KR20020013476A - 트랜스진 발현을 조절하는 신규 시스템 - Google Patents

트랜스진 발현을 조절하는 신규 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포에서 핵산 발현을 조절하는 신규 조성물 및 방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 a) 중간 프로모터의 통제하에 테트라사이클린(tTA)-의존 트랜스액티베이터를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 영역; 및 b) tTA 민감성 프로모터의 통제하에 해당 핵산을 포함하는 제2 영역을 포함함을 특징으로 하는 임의 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 시험관내 및 생체내 신경 세포에서 핵산 발현, 예를 들면 인간 티로신 히드로사이클로시스를 조절하는데 좀더 특히 유용하다.

Description

트랜스진 발현을 조절하는 신규 시스템{NOVEL SYSTEM FOR REGULATING TRANSGENE EXPRESSION}
세포에서 핵산 발현의 조절은 생물공학의 전 영역에서 주된 관심사이다. 이로 인해, 시험관내 또는 생체외에서 재조합 단백질을 발현시키는 조건을 개선하고, 유전자의 기능 또는 조절을 연구하며, 바이러스 입자를 생산하여, 생체내로 이식될 세포를 제조하는 등이 가능하다. 생체내에서, 동물 모델의 특성을 개선시키고, 화합물의 생물효용 또는 독성 또는 유전자의 기능을 좀더 정확하게 연구하거나, 예를 들어 치료 또는 백신접종을 목적으로 한 화합물의 좀더 효과적인 생산을 조절할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 생물공학의 모든 영역에 이용될 수 있다.
유전자의 발현을 조절하는 각종 시도가 선행 기술에 공지되어 있다. 이들 접근법은 특히 조직-특이성 전사 프로모터 또는 벡터를 이용하는데 있다. 그러나, 보고된 시스템은 특히 생체내에서 반드시 예측된 수준의 특이성을 나타내는 것은 아니고, 발현을 일시적으로 제어할 수는 없다.
Gossen et al. (PNAS 89 (1992) 5547; Science 268 (1995) 1766)은 한편에 테트라사이클린-통제된 트랜스액티베이터 tTa와 다른 한편에 tTa-민감성 프로모터를 사용하는 복합 시스템에 관해 기재하고 있다. 발현의 일시 조절 측면에서 이점을 제공하지만, 지금까지 공지된 이러한 시스템은 이의 효용을 제한하는 특정 단점을 여전히 가지고 있다. 이러한 단점들에는 특히 세포 독성, 관측된 발현 손실, 두가지 벡터의 사용 필요성 등이 있다.
본 발명은 세포에서 핵산의 발현을 조절하는 신규 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 좀더 구체적으로는 시험관내 및 생체내 신경 세포에서 핵산의 발현을 조절하는데 적합하다.
도 1: 본 발명에 따른 핵산을 함유하는 아데노바이러스 게놈의 구조 다이어그램. 역 말단 반복(ITR) 서열과 캡시드화 서열(ψ)이 도시됨. pIX는 아데노바이러스 IX 단백질에 의해 암호화된 서열을 나타낸다.
도 2: 패널 (a): 각종 MOI에서 아데노바이러스 AdPGK.tet.hTH-1으로 인간 신경 조상세포의 감염. 도시된 값은 4회 실험의 평균임.
패널 (b) 및 (c): MOI=140 감염 후 7일째 면역조직화학에 의해 측정된 인간 신경 조상세포에서 시험관내 TH의 생성. 패널 (b) 무처리, 및 패널 (c) 감염 후 즉시 및 7일에 걸쳐 독시사이클린(10 ng/ml)의 존재하에 처리 후. 배율은 360(패널 (b)) 및 220(패널 (c))임.
도 3: 아데노바이러스 Ad PGK.tet.hTH1(MOI = 40)로 감염된 다음 0일째(감염 5.5일 후) 독시사이클린(5 ng/ml)의 첨가(a) 및 투여 중지(b)된 배양액에서 hTH 활성의 상실 (a) 및 회복 (b)의 동역학. 처리되지 않은 배양액에서 hTH 활성은 0일째 100%로 측정되었음. (c) 감염 11일 후 측정시 hTH의 발현에 미치는 다양한 투여분의 독시사이클린의 효과. 값은 최소 4회 실험의 평균이다.
도 4: (a) 처리되지 않은 동물 및 (b) 매일 독시사이클린으로 처리된 동물의 15 ㎛ 동결 건조된 뇌 절편에서 안티-TH 면역조직화학으로 측정시 아데노바이러스 AdPGK.tet.hTH-1(MOI=40)으로 감염된 인간 신경 조상세포의 조직 세포내 이식물에서 TH에 대한 면역반응성. 바이올릿 염색(a)(b)은 알칼리 포스파타제-커플링된 안티-디그옥시게닌 항체로 배양한 다음 특정 기질로 염색한 후 디그옥시게닌-라벨링된 alu 프로브로 하이브리드화하는 인간 세포의 존재를 나타냄. 배율 110.
도 5: 안티-TH 면역조직화학에 의해 측정한 아데노바이러스 AdPGK.tet.hTH1으로 감염된(MOI=40) 인간 신경 조상세포의 이식물에서 TH 면역반응성, 및 (a)비처리 동물과 (b)독시사이클린으로 매일 처리한 동물로부터의 15 ㎛ 동결건조 뇌 절편에서 수행한, 35 황-표지 HTH-1-특이성 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용한 현장 하이브리드화. 이들 절편을 크레실 바이올릿으로 대비염색한다. 배율 450배.
도 6: tTA 유전자(A); UMS 서열(B); Op 서열(C) 및 최소 CMV 프로모터(D)의 뉴클레오타이드 서열.
본 발명은 선행 기술의 시스템보다 우수한 안정성, 특이성 및 통제가능성을 보유한 신규 조절된 발현 시스템을 제공한다.
본 발명의 제1 측면은 유전자 발현을 엄격히 통제할 수 있는 특이적 성질 및 구조를 지닌 요소들로 이루어진 유전자 작제물에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 이러한 유전자 작제물을 포함하는 벡터, 특히 바이러스 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 유전자 작제물 또는 벡터에 의해 유전적으로 변형되는 세포, 이를 포함하는 조성물 및 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 해당 산물 생성을 위한 이의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 시험관내, 생체외 또는 생체내 세포, 좀더 구체적으로는 신경 세포에서 핵산의 조절된 발현을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 측면은 생체내에서 핵산의 전달 및 조절된 발현 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 작제물 또는 벡터에 의해 유전적으로 변형된 세포 (특히 신경 조상 세포)의 생체내 주입 (또는 이식)을 포함한다.
본 발명은 좀더 구체적으로 말하면 tTA를 사용하고 개선된 성질을 나타내는 신규 조절된 발현 시스템에 관해 기재하고 있다. 이러한 시스템은 아데노바이러스 측면에서 특히 효과적이고 시험관내 및 생체내 모두, 특히 신경계에서 효과적이고 조절된 발현을 가능케 한다.
본 발명은 첫째 좀더 상세히 말하면
a) 중간 프로모터의 통제하에 테트라사이클린-조절 시스템의 tTA 트랜스액티베이터를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 영역, 및
b) tTA-민감성 프로모터의 통제하에 해당 핵산을 포함하는 제2 영역을 포함하고,
두 영역 a)와 b)가 동일한 전사 배향으로 배열됨을 특징으로 하는 핵산에 관한 것이다.
좀더 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산은 부가적으로 두 영역 a)와 b) 사이에 배열되고 영역 a)와 b) 사이의 전사 방해를 제한하는 제3 영역 c)를 포함한다.
이에 따라, 본 발명은 특히 생체내, 특히 신경 세포에서 유전자 발현을 통제하는 이러한 작제물의 유리한 성질을 입증한 결과이다. 본 발명은 또한 이들 작제물의 유리한 성질이 부분적으로 이들 내부의 여러 유전 요소들의 선택 및 구조를 야기함을 보여준다.
이에 따라, 본 발명의 핵산 영역 a)에서, tTA 트랜스액티베이터 유전자의 발현을 통제하는데 이용되는 프로모터가 중간 프로모터이다. 본 발명의 의미상, 용어 "중간 프로모터"는 숙련인에 따르면 활성 수준이 평균 정도로서, 강한 프로모터보다 약한 프로모터를 의미한다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명의 문맥상 중간 프로모터는 생리 수준으로 발현시키는 비-바이러스 프로모터이다.
이에 따라, 사용된 프로모터가 강한 바이러스 프로모터(특히 hCMV)인 기존에 공지된 시스템과는 달리(Gossen et al., PNAS 89 (1992) 5547), 본 발명의 작제물은 포유동물 세포에 독성이 없는 수준으로 tTA 트랜스액티베이터를 체계적으로 합성할 수 있다. 본 출원인은 세포에서 중간 수준의 tTA를 유지하면 특히 신경 세포에서 유전자 발현을 좀더 완벽하고도 정확하게 조절할 수 있음을 입증해 보였다.
좀더 바람직하게는, 이용된 프로모터는 세포 프로모터이고, 이는 세포에서 발현되는 유전자로부터 유래된 프로모터이다. 유리하게도, 프로모터는 유전자 작제물이 도입되는 세포와 동일한 종의 유기체에서 유도된 세포로부터 유래 (또는 유도)된 프로모터이다. 이에 따라, 본 발명의 작제물에 의해 핵산을 동물에 도입하는 경우, 이용된 중간 세포 프로모터는 바람직하게는 동일한 종 또는 밀접히 관련되거나 대립 종의 동물의 세포로부터 유도된다. 본래, 이용된 프로모터가 기능적이라면 여러 유기체로부터 유도된 프로모터, 예를 들면 인간에서 발현을 위해 쥐 프로모터를 이용할 수 있다.
좀더 바람직하게는, 이용된 프로모터는 중간 구조 세포 프로모터이다. 이에 따라, 본 출원은 이용된 프로모터가 구성 요소인 경우에 본 발명 시스템의 최상의 성질이 얻어지고, 세포에서 안정한 수준의 tTA의 존재 및 유지를 보장함을 입증해보였다.
본 발명에 적당한 중간 구성요소 세포 프로모터의 구체적인 예는 특히 하우스키핑 유전자 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 또는 신장 인자 1a (EF1a)의 프로모터와 같은 편재 프로모터이다. 본 발명의 측면에서 이용될 수 있는 기타 중간 세포 프로모터는 조직-특이성 프로모터, 예를 들면 신경교-특이성 GFAP("신경교-특이성 원섬유 산성 단백질), 뉴런-특이성 NSE("뉴런-특이성 단백질"), β-액틴, β-글로빈 및 심근-특이성 MHCa("마이오시스 헤비 체인 a") 유전자의 프로모터, 또는 예를 들어 NRSE-PGK 타입의 복합 프로모터이다.
본 발명의 의미상, 중간 프로모터는 유리하게는 편재되거나 특정 조직 또는 세포 타입에 국한된 구조적 발현을 보장하고 바람직하게는 생리적 수준의 발현을 얻을 수 있는 세포 프로모터이다. PGK 프로모터 (또는 이러한 프로모터의 변이체)의 사용은 본 발명의 바람직한 양태를 나타낸다. 이에 따라, 하기에 기재되는 실시예는 이러한 프로모터를 사용하는 경우 작제물의 도입 후 최소 한달간 해당 핵산의 발현을 생체내에서 유지할 수 있음을 입증해 준다. 이에 따라, 이 시기 동안 해당 핵산을 발현시키는 세포 수의 감소가 관찰되지 않았다. 이러한 발현 안정성은 선행 기술 시스템과 비교해서 본 발명의 상당한 이점 중 하나를 보여준다. 이에 따라, 강한 프로모터(RSV 바이러스 LTR 프로모터)의 통제하에 β-갈락토시다제를 암호화하는 아데노바이러스로 감염된 조상 신경 세포의 이식물에서, 이식 후 한달 이내에 명백한 발현 수준의 감소가 관찰된다. 이는 안정성 측면에서 본 발명의 유리한 성질을 입증해 주고, 이러한 성질들이 공교롭게도 tTA 유전자의 발현을 지시하는 중간 프로모터의 사용과 연관됨을 보여준다.
본 발명에 따른 작제물의 또다른 중요한 특성은 두 영역 a)와 b)의 구성에 있다. 이에 따라, 이들 두 영역은 유리하게는 (i) 동일한 전사 배향으로 배열되고 (ii) 전사 방해를 제한하는 영역 c)에 의해 분리된다.
본 출원은 우선 본 발명 시스템의 효능을 개선 (즉, 발현 조절을 개선)시키기 위해, 두 카세트 a)와 b)를 동일한 전사 배향으로 위치시킴이 특히 유리함을 입증해 준다. 이러한 결과는 두 카세트가 반대 배향으로 위치될 때 개선된 발현 통제가 자주 관찰되었다면 한층 더 놀랍다. 반면, 본 발명의 문맥상, 카세트가 동일한 배향으로 있을 때 아데노바이러스의 경우 어떠한 손실도 관찰되지 않았지만 역평행 배향을 가진 작제물의 경우에 이러한 손실이 보고되었다(Kojima et al., Biochem.Biophys.Res.Commun 238 (1997) 569).
다른 한편, 본 발명의 작제물의 성질을 추가로 개선하기 위해, 앞서언급된 영역 a)와 b) 사이에 a)와 b) 사이의 전사 방해를 제한하는 제3 영역 c)를 도입함이 특히 유리하다. 표현 "전사 방해"는 핵산 b)의 전사시 영역 a)의 프로모터의 영향력 또는 효과 또는 그 역을 말한다. 좀더 구체적으로 말하면, "전사 방해"는 분리되어 있을 때의 영역 b)의 발현과 영역 a)에 기능적으로 연결된 경우에 영역 b)의 발현 사이에 존재할 수 있는 차이를 말한다. 이러한 영역 c)는 바람직하게는 전사 종결자, 바람직하게는 UMS 서열을 포함한다. UMS("상류 마우스 서열") 서열은 c-mos 쥐 유전자의 상류에서 동정된 게놈 서열이다(McGeady et al., DNA 5 (1986)289). 이 서열은 전사 종결자로서 행동한다. 본 발명은 이러한 서열이 유리하게도 생체내, 특히 신경계, 좀더 구체적으로는 아데노바이러스 측면에서 유전자 발현을 효과적으로 통제하는데 이용될 수 있음을 보여준다.
본 발명 시스템은 일 및 동일한 핵산에서 두 카세트(영역)의 존재에 기초하며 이 중에서 하나는 조절가능한 조건하에 두번째 카세트에서 해당 핵산의 발현을 활성화할 수 있는 전사 인자를 발현시킨다. 이러한 두번째 카세트 (영역 b)에서 본 발명의 유전자 작제물에 적합한 전사 프로모터를 선택함이 중요하다. 이에 따라, 영역 b)에서 이용된 프로모터는 tTA 트랜스액티베이터에 민감한 프로모터로서, 트랜스액티베이터의 존재하에 활성이 증가된다. 구조적 측면에서 볼때, 프로모터는 서열에서 또는 이러한 서열로부터 기능적인 거리에서 tTA 인자와 결합하는 적어도 일 부위를 포함하는 프로모터이다(Gossen et al., 1992). 이러한 결합 부위 또는 작동자 영역(Op 또는 tetOp)은 예를 들면 도 6에서 볼 수 있는 서열 또는 이러한 서열의 기능적 변이체를 보유할 수 있다. 변이체는 예를 들면 1 이상의 염기쌍의 돌연변이, 결실 또는 첨가에 의해 유전적으로 변형되고 tTA 트랜스액티베이터에 결합하는 능력을 보유하는 서열에 대응될 수 있다. 바람직하게는, 변형은 도 6에서 보여진 서열의 10% 이하에 영향을 미친다. 부가적으로, Op 서열은 1개 이상의 복사본, 예를 들면 1 내지 10개의 복사본, 바람직하게는 3 내지 10개의 복사본, 좀더 바람직하게는 3 내지 8개의 복사본으로 영역 b)에 존재할 수 있다. 일 특정 양태에서, b)에 사용된 프로모터는 7 작동자 서열을 함유한다. 좀더 바람직하게는, 해당 핵산의 발현을 실질적으로 통제하기 위해, b)에 사용된 프로모터가 0은 아니지만매우 낮은 기본 활성을 가질 것을 적극 추천한다. 그 결과, 이러한 프로모터는 tTA의 존재시에만 활성이 있는 것으로 관찰되고 조절은 매우 엄격하다. 유리하게도, b)에 사용된 프로모터는 tTA 트랜스액티베이터에 민감한 최소 프로모터이다. 최소 특성은 0은 아니더라도 매우 낮은 기본 활성의 프로모터를 말한다. 일반적으로, 이러한 프로모터는 전사 프로모터 기능에 필수적이고(예; TATA 박스), 본래 프로모터의 세기 또는 조절에 수반된 기타 영역이 결여된 최소 요소를 포함한다. 이러한 프로모터는 요소("침묵자")의 결실 및/또는 첨가에 의해 각종 타입의 프로모터로부터 제조될 수 있다. b)에 바람직한 프로모터는 본질적으로 tTA의 부재시 비활성이고 tTA 트랜스액티베이터의 존재하에 촉진되는 포유 동물 세포에서 기능적인 프로모터이다. 용어 "본질적으로 비활성"은 통상적인 기술, 특히 효소 분석 또는 면역조직화학법, 미세투석 또는 HPLC에 의해 검출될 수 있는 임의 발현 산물(폴리펩티드)의 부재를 말한다. 이러한 용어가 PCR 또는 기타 고감도 검출 기법에 의해 검출될 수 있는 mRNA 분자의 존재를 배제하지 않았지만, 농도 수준은 실제로 무시할 정도이다.
b)에 사용된 프로모터는 다양한 성질 및 기원일 수 있고 다양한 성질을 가진다. 이는 사용된 프로모터의 선택이 특히 요구시 사용 및 해당 유전자에 좌우되기 때문이다. 이에 따라, 프로모터는 예를 들면 강하거나 약하고, 편재되거나 조직/세포에 특이적이거나, 생리적 또는 병리생리적 상태에 특이적인 프로모터에서 유도될 수 있다(활성은 세포 분화 상태 또는 세포 사이클의 특정 단계에 좌우됨). 프로모터는 진핵생물, 원핵생물, 바이러스, 동물, 식물, 인공, 인간 등의 기원일 수 있다. 프로모터의 구체적인 예는 TK, GH, EF1-a, APO 및 CMV 즉시 초기 유전자 등의 프로모터, 또는 인공 프로모터이다. 본 발명에서 사용시, 이러한 프로모터는 바람직하게는 "최소", 즉 tTA의 존재에 좌우된다. 이를 위해, 본래 프로모터는 효소에 의해 절단되고 바람직하게는 1 이상의 Op 서열에 기능적으로 커플링된 후 이의 활성이 시험될 수 있다. 숙련인은 tetOp 서열의 수 및 선택된 프로모터에 대한 거리를 조절하여 프로모터의 발현이 엄격히 tTA-의존적이도록 할 수 있다. 바람직하게는, b)에 사용된 프로모터는 Corti et al(Neuroreport 7 (1996) 1655)(본원에서 참고됨)이 기재한 바와 같이 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 유전자, 바람직하게는 인간 CMV(hCMV)에서 나온 최소 프로모터이다.
본 발명은 요구식 적용에 의존하는 각종 해당 핵산을 발현시키는데 사용될 수 있다. 이에 따라, 영역 b)에서 해당 핵산은 유리하게도 해당 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이다. 본 발명의 문맥에서, 언급될 수 있는 해당 산물은 좀더 구체적으로 말하면 효소, 혈액 유도체, 생장 호르몬과 같은 호르몬, 사이토킨, 림포카인: 인터루킨, 인터페론, TNF 등(프랑스 특허 번호 92 03120), 생장 인자, 예를 들면 VEGF 또는 FGF와 같은 안기오게닉 인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 이들을 합성하는 효소(티로신 히드록실라제: TH), 트로픽 인자, 특히 신경퇴행성 질환, 손상된 신경계를 지닌 창상 또는 망막 퇴행을 치료하는 뉴로트로픽 인자: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, NT3, NT5 또는 HARP/플레이오트로핀, 또는 골격 생장 인자, 조혈 인자 등, 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(프랑스 특허 91 11947), 응고에 수반된 인자를 암호화 하는 유전자: 인자 VII, VIII 및 IX, 자살 유전자(티미딘 키나제 및 사이토신 데아미나제), 세포 사이클에 수반된 단백질, 예를 들면 p21, 또는 의존 키나제, Rb, Gas-1, Gas-6, Gas-3, Gad 45, Gad 153, cyclins A, B 및 D를 억제하는 기타 단백질, 평활근에서 세포의 증식을 제한하는 GAX 단백질(재협착증 치료), 아폽토시스-유도 단백질 또는 p53, Bax, BclX-s, Bad 또는 임의의 기타 Bc12 및 BclX-1 길항제와 같은 기타 종양 억제제, 헤모글로빈 또는 기타 단백질 전달자를 위한 유전자, 아포리포프로테인 A-I, A-II, A-VI, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J 및 apo(a) 중에서 선택된 아포리포프로테인 타입의 지질 대사에 수반되는 단백질에 대응하는 유전자, 대사 효소 예를 들면 리포프로테인 리파제, 간 리파제, 리세틴 콜레스테롤 아실트랜스퍼라제, 7-알파-콜레스테롤 히드록실라제 또는 포스파티딜 산 포스파타제, 또는 지질-전달 단백질 예를 들면 콜레스테롤 에스테르-전달 단백질 및 인지질-전달 단백질, HDL-결합 단백질, 또는 LDL 수용체, 킬로마이크론 렘난트 수용체 및 스캐빈저 수용체 중에서 선택된 수용체 등이 있다.
해당 산물 중, 항체, 단일-체인 가변 항체 분획(ScFv) 또는 면역요법, 예를 들어 감염성 질환, 종양(안티-RAS, 안티-p53 또는 안티-GAP 항체), 또는 자가면역 질환 예를 들면 다발성 경화(안티이디오타입 항체)를 치료하는데 유용한 인식 능력을 보유하는 임의의 기타 항체 분획을 강조함이 중요하다.
비-제한적인 방법에서, 해당 기타 단백질은 안티-HIV 요법의 경우 가용성 CD4 수용체 또는 가용성 TNF 수용체, 또는 근무력증 치료의 경우 가용성 아세틸콜린 수용체와 같은 가용성 수용체; 효소의 기질 또는 억제제인 펩티드, 또는 천식,혈전증 및 재협착증 치료의 경우 수용체 또는 부착 단백질의 아고니스트 또는 길항제인 펩티드: 인공, 키메라 또는 끝잘린 단백질이다. 언급될 수 있는 주된 호르몬은 당뇨병의 경우 인슐린, 생장 호르몬 및 칼시토닌이다.
핵산은 또한 표적 세포에서의 발현이 유전자의 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 통제할 수 있는 유전자 또는 안티센스 서열일 수 있다. 이러한 서열은 예를 들면 표적 세포에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사되고 전자가 단백질로 해독되는 것을 차단할 수 있다(유럽 특허 140 308에 기재된 기술에 따름). 치료 유전자는 또한 표적 RNA를 선택적으로 파괴할 수 있는 라이보자임을 암호화하는 서열을 포함한다(유럽 특허 321 201).
핵산은 또한 인간 또는 동물에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 항원성 펩티드를 암호화하는 1 이상의 유전자를 함유할 수 있다. 이러한 특정 양태에서, 본 발명은 특히 미생물, 바이러스 또는 암에 대항해서 인간 또는 동물에 적용되는 백신 또는 면역요법 치료를 개발할 수 있다. 펩티드는 특히 엡스타인 바 바이러스, HIV 바이러스, 간염 B 바이러스(유럽 특허 185 573), 슈도-공수병 바이러스, "합포-형성 바이러스" 또는 기타 바이러스에 특이적인 항원성 펩티드, 또는 MAGE 단백질과 같은 종양-특이성 항원(유럽 특허 259 212)일 수 있다.
핵산은 또한 세포에 독성인, 특히 조건부 독성을 나타내는 산물을 암호화할 수 있다(즉, 티미딘 키나제, 사이토신 데아미나제 등).
해당 기타 유전자는 특히 McKusick 및 V.A. Mendelian(Inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes,Eighth edition, John Hopkins University Press (1988)) 및 Standbury, J.B. et al(The metabolic basis of inherited disease, Fifth edition. McGraw-Hill (1983))이 기재하고 있다. 해당 유전자는 아미노산, 지질 및 세포의 기타 구성분의 대사에 수반되는 단백질을 포함한다.
한편, 영역 b)는 또한 해당 핵산의 3'에 위치된 전사 종결자를 포함할 수 있다. 마지막으로, 핵산은 적절한 경우에 IRES에 의해 분리되어, 해당 다수 산물을 생성할 수 있는 다수의 암호 영역을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 작제물이 특히 신경계에서 발현을 조절하는데 매우 적합하기 때문에, 해당 핵산은 좀더 구체적으로는 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 이들을 합성하는 효소(티로신 히드록실라제: TH), 또는 트로픽 인자, 특히 신경퇴행성 질환, 손상된 신경계를 지닌 창상 또는 망막 퇴행을 치료하는 뉴로트로픽 인자를 암호화 한다.
일 특정 양태에서, 본 발명은
a) PGK 유전자의 프로모터의 통제하에 테트라사이클린-조절 시스템(tTA)의 트랜스액티베이터를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 영역, 및
b) 1 내지 10개, 바람직하게는 3 내지 8개, 특히 7개의 tetOp 서열을 포함하도록 변형된 최소 CMV 프로모터의 통제하에 특히 인간 티로신 히드록실라제를 암호화하는 해당 핵산을 포함하는 제2 영역,
c) UMS 서열을 포함하는 제3 영역을 포함하고,
두 영역 a)와 b)가 동일한 전사 배향으로 배열됨을 특징으로 하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 이는 좀더 구체적으로 말하면 게놈 DNA(gDNA) 또는 상보성 DNA(cDNA)일 수 있다. 본 발명의 핵산은 숙련인에게 익히 공지되고 예를 들어 핵산의 합성, 라이브러리 선별, 연결, 효소를 이용한 절단, 증폭, 클로닝 등에 수반되는 기술을 이용하여 제조될 수 있다(Maniatis et al. 참조). 이에 따라, 상이한 영역 a), b) 및 c)는 별도로 제조된 다음 기능적으로, 즉 동일한 전사 배향으로 집합될 수 있다. 영역 a)와 b) 사이의 스페이스는 본 발명의 작제물의 효능에 손상을 줌이없이 달라질 수 있다. 이에 따라, 이들 영역은 0 내지 3000 bp, 예를 들면 좀더 일반적으로 0 내지 1000 bp, 유리하게는 500 bp 이하로 분리될 수 있다. 영역 a)와 b) 사이의 이러한 거리는 일반적으로 영역 c)(존재한다면)의 길이 및 이용된 벡터의 클로닝 능력에 의해 결정된다. 숙련인은 이를 쉽게 조절할 수 있다. 본 발명의 핵산은 각종 기원, 특히 원핵생물, 진핵생물(동물, 식물, 바이러스 등)에서 유래된 기원의 요소, 합성 또는 반합성 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 앞서 정의된 핵산을 포함하는 임의 벡터에 관한 것이다. 벡터는 숙련인에게 공지된 임의 벡터, 예를 들면 플라스미드, 코스미드, 파아지, YAC, HAC, 트랜스포손, 에피솜, 바이러스 등일 수 있다. 본 발명에 바람직한 벡터 타입은 아데노바이러스, AAV, 허프스바이러스, 백시니아 바이러스 또는 몇몇 레트로바이러스(특히 렌티바이러스)와 같은 바이러스 벡터로 표현된다. 바이러스는 좀더 바람직하게는 신경 세포, 특히 신경 조상 세포에 대한 트로피즘을 보유하는 바이러스이다. 이러한 관점에서, 본 발명의 문맥에서 특히 바람직한 벡터는 아데노바이러스이다.
본 발명에 이용되는 아데노바이러스는 유리하게는 재조합 결손 아데노바이러스이고, 이의 게놈은 이종 핵산을 포함하며 세포에서 자가 복제할 수 없다. 좀더 바람직하게는, 본 발명의 아데노바이러스는 최소한 E1과 E3 영역 전부 또는 일부가 결여되어있다.
재조합 결손 아데노바이러스는 또한 3세대 재조합 결손 아데노바이러스일 수 있으며, 이는 E1과 E4 영역 전부 또는 일부 및 가능하다면 E3 영역이 결여된 재조합 아데노바이러스이다.
본 발명의 특정 측면은 하기 영역 전부 또는 기능성 부위에 영향을 주는 결실을 운반하는 아데노바이러스를 사용하는데 있다:
-E1, E4 및 E3
-E1, E4 및 E2,
-E1, E4, E2 및 E3,
- 상기 영역 및 아데노바이러스의 후기 기능(L1에서 L5)을 암호화 하는 유전자 전부 또는 일부, 또는
- 바이러스의 모든 암호 영역.
아데노바이러스의 게놈 구조는 문헌에 충분히 공지되어 있다. 이러한 관점에서, 아데노바이러스 Ad5 게놈의 서열이 완성되었고 이를 데이터베이스로 입수가능하다(특히 GeneBank M73260 참조). 마찬가지로, 전부는 아니지만 기타 아데노바이러스 게놈(Ad2, Ad7, Ad12, 개 아데노바이러스 CAV-2 등)의 일부도 서열 분석되었다. 또한, 재조합 결손 아데노바이러스의 구조도 문헌에 공지되어 있다. 이에 따라, 출원 WO 94/28152, WO 95/02697 및 WO 96/22378은 E1과 E4 영역에서의 다양한 결실에 관해 기재하고 있다. 마찬가지로, 출원 WO 96/10088은 lva2 유전자 수준에서 변형을 운반하는 벡터에 관해 기재하고 있는 반면, 출원 WO 94/26914는 동물 기원의 아데노바이러스에 관해 기재하고 있으며 WO 95/29993은 아데노바이러스의 E2 영역에 영향을 미치는 결실에 관해 기재하고 있다.
유리하게도, 본 발명의 문맥에서 사용되는 재조합 아데노바이러스는 게놈의 E1 영역에 결실을 포함하며, 이러한 결실은 E1a와 E1b 영역에 영향을 미친다. 뉴클레오타이드 454-3328, 382-3446 또는 357-4020에 영향을 미치는 결실(Ad5 게놈의 경우)은 특정 예로서 언급될 수 있다.
또한, E4 영역의 결실은 바람직하게는 모든 개방 해독 프레임, 예를 들면 결실 33466-35535 또는 33093-35535, 또는 E4 영역의 단지 일부(ORF6 또는 ORF3)에 영향을 미친다(본원에서 참고된 출원 WO 95/02697 및 WO 96/22378에 기재).
부가적으로 후기 기능("최소" 벡터) 또는 모든 암호 영역("실질이 없는(gutless)" 벡터)이 결여된 아데노바이러스의 작제가 예를 들어 Parks et al. PNAS 93(1996) p. 13565 및 Lieber et al., J. Virol. 70 (1996) p. 8944에 기재되어 있다.
본 발명의 핵산은 재조합 아데노바이러스 벡터상의 여러 위치에 삽입될 수 있다. 이는 결실된 서열을 대체하거나 정상 서열에 더하여 E1, E3 또는 E4 영역 내부에 삽입될 수 있다. 이는 또한 바이러스 생산을 위해 cis로 요구되는 서열에서 떨어진 임의 기타 위치에 삽입될 수 있다(ITR 서열 및 캡시드화 서열).
또한, 재조합 아데노바이러스는 인간 또는 동물 기원일 수 있다. 바람직하게 언급될 수 있는 인간 기원의 아데노바이러스는 C 그룹으로 분류되는 것들, 특히 타입 2 (Ad2) 및 타입 5(Ad5) 아데노바이러스; 또는 타입 7(Ad7) 또는 타입 12(Ad12) 아데노바이러스이다. 동물 기원의 각종 아데노바이러스 중에서, 바람직하게 언급될 수 있는 것은 개 기원의 아데노바이러스, 특히 모든 CAV2 아데노바이러스 균주이다[예를 들면; Manhattan 균주 또는 A26/61(ATCC VR-800)]. 동물 기원의 기타 아데노바이러스는 특히 본원에서 참고되는 출원 WO 94/26914에 언급되고 있다.
재조합 아데노바이러스는 재조합 아데노바이러스 게놈에 결여된 1 이상의 기능을 trans로 상보할 수 있는 세포주인 캡시드화 세포주에서 생산된다. 숙련인에게 공지되고 언급될 수 있는 캡시드화 세포주의 예는 아데노바이러스 게놈의 일부가 통합되는 세포주 293이다. 좀더 정확히 말하면, 세포주 293은 좌측 ITR, 캡시드화 영역, (E1a와 E1b를 포함한) E1 영역, pIX 단백질을 암호화 하는 영역 및 pIVa2 단백질을 암호화 하는 영역의 일부를 포함하는 아데노바이러스 혈청타입 5 게놈(Ad5)의 좌측 말단(대략 11-12%)을 함유하는 인간 신장 배 세포주이다. 이러한 세포주는 E1 영역이 결여된, 즉 E1 영역의 전부 또는 일부가 결핍된 재조합 아데노바이러스를 트랜스상보하고, 높은 역가의 바이러스 스톡을 생산할 수 있다. 허용 온도(32℃)에서, 이러한 세포주는 또한 부가적으로 온도-감성 E2 돌연변이를 함유하는 바이러스 스톡을 생산할 수 있다. E1 영역을 보충할 수 있는 기타 세포주가 공지되어있으며, 이들 세포주는 특히 A549 인간 폐 육종 세포(WO 94/28152) 또는 인간 망막아종(Hum. Gen. Ther. (1996) 215)에 기초한다. 부가적으로, 다수의 아데노바이러스 기능을 트랜스상보할 수 있는 세포주도 또한 기재되고 있다. E1과 E4 영역을 보충하는 세포주(Yeh et al., J. Virol, Vol. 70(1996) pp. 559-565; Cancer Gen. Ther. 2(1995) 322; Krougliak et al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575) 및 E1과 E2 영역을 보충하는 세포주(WO 94/28152, WO 95/02697, WO 95/27071) 또는 이들 세포주에서 유도되고 최소 아데노바이러스를 생산하는데 이용될 수 있는 세포주가 특별히 언급될 수 있는데, 특히 이들이 부가적으로 이러한 바이러스 작제에 수반된 부위-특이성 재조합효소 활성을 발현시키기 때문이다.
재조합 아데노바이러스는 일반적으로 바이러스 DNA를 캡시드화 세포주에 도입시켜 생산되며, 세포는 약 2 또는 3일 후에 용해된다(아데노바이러스 사이클의 동역학은 24 내지 36시간임). 방법을 시행하기 위해, 도입되는 바이러스 DNA는 완전 재조합 바이러스 게놈일 수 있으며, 적절한 경우 박테리아(WO 96/25506) 또는 효모(WO 95/03400)에서 작제된 다음, 세포로 형질감염된다. 바이러스 DNA는 또한 캡시드화 세포주를 감염시키는 경우에 이용되는 재조합 바이러스 형태일 수 있다. 바이러스 DNA는 또한 분획 형태로 도입될 수 있고, 각각의 분획은 재조합 바이러스 게놈의 일부와, 분획을 캡시드화 세포로 도입한 후 여러 분획 사이의 상동 재조합에 의해 재조합 바이러스 게놈을 재구성할 수 있는 상동성 영역을 운반한다.
세포가 용해된 후, 재조합 바이러스 입자는 세슘 클로라이드 구배에서 원심분리 또는 크로마토그래피와 같은 임의의 공지 기술에 의해 분리될 수 있다. 다른방법은 특히 본원에서 참고된 출원 FR 9608164에 기재되어 있다.
본 발명은 부가적으로 앞서 정의된 타입의 벡터, 바람직하게는 앞서 정의된 타입의 재조합 결손 아데노바이러스를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 양태에서, 본 발명에 따른 조성물은 다양항 양의 재조합 아데노바이러스를 포함할 수 있고, 양은 출원이 속한 업계의 숙련인이 쉽게 조절할 수 있다(예, 시험관내, 생체외 또는 생체내). 일반적으로, 조성물은 재조합 아데노바이러스 105내지 1015v.p, 바람직하게는 107내지 1012v.p.를 포함한다. 용어 v.p.는 조성물에 존재하는 바이러스 입자 수에 해당된다.
본 발명의 벡터 및 조성물은 시험관내 또는 생체내에서 세포로 핵산의 전달 및 조절된 발현에 이용되거나 이들 세포가 생체내 주입(또는 이식)되는 세포 중으로 핵산을 도입하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 앞서 정의된 핵산 또는 벡터를 포함하는 임의의 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 세포는 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포이다. 일 특히 바람직한 양태에서, 세포는 신경 세포, 특히 조상 신경 세포이다. 이러한 세포 집단의 예는 Buc et al(Neurobiol.Dis.2 (1995) 37)이 기재한 인간 신경 조상 세포이다.
이러한 관점에서, 본 발명의 일 특정 양태는 앞서 정의된 핵산을 포함하는 재조합 아데노바이러스에 의해 유전적으로 변형된 신경 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 앞서 정의된 세포를 포함하는 임의 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 부가적으로 생체내에서 해당 핵산을 발현시키는 조성물을 제조하기 위해 앞서 정의된 핵산 또는 벡터 또는 조성물의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 또한 생체내 신경계에서 해당 핵산을 발현시키는 조성물을 제조하기 위한 앞서 기재된 핵산 또는 벡터 또는 조성물의 사용에 관한 것이다.
일 특정 양태에서, 본 발명은 신경계에서 핵산의 조절된 발현 방법에 관한 것으로, 앞서 정의된 세포를 환자의 신경계에 이식하고, 테트라사이클린 또는 테트라사이클린 유사체를 환자에게 투여하여 발현을 조절하는 단계를 포함한다.
본 발명의 조성물은 각종 형태, 예를 들어 용액, 겔, 분말 등으로 존재할 수 있다. 이는 바람직하게는 멸균액, 예를 들면 등장성 식염(모노나트륨 또는 디나트륨 포스페이트, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등, 또는 이들 염의 혼합물)액 또는 경우에 따라 멸균수 또는 생리 식염을 첨가하여 용액을 만들 수 있는 건조, 특히 동결 건조 조성물이다. 히드로겔과 같은 기타 부형제도 이용될 수 있다. 이러한 히드로겔은 생물화합성 및 무-독성 중합체(단일중합체 또는 이종중합체)로부터 제조될 수 있다. 이러한 중합체는 예를 들면 출원 WO 93/08845에 기재되어 있다. 부가적으로, 본 발명에 따른 조성물을 적당한 용기, 예를 들면 병, 튜브, 앰풀, 포켓, 시린지, 작은 플라스크 등에 담을 수 있다.
앞서 지적했듯이, 본 발명의 조성물은 시험관내, 생체외 또는 생체내에 이용될 수 있다.
시험관내 또는 생체외 이용을 위해, 세포는 앞서 기재된 벡터 조성물의 존재하에 임의의 적당한 용기(플레이트, 접시, 포켓 등)에서 간단히 배양될 수 있다.이러한 형태의 적용을 위해, 아데노바이러스를 포함하는 조성물은 예를 들어 세포당 10 내지 5000 v.p., 바람직하게는 100 내지 2000 v.p.의 감염 중복도(MOI)로 이용될 수 있다.
생체내 사용을 위해, 본 발명의 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안구내, 경피 또는 종양내 경로 등에 의한 투여법에 따라 제형될 수 있다. 특히 세포 조성물에 대한 이러한 적용에서, 이용되는 조성물은 유리하게는 104내지 106세포, 좀더 바람직하게는 105내지 106세포를 포함한다. 또한, 이식된 조성물은 바람직하게는 고 밀도의 세포(약 105내지 106/㎕)를 포함한다. 이에 따라, 실시예에 제시된 결과는 고밀도의 세포를 이용하는 경우 이식을 좀더 쉽게 할 수 있고 이식된 세포의 생존을 증강시킴을 보여준다. 또한, 생체내 이식물의 생존을 증강시키기 위해, 차후는 아니더라도 동시에 또는 이전에 1 이상의 면역억제 화합물 또는 면역억제 처리를 행할 수 있다(Neuroscience 78 (1997) 685).
이러한 관점에서, 본 발명은 또한 생체내에서 핵산을 전달하는 방법에 관한 것으로, 앞서 기재된 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 라벨링 또는 생물효용 연구 또는 의료 목적으로 동물에서 병리 모델을 만들거나 인간에서 유전자 등의 조절을 연구하는데 이용될 수 있다.
발현을 조절하기 위해, 본 발명의 조성물은 유리하게도 tTA 트랜스액티베이터의 활성에 영향을 미칠 수 있는 테트라사이클린 또는 임의의 테트라사이클린 유사체를 포함한다. 이러한 유사체의 예는 독시사이클린(Kistner et al., PNAS 93(1996) 10933)이다. 본 발명에 이용될 수 있는 기타 유사체는 예를 들면 본원에서 참고되는 문헌[참조: Alvarez et al., Gene Ther. 4(1997) 993]에 기재되어 있다. 유사체 투여분은 이용된 유사체 및 작제물에 따라 숙련인이 쉽게 조절할 수 있다. 지시에 따르면, 0.1 ng/ml 독시사이클린 투여분이 본 발명의 작제물에서 시험관내 핵산 발현을 완벽히 차단하는데 충분하다.
본 발명은 특히 파킨슨병(PD)과 같은 신경퇴행성 질환을 치료(즉, 부분 또는 완전히 억제)하는데 특히 적당하다. PD는 흑질에서 도파미너직 뉴런의 진행성 상실이 특징적인 질환이다. 이러한 질환은 질환 징후를 조절하기 위해 L-DOPA로 치료되지만, 질환이 진행되면서 이러한 치료의 효능은 떨어진다. 본 출원은 생체내 도파민을 합성하는데 수반된 유전자(티로신 히드록실라제, TH)를 도입시켜 이러한 질환을 치료하는 유리한 대안을 제시한다. 도파미너직 화합물로 장기간 약물 처리하는 실험은 이러한 처리가 대부분의 경우에 운동 뉴런 반응에서 매우 원하지 않는 동요를 야기할 수 있는 조절이 되지 않는 보편적인 효과를 보여주었다. 본 발명은 정확하고 국부적인 L-DOPA 합성의 조절을 가능케 하기 때문에 조절 형태가 도파미너직 자극의 복합 메카니즘을 생리학적으로 재생하는 운동 반응을 얻는데 필수적인 이러한 종류의 증세에 특히 적합하다.
본 출원은 하기의 구체적이고도 비제한적인 실시예에 의해 좀더 상세하게 기재될 것이다.
I -재료와 방법
1.아데노바이러스 AdPGK.Tet.HTH-1의 작제
테트라사이클린-조절 시스템(tTA)의 트랜스액티베이터를 암호화하는 서열과 인간 사이토메갈로바이러스 최소 프로모터(hCMV)를 포함하는 DNA 단편을 플라스미드 pUMS-luc(Corti et al, Neuroreport 7 (1996, 1655)로부터 효소 Xho1과 Sca1으로 분해하여 절단한 다음, 이를 효소 BglII/ClaI으로 분해한 셔틀 플라스미드 pCMVlucIX(M.C. Geoffroy 제공) 중으로 삽입한다. 이렇게 함으로써 벡터 ptetIX가 생성된다. 뒤에 SV40 바이러스 폴리아데닐화 시그널이 따르는 인간 티로신 히드록실라제 I(hTH-1)(Grima B. et al., Nature 1987, 326:707-711)에 대한 cDNA를 함유하는 BglII/HindIII 단편을 벡터 ptetIX의 ClaI과 EcoRV 부위 사이에 삽입함으로써 벡터 ptetIXhTH-1이 생성된다. 벡터 ptetIXhTH에서 tTA의 발현을 조절하는 인간 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터(hCMVp)를 포스포글리세레이트 키나제(PGK)(Adra et al., Gene 1987; 60-65)에 대한 유전자의 편재성 쥐 프로모터로 대치한다. PGK 프로모터를 함유하는 XhoI/Sp1I 단편을 벡터 ptetIXhTH-1의 SpeI 부위와 Sp1I 부위 사이에 연결하여 플라스미드 pPGKtetIXhTH-1을 생성시킨다. 상동성 재조합을 위해(Stratford et al., J. Clin. Invest. (1992) 626), 벡터 pPGKtetIXhTH-1을 XmnI로 선형화하고 아데노바이러스 Adβgal의 ClaI 대단편과 함께, E1 영역을 트랜스상보하는 293 세포주에 공형질감염시킨다. 재조합 아데노바이러스 AdPGK.tet.hTH-1을 플라크 분석에 의해 2회 정제한다. 바이러스 스톡을 293 세포에서 증폭시킨 다음 구배 및 세슘 클로라이드에 이은 세파덱스 칼럼에서 정제함으로써 수득된다. 293 세포에서의 플라크 적정으로 측정한 바이러스 역가는 3.5 x 1010pfu/ml이다.
2.인간 신경 조상세포의 생성과 배양
인간 배아의 뇌 1차 배양액을 수득하여 전술한 바와 같이(Buc et al., Neurobiol. 10 (1995) 37) 기초 FGF로 보충한 무혈청 배지에서 시험관내 증식시킨다.
3.인간 신경 조상세포의 감염
시험관내 연구를 위하여, 세포를 웰당 6 내지 7 x 105세포 밀도로 12-웰 조직 배양판에 시딩한 다음 혈청이 결여된 규정 배지(DS-FM) 400 ㎕에서 선택된 감염 중복도(MOI)로 바이러스와 배양한다. 6시간 후에 상등액을 제거하고 동 부피의 DS-FM으로 대치한다. 감염 후 다양한 시기에 세포를 수거하여 원심분리하고(4000 RPM, 5분), 펠릿을 효소 분석을 위해 -80℃에서 동결시킨다(Reinhardt et al., LifeSciences (1986) 21-85).
이식을 위하여, 세포를 플레이트당 5 x 106세포 밀도로 6 cm 직경 조직 배양판에 시딩하여 세포당 40 pfu의 MOI로 AdPGK.tet.hTH-1 바이러스와 6시간 배양한다. 감염 다음 날 세포를 전술한 바와 같이 수거하고(Sabate et al., Nature Genetics, 9 (1995) 256), DS-FM 배지에서 4 x 105세포/㎕의 밀도로 재현탁시킨 다음 모든 이식 작업 중에 얼음 위에서 보관한다.
4.병변 및 뇌내 이식
뇌내 이식 5 내지 6주 전에, 6-히드록시도파민(6-OHDA)을 전술한 바와 같이(Morellou et al., Neuron 5 (1990), 393) 성체 스프라그-돌리(Charles-River) 래트의 좌측 상행 중선조체 도파민 작동관에 음주촉성으로 주사한다. 16마리의 래트를 kg당 1:1 비의 케타민(UVA)과 Rompun(Bayer)의 혼합물 800 ㎕에 의해 생성된 마취하에 이식한다. 10 ㎕ 해밀턴 시린지를 사용하여 세포 현탁액 1 ㎕를 하기 음주촉성 코디네이트에서 손상된 선조체상 두 부위 각각에 주사한다: 전정(前頂)(AB)으로부터 +0.7 전방, 중앙선(ML)으로부터 +2.5 측부, 경막 표면(V)상의 5 복측, 및 +1.5 AB, -2.5 ML, 5V(0으로 세팅한 출발선). 동물에 kg당 1일 사이클로스포린 10 mg을 주사한다.
5.현장 하이브리드화 및 면역조직화학
이식 4주 후에, 동물을 전술한 바와 같이(Sabate et al., loc. cit.) 관류시킨다. 뇌를 회수하여, 4% pfa에 고정한 다음, 20% 슈크로스를 함유하는 PBS 매질에보관한다. 뒤이어 15 ㎕ 절편을 수득한다.
디곡시게닌-태그 뉴클레오타이드(5′-XTTgCAgTgAgCCgAgATCgCgCC-3′)로 표지한 인간-특이성 alu 프라이머를 사용하는 하이브리드화에 의해 인간세포를 검출해낸다. 초기 변성단계(75℃에서 진탕하에, 95% 포름아미드, 0.1 x SSC에서 20분) 후에 절편을 전술한 바와 같이(Dumas et al., J. Chem. Neuroanat. 5 (1992) 11) 처리한다. 인간 TH의 엑손 1(5′-TgCCTgCTTggCgTCCAgCTCAgACA-3′)에 대한 35 황-표지 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 현장 하이브리드화에 의해 인간 TH-1 RNA가 이식물에서 검출된다. 하이브리드화 조건은 Laniece 등(J. Neurochem. 66 (1996) 1819)에 의해 기술된 것과 동일하다. 면역조직화학을 위해, 절편을 표준기술에 따라 처리한다.
II -결과
1.본 발명에 따른 조절 시스템의 조절하에 인간 TH-1을 암호화하는 아데노바이러스(AdPGK.tet.hTH-1)의 생성
단일 아데노바이러스 벡터를 사용하여 hTH-1 트랜스진의 조절된 발현을 달성하기 위하여, 초기에 두 벡터 사용에 기초한 테트라사이클린을 사용하는 tet-off 음성 조절 시스템을 변형시킨다. 테트라사이클린-민감성 tTA 트랜스액티베이터와 인간 TH-1 cDNA를 E1 및 E3 영역이 결실된 Ad5 아데노바이러스 골격 중으로 삽입시킨다. 벡터 AdPGK.tet.hTH-1에서, tTA 발현은 쥐 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 유전자의 편재성 프로모터의 조절하에 있는 반면에, 인간 TH의 전사는 tTA-민감성 최소 프로모터(CMV 프로모터)에 의해 조절된다. UMS 서열을 tTA와 CMV 프로모터 사이에 삽입시켜 두 전사 단위 간의 전사 방해를 제한한다.
2.AdPGK.tet.hTH-1에 의한 인간 신경 조상세포의 감염: 시험관내에서의 조절된 발현
AdPGK.tet.hTH-1 아데노바이러스가 인간 신경 조상세포에서 TH의 활발한 합성을 일으킬 수 있는지 여부를 측정하기 위하여, 세포를 다양한 감염 중복도로 감염시킨다(도 2a). 수득된 결과는 활성이 사용된 벡터 용량의 함수로서 감염세포에서 증가하여, AdPGK.tet.hTH-1 아데노바이러스가 기능성임을 입증한다.
독시사이클린에 의한 hTH-1 유전자의 발현 조절 가능성을 아데노바이러스-감염 세포에서 연구한다. 감염 직후에 배양배지에 항생물질을 가하였을 때(10 ng/ml), 어느 시기에서도, 심지어는 더 높은 바이러스 용량을 사용하였을 때에도 TH 활성을 증명할 수 없었다. 또한, TH 면역반응성을 보이는 어떠한 세포도 확인되지 않았다(도 2b와 2c).
이어서, 이미 트랜스진을 발현하고 있는 세포에서 결과적으로 유전자 발현이 저지될 수 있는 가능성도 시험한다. 이를 위해서. TH 활성이 세포에서 이미 검출가능할 때, 감염 5.5일 후에 배양배지에 독시사이클린을 가한다. 수득된 결과는 효소활성이 점진적으로 감소하여 독시사이클린 첨가 5.5일 후에는 거의 완전히 소멸함을 보여준다(도 3a). 따라서, 인간 신경 조상세포에 있어서 본 발명의 조건하에서 TH-1 유전자의 전사는 매우 효율적인 방식으로 음성적으로 조절될 수 있다.
트랜스진 활성을 재유도할 수 있는지 여부를 시험하기 위하여, 감염세포의 배양배지로부터 독시사이클린을 제거한 후에 TH 활성을 모니터한다(도 3d). 수득된결과는 TH 활성이 세포에서 점진적으로 증가하여, 독시사이클린에 의한 트랜스진의 억제가 가역적임을 시사한다.
유전자의 발현 억제에 요구되는 항생물질의 최소 용량을 측정하기 위하여, 이어서 세포를 감염 직후 다양한 농도의 독시사이클린과 배양한다(도 3c). 0.1 ng/ml의 농도는 TH 활성의 출현 방지에 충분한 반면에, TH 활성은 0.01 ng/ml의 용량에서 검출될 수 있다.
3.AdPGK.tet.hTH-1 아데노바이러스로 감염된 인간 신경 조상세포의 뇌 이식: 생체내 발현의 조절
본 실시예는 본 발명 시스템 및 특히, 아데노바이러스-감염 인간 신경 조상세포의 생체내 인간 TH의 발현 중개능과, 또한 특히 독시사이클린을 사용하는, 본 발명 시스템의 이러한 생체내 발현 조절능을 입증한다. 세포를 AdPGK.tet.hTH-1 아데노바이러스로 감염시킨 다음, 독소 6-OHDA를 주사하여 야기된 도파민 작동 경로의 일방 병변이 일어난 래트의 선조체에 이식한다. 이식 착수를 촉진하기 위하여, 고밀도로(4 x 105/㎕) 현탁시킨 다수의 세포(8 x 105)를 각각의 동물에 이식한다. 이식이 일어난 후에, 동물을 처리하지 않거나(n = 8) 독시사이클린(수중 1 mg/ml)으로 매일 처리한다(n = 8). 이식 4주 후에 래트를 참수시켜 뇌를 TH 발현에 대해 분석한다.
시험된 모든 뇌는 인간-특이성 alu 반복서열에 대한 올리고뉴클레오타이드 탐침과의 현장 하이브리드화에 의해 증명되는 바와 같이 인간세포의 생존 이식물을함유한다(도 4a). 독시사이클린을 처리하거나 처리하지 않은 동물 간에는 이식물의 크기 또는 출현에 있어 어떠한 차이도 관찰되지 않았다.
비처리 동물에서의 이식물은 상당한 TH 면역반응성을 보인다(도 4a). 따라서, 이식물내 TH 발현 세포의 수는 5 내지 10%인 것으로 평가되었다. 이식 후 무혈청 배지에서 6일간 재배양한 세포의 유사 %도 TH 면역반응성을 보인다. 이러한 결과는 시험관내에서와 동일한 조건하에서 유전자의 생체내 발현을 분명하게 증명한다.
한편, 독시사이클린을 투여한 어떠한 이식 동물에서도 TH 면역반응성을 보이는 세포가 검출되지 않았다(도 4b). 이러한 사실은 독시사이클린이 이식물에서 면역조직화학에 의해 검출될 충분량의 TH 출현을 효율적으로 억제함을 시사한다.
독시사이클린의 효과가 전사수준에서 유전자 발현의 엄격한 조절을 반영하는 여부를 설정하기 위하여, TH-1 mRNA 특이성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 절편에서 현장 하이브리드화를 수행한다. 비처리 동물내 이식물을 상당 범위까지 표지한다. 표지는 면역반응성 세포로 함께 위치가 결정된다(도 5a). 한편, 처리 동물의 이식물에서는 어떠한 특이적 표지도 검출되지 않았다(도 5b).
결론적으로, 이식된 인간 신경 조상세포에 의해 도입되는 아데노바이러스 컨텍스트내 본 발명 시스템에서 트랜스진의 전사를 독시사이클린이 효율적으로 억제한다고 말할 수 있다.
서열 목록
(1) 일반 정보:
(i) 출원인:
(A) 명칭: 로오느-푸우렌크 로레르 소시에테 아노님
(B) 거리: 아브뉴 레이몽 아롱 20
(C) 시: 앙토니
(E) 국가: 프랑스
(F) 우편 번호: 92165
(H) FAX: 33155717291
(ii) 발명의 명칭: 트랜스진 발현을 조절하는 신규 시스템
(iii) 서열 개수: 1
(iv) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환가능
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
(2) 서열 번호:1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 2502 염기쌍
(B) 타입: 뉴클레오타이드
(D) 형태: 선형
(ii) 분자형: cDNA
(iii) 가정: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: - tTA (A)
(B) 위치: 1..1040
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: - UMS (B)
(B) 위치: 1041..2069
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: - 7 OP (C)
(B) 위치: 2069..2362
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: - 1 OP
(B) 위치: 2070..2110
(ix) 특징:
(A) 명칭/키: - 최소 CMV 프로모터 (D)
(B) 위치: 2363..2502
(xi) 서열 설명: 서열 번호: 1:

Claims (18)

  1. a) 중간 프로모터의 통제하에 테트라사이클린-조절 시스템(tTA)의 트랜스액티베이터를 암호화하는 핵산을 포함하는 제 1 영역, 및
    b)tTA-민감성 프로모터의 통제하에 있는 해당 핵산을 포함하는 제 2 영역을 포함함을 특징으로 하고,
    두 영역 a)와 b)가 동일한 전사 배향으로 배열됨을 특징으로 하는 핵산.
  2. 제 1 항에 있어서, 두 영역 a)와 b) 사이에 배열되고 영역 a)와 b) 간의 전사 방해를 제한하는 제 3 영역 c)를 추가로 포함함을 특징으로 하는 핵산.
  3. 제 2 항에 있어서, 영역 c)가 전사 종결자, 바람직하게는 UMS 서열을 포함함을 특징으로 하는 핵산.
  4. 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 영역 a)에서, 중간 프로모터가 바람직하게는 구조적이고 조직 특이성인 세포 프로모터임을 특징으로 하는 핵산.
  5. 제 4 항에 있어서, 중간 세포 프로모터가 PGK, DHFR, EFla, β-액틴, β-글로빈 및 MHCa 유전자의 프로모터 중에서 선택됨을 특징으로 하는 핵산.
  6. 제 1 항 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 영역 b)에서, 해당 핵산이 해당 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산임을 특징으로 하는 핵산.
  7. 제 6 항에 있어서, 해당 단백질 또는 폴리펩타이드가 신경전달물질이나 이의 전구체 또는 이들의 합성효소 및 트로픽 인자 중에서 선택됨을 특징으로 하는 핵산.
  8. 제 1 항 내지 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 영역 b)에서, 프로모터가 포유동물 세포에서 기능하는 프로모터임을 특징으로 하는 핵산.
  9. a)PGK 유전자의 프로모터 조절하에서 테트라사이클린-조절 시스템(tTA)의 트랜스액티베이터를 암호화하는 핵산을 포함하는 제 1 영역, 및
    b)1 내지 10개의 tetOp 서열을 함유하도록 변형된 최소 CMV 프로모터의 조절하에서 인간 티로신 히드록실라제를 암호화하는 핵산을 포함하는 제 2 영역,
    c)UMS 서열을 포함하는 제 3 영역을 포함함을 특징으로 하고,
    두 영역 a)와 b)가 동일한 전사 배향으로 배열됨을 특징으로 하는 핵산.
  10. 제 1 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  11. 제 10 항에 있어서, 바이러스 벡터, 바람직하게는 아데노바이러스임을 특징으로 하는 벡터.
  12. 제 1 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 제 10 항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
  13. 제 12 항에 있어서, 포유동물 세포, 바람직하게는 인간세포임을 특징으로 하는 세포.
  14. 제 13 항에 있어서, 신경세포임을 특징으로 하는 세포.
  15. 제 9 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 아데노바이러스에 의해 유전자 변형되는 신경세포.
  16. 제 12 항 내지 15 항 중 어느 한 항에 따른 세포를 포함하는 조성물.
  17. 해당 핵산의 생체내 발현용 조성물 제조를 위한, 제 1 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 제 10 항에 따른 벡터 또는 제 16 항에 따른 조성물의 용도.
  18. 해당 핵산의 생체내 신경계에서의 발현용 조성물 제조를 위한, 제 1 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 제 10 항에 따른 벡터 또는 제 16 항에 따른 조성물의 용도.
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