JP2002529099A - トランスジーンの新規な発現調節系 - Google Patents
トランスジーンの新規な発現調節系Info
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Abstract
Description
法に関する。より特定的には本発明は、in vitro及びin vivoの
神経細胞内で核酸の発現をコントロールするために特に好適である。
も待ち望まれている技術である。細胞内の核酸の発現をコントロールすることが
できれば、例えば、in vitroまたはex vivoで、組換えタンパク
質の発現条件の改善、遺伝子の機能または調節の研究、ウイルス粒子の産生、i
n vivo移植用細胞の調製、などを行うことが可能になる。in vivo
では、動物モデルの特性の改良、化合物の生体内利用率もしくは毒性のより詳細
な研究、遺伝子の機能のより詳細な研究が可能になり、あるいは、例えば治療も
しくはワクチン製造を目的とする化合物の産生のより有効なコントロールが可能
になる。本発明の組成物及び方法はこのように生物工学のすべての分野で役立つ
。
れている。これらの方法は特に、組織特異的な転写プロモーターまたはベクター
の使用から成る。しかしながら、記載された系は、特にin vivoでは、期
待通りの特異性レベルを必ずしも示さない。また、発現を一時的にコントロール
することができない。
68(1995)1766)は、一方でテトラサイクリンによってコントロール
されるトランス作用因子tTAを使用し、他方でtTA感受性プロモーターを使
用する複合系を記載している。該系は発現の一時的調節に関して利点を与えるこ
とはできるが、現在までに記載された限りではまだ幾つかの欠点を有しており、
これらの欠点によってその利用が限られている。これらの欠点は、細胞毒性や発
現低下が観察されること、2つのベクターを使用する必要があること、などであ
る。
などの特性を有している新規な調節的発現系を提供する。
別な種類及び編成の要素から構成された遺伝子構築物に関する。
スベクターに関する。
伝子修飾された細胞、このような細胞を含む組成物、及び、目的とする所望の物
質をin vitro、ex vivoまたはin vivoで産生するための
このような細胞及び組成物の使用に関する。
oの細胞内、より特定的には神経細胞内で核酸を調節的に発現させる方法及び組
成物に関する。本発明の別の目的はまた、本発明の構築物またはベクターによっ
て遺伝子修飾された細胞(特に神経前駆細胞)のin vivo接種(または移
植)から成る、核酸のin vivo導入及び調節的発現方法に関する。
的発現系を記載している。この系はアデノウイルスに含まれているときに特に有
効であり、特に神経系ではin vitro及びin vivoの双方で効率的
な調節的発現を示し得る。
を中等度プロモーターのコントロール下に含む第一領域と、 (b)所望の核酸をtTA感受性プロモーターのコントロール下に含む第二領域
とから成り、 2つの領域(a)及び(b)が同一転写方向に配置されていることを特徴とする
核酸に関する。
)との間に配置されており領域(a)と領域(b)との間の転写干渉を制限する
第三領域(c)を含む。
コントロールするために有利な特性を有しているという知見から得られた。本発
明はまた、これらの構築物の有利な特性が部分的には種々の遺伝子要素の選択及
び編成に由来することを示す。
子の発現をコントロールするために使用されるプロモーターは中等度プロモータ
ーである。本文中で使用された“中等度プロモーター”なる用語は、その活性レ
ベルが中等である、即ち強いプロモーターの活性レベルよりも低いと当業者が考
えるようなプロモーターを意味する。より特定的には、本文中で使用された中等
度プロモーターなる用語は、生理的レベルの発現を許容する非ウイルスプロモー
ターを意味する。
用する既刊の文献(Gossenら,PNAS 89(1992)5547)に
記載された系と違って、本発明の構築物は、tTAトランス作用因子を哺乳類細
胞に毒性でないレベルで構成的に合成し得る。出願人はここに、細胞内でtTA
が中等レベルに維持されるとき、特に神経細胞内で遺伝子発現がより精密にかつ
より正確に調節され得ることを知見した。
で発現される遺伝子に由来するプロモーターである。遺伝子構築物を導入する予
定の細胞と同種の生物の細胞に由来する(または誘導される)プロモーターが有
利である。従って、本発明の構築物を動物体内への核酸導入に使用するとき、使
用される中等度細胞プロモーターは同種の動物または類縁の動物また近縁の動物
の細胞から誘導されるのが好ましい。異なる生物に由来するプロモーターを使用
することも勿論可能であり、例えば、使用されたプロモーターが機能する限りヒ
トの体内で発現させるためにネズミのプロモーターを使用してもよい。
ターである。従って本出願では、本発明の系の最良特性は構成性プロモーターを
使用するときにのみ得られること、即ち、このときに細胞内で安定なレベルのt
TAの存在及び維持が確保されることを証明する。
ホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)ま
たは延長因子1α(EF1α)の“ハウスキーピング”遺伝子のプロモーターの
ような遍在性プロモーターである。本発明の範囲内で使用できる別の中等度細胞
プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、グリア細胞特異的GFAP
(“Glial−specific fibrillary acidic p
rotein(グリア細胞特異的原線維酸性タンパク質)”の遺伝子、ニューロ
ン特異的NSE(“neuron−specific enolase(ニュー
ロン特異的エノラーゼ)”の遺伝子、β−アクチン遺伝子、β−グロビン遺伝子
、心筋細胞特異的MHCα(“myosis heavy chain α”の
遺伝子のプロモーター、あるいは、例えばNRSE−PGK型の複合プロモータ
ーがある。
性の構成性発現または特定の組織もしくは細胞型に限局された構成性発現を確保
し、好ましくは生理的発現レベルを得ることが可能な細胞プロモーターを意味す
る。PGKプロモーター(または該プロモーターの変異体)の使用は本発明の好
ましい実施態様を表す。例えば、後出の実施例は、該プロモーターの使用によっ
て構築物導入後の少なくとも1カ月間は所望の核酸のin vivo発現を維持
し得ることを示す。即ちこの期間中には所望の核酸を発現している細胞の数の減
少が全く観察されなかった。このような発現安定性は、従来技術の系に比較して
卓越した本発明の重要な利点の1つを表す。例えば、強いプロモーター(RSV
ウイルスのLTRのプロモーター)のコントロール下のβ−ガラクトシダーゼを
コードしているアデノウイルスを感染させた神経前駆細胞の移植組織では、移植
後1カ月以内に発現レベルの明らかな低下が観察される。これは安定性に関する
本発明の有利な特性を示しており、これらの特性は、tTA遺伝子の発現を指令
するために中等度プロモーターを使用したことに伴って予想外に得られたもので
ある。
)との配置にある。即ち、有利な配置ではこれらの2つの領域が、(i)同一転
写方向に配置されており、(ii)転写干渉を制限する領域(c)によって隔て
られている。
ルを改善するために)、2つのカセット(a)及び(b)を同一転写方向に配置
することが特に有利であることを示す。2つのカセットを逆向きに配置したとき
に発現コントロールの改善がしばしば観察されていただけに、この結果はむしろ
意外である。逆平行配置を有する構築物の場合に発現低下が報告されていたにも
かかわらず(Kojimaら,Biochem.Biophys.Res.Co
mmun 238(1997)569)、本発明の条件では対照的に、同一方向
に配置されたカセットがアデノウイルスに含まれているときにも発現低下は全く
生じない。。
域(b)との間に、(a)と(b)との間の転写干渉を制限する第三の領域(c
)を導入するのが特に有利である。“転写干渉”という表現は、領域(b)の核
酸の転写に対する領域(a)のプロモーターの影響または効果あるいはその逆を
意味する。より詳細には、“転写干渉”という表現は、単離状態で含まれている
ときの領域(b)の発現と領域(a)に機能的に結合したときの領域(b)の発
現との間に存在し得る差異を意味する。このような領域(c)は、好ましくは転
写終結因子から成り、好ましくはUMS配列を含む。UMS配列(“upstr
eam mouse sequence(上流マウス配列)”)は、ネズミのc
−mos遺伝子の上流で同定されたゲノム配列である(McGeadyら,DN
A 5(1986)289)。この配列は、転写終結因子として挙動する。本発
明はここに、これらの配列が、より特定的にはアデノウイルスに含まれていると
きに、特に神経系内での遺伝子のin vivo発現を有効にコントロールする
目的で有利に使用できることを示す。
に基づく。一方のカセットは、第二カセットの所望の核酸の発現を活性化し得る
転写因子を調節可能な条件下で発現させる。従ってこの第二カセット(領域b)
では、本発明の遺伝子構築物に適合した転写プロモーターを選択することが重要
である。即ち領域(b)で使用されるプロモーターはtTAトランス作用因子に
感受性のプロモーター、即ち、該トランス作用因子の存在下で活性が増加するプ
ロモーターである。従って構造的な見地から、該プロモーターは、その配列中に
またはその配列から機能性距離を隔てて、少なくとも1つのtTA因子結合部位
を含むプロモーターである(Gossenら,1992)。この結合部位または
オペレーター領域(OpまたはtetOp)は例えば、図6に示す配列または該
配列の機能性変異体を有し得る。1つの変異体は例えば、1つまたは複数の塩基
対の突然変異、欠失または付加によって遺伝子修飾されているがtTAトランス
作用因子に結合する能力を保存している配列に対応し得る。好ましくは、修飾は
図6に示す配列の10%未満に関連する。更に、領域(b)に存在するOp配列
は、1つまたは複数のコピー、例えば1−10コピー、好ましくは3−10コピ
ー、更に好ましくは3−8コピーで存在し得る。特定実施態様では、(b)に使
用されるプロモーターは、7個のオペレーター配列を含む。より好ましくは、所
望の核酸の発現の実質的なコントロールを確保するために、(b)に使用される
プロモーターは、基底活性が零ではないにしても極めて弱い基底活性を有してい
るのが望ましい。その結果として、このプロモーターはtTAの存在下でのみ活
性であることが観察され、従って調節が極めて厳密である。好ましくは、(b)
に使用されるプロモーターがtTAトランス作用因子に感受性の最小プロモータ
ーである。最小という特性は、基底活性が零ではないにしても極めて弱い基底活
性を有しているプロモーターを意味する。このようなプロモーターは一般に、転
写プロモーターの機能に必須の最小要素(例えばTATAボックス)を含んでお
り、例えばプロモーターの強さまたはプロモーターの調節に天然に関与する他の
領域は欠如している。このようなプロモーターは、様々な種類のプロモーターか
ら要素の欠失及び/または付加(“サイレンサー”)によって調製され得る。(
b)の好ましいプロモーターは、哺乳類細胞中で機能性であり、tTAの非存在
下で本質的に不活性であり、tTAトランス作用因子の存在下で刺激されるプロ
モーターである。“本質的に不活性の”という用語は、慣用の技術、特に酵素ア
ッセイ、免疫組織化学、微量透析またはHPLCなどの技術によって検出できる
発現産物(ポリペプチド)が全く存在しないことを意味する。しかしながらこの
用語は、PCRまたはその他の極めて高感度の検出技術によって検出可能である
が濃度レベルが実質的に有意でないmRNA分子の存在を排除しない。
特性を有し得る。使用されるプロモーターの選択は特に、所望の用途及び目的と
する遺伝子に依存する。従って、プロモーターは強いプロモーターもしくは弱い
プロモーターに由来してもよく、または、遍在性プロモーターもしくは組織/細
胞特異的プロモーターに由来してもよい。あるいは、生理学的状態または病態生
理学的状態に特異的なプロモーター(細胞分化の状態または細胞周期の幾つかの
段階に依存する活性をもつプロモーター)に由来してもよい。プロモーターの起
原は、真核細胞、原核細胞、ウイルス細胞、動物細胞、植物細胞、人工細胞また
はヒト細胞などでよい。プロモーターの特定例は、CMV、TK、GH、EF1
−α、APOなどの前初期遺伝子のプロモーター、または人工プロモーターであ
る。本発明に使用するためには、これらのプロモーターを“最小”にする、即ち
、tTAの存在に依存性にするのが好ましい。このために、出発プロモーターを
酵素で消化し、好ましくは1つまたは複数のOp配列に機能的に結合した後で、
プロモーターの活性を試験する。tetOp配列の数、及び、該配列から選択プ
ロモーターまでの距離は、該プロモーターの発現が厳密にtTA依存性になるよ
うに当業者によって適宜調節される。好ましくは、(b)に使用されるプロモー
ターは、Cortiら(Neuroreport 7(1996)1655)に
記載されているようなサイトメガロウイルス(CMV)、好ましくはヒトのサイ
トメガロウイルス(hCMV)の遺伝子の前初期プロモーターである。該文献の
記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
得る。従って、領域(b)の所望の核酸は好ましくは、所望のタンパク質または
ポリペプチドをコードする核酸である。本発明の意味に含まれる所望の産物の特
定例は、酵素、血液誘導体、成長ホルモンのようなホルモン、サイトカイン、リ
ンホカイン:インターロイキン、インターフェロン及びTNFなど(フランス特
許第9203120号)、増殖因子、例えばVEGFまたはFGFのような血管
新生促進因子、神経伝達物質またはそれらの前駆体またはそれらの合成酵素(チ
ロシンヒドロキシラーゼ:TH)、栄養因子、特に、神経変性疾患、神経系傷害
を生じた外傷性全身障害または網膜変性を治療するための神経栄養因子:BDN
F、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、NT3、NT5、HARP
/プレイオトロフィン、あるいは、骨成長因子、造血因子、など、ジストロフィ
ンまたはミニジストロフィン(フランス特許第9111947号)、凝血に関与
する因子:VII因子、VIII因子、IX因子をコードする遺伝子、自殺遺伝
子(チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ)、p21のような細胞周期に関
与するタンパク質、あるいは、依存性キナーゼを阻害するその他のタンパク質、
Rb、Gas−1、Gas−6、Gas−3、Gad 45、Gad 153、
サイクリンA、B、D、あるいは、平滑筋中の細胞増殖を制限するGAXタンパ
ク質(再発狭窄症の治療)、アポトーシスを誘発するタンパク質、または、p5
3、Bax、BclX−s、Badのようなその他の腫瘍抑制タンパク質、また
は、Bcl2及びBclX−1のその他のアンタゴニスト、ヘモグロビンの遺伝
子またはその他の輸送タンパク質の遺伝子、アポリポタンパク質A−I、A−I
I、A−IV、B、C−I、C−II、C−III、D、E、F、G、H、J及
びアポ(a)から選択されたアポリポタンパク質型の脂質の代謝に関与するタン
パク質に対応する遺伝子、リポタンパク質リパーゼ、肝性リパーゼ、レシチンコ
レステロールアシルトランスフェラーゼ、7−アルファ−コレステロールヒドロ
キシラーゼ、ホスファチジル酸ホスファターゼのような代謝酵素、あるいは、コ
レステロールエステル輸送タンパク質、リン脂質輸送タンパク質、HDL結合タ
ンパク質のような脂質輸送タンパク質、あるいは、LDL受容体、キロミクロン
レムナント受容体及びスカベンジャー受容体から選択される受容体、などがある
。
ト(ScFv)、または、免疫治療に役立つ認識能力を有している他の任意の抗
体フラグメントである。抗体フラグメントによる治療の対象は、例えば感染性疾
患、腫瘍(抗RAS抗体、抗p53抗体または抗GAP抗体)、または、多発性
硬化症のような自己免疫疾患(抗イディオタイプ抗体)である。
合の可溶性CD4受容体もしくは可溶性TNF受容体または筋無力症治療の場合
の可溶性アセチルコリン受容体;酵素の基質またはインヒビターとなるペプチド
、あるいは、例えば、喘息、血栓症または再発狭窄症の治療の場合のような受容
体または接着タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストとなるペプチド:人
工タンパク質、キメラタンパク質または一部欠失タンパク質、などである。所望
の必須ホルモンとしては、糖尿病に対するインスリン、成長ホルモン及びカルシ
トニンがある。
胞性mRNAの転写をコントロールし得る遺伝子またはアンチセンス配列でもよ
い。このような配列は例えば、欧州特許第140308号に記載の技術に従って
ターゲット細胞中に細胞性mRNAの相補RNAとして転写され細胞性mRNA
がタンパク質に翻訳されることを阻止し得る。治療用遺伝子はまた、ターゲット
RNAを選択的に破壊し得るリボザイムをコードする配列を含む(欧州特許第3
21201号)。
をコードする1つまたは複数の遺伝子を含み得る。従ってこの特定実施態様では
、特に微生物、ウイルスまたは癌を対象としたヒト用または動物用のワクチンま
たは免疫治療薬の開発に本発明を使用し得る。このようなペプチドは特に、エプ
スタイン・バールウイルス、HIVウイルス、肝炎B型ウイルス(欧州特許第1
85573号)、偽狂犬病ウイルス、“シンシチウム形成ウイルス”及びその他
のウイルスに特異的な抗原性ペプチドでもよく、あるいは、MAGEタンパク質
のような腫瘍特異的抗原(欧州特許第259212号)でもよい。
ミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、など)をコードし得る。
an(Inheritance in man,catalogs of au
tosomal dominant,autosomal recessive
,and X−linked phenotypes,Eighth edit
ion.John Hopkins University Press(19
88))、及びStandbury,J.B.ら(The metabolic
basis of inherited disease,Fifth ed
ition.McGraw−Hill(1983))に記載されている。所望の
遺伝子は、アミノ酸、脂質及びその他の細胞構成成分の代謝に関与するタンパク
質を包含する。
含み得る。最後に、核酸は、IRESによって適宜に隔てられている複数のコー
ディング領域を含むことができ、これによって複数の有益産物を産生し得る。
酸はより特定的に、神経伝達物質またはそれらの前駆体またはそれらの合成酵素
(チロシンヒドロキシラーゼ:TH)、または、栄養因子、特に神経変性疾患、
神経系損傷を生じた外傷性全身障害または網膜変性を治療するための神経栄養因
子をコードしている。
をPGK遺伝子のプロモーターのコントロール下に含む第一領域と、 (b)特にヒトのチロシンヒドロキシラーゼをコードする核酸を1−10個、好
ましくは3−8個、特に7個のtetOp配列を含むように修飾されたCMV最
小プロモーターのコントロール下に含む第二領域と、 (c)UMS配列を含む第三領域とから成り、 2つの領域(a)及び(b)が同一転写方向に配置されていることを特徴とする
核酸に関する。
核酸は、ゲノムDNA(gDNA)または相補的DNA(cDNA)である。本
発明の核酸は、実施例に示すような例えば核酸の合成、ライブラリーのスクリー
ニング、結合、酵素による切断、増幅、クローニング、などを含む当業者に公知
の技術によって作製できる(Maniatisら参照)。従って、異なる領域(
a)、(b)及び(c)を別々に作製し、次いで機能的に組立てる。即ち、同じ
転写方向で組立てる。領域(a)と領域(b)との間の間隔は本発明の構築物の
有効性を損なわない範囲で調節可能である。従ってこれらの領域間の距離は、例
えば0−3000bp、より普遍的には0−1000bp、好ましくは500b
p未満である。領域(a)と(b)との間のこの距離は一般に領域(c)の長さ
(領域(c)が存在する場合)及び使用されるベクターのクローニング能力によ
って決定される。当業者はこの距離を容易に調節できる。本発明の核酸は種々の
起原の要素、特に、原核細胞、真核細胞(動物、植物、ウイルス、など)、合成
または半合成の核酸に由来の種々の要素を含み得る。
明のベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、YAC、HAC、ト
ランスポゾン、エピソーム、ウイルス、などのような当業者に公知の任意のベク
ターでよい。本発明の好ましいベクターの種類は、例えば、アデノウイルス、A
AV、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスまたはある種のレトロウイルス(
特にレンチウイルス)のようなウイルスベクターによって代表される。本発明の
ウイルスはより好ましくは、神経細胞、特に神経細胞の前駆体に向性を有するウ
イルスである。この観点から本発明に含まれる特に好ましいベクターはアデノウ
イルスである。
アデノウイルス、即ち、そのゲノムがヘテロロガス核酸を含み細胞中で自律複製
できないアデノウイルスである。より好ましくは、本発明のアデノウイルスは少
なくともE1及びE3領域の全部または一部に欠陥を有している。
ち、領域E1及びE4の全部または一部と任意に領域E3に欠陥を有しているア
デノウイルスでもよい。
を含むアデノウイルスの使用から成る: −E1、E4及びE3、 −E1、E4及びE2、 −E1、E4、E2及びE3、 −上記領域とアデノウイルスの後期機能をコードする遺伝子(L1−L5)の全
部または一部、あるいは、 −ウイルスのコーディング領域全部。
ウイルスAd5のゲノムは完全に配列決定され、データベースでアクセスできる
(特に、GeneBank M73260参照)。同様に、別のアデノウイルス
(Ad2、Ad7、Ad13、イヌのアデノウイルスCAV−2、など)もその
ゲノムの全部ではないまでも一部が配列決定されている。更に、組換え欠陥アデ
ノウイルスの構築も文献に記載されている。従って、例えば、国際出願WO94
/28152、WO95/02697及びWO96/22378は、領域E1及
びE4の種々の欠失を記載している。また、国際出願WO96/10088は、
Iva2遺伝子の処に修飾を含むベクターを記載しており、国際出願WO94/
26914は動物起原のアデノウイルスを記載しており、国際出願WO95/2
9993はアデノウイルスの領域E2に関する欠失を記載している。
域E1に欠失を含み、この欠失は領域E1a及びE1bに関係する。特定例とし
て欠失は、(Ad5のゲノムを基準として)ヌクレオチド454−3328、3
82−3446または357−4020に関係する。
ているように、領域E4中の欠失は好ましくは読取り枠全体に関係し、例えば3
3466−35535もしくは33093−35535の欠失または領域E4の
一部分だけ(例えばORF6またはORF3)が欠失している。引用したこれら
の特許出願の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
ィング領域全部が欠失したアデノウイルス(“gutless”ベクター)の構
築が、例えばParksら,PNAS 93(1996)p.13565及びL
ieberら,J.Virol.70(1996)p.8944によって記載さ
れている。
酸は、領域E1、E3またはE4の処に欠失配列に置換してまたは付加配列とし
て挿入できる。該核酸はまた、ウイルスの産生に必要なシス位置の配列(ITR
配列及びキャプシド形成配列)以外の別の任意の部位に挿入できる。
好ましいアデノウイルスは、グループCのクラスのアデノウイルス、特に、2型
(Ad2)及び5型(Ad5)のアデノウイルスまたは7型(Ad7)もしくは
12型(Ad12)のアデノウイルスである。動物起原の種々のアデノウイルス
のうちでは、イヌ起原のアデノウイルス、特に、アデノウイルスCAV2のすべ
ての菌株が好ましい〔マンハッタン株またはA26/61株(ATCC VR−
800)〕。動物起原の別のアデノウイルスは特に、国際出願WO94/269
14に引用されている。該特許出願の記載内容は参照によって本発明に含まれる
ものとする。
スのゲノムに欠失している1つまたは複数の機能をトランス位置で相補し得る細
胞系において産生される。当業者に公知のキャプシド形成系の一例は、アデノウ
イルスのゲノムの一部分が組込まれた293細胞系である。より詳細には、29
3細胞系は、左側ITRを含むアデノウイルス血清型5(Ad5)のゲノムの左
側末端(約11−12%)と、キャプシド形成領域と、E1aとE1bとを含む
領域E1と、pIXタンパク質をコードする領域と、pIVa2をコードする領
域の一部分とを含むヒトの腎胚細胞系である。この細胞系は、領域E1に欠陥を
もつ組換え欠陥アデノウイルス、即ち、領域E1の全部または一部が欠失した組
換え欠陥アデノウイルスをトランス相補し、高い力価をもつウイルス予製液を産
生し得る。この細胞系はまた許容温度(32℃)で、温度感受性E2突然変異を
更に含むウイルス予製液を産生し得る。領域E1を相補し得る別の細胞系、特に
、ヒト肺癌細胞A549(国際特許WO94/28152)またはヒト網膜芽腫
(Hum.Gen.Ther.(1996)215)に基づく細胞系も記載され
ている。更に、アデノウイルスの複数の機能をトランス相補し得る細胞系も記載
されている。特に、領域E1及びE4を相補する細胞系(Yehら,J.Vir
ol.Vol.70(1996)pp.559−565;Cancer Gen
.Ther.2(1995)322;Krougliakら,Hum.Gen.
Ther.6(1995)1575)、及び、領域E1及びE2を相補する細胞
系(国際特許WO94/28152、WO95/02697、WO95/270
71)、または、上記の細胞系から誘導され、特にこのようなウイルスの構築に
関与する部位特異的リコンビナーゼ活性を更に発現するので最小アデノウイルス
を産生するために使用できる系が記載されている。
で(アデノウイルスのサイクル速度は24−36時間なので)約2−3日後に細
胞を溶解させることによって組換えアデノウイルスを作製する。この方法を実施
するために導入されるウイルスDNAは、細菌中(国際特許WO96/2550
6)または酵母中(国際特許WO95/03400)で適宜構築され、次いで細
胞にトランスフェクトされ得る組換えウイルスの完全ゲノムでよい。ウイルスD
NAはまた、キャプシド形成細胞系の感染に使用される組換えウイルスの形態で
もよい。ウイルスDNAはまた、組換えウイルスゲノムの一部分と相同領域とを
各々が含むフラグメントの形態で導入されてもよく、フラグメントがキャプシド
形成細胞に導入された後、種々のフラグメント間の相同的組換えによって組換え
ウイルスゲノムが再構築され得る。
の任意の技術によって組換えウイルス粒子を単離し得る。代替方法は特にフラン
ス特許出願FR9608164に記載されている。該特許出願の記載内容は参照
によって本発明に含まれるものとする。
定義のような組換え欠陥アデノウイルスを含む組成物に関する。この実施態様に
おいては本発明の組成物が可変量の組換えアデノウイルスを含み得る。該量は所
望の用途(例えば、in vitro、ex vivoまたはin vivo)
に応じて当業者が容易に調整し得る。組成物は組換えアデノウイルスを、一般的
には105−1015v.p.のオーダ、好ましくは107−1012v.p.
のオーダで含んでいる。v.p.なる用語は、組成物中に存在するウイルス粒子
の数に相当する。
ためにin vitroもしくはin vivoで直接使用されてもよく、また
は、in vivo接種(または移植)予定の細胞に核酸を導入するために使用
されてもよい。
する。これらの細胞は好ましくは、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞である。特
に好ましい実施態様では、細胞が神経細胞、特に神経前駆細胞である。このよう
な細胞集団は例えば、Bucら(Neurobiol.Dis.2(1995)
37)に記載されているようなヒトの神経前駆細胞である。
えアデノウイルスによって遺伝子修飾された神経細胞を含む。
成物を製造するための、上記に定義のような核酸またはベクターまたは組成物の
使用に関する。
れる組成物を製造するための、上記に定義のような核酸またはベクターまたは組
成物の使用に関する。
し、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体を患者に投与することによ
って該細胞の発現をコントロールする核酸の調節的発現方法に関する。
は一般に、好ましくは無菌の溶液、例えば無菌の等張性生理的塩類溶液(リン酸
一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カル
シウムまたは塩化マグネシウムなど、またはこれらの塩の混合物)の形態である
か、または、必要に応じて滅菌水もしくは生理的血清の添加によって溶液に復元
し得る乾燥組成物、特に、凍結乾燥組成物の形態である。ヒドロゲルのような別
の賦形剤も使用できる。このヒドロゲルは、細胞毒性でなく生体親和性である任
意のポリマー(ホモポリマーまたはヘテロポリマー)から調製できる。このよう
なポリマーは例えば、国際出願WO93/08845に記載されている。更に、
本発明の組成物は、瓶、管、アンプル、袋、シリンジ、小フラスコ(ballo
net)などのような任意の適当な型の容器に包装できる。
またはin vivoで使用できる。
器(プレート、皿、袋、など)内で、上記に定義のようなベクター組成物の存在
下で細胞をインキュベートするだけでよい。この種の用途の場合、アデノウイル
スを含む組成物は、細胞1個あたり、例えば10−5000v.p.の感染多重
度(MOI)、好ましくは100−2000v.p.の感染多重度で使用され得
る。
孔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮、腫瘍内、などの経路で投与できるよ
うに製剤化し得る。この用途で使用される組成物は、特に細胞性組成物の場合、
104−106個の細胞、より好ましくは105−106個の細胞を含むのが有
利である。更に、移植された組成物は好ましくは、細胞を高密度(約105−1
06細胞/μl)で含む。実際、実施例に示した結果は、高密度細胞を使用する
と移植物がより容易に取込まれ、移植細胞の生存率が向上することを示す。また
、in vivo移植細胞の生存率を更に向上させるために、1種または複数の
免疫抑制化合物または免疫抑制治療薬を、必ずしも移植後でなく移植と同時にま
たは移植よりも前に投与することが可能である(Neuroscience 7
8(1997)685)。
n vivo導入方法に関する。本発明は例えば、動物体内で病理学的モデルを
作製するためまたはヒト体内で遺伝子の調節などを研究するため、あるいはまた
、標識試験もしくは生体内利用率試験のためまたは医療目的で使用される。
Aトランス作用因子の活性に作用し得る任意のテトラサイクリン類似体を含むの
が有利である。このような類似体の一例はドキシサイクリンである(Kistn
erら,PNAS 93(1996)10933)。本発明で使用可能な他の類
似体は例えばAlvarezら(Gene Ther.4(1997)993)
によって記載されている。該文献は参照によって本発明に含まれるものとする。
類似体の用量は、類似体の種類及び使用される構築物に従って当業者が容易に調
整し得る。一例として、本発明の構築物中の核酸のin vitro発現を完全
に阻止するために十分なドキシサイクリンの用量は0.1ng/mlである。
、部分的または全面的な軽減)に特に適している。PDは黒質中のドーパミン作
動性ニューロンの進行性消失を特徴とする疾患である。病気の症状をコントロー
ルするためにL−DOPAによる治療が試みられたが、治療効果は病気の進行に
伴って低下する。本出願は、ドーパミンのin vivo合成に関与する遺伝子
(チロシンヒドロキシラーゼ、TH)の導入によってこの病気を治療するという
有利な代替方法を提供する。ドーパミン作動性化合物で長期間の薬理学的処置を
行った試験では、これらの処置が調節されない全身的作用を誘発し、殆どの場合
に、運動ニューロン応答が波動性を示すという極めて好ましくない結果を生じる
。本発明はこの種の状況に特に好適である。何故なら、本発明によればL−DO
PA合成を精密にかつ局所的にコントロールすることが可能であり、この種のコ
ントロールはドーパミン作動性刺激の複合メカニズムを生理的に再現する運動応
答を得るために必須であると考えられるからである。
例であるが本発明はこれらの実施例に限定されないことを理解されたい。
向末端反復配列(ITR)とキャプシド形成配列(ψ)とが示されている。pI
Xはアデノウイルスのタンパク質IXをコードする配列を表す。
のMOIで感染させたヒト神経前駆細胞を示す。示した値は4つの試験の平均値
である。
によって測定したin vitroヒト神経前駆細胞中のTHの産生を示す。パ
ネル(b)は非処理、パネル(c)は感染直後から7日目までドキシサイクリン
(10ng/ml)の存在下で処理。倍率はパネル(b)で360倍、パネル(
c)で220倍。
させた培養物中のhTH活性の消失速度(a)及び回復速度(b)。0日目(感
染の5.5日後)にドキシサイクリン(5ng/ml)を添加(a)または除去
(b)。非処理培養物中の0日目のhTH活性を100%とした。(c)は感染
11日後に測定したhTHの発現に対する種々の用量のドキシサイクリンの効果
を示す。数値は少なくとも4回の試験の平均値である。
感染させたヒト神経前駆細胞を線条体内に移植し、この移植細胞中のTHに対す
る免疫反応性を示す。免疫反応性は、(a)非処理動物、及び、(b)ドキシサ
イクリンで毎日処理した動物から採取した15μmの凍結乾燥脳切片〔lacu
na〕に対する抗TH免疫組織化学によって測定した。バイオレット染色(a)
(b)は、細胞をアルカリホスファターゼに結合した抗ジゴキシゲニン抗体と共
にインキュベーションし次に特異的基質で染色することによって、ジゴキシゲニ
ン標識aluプローブとハイブリダイズするヒト細胞の存在を検出する。倍率1
10。
感染させたヒト神経前駆細胞移植物中のTH免疫反応性を示す。免疫反応性は、
(a)非処理動物、及び、(b)ドキシサイクリンで毎日処理した動物から採取
した15μmの凍結乾燥脳切片に対して抗TH免疫組織化学、及び、35イオウ
標識HTH−1特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したin sit
uハイブリダイゼーションを行うことによって測定した。これらの切片をクレジ
ルバイオレットで対比染色した。倍率450。
小プロモーター(D)のヌクレオチド配列を示す。
ウイルスの最小プロモーター(PhCMV)をコードする配列を含むDNAフラ
グメントを、プラスミドpUMS−luc(Cortiら,Neurorepo
rt 7(1996)1655)から、酵素XhoI及びScaIで消化するこ
とによって切除し、酵素BglII/ClaIによって消化しておいたシャトル
プラスミドpCMVlucIX(M.C.Geoffroyから提供)に挿入し
た。このようにしてベクターptetIXが得られた。ヒトチロシンヒドロキシ
ラーゼI(hTH−1)のcDNA(Grima B.ら,Nature 19
87,326:707−711)とSV40ウイルスのポリアデニル化シグナル
とを順次に含むBglII/HindIIIフラグメントをベクターptetI
XのClaI部位とEcoRV部位との間に挿入し、これによってベクターpt
etIXhTH−1を作製した。ベクターptetIXhTH中のtTAの発現
をコントロールするヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーター(hCMV
p)をホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)のネズミの遍在性プロモーターの
遺伝子(Adraら,Gene 1987;60−65)で置換した。PGKプ
ロモーターを含むXhoI/SplIフラグメントをベクターptetIXhT
H−1のSpeI部位とSplI部位との間に挿入することによってプラスミド
pPGKtetIXhTH−1を作製した。相同的組換えのために(Strat
fordら,J.Clin.Invest.(1992)626)、ベクターp
PGKtetIXhTH−1をXmnIで直鎖化し、アデノウイルスAdβga
lの大きいClaIフラグメントと共に、領域E1をトランス相補する293細
胞系にコトランスフェクトした。組換えアデノウイルスAdPGK.tet.h
TH−1をプラークアッセイによって2回精製した。293細胞系で増幅し、塩
化セシウム勾配及びセファデックス(Sephadex)カラムで順次精製する
ことによってウイルス予製液が得られた。293細胞系のプラーク滴定によって
測定したウイルス価は3.5×1010pfu/mlである。
.10(1995)37)に記載されているように、塩基性FGFを補充した無
血清培地中でin vitro増殖させた。
たり6−7×105細胞の密度で細胞を播種し、選択した感染多重度(MOI)
のウイルスと共に400μlの無血清規定培地(DS−FM)中でインキュベー
トした。6時間後、上清を除去し、同量のDS−FMで置換した。感染後の種々
の時点で、細胞を採取し、遠心し(4000 RPM,5分)、ペレットを−8
0℃で凍結させ、酵素アッセイを行った(Reinhardtら,Life S
ciences,(1986)21−85)。
06細胞の密度で播種し、1細胞あたり40pfuのMOIのウイルスAdPG
K.t.thTH−1と共に6時間インキュベートした。感染の翌日、既刊の文
献(Sabateら,Nature Genetics,9(1995)256
)に記載の手順で細胞を採取し、DS−FM培地に1μlあたり4×105細胞
の密度で再懸濁させ、移植処理中を通じて氷上に保存した。
5(1990),393)に記載の手順で、スプレーグドーリーネズミ(Ch
arles−River)の成体の左上行中線条体ドーパミン作動性経路に、6
−ヒドロキシドーパミン(6−OHDA)を定位固定的に注入した。1kgあた
り800μlのケタミン(UVA)とロンプン(Bayer)との1:1比の混
合物で麻酔にかけた16匹のラットに移植処理を行った。10μlのHamil
tonシリンジを使用し、傷付けた線条体の2つの部位の各々に1μlの細胞懸
濁液を以下の定位固定座標に注入した:ブレグマ(AB)の+0.7前方,中央
線(LM)の+2.5側方,硬膜面(V)の5腹側、及び、+1.5AB,−2
.5LM,5V(出発線を0に設定)。動物に体重1kgあたり10mgのシク
ロスポリンを毎日注入した。。
流した。脳を摘出し、4%pfa中で固定し、20%ショ糖を含むPBS培地中
に保存した。次いで、15μmの切片を作製した。
的なaluプライマー(5′−XTTgCAgTgAgCCgAgATCgCg
CC−3′)を使用したハイブリダイゼーションによってヒト細胞を検出した。
初期変性段階(95%ホルムアミド、0.1×SSC中で撹拌下に75℃で20
分間)後、切片を既刊の文献(Dumasら,J.Chem.Neuroana
t.5(1992)11)に記載の手順で処理した。移植組織中のヒトTH−1
RNAをヒトTHのエキソン1に逆向きの35イオウ標識オリゴヌクレオチド
(5′−TgCCTgCTTggCgTCCAgCTCAgACA−3′)と共
にin situハイブリダイゼーションによって検出した。ハイブリダイゼー
ション条件は、Lanieceらによって記載された条件に等しい(J.Neu
rochem.66(1966)1819)。免疫組織化学のために、切片を標
準技術によって処理した。
るために、最初は2つのベクターの使用に基づいたテトラサイクリン依存性の負
の調節系tet−offを修飾した。テトラサイクリン感受性のtTAトランス
作用因子とヒトTH−1 cDNAとを、領域E1及びE3が欠失したアデノウ
イルスAd5の主鎖に挿入した。ベクターAdPGK.tet.hTH−1中で
、tTAの発現はネズミのホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)遺伝子の遍在
性プロモーターのコントロール下にあり、ヒトTHの転写はtTA感受性最小プ
ロモーター(CMVプロモーター)によってコントロールされている。2つの転
写ユニット間の転写干渉を制限するためにtTAとCMVプロモーターとの間に
UMS配列を挿入した。
THを合成できるか否かを判定するために、細胞を種々の感染多重度で感染させ
た(図2a)。得られた結果は、感染細胞中のTH活性がベクターの使用用量の
関数として増加することを示す。これは、アデノウイルスAdPGK.tet.
hTH−1が機能性であることを示す。
ノウイルス感染細胞中で試験した。感染直後に培養培地にこの抗生物質を添加す
ると(10ng/ml)、ウイルスの使用用量が最大のときにもTH活性はいか
なる時点でも全く観察されなかった。更に、TH免疫反応性を示す細胞は全く同
定されなかった(図2b及び2c)。
されるか否かを試験した。このために、細胞が既に検出可能なTH活性を有して
いる感染後5.5日目に培養培地にドキシサイクリンを添加した。得られた結果
は、酵素活性が次第に減少し、ドキシサイクリン添加の5.5日後にはほぼ完全
に消滅することを示す(図3a)。従って、ヒト神経前駆細胞に本発明の条件下
でTH−1遺伝子を転写すると、極めて有効な負の調節が得られる。
に、感染細胞の培養培地からドキシサイクリンを除去した後でTH活性をモニタ
ーした(図3d)。得られた結果は、細胞中のTH活性が次第に増加することを
示す。これはドキシサイクリンによるトランスジーンの阻害が可逆的であること
を表す。
めに、感染直後の細胞を種々の濃度のドキシサイクリンと共にインキュベートし
た(図3c)。0.01ng/mlの用量ではTH活性が検出可能であるが、0
.1ng/mlの濃度はTH活性の出現を阻止するために十分である。
胞がヒトTHのin vivo発現に介在する能力、及び、本発明の系がこのi
n vivo発現を特にドキシサイクリンを使用して調節する能力を証明する。
細胞にアデノウイルスAdPGK.tet.hTH−1を感染させ、次いで、毒
素6−OHDAを注入してドーパミン作動性経路に片側性病変を生じさせたネズ
ミの線条体に移植した。移植物の取込みを容易にするために、高密度(4×10 5 /μl)に懸濁させた多数の細胞(8×105)を各動物に移植した。移植後
、動物を非処理(n=8)で維持するかまたはドキシサイクリン(1g/mlの
水溶液)で毎日処理(n=8)した。移植の4週後に、ラットを殺し、脳のTH
発現を分析した。
situハイブリダイゼーションを行うことによって測定すると、試験した全
部の脳がヒト細胞の生存移植組織を含んでいた(図4a)。ドキシサイクリン処
理動物と非処理動物との間に移植組織のサイズ及び見かけの差異は全く観察され
なかった。
織中でTHを発現している細胞の数は5−10%であると推定された。移植後に
無血清培地中で6日間再培養した細胞では同様のパーセントの細胞がTH免疫反
応性を示す。これらの結果は、遺伝子の発現がinvivoでもin vitr
oでも同じ条件下であることをはっきりと示す。
す細胞は全く観察されなかった(図4b)。これは、ドキシサイクリンが移植組
織内で、免疫組織化学によって十分に検出し得る量のTHの発現を有効に阻害す
ることを表す。
ルを表しているか否かを確認するために、TH−1のメッセンジャーRNAに特
異的なオリゴヌクレオチドを使用して切片のin situハイブリダイゼーシ
ヨンを行った。非処理動物の移植組織はかなりの程度に標識されていた。標識は
免疫反応性細胞と共存していた(図5a)。これに反して、処理動物の移植組織
では特異的標識は全く検出されなかった(図5b)。
アデノウイルスに含まれている本発明の系のトランスジーンの転写を有効に阻害
すると言うことができる。
反復配列(ITR)とキャプシド形成配列(ψ)とが示されている。pIXはア
デノウイルスのタンパク質IXをコードする配列を表す。
ヒト神経前駆細胞を示す。示した値は4つの試験の平均である。
itroヒト神経前駆細胞中のTHの産生を示す。非処理。倍率は360倍。
itroヒト神経前駆細胞中のTHの産生を示す。感染直後から7日目までドキ
シサイクリン(10ng/ml)の存在下で処理。倍率は220倍。
培養物中のhTH活性の消失速度。0日目(感染の5.5日後)にドキシサイク
リン(5ng/ml)を添加。非処理培養物中の0日目のhTH活性を100%
とした。数値は少なくとも4回の試験の平均値である。
培養物中のhTH活性の回復速度。0日目(感染の5.5日後)にドキシサイク
リン(5ng/ml)を除去。非処理培養物中の0日目のhTH活性を100%
とした。数値は少なくとも4回の試験の平均値である。
培養物中のhTH活性。感染11日後に測定したhTHの発現に対する種々の用
量のドキシサイクリンの効果を示す。数値は少なくとも4回の試験の平均値であ
る。
たヒト神経前駆細胞を線条体内に移植し、移植細胞中のTHに対する免疫反応性
を示す。免疫反応性は、非処理動物から採取した15μmの凍結乾燥脳切片〔l
acuna〕に対する抗TH免疫組織化学によって測定した。バイオレット染色
は、細胞をアルカリホスファターゼに結合した抗ジゴキシゲニン抗体と共にイン
キュベーションし次に特異的基質で染色することによって、ジゴキシゲニン標識
aluプローブとハイブリダイズするヒト細胞の存在を検出する。倍率110。
たヒト神経前駆細胞を線条体内に移植し、移植細胞中のTHに対する免疫反応性
を示す。免疫反応性は、ドキシサイクリンで毎日処理した動物から採取した15
μmの凍結乾燥脳切片〔lacuna〕に対する抗TH免疫組織化学によって測
定した。バイオレット染色は、細胞をアルカリホスファターゼに結合した抗ジゴ
キシゲニン抗体と共にインキュベーションし次に特異的基質で染色することによ
って、ジゴキシゲニン標識aluプローブとハイブリダイズするヒト細胞の存在
を検出する。倍率110。
たヒト神経前駆細胞移植物中のTH免疫反応性を示す。免疫反応性は、非処理動
物から採取した15μmの凍結乾燥脳切片に対して抗TH免疫組織化学、及び、
35イオウ標識HTH−1特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用したi
n situハイブリダイゼーションを行うことによって測定した。これらの切
片をクレジルバイオレットで対比染色した。倍率450。
たヒト神経前駆細胞移植物中のTH免疫反応性を示す。免疫反応性は、ドキシサ
イクリンで毎日処理した動物から採取した15μmの凍結乾燥脳切片に対して抗
TH免疫組織化学、及び、35イオウ標識HTH−1特異的アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを使用したin situハイブリダイゼーションを行うことによ
って測定した。これらの切片をクレジルバイオレットで対比染色した。倍率45
0。
ーター(D)のヌクレオチド配列を示す。
Claims (18)
- 【請求項1】 (a)テトラサイクリン調節系のトランス作用因子(tTA
)をコードする核酸を中等度プロモーターのコントロール下に含む第一領域と、 (b)所望の核酸をtTA感受性プロモーターのコントロール下に含む第二領域
とから成り、 2つの領域(a)及び(b)が同一転写方向に配置されていることを特徴とする
核酸。 - 【請求項2】 更に、2つの領域(a)及び(b)の間に配置されており、
領域(a)と領域(b)との間の転写干渉を制限する第三領域(c)を含むこと
を特徴とする請求項1に記載の核酸。 - 【請求項3】 領域(c)が転写終結因子、好ましくはUMS配列を含むこ
とを特徴とする請求項2に記載の核酸。 - 【請求項4】 領域(a)の中等度プロモーターが細胞性プロモーター、好
ましくは組織特異的な構成プロモーターであることを特徴とする請求項1から3
のいずれか一項に記載の核酸。 - 【請求項5】 中等度細胞性プロモーターが、PGK、DHFR、EF1α
、β−アクチン、β−グロビン及びMHCαなどの遺伝子のプロモーターから選
択されることを特徴とする請求項4に記載の核酸。 - 【請求項6】 領域(b)の所望の核酸が所望のタンパク質またはポリペプ
チドをコードする核酸であることを特徴とする請求項1から5のいずれか一項に
記載の核酸。 - 【請求項7】 所望のタンパク質またはポリペプチドが神経伝達物質または
それらの前駆体またはそれらの合成酵素及び栄養因子から選択されることを特徴
とする請求項6に記載の核酸。 - 【請求項8】 領域(b)のプロモーターが哺乳類細胞中で機能性のプロモ
ーターであることを特徴とする請求項1から7のいずれか一項に記載の核酸。 - 【請求項9】 (a)テトラサイクリン調節系のトランス作用因子(tTA
)をコードする核酸をPGK遺伝子のプロモーターのコントロール下に含む第一
領域と、 (b)ヒトのチロシンヒドロキシラーゼをコードする核酸を1−10個のtet
Op配列を含むように修飾されたCMV最小プロモーターのコントロール下に含
む第二領域と、 (c)UMS配列を含む第三領域とから成り、 2つの領域(a)及び(b)が同一転写方向に配置されていることを特徴とする
核酸。 - 【請求項10】 請求項1から9のいずれか一項に記載の核酸を含むベクタ
ー。 - 【請求項11】 ウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターで
あることを特徴とする請求項10に記載のベクター。 - 【請求項12】 請求項1から9のいずれか一項に記載の核酸または請求項
10に記載のベクターを含む細胞。 - 【請求項13】 哺乳類細胞好ましくはヒト細胞であることを特徴とする請
求項12に記載の細胞。 - 【請求項14】 神経細胞であることを特徴とする請求項13に記載の細胞
。 - 【請求項15】 請求項9に記載の核酸を含む組換えアデノウイルスによっ
て遺伝子修飾された神経細胞。 - 【請求項16】 請求項12から15のいずれか一項に記載の細胞を含む組
成物。 - 【請求項17】 所望の核酸をin vivoで発現させる組成物を製造す
るための、請求項1から9のいずれか一項に記載の核酸、または、請求項10に
記載のベクター、または、請求項16に記載の組成物の使用。 - 【請求項18】 所望の核酸を神経系内でin vivoで発現させる組成
物を製造するための、請求項1から9のいずれか一項に記載の核酸、または、請
求項10に記載のベクター、または、請求項16に記載の組成物の使用。
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