WO2001094570A2 - Transfektionsverfahren - Google Patents

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WO2001094570A2
WO2001094570A2 PCT/EP2001/006495 EP0106495W WO0194570A2 WO 2001094570 A2 WO2001094570 A2 WO 2001094570A2 EP 0106495 W EP0106495 W EP 0106495W WO 0194570 A2 WO0194570 A2 WO 0194570A2
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Hartmut Hahn
Hubert LÖWENHEIM
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Otogene Aktiengesellschaft
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    • C07K—PEPTIDES
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Definitions

  • the invention relates to a method for introducing substances into cells of sensory organs.
  • Gene and peptide therapeutic methods have long been used or tested to enable the treatment of a wide variety of diseases such as cancer, viral infections or degenerative processes of the cardiovascular and central nervous system.
  • Gene or peptide therapy is a medical procedure in which the malfunction or the undesired function of a defective gene or an undesired gene product is regulated by the artificial introduction of counteracting genes or peptides.
  • a gene in so-called gene therapy, a gene can be introduced into the cell which codes for a specific peptide or protein or which interacts with a gene sequence whose expression is not desired and thus prevents its expression (antisense technique).
  • a peptide or protein is introduced directly into the cell, which, for example, replaces a defective peptide or protein or which interacts with a peptide or protein of the cell, and thus inhibits or switches off its function, which is undesirable in this case ,
  • Each cell type in the organism is characterized by its specific gene expression pattern. Diseases that are not caused by Pathogens are usually triggered by a change in the gene expression pattern of any cell type or are the result of mutations of functionally and pathophysiologically important proteins. With gene or peptide therapy, there are basically two options for a causal molecular therapy:
  • gene therapy methods can be used to change the gene expression patterns of human cells in a targeted manner by introducing the corrected sequence desired in each case, d. H. the production of certain proteins can be initiated or prevented by the previously mentioned antisense technique;
  • functional aspects of certain proteins can be influenced by, for example, introducing interacting peptides or proteins into the cells.
  • a very common disease of the sensory organs includes diseases of the inner ear, especially hearing loss.
  • Hearing loss is one of the most common forms of chronic illnesses. For example, recent estimates from the 1994 US National Health Interview Survey showed that hearing loss is three times more common than diabetes. The number of hearing disorders is similar to the number of heart diseases or hypertension disorders.
  • Another indication for gene or peptide therapies are diseases of the optical apparatus.
  • Particularly degenerative diseases of the retina (retina) should be mentioned here.
  • age-related degeneration of the optical sensory cells can occur, which cannot be treated with conventional methods.
  • a prerequisite for a gene or peptide therapeutic approach is an effective transfer method that brings the respective nucleic acid or the peptide or protein into the target cell.
  • This is particularly difficult in the case of cells of sensory organs, since these cells appear in a compact and orderly assembly, by means of which the total area of the cell membranes which are freely accessible from the outside is largely minimized.
  • the inner hair sensory cells have two closely spaced cell membrane systems, the penetration of which is made difficult by molecules.
  • cells of the inner ear are extremely difficult to handle and to keep in culture in such a way that the cortico-organ's cytoarchitecture remains largely intact.
  • no reliable non- viral methods could be developed that ensure the transfer of nucleic acids and peptides / proteins into sensory cells.
  • the object of the invention is therefore to provide a non-viral method with which substances (active substances), in particular gene or peptide therapeutic substances, can be effectively introduced into cells of sensory organs.
  • substances active substances
  • This object is achieved by the use of the peptide penetratin, as set out in claim 1.
  • Preferred embodiments of this use are described in claims 2 to 13.
  • Claim 14 relates to a method for introducing substances into sensory cells and Claims 15 and 16 to a corresponding kit.
  • Claims 17 to 23 relate to the use of penetratin for the manufacture of medicaments. The wording of all claims is hereby incorporated by reference into the content of the description.
  • the peptide penetratin or sequences derived therefrom are used for introducing substances into cells of sensory organs (in vivo and in vitro).
  • Penetratin in the narrower sense is a 16-amino acid peptide which is derived from the homeodomain of the Antennapedia gene of Drosophila (Derossi et. Al., Cell Biology 1998, 8, 84-87). This peptide is part of the homeobox sequence, which makes up a total of 60 amino acids and is part of many conserved homeoproteins of various origins. Homeoproteins are able to bind to certain areas of DNA, the so-called consensus sequences.
  • sequence of penetratin in the narrower sense comprises the following amino acids:
  • the invention further encompasses various modifications of this sequence and sequences which contain the sequences mentioned as part. These sequences derived from penetratin in the narrower sense are summarized under the generic term penetratin. The use of such derived sequences is also covered by the invention.
  • the different derived sequences are shown below. For easier understanding, the different positions of the penetratin sequence are designated Xi to Xi ⁇ . On the one hand, the derived sequences include the retroform of penetratin, ie the sequence in reverse orientation. The derived sequences continue to be the To understand sequences that have the following deviations from the peptide sequence shown above (the different amino acids are represented by the one-letter code).
  • the invention further relates to sequences of 16-amino acids, 6 to 10 amino acids, preferably 6, being hydrophobic and X ⁇ being tryptophan or X 3 and X 5 being valine.
  • Hydrophobic amino acids are to be understood as alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), proline (P), phenylalanine (F), tryptophan (W) and methionine (M).
  • X1, X 2 , X 4 , Xg, X 15 and X 16 are non-hydrophobic amino acids and X3, X7 and X14 are hydrophobic amino acids, where X 14 is preferably tryptophan (W) or isoleucine (I). In a further embodiment, at least one of the amino acids X3, X 7 or X 4 is proline (P).
  • the cells of sensory organs, into which substances are introduced through the use of penetratin are cells of the ear and, in particular, the inner ear.
  • Cells of the inner ear for example the supporting cells of the Cortic organ, are very difficult to access using conventional methods.
  • the cultivation of such cells outside the organism is very difficult and problematic, so that it has not yet been possible to develop acceptable non-viral transfection methods for the cells of the inner ear.
  • penetratin or sequences derived therefrom are used in order to introduce desired substances into the cells of the inner ear. This method according to the invention makes it possible to make cells of sensory organs, in particular of the inner ear, accessible for gene or peptide therapeutic treatment approaches.
  • the cells into which substances according to the invention are introduced are supporting and hair sense cells of the cortic organ, neurons of the auditory nerve, cells of the vestibular organ and / or neurons of the vestibular nerve. So far, these cells have also been introduced of substances have not been accessible. With the method according to the invention, it is now possible to treat these cells with the therapeutic approaches described.
  • the cells of sensory organs into which substances are introduced by means of penetratin or sequences derived therefrom, are cells of the eye.
  • the cells in particular the sensory cells of the retina, ie the retina, are particularly preferred.
  • the treatment according to the invention of the so-called Müller cells in the eye which correspond to the supporting cells of the Cortic organ in the ear, and / or the neurons of the optical nerve, is particularly advantageous. Even with these cells, it has not been possible to carry out effective treatment using conventional methods.
  • Penetratin or the sequences derived therefrom are advantageously coupled to the substances which are to be introduced into the cells according to the invention.
  • the coupling can be covalent or non-covalent.
  • covalent coupling of the substances to penetratin or the derived sequences is particularly preferred. This can be achieved, for example, by seamless further synthesis of the C- to N-terminus of the peptide sections involved.
  • the C and N terminus can consist of cysteines, so that covalent bonds are formed by disulfide bridges.
  • the coupling of different spacer molecules one or more, also in combination
  • B. epsilon-caproic acid, beta-alanine or other aliphatic chains is a further possibility for covalent couplings.
  • non-covalent coupling possibilities include, for example, coupling via ionic interactions, direct steric fit (including various non-covalent force contributions are to be understood) as well as indirect steric fit via third partners.
  • the substances which are introduced into the cells via penetratin or sequences derived therefrom are peptides and / or proteins.
  • covalent coupling is preferred.
  • the coupling of the substances to penetratin or the sequences derived therefrom takes place, for example, in that penetratin or the sequences derived therefrom and the substance to be introduced (peptide or protein) are encoded on the same recombinant nucleic acid molecule, so that by translating this nucleic acid molecule the two components as a coherent Molecule are formed.
  • the order of the two components can be varied here and further constituents can also be inserted into the connected molecule, for example different labels (marking molecules) or spacer regions.
  • the substances to be introduced are nucleic acids. These can be provided to exert their effect in the cell as nucleic acid, for example as an antisense sequence. Furthermore, these nucleic acids can be intended to be translated in the cell and thus to act as a peptide or protein in the cell.
  • the nucleic acids to be introduced can also be covalently coupled to penetratin or the sequences derived therefrom, or the nucleic acids can be otherwise associated with penetratin or the sequences derived therefrom. With such a different association, however, it is advantageous if the two components are relatively firmly associated with one another, so that there is no separation of the components during the transfer into the cell.
  • the substances to be introduced are so-called "small molecules". This includes small molecules, which in particular have a molecular weight of less than about 1000 Da. Classic pharmaceutical molecules usually fall in this range.
  • substances which influence the cell cycle of the cell are introduced into the cell with the aid of the use according to the invention. It is particularly advantageous here to stimulate the cell cycle, particularly in the case of cells that would normally no longer divide, that is to say are terminally differentiated. This can be useful, for example, to regenerate new sensory cells in the inner ear or in the retina that would not be regenerable under normal circumstances.
  • the substances to be introduced are advantageously substances which have an inhibitory effect on cell cycle inhibitors. This can in particular influence the cell cycle, advantageously stimulation.
  • a suitable cell cycle inhibitor which can be inhibited by the substances to be introduced is, for example, a cyclin kinase inhibitor.
  • the cyclin kinase inhibitor p27 K ⁇ p1 is particularly preferred as a point of attack for inhibition by the substance to be introduced.
  • a potentially particularly suitable substance for inhibiting this cyclin kinase inhibitor is a peptide of the sequence tyrosine (Y) - glutamic acid (E) - tryptophan (W) - glutamine (Q) - glutamic acid (E) - valine (V) - glutamic acid (E) - Lysine (K) - glycine (G) or a substance containing this peptide or a nucleic acid which codes for this peptide.
  • the penetratin or the sequence derived therefrom is provided in a concentration between 100 nm and 100 ⁇ m. Within this concentration range, concentrations between 10 ⁇ m and 60 ⁇ m, in particular between 20 ⁇ m and 50 ⁇ m, are preferred.
  • penetratin is used together with a negatively charged excipient.
  • This can further improve the transfection properties of penetratin in the inner ear system.
  • the inner ear can preferably be accessed, for example, by application of the corresponding substances into the tympani scale. This can be done either directly through an opening in the Scala tympani or through the round window of the cochlea.
  • the substances to be introduced In order to reach the target cells, that is to say in particular the hair cells or supporting cells on the basilar membrane in the Scala media, the substances to be introduced must cross the basilar membrane, which essentially represents an electrostatic barrier.
  • the use of negatively charged excipients significantly improves the passage of the molecules to be introduced through the basilar membrane.
  • the use of sodium dodecyl sulfate (SDS) is particularly preferred.
  • a large number of conventional substances with corresponding properties can also be considered as negatively charged auxiliaries.
  • the invention comprises a method for introducing substances into cells of sensory organs, wherein penetratin or sequences derived therefrom are used as described above.
  • the invention further comprises a kit for introducing substances into cells of sensory organs.
  • a corresponding kit comprises at least penetratin or a sequence derived therefrom and at least one substance as described above.
  • this substance is preferably coupled to penetratin or the sequence derived therefrom, in particular covalently coupled.
  • a suitable kit can additionally comprise, for example, buffer substances and / or suitable information about the concentration to be used, incubation times or the like.
  • the invention comprises the use of penetratin or a sequence derived therefrom as a means of transport for the manufacture of medicaments for the treatment of diseases of sensory organs.
  • Medicaments of this type are advantageously provided for the treatment of diseases of the ear, in particular the inner ear.
  • medicaments of this type are provided for the treatment of diseases of the eye, in particular the retina.
  • the medication is prepared according to methods familiar to the person skilled in the art, the medication being formulated and provided with regard to systemic administration or, particularly advantageously, with regard to local administration, in particular for the ear or for the eye.
  • FIG. 1 Transfection of supporting cells of the cortic organ with penetratin FITC (fluorescein isothiocyanate). Left: Alexa 568 staining of the cytoskeleton; Middle: FITC staining of the transfected penetratin; right: DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindo) cell staining.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Left Alexa 568 staining of the cytoskeleton
  • Middle FITC staining of the transfected penetratin
  • right DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindo) cell staining.
  • the same tissue section of a Cortic organ is shown in all three images. The arrows mark a penetratin-transfected support cell.
  • Figure 2 Transfection of hair cells of the Cortic organ in mouse organ cultures with FITC penetratin-p27ß. FITC staining of the transfected peptide.
  • Figure 3 Transfection of hair cells of the Cortic organ in mouse organ cultures with FITC penetratin-p27ß. Alexa-phalloidin staining of the cytoskeleton of the hair cells.
  • Figure 4 Transfection of hair cells of the Cortic organ in organ cultures of the guinea pig, age 6 weeks. (10 ⁇ M, acute scala media perfusion (15 min + 2h), cryosection (7 ⁇ m), cortic organ in the area of the hook, biotin detection as a stain, Chromogen AEC, stained basilar membrane)
  • Figure 5 Transfection of hair cells of the Cortic organ in organ cultures of guinea pigs, age 6 weeks. (25 ⁇ M, acute scala media perfusion (15 min + 2h), cortic organ in the area of the first turn, biotin detection as staining, Chromogen AEC, colored Deiters cells)
  • Figure 6 Transfection of hair cells of the Cortic organ in guinea pig organ cultures, age 6 weeks. (25 ⁇ M + 0.1 mM SDS, acute scala tympani perfusion (30 min + 2h), Corticians Organ in the area of the first turn, biotin detection as coloring, chromogen AEC, colored outer and inner hair cells).
  • Figure 7 Transfection of hair cells of the Cortic organ in organ cultures of guinea pigs, age 6 weeks. (FITC 10 ⁇ M + 0.05 mM SDS, chronic Scala tympani perfusion (7 days, 12 ⁇ l / d), cortical organ in the area of the first turn, immunohistochemical detection of FITC as a stain, Chromogen DAB, colored Deiters cells and an outer hair cell ).
  • the Cortic organ is taken from a mouse in postnatal stage P3 (postnatal day 3).
  • the cultivation is initially carried out overnight in MEM D-Val medium (culture medium, from Life Technologies) which contains 10% FBS (fetal calf serum) and 5 mM glutamine.
  • FBS fetal calf serum
  • 1 mM neomycin is added to the culture medium for 48 hours. Due to the neomycing administration, the hair cells of the Cortic organ die.
  • a media change is carried out, in which the culture medium described above is applied again without neomycin.
  • the transfection with penetratin-FITC concentration 50 ⁇ M takes place on the sixth day. The duration of the transfection is six hours.
  • Example 2 Transfection of hair cells of the Cortic organ with penetratin-p27ß
  • a peptide was synthesized which, in addition to the FITC label, comprises the sequence of penetratin (RQIKI WFANR RMKWK K) and p27 (YEWQ EVEKG). Beta-alanine was used as the linker molecule between the two sections. The sequence of both peptide components was thus RQIKI WFANR RMKWK K-beta-alanine-YEWQ EVEKG. The molecular weight of this peptide was 3869.3 daltons.
  • the cochlea was removed from the animal and the cortical organ was subsequently exposed by microsection. With the help of a cell adhesive, the preparation was fixed on a cover glass and cultivated for 24 hours. Neurobasal medium with B27 (culture medium additive, Life Technologies) and 0.1% serum was used as the culture medium. The peptide was transfected in serum-free culture medium (3 hours, 50 ⁇ M). After the transfection, the preparation was fixed with 4% paraformaldehyde and stained with the red-orange fluorescent Alexa phalloidin (20 mg / ml).
  • FIG. 2 shows the successful transfection with the peptide, visible through the FITC staining.
  • FIG. 3 shows the same section of the cortic organ after Alexa phalloidin staining, which makes the structure of the cytoskeleton visible.
  • FIG. 4 shows a histological section through the Cortic organ.
  • biotinilated penetratin sequence: Biotin-beta-alanine-RQIKI WFANR RMKWK K
  • Biot penetratin Biot penetratin
  • FIG. 5 shows a weak labeling of the cells on the basilar membrane after application of the labeled peptide to the scala media.
  • FIG. 6 and FIG. 5 show an application of Biot penetratin in the scala tympani, SDS additionally being used here. The marked marking of the cells on the basilar membrane is clearly visible.
  • FIG. 7 shows a section through a basilar membrane treated as described above. The marking of the nuclei of the hair and support cells can be clearly seen.

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Abstract

Substances are introduced into the cells of sensory organs by using penetratin or a sequence derived therefrom. The use of penetratin according to the invention allows gene or peptide therapeutic substances to be introduced effectively into the cells of sensory organs, in order to treat diseases of the corresponding organs in this manner. The invention enables diseases of the ear, in particular of the inner ear, or diseases of the eye, in particular of the retina, to be treated in a particularly advantageous manner.

Description

Transfektionsverfahren
Beschreibung:
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einbringen von Substanzen in Zellen sensorischer Organe.
Gen- und peptidtherapeutische Verfahren werden seit längerem eingesetzt bzw. getestet, um die Behandlung einer großen Vielfalt von Krankheiten wie Krebs, virale Infektionen oder degenerative Prozesse des Herz-Kreislauf- und des Zentralnervensystems zu ermöglichen.
Die Gen- oder Peptidtherapie ist ein medizinisches Verfahren, bei welchem die Fehlfunktion oder die nicht erwünschte Funktion eines defekten Gens oder eines unerwünschten Genprodukts durch das künstliche Einbringen von gegensteuernden Genen oder Peptiden reguliert wird.
Bei der sogenannten Gentherapie kann ein Gen in die Zelle eingebracht werden, welches für ein bestimmtes Peptid oder Protein kodiert oder welches mit einer Gensequenz, deren Expression nicht gewünscht ist, interagiert und somit deren Expression verhindert (Antisense-Technik). Bei dem Verfahren der Peptidtherapie wird ein Peptid oder Protein direkt in die Zelle eingebracht, welches beispielsweise ein defektes Peptid oder Protein ersetzt oder welches mit einem Peptid oder Protein der Zelle interagiert, und somit dessen Funktion, die in diesem Falle unerwünscht ist, hemmt oder ausschaltet.
Jeder Zelltyp im Organismus ist durch sein spezifisches Genexpressionsmuster gekennzeichnet. Krankheiten, die nicht durch Erreger verursacht werden, werden in der Regel durch die Veränderung des Genexpressionsmusters irgendeines Zelltyps ausgelöst oder sind die Folge von Mutationen funktioneil und pathophysiologisch bedeutender Proteine. Damit bieten sich mit der Gen- bzw. Peptidtherapie grundsätzlich zwei Möglichkeiten einer ursächlichen molekularen Therapie an:
(a) auf Nukleinsäureebene lassen sich mit Hilfe von gentherapeutischen Verfahren die Genexpressionsmuster von menschlichen Zellen durch Einbringen der jeweils gewünschten korrigierten Sequenz gezielt verändern, d. h. die Produktion bestimmter Proteine kann initiiert werden oder durch die bereits erwähnte Antisense-Technik unterbunden; (b) auf der Proteinebene lassen sich funktioneile Aspekte von bestimmten Proteinen dadurch beeinflussen, dass man beispielsweise mit diesen interagierende Peptide oder Proteine in die Zellen einbringt.
Von besonderem Interesse ist eine Behandlung mit gen- oder peptidtherapeutischen Verfahren bei Erkrankungen der sensorischen Organe. Derartige Erkrankungen, die beispielsweise mit einer Degeneration von Sinneszellen einhergehen können, sind bisher in der Regel nicht zu behandeln gewesen. Der besonders kritische Punkt hierbei ist, dass Sinneszellen beim Menschen in der Regel nicht zu einer Regeneration fähig sind. Mit herkömmlichen Methoden, z. B. operativen Eingriffen, ist hier relativ wenig auszurichten, so dass besonders in den Fällen von Krankheiten sensorischer Organe neuartige Behandlungsme- thoden notwendig sind.
Zu einer sehr häufigen Erkrankung von Sinnesorganen zählen Erkrankungen des Innenohres, insbesondere die Schwerhörigkeit. Schwerhörigkeit zählt zu den häufigsten Formen von chronischen Erkrankungen überhaupt. Aktuelle Schätzungen des US National Health Interview Survey von 1994 ergaben beispielsweise, dass Schwerhörigkeit dreimal häufiger vorkommt als Diabetes. Die Anzahl von Hörstörungen ist ähnlich hoch wie die Anzahl an Herzerkrankungen oder an Bluthochdruckstörungen-.
Den meisten Fällen von sensorineuralen Hörminderungen liegt ein irreversibler Verlust von speziellen Zellen des Innenohres zugrunde. Der Verlust dieser Zellen, der Haarsinneszellen, kann durch viele Faktoren, wie z. B. durch degenerative Alterungsprozesse (Presbycusus), Schädigung durch Lärm, Infektionen, genetische Störungen, Autoimmunerkrankungen oder auch Arzneimittel (Antibiotika oder Chemotherapie) hervorgerufen werden. Alle diese Erkrankungen des Innenohres stellen Beispiele für Indikationen einer Gen- oder Peptidtherapie dar.
Eine weitere Indikation für Gen- oder Peptidtherapien sind Erkrankungen des optischen Apparates. Hierbei sind besonders degenerative Erkrankungen der Netzhaut (Retina) zu nennen. Beispielsweise altersbedingt kann es hier zu einer Degeneration der optischen Sinneszellen kommen, die mit herkömmlichen Methoden nicht behandelbar ist.
Voraussetzung für einen gen- oder peptidtherapeutischen Behandlungsansatz ist eine effektive Transfermethode, die die jeweilige Nukleinsäure oder das Peptid oder Protein in die Zielzelle bringt. Dies bereitet insbesondere bei Zellen sensorischer Organe Schwierigkeiten, da diese Zellen in einem kompakten und geordneten Verband auftreten, durch den die Gesamtfläche der von außen frei zugänglichen Zellmembranen weitgehend minimiert ist. Weiterhin haben die inneren Haarsinneszellen zwei eng aneinanderliegende Zellmembransysteme, deren Penetration durch Moleküle erschwert ist. Generell sind Zellen des Innenohres äußerst schwer zu handhaben und so in Kultur zu halten, dass die Zytoarchitektur des Cortiorgans weitgehend intakt bleibt. Das hat dazu geführt, dass bisher noch keine zuverlässigen nicht- viralen Methoden entwickelt werden konnten, die den Transfer von Nukleinsäuren und Peptiden/Proteinen in Sinneszellen gewährleisten.
Die Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, ein nicht-virales Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit welchem Substanzen (Wirkstoffe), insbesondere gen- oder peptidtherapeutische Substanzen, in Zellen sensorischer Organe effektiv eingebracht werden können. Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung des Peptids Penetratin, wie sie im Anspruch 1 dargestellt ist. Bevorzugte Ausführungsformen dieser Verwendung sind in der Ansprüchen 2 bis 13 beschrieben. Der Anspruch 14 betrifft ein Verfahren zum Einbringen von Substanzen in sensorische Zellen und die Ansprüche 15 und 16 einen entsprechenden Kit. Ansprüche 17 bis 23 beziehen sich auf eine Verwendung von Penetratin zur Herstellung von Medikamenten. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Erfindungsgemäß wird das Peptid Penetratin oder hiervon abgeleitete Sequenzen für das Einbringen von Substanzen in Zellen sensorischer Organe (in vivo und in vitro) verwendet. Als Penetratin im engeren Sinne wird ein 16 Aminosäuren langes Peptid bezeichnet, welches sich aus der Homeodomäne des Antennapedia-Gens von Drosophila ableitet (Derossi et. al., Cell Biology 1998, 8, 84-87). Dieses Peptid ist ein Teil der Homeobox-Sequenz, welche insgesamt 60 Aminosäuren ausmacht und die Teil von vielen konservierten Homeoproteinen verschiedenen Ursprungs ist. Homeoproteine sind in der Lage, an bestimmte Bereiche der DNA, an die sog. Konsensussequenzen, zu binden. Man nimmt an, dass die natürliche Funktion von Homeoproteinen die Regulation der Genexpression ist, und dass Homeoproteine entscheidend an entwicklungsphysiologischen Vorgängen beteiligt sind. Darüberhinaus konnte gezeigt werden, dass Penetratin in der Lage ist, in Zellen einzudringen und sich im Zellkern anzuhäufen (EP 0 485 578 B1 ). -
Überraschenderweise konnte nun gezeigt werden, dass durch die Verwendung von Penetratin das besondere Transfektionsproblem bei Zellen sensorischer Organe gelöst werden kann. Mit dieser neuen Verwendung von Penetratin ist es daher möglich, gen- oder peptidtherapeutische Ansätze zur Behandlung von Erkrankungen sensorischer Organe einzusetzen.
Die Sequenz von Penetratin im engeren Sinne umfasst die folgenden Aminosäuren:
Arginin (R) - Glutamin (Q) - Isoleucin (I) - Lysin (K) -Isoleucin (I) - Trypto- phan (W) - Phenylalanin (F) - Glutamin (Q) - Asparagin (N) - Arginin (R) - Arginin (R) - Methionin (M) - Lysin (K) - Tryptophan (W) - Lysin (K) - Lysin (K)
Weiterhin werden von der Erfindung verschiedene Abwandlungen dieser Sequenz sowie Sequenzen, die die genannten Sequenzen als einen Teil enthalten, umfasst. Diese vom Penetratin im engeren Sinne abgeleiteten Sequenzen werden unter dem "Oberbegriff Penetratin zusammengefasst. Die Verwendung solcher abgeleiteter Sequenzen ist ebenfalls von der Erfindung erfasst.
Im folgenden werden die verschiedenen abgeleiteten Sequenzen dargestellt. Hierbei werden zum einfacheren Verständnis die verschiedenen Positionen der Penetratin-Sequenz mit Xi bis Xiβ bezeichnet. Zum einen zählt zu den abgeleiteten Sequenzen die Retroform von Penetratin, d. h. also die Sequenz in umgekehrter Orientierung. Unter abgeleiteten Sequenzen sind weiterhin die Sequenzen zu verstehen, die folgende Abweichungen von der oben dargestellten Peptidsequenz aufweisen (die verschiedenen Aminosäuren sind durch den Ein-Buchstabencode dargestellt).
1. X8-A
2. X8-P
3. X3-P, Xs-P, X12-K, X13-P
Figure imgf000007_0001
6. X4-R, X13-R, X15-R, Xie-R
7. X2-R, X3-W, X4-R, X5-R, X7-W, X8-R, Xg-R, X10-W, Xn-W, X12-R,
Figure imgf000007_0002
Weiterhin betrifft die Erfindung Sequenzen aus 16 -Aminosäuren, wobei 6 bis 10 Aminosäuren, vorzugsweise 6, hydrophob sind und Xβ Tryptophan ist oder X3 und X5 Valin sind. Unter hydrophoben Aminosäuren sind Alanin (A), Valin (V), Leucin (L), Isoleucin (I), Prolin (P), Phenylalanin (F), Tryptophan (W) und Methionin (M) zu verstehen. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Sequenzen sind X1, X2, X4, Xg, X15 und X16 nicht-hydrophobe Aminosäuren und X3, X7 und X14 hydrophobe Aminosäuren, wobei X14 vorzugsweise Tryptophan (W) oder Isoleucin (I) ist. In einer weiteren Ausführungsform ist wenigstens eine der Aminosäuren X3, X7 oder Xι4 Prolin (P).
Die erfindungsgemäße Wirkung wird weiterhin mit Peptiden erzielt, die die oben genannten Sequenzen lediglich als einen Bestandteil enthalten.
Neben diesen Sequenzen werden auch die jeweiligen Retroformen von der Erfindung umfasst. In der EP 0 485 578 B1 wird gezeigt, daß
Homeobox-Peptide prinzipiell in der Lage sind, die Membranschranken von Zellen zu durchqueren und so in die Zellen einzudringen. Dies geschieht ohne eine spezifische und aktive Rezeptorvermittlung. Es gibt starke Hinweise dafür, dass die Membranpassage von solchen Peptiden ein rein entropisches Phänomen ist, bei dem Peptidseiten ketten mit geladenen Phosphopeptidketten der Membran interagieren. Die dadurch induzierte Destabilisierung der membranären Lipiddoppelschicht führt zum Einschluß der Peptidmoleküle in inverse Micellen, die, vergleichbar mit Liposomen ins Innere der Zelle hineinbefördert werden. Die WO 97/12912 A1 zeigt, dass nicht nur die als Penetratin bezeichnete Sequenz des Antennapedia-Gens aus Drosophila, sondern auch hiervon abgeleitete Sequenzen zum Eindringen in Zellen in der Lage sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Zellen sensorischer Organe, in welche durch die Verwendung von Penetratin Substanzen eingebracht werden, Zellen des Ohres und hierbei insbesondere des Innenohres. Zellen des Innenohres, beispielsweise die Stützzellen des Cortischen Organs, sind mit herkömmlichen Methoden sehr schwer erreichbar. Außerdem ist die Kultivierung solcher Zellen außerhalb des Organismus sehr schwierig und problematisch, so dass es bisher noch nicht gelungen ist, für die Zellen des Innenohres akzeptable nicht-virale Transfektionsmethoden zu entwickeln. Erfindungsgemäß werden nun Penetratin bzw. hiervon abgeleitete Sequenzen eingesetzt, um jeweils gewünschte Substanzen in die Zellen des Innenohres einzubringen. Durch diese erfindungsgemäße Methode ist es möglich, Zellen sensorischer Organe, insbesondere des Innenohres, für gen- oder peptidtherapeutische Behandlungsansätze zugänglich zu machen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Zellen, in welche erfindungsgemäß Substanzen eingebracht werden, Stütz- und Haarsinneszellen des Cortischen Organs, Neuronen des auditorischen Nervs, Zellen des Vestibularorgans und/oder Neuronen des Vestibularnervs. Auch diese Zellen sind bisher für das Einbringen von Substanzen nicht zugänglich gewesen. Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es nun möglich, diese Zellen mit den beschriebenen therapeutischen Ansätzen zu behandeln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Zellen sensorischer Organe, in welche Substanzen mittels Penetratin oder davon abgeleitete Sequenzen eingebracht werden, Zellen des Auges. Besonders bevorzugt sind hierbei die Zellen, insbesondere die Sinneszellen der Retina, also der Netzhaut. Besonders vorteilhaft ist die erfindungsgemäße Behandlung der sog. Müllerzellen im Auge, die den Stützzellen des Cortischen Organs im Ohr entsprechen, und/oder der Neuronen des optischen Nervs. Auch bei diesen Zellen war es bisher nicht möglich, mit herkömmlichen Methoden eine effektive Behandlung durchzuführen.
Vorteilhafterweise ist Penetratin oder die davon abgeleiteten Sequenzen an die Substanzen gekoppelt, die in die Zellen erfindungsgemäß eingebracht werden sollen. Die Kopplung kann kovalent oder nicht- kovalent sein. Besonders bevorzugt ist hierbei jedoch eine kovalente Kopplung der Substanzen an Penetratin oder die abgeleiteten Sequenzen. Dies kann beispielsweise erreicht werden durch eine lückenlose Weitersynthese von C- auf N-Terminus der beteiligten Peptidabschnitte. Weiterhin kann der C- und N-Terminus aus Cysteinen bestehen, so dass kovalente Bindungen durch Disulfidbrücken gebildet werden. Die Einkopplung verschiedener Spacer-Moleküle (ein oder mehrfach, auch in Kombination) wie z. B. epsilon-Capronsäure, beta- Alanin oder sonstige aliphatische Ketten, stellt eine weitere Möglichkeit für kovalente Kopplungen dar. Es sind jedoch auch andere, insbesondere nicht-kovalente Kopplungsmöglichkeiten mit von der Erfin- düng umfasst. Hierzu zählen beispielsweise eine Kopplung über ionische Wechselwirkungen, direkte sterische Passung (worunter verschiedene nicht-kovalente Kraftbeiträge zu verstehen sind) sowie indirekte sterische Passung über dritte Partner.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den Substanzen, die über Penetratin oder hiervon abgeleitete Sequenzen in die Zellen eingebracht werden, um Peptide und/oder Proteine. Insbesondere bei dieser Substanzklasse ist eine kovalente Kopplung bevorzugt. Die Kopplung der Substanzen an Penetratin oder die davon abgeleiteten Sequenzen erfolgt beispielsweise dadurch, dass Penetratin oder die davon abgeleiteten Sequenzen und die einzubringende Substanz (Peptid oder Protein) auf demselben rekombinanten Nukleinsäuremolekül kodiert sind, so dass durch Translation dieses Nukleinsäuremoleküls die beiden Komponenten als ein zusammenhängendes Molekül gebildet werden. Hierbei kann die Reihenfolge beider Komponenten variiert werden und es können auch weitere Bestandteile in das zusammenhängende Molekül eingefügt werden, beispielsweise verschiedene Label (Markierungsmoleküle) oder Spacerbereiche.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die einzubringenden Substanzen Nukleinsäuren. Diese können dazu vorgesehen sein, ihren Effekt in der Zelle als Nukleinsäure, beispielsweise als Antisense-Sequenz auszuüben. Weiterhin können diese Nukleinsäuren dafür vorgesehen sein, in der Zelle translatiert zu werden und somit als Peptid oder Protein in der Zelle zu wirken. Die einzubringenden Nukleinsäuren können ebenfalls kovalent an Penetratin oder die davon abgeleiteten Sequenzen gekoppelt sein oder die Nukleinsäuren können anderweitig mit Penetratin oder den hiervon abgeleiteten Sequenzen assoziiert sein. Bei einer solchen anderweitigen Assoziierung ist es allerdings vorteilhaft, wenn die beiden Komponenten relativ fest miteinander assoziiert sind, so dass während des Transfers in die Zelle keine Trennung der Komponenten erfolgt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den einzubringenden Substanzen um sogenannte "small molecules", also kleine Moleküle. Hierunter sind kleine Moleküle zu verstehen, die insbesondere ein Molekülgewicht von weniger als etwa 1000 Da aufweisen. In dieser Größenordnung fallen üblicherweise die klassischen Pharmamoleküle.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verwendung Substanzen in die Zelle eingebracht, die den Zellzyklus der Zelle beeinflussen. Besonders vorteilhaft ist hierbei eine Stimulierung des Zellzyklus, insbesondere bei Zellen, die sich normalerweise nicht mehr teilen würden, also terminal differenziert sind. Dies kann beispielsweise sinnvoll sein, um neue Sinneszellen im Innenohr oder in der Netzhaut zu regenerieren, die unter normalen Umständen nicht regenerierbar wären.
Vorteilhafterweise handelt es sich bei den einzubringenden Substanzen um Substanzen, die hemmend auf Zellzyklus-Inhibitoren wirken. Hierdurch kann insbesondere eine Beeinflussung des Zellzyklus, vorteilhafterweise eine Stimulierung, erreicht werden. Ein geeigneter Zellzyklus-Inhibitor, der durch die einzubringenden Substanzen gehemmt werden kann, ist beispielsweise ein Zyklinkinase-Inhibitor. Besonders bevorzugt ist hierbei der Zyklinkinase-Inhibitor p27Kιp1 als Angriffspunkt für eine Hemmung durch die einzubringende Substanz. Eine potentiell besonders geeignete Substanz zur Hemmung dieses Zyklinkinase-Inhibitors ist ein Peptid der Sequenz Tyrosin (Y) - Glutaminsäure (E) - Tryptophan (W) - Glutamin (Q) - Glutaminsäure (E) - Valin (V) - Glutaminsäure (E) - Lysin (K) - Glycin (G) oder eine dieses Peptid enthaltende Substanz bzw. eine Nukleinsäure die für dieses Peptid kodiert. Gemäß der Erfindung ist das Penetratin oder die davon abgeleitete Sequenz in einer Konzentration zwischen 100 nm und 100 μm vorgesehen. Innerhalb dieses Konzentrationsbereiches sind Konzentrationen zwischen 10 μm und 60 μm, insbesondere zwischen 20 μm und 50 μm bevorzugt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Penetratin zusammen mit einem negativ geladenen Hilfsstoff verwendet. Gemeint sind hiermit (vorzugsweise organische) Substanzen, die zumindest in Lösung, d. h. vorzugsweise in den hier verwendbaren Applikationssystemen eine negative (Rest-/Überschuß-) Ladung aufweisen. Hierdurch können die Transfektionseigenschaften von Penetratin im System Innenohr weiter verbessert sein. Der Zugang zum Innenohr kann beispielsweise bevorzugt durch Applikation der entsprechenden Substanzen in die Scala tympani erfolgen. Dies kann entweder direkt durch eine Öffnung in der Scala tympani oder durch das runde Fenster der Cochlea. Um zu den Zielzellen zu gelangen, das heißt also insbesondere zu den Haarzellen oder Stützzellen auf der Basilarmembran in der Scala media, müssen die einzubringenden Substanzen die Basilarmembran überqueren, welche im wesentlichen eine elektrostatische Barriere darstellt. Durch den Einsatz von negativ geladenen Hilfsstoffen wird der Durchtritt der einzubringenden Moleküle durch die Basilarmembran entscheidend verbessert. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Sodium Dodecyl Sulfat (SDS). Als negativ geladene Hilfsstoffe kommen darüber hinaus eine Vielzahl herkömmlicher Substanzen mit entsprechenden Eigenschaften in Frage.
Ferner umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Einbringen von Substanzen in Zellen sensorischer Organe, wobei Penetratin oder hiervon abgeleitete Sequenzen gemäß der vorhergehenden Beschreibung verwendet werden. Weiterhin umfasst die Erfindung einen Kit zum Einbringen von Substanzen in Zellen sensorischer Organe. Ein entsprechender Kit umfasst zumindest Penetratin oder eine davon abgeleitete Sequenz und mindestens eine Substanz gemäß der obigen Beschreibung. Hierbei ist diese Substanz vorzugsweise an Penetratin oder die davon abgeleitete Sequenz gekoppelt, insbesondere kovalent gekoppelt. Weiterhin kann ein geeigneter Kit zusätzlich beispielsweise Puffersubstanzen und/oder geeignete Informationen über einzusetzende Konzentration, Inkubationszeiten oder ähnliches umfassen.
Schließlich umfasst die Erfindung die Verwendung von Penetratin oder einer davon abgeleiteten Sequenz als Transportmittel, zur Herstellung von Medikamenten für die Behandlung von Krankheiten sensorischer Organe. Vorteilhafterweise sind derartige Medikamente für die Behandlung von Krankheiten des Ohres, insbesondere des Innenohres vorgesehen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind derartige Medikamente für die Behandlung von Krankheiten des Auges, insbesondere der Netzhaut (Retina) vorgesehen. Die Zubereitung der Medikamente erfolgt nach dem Fachmann geläufigen Methoden, wobei die Medikamente im Hinblick auf eine systemische Applikation oder, besonders vorteilhaft, im Hinblick auf eine lokale Applikation, insbesondere für das Ohr oder für das Auge, formuliert und bereitgestellt werden. Bezüglich der weiteren Ausgestaltung dieses Aspektes der Erfindung wird auf die obige Beschreibung verwiesen.
Die beschriebenen Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen, wobei jedes der individuellen Merkmale für sich oder in Kombination mit anderen verwirklicht sein kann.
Die Figuren zeigen: - Figur 1 : Transfektion von Stützzellen des Cortischen Organs mit Penetratin-FITC (Fluorescein-Isothiocyanat). Links: Alexa 568-Färbung des Cytoskeletts; Mitte: FITC-Färbung des transfizierten Penetratins; rechts: DAPI(4,6-Diamidino-2-phenylindo)-Zellkemfärbung. In allen drei Bildern ist der gleiche Gewebeabschnitt eines Cortischen Organs dargestellt. Die Pfeile markieren eine Penetratin-transfizierte Stützzelle.
Figur 2: Transfektion von Haarzellen des Cortischen Organs in Organkulturen der Maus mit FITC-Penetratin-p27ß. FITC-Färbung des transfizierten Peptids.
Figur 3: Transfektion von Haarzellen des Cortischen Organs in Organkulturen der Maus mit FITC-Penetratin-p27ß. Alexa-Phalloidin- Färbung des Cytoskeletts der Haarzellen.
Figur 4: Transfektion von Haarzellen des Cortischen Organs in Organkulturen des Meerschweinchens, Alter 6 Wochen. (10 μM, akute Scala media Perfusion (15 min + 2h), Kryo-Schnitt (7 μm), Cortisches Organ im Bereich des Hakens, Biotin-Nachweis als Färbung, Chromogen AEC, Basilarmembran gefärbt)
Figur 5: Transfektion von Haarzellen des Cortischen Organs in Organkulturen des Meerschweinchens, Alter 6 Wochen. (25 μM, akute Scala media Perfusion (15 min + 2h), Cortisches Organ im Bereich der ersten Windung, Biotin-Nachweis als Färbung, Chromogen AEC, gefärbte Deiterszellen)
Figur 6: Transfektion von Haarzellen des Cortischen Organs in Organkulturen des Meerschweinchens, Alter 6 Wochen. (25 μM + 0,1 mM SDS, akute Scala tympani Perfusion (30 min + 2h), Cortisches Organ im Bereich der ersten Windung, Biotin-Nachweis als Färbung, Chromogen AEC, gefärbt sind äußere und innere Haarzellen).
Figur 7: Transfektion von Haarzellen des Cortischen Organs in Organkulturen des Meerschweinchens, Alter 6 Wochen. (FITC 10 μM + 0,05 mM SDS, chronische Scala tympani Perfusion (7 Tage, 12 μl/d), Cortisches Organ im Bereich der ersten Windung, immunhistochemischer Nachweis von FITC als Färbung, Chromogen DAB, gefärbt sind Deiterszellen und eine äußere Haarzelle).
Beispiele
Beispiel 1 : Transfektion von Stützzellen des Cortischen Organs
Das Cortische Organ wird einer Maus im postnatalen Stadium P3 (postnataler Tag 3) entnommen. Die Kultivierung erfolgt zunächst über Nacht in MEM D-Val-Medium (Kulturmedium, Fa. Life Technologies), das 10 % FBS (fötales Kälberserum) und 5 mM Glutamin enthält. Am zweiten Tag nach Anlegen der Kultur wird dem Kulturmedium 48 Stunden 1 mM Neomycin hinzugefügt. Durch die Neomycingabe sterben die Haarzellen des Cortischen Organs ab. Am fünften Tag wird ein Medienwechsel durchgeführt, bei dem erneut das oben beschriebene Kulturmedium ohne Neomycin appliziert wird. Am sechsten Tag erfolgt die Transfektion mit Penetratin-FITC (Konzentration 50 μM). Die Dauer der Transfektion beträgt sechs Stunden. Die Fixierung der Kultur wird mit 4 % Paraformaldehyd durchgeführt. Nach der Fixierung werden das Cytoskelett mit einer Alexa 568-Färbung sowie die Zellkerne mit einer DAPI-Färbung dargestellt. Wie die mikroskopischen Darstellungen in Figur 1 belegen, konnten die Stützzellen erfolgreich mit dem markierten Penetratin transfiziert werden. Beispiel 2: Transfektion von Haarzellen des Cortischen Organs mit Penetratin-p27ß
Für die Transfektion von Haarzellen des Cortischen Organs einer Maus wurde ein Peptid, welches neben dem Label FITC die Sequenz von Penetratin (RQIKI WFANR RMKWK K) sowie von p27 (YEWQ EVEKG) umfasst, synthetisch hergestellt. Als Linkermolekül zwischen beiden Abschnitten wurde beta-Alanin verwendet. Die Sequenz beider Peptidkomponenten war somit RQIKI WFANR RMKWK K-beta-Alanin- YEWQ EVEKG. Das Molekulargewicht dieses Peptids betrug 3869,3 Dalton.
Für die Herstellung des Präparates wurde die Cochlea dem Tier entnommen und das Cortische Organ anschließend durch Mikro- dissektion freigelegt. Mit Hilfe eines Zellklebers wurde das Präparat auf einem Deckglas fixiert und 24 Stunden kultiviert. Als Kultivierungsmedium wurde Neurobasalmedium mit B27 (Kulturmediumzusatz, Life Technologies) und 0,1 % Serum verwendet. Die Transfektion des Peptids erfolgte in serumfreiem Kulturmedium (3 Stunden, 50 μM). Nach der Transfektion wurde das Präparat mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und eine Anfärbung mit dem rotorange fluoreszierenden Alexa-Phalloidin (20 mg/ml) vorgenommen.
Die in Figur 2 dargestellte mikroskopische Aufnahme zeigt die erfolgreiche Transfektion mit dem Peptid, sichtbar durch die FITC- Färbung. Im Vergleich hierzu ist in Figur 3 der gleiche Ausschnitt des Cortischen Organs nach Alexa-Phalloidin-Färbung gezeigt, welcher die Struktur des Cytoskeletts sichtbar macht.
Beispiel 3: Transfektion von Haar- und Stützzellen des Cortischen Organs mit Biotin-Penetratin in vivo unter Zuhilfenahme eines negativ geladenen Hilfsstoffes ln Figur 4 ist ein histologischer Schnitt durch das Cortische Organ dargestellt. Hier ist eine Applikation von biotiniliertem Penetratin (Sequenz: Biotin-beta-alanin-RQIKI WFANR RMKWK K) in die Scala tympani erfolgt. Eine Markierung der Zellen ist nicht zu erkennen, biotiniliertes Penetratin (Biot-Penetratin) konnte in der Basilarmembran nachgewiesen werden. Figur 5 zeigt eine schwache Markierung der Zellen auf der Basilarmembran nach einer Applikation des markierten Peptids in die Scala media. Hierdurch wird deutlich, dass eine Transfektion der Zellen mit Penetratin erfolgt, wenn Penetratin direkt mit den Zellen auf der Basilarmembran in Kontakt gebracht wird. In Figur 6 und in Figur 5 ist eine Applikation von Biot-Penetratin in die Scala tympani gezeigt, wobei hier zusätzlich SDS verwendet wurde. Die deutlich stärkere Markierung der Zellen auf der Basilarmembran ist sichtbar. Figur 7 zeigt einen Schnitt durch eine wie oben beschrieben behandelte Basilarmembran. Hierbei ist deutlich die Markierung der Kerne der Haar- und Stützzellen zu erkennen.

Claims

Patentansprüche:
1. Verwendung von Penetratin oder einer davon abgeleiteten Sequenz für das Einbringen mindestens einer Substanz in Zellen sensorischer Organe.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen solche des Ohres, insbesondere des Innenohres, sind, wobei vorzugsweise die Zellen Stützzellen des Cortischen Organs sind.
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Haarsinneszellen des Cortischen Organs, Neuronen des auditorischen Nervs, Zellen des Vestibularorgans und/oder Neuronen des Vestibulamervs sind.
4. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen solche des Auges, insbesondere der Netzhaut, sind, wobei vorzugsweise die Zellen Müllerzellen und/oder Neuronen des optischen Nervs sind.
5. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Penetratin oder die davon abgeleitete Sequenz an die Substanz gekoppelt, insbesondere kovalent gekoppelt, ist.
6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz ein Peptid und/oder Protein ist.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz eine Nukleinsäure ist.
8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz ein sogenanntes "small- molecule" ist, das vorzugsweise ein Molekulargewicht von weniger als etwa 1000 Da aufweist.
9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz den Zellzyklus der Zellen beeinflusst, insbesondere stimuliert.
10. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz hemmend auf mindestens einen Zellzyklus-Inhibitor wirkt, wobei vorzugsweise der Zellzyklus-Inhibitor ein Zyklinkinase-Inhibitor, insbesondere der Zyklinkinase-Inhibitor p27κ,p1 ist.
11. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz ein Peptid mit der Sequenz Tyrosin - Glutaminsäure - Tryptophan - Glutamin - Glutaminsäure - Valin - Glutaminsäure - Lysin - Glycin und/oder eine Nukleinsäure, die für diese Peptidsequenz kodiert, umfasst.
12. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich ein negativ geladener Hilfsstoff verwendet wird.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Hilfsstoff Sodium Dodecyl Sulfat ist.
14. Verfahren zum Einbringen mindestens einer Substanz in Zellen sensorischer Organe, dadurch gekennzeichnet, dass Penetratin oder eine davon abgeleitete Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 verwendet wird.
15. Kit zum Einbringen mindestens einer Substanz in Zellen sensorischer Organe, umfassend a) Penetratin oder eine davon abgeleitete Sequenz und b) mindestens eine Substanz, definiert gemäß einem der
Ansprüche 6 bis 1 1 , wobei vorzugsweise die Substanz an Penetratin oder die davon abgeleitete Sequenz gekoppelt, insbesondere kovalent gekoppelt, ist.
16. Kit nach Anspruch 15, weiter umfassend einen negativ geladenen Hilfsstoff, insbesondere Sodium Dodecyl Sulfat.
17. Verwendung von Penetratin oder einer davon abgeleiteten Sequenz als Transportmittel, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten sensorischer Organe.
18. Verwendung nach Anspruch 17 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten des Ohres, insbesondere des Innenohres, oder des Auges, insbesondere der Netzhaut.
19. Verwendung nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass Penetratin oder die davon abgeleitete Sequenz an mindestens eine Substanz gekoppelt, insbesondere kovalent gekoppelt ist.
20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz ein Peptid und/oder Protein, eine Nukleinsäure oder insbesondere ein sogenanntes "small molecule" ist, wobei vorzugsweise die Substanz den Zellzyklus von Zellen beeinflusst, insbesondere stimuliert.
21. Verwendung nach Anspruch 19 oder Anspruch 20, insbesondere nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz hemmend auf mindestens einen Zellzyklus-Inhibitor wirkt, wobei vorzugsweise der Zellzyklus-Inhibitor ein Zyklinkinase-Inhibitor, insbesondere der Zyklinkinase-Inhibitor p27Kιp1 ist.
22. Verwendung nach Anspruch 20 oder Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz ein Peptid mit der Sequenz Tyrosin - Glutaminsäure - Tryptophan - Glutamin - Glutaminsäure - Valin - Glutaminsäure - Lysin - Glycin und/oder eine Nukleinsäure, die für diese Peptidsequenz kodiert, umfasst.
23. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich ein negativ geladener Hilfsstoff, insbesondere Sodium Dodecyl Sulfat eingesetzt wird.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004104028A1 (en) * 2003-05-20 2004-12-02 Institute Of Ophthalmology Anti-inflammatory agents
EP1657306A1 (de) * 2004-11-16 2006-05-17 Qiagen GmbH Genabschaltung (Gene silencing) durch hybride Sens-DNA und Antisens-RNA Konstrukte, gekoppelt an ein Peptid zur erleichterten Aufnahme in Zellen

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991018981A2 (fr) * 1990-06-05 1991-12-12 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Facteurs de croissance neurotropes comprenant un peptide homeoboite
WO1997012912A1 (fr) * 1995-10-05 1997-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Peptides utilisables comme vecteurs pour l'adressage intracellulaire de molecules actives
WO1999005302A1 (en) * 1997-07-24 1999-02-04 The Perkin-Elmer Corporation Conjugates of transporter peptides and nucleic acid analogs, and their use
WO1999011809A1 (en) * 1997-09-02 1999-03-11 Imperial College Innovations Limited Conjugates that contain the homeodomain of antennapedia
WO1999042088A2 (de) * 1998-02-23 1999-08-26 Otogene Aktiengesellschaft Verfahren zur behandlung von erkrankungen oder störungen des innenohrs
WO2000025804A2 (en) * 1998-11-02 2000-05-11 The Regents Of The University Of California A method for inhibition of phospholamban activity for the treatment of cardiac disease and heart failure
WO2000029427A2 (en) * 1998-11-13 2000-05-25 Cyclacel Limited Antennapedia homeodomain helix 3 derived translocation vectors
WO2001000677A1 (en) * 1999-06-28 2001-01-04 The University Of Newcastle Research Associates Limited A method of modulating integrin mediated cellular activity and agents useful for same

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991018981A2 (fr) * 1990-06-05 1991-12-12 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Facteurs de croissance neurotropes comprenant un peptide homeoboite
WO1997012912A1 (fr) * 1995-10-05 1997-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Peptides utilisables comme vecteurs pour l'adressage intracellulaire de molecules actives
WO1999005302A1 (en) * 1997-07-24 1999-02-04 The Perkin-Elmer Corporation Conjugates of transporter peptides and nucleic acid analogs, and their use
WO1999011809A1 (en) * 1997-09-02 1999-03-11 Imperial College Innovations Limited Conjugates that contain the homeodomain of antennapedia
WO1999042088A2 (de) * 1998-02-23 1999-08-26 Otogene Aktiengesellschaft Verfahren zur behandlung von erkrankungen oder störungen des innenohrs
WO2000025804A2 (en) * 1998-11-02 2000-05-11 The Regents Of The University Of California A method for inhibition of phospholamban activity for the treatment of cardiac disease and heart failure
WO2000029427A2 (en) * 1998-11-13 2000-05-25 Cyclacel Limited Antennapedia homeodomain helix 3 derived translocation vectors
WO2001000677A1 (en) * 1999-06-28 2001-01-04 The University Of Newcastle Research Associates Limited A method of modulating integrin mediated cellular activity and agents useful for same

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BONNEL S ET AL: "Ocular cell transfection with the human basic Fibroblast Growth Factor gene delays photoreceptor cell degeneration in RCS rats" INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE, ASSOCIATION FOR RESEARCH IN VISION AND, US, Bd. 41, Nr. 4, 15. M{rz 2000 (2000-03-15), Seite S397 XP002184149 ISSN: 0146-0404 *
DEROSSI D (REPRINT) ET AL: "Trojan peptides: the penetratin system for intracellular delivery" TRENDS IN CELL BIOLOGY, ELSEVIER SCIENCE LTD, XX, Bd. 8, Februar 1998 (1998-02), Seiten 84-87, XP002122131 ISSN: 0962-8924 in der Anmeldung erw{hnt *
SCHUTZE-REDELMEIER M ET AL: "Introduction of exogenous antigens into the MHC class I processing and presentation pathway by Drosophila antennapedia homeodomain primes cytotoxic T cells in vivo" J IMMUNOL, Bd. 157, Nr. 2, 1996, Seiten 650-655, XP002194079 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004104028A1 (en) * 2003-05-20 2004-12-02 Institute Of Ophthalmology Anti-inflammatory agents
EP1657306A1 (de) * 2004-11-16 2006-05-17 Qiagen GmbH Genabschaltung (Gene silencing) durch hybride Sens-DNA und Antisens-RNA Konstrukte, gekoppelt an ein Peptid zur erleichterten Aufnahme in Zellen
WO2006053683A2 (en) * 2004-11-16 2006-05-26 Qiagen Gmbh Gene silencing using sense dna and antisense rna hybrid constructs coupled to peptides facilitating the uptake into cells
WO2006053683A3 (en) * 2004-11-16 2006-08-03 Qiagen Gmbh Gene silencing using sense dna and antisense rna hybrid constructs coupled to peptides facilitating the uptake into cells

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