JPH11503608A - グルコースで誘導し得る組換えウイルスベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 グルコースで誘導し得る発現シグナルに制御される異種遺伝子を一つ以上含む欠陥組換えウイルス、該ウイルスを含む医薬組成物、及び前記ベクターを使用して形質転換した細胞を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 グルコースで誘導し得る組換えウイルスベクター 本発明は、ウイルス由来の組換えベクター、これらのベクターの製造、これら のベクターを含む医薬組成物及びその治療的使用、特に遺伝子治療における使用 、より特定的には高血糖に関連した病気を治療及び／又は予防するための使用に 関する。 遺伝子治療は、病気に冒された細胞又は器官に遺伝情報を導入することによっ て欠陥又は異常（突然変異、異常発現等）を治すことからなる。前記遺伝情報は 一般的に、器官から抽出した細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで導入し、次いで修飾され た細胞を生体内に再導入するか、又は適当な組織にｉｎ ｖｉｖｏで直接導入し 得る。この遺伝情報の導入については様々な方法が記述されており、例えばＤＮ ＡとＤＥＡＥデキストランとの複合体（Ｐａｇａｎｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１ ９６７）８９１）、ＤＮＡと核タンパク質との複合体（Ｋａｎｅｄａら，Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２４３（１９８９）３７５）、ＤＮＡと脂質との複合体（Ｆｅｌｇｎ ｅｒら，ＰＮＡＳ ８４（１９８７）７４１３）、リポソームの使用（Ｆｒａｌ ｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１９８０）１０４３１）等を利用す る種々のトランス フェクション方法が提案された。 その後、前述の物理的トランスフェクション方法に代わる有望な方法として、 ウイルスを遺伝子移入用ベクターとして使用する方法が出現した。これに関して は、特定細胞集団の感染能力について種々のウイルスが試験された。特に、レト ロウイルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳ等）、ＨＳＶウイルス、アデノ関連ウイル ス及びアデノウイルスがそれである。 本発明はより特定的には、糖尿病のような高血糖関連疾患の治療に特に有用な 新規のウイルスベクターの開発に関する。 グルコース糖尿病は通常は慢性の症候群であり、最も特徴的な症状は、グルコ ースの腎閾値の増加が見られない状態で糖尿を引き起こす高血糖である。その主 因は、炭水化物だけでなくタンパク質及び脂肪の代謝異常も誘発するインスリン の絶対的又は相対的欠乏である。 糖尿病は通常インスリン投与によって治療するが、この治療法は患者の生活を 著しく拘束するものである。 本発明の目的は正確には、インスリンの適切なｉｎ ｖｉｖｏ濃度を調節的に 回復させることにより、生体内のグルコース代謝の乱れを補うことを可能にする 新規のウイルスベクターを 提供することにある。 周知のように、グルコースは大半の生物における遺伝子転写の調節因子である 。特に、グルコースは、肝細胞及び脂肪細胞内の解糖酵素及び脂質合成酵素をコ ードする遺伝子、例えば、肝臓内での解糖及び糖新生の調節で決定的な役割を果 たす組織特異的解糖酵素であるＬ型ピルビン酸キナーゼの遺伝子の転写を刺激で きることが判明した。肝臓におけるタンパク質Ｌ−ＰＫの発現は食物及びホルモ ンの制御下にある。グルコースの豊富な食餌によって誘発され、逆にグルコース の欠乏、及び糖尿病患者では抑制される。従って、前記タンパク質の遺伝子の発 現はグルコース／インスリン系によって正の調節を受け、グルカゴンによりその 第二のメッセンジャーサイクリックＡＭＰを介して負の調節を受けることが判明 した（Ａ．Ｋａｈｎ；Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６４，（１９８９，１１５８４ −１１５９０）。 最近になって本出願人は、前記酵素Ｌ−ＰＫの遺伝子のプロモーターの上流部 分における転写因子の種々の結合部位（エレメントＬ１〜Ｌ４）、特にグルコー ス／インスリン応答エレメント、即ちＧＩＲＥの特徴を解明した（Ａ．Ｋａｈｎ ；Ｊ．Ｍ ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０９，（１９８９），２０５−２１９）。即ち、ボックスＴ ＡＴＡから３’−５’方向でそれぞれ、肝細胞核因子１（ＨＮＦ１）の結合部位 であるエレメントＬ１、核因子１（ＮＦ１）の結合部位であるエレメント２、肝 細胞核因子４（ＨＮＦ４）の結合部位であるエレメント３、及び後期主要転写因 子（ｆａｃｔｅｕｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｎｅｌ ｍａｊｏｒ ｌａｔ ｅ）（ＭＬＦＴ）／ＵＳＦの結合部位であるエレメントＬ４が同定された（第１ 図参照）。グルコース／インスリン応答特異的エレメントは正確には、キャップ 部位からヌクレオチド−１６８〜−１４４の間、即ちエレメントＬ４内の完全パ リンドロームの形態で、Ｌ−ＰＫをコードする遺伝子内に局在していた（第２図 参照）。このＧＩＲＥは、ボックスＴＡＴＡ及びエレメントＬ１からなるＬ−Ｐ Ｋ最小プロモーターに、グルコースに対する転写応答を付与できることが判明し た。 本出願人は予想外のことに、グルコースに応答するという前記エレメントＧＩ ＲＥの素質を、遺伝子治療で所期のタンパク質の発現を変えるためにウイルスを 背景として利用することが可能なことを発見した。 より正確には、本発明は、グルコース又はその類似体の一つによって誘導し得 る発現シグナルの制御下の異種遺伝子を少なくとも一つ含む欠陥組換えウイルス に関する。 グルコースの類似体とは、グルコースと構造的に相同性を有し、発現シグナル の活性化を誘発できる任意の化合物を意味する。本発明で使用し得る類似体とし ては特に、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトース及びこれらの 物質に加水分解できる総ての糖が挙げられる。 本発明では、グルコースで誘導できる発現シグナルとは、結合した異種遺伝子 の後続の転写を条件付ける活性化が本質的にグルコース又はその類似体の一つの 存在下で誘発される任意の発現シグナル配列を意味する。 より特定的には、少なくとも一つの異種遺伝子の発現が、Ｌ型ピルビン酸キナ ーゼＬ−ＰＫをコードする遺伝子のプロモーターに全面的又は部分的に由来する 発現シグナルの制御下におかれるような組換え欠陥ウイルスを目的とする。より 正確には、前記発現シグナルは、Ｌ−ＰＫをコードする遺伝子のコーディング領 域（ｐｈａｓｅ ｃｏｄａｎｔｅ）の５’末端に位置する１８３ｂｐからなるフ ラグメントに全面的又は部分的に由来 する。 好ましくは、本発明の発現シグナルは、配列番号１の配列の全体又は一部を含 む。 好ましい実施態様では、この発現シグナルは少なくとも前記プロモーターのエ レメントＬ４の全体又は一部を含む。 エレメントＬ４は好ましくは、配列番号２の配列の全体もしくは一部、該配列 の全体もしくは一部とハイブリダイズする配列、又は該配列に由来し因子ＭＬＴ Ｆ／ＵＳＦと相互作用できる配列で表される。 本発明では、由来（誘導体）という用語は、一つ以上の修飾によって得られ、 元の配列の生物学的性質を少なくとも一つ保持しており、特に特異的結合因子（ この場合は因子ＭＬＴＦ／ＵＳＦからなる）と相互作用する能力を保持している 任意の配列を意味する。修飾とは、総ての突然変異、置換、欠失、付加、あるい は遺伝的及び／又は化学的性質の変化を意味する。これらの修飾は、当業者に公 知の方法で実施し得る。 本発明の変形実施態様では、エレメントＬ４が発現シグナル内で４個の連続オ リゴマーの形態で反復する。 本発明の好ましい実施態様では、発現シグナルはエレメント Ｌ４以外に、Ｌ−ＰＫをコードする遺伝子のプロモーターのエレメントＬ３の全 体又は一部を含む。 実際、エレメントＬ３はエレメントＬ４のより良い効果に寄与することが判明 した（Ａ．Ｋａｈｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０ ，（１９９２），Ｎｏ．８，ｐ．１８７１）。エレメントＬ３は好ましくは、配 列番号３の配列の全体もしくは一部、該配列の全体もしくは一部とハイブリダイ ズする配列、又は該配列に由来し因子ＨＮＦ４と相互作用できる配列で全面的又 は部分的に表される。 本発明の好ましい実施態様では、発現シグナルは、Ｌ−ＰＫをコードする遺伝 子のプロモーターのエレメントＬ４を、同じプロモーターのエレメントＬ３の上 流に融合したものからなる。従って、該発現シグナルはＬ４−Ｌ３と称する。よ り好ましくは、本発明の発現シグナルは４個の連続的Ｌ４−Ｌ３オリゴマーを含 む。 前記発現シグナルは更にいわゆる最小プロモーターも含む。 本発明では、最小プロモーターとは、結合した異種配列の転写を単独では効果 的に実現させることができない任意のプロモーター配列を意味する。この種のプ ロモーターの活性は、グル コースに応答するエレメントの活性化に全面的に依存することが判明している。 実際、この最小プロモーターは主に転写を方向づける役割を有する。このことを 考えれば、該最小プロモーターは、異種配列と一緒に連続的ヌクレオチド配列を 形成するように前記異種配列の上流に位置することが好ましい。 本発明では、一般的なプロモーター、例えばチミジンキナーゼ、クロラムフェ ニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼもしくはルシフェ ラーゼといった類いの遺伝子転写を活性化するものに由来する最小プロモーター 、又は特に、Ｌ型ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子のプロモーターに由来 する最小プロモーターを使用することが可能である。この最小プロモーターはヒ トＣＭＶに由来するものであってもよい。場合によっては、この種のプロモータ ーを、該プロモーターが単独では異種遺伝子の転写を実施できないようにする一 つ以上の遺伝子突然変異を介して最小にし得る。 同じ原理で、最小プロモーターは、所期の異種遺伝子の発現に生来的に関与す るプロモーターに由来するものであってもよい。 本発明で使用し得る最小プロモーターとして、より特定的に は、Ｌ−ＰＫをコードする遺伝子の５’末端に位置するフラグメント−１１９〜 １１に対応する配列が挙げられる。 一般的には、この最小プロモーターは、該プロモーターによって発現が制御さ れる核酸配列の上流に、該配列の生来のプロモーターを置換して又は置換せずに 配置する。実際、前記核酸配列の自己のプロモーターは残存し得るが、当業者に 公知の方法、特に除去、欠失及び／又は１個以上の塩基の付加によって、失活し た、又は非機能性になった形態で存在する。 より好ましくは、発現シグナルは全体的又は部分的に、配列番号４の配列又は その誘導体の一つに対応する。 一方、プロモーター部分は、活性化配列又は調節配列（特にエンハンサー配列 ）の付加により修飾して、プロモーターの強さをその誘導可能特性に影響を与え ずに高めることができる。特にプロモーターの強さを改善するために、我々は、 転写開始部位（ヌクレオチド１９１５〜２３７９に対応する配列番号６）に対し て遺伝子ＰＫ−Ｌの１８３ｂｐのプロモーターの前に、ヌクレオチド１９２０か らヌクレオチド２３２１までのマウスアルドラーゼＢの遺伝子の第一イントロン 内に存在する４０２ｂｐフラグメントが位置するハイブリッドベクターを構築 した。実施例に記載の結果は、この構築物が、グルコースに応答して遺伝子の発 現を５倍増加させることを示している。 本発明の発現シグナルの制御下におかれる異種核酸配列は、細胞、器官又は生 体内への挿入及び／又はそこでの発現が所望される一つ以上の治療用遺伝子を含 む。 このようにして挿入できる治療用遺伝子は、標的細胞内での転写、そして場合 によっては翻訳により、治療効果を有する生成物を産生する任意の遺伝子である 。 前記遺伝子は特に、治療効果を有するタンパク質性生成物をコードする遺伝子 である。このようにコードされるタンパク質性生成物は、タンパク質、ペプチド 、アミノ酸等であり得る。このタンパク質性生成物は標的細胞に対して相同であ り得る（即ち、標的細胞が病気をもっていない時には標的細胞内で普通に発現さ れる生成物）。その場合は、タンパク質の発現によって、例えば細胞内の不十分 な発現、又は修飾に起因して不活性もしくは低活性であるタンパク質の発現が改 善され、又は前記タンパク質が過剰発現される。治療用遺伝子は、増加した安定 性、改変された活性等を有する細胞タンパク質の突然変異体もコードできる。タ ンパク質性生成物は標的細胞に対して異種 であってもよい。その場合は、発現されたタンパク質が例えば細胞内の活性不足 を補うか又は満たして、該細胞が病気と戦えるようにし得る。 本発明における治療用生成物として、より特定的には、酵素、血液誘導体、ホ ルモン、例えばインスリン、リンホカイン：インターロイキン、インターフェロ ン、ＴＮＦ等（仏国特許出願公開明細書第９２０３１２０号）、成長因子、神経 伝達物質もしくはその前駆体、又は合成酵素、栄養因子（ｆａｃｔｅｕｒｔｒｏ ｐｈｉｑｕｅ）：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂ ＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５等、アポリポタンパク質：ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、 ＡｐｏＥ等（仏国特許出願公開明細書第９３ ０５１２５号）、ジストロフィン もしくはミニジストロフィン（仏国特許出願公開明細書第９１ １１９４７号） 等が挙げられる。 本発明の好ましい変形実施態様では、異種配列は、インスリン又はインスリン 変種をコードする遺伝子を一つ以上含む。本発明では、変種（ｖａｒｉａｎｔ） という用語は特にインスリンの種々の成熟形態、例えばプロインスリンを意味す る（Ｖｏｌｌｅｎｗｅｉｄｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７， （１９９２）１４６２９−１４６３６及びＧｒｏｓｋｒｅｕｔｚら，Ｊ．Ｂｉｏ ｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，（１９９４）６２４１−６２４５）。 より好ましくは、インスリンをコードし本発明のベクター内に存在する遺伝子 は、配列番号５の配列の全体又は一部を含む。 本発明のベクターは種々のウイルスから作成できる。好ましくは、アデノウイ ルス又はレトロウイルスに由来するベクターを使用する。 本発明のウイルスは欠陥性である。即ち、標的細胞内で自律的に複製すること ができない。従って通常は、本発明で使用する欠陥ウイルスのゲノムは、少なく とも、感染細胞内での前記ウイルスの複製に必要な配列を欠失している。これら の領域は除去するか（全体又は一部）、非機能性にするか、別の配列、特に例え ばインスリンの遺伝子のような所期の遺伝子をコードするＤＮＡ配列で置換し得 る。欠陥ウイルスは、それにもかかわらず、ウイルス粒子のキャプシド形成（ｅ ｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）に必要なゲノムの配列を保持するのが好ましい。 より特定的にアデノウイルスについては、構造及び性質が少し異なる種々の血 清型が特定化された。これらの血清型のうち、 本発明では、２型もしくは５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ２もしくはＡｄ５）、 又は動物由来アデノウイルス（仏国特許出願公開明細書第９３ ０５９５４号参 照）を使用するのが好ましい。本発明で使用し得る動物由来アデノウイルスとし ては、イヌ由来、ウシ由来、マウス由来（例えばＭａｖ１、Ｂｅａｒｄら，Ｖｉ ｒｏｌｏｇｙ ７５（１９９０）８１）、ヤギ由来、ブタ由来、トリ由来又はサ ル由来（例えばＳＡＶ）が挙げられる。動物由来アデノウイルスは好ましくはイ ヌアデノウイルス、より好ましくはアデノウイルスＣＡＶ２［例えばマンハッタ ン株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）］である。本発明では、ヒト 由来もしくはイヌ由来のアデノウイルス、又はこれらの混合物を使用するのが好 ましい。 好ましくは、本発明の欠陥アデノウイルスは、ＩＴＲ、キャプシド形成を可能 にする配列、及び所期の治療用タンパク質をコードする配列を含む。より好まし くは、本発明のアデノウイルスのゲノムでは、遺伝子Ｅ１と、遺伝子Ｅ２、Ｅ４ 、Ｌ１〜Ｌ５のうちの少なくとも一つとが非機能性である。所期のウイルス遺伝 子は当業者に公知の任意の方法、特に完全除去、置換、部分的欠失、又は所期の 遺伝子内への一つ以上の塩基の付加に よって非機能性にすることができる。この種の修飾はｉｎ ｖｉｔｒｏ（分離し たＤＮＡ上）で、又はその場で、例えば遺伝子工学技術を用いて、あるいは突然 変異誘発物質で処理することによって実施し得る。本発明の欠陥組換えアデノウ イルスは、当業者に公知の任意の方法で製造できる（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎ ｅ １０１（１９９１）１９５，欧州特許出願公開明細書第１８５ ５７３号； Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）２９１７）。 レトロウイルスについては、組換えベクターの構築は文献に広く記述されてい る。特に、Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄら，Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ３（１９９ １）２０３；欧州特許出願公開明細書第４５３２４２号、欧州特許出願公開明細 書第１７８２２０号、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７（１９８ ５）２３５；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３（１９８ ５）６８９等参照。特に、レトロウイルスは分割中の細胞に選択的に感染する完 全（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ウイルスである。レトロウイルスのゲノムは本質 的に二つのＬＴＲ、一つのキャプシド形成配列及び三つのコーディング領域（ｇ ａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を含む。レトロウイル スに由来する組換えベクターでは、遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖが通常は全 面的又は部分的に欠失し、所期の異種核酸配列で置換されている。これらのベク ターは種々のレトロウイルス、例えば特にＭｏＭｕＬＶ（ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｌ ｏｎｅｙ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ（マウスモロニー白血病ウイルス、別 称ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＶ（ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｌｏｎｅｙ ｓａｃｒｏｍａ ｖ ｉｒｕｓ（マウスモロニー肉腫ウイルス））、ＨａＳＶ（ｈａｒｖｅｙ ｓｃｒ ｏｍａ ｖｉｒｕｓ（ハーベイ肉腫ウイルス））；ＳＮＶ（ｓｐｌｅｅｎ ｎｅ ｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（脾臓壊死ウイルス）；ＲＳＶ（ｒｏｕｓ ｓａｃｒ ｏｍａ ｖｉｒｕｓ（ラウス肉腫ウイルス））又はフレンドウイルスから形成で きる。 所期の配列を含む組換えレトロウイルスを構築するためには通常、特にＬＴＲ 、キャプシド形成配列、及び前記所期の配列を含むプラスミドを構築し、次いで 、欠失したレトロウイルス機能をプラスミド内でトランスで引き起こすことがで きるキャプシド形成細胞系のトランスフェクションに使用する。従ってキャプシ ド形成細胞系は通常、遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖを発現することができる 。この種のキャプシド形成細胞系は 先行技術の文献に記述されており、特に細胞系ＰＡ３１７（米国特許明細書第４ ，８６１，７１９号）、細胞系ＰｓｉＣＲＩＰ（国際特許出願公開明細書第９０ ／０２８０６号）及び細胞系ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（国際特許出願公開明細書 第８９／０７１５０号）が知られている。細胞系の具体例としては特に、キャプ シド形成配列Ψを欠失しているマウスモロニー白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ） のゲノムを含むプラスミドであるｐＭＯＶ−Ψ^-によるトランスフェクションに よって、細胞系ＮＩＨ−３Ｔ３（マウス繊維芽細胞系）から形成される細胞系Ψ −２が挙げられる（Ｍａｎｎら，Ｃｅｌｌ，（１９８３），３３，１５３−１５ ９）。一方、組換えレトロウイルスは、転写活性を除去するためにＬＴＲに修飾 を含み得ると共に、遺伝子ｇａｇの一部を含む延長したキャプシド形成配列を含 み得る（Ｂｅｎｄｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）６１，１６３９）。形 成した組換えレトロウイルスは次いで一般的な方法で精製する。 本発明の特定実施態様では、レトロウイルスは、所期のタンパク質をコードす る遺伝子に結合した本発明の発現シグナルを含むレトロウイルスプラスミドを、 ゲノムがトランス遺伝子（ｔ ｒａｎｓｇｅｎｅ）をコードするウイルス粒子の産生を可能にすることになるト ランス相補的（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｎｔ）細胞系内にトランスフ ェクションすることによって製造し得る。 本発明を実施する場合は、欠陥アデノウイルス又はレトロウイルスを使用する と特に有利であり、レトロウイルスは特にインスリンの発現に有利である。 本発明のベクター内で、インスリンをコードする遺伝子の発現をグルコースに 制御される発現シグナルの制御下におき、この種のベクターを使用して細胞のト ランスフェクションを行うことにより、これらの細胞が生理学的含量のグルコー スの作用下でインスリンを産生できるようにする。これらの細胞は十分な生理学 的濃度のグルコースの存在下でインスリンのトランス遺伝子を発現できるように なる。 本発明の好ましい実施態様では、トランスフェクションされた細胞はグルコー ス検出内部システムを有する。このシステムはグルコース感知装置（ｍａｃｈｉ ｎｅｒｉｅ ｓｅｎｓｅｕｒ ｄｅ ｇｌｕｃｏｓｅ）とも称され、発現シグナ ルの活性化を誘発することができる。特定の種類の細胞、例えば肝細胞 及び膵臓β細胞は生来的に前記システムを備えている。これは、特に特異的酵素 、例えば輸送体Ｇｌｕｔ−２−グルコース及びグルコキナーゼからなるシステム である。この種の感知装置を備えていない細胞には、人為的に補充することが可 能である。この特定事例では、処理すべき細胞を、本発明のウイルスの注入の前 に又は同時に、酵素グルコキナーゼの輸送体Ｇｌｕｔ−２の合成を指令する遺伝 子構築物を用いてトランスフェクションする。 本発明の組換えウイルスによる肝細胞のような細胞のトランスフェクションは 、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで実施することができ、その結果ト ランスフェクションした細胞がインスリン分泌能力を示すようになる。本発明に おける優先的感染部位は、門脈のような天然のインスリン分泌部位である。 本発明は、一つ以上の本発明のウイルスに感染した哺乳動物、好ましくはヒト の細胞、より好ましくは肝細胞及び／又は膵臓β細胞にも関する。 本発明のベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏでインスリンの発現を誘発できると共に 、有利には、一般的なＡＭＰに起因してグル カゴンの作用下で前記分泌を即座に抑止することができる。このようにして、イ ンスリンの過剰分泌によって誘発される低血糖の危険が回避される。 従って、本発明のベクターは特に、グルコースでの誘発現象を介してｉｎ ｖ ｉｖｏで生体の特定部分、好ましくは、門脈循環のような、インスリンが普通に 分泌される部位で、インスリンの産生を制御するのに有利である。従って、本明 細の１種類以上のウイルスに感染した細胞は、肝臓、脾臓、膵臓又は腸に移植し 得る。 従って本発明は、特にインスリンに依存する糖尿病を治療するための新規の方 法を提供する。この方法は、グルコースの生理学的濃度に応答してｉｎ ｖｉｖ ｏでインスリン合成を誘発することからなる。 本発明のベクターをトランスフェクションした細胞が、例えばインスリン以外 の異種遺伝子の発現のイニシエーターである前記生理学的濃度のグルコースを含 まない特定の事例では、下記のプロトコルを検討することができる：グルコース 応答配列（Ｌ４−Ｌ３）に同じ影響を与えるグルコース又は類似体の濃度を、本 発明の発現シグナルの活性を介して所期のタンパク質 の発現を誘発するように調節する。この濃度が、注入ベクターの量と感染部位の 種類とタンパク質の所期の発現とに応じて決定されることは明らである。 前述のように、本発明は、特に高血糖に関連した疾患の治療及び／又は予防を 目的とする医薬組成物を製造するための上述のウイルスの使用にも関する。 本発明は、前述のような欠陥組換えウイルスを１種類以上含む医薬組成物にも 関する。これらの医薬組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻内投与、 静脈内投与、筋内投与、皮下投与、眼内投与、皮膚浸透（ｔｒａｎｓｄｅｒｍｉ ｃ）投与等に適するように配合し得る。好ましくは、本発明の医薬組成物は、注 射用組成物のための医薬的に許容し得るビヒクルを含む。これは特に、無菌等張 溶液、又は場合に応じて無菌水もしくは生理学的食塩水の添加により注射剤を構 成する乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得る。 注射に使用する欠陥組換えウイルスの用量は、種々のパラメーター、特にウイ ルスベクター、使用する投与方法、当該疾患又は所期の治療期間に応じて調整し 得る。一般的には、本発明の組換えウイルスは、１０⁴〜１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌ、 好ましく は１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの投薬量形態で配合し投与する。ｐｆｕ（ｐｌａ ｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ（プラーク形成単位））という用語は、ウイ ルス溶液の感染能力に対応し、適当な細胞培養物の感染によって決定され、一般 的には４８時間後の感染細胞プラークの数を示す。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の 測定方法は文献に記述されている。レトロウイルスに関しては、本発明の組成物 は産生細胞をそれらの移植のために直接含み得る。 本発明の別の利点及び特徴は、以下に記す本発明の非限定的実施例及び添付図 面によって明らかにされよう。 図面の説明 第１図：遺伝子Ｌ−ＰＫのプロモーター内で同定されたエレメントＬ１〜Ｌ４ の順番と、それぞれの結合タンパク質とを簡単に示す説明図である。 第２図：エレメントＬ４のパリンドロームの説明図である。 第３図：レトロウイルスプラスミドｐＨＳＧ（Ｌ４Ｌ３）４ＰＫＣＡＴ並びに クローンＦ６及びＢ８を部分的に示す説明図である。 第４図：クローンＢ８で形質転換した細胞ｍｈＡＴＩＩＩＦ 内のＣＡＴ活性の定量をグルコース注入量の関数として示すグラフである。 第５図：クローンＢ８で形質転換した細胞ｍｈＡＴＩＩＩＦ内のＣＡＴ活性の 種々の誘発時間での定量を示すグラフである。 第６図：プラスミドｐＨＳＧ／ＰＫ−ＣＡＴ及びｐＨＳＧ／ＡＬ−ＰＫ−ＣＡ Ｔの構築を示す説明図である。 第７図：種々の用量のグルコースによるプラスミドｐＨＳＧ／ＰＫ−ＣＡＴ及 びｐＨＳＧ／ＡＬ−ＰＫ−ＣＡＴの発現の誘発を示すグラフである。 分子生物学の一般的方法 分子生物学で一般的に使用されている方法、例えばプラスミドＤＮＡの分離用 抽出、塩化セシウム勾配でのプラスミドＤＮＡの遠心分離、アガロースゲルもし くはアクリルアミド上での電気泳動、エレクトロエリューションによるＤＮＡフ ラグメントの精製、フェノールもしくはフェノール−クロロホルムでのタンパク 質抽出、エタノールもしくはイソプロパノールによる食塩水中でのＤＮＡ沈降、 大腸菌内への形質転換等は当業者によく知られており、文献に広く記述されてい る［Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．， １９８２；Ａｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら（編），“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７］。 ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ及びＭ１３系列ファージといった類いのプラスミドは市 販のものである（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ）。 連結反応のために、ＤＮＡフラグメントは大きさに応じてアガロースゲル又は アクリルアミド電気泳動で分離し、フェノールで又はフェノール／クロロホルム 混合物で抽出し、エタノールで沈降させ、次いでファージＴ４のＤＮＡリガーゼ （Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造業者の指示に従い存在させてインキュベートし得る。 突出５’末端の充填は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント （Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造業者の指示通りに使用して実施し得る。突出３’末端 の破壊は、ファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を製造業者の 指示通り に使用し、その存在下で実施し得る。突出５’末端の破壊はヌクレアーゼＳ１を 用いて処理することにより実施する。 ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いる部位指向突然変 異誘発は、Ｔａｙｌｏｒらが開発した方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４］で、Ａｍｅｒｓｈａｍから市販され ているキットを用いて実施し得る。 ＰＣＲ法［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａ ｃｔｉｏｎ，Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０（１９８５）１ ３５０−１３５４；Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．及びＦａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．，Ｍ ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０］によるＤＮＡフラグ メントの酵素的増幅は、ＤＮＡサーマルサイクラー(Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ)を製造業者の指示通りに使用して実施し得る。 ヌクレオチド配列の確認は、Ｓａｎｇｅｒらが開発した方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７４（１９７７）５４６３−５４６７］によ り、Ａｍｅｒｓｈａｍから市販されているキットを用いて実施し得る。 実施例１：レトロウイルスベクターの構築 総てのプラスミドを標準的ＤＮＡクローニング方法で構築する。結合（ｊｏｎ ｃｔｉｏｎ）をＤＮＡ配列決定によって確認する。プラスミドｐＨＳＧ（Ｌ４Ｌ ３）４−ＰＫＣＡＴの構築物（第３図に示す）は、ｐＨＳＧＮｅｏの構成部分Ｍ ＭＬＶと、その上流でフラグメントＬ４Ｌ３が４回反復してオリゴマー化されて いる（ＧＩＲＥ及び隣接ＨＮＦ４結合部位）マウスＬ型ピルビン酸キナーゼ遺伝 子のプロモーター（ｂｐ−１１９〜＋１１）の制御下で遺伝子ＣＡＴをコードす る配列とを含む。Ｌ−ＰＫ転写開始部位の上流でｂｐ−１７２〜−１２３の間に 含まれているフラグメントに対応するフラグメントＬ４Ｌ３をＰＣＲによって得 た。使用したシグナル配列ｐｏｌｙＡは、ＭＭＬＶの３’末端のＬＴＲ内に存在 する配列である。プラスミドｐＨＳＧＮｅｏ（Ｇｕｉｌｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． １９８８，６２，３７９５−３８０１）ＭＭＬＶ由来レトロウイルスプラスミド 、細胞系ｐｓｉ−ＣＲＩＰ、ＭＭＬＶの構造タンパク質をトランスにもたらすア ンホトロピック（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｑｕｅ）相補的細胞系は、Ｄｒ．Ａ．Ｗ ｅｂｅｒ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｃｏｃｈｉｎ ｄｅ Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｉｒｅ，Ｐａｒｉｓ）から入手した。アミノグリコシド−ホスホト ランスフェラーゼ遺伝子がＲＳＶのＬＴＲのプロモーターの制御下にあるプラス ミドｐＲＳＶＮｅｏを同時トランスフェクションに使用する。 実施例２：細胞培養及びトランスフェクション 細胞系ｍｈＡＴＩＩＩＦは、肝臓に特異的な抗トロンビンＩＩＩプロモーター の制御下で早期遺伝子ＳＶ４０を発現するトランスジェニックマウスの肝臓腫瘍 に由来する（ＡＴＩＩＩ−ＳＶ４０）（Ｋａｈｎ Ａ．ら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ；２００，１７５−１８５）。これらの細胞を、グルタマックス−１を含 む栄養培地ＤＭＥＭ Ｆ１２／ＮＵＴ．ＭＩＸ．（１：１ ｖｏｌ／ｖｏｌ）、 又はＤ（＋）グルコース（Ｓｉｇｍａ）を含むもしくは含まない栄養培地ＤＭＥ Ｍ／ＨａｍＦ１２（１：１ ｖｏｌ／ｖｏｌ）に１μＭのデキサメタソン、１μ Ｍのトリオドチロニン、２０ｎＭのヒトインスリン、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の ＳＶＦ（ＦＣＳ）を添加した培地で培養する。細胞ＮＩＨ３Ｔ３及びｐｓｉ−Ｃ ＲＩＰは、ＤＭＥＭ（５．５ｍＭグルコース、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム ）に１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウシ新生児血清を加えた培地で培養する。 総ての培地にアンピシリン、ストレプトマイシン及びグルタミンを加え、培養物 を５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＣＯ₂と共に３７℃でインキュベートする。細胞ｐｓ ｉ−ＣＲＩＰをカチオンリポソーム法（ＤＯＴＡＰ，Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａ ｎｎｈｅｉｍ）でプラスミドｐＨＳＧ（Ｌ３Ｌ４）４−ＰＫＣＡＴ及びｐＲＳＶ Ｎｅｏと同時トランスフェクションし（これら二つのプラスミドのモル比は１０ ：１）、Ｇ４１８（８００μｇ／ｍｌ）の存在下で選択する。レトロウイルス産 生試験のために、Ｇ４１８に対して耐性のクローンを分離する。 実施例３：ウイルスＲＮＡの製造及び１ステップＰＣＲ−ＲＴ Ｇ４１８に対して耐性の細胞クローンを９０ｍｍウェル内に接種し、１００％ 集密状態まで培養する。細胞培養物の上清を細孔０．２２μｍの膜で濾過し、Ｄ ＮアーゼＩ（１０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で３０分間インキュベートし、次い で４℃で２０分間６５０００ｒｐｍで遠心分離する。レトロウイルスＲＮＡを抽 出し、沈渣をプロテイナーゼＫ及びフェノール／クロロホルム混合物で精製し、 次いでｔＲＮＡと一緒に同時沈降させる。試料を、１ｍＭのジチオトレイトール （ＤＴＴ）、４０ＵのＲＮＡｓｉｎ／１００μｍを含む水処理したピロ炭酸ジエ チルに溶解し、次いで逆転写酵素及び単一ステップＰＣＲにかける。増幅に使用 する二つのプローブは、ＭＭＬＶのＧａｇ部分（ｂｐ１５２４〜１５４４）に対 応する５’ＡＣＴＣＡＡＡＴＧＣＣＣＡＡＴＧＡＡＧＴＣ３’（配列番号７）、 及び遺伝子ＣＡＴのコーディング部分（翻訳開始部位に関してｂｐ３５〜１５） に対応する５’ＴＣＡＡＣＧＧＴＧＧＴＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴ３’（配列番号８ ）である。 アンチセンスＰＣＲプローブからの逆転写は、逆転写酵素８Ｕ ＡＭＶ（Ｐｒ ｏｍｅｇａ）により４２℃で１時間触媒し、次いでＤＮＡポリメラーゼＴａｑ２ ５ＵでのＰＣＲを３５〜４０サイクルで実施する。所期の増幅フラグメントは長 さが４４０ｂｐであり、遺伝子ｇａｇの一部、パターンＬ３Ｌ４を４回反復した もの、Ｌ−ＰＫ−１１９プロモーター、及び遺伝子ＣＡＴの最初の６９ｂｐを含 む。必要であれば、フラグメントＲＴ−ＰＣＲをクローニングし、配列決定する 。 実施例４：組換えレトロウイルスの製造 レトロウイルスベクターｐＨＳＧ（Ｌ４Ｌ３）４−１１９ＰＫＣＡＴ及びｐＲ ＳＶＮｅｏを、細胞系ｐｓｉ−ＣＲＩＰの同時トランスフェクションに使用する 。Ｇ４１８に耐性の７０個 のクローンを分析する。ＲＴ−ＰＣＲで陽性の８個のクローンは、感染性組換え レトロウイルスを産生する能力を示す。この能力は、細胞ＮＩＨ３Ｔ３のゲノム ＤＮＡの予想フラグメントの特異的ＰＣＲによって決定される。下記の二つのク ローンで、大きな力価のレトロウイルスの産生が明らかにされた：感染性レトロ ウイルスクローンＦ６（５．１０⁴）は、シグナル配列の完全領域（完全Ｌ４Ｌ ３フラグメントが４回反復（第３図参照））を有するレトロウイルスを産生し、 クローンＢ８（２．１０⁵）は、部分的に欠失したシグナル配列（単一の完全Ｌ ４Ｌ３パターン及び第二のパターンのカセットＬ３の小部分（第３図参照））を 有するレトロウイルスを産生する。 種々のｐＨＳＧ（Ｌ４Ｌ３）４１９９ＰＣＡＴ欠失を標準として使用して、半 定量的ＰＣＲ−ＲＴによりレトロウイルス力価を評価した。 実施例５：組換えレトロウイルスによる感染、レトロウイルス力価の評価及びタ ンパク質ＣＡＴの定量 産生したレトロウイルスの感染能力を評価するために、陽性クローンを使用し て細胞ＮＩＨ３Ｔ３に感染させる。 集密度１００％の細胞培養物の上清１ｍｌを使用して、８μ ｇ／ｍｌのポリブレンを加えて、対数増殖期の細胞ＮＩＨ３Ｔ３に感染させる。 ３時間インキュベートした後、ポリブレンを培地で２μｇ／ｍｌに希釈し、培養 を４８時間続ける。感染した細胞ＮＩＨ３Ｔ３のゲノムＤＮＡを抽出し、実施例 ３に記載のプローブを用いるＰＣＲ増幅に使用する。特異的増幅フラグメントの 検出は、感染細胞のゲノム内にレトロウイルス配列が取り込まれたことを意味す る。感染細胞のゲノムＤＮＡに由来する増幅ＤＮＡバンドの強さをレトロウイル スの種々の希釈物（１０²〜１０⁶分子）に由来するものと比較することにより、 力価を評価する。感染性レトロウイルスを産生するクローンを下記のプロトコル に従って細胞ｍｈＡＴＩＩＩＦと同時培養する： − ９０ｍｍウェル内に、底部を除去し壁面をシリコーン油で皮膜した６０ｍｍ ウェルを配置して、前記ウェルを二つの部分に分割する。 − 細胞ｍｈＡＴＩＩＩＦとレトロウイルスを産生する細胞とを、これら２種類 の細胞が混ざり合わないように注意しながら、前記ウェルの中央及び周辺にそれ ぞれ導入する。 − ６時間インキュベートした後、細胞がウェルに十分に固定 されたら、小さい方のウェルを除去する。培地を取り替えて新たに１６時インキ ュベートし、次いでポリブレンを加え（８μｇ）、細胞を４８時間培養する。 − ＣＡＴ活性を薄層クロマトグラフィーで測定し、シンチレーションによりｃ ｐｍで定量する。 実施例６：グルコースによる種々の用量及び時間でのキメラ発現の誘発 マウス肝細胞と同一視できる細胞系ｍｈＡＴＩＩＩＦは、遺伝子Ｌ−ＰＫの転 写活性化によりグルコースに応答する能力を保持するため、レトロウイルスベク ターで挿入したトランス遺伝子ＣＡＴの応答を試験するのに適しており、従って レトロウイルス環境内のＧＩＲＥ Ｌ−ＰＫの活性を調べるのに適している。 トランスフェクションの効果を高めるために、細胞ｍｈＡＴＩＩＩＦをレトロ ウイルス産生細胞と共に２回培養する。その結果、クローンＢでの感染率が十分 に大きくなる。第４図及び第５図から明らかなように、感染細胞ｍｈＡＴＩＩＩ Ｆ内でのトランス遺伝子Ｌ−ＰＫ／ＣＡＴの発現はグルコースによって確実に誘 発され、３〜４ｍＭのグルコースで最大誘発の半分の レベルが達成され、８ｍＭのグルコースで最大誘発が達成される。グルコース濃 度が高いと、ＣＡＴ活性は比較的安定な状態を維持する。 １７ｍＭのグルコースを含む培地で細胞ｍｈＡＴＩＩＩＦを培養し、インキュ ベーション開始後８時間目から遺伝子の誘導を観察する。２４時間目以前に誘導 の半分が達成され、４８時間目で最大誘導が達成される。 実施例７：プラスミドｐＨＳＧ／ＰＫ−ＣＡＴ及びｐＨＳＧ／ＡＬ−ＰＫ−ＣＡ Ｔの構築 標準的ＤＮＡクローニング方法でこれらのプラスミドを構築する。結合をＤＮ Ａ配列決定で確認する。プラスミド構築物ｐＨＳＧ／ＰＫ−ＣＡＴは１〜２０１ ５及び３８８８〜４４４５のヌクレオチド間に位置するｐＨＳＧのＭＭＬＶ部分 を含む。プラスミドｐＨＳＧ／ＡＬ−ＰＫ−ＣＡＴの場合は、配列ＭＭＬＶは１ 〜２０１５及び４２９０〜４８４７のヌクレオチドの間に存在する（第６図）。 マウスＬ型ピルビン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターの制御下で遺伝子ＣＡＴを コードする配列（−１８３〜＋１１ｂｐ）は、プラスミドｐＨＳＧ／ＰＫ−ＣＡ Ｔの場合はヌクレオチド２０４８〜３０３３の間に存在し、 プラスミドｐＨＳＧ／ＡＬ−ＰＫ−ＣＡＴの場合は２４５０及び３４３５の間に 位置する。アルドラーゼＢの遺伝子のエンハンサーフラグメントの配列（配列番 号６）は、プラスミドｐＨＳＧ／ＡＬ−ＰＫ−ＣＡＴ内でヌクレオチド２０３５ 及び２４３７の間に存在する。使用したシグナル配列ｐｏｌｙＡは、ｐＨＳＧ／ ＰＫ−ＣＡＴ内でヌクレオチド３０３３及び３８７３の間に位置し、ｐＨＳＧ／ ＡＬ−ＰＫ−ＣＡＴ内で３４３５及び４２７５の間に位置するＳＶ４０からの配 列である。ヌクレオチド２０１５〜２０４８、２２４２〜２４５２及び３８７３ 〜３８８８は、プラスミドｐＨＳＧ／ＰＫ−ＣＡＴの場合は、種々のフラグメン トの間のアダプターである。これらのヌクレオチドは、プラスミドｐＨＳＧ／Ａ Ｌ−ＰＫ−ＣＡＴでは、２０１５〜２０３５、２４３７〜２４５０、２６４４〜 ２６５４及び４２７５〜４２９０に位置する。 実施例８：種々の用量のグルコースによるプラスミドｐＨＳＧ／ＰＫ−ＣＡＴ及 びｐＨＳＧ／ＡＬ−ＰＫ−ＣＡＴの発現の誘発 細胞系ｍｈＡＴ３Ｆは、肝臓に特異的な抗トロンビンＩＩＩプロモーターの制 御下で早期遺伝子ＳＶ４０を発現するトラン スジェニックマウスの肝臓腫瘍に由来する（Ｋａｈｎ Ａ．ら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌ ｌ．Ｒｅｓ；２００，１７５−１８５）。これらの細胞を、グルタマックス−１ （Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含み、Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ）を含むかもしく は含まず、１μＭのデキサメタソン、１μＭのトリオドチロニン及び２０ｎＭの ヒトインスリンを添加した栄養培地ＤＭＥＭ Ｆ１２／ＮＵＴ．ＭＩＸ．（１： １ ｖｏｌ／ｖｏｌ）中で、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＣＯ₂と共に３７℃で培養 した。５μｇのプラスミドｐＨＳＧ／ＰＫ−ＣＡＴ又はプラスミドｐＨＳＧ／Ａ Ｌ−ＰＫ−ＣＡＴをカチオンリポソーム法（ＤＯＰＡＰ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）でトランスフェクションした。次いで、これらの細胞を種 々の濃度のグルコースの存在下で２４時間培養してＰＫ−Ｌのプロモーターを誘 導した。ＣＡＴ活性を薄層クロマトグラフィーで測定し、シンチレーションによ りｃｐｍで定量する。結果は第７図に示す。種々の濃度のグルコースの存在下で ２４時間誘導した後は、アルドラーゼＢエンハンサーの存在下でのプラスミドｐ ＨＳＧ／ＰＫ−Ｌの発現が、８ｍＭのグルコースの存在下で、アルドラーゼＢエ ンハンサーを欠失したプラスミドの場合の５倍の強さになってい る（第７図）。 従って、前記アルドラーゼＢ／ＰＫ−Ｌハイブリッドプロモーターは、特に適 当なｉｎ ｖｉｖｏ濃度のインスリンを血糖に応じて産生させる糖尿病遺伝子治 療方法の開発において、グルコースに対する感受性を保持しながら遺伝子に大き い発現レベルを与える上で特に有利である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 カーン，アクセル フランス国、エフ−75015・パリ、リユ・ ドユ・ドクトール−ル、10

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． グルコース又はその類似体の一つで誘導できる発現シグナルの制御下の異 種遺伝子を少なくとも一つ含む欠陥組換えウイルス。 ２． Ｌ型ピルビン酸キナーゼ（Ｌ−ＰＫ）をコードする遺伝子のプロモーター に全面的又は部分的に由来する発現シグナルの制御下の異種遺伝子を少なくとも 一つ含む欠陥組換えウイルス。 ３． 発現シグナルが、Ｌ−ＰＫをコードする遺伝子のコーディング領域の５’ 末端に位置する１８３ｂｐからなるフラグメントに全面的又は部分的に由来する ことを特徴とする請求項１又は２に記載のウイルス。 ４． 発現シグナルが、配列番号１で表される配列の全体又は一部を含むことを 特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルス。 ５． 発現シグナルが、少なくとも、Ｌ−ＰＫをコードする遺伝子のプロモータ ーのエレメントＬ４を含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記 載のウイルス。 ６． 前記エレメントが、配列番号２の配列、前記配列の全体もしくは一部とハ イブリダイズする配列、又は前記配列に由来し、因子ＭＬＴＦ／ＵＳＦと相互作 用することができる配列で全面的又は部分的に表されるエレメントＬ４である請 求項５に記載のウイルス。 ７． エレメントＬ４が発現シグナル内で４個の連続オリゴマーの形態で反復し ていることを特徴とする請求項５又は６に記載のウイルス。 ８． Ｌ−ＰＫをコードする遺伝子のプロモーターのエレメントＬ３も含むこと を特徴とする請求項５から７のいずれか一項に記載のウイルス。 ９． エレメントＬ３が、配列番号３の配列、前記配列の全体もしくは一部とハ イブリダイズする配列、又は前記配列に由来し、因子ＨＮＦ４と相互作用するこ とができる配列で全面的又は部分的に表されることを特徴とする請求項８に記載 のウイルス。 １０． 発現シグナルが、Ｌ−ＰＫをコードする遺伝子のプロモーターのエレメ ントＬ４を同じプロモーターのエレメントＬ３の上流に融合したものであるＬ４ −Ｌ３を含むことを特徴と する請求項１から９のいずれか一項に記載のウイルス。 １１． 発現シグナルが４個の連続するＬ４−Ｌ３オリゴマーを含むことを特徴 とする請求項１０に記載のウイルス。 １２． 発現シグナルが最小プロモーターも含むことを特徴とする請求項１から １１のいずれか一項に記載のウイルス。 １３． 前記プロモーターが、好ましくはＬ−ＰＫをコードする遺伝子の５’末 端に位置するフラグメント−１１９〜１１に対応する配列であることを特徴とす る請求項１２に記載のウイルス。 １４． 発現シグナルが配列番号４又はその誘導体の一つで表されることを特徴 とする請求項１から１３のいずれか一項に記載のウイルス。 １５． 発現シグナルが転写エンハンサーも含むことを特徴とする請求項１から １４のいずれか一項に記載のウイルス。 １６． 転写エンハンサーがマウスアルドラーゼＢ遺伝子の第一イントロンに由 来することを特徴とする請求項１５に記載のウイルス。 １７． 標的細胞内での複製に必要なゲノムの領域を欠失していることを特徴と する請求項１から１６のいずれか一項に記載 のウイルス。 １８． アデノウイルスであることを特徴とする請求項１から１７のいずれか一 項に記載のウイルス。 １９． Ａｄ２型もしくはＡｄ５型ヒトアデノウイルス、又はＣＡＶ−２型イヌ アデノウイルスであることを特徴とする請求項１７に記載のウイルス。 ２０． レトロウイルスであることを特徴とする請求項１から１７のいずれか一 項に記載のウイルス。 ２１． ＭｏＭｕＬＶファミリーのレトロウイルスであることを特徴とする請求 項２０に記載のウイルス。 ２２． 異種遺伝子がインスリン又はその変種の一つをコードすることを特徴と する請求項１から２１のいずれか一項に記載のウイルス。 ２３． 高血糖に関連した疾患の治療及び／又は予防を目的とする医薬組成物を 製造するための請求項１から２２のいずれか一項に記載のウイルスの使用。 ２４． 請求項１から２１のいずれか一項に記載の欠陥組換えウイルスを１種類 以上含む医薬組成物。 ２５． 注射可能な形態を有することを特徴とする請求項２４ に記載の医薬組成物。 ２６． １０⁴〜１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの 欠陥組換えアデノウイルスを含むことを特徴とする請求項２４又は２５に記載の 医薬組成物。 ２７． 請求項１から２１のいずれか一項に記載の１種類以上の欠陥組換えウイ ルスに感染した哺乳動物細胞。 ２８． ヒト細胞であることを特徴とする請求項２７に記載の細胞。 ２９． 肝細胞又は膵臓β細胞であることを特徴とする請求項２８に記載の細胞 。