KR19980703843A - 글루코스-유도성 재조합 바이러스 벡터 - Google Patents

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Abstract

글루코스-유도성 발현 시그널에 의해 조절되는 적어도 하나의 이종 유전자를 포함하는 결손 재조합 바이러스, 이를 함유하는 약학 조성물 및 상기 벡터를 사용하여 형질전환된 세포가 개시된다.

Description

글루코스-유도성 재조합 바이러스 벡터
유전자 치료는 유전 정보를 결함있는 세포 또는 기관내로 도입함에 의하여 결실 또는 이상(돌연변이, 이상 발현 등)을 치료하는 것으로 이루어진다. 전통적으로, 이러한 유전 정보는 기관으로부터 추출된 세포내로 시험관내에서 도입된 다음, 변형된 세포를 체내로 재도입함에 의하거나, 또는 유전 정보를 생체내 적절한 조직내로 직접 도입함에 의하여 체내로 도입이 이루어진다. 유전 정보를 도입하기 위한 상이한 기술들이 개발되었는데, 이 중에서 DNA 및 DEAE-덱스트란의 복합체[참고문헌; Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891], DNA 및 핵 단백질의 복합체[참고문헌; Kaneda et al., Science 243 (1989) 375], DNA 및 지질의 복합체[참고문헌; Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413], 리포좀의 사용[참고문헌; Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431]등을 수반하는 다양한 형질감염(transfection) 기술이 있다.
좀 더 최근에는, 유전자 전달을 위한 벡터로서 바이러스를 사용하는 것이 이러한 물리적 형질감염 기술에 대한 확실한 대안인 것으로 보여졌다. 이와 관련하여, 일정 세포군을 감염시킬 수 있는 능력이 있는지 알아보기 위해 상이한 바이러스들이 검사되었다. 특히, 레트로바이러스(RSV, HMS, MMS 등), HSV 바이러스, 아데노-수반 바이러스 및 아데노 바이러스[lacuna].
본 발명은 바이러스 기원의 재조합 벡터, 이 벡터의 재조방법, 이를 함유하는 약학 조성물 및 이의 치료적 용도, 특히 유전자 치료, 보다 상세히는 과혈당증 관련 질병의 치료 및/또는 예방에 관한 것이다.
도 1: L-PK 유전자 프로모터 내에 규명된 L1 내지 L4 엘리먼트 및 이들 각각에 대한 결합 단백질을 순서적으로 나타낸 도식도.
도 2: L4 엘리먼트의 팰린드롬에 대한 도시.
도 3: 레트로바이러스 플라즈미드 pHSG(L4L3) 4PKCAT 및 클론 F6 및 B8의 부분적인 도시.
도 4: 주입된 글루코스 양에 대한 함수로서, 클론 B8로 형질전환된 mhATIIIF 세포 내의 CAT 활성에 대한 정량적 측정.
도 5: 상이한 유도 기간에서 클론 B8로 형질전환된 mhATIIIF 세포 내의 CAT 활성에 대한 정량적 측정.
도 6: 플라즈미드 pHSG/PK-CAT 및 pHSG/AL-PK-CAT의 작제.
도 7: 상이한 투여량의 글루코스에 의한, 플라즈미드 pHSG/PK-CAT 및 pHSG/AL-PK-CAT의 발현 유도.
보다 상세히, 본 발명은 신규한 바이러스 벡터의 개발, 특히 당뇨병과 같은 과혈당증 관련 질병의 치료를 위한 특별한 관심이 있는 바이러스 벡터의 개발에 관한 것이다.
당뇨병은 대개 만성 증후군으로, 이의 특징적인 증상은 신장내 글루코스 역치가 상승하지 않는 상태에서 당뇨를 야기하는 과혈당증이다. 이의 주요인은 인슐린의 절대적 또는 상대적 부족으로서, 탄화수소의 대사 뿐만 아니라, 단백질 및 지방 대사의 이상을 유발한다.
당뇨병은 인슐린의 투여에 의해 일반적으로 치료되나, 이러한 치료는 환자들에게 매우 제한적이다.
본 발명의 목적은, 조절된 방식에 의한 적절한 생체내 인슐린 농도의 복구를 통해 상기 파괴된 글루코스 대사가 체내에서 보완될 수 있게끔 하는 신규한 바이러스 벡터를 제공하는 것이다.
글루코스는 살아있는 유기체 대부분의 유전자 전사를 조절하는 인자로 알려져 있다. 특히, 글루코스는 간세포 및 지방세포에서의 당분해 효소 및 지방형성 효소에 대한 암호화 유전자, 예컨대 간에서의 해당작용 및 당신생작용을 조절하는데 결정적인 역할하는 조직-특이적 당분해 효소인 L형 피루베이트 키나아제에 대한 유전자의 전사를 자극할 수 있다. 간에서의 L-PK 단백질의 발현은 영양 및 호르몬 조절 하에 놓인다. 이는 글루코스가 풍부한 식품에 의해 유도되고, 반대로,글루코스 결핍 및 당뇨병 환자에게서 억제된다. 따라서, 이 유전자의 발현은 글루코스/인슐린 시스템에 의해 양성적으로 조절되며 이차 메신저 시클릭 AMP를 통해 글루카곤에 의해서는 음성적으로 조절된다[참고문헌: A. Kahn; J. Bio. Chem. 264, (1989), 11584-11590].
최근에, 출원인은 L-PK 효소에 대한 유전자의 프로모터의 상부 영역에서 전사 인자에 대한 상이한 결합좌(binding sites)(L1 내지 L4 엘리먼트), 특히 글루코스/인슐린 반응 엘리먼트, 즉 GIRE를 규명했다[참고문헌: A. Kahn et al., J. Mol. Biol. 209, (1989), 205-219)]. 따라서, 그는 TATA 박스의 3'으로 부터 5'방향으로 시작하는, 간세포 핵 인자 1 (HNF1)에 대한 결합좌인 L1 엘리먼트, 핵인자 1 (NF1)에 대한 결합좌인 L2 엘리먼트, 간세포 핵인자 4 (HNF 4)에 대한 결합좌인 L3 엘리먼트 및 주요 후기 전사 인자 (MLTF)/USF (도 1 참조)에 대한 결합좌인 L4 엘리먼트를 각각 규명했다. 글루코스/인슐린 반응에 대한 특이적 엘리먼트는 정확하게는, L-PK 암호화 유전자 내에, 캡 좌로부터 -168 내지 -144 뉴클레오티드의 사이, 즉 L4 엘리먼트 내에 완전한 팰린드롬 형태로 위치되어 있다(도 2 참조). GIRE는 TATA 박스 및 L1 엘리먼트로 이루어진 최소 L-PK 프로모터 상에서 글루코스에 전사 반응을 전달할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
예기치 않게도, 출원인은 유전자 치료에서 해당 단백질의 발현을 조율하기 위해서 글루코스에 반응하는 이러한 GIRE 엘리먼트를 바이러스 범주 내에서 업그레이드할 수 있음을 보였다.
보다 상세히, 본 발명은 글루코스 또는 이들의 동족체 중 하나에 의해 유도될 수 있는 시그널 발현의 조절 하에 적어도 하나의 이종의 유전자를 포함하는 결손 재조합 바이러스에 관한 것이다.
글루코스 동족체는 글루코스와 구조적 상동을 보이며 시그널 발현의 활성을 유도할 수 있는 임의의 화합물을 망라하는 것으로 여겨진다. 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 동족체로는, 프락토스, 갈락토스, 수크로스, 락토스 및 이들 물질로 가수분해될 수 있는 모든 당이 특히 언급될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해서, 글루코스와 함께 유도될 수 있는 발현 시그널은, 수반된 이종 유전자의 후속 전사를 조절하는 활성이 글루코스 또는 이의 동족체의 존재하에서 필수적으로 유도되는 임의의 발현 시그널 서열을 망라한다.
보다 특히, 문제의 바이러스는 적어도 하나의 이종 유전자의 발현이 L형 피루베이트 키나아제(L-PK)에 대한 암호화 유전자의 프로모터로부터 전부 또는 일부 파생된 발현 시그널의 조절 하에 놓인다. 보다 특히, 상기 발현 시그널은 L-PK에 대한 암호화 유전자의 암호틀의 5' 말단에 위치한 183 bp로 이루어진 단편으로부터 전부 또는 일부 파생된다.
바람직하게, 본 발명에 따른 발현 시그널은 서열 번호 1의 서열의 전부 또는
일부를 포함한다.
바람직한 양태에 따라, 본 발현 시그널은 최소한 상기 프로모터의 L4 엘리먼트의 전부 또는 일부를 포함한다.
L4 엘리먼트는 서열 번호 2의 서열, 후자의 전부 또는 일부와 혼성화하는 서열 또는 그로부터의 파생된 서열의 전부 또는 일부에 의해 바람직하게 표현되며, MLTF/USF 인자와 상호작용할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해서, 유도체는 하나 이상의 변형에 의해 수득되며 본래 서열의 생물학적 성질 중 적어도 하나, 특히 MLTF/USF 인자로 이루어진 본 경우에서 특이적 결합 인자(들)과 상호작용하는 성능을 보유하는 임의의 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 변형은 임의의 돌연변이, 치환, 결실, 첨가 또는 유전적 및/또는 화학적 성질의 변형을 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 변형은 당업자에게 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 변이체 중에서, L4 엘리먼트는 발현 시그널 내에서 4개의 연속적인 올리고머 형태로 반복된다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 발현 시그널은 L4 엘리먼트 이외에, L-PK에 대한 암호화 유전자 프로모터의 L3 엘리먼트의 전부 또는 일부를 포함한다.
상기 L3 엘리먼트는 L4 엘리먼트의 증진된 효율에 기여하는 것으로 밝혀졌다[참고문헌: A. Kahn et al., Nucleic Acids Research 20, (1992), No. 8p. 1871]. L3 엘리먼트는 서열 번호 3의 서열, 후자의 전부 또는 일부와 혼성화하는 서열 또는 그로부터의 파생 서열의 전부 또는 일부에 의해 바람직하게 표현되며, HNF4 인자와 상호작용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라, 발현 시그널은 L-PK에 대한 암호화 유전자의 프로모터의 L3 엘리먼트의 상부에 융합되는 동일 프로모터의 L4 엘리먼트를 포함한다. 이후부터는 L4-L3로 명명한다. 보다 바람직하게, 본 발명에 따른 발현 시그널은 4번의 연속적인 L4-L3 올리고머를 포함한다.
발현 시그널은 소위 최소 프로모터를 추가하여 포함한다.
본 발명의 목적을 위해서, 최소 프로모터는 그 자체로는 이와 결합한 이종 서열의 전사를 효율적으로 제공할 수 없는 임의의 프로모터 서열을 의미한다. 상기 프로모터의 활성은 글루코스에 반응하는 엘리먼트의 활성화에 전적으로 의존하는 것으로 밝혀졌다. 실제로, 최소 프로모터의 대부분은 전사를 안내하는 기능을 가진다. 이 점에서, 이종 서열의 상부에 바람직하게 위치되어서 이와 함께 연속적 뉴클레오티드 서열을 형성한다.
본 발명에 따라서, 통상의 프로모터, 예를 들면, 티미딘 키나아제, 클로람페니콜, 아세틸트랜스퍼라아제, β-갈락토시다아제 또는 루시퍼라아제 유형의 유전자의 전사를 활성화하는 것들로 파생되거나, L형 피루베이트 키나아제에 대한 암호화 유전자의 프로모터로부터 파생되는 최소 프로모터가 사용된다. 또한, 최소 프로모터는 인간 CMV로부터 파생될 수 있다. 적절하게, 상기 프로모터는 그 자체로는 이종 유전자의 전사를 제공할 수 없는 하나 이상의 돌연변이 방편에 의해 최소로 제공될 수 있다.
동일 원리에 따라서, 최소 프로모터는 문제의 이종 유전자의 발현에 본래 책임이 있는 프로모터로부터 파생될 수 있다.
본 발명에 따라서 사용될 수 있는 최소 프로모터로서, L-PK에 대한 암호화 유전자 5' 말단에 위치한 -119 내지 11 단편에 상응하는 서열이 보다 특히 언급될 수 있다.
일반적으로, 최소 프로모터는 본래 프로모터에 대한 치환체 또는 대안물로서, 이에 의해 조절되는 핵산 서열의 상부에 위치한다. 핵산 서열에 속하는 프로모터는 그대로 존재할 수 있지만, 비활성화된 유형 또는 당업자에게 공지된 상이한 기술에 의해, 특히 제거, 결실 및/또는 한 개 이상의 염기 첨가에 의해 비-기능적 유형으로 존재할 수도 있다.
보다 바람직하게, 발현 시그널은 서열 번호 4의 서열 또는 이의 유도체 중의 하나와 전부 또는 일부 상응한다.
더군다나, 프로모터 영역은 활성 또는 조절 서열(특히, 인핸서 서열)을 첨가하므로써, 유도 성질에는 영향을 주지 않으면서 프로모터의 성능을 증가시킬 수 있도록 변형될 수 있다. 특히, 프로모터의 성능을 강화하고자, PK-L 유전자의 183-bp 앞에, 쥐 알도라제 B 유전자의 제 1 인트론에 위치한 전사 개시좌에 상대적인 1920 뉴클레오티드 부터 2321 뉴클레오티드까지(1915 내지 2379의 뉴클레오티드에 상응하는 서열 번호 6)의 402-bp 단편을 위치시킨 하이브리드 벡터를 작제한다. 실시예에서 제시된 결과는 이 작제물이 글루코스에 반응하여 인자 5에 의하여 유전자의 발현을 증가시킴을 보여준다.
본 발명에 따라 발현 시그널의 조절 하에 놓이는 이종 핵산 서열에 관하여, 이는 세포, 기관 또는 체내로 도입되거나 그 안에서 발현되는 하나 이상의 치료 유전자를 함유한다.
이러한 방식으로 도입될 수 있는 치료 유전자는 표적 세포 내에서 전사 및 적절한 장소에서의 해독에 의해 치료 효과를 지닌 산물을 생성하는 임의의 유전자일 수 있다.
특히, 상기 유전자는 치료 효과를 지닌 단백질성 산물에 대한 암호화 유전자일 수 있다. 이리하여, 암호화되는 단백질성 산물은 단백질, 펩티드, 아미노산 등일 수 있다. 이러한 단백질성 산물은 표적세포에 대하여 동종일 수 있다(즉, 표적 세포 내에서 정상적으로 발현되는 산물로서 아무런 병변을 보이지 않음). 상기 경우에, 단백질의 발현은 예를 들면, 세포내에서의 불충분한 발현 또는 변형으로 인해 비활성 또는 약활성인 단백질의 발현을 보충할 수 있으며, 또는 대안적으로 상기 단백질을 과발현시킬 수 있다. 치료 유전자는 증진된 안정도, 변형된 활성 등을 지닌 세포 단백질의 변이형을 암호화할 수도 있다. 단백질성 산물은 또한, 표적 세포에 관해 이종일 수도 있다. 이 경우에, 과발현된 단백질은 예를 들면, 세포내 부족한 활성을 보충 또는 공급함으로써 병변에 대항할 수 있도록 한다.
본 발명의 목적을 위한 치료 유전자 중에는, 효소, 혈액 유도체, 인슐린, 림포카인, 즉 인터류킨, 인터페론, TNF 등과 같은 호르몬(FR 92/03120), 생장 인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소, 영양 인자, 즉 BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 등: 전지질 단백질, 즉 ApoAI, ApoAIV, ApoE 등(FR 93/05125), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(FR 91/11947) 등이 보다 특히 언급될 수 있다.
본 발명의 바람직한 변이체에 따라, 이종 서열은 인슐린 또는 인슐린 변이체에 대한 적어도 하나의 암호화 유전자를 함유한다. 본 발명의 목적을 위하여, 변이체는 특히, 인슐린의 상이한 돌연변이형, 가령 프로인슐린을 망라한다[참고문헌: Vollenweider et al., J. Biol. Chem. 267, (1992) 14629-14636 and Groskreutz et al., J. Biol. Chem. 269, (1994), 6241-6245].
보다 바람직하게는, 본 발명에 따라 벡터내에 존재하는 인슐린에 대한 암호화 유전자는 서열 번호 5의 서열의 전부 또는 일부를 포함한다.
본 발명의 벡터는 상이한 유형의 바이러스로부터 마련될 수 있다. 바람직하게는, 아데노바이러스 또는 레트로바이러스로부터 파생된 벡터가 사용된다.
본 발명에 따른 바이러스는 결손형으로서, 즉 표적 세포내에서 자동적으로 복제할 수 없다. 일반적으로, 본 발명의 범주내에서 사용되는 결손 바이러스의 게놈은 감염된 세포내에서 바이러스의 복제를 위해 필요한 최소한의 서열이 부족하다. 이러한 영역은 제거되거나(전부 또는 일부) 또는 비기능적이거나 또는 다른 서열, 특히, 인슐린 유전자와 같은 해당 유전자에 대한 암호화 DNA 서열에 의해 치환될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 결손 바이러스는 바람직하게도, 바이러스 입자를 캡슐화하는데 필요한 게놈 서열을 보유한다.
보다 특히 아데노바이러스에 관하여, 구조 및 성질면에서 약간씩 상이한 혈청형이 규명되었다. 이러한 혈청형 중, 본 발명의 범주내에서 2 또는 5 유형(Ad 2 또는 Ad 5)의 인간 아데노바이러스 또는 동물 기원의 아데노바이러스가 바람직하게 사용된다(출원 FR 93/05954 참조). 본 발명의 범주내에서 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스 중에는 개, 소, 쥐(예: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 새 또는 원숭이(예: SAV) 기원이 언급될 수 있다. 개 아데노바이러스, 보다 특히 CAV2 아데노바이러스[예: 맨하탄 변종 또는 A26/61 (ATCC VR-800)]가 동물 기원의 아데노바이러스로 바람직하다. 바람직하게는, 인간 또는 개 또는 혼합 기원의 아데노바이러스가 본 발명의 범주내에서 사용된다.
바람직하게는, 본 발명의 결손 아데노바이러스는 ITRs, 캡슐화를 가능케하는 서열 및 해당 치료 단백질에 대한 암호화 서열을 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명의 아데노바이러스의 게놈에서, E1 유전자 및 E2, E4 및 L1-L5 유전자 중의 적어도 하나는 비-기능성이다. 문제의 바이러스 유전자는 당업자에게 공지된 기술, 특히 전체 제거, 치환, 부분 결실 또는 문제의 유전자(들)내 하나 이상의 염기의 첨가에 의하여 비-기능성으로 될 수 있다. 상기 변형은 시험관내(분리된 DNA 상에서) 또는 현장에서, 예컨대 유전 공학 기술에 의하여, 또는 돌연변이제의 처리에 의하여 수득될 수 있다. 본 발명에 따른 결손 재조합 아데노바이러스는 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 마련될 수 있다[참고문헌: Levreto et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917].
레트로바이러스에 관해서, 재조합 벡터의 작제는 문헌에 광범위하게 기술되어 있다[참고문헌: Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc]. 특히, 레트로바이러스는 분열하는 세포를 선택적으로 감염시키는 통합형 바이러스이다. 레트로바이러스의 게놈은 본질적으로 두 개의 LTRs, 캡슐화 서열 및 세 개의 암호화 영역 (gag, pol 및 env)을 포함한다. 레트로바이러스로부터 파생된 재조합 벡터에서, gag, pol 및 env 유전자는 일반적으로 전부 또는 부분 결실되어 있으며 해당 이종 핵산 서열에 의해 대체된다. 이러한 벡터는 특히, MoMuLV (뮤린 몰로니 류케미아 바이러스 또한, MoMLV로도 명명됨), MSV (뮤린 몰로니 사코마 바이러스), HsSV (하베이 사코마 바이러스), SNV (스플린 네크로시스 바이러스), RSV (라우스 사코마 바이러스) 또는 프렌드 바이러스와 같은 상이한 유형의 레트로바이러스로부터 생성될 수 있다.
해당 서열을 함유하는 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위하여, 특히 캡슐화 서열 및 상기 해당 서열을 함유하는 플라즈미드를 일반적으로 작제한 다음, 이를 플라즈미드내에 결핍된 레트로바이러스 기능을 트랜스로 제공할 수 있는 소위 캡슐화 세포주를 형질감염시키는데 사용한다. 일반적으로, 캡슐화 세포주는 gag, pol 및 env 유전자를 발현할 수 있다. 상기 캡슐화 세포주는 선행 기술, 특히 PA317 세포주 (미국 4,861,719), PciCRIP 세포주 (WO 90/02806) 및 GP+envAm-12 세포주 (WO 89/07150)에 기술되어 있다. 세포주의 예로서, ψ 캡슐화 서열이 결실된 몰로니 뮤린 류케미아 바이러스(MoMuLV)의 게놈을 함유하는 플라즈미드, pMOV-ψ-로 형질감염함에 의해 NIH-3T3 세포주 (쥐 섬유아세포 세포주)로부터 기원하는 ψ-2 세포주를 특히 언급할 수 있다[참고문헌: Mann et al., Cell, (1983), 33, 153-159]. 더군다나, 재조합 바이러스는 전사 활성을 제거하기 위해 LTRs에 관한 변형을 함유할 수 있으며, 또한 gag 유전자의 일부를 함유하는 연장된 캡슐화 서열 또한 함유할 수 있다[참고문헌: Bender et al., J. Virol. (1987) 61, 1639]. 이리하여, 수득된 재조합 레트로바이러스는 표준 기술에 의해 정제된다.
본 발명의 특별한 경우에, 레트로바이러스는, 본 발명에 따른 발현 시그널을 함유하며 해당 단백질에 대한 암호화 유전자와 커플링된 레트로바이러스 플라즈미드를, 트랜스진을 암호화하는 게놈을 지닌 바이러스 입자가 생성될 수 있도록 하는 트랜스보족성 세포주 내로 형질감염시키므로써 제조할 수 있다.
본 발명을 수행하기 위하여, 결손 재조합 아데노바이러스 또는 인슐린 발현에 가장 특히 유용한 레트로바이러스를 이용하는 것이 가장 특히 유리하다.
본 발명에 의한 벡터 내에, 글루코스에 의하여 조절되는 발현 시그널의 조절 하에 인슐린을 암호화하는 유전자를 발현시키고, 이러한 유형의 벡터를 이용하여 생체 내에서 세포를 형질감염시킴으로써, 이들 세포가 생리적 글루코스 함량의 영향에 의하여 인슐린을 생성하도록 유도한다. 이들 세포는 충분한 농도의 생리적 글루코스의 존재 하에 인슐린에 대한 트랜스진을 발현할 수 있게 된다.
본 발명의 바람직한 양태에 의하면, 형질감염된 세포는, 발현 시그널의 활성화를 유도할 수 있는, 글루코스 감지기라고도 명명되는 글루코스 검출을 위한 내부 시스템을 가진다. 간세포 및 췌장의 β 세포와 같은 일부 세포형은 본래 이를 가진다. 이러한 시스템은 특히, 트랜스포터 Glut-2-글루코스 및 글루코키나아제와 같은 특정 효소로 구성된다. 이러한 유형의 감지기가 없는 세포의 경우, 이를 인위적으로 보충할 것을 착상하는 것은 확실히 가능하다. 이러한 특정 경우에 있어서, 본 발명에 의한 바이러스의 주입 이전 또는 이와 동시에, 글루코키나아제를 위한 트랜스포터 Glut-2의 합성을 조절하는 유전적 작제물에 의하여, 처리될 세포가 형질감염된다.
본 발명에 의한 재조합 바이러스를 이용한 간세포와 같은 세포의 감염은 생체 외 및/또는 생체 내에서 수행될 수 있으며, 이와 같이 하여 형질감염된 세포는 인슐린을 분비할 수 있도록 된다. 본 발명의 범위 내에서 바람직한 감염 영역은 문맥(門脈)과 같은 본래의 인슐린 분비 영역이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 청구된 바이러스로 감염된 포유류, 바람직하게는 인간 세포, 및 보다 바람직하게는 간세포 및/또는 췌장 β 세포에 관한 것이다.
생체 내에서 인슐린 발현을 유도하는 능력외에도, 본 발명에 의한 벡터는 유리하게 전형적인 AMP의 결과로서 글루카곤의 영향 하에 그 분비가 즉시 제한되도록 한다. 이러한 방식으로, 과도한 인슐린 분비에 의하여 유도되는 저혈당증을 피할 수 있다.
결과적으로, 청구된 벡터는 글루코스를 이용한 유도 현상을 통하여, 생체 내에서 신체의 정확한 영역, 바람직하게는 문맥 순환과 같은 정상적인 인슐린 분비 영역 내의 인슐린의 생성을 조절하는데에 특히 유용하다. 하나 이상의 청구된 바이러스로 감염된 세포가 따라서 간, 비장, 췌장 또는 장 내에 이식될 수 있다.
따라서, 본 발명은 특히, 생리적 글루코스 함량에 따라 생체 내에서 인슐린의 합성을 유도하는 것으로 이루어지는, 인슐린-의존성 당뇨병의 치료에 관한 접근에 대하여 기술한다.
본 발명에 의한 벡터로 형질감염된 세포가 인슐린을 위한 유전자 이외의 이종 유전자 발현을 개시하는 생리적 글루코스 함량을 가지지 않는 특정 경우, 다음 방법을 착안할 수 있다: 글루코스 또는 글루코스 반응 서열(L4-L3)에 대하여 동일한 작용을 하는 동족체의 농도를 조절함으로써, 본 발명에 의한 발현 시그널의 활성을 통하여 문제시 되는 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 농도는 주입되는 벡터, 감염 영역의 성질 및 요구되는 단백질의 발현에 대한 함수로 측정된다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 또한 특히 과혈당증 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한 상기한 바이러스의 임의의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 상기한 결손 재조합 바이러스를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이들 약학 조성물은, 국소적, 경구적, 비경구적, 코 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 눈 내, 경피 등의 투여를 목적으로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 주사할 수 있는 조성물을 위한 약학적으로 허용되는 매개체를 포함한다. 그러한 조성물은 특히 멸균 등장 용액 또는 건조, 특히 적절한 생리 식염수 또는 멸균수의 첨가에 따라 주사할 수 있는 용액을 형성하는 동결건조된 조성물을 포함할 수 있다.
주입을 위하여 사용되는 결손 재조합 바이러스의 투여량은 상이한 파라미터 및 특히 바이러스 벡터, 사용되는 투여 방식, 문제시 되는 질병 또는 요구되는 치료 기간에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로 말하면, 본 발명에 의한 재조합 바이러스는 104내지 1014pfu/ml의 투여량으로 제조 및 투여된다. pfu(플라그 형성 단위)라는 용어는 바이러스 용액의 감염력에 상응하는 것이며, 적절한 세포 배양액을 감염시키고 일반적으로 48 시간 후에 감염된 세포의 플라그 수를 측정함으로써 결정된다. 바이러스 용액의 pfu 역치 결정 기술은 문헌에 잘 기술되어 있다. 레트로바이러스의 경우, 본 발명에 의한 조성물은 그 이식을 위하여 직접적으로 생성하는 세포를 함유할 수 있다.
하기의 실시예 및 도면은 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 기타 이점 및 특징들이 드러나도록 할 것이다.
일반적인 분자 생물학적 기술
플라즈미드 DNA의 예비 추출, 염화 세슘 구배 내 플라즈미드 DNA 원심분리, 아가로오스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동, 전기용출에 의한 DNA 단편의 정제, 단백질의 페놀 또는 페놀-클로로포름 추출, 식염 매질 내의 DNA의 에탄올 또는 이소프로판올 침전, 이.콜라이 내에서의 형질전환 등과 같이 분자 생물학에서 전형적으로 사용되는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌에 충분히 기술되어 있다 [참고문헌: Maniatis T et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley Sons, New York, 1987].
pBR322 및 pUC 유형의 플라즈미드 및 M13 시리즈의 파지는 상업적 공급원이다 (Bethesda Research Laboratories).
연결을 수행하기 위하여, DNA 단편을 그들의 크기에 따라 아가로오스 또는 아크릴아미드 전기영동에 의하여 분리하고, 페놀 또는 페놀-클로로포름 혼합물로 용출하고, 에탄올로 침전시킨 후, 공급자의 권유에 따라 T4 파지 DNA 리가아제 (Biolabs)의 존재 하에 배양시킬 수 있다.
공급자의 설명에 따라, 이.콜라이 DNA 중합효소 I (Biolabs)의 Klenow 단편으로 5' 돌출 말단의 충진을 수행할 수 있다. 제조자의 권유에 따라, T4 파지 DNA 중합효소 (Biolabs)의 존재 하에 3' 돌출 말단의 분해를 수행할 수 있다. 조절된 S1 뉴클라아제 처리에 의하여 5' 돌출 말단의 분해를 수행할 수 있다.
Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764]에 의하여 개발된 방법에 따라, Amersham으로부터 구입한 도구를 이용하여, 시험관 내에서 합성 올리고디옥시뉴클레오티드를 이용하는 영역-지정 돌연변이(site-directed mutagenesis) 유발을 수행할 수 있다.
소위 PCR [중합효소-촉매 연쇄 반응, Saiki P.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. 및 Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] 기술에 의하여, 제조자의 설명에 따라 DNA 열 사이클러 (Perkin Elmer Cetus)를 이용하여, DNA 단편의 효소적 증폭을 수행할 수 있다.
Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467]에 의하여 개발된 방법에 의하여, Amersham으로부터 구입한 도구를 이용하여, 뉴클레오티드 서열의 확인을 수행할 수 있다.
실시예 1: 레트로바이러스 벡터의 작제.
표준 DNA 클로닝 기술에 의하여 모든 플라즈미드를 작제할 수 있다. DNA 서열 분석에 의하여 접합(junction)이 확인된다. 플라즈미드 pHSG(L4L3)4-PKCAT(도 3)의 작제는, 4 회 올리고머화된 L4L3 단편의 상부(즉, GIRE 및 인접한 HNF4 결합 영역)가 연결되는 쥐 피루베이트 키나아제 유형 L 유전자 (bp -119 내지 +11)의 프로모터의 조절 하에 CAT 유전자를 암호화하는 서열 및 pHSGNeo의 MMLV 작제 부분을 함유한다. L-PK 전사 개시 영역의 상부인 bp -172 내지 -123으로 한정된 단편에 상응하는 L4L3 단편이 PCR에 의하여 수득된다. 사용되는 polyA 시그널 서열은 MMLV의 3' 말단의 LTR 내에 존재하는 것이다. 플라즈미드 pHSGNeo (Guild et al., J. Virol. 1988, 62, 3795-3801), MMLV로부터 유도된 레트로바이러스 플라즈미드 및 MMLV의 구조 단백질을 트랜스로 공급하는 암포트로핀 보족성 세포주인 psi-CRIP 세포주가 Dr A. Weber (Cochin Institute of Molecular Genetics, Paris)에 의하여 수득된다; 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제 유전자가 RSV LTR 프로모터의 조절 하에 있는 플라즈미드 pRSVNeo가 동시형질감염을 위하여 사용된다.
실시예 2: 세포 배양 및 형질감염
mhATIIIF 세포주는, 간-특이성 안티트롬빈 III (SV40 ATIII) 프로모터의 조절 하에 SV40 초기 유전자를 발현시키는 트랜스제닉 마우스 내의 간 종양으로부터 생겨난 것이다 (Kahn A et al. Exp. Cell. Res. 200, 175-185). 이들 세포는 글루타맥스-1을 구비한 DMEM F12/NUT. MIX (1:1 부피/부피) 영양 매질, 또는 D(+)-글루코스 (Sigma)가 구비 또는 구비되지 않고, 1 μM 덱사메타손, 1μM 요오도티로닌, 20nM 인간 인슐린 및 5%(부피/부피) FCS로 보충된 DMEM/HamF12 (1:1 부피/부피) 영양 매질(Gibco-BRL) 내에서 배양된다. NIH3T3 및 psi-CRIP 세포는, 10% (부피/부피)의 신생 송아지 혈청으로 보충된 DMEM (5.5 mM 글루코스, 1.0 Mm 피루브산 나트륨) 내에서 배양된다. 앰피실린, 스트렙토마이신 및 글루타민이 모든 매질에 첨가되며, 37℃에서 5% (부피/부피)의 CO2로 배양액을 배양시킨다. Psi-CRIP 세포는, 양이온 리포좀 방법(DOTAP, Boeringer Mannheim)에 의하여 플라즈미드 pHSG(L3L4)4-PKCAT 및 pRSVNeo로(두 플라즈미드의 몰 비는 10:1) 동시형질감염되며, G418(800 ㎍/ml)의 존재 하에 선별된다. 레트로바이러스 생성 시험을 위하여 G418 내성 클론을 분리한다.
실시예 3: 한 단계의 바이러스 RNA 및 PCR-RT의 제조
G418 내성 세포 클론을 90-mm 웰 내에 접종하고, 100% 융합 배양한다. 세포 배양액 상층액을 0.22 ㎛ 포어를 가지는 막을 통하여 여과시키고, 37℃에서 30 분간 DNase I (10㎍/ml)로 배양시킨 후, 65,000 rpm으로 4℃에서 20 분간 원심분리한다. 레트로바이러스 RNA를 추출하고, 단백효소 K 및 페놀/클로로포름 혼합물을 이용하여 침전물 펠리트로부터 정제한 후, tRNA로 동시침전시킨다. 1 mM 디티오트레이톨 (DTT) 및 40 U의 RNAsin/100㎛를 함유하며 물로 처리된 디에틸 피로카보네이트 내에 샘플을 용해시킨 후, 역전사효소 및 한 단계 PCR에 투입시킨다. 증폭을 위하여 사용되는 두 개의 탐침은 하기와 같다:
-MMLV (bp 1524 내지 1544)의 Gag 영역에 상응하는 5'ACTCAAATGCCCAATGAAGTC3' (서열 번호 7);
-CAT 유전자(번역 개시 영역에 대하여 bp 35 내지 15)의 코딩 영역에 상응하는 5'TCAACGGTGGTATATCCAGAT3' (서열 번호 8).
안티센스 PCR 탐침으로부터의 역전사는 42℃에서 1 시간 동안 8U AMV 역전사효소(Promega)에 의하여 촉매되며, Tag25U DNA 중합효소를 이용하여 35 내지 40 사이클로 다음 PCR을 수행한다. 기대되는 증폭 단편은 440 bp 길이이며, gag 유전자, 4 L3L4 반복 모티프, L-PK-119 프로모터 및 CAT 유전자의처음 69 bp 부위를 함유한다. 경우에 따라, RT-PCR 단편을 클로닝하고, 서열 분석한다.
실시예 4: 재조합 레트로바이러스의 생성
psi-CRIP 세포주를 동시형질감염시키기 위하여, 레트로바이러스 벡터 pHSG(L4L3)4-119PKCAT 및 pRSVNeo가 사용된다. 70 G418-내성 클론을 분석한다. RT-PCR에 양성인 8 클론은, NIH3T3 세포의 게놈 DNA의 기대되는 단편의 특이적 PCR에 의하여 측정된 감염성 재조합 바이러스 생성 능력을 입증한다. 두 개의 클론 내에서 상당한 역치의 레트로바이러스의 생성이 입증된다.
-감염성 레트로바이러스 클론 F6 (5×104)은 시그널 서열의 완전한 영역(모든 L4L3 단편의 4 반복 (도 3 참조))을 가지는 레트로바이러스를 생성하며,
-클론 B8 (2×105)은 부분적으로 결실된 시그널 서열 (하나의 전체 L4L3 모티프 및 두번째 모티프의 소량의 L3 카세트 (도 3 참조))을 가지는 레트로바이러스를 생성한다.
pHSG(L4L3)4199PKCAT 내에 표준으로서 상이한 결실을 이용하는 반-정량적 PCR-RT에 의하여, 레트로바이러스의 역치를 측정한다.
실시예 5: 재조합 레트로바이러스로 감염, 레트로바이러스의 역치 측정 및 CAT 단백질 분석
생성된 레트로바이러스의 감염력을 측정하기 위하여, 양성 클론을 사용하여 NIH3T3 세포를 감염시킨다.
100% 융합에서 1 ml의 세포 배양액 상층액을 이용하여, 대수적으로 성장하는 NIH3T3 세포를 8 ㎍/ml의 폴리브렌으로 감염시킨다. 배양 3 시간 후, 매질을 이용하여 폴리브렌을 2 ㎍/ml로 희석시키고, 48 시간 동안 배양을 계속한다. 감염된 NIH3T3 세포의 게놈 DNA를 추출하고, 실시예 3에 기술된 탐침을 이용하는 PCR 증폭에 사용한다. 특정 증폭된 단편의 검출은, 감염된 세포 게놈 내에 레트로바이러스 서열의 통합을 증명한다. 감염된 세포의 게놈 DNA로부터 생기는 증폭된 DNA 밴드의 강도를 상이한 희석의 레트로바이러스(102내지 106분자)로부터 생기는 밴드와 비교함으로써, 역치를 측정한다. 하기의 방법에 따라, 감염성 레트로바이러스를 생성하는 클론을 mhATIIIF 세포와 함께 동시 배양한다:
-바닥이 제거되고 벽이 실리콘유로 코팅된 60 mm 웰을 90 mm 웰 내부에 위치시켜, 이를 두 개의 부분으로 분리시킨다.
-두 유형의 세포가 혼합되지 않도록 주의하면서, mhATIIIF 세포 및 레트로바이러스 생성 세포를 중심부 내 및 주위에 각각 주입시킨다.
-배양 6 시간 후 세포가 웰에 잘 부착되면, 적은 웰을 제거시킨다. 추가적인 16 시간의 배양을 위하여 매질을 교체하고, 폴리브렌(8 ㎍)을 가한 후, 세포를 48 시간 동안 배양한다.
-박층 크로마토그래피에 의하여 CAT 활성을 측정하고, 신틸레이션에 의하여 cpm으로 정량한다.
실시예 6: 상이한 투여량 및 키메라 발현 시간으로 글루코스 도입.
쥐 내의 간 세포에 결합될 수 있는 mhATIIIF 세포주는 L-PK 유전자의 전사적 활성에 의하여 글루코스에 대한 반응력을 보유하며, 따라서 레트로바이러스 벡터에 의하여 전달된 CAT 트랜스진의 반응 및 결과적으로 레트로바이러스 환경 내의 GIRE L-PK의 활성 시험에 적합하다.
형질감염의 효율을 증가시키기 위하여, 레트로바이러스를 생성하고 클론 B8에 의한 만족스러운 감염도를 유도하는 세포를 이용하여, mhATIIIF 세포를 2 회 배양한다. 도 4 및 5에 도시하는 바와 같이, 감염된 mhATIIIF 세포 내의 L-PK/CAT 트랜스진의 발현은 글루코스에 의하여 유도되며, 3 내지 4 mM 글루코스에 대하여 반-최대 유도(half the maximal induction)가, 8 mM 글루코스에 대하여 최대 유도가 얻어진다. 더 고농도의 글루코스에 대하여, CAT 활성은 비교적 안정하게 유지된다.
17 mM 글루코스를 함유하는 매질 내에서 mhATIIIF 세포를 배양하며, 배양 8 시간째 유전자 유도가 관측되며, 24 시간째 이전에 절반 유도가, 48 시간째에 최대 유도가 관측된다.
실시예 7: 플라즈미드 pHSG/PK=CAT 및 pHSG/AL-PK-CAT의 작제
표준 DNA 기술에 의하여, 플라즈미드를 작제한다. DNA 서열 분석에 의하여 접합을 조사한다. 플라즈미드 작제물 pHSG/PK-CAT는 뉴클레오티드 1 내지 2015 및 3888 내지 4445 사이에 위치한 pHSG의 MMLV 부분을 함유한다; 플라즈미드 pHSG/AL-PK-CAT의 경우, MMLV 서열은 뉴클레오티드 1 내지 2015 및 4290 내지 4847 사이에 위치한다 (도 6). 쥐 L-유형 피루베이트 키나아제 유전자 프로모터(-183 내지 +11 bp)의 조절 하에 CAT 유전자를 암호화하는 서열은 플라즈미드 pHSG/PK-CAT의 경우 뉴클레오티드 2048 내지 3033 사이에, 플라즈미드 pHSG/AL-PK-CAT의 경우 2450 내지 3435 사이에 위치한다. 알도라제 B 유전자의 강화 단편 서열(서열 번호 6)은 플라즈미드 pHSG/AL-PK-CAT 내 뉴클레오티드 2035 내지 2437 사이에 위치한다. 사용되는 poly A 시그널 서열은 pHSG/PK-CAT 내 뉴클레오티드 3033 내지 3873 사이에, pHSG/AL-PK-CAT 내 뉴클레오티드 3435 내지 4275 사이에 위치한 SV40으로부터 유도된 것이다. 뉴클레오티드 2015 내지 2048: 2242 내지 2452 및 3873 내지 3888은 플라즈미드 pHSG/PK-CAT를 위한 상이한 단편 간의 어댑터이다; 이들은 플라즈미드 pHSG/AL-PK-CAT에 대하여 2015 내지 2035; 2437 내지 2450; 2644 내지 2654 및 4275 내지 4290에 위치한다.
실시예 8: 상이한 투여량의 글루코스에 의한 플라즈미드 pHSG/PK-CAT 및 pHSG/AL-PK-CAT의 발현의 유도
간-특이성 안티트롬빈 III 프로모터의 조절 하에, SV40 초기 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스 내 간 종양으로부터 세포주 mhAT3F를 유도한다(Kahn A et al., Exp; Cell. Res; 200, 175-185). 이들 세포를, 1μM의 덱사메타손, 1 μM의 트리요오도티로신 및 20nM의 인간 인슐린으로 보충되며, D-글루코스(Sigma)가 구비 또는 구비되지 않고, 글루타맥스-1 (Gibco-BRL)이 구비된 DMEM F12/NUT.MIX 영양 매질 (1:1 부피/부피) 내에서, 37℃에서 5% (부피/부피) CO2를이용하여 배양한다. 5 ㎍의 플라즈미드 pHSG/PK-CAT 또는 플라즈미드 pHSG/AL-PK-CAT를 양이온 리포좀 방법(DOPAP, Boehringer Mannheim)에 의하여 형질감염시킨다. PK-L프로모터를 유도하기 위하여, 상이한 농도의 글루코스의 존재 하에 24 시간 동안 세포를 연속적으로 배양한다. 박층 크로마토그래피에 의하여 CAT 활성을 측정하고, 신틸레이션에 의하여 cpm으로 정량한다. 결과를 도 7에 나타낸다. 상이한 농도의 글루코스의 존재 하에 유도 24 시간 후, 8 mM 글루코스의 존재 하에, 알도라제 B 인핸서의 존재 하의 플라즈미드 pHSG/PK-L의 발현은 알도라제 B 인핸서 결여시보다 5 배 높다 (도 7).
이러한 알도라제 B/PK-L 하이브리드 프로모터는, 따라서 특히 혈당에 따라 적절한 농도의 인슐린을 생체 내에 생산하도록 의도되는 당뇨병에 대한 유전자 치료법의 개발에 있어, 글루코스에 대한 민감성을 유지하면서, 유전자에 고수준의 발현을 부여하는데 있어 특히 유용하다.
서열목록
(1) 종합 정보
(i) 출원인
(A) 성명: 인섬
(B) 가명: 뤼 드 톨비악 101
(C) 도시명: 파리
(E) 국명: 프랑스
(F) 우편번호: 파리 세덱 13, 75654
(ii) 발명의 명칭: 재조합 바이러스 벡터, 이를 함유하는 약학 조성물 및 상응하는 형질전환된 세포
(iii) 서열 수: 8
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체형: 테이프
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 운영 체계: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn 발매 #1.0, 버젼 #1.25 (EPO)
(2) 서열 번호 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 194 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 1:
(2) 서열 번호 2에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 2:
(2) 서열 번호 3에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 19 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 3:
(2) 서열 번호 4에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 129 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 4:
(2) 서열 번호 5에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 416 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 5:
(2) 서열 번호 6에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 464 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: DNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 6:
(2) 서열 번호 7에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 7:
(2) 서열 번호 8에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iii) 안티센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 8:

Claims (29)

  1. 글루코스 또는 이의 동족체 중의 하나에 의해 유도될 수 있는 발현 시그널의 조절 하에 하나 이상의 이종 유전자를 포함하는 결손 재조합 바이러스.
  2. L형 피루베이트 키나아제 (L-PK)에 대한 암호화 유전자의 프로모터로부터 전부 또는 일부 파생되는 발현 시그널의 존재 하에 하나 이상의 이종 유전자를 포함하는 결손 재조합 바이러스.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 발현 시그널이 L-PK에 대한 암호화 유전자의 암호틀의 5' 말단에 위치한 183 bp로 이루어진 단편으로부터 전부 또는 일부 파생됨을 특징으로 하는 바이러스.
  4. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 발현 시그널이 서열 번호 1로서 표현되는 서열의 전부 또는 일부를 포함함을 특징으로 하는 바이러스.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 시그널이 L-PK에 대한 암호화 유전자 프로모터 중 최소한 L4 엘리먼트를 포함함을 특징으로 하는 바이러스.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 엘리먼트가 MLTF/USF 인자와 상호작용할 수 있는 서열 번호 2의 서열, 후자의 전부 또는 일부와 혼성화하는 서열 또는 이로부터 파생되는 서열에 의해 전부 또는 일부 표현되는 L4 엘리먼트인 바이러스[lacuna].
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, L4 엘리먼트가 발현 시그널 내에서 4개의 연속적인 올리고머 유형으로 반복됨을 특징으로 하는 바이러스.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, L-PK에 대한 암호화 유전자 프로모터의 L3 엘리먼트를 추가로 포함함을 특징으로 하는 바이러스.
  9. 제 8 항에 있어서, L3 엘리먼트가 HNF4 인자와 상호작용할 수 있는 서열 번호 3의 서열, 후자의 전부 또는 일부와 혼성화하는 서열 또는 이로부터 파생되는 서열에 의해 전부 또는 일부 표현됨을 특징으로 하는 바이러스.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 시그널이 L-PK에 대한 암호화 유전자 프로모터 중 L3 엘리먼트의 상부에 융합된 동일 프로모터의 L4 엘리먼트, 즉 L4-L3를 포함함을 특징으로 하는 바이러스.
  11. 제 10 항에 있어서, 발현 시그널이 4개의 연속적인 L4-L3 올리고머를 포함함을 특징으로 하는 바이러스.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 시그널이 최소 프로모터를 추가로 포함함을 특징으로 하는 바이러스.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 프로모터가 바람직하게는, L-PK에 대한 암호화 유전자의 5' 말단에 위치한 -119 내지 11 단편에 상응하는 서열임을 특징으로 하는 바이러스.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 시그널이 서열 번호 4 또는 이의 유도체 중의 하나에 의해 표현됨을 특징으로 하는 바이러스.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 시그널이 전사 인핸서를 추가로 포함함을 특징으로 하는 바이러스.
  16. 제 15 항에 있어서, 전사 인핸서가 쥐 알도라제 B 유전자의 제 1 인트론으로부터 파생됨을 특징으로 하는 바이러스.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포 내에서의 복제에 필요한 게놈 영역이 결여됨을 특징으로 하는 바이러스.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스임을 특징으로 하는 바이러스.
  19. 제 17 항에 있어서, Ad 2 또는 Ad 5 유형의 인간 아데노바이러스 또는 CAV-2 유형의 개 아데노바이러스임을 특징으로 하는 바이러스.
  20. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스임을 특징으로 하는 바이러스.
  21. 제 20 항에 있어서, MoMuLV 계열의 레트로바이러스임을 특징으로 하는 바이러스.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 유전자가 인슐린 또는 이의 변이체 중 하나를 암호화함을 특징으로 하는 바이러스.
  23. 과혈당증 관련 질병의 치료 및/또는 예방을 위해 의도되는 약학 조성물 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 바이러스의 용도.
  24. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 결손 재조합 바이러스를 포함하는 약학 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서, 주사가능한 형태임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 결손 재조합 아데노바이러스를 104내지 1014pfu/ml, 바람직하게는 106내지 1010pfu/ml 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물.
  27. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 결손 재조합 바이러스에 의해 감염된 포유류 세포.
  28. 제 27 항에 있어서, 인간 세포임을 특징으로 하는 세포.
  29. 제 28 항에 있어서, 간세포 또는 췌장 β 세포임을 특징으로 하는 세포.
KR1019970707243A 1995-04-14 1996-04-12 글루코스-유도성 재조합 바이러스 벡터 KR19980703843A (ko)

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