growth factors, immune stimulants).
  • the stimulants specific for the ClD gene are recognized in that 5'-neighboring sequences present on, for example, the BAC (bacterial arteficial chromosome) clones are combined with a reporter gene, for example CAT or EGFP, and in terms of reporter gene expression or their stimulation by exogenous factors, possibly with a "high-throughput" method, are examined.
  • ClD protein is taken via suitable measures, e.g. enclosed in liposomes or viral capsids, introduced into the cell.
  • the CID protein is expressed, for example, in prokaryotes (e.g. E. coli) or eukaryotes (e.g. animal cells) and purified accordingly before it is administered.
  • the inhibition of the degradation of the ClD gene product can, as already indicated above, in principle take place on two levels, (a) inhibition of the proteolytic degradation of the ClD gene product, i.e. the CID protein (e.g. by proteasome inhibitors) and / or (b) changing the amino acid sequence of the ClD gene product so that it becomes resistant to proteolytic degradation without losing the apoptotic activity.
  • inhibition can take place by a ligand, e.g. an antibody that binds to the CID gene product in such a way that it is protected against degradation but does not lose its biological (apoptotic) activity.
  • the degradation of the ClD gene product is inhibited by at least one proteasome inhibitor.
  • proteasome inhibitors are known to the person skilled in the art and include, preferably, benzyloxycarbonyl-leu-leuralvalinal (MG115; Calbioche-Novabiochem GmbH, Bad Soden, Germany).
  • a suitable proteasome inhibitor is also a polypeptide comprising the ClD amino acid sequence from positions 50 to 90 or fragments thereof which can still bind ubiquitin residues. This can, preferably if present in excess, saturate the proteasomes, so that no free proteasomes are available for ClD degradation in the cell.
  • the pseudo-substrate is preferably added simultaneously with the transfection. If the inhibitor is a protein or peptide, it can also be administered by transfecting the cell with a vector according to the procedure described above, which expresses the corresponding nucleic acid sequence. This vector can also be the vector used to overexpress ClD.
  • the inhibition of the degradation of the ClD gene product is brought about by using a nucleic acid sequence for C1D overexpression which is modified such that the gene product encoded by it is resistant to degradation by proteasomes, however still has apoptotic activity
  • the term "resistant” used in this context also referring to ClD variants whose degradation (compared to the original form) is at least reduced.
  • the person skilled in the art can change a nucleic acid sequence modified in this way according to customary methods, for example in vitro -Mutagenesis, generate and determine the proteasome resistance or the apoptotic activity of the gene product encoded thereby, for example using the assays described in the examples below.
  • the ClD-coding nucleic acid sequence is preferably changed in such a way that the amino acid sequence of the ClD gene product is changed between positions 50 to 90, since the signals for the proteolytic degradation lie in this area.
  • the amino acid sequence of the ClD gene product modified so that one, two or three lysine residues at positions 54, 79 and / or 84 are replaced by other amino acid residues, preferably arginine residues. These lysine residues are obviously binding sites for ubiquitin molecules of the ubiquitin-proteaso system and their replacement by other amino acid residues prevents ubiquitination, which initiates degradation by proteasomes.
  • the pseudo-substrate inhibitors should preferably also be selected such that the amino acid sequence of the ClD gene product is overlapped between positions 50 to 90, since the signals for the proteolytic degradation lie in this range.
  • the lysine residues at positions 54, 79 and / or 84 should be covered by the pseudo-substrate inhibitors and displaced competitively because these lysine residues obviously represent binding sites for ubiquitin molecules of the ubiquitin-proteasome system.
  • the present invention provides a possibility not to trigger apoptosis (e.g. of tumor cells) via the usual signaling pathways, but by overexpressing the CIG gene and inhibiting the proteolytic degradation of the ClD gene product by proteasomes.
  • apoptosis e.g. of tumor cells
  • the CIG gene e.g. of tumor cells
  • proteolytic degradation of the ClD gene product by proteasomes This can be of particular importance in many diseases, especially tumor diseases.
  • tumor cells are much more sensitive to overexpression of ClD than normal cells. There are therefore no side effects for normal cells, whereas tumor cells suffer safe cell death.
  • Figure 1 Bimodal distribution of C1D-EGFP expression in transferred cells.
  • a fraction of transferred cells contains a high level of ClD-EGFP fusion protein, which is characterized by short Exposure times is displayed (510 nm fluorescence mode; approximately 100 milliseconds exposure time).
  • Images in the first row are taken in phase contrast mode.
  • Images in the second row show DNA-specific fluorescence staining (456 nm fluorescence mode).
  • Images in the third row show ClD-EGFP expression (510 nm fluorescence mode). Bar: 10 ⁇ m
  • Figure 2 Fluorescence micrograph of type B cells. A fraction of cells with medium amounts of fusion protein (average exposure times required for 510 nm fluorescence mode images are 2-3 seconds). The left picture is taken in phase contrast mode, the right picture shows C1D-EGFP expressing cells in fluorescence mode. Bar: 10 ⁇
  • FIG. 4 Western blot of the cellular concentration of MClD-EGFP in only transfected cells (-) and in transfected cells after inhibitor treatment (+)
  • Lane M is loaded with size markers and is used to determine the size of the fusion protein.
  • Figure 5 Graphical representation of the detection of EGFP or ClD (EGFP) in transfected cells as a function of the cultivation period
  • the magnification is shown in the picture.
  • the enlarged image section on the right shows one by mt54 / 84-
  • Image section on the left shows the expression of the gene construct in two CT26 cells before the start of apoptosis.
  • the present invention is illustrated by the following examples. These examples show that the degradation of the C1D protein mediated by the ubiquitin-proteasome system in mammalian cells can be clearly inhibited on two levels: i) by using low-molecular substances which specifically inhibit the proteolytic activity of proteasomes, and ii) by the exchange of certain amino acids that largely prevent the enzymatic incorporation of ubiqitin molecules into the ClD protein as a prerequisite for proteasome degradation.
  • example 1 show that the degradation of the C1D protein mediated by the ubiquitin-proteasome system in mammalian cells can be clearly inhibited on two levels: i) by using low-molecular substances which specifically inhibit the proteolytic activity of proteasomes, and ii) by the exchange of certain amino acids that largely prevent the enzymatic incorporation of ubiqitin molecules into the ClD protein as a prerequisite for proteasome degradation.
  • the CID gene product is one of the substrates of proteasomes because its degradation is inhibited by specific proteasome inhibitors. It is therefore possible to increase the intracellular concentration by natural expression and by transfection with C1D expression constructs by simultaneous administration of specific inhibitors of proteolytic degradation by proteasomes of the ClD gene product in transfected cells in such a way that the threshold value in a significantly higher proportion of the Cells are exceeded and these die apoptotically.
  • cells were transfected with expression constructs which contain the protein-coding sequence of the human ClD cDNA (Genbank X95592) or the mouse ClD cDNA (Genbank X95591) without or in fusion with a reporter gene (eg EGFP) and which contains the ClD in the target cells - Overexpress protein.
  • the transfection was combined with one or more doses (before, during or after the transfection) of a specific proteasome inhibitor (MGI15; benzyloxycarbonyl-leu-leu-norvalinal).
  • Type B relatively low but recognizable MCID-EGFP content, not dying, but fusion protein "disappears" within 120 hours after transfection by degradation without these cells dying (FIG. 2).
  • FIG. 4 shows a Western blot, a method which is suitable for indicating the intracellular concentration of a protein.
  • the left lanes of an SDS-polyacrylamide gel were loaded with equal amounts of protein lysate from cells transfected with pcDNA3-MCID-EGFP.
  • the lysate (-) is from cells that have only been transfected and the lysate (+) is from cells that have been transfected and treated with 10 ⁇ M proteasome inhibitor (MG115).
  • proteasomes proteins which are degraded by proteasomes are initially provided with ubiquitin residues at specific sub-sequences (ubiquitination) and that the sites in the protein which have been changed in this way thus become the target for proteolytic attack by proteasomes.
  • the proteasome-dependent degradation of a protein is therefore not stimulated by the protein as a whole, but only by partial sequences of the protein. If the partial sequence which stimulates proteolytic degradation is known, this sequence can be mutated at the nucleotide level in such a way that the resulting protein is not a substrate or at least only a weaker substrate for proteolytic degradation.
  • the reporter gene EGFP per se persists in transfected cells, while the ClD fusion protein from transfected cultures is no longer detectable in the cells 120 hours after transfection (FIG. 5). The latter is caused by the cell death of type A cells on the one hand and by the proteasome-dependent breakdown of the fusion protein in type B cells. This result proves that the ClD sequence and not the indicator or reporter gene product EGFP is the substrate for the rapid breakdown of the fusion protein.
  • the intensity of the reporter gene-related fluorescence can serve as a measure of the fusion protein present in each case.
  • Synthesis rate constant Relatively low fluorescence in transfected cells therefore means high degradation rate, relatively high fluorescence means low degradation rate.
  • the total sequence of the ClD gene product is 141 amino acids.
  • relatively low fluorescence positions 1-50
  • positions 50-80 the measured fluorescence increases, which indicates that the fusion proteins are degraded to a lesser extent and that sub-sequences are increasingly being deleted, which serve as a recognition signal for the proteolytic degradation by proteasomes.
  • the results of the deletions at the 3 'end show that the end of the overall sequence (positions 90-141) cannot serve as a signal for the proteolytic degradation either.
  • the signals for the proteolytic degradation of the CID gene product must lie between positions 50-90 and that mutations in this area should thus cause a reduction in the degradation rate while maintaining the apoptotic effect.
  • Example 2 (A) Based on the findings of Example 2 (A), various mutations were introduced in the region aa 50 to 90 at the nucleotide level, which lead to amino acid exchanges at the protein level, as a result of which a lower degradation rate and a higher efficiency with regard to triggering apoptosis are achieved could.
  • the plasmid DNA was transfected with a liposomal transfection agent (DMRIE-C, Gibco-DMRIE-C, Gibco-DMRIE-C, Gibco-DMRIE-C, Gibco-DMRIE-C, Gibco-DMRIE-C, Gibco-DMRIE-C, Gibco-DMRIE-C, Gibco-DMRIE-C, Gibco-DMRIE-C, Gibco-DMRIE-C, Gibco-DMRIE-C, Gibco-
  • FIG. 7 cells are shown which mutate the mutated gene product mt54 / 84-MClD-EGFP (FIG. 7a) and, in comparison, the unchanged gene product MCID-EGFP (FIG. 7b) and the reporter gene product EGFP (FIG. 7c) express experimental conditions.
  • the proportion of fluorescent cells is somewhat lower than in the cells transfected with the reporter gene. However, it is clearly visibly higher than in the cells that produce the genetically unchanged ClD protein.
  • the amount of the gene product in the with the. mutated ClD plasmid transfected cells approximately the same size as in the cells transfected with the reporter gene. However, it is clearly larger than in the cells that were transfected with the unchanged plasmid DNA.
  • LCLC 103H cells were cultured by conventional methods and subjected to the treatments listed in the table below. 24 hours after the start of treatment, the remaining living cells were counted in 8 randomly selected frames.
  • the pseudo-substrate mix was composed of synthetic hepta peptides that overlap with positions 51-57, 76-82 and 81-87 of the ClD amino acid sequence. Mean values and standard deviations are given.

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Auslösung von Apoptose in einer Zelle, vorzugsweise einer Tumorzelle, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die intrazelluläre C1D-Konzentration über einen kritischen Schwellenwert erhöht wird und der Abbau von C1D gehemmt wird.

Description

Verfahren zur Auslösung von Apoptose in Zellen durch Erhöhung des ClD-Spiegels und Hemmung des Abbaus von CID
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auslösung von Apoptose in einer Zelle, vorzugsweise einer Tumorzelle, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Konzentration von CID in der Zelle über einen kritischen Schwellenwert erhöht wird und außerdem der Abbau von CID gehemmt wird.
Apoptose ist der programmierte Zelltod. Dieser unterliegt einer genauen Regulation, wobei Apoptose induziert bzw. inhibiert werden kann. Die Induktion von Apoptose kann zum Beispiel über eine Reihe von sog. Todesrezeptoren, d.h. Rezeptoren, die eine "Death Domain" (DD) enthalten, wie CD95, TNF-RI, DR3, DR4 oder DR5 , erfolgen, die nach Bindung ihrer Liganden Apoptose-Signalwege induzieren. Beispielsweise interagiert nach Bindung des CD95-Liganden der CD95-Rezeptor mit dem Adapterprotein FADD/MORTl, wodurch das "Recruitment" und die Aktivierung der Protease FLICE/Caspase-8, am DISC "Death Inducing Signalling Complex"' induziert werden. FADD und FLICE enthalten jeweils "Death Effector Domains" (DED) . Die Induktion der Apoptose über diese Apoptose-Signalwege ist von außen beispielsweise durch die Gabe von Zellgiften (cytotoxischen Substanzen) , Bestrahlung, Viren, Entzug von Wachstumsfaktoren oder mechanische Zellverletzung möglich. Diese Möglichkeiten der Apoptose-Induktion sind allerdings von bestimmten Nachteilen begleitet. So führt die Gabe von Zellgiften, wie Zytostatika, oder die Bestrahlung bei Krebszellen zur Resistenzentwicklung und darüberhinaus zu einer Schädigung normaler Zellen, bei denen eigentlich keine Apoptose ausgelöst werden sollte.
Alternativ kann Apoptose auch durch andere Prozesse ausgelöst werden, z.B. durch Überexpression eines definierten Gens, wobei eine andere Signalkette aktiviert wird, die zum programmierten Zelltod führt. In diesem Fall wird eine ansonsten DNA-abhängige Proteinkinase (DNA-PK) auf DNA- abhängige Weise aktiviert ' (Yavuzer et al . , Genes and Development 12 (1998), 2188-2199) was zu einer Erhöhung des p21 (CIP1, WAF1) -Spiegels in der Zelle und letztlich zur Auslösung von apoptotische Zelltod führt (Rothbarth et al., J. Cell. Science 112 (1999), 2223-2232).
In der deutschen Patentschrift DE 198 24 811 C2 wird beschrieben, dass in Tieren ein Protein (CID) vorliegt, das sich zur Induktion von Apoptose eignet. Dieses weist eine Größe von ca. 16 kD auf und wurde bisher als DNA-bindendes Protein charakterisiert (Nehls et al . , Nucleic Acids Research 26, S. 1160-1166 (1998)). Es wurde erkannt, daß CID zur Induktion von Apoptose geeignet ist und in jeder Zelle, auch in Tumorzellen vorhanden ist, und dort in einer vom Organismus vorgegebenen Menge expri iert wird. Kommt es zu einer Überexpression des ClD-Genprodukts, wird in den überexprimierenden Zellen Apoptose ausgelöst, was im Fall von Tumorzellen therapeutisch wünschenswert ist, da diese Überexpression per se die Tumorzellen abtöten kann. In der deutschen Patentschrift DE 198 24 ' 811 C2 wird schließlich beschrieben, dass in Tumorzellen tatsächlich Apoptose dadurch erreicht werden kann, dass das ClD-Gen zur Überexpression gebracht wird, d.h. die Konzentration des zellulären ClD-Genprodukts erhöht wird. Dies kann dadurch erreicht werden, dass die Zellen mit Expressionskonstrukten transfiziert werden, die das ClD-Gen exprimieren oder das endogene ClD-Gen zur Überexpression stimuliert wird.
Allerdings zeigte sich in Vorexperimenten zu der vorliegenden Erfindung, dass die bisher angewendeten Verfahren zur Erhöhung des ClD-Spiegels in Zellen (z.B. Transfektion mit Expressionskonstrukten) immer nur in einem relativ kleinen Anteil der behandelten Zellen zur Auslösung von Apoptose führen. Es stellte sich heraus, dass dies daran liegt, dass
Zellen einen kryptischen Rettungsmechanismus aktivieren können. Es besteht ein Schwellenwert, und nur dann, wenn die intrazelluläre Konzentration des ClD-Gen-Produkts diesen Schwellenwert übersteigt, wird die Apoptose ausgelöst. Ist die initiale intrazelluläre Konzentration des ClD-Gen- Produkts zwar erhöht, liegt aber unter diesem Schwellenwert, kann die Zelle diesen Rettungsmechanismus aktivieren. Da aber für therapeutische Zwecke letztendlich alle Zielzellen abgetötet werden sollen, besteht der Nachteil in dem bisher angewendeten Verfahren, dass die Behandlungen z.B. solange wiederholt werden müssen, bis alle Zielzellen abgetötet sind. Dieser Nachteil ist von Bedeutung, weil die Zellen, die bei der ersten Behandlung nicht abgetötet werden, sich bis zur weiteren Behandlung vermehren. Bleibt die Rate der bei einer Behandlung tödlich getroffenen Zellen unter der Vermehrungsrate, wird es nicht gelingen die gesamte Population der Tumorzellen abzutöten.
Somit besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit denen der initiale C1D- Genprodukt-Spiegel in möglichst vielen Zellen, insbesondere Tumorzellen, derart erhöht werden kann, dass in möglichst vielen Zellen der Schwellenwert und damit des „points of no return" erreicht wird.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände der Patentansprüche erreicht .
Die Erfindung basiert auf der Identifikation des „Rettungs"- Prozesses, der auf einem raschen Abbau des kryptisch cytotoxischen ClD-Gen-Produkts beruht. Dabei wird das ClD- Gen-Produkt durch Proteaso en abgebaut. Proteasomen stellen ein zelluläres ÜberwachungsSystem dar, das u.a. regulatorische Proteine bei Erreichung eines bestimmten Niveaus rasch abbauen kann. Erfindungsgemäß kann der Abbau des Apoptose-auslösenden ClD-Genprodukts durch Vermeidung dieses Proteasomen-abhängigen Abbaus gehemmt und damit dessen intrazelluläre Konzentration und somit seine Wirkung hinsichtlich der Auslösung der Apoptose in möglichst vielen
Zellen verstärkt werden. Dabei kann die Vermeidung dieses
Abbaus prinzipiell durch zwei Verfahren erreicht werden: (a)
Hemmung des Abbaus durch spezifische Proteaso en-Inhibitoren, und (b) Identifizierung des ClD-Zielsequenz-Abschnitts, der den Abbau anregt, und gezielte genetische Veränderung der entsprechenden Nukleinsäuresequenz, wodurch dem produzierten
Protein Substrateigenschaften hinsichtlich des spezifischen
Abbaus verloren gehen.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Auslösung von Apoptose in einer Zelle, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
(a) Erhöhen der intrazellulären ClD-Konzentration über einen kritischen Schwellenwert; und
(b) Hemmung des Abbaus von CID.
Die Erhöhung der intrazellulären ClD-Konzentration über einen kritischen Schwellenwert kann durch verschiedene Maßnahmen erfolgen. Dies kann beispielsweise durch Überexpression einer das CID-Genprodukt kodierenden Nukleinsäuresequenz in der Zelle oder durch Einbringen von CID-Protein in die Zelle geschehen .
Verfahren zur Überexpression einer das CID-Genprodukt kodierenden Nukleinsäuresequenz sind in der deutschen Patentschrift DE 198 24 811 C2 beschrieben. Dabei umfaßt der Begriff „CID-Genprodukt" ein Protein mit der in den Figuren 1 bzw. 2 der deutschen Patentschrift DE 198 24 811 C2 gezeigten Aminosäuresequenz oder einer hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedlichen Aminosäuresequenz, wobei in diesem Fall das Protein noch apoptotische Aktivität besitzt und zu den in den dortigen Figuren gezeigten Sequenzen noch mindestens 70%, bevorzugt 80%, ganz bevorzugt 90 oder 95% Homologie aufweist. Der Ausdruck "eine durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz" umfaßt jegliche Aminosäuresequenz eines CID- (verwandten) Proteins, wobei die entsprechende DNA-Sequenz mit der DNA dieser Figuren hybridisiert. Bezüglich der Definition des Begriffs "hybridisiert" wird auf die Definition in der deutschen Patentschrift DE 198 24 811 C2 verwiesen.
Für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist insbesondere eine für CID kodierende Nukleinsäuresequenz in Form einer DNA, insbesondere cDNA, geeignet.
Der Ausdruck „CID-Genprodukt" umfaßt das (native) Protein und auch ein Fragment des ursprünglichen Proteins, wobei dieses noch die Apoptose auslösenden Eigenschaften von CID aufweist. Der Fachmann ist auch in der Lage zu bestimmen, ob ein CID- Genprodukt, das sich von dem ursprünglichen unterscheidet, noch über die biologische Aktivität der Apoptose-Induktion verfügt, z.B. durch Nachweis von Apoptose-typischem Zelltod gekennzeichnet durch z.B. Morphologie, multizentrische Chromatinkondensation, typische Membranveränderungen und endogene DNA-Degradation.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die CID überexprimierende Zelle eine Tumorzelle.
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die ClD kodierende Nukleinsäuresequenz in einen Vektor oder Expressionsvektor inseriert, z.B. pBlueScript, pQE8, pUC- oder pBR322-Derivate. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz im Vektor mit regulatorischen Elementen funktioneil verknüpft, die deren Expression in eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Eukaryonten zählen der CMV-, SV40-, RVS-40- Promotor, sowie CMV- oder SV 0-Enhancer. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor .
In einer für gentherapeutische Zwecke bevorzugten Ausführungsform ist der die ClD-DNA enthaltende Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia-Virus oder Adeno-abhängige Parvoviren (AAV) . Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Lipososmen oder Lipoplexe (Mannino et al . , Biotechniques 6 (1988), 682).
Allgemeine auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressions— und insbesondere Gentherapievektoren, die die oben genannten Nukleinsäuremoleküle und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro- Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie in der Fachliteratur beschrieben sind. Der Fachmann weiß somit, in welcher Weise eine ClD-DNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die ClD kodierende DNA in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden kann, beispielsweise in Form eines Fusionsproteins, bei dem der andere Teil GFP (das grün fluoreszierende Protein von Aequorea Victoria) ist.
Für die Expression des ClD-Gens werden die oben genannten Expressionsvektoren in Wirtszellen ■ eingeführt. Zu diesen Wirtszellen zählen Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen, sowohl in Kultur wie auch im lebenden Organismus. Bevorzugt sind die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur Erkennung erfolgter Transformation und Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle ■ unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt .
Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße DNA exprimierte Protein bzw. Fusionsprotein zu isolieren und zu reinigen.
Um das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen, wird in einer bevorzugten Ausführungsform die ClD-DNA in einen Expressionsvektor, insbesondere einen Gentherapievektor, inseriert und in Zellen, bevorzugt Tumorzellen, eingeführt. Dort kommt es zur Expression von ClD-Protein, das zusätzlich zum zelleigenen Protein, zur Auslösung von Apoptose führt. Das Einbringen der Vektoren in die Zellen erfolgt unter den dem Fachmann bekannten Bedingungen. Hinsichtlich der in-vivo Gentherapie wird insbesondere auf "K.W. Culver, Gene Therapy, A Handbook for Physicans, Mary Ann Libert, Inc., New York , 1994" und "P.L. Chang, Sonatic Gene Therapy, CRC Press, London, 1995" verwiesen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das zelleigene ClD-Gen zu einer vermehrten Expression stimuliert, z.B. durch exogene Stimulation des endogenen ClD-Promoters . Als Promoter bezeichnet man 5 ' -Nachbarsequenzen eines Gens, die als Startpunkte der RNA Polymerase II dienen, welche im Zusammenwirken mit Transkriptionsfaktoren die Expression des Gens bewirkt. Bei vielen Genen, wie auch bei ClD, ist dieser Prozeß durch exogene Faktoren induzierbar bzw. stimulierbar. Faktoren, die die spezifische Expression eines Gens bewirken sind sehr zahlreich und reichen von physikalischen Faktoren (wie Licht, Wärme, Kälte) , über niedermolekulare anorganische Stoffe (wie Salze, Metallionen) und niedermolekulare organische Stoffe (Peptide, Nukleinsäurebausteine, biogene Amine, Steroide) bis zu höhermolekularen Stoffen (Serum, Wachstumsfaktoren, Immun-Stimulantien) . Die für das ClD-Gen spezifischen Stimulantien werden dadurch erkannt, daß 5'- NachbarSequenzen, vorhanden auf z.B. den BAC (bacterial arteficial chromosome) Klonen mit einem Reportergen, z.B. CAT oder EGFP, kombiniert und hinsichtlich der Reportergen- Expression bzw. deren Stimulation durch exogene Faktoren, ggf. mit einem "high-throughput" -Verfahren, untersucht werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ClD- Protein über geeignete Maßnahmen, z.B. eingeschlossen in Liposomen oder Viruskapside, in die Zelle eingebracht. Das CID-Protein wird beispielsweise in Prokaryonten (z.B. E.coli) oder Eukaryonten (z.B. tierischen Zellen) exprimiert und entsprechend aufgereinigt, bevor es verabreicht wird.
Die Hemmung des Abbaus des ClD-Genprodukts kann, wie bereits vorstehend angedeutet, prinzipiell auf zwei Ebenen erfolgen, (a) Hemmung des proteolytischen Abbaus des ClD-Genprodukts, d.h. des CID-Proteins (z.B. durch Proteasomen-Inhibitoren) und/oder (b) Veränderung der Aminosäuresequenz des ClD- Genprodukts so, dass dieses resistent gegenüber einem proteolytischen Abbau wird ohne dabei die apoptotische Aktivität zu verlieren. Andererseits ist auch denkbar, dass eine Hemmung dadurch erfolgen kann, dass ein Ligand, z.B. ein Antikörper, so an das CID-Genprodukt bindet, dass es vor Abbau geschützt ist, nicht jedoch seine biologische (apoptotische) Aktivität verliert.
Somit erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Hemmung des Abbaus des ClD- Genprodukts durch mindestens einen Proteasomen-Inhibitor . Geeignete Proteasomen-Inhibitoren sind dem Fachmann bekannt und dazu zählt, vorzugsweise, Benzyloxycarbonyl-leu-leu- norvalinal (MG115; Calbioche -Novabiochem GmbH, Bad Soden, Deutschland) . Ein geeigneter Proteasomen-Inhibitor ist außerdem ein Polypeptid, das die ClD-Aminosäuresequenz von den Positionen 50 bis 90 umfaßt oder Fragmente davon, die noch Ubiquitin-Reste binden können. Dieses kann, vorzugsweise wenn im Überschuß vorhanden, die Proteasomen absättigen, so dass keine freien Proteasomen für den ClD-Äbbau mehr in der Zelle zur Verfügung stehen. Die Zugabe des Pseudo-Substrat- (Inhibitors) erfolgt vorzugsweise gleichzeitig mit der Transfektion. Falls es sich bei dem Inhibitor um ein Protein oder Peptid handelt, kann dessen Verabreichung auch dadurch erfolgen, dass die Zelle mit einem Vektor gemäß dem vorstehend beschriebenen Vorgehen transfiziert wird, der die entsprechende Nukleinsäuresequenz exprimiert . Bei diesem Vektor kann es sich auch um den Vektor handeln, der zur Überexpression von ClD verwendet wird.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Hemmung des Abbaus des ClD-Genprodukts dadurch bewirkt, dass für die C1D- Überexpression eine Nukleinsäuresequenz verwendet wird, die so verändert ist, dass das davon kodierte Genprodukt resistent gegenüber einem Abbau durch Proteasomen ist, jedoch noch apoptotische Aktivität aufweist, wobei der in diesem Zusammenhang verwendete Ausdruck „resistent" sich auch auf ClD-Varianten bezieht, deren Abbau (gegenüber der ursprünglichen Form) zumindest verringert ist. Der Fachmann kann eine so veränderte Nukleinsäuresequenz gemäß üblicher Verfahren, z.B. in-vitro-Mutagenese, erzeugen und die Bestimmung der Proteasomen-Resistenz bzw. der apoptotischen Aktivität des davon kodierten Genprodukts z.B. über die in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Assays durchführen.
Vorzugsweise ist die ClD kodierende Nukleinsäuresequenz so verändert, dass die Aminosäuresequenz des ClD-Genprodukts zwischen den Positionen 50 bis 90 verändert ist,, da in diesem Bereich die Signale für den proteolytischen Abbau liegen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Aminosäuresequenz des ClD-Genprodukts so verändert, dass ein, zwei oder drei Lysinreste an den Positionen 54, 79 und/oder 84 gegen andere Aminosäurereste, vorzugsweise Argininreste, ausgetauscht sind. Diese Lysinreste stellen offensichtlich Bindungsstellen für Ubiquitin-Moleküle des Ubiquitin-Proteaso en-Systems dar und deren Ersatz durch andere Aminosäurereste verhindert die Ubiquitinierung, die den Abbau durch Proteasomen einleitet.
Vorzugsweise sind auch die Pseudo-Substrat-Inhibitoren so zu wählen, dass die Aminosäuresequenz des ClD-Genprodukts zwischen den Positionen 50 bis 90 überlappt wird, da in diesem Bereich die Signale für den proteolytischen Abbau liegen. Insbesondere sollten die Lysinreste an den Positionen 54, 79 und/oder 84 durch die Pseudo-Substrat-Inhibitoren abgedeckt und kompetitiv verdrängt werden, weil diese Lysinreste offensichtlich Bindungsstellen für Ubiquitin- Moleküle des Ubiquitin-Proteasomen-Systems darstellen.
Somit stellt die vorliegende Erfindung erstmalig eine Möglichkeit bereit, Apoptose (z.B. von Tumorzellen) nicht über die üblichen Signalwege auszulösen, sondern durch Überexpression des CIG-Gens und der Hemmung des proteolytischen Abbaus des ClD-Genprodukts durch Proteasomen. Dies kann eine besondere Bedeutung bei vielen Erkrankungen haben, insbesondere Tumorerkrankungen. Insbesondere hat sich als vorteilhaft herausgestellt, daß Tumorzellen auf eine Überexpression von ClD sehr viel empfindlicher als normale Zellen reagieren. Für normale Zellen bestehen deshalb keinerlei Nebenwirkungen, während Tumorzellen den sicheren Zelltod erleiden.
Kurze Beschreibung der Figuren:
Figur 1: Bimodale Verteilung von C1D-EGFP Expression in transferierten Zellen Eine Fraktion transferierter- Zellen enthält einen hohen Level an ClD-EGFP-Fusionsprotein, welches durch kurze Expositionszeiten angezeigt wird (510 nm Fluoreszenzmodus; ungefähr 100 Millisekunden Expositionszeit) . Bilder in der ersten Reihe sind im Phasenkontrastmodus aufgenommen. Bilder in der zweiten Reihe zeigen DNA-spezifische Fluoreszenz- Anfärbung (456 nm Fluoreszenzmodus) . Bilder in der dritten Reihe zeigen ClD-EGFP-Expression (510 nm Fluoreszenzmodus) . Balken: 10 μm
Figur 2 : Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von Typ B-Zellen Eine Fraktion von Zellen mit mittleren Mengen an Fusionsprotein (mittlere Expositionszeiten, die für 510 nm Fluoreszenzmodusbilder benötigt werden, sind 2-3 Sekunden) . Das linke Bild ist im Phasenkontrastmodus aufgenommen, das rechte Bild zeigt C1D-EGFP exprimierende Zellen im Fluoreszenzmodus. Balken: 10 μ
Figur 3 : Quantitative Auswertung der Ergebnisse gemäß Figuren 1 und 2
(A) Prozent Typ A-Zellen, apoptotische Zellen.
(B) Prozent Typ B-Zellen; transfizierte, aber nicht- apoptotische Zellen.
Blanke Säulen: ohne Inhibitor Gestrichelte Säulen: mit Inhibitor.
Figur 4: Western-Blot der zellulären Konzentration von MClD- EGFP in nur transfizierten Zellen (-) und in transfizierten Zellen nach Inhibitor-Behandlung ( + )
Die Bahn M ist mit Größenmarkern , beladen und dient zur Bestimmung der Größe des Fusionsproteins .
Figur 5: Graphische Darstellung des Nachweises von EGFP bzw ClD (EGFP) in transfizierten Zellen in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer
Figur 6 :
Oberer Teil: Darstellung der getesteten Deletionskonstrukte
Unterer Teil: Relative Fluoreszenz nach Transfektionsverlauf Figur 7
(A) : CT26-Tumorzellen nach Transfektion mit dem Genkonstrukt pCDNA3-mt54/84-MClD-EGFP
Linkes Bild, Fluoreszenzaufnahme; rechtes Bild, Durchlicht.
Die Vergrößerung ist in der Abbildung angegeben. Der vegrößerte Bildausschnitt rechts zeigt eine durch mt54/84-
MClD induzierte apoptotische Zelle. Der vergrößerte
Bildausschnitt links zeigt die Expression des Genkonstrukts in zwei CT26-Zellen vor Beginn der Apoptose.
(B) : CT26-Tumorzellen nach Transfektion mit dem Genkonstrukt PCDNA3-MC1D-EGFP
Linkes Bild, Fluoreszenzaufnahme; rechtes Bild, Durchlicht. Die Vergrößerung ist in der Abbildung angegeben. Der vergrößerte Bildausschnitt zeigt eine durch MCID induzierte apoptotische Zelle.
(C) : CT26-Tumorzellen nach Transfektion mit dem Reporter- Genkonstrukt pcDNA3-EGFP.
Linkes Bild, Fluoreszenzaufnahme; rechtes Bild, Durchlicht. Die Vergrößerung ist in der Abbildung angegeben
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert. Diese Beispiele zeigen, dass der durch das Ubiquitin-Proteasomen-System vermittelte Abbau des C1D- Proteins in Säugerzellen auf zwei Ebenen deutlich gehemmt werden kann: i) durch die Verwendung niedermolekularer Substanzen, die die proteolytische Aktivität von Proteasomen spezifisch hemmen, und ii) durch den Austausch bestimmter Aminosäuren, die den enzymatischen Einbau von Ubiqitinmolekülen in das ClD-Protein als Voraussetzung für den Proteasomenabbau weitgehend verhindern. Beispiel 1
Hemmung des Abbaus des ClD-Genprodukts durch den Proteasomen-
Inhibitor MG 115
Das CID-Genprodukt gehört zu den Substraten von Proteasomen, da sein Abbau durch spezifische Proteasomen-Inhibitoren gehemmt wird. Es ist deshalb möglich die durch natürliche Expression und die durch Transfektion mit C1D- Expressionskonstrukten erhöhte intrazelluläre Konzentration durch gleichzeitiger Gabe von spezifischen Inhibitoren des proteolytischen Abbaus durch Proteasomen das ClD-Genprodukts in transfizierten Zellen derart zu erhöhen, dass der Schwellenwert in einem signifikant höheren Anteil der Zellen überschritten wird und diese apoptotisch verenden. Dazu wurden Zellen mit Expressionskonstrukten transfiziert, die die Protein-kodierende Sequenz der Mensch ClD cDNA (Genbank X95592) oder der Maus ClD cDNA (Genbank X95591) ohne oder in Fusion mit einem Reportergen (z.B. EGFP) enthalten, und die in den Zielzellen das ClD-Protein zur Überexpression bringen. Die Transfektion wurde kombiniert mit einer oder mehreren Gaben (vor, während oder nach der Transfektion) eines spezifischen Proteasomeninhibitors (MGI15; Benzyloxycarbonyl- leu-leu-norvalinal) .
Ehrlich Ascites Tumorzellen (EAT) wurden mit dem Reportergen- Konstrukt pcDNA3-MCID-EGFP transfiziert (20 μg/ l, Zelldichte 107 pro ml, Biorad Gene Pulser II, Elektrodenabstand D=4 mm, 366 V / 950 μF) . Zur Bestimmung des Proteasomen-Inhibitor- Effekts wurde die transfizierte Zellkultur geteilt und ohne bzw. nach Zusatz von MG 115 (10 μM) kultiviert.
Die Auswertung erfolgte qualitativ und quantitativ mittels des Openlab Imaging Sytems (Improvision, Warwick, UK) . Fluoreszenzmikroskopisch wurden qualitativ zwei Typen von transfizierten Zellen unterschieden: Typ A, sehr hoher MCID-EGFP Gehalt, erkennbar an sehr starker
Fluoreszenz, apoptotische Zellen, absterbend (Figur 1) .
Typ B, relativ niedriger aber erkennbarer MCID-EGFP Gehalt, nicht absterbend, Fusionsprotein „verschwindet" aber innerhalb von 120 Stunden nach Transfektion durch Abbau ohne dass diese Zellen absterben (Figur 2) .
Eine quantitative Auswertung (24 Stunden nach Transfektion) von drei unabhängigen Experimenten (Figur 3, Experiment 1, 2, 3) zeigt, dass der Anteil an apoptotischen Typ A-Zellen in Anwesenheit des Proteasomen-Inhibitors (durchschnittlich 15x) erhöht wird. Dies zeigt, dass durch die Hemmung des Proteasomen-abhängigen Abbaus von CID der Schwellenwert (point of no return) in einem signifikant höheren Anteil der Zellen überschritten wird.
Die signifikante Erhöhung des ClD-Gen-Produkts in Anwesenheit eines Hemmstoffs für den Abbau durch Proteasomen kann auch durch das in Figur 4 dargestellte Experiment belegt werden. Figur 4 zeigt einen Western-Blot, eine Methode, die geeignet ist um die intrazelluläre Konzentration eines Proteins anzuzeigen. Die linken Bahnen eines SDS-Polyacrylamid-Gels wurden mit gleichen Mengen Proteinlysat aus mit pcDNA3-MCID- EGFP transfizierten Zellen beladen. Das Lysat (-) stammt von Zellen, die nur transfiziert wurden und das Lysat (+) stammt von Zellen, die transfiziert und mit 10 μM Proteasomen- Inhibitor (MG115) behandelt wurden. Der rechte Teil der Figur zeigt den immunochemischen Nachweis des Fusionsproteins mit einem anti-ClD-Antikörper (Nehls et al., Nucleic Acid Res . 26, S. 1160-1166 (1998)). Man sieht, dass die Menge des Fusionsproteins im Lysat (+) um ein Vielfaches (10-20x) erhöht ist. Beispiel 2 (A)
Identifikation der ClD-Zielsequenz für den proteolytischen
Abbau
Es ist bekannt, dass Proteine, die durch Proteasomen abgebaut werden, zunächst an spezifischen Sub-Sequenzen mit Ubiquitin- Resten versehen werden (Ubiquitinierung) und dass die dermaßen veränderten Stellen im Protein dadurch zum Ziel für den proteolytischen Angriff durch Proteasomen werden. Der Proteasomen-abhängige Abbau eines Proteins wird also nicht durch das Protein insgesamt angeregt, sondern nur von Teilsequenzen des Proteins. Kennt man die Teilsequenz, die den proteolytischen Abbau anregt, kann man diese Sequenz auf der Nukleotidebene derart mutieren, dass das resultierende Protein kein Substrat oder zumindest nur noch ein schwächeres Substrat für den proteolytischen Abbau darstellt.
Die Erfinder konnten in einem in der Literatur noch nicht beschriebenen Ansatz den Bereich des ClD-Gen-Produkts identifizieren, der den proteolytischen Abbau anregt. Dieser Ansatz basierte auf folgenden Erkenntnissen:
1. Das Reportergen EGFP an sich persistiert in transfizierten Zellen, während das ClD-Fusionsprotein aus transfizierten Kulturen 120 Stunden nach Transfektion in den Zellen nicht mehr nachweisbar ist (Figur 5) . Letzteres ist bedingt durch den Zelltod der Typ A-Zellen einerseits und durch den Proteasomen-abhängigen Abbau des Fusionsproteins in Typ B-Zellen. Dieses Ergebnis belegt, dass die ClD-Sequenz und nicht das Indikator- bzw, Reportergen-Produkt EGFP das Substrat für den raschen Abbau des Fusionsproteins darstellt.
2. Die' Intensität der Reportergen-bedingten Fluoreszenz kann als Maß des jeweils vorhandenen Fusionsproteins dienen.
3. Die jeweilige Menge des Fusionsproteins ergibt sich aus der Bilanz zwischen Neusynthese und Abbau. Da die in der Folge beschriebenen Expressionskonstrukte alle unter der Regulation des gleichen Promotors stehen (CMV) , ist ihre
Syntheserate konstant. Relativ niedrige Fluoreszenz in transfizierten Zellen bedeutet deshalb hohe Abbaurate, relativ hohe Fluoreszenz bedeutet niedrige Abbaurate.
Es wurden deshalb 5 ' und 3 ' deletierte Expressions-Konstrukte hergestellt, und die Menge des jeweiligen Fusionsproteins wurde nach Transfektion (siehe Beispiel 1) in den transfizierten Zellen unter identischen Bedingungen mittels des „Openlab Imaging Systems" (siehe Beispiel 1) bestimmt (Figur 6) .
Ergebnisse
Die Gesamtsequenz des ClD-Gen-Produkts beträgt 141 Aminosäuren. Bei Deletionen am 5' Ende findet man zunächst relative niedrige Fluoreszenz (Positionen 1-50), d.h. die entsprechenden Fusionsproteine werden mit hoher Rate abgebaut. Daraus folgt, dass in diesem Sequenzbereiche keine Signale deletiert wurden, die für den proteolytischen Abbau Maßgebend sind. Bei weiteren Deletionen (Positionen 50-80) steigt die gemessene Fluoreszenz an, was anzeigt, dass die Fusionsproteine in geringerem Maße abgebaut werden und dass hier zunehmend Sub-Sequenzen deletiert werden, die als Erkennungssignal für den proteolytischen Abbau durch Proteasomen dienen. Die Ergebnisse der Deletionen am 3' Ende zeigen, dass das Ende der Gesamtsequenz (Positionen 90-141) ebenfalls nicht als Signal für den proteolytischen Abbau dienen kann. Zusammenfassend wurde erkannt, dass die Signale für den proteolytischen Abbau des CID-Gen-Produkts zwischen den Positionen 50-90 liegen müssen und dass somit Mutationen in diesem Bereich bei Erhalt der apoptotischen Wirkung eine Herabsetzung der Abbaurate bewirken sollten. Beispiel 2 (B)
Hemmung des Abbaus des ClD-Genprodukts durch Modifikation der
Aminosäuresequenz
Auf der Basis der Befunde von Beispiel 2 (A) wurden in dem Bereich aa 50 bis 90 auf Nukleotidebene verschiedene Mutationen eingeführt, die auf der Proteinebene zu Aminosäureaustauschen führen, wodurch eine geringere Abbaurate und eine höhere Effizienz im Hinblick auf die Auslösung von Apoptose erzielt werden konnte.
In der Teilsequenz, die für den Proteasomen-vermittelten Abbau des ClD-Proteins verantwortlich ist, befinden sich drei Lysinreste (Positionen 54, 79 und 84), die als Ziele für die Bindung von Ubiqitinmolekülen in Frage kommen. Durch die gezielte Einführung von Mutationen auf der Nukleotid-Ebene wurde erreicht, dass diese Lysinreste in dem Genprodukt entweder einzeln oder in Kombination durch die Aminosäure Arginin ersetzt wurden. Für die Mutagenese-Experimente wurde das in der deutschen Patentschrift DE 198 24 811 C2 beschriebene Plasmid pcDNA3-MCID-EGFP verwendet. Die Veränderung der Nukleotidsequenz wurde . mit einem Kit der Firma Stratagene (QuickChange Site-Directed Mutagenesis-Kit; Amsterdam, Niederlande) und nach deren Protokoll durchgeführt .
Auf diese Weise wurden insgesamt 7 unterschiedlich mutierte DNA-Konstrukte erhalten. In den daraus resultierenden C1D- Proteinen sind die Lysinreste an den Positionen 54, 79 und 84 jeweils einzeln oder in Kombination (54/79, 54/84, 79/84 und 54/79/84) durch Argininreste ersetzt.
Der Effekt der genetischen Veränderungen auf den Abbau des ClD-Proteins wurde durch Transfektion der entsprechenden DNA-
Konstrukte in CT26-Tumorzellen überprüft. Als Kontrollen dienten das genetisch unveränderte pcDNA3-MCID-EGFP und das in der deutschen Patentschrift DE 198 24 811 C2 beschriebene
Reporter-Genkonstrukt pcDNA3-EGFP, dessen Genprodukt (EGFP) nicht durch Proteasomen abgebaut wird (siehe oben) . CT26-
Zellen wurden über Nacht in Mikrotiter-Platten (2,5 x 104
Zellen/well, 24 wells/Platte) bei 37°C in Medium (DMEM/10%
FKS) kultiviert. Für die Transfektion wurde die Plasmid-DNA mit einem liposomalen Transfektions ittel (DMRIE-C, Gibco-
BRL, Karlsruhe, Deutschland) komplexiert und zu den Zellen hinzugefügt . Nach 5 h Inkubation wurde die
Transfektionslösung durch Medium ersetzt. Die Auswertung der
Experimente erfolgte 24 h später.
In Figur 7 sind Zellen abgebildet, die das mutierte Genprodukt mt54/84-MClD-EGFP (Fig. 7a) und vergleichend dazu das unveränderte Genprodukt MCID-EGFP (Fig. 7b) sowie das Reporter-Genprodukt EGFP (Fig. 7c) unter gleichen experimentellen Bedingungen exprimieren. In Zellen, die mit dem mutierten ClD-Plasmid transfiziert wurden, ist der Anteil der fluoreszierenden Zellen zwar etwas geringer als in den mit dem Reportergen transfizierten Zellen. Er ist aber deutlich sichtbar höher als in den Zellen, die das genetisch unveränderte ClD-Protein produzieren. Auch ist die Menge des Genprodukts in den mit dem . mutierten ClD-Plasmid transfizierten Zellen annähernd gleich groß wie in den mit dem Reportergen transfizierten Zellen. Sie ist aber eindeutig größer als in den Zellen, die mit der unveränderten Plasmid- DNA transfiziert wurden.
Gemäß den zuvor erwähnten Befunden bedeutet dies, dass der Austausch bestimmter Aminosäuren einen deutlich verringerten Abbau des Genprodukts zur Folge hat. Ein Schutz vor dem Abbau durch Proteasomen wurde auch im Falle, der Einzelmutanten mt54-MClD-EGFP und mt84-MClD-EGFP beobachtet. Im Vergleich zur Doppelmutante ist die Schutzwirkung allerdings etwas geringer. Die anderen Mutanten zeigten keine protektive
Wirkung. Die Tatsache, dass das genetisch veränderte C1D-
Protein seine Apoptose-induzierende Aktivität behalten hat, ist an den für diesen Prozeß typischen zellmorphologischen
Veränderungen zu erkennen (siehe Fig. 7a, b) .
Beispiel 3
Hemmung des Abbaus des ClD-Genprodukts durch Pseudo-Substrat- Mix
In Anwesenheit von Pseudo-Substrat-Inhibitoren wurde C1D- induzierter Zelltod signifikant zu einer Zeit erreicht (24 Stunden nach Transfektion) , wo Transfektionen mit C1D- Expressionskonstrukten allein keine signifikante Zelltötungsaktivtät zeigten. LCLC 103H-Zellen wurden nach üblichen Methoden kultiviert und den in der nachfolgenden Tabelle aufgelisteten Behandlungen unterzogen. 24 Stunden nach Beginn der Behandlung wurden die verbleibenden lebenden Zellen in 8 willkürlich ausgewählten Rahmen gezählt. Der Pseudo-Substrat-Mix war aus synthetischen Hepta-Peptiden, die mit den Positionen 51-57, 76-82 und 81-87 der ClD A inosäureseuquenz überlappen, zusammengesetzt. Mittelwerte und Standardabweichungen sind angegeben.
Behandlung Lebende, nicht-abgebaute Zellen
(%)
Kontrolle, keine Behandlung 100,0 +/- 18
Pseudo-Substrat-Mix (lOOμM) 92,1 +/- 25
Transfektionen mit C1D-
Expressionskonstrukt 94,5 +/- 41
Transfektionen mit C1D-
Expressionskonstrukt plus 69,5 +/- 29 zusätzliche Behandlung mit
Pseudo-Substrat-Mix (100 μM)

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Auslösung von Apoptose in einer Zelle, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
(a) Erhöhen der intrazellulären ClD-Konzentration über einen kritischen Schwellenwert; und
(b) Hemmung des Abbaus von ClD.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Erhöhung der intrazellulären ClD-Konzentration durch Überexpression einer das ClD-Genprodukt kodierenden Nukleinsäuresequenz oder durch Einbringen von ClD-Protein in die Zelle erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zelle eine Tumorzelle ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die ClD kodierende Nukleinsäuresequenz in einen Expressionsvektor inseriert ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das in der Zelle endogen enthaltene ClD-Gen stimuliert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5 , wobei der Promotor des endogenen ClD-Gens durch extrazelluläre Faktoren stimuliert wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Hemmung des Abbaus des ClD-Genprodukts bzw. ClD-Proteins durch mindestens einen Proteasomen-Inhibitor erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Proteasomen-Inhibitor
Benzyloxycarbonyl-leu-leu-norvalinal (MG115) ist.
9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Proteasomen-Inhibitor ein Polypeptid ist, das die ClD-Aminosäureseguenz von den Positionen 50 bis 90 umfaßt oder ein Fragment davon, das noch Ubiquitin-Reste binden kann.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Proteasomen- Inhibitor ein synthetisches Peptid ist, das die Lysinreste an den Positionen 54, 79 und/oder 84 der ClD Aminosäuresequenz abdeckt .
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 7 bis 10, wobei die ClD kodierende Nukleinsäuresequenz so verändert ist, dass das davon kodierte Genprodukt resistent gegenüber einem Abbau durch Proteasomen ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die ClD kodierende Nukleinsäuresequenz so verändert ist, dass die Aminosäuresequenz des ClD-Genprodukts zwischen den Positionen 50 bis 90 verändert ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die ClD kodierende Nukleinsäuresequenz so verändert ist, dass die Aminosäuresequenz des ClD-Genprodukts so verändert ist, dass ein, zwei oder drei Lysinreste an den Positionen 54, 79 und/oder 84 gegen andere Aminosäurereste ausgetauscht sind.
1 . Verfahren nach Anspruch 13 , wobei die anderen Aminosäurereste Argininreste sind.
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WO1999063071A2 (de) * 1998-06-03 1999-12-09 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Verfahren zur auslösung von apoptose in zellen

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