CA2215987A1 - Vecteur viral recombinant, composition pharmaceutique le contenant et cellules transformees correspondantes - Google Patents
Vecteur viral recombinant, composition pharmaceutique le contenant et cellules transformees correspondantes Download PDFInfo
- Publication number
- CA2215987A1 CA2215987A1 CA002215987A CA2215987A CA2215987A1 CA 2215987 A1 CA2215987 A1 CA 2215987A1 CA 002215987 A CA002215987 A CA 002215987A CA 2215987 A CA2215987 A CA 2215987A CA 2215987 A1 CA2215987 A1 CA 2215987A1
- Authority
- CA
- Canada
- Prior art keywords
- virus according
- sequence
- virus
- promoter
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Abandoned
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
- C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Obesity (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La présente invention se rapporte à un virus recombinant défectif comprenant au moins un gène hétérologue sous contrôle d'un signal d'expression inductible par le glucose. Elle concerne également toute composition pharmaceutique le contenant et des cellules transformées avec ledit vecteur.
Description
CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCT/~h~ 6 Vecteur viral recombinant inductible par le glucose La présente invention con~rne des vecteurs recombin~nt~ d'origine virale, la ~ epa.~Lion de ces vecte3lr~, les compositions pharm~cel1titlues les contPn~nt et leur 5 utilisation thérapeutique, not~mmPnt en thérapie génique et plus particulièrement pour le traitement et/ou la ~ vellLion de pathologies liées à une hyperglycémie.
La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une ~n~)m~lie (mutation, expression aberrante, etc) par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. ClassiquPm~nt, cette information génétique peut 10 être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu ~ )p~ ié. Différentes techniques ont été décrites pour l'introduction de cette information génétique, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989)375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc.
Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS.
etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
La présente invention se rapporte plus particulièrement à la mise au point de nouveaux vecteurs viraux présentant notamment un intérêt particulier pour le ~ 25 traitement des pathologies liées aux hyperglycémies comme le diabète.
Le diabète sucré est un syndrome habituellPmPnt chronique, dont le symptôme le plus caractéristique est une hypetglycé~l,ie provoquant, en l'absence d'élévation du seuil rénal pour le glucose, une glycosurie. Sa cause principale est une carence, CA 0221~987 1997-10-08 W 096132489 PCTAFRg6/00560 absolue ou relative, en insuline entrâînant des anomalies non seulement du métabolisme des hydrates de carbone mais aussi de ceux des protéines et des graisses.
Le diabète est génér~lemPnt traité par ~rlmini~tration d'in~llin~, traitement qui s'avère très contraignant pour le patient.
La présente invention a précisément pour objet de proposer un vecteur viral original permettant de suppléer à cette désorg~ni~tion du métabolisme du glucosedans un organisme via la restauration de manière contrôlée d'une concentration convenable in vivo en insuline.
On sait que le glucose est un facteur de régulation de la transcription de gènesdans la majorité des être vivants. Il a notamment été démontré que le glucose est capable de stimuler la transcription de gènes codant pour des enzymes glycolytiques et lipogéniques dans les hépatocytes et adipocytes comme par exemple le gène de la pyruvate kinase de type L, une enzyme glycolytique tissus spécifique qui joue un rôle déterminant dans la régulation de la glycolyse et la gluconéogénèse dans le foie.
L'expression de la protéine L-PK, au niveau du foie, est sous contrôle alimentaire et hormonal. Elle est induite par un régime riche en glucose et au contraire inhibée par privation et chez les diabétiques. Il a ainsi été démontré que l'expression de son gène est régulée positivement par le couple glucose/insuline et négativement par le glucagon via son second messager L'AMP cyclique (A. Kahn; J. Bio. Chem. 264, (1989), 11584-11590).
Récemment, la c~em~3nfl.?resse a caractérisé différents sites de liaisons (éléments L1 à LA) pour des facteurs de transcription et en particulier un élément de réponse au glucose/insuline, ou encore "GIRE", dans la région amont du promoteurdu gène de cette enzyme L-PK (A. Kahn et al.; J. Mol. Biol. 209, (1989), 205-219). Il 25 a ainsi été identifié dans le sens 3' à 5' à partir de la boîte TATA, respectivement l'élément L1, un site de liaison pour le facteur nllcle~ire 1 des hépatocytes (HNF1), l'~lément L2, un site de liaison pour le facteur nucléaire 1 (NF1), l'élément L3, un site de liaison pour le facteur nucléaire 4 des hépatocytes (HNF 4) et l'élément IA, un site CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCTA~R96/00560 de liaison pour le facteur transcrpitionnel major late (MLFT)/USF (voir figure 1).
L'élément spécifique de réponse au glucose/insuline, a préci~émt~nt été localisé dans le gène codant pour la L-PK, sous la forme d'un palindrome parfait entre les nucléotides -168 à -144 à partir du site cap, soit dans l'élément L4 (voir figure 2). Ce 5 GIRE s'est avéré capable de collfér~r une réponse transcriptionnel au glucose à un promoteur minim~l de L-PK c-)n~titt-e de la boîte TATA et de l'élément L1.
De manière in~tten~ e, la ~em~n~l~resse a mis en évidence qu'il était possible de valoriser l'aptitude de cet élément GIRE, à répondre au glucose, dans un contexte viral pour moduler l'expression d'un protéine d'intérêt en thérapie génique.
Plus précisément, la présente invention se rapporte à un virus recombinant défectif comprenant au moins un gène hétérologue sous contrôle d'un signal d'expression inductible par le glucose ou un de ses analogues.
Par analogue du glucose, on entend couvrir tout composé prés~nt~nt des homologies structurales avec le glucose et étant capable d'induire l'activation du 15 signal d'expression. A titre d'analogues susceptibles d'être utilisés selon la présente invention on peut notamment citer le fructose, le galactose, le sucrose, le lactose et tous les sucres pouvant être hydrolysés en ces substances.
Au sens de la présente invention, un signal d'expression inductible au glucose couvre toute séquence signal d'expression dont l'activation, qui conditionne la 20 transcription subséquente du gène hétérologue associé, est ~ nti~llement induite en présence de glucose ou un de ses analogues.
Plus particulièrement il s'agit d'un virus défectif recombinant dans lequel l'expression d'au moins un gène hétérologue est placée sous contrôle d'un signald'expression dérivant en tout ou partie du promoteur du gène codant pour la pyruvate 25 kinase de type L, L-PK. Plus précisement, ce signal d'expression dérive en tout ou partie du fragment constitué des 183pb situé en 5' de la phase codante du gène codant pour L-PK.
CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCTn~R96/00560 De pl~f~L~;:nce, le signal d'expression selon l'invention co~llp-elld tOtlt ou partie de la séquence SEQ ID N~l.
Selon un mode de réalisation préféréJ ce signal d'expression comprend au moins tout ou partie de l'élément L4 de ce promoteur.
L'élément L4 est de p-er~ ce représenté par tout ou partie de la séquence SEQ ID N~2, d'une séquence hybridant avec tout ou partie de celle-ci ou d'une séquence qui en dérive, et capable d'interagir avec le facteur MLTF/USF.
Au sens de la présente invention, on entend par dérivé, toute sé~uence obtenue par une ou plusieurs modifications et conservant l'une au moins des propriétés biologiques de la séquence d'origine et notamment sa capacité d'interagir avec son ou ses facteur(s) de liaison spécifique(s), dans le cas présent constitué par le facteur MLTF/USF. Par modification, on doit entendre toute mutation, substitution, délétion, addition ou modification de nature génétique et/ou chimique. Ces modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier.
Dans une variante de l'invention, l'élément L4 est répété sous la forme de 4 oligomères successifs dans le signal d'expression.
Selon un mode préféré de l'invention, le signal d'expression comprend outre l'élément L4, tout ou partie de l'élément L3 du promoteur du gène codant pour la L-PK.
Il a en effet été monté que cet élément L3 contribue à une meilleure efficacité
de l'élément L4. ( A. Kahn et al; Nucleic Acids Research 20, (1992)J N''8 pl871).
L'élément L3 est de preré.el-ce représenté en tout ou partie par la séquence SEQ ID
N~3, une séquence hybridant avec tout ou partie de celle-ci ou d'une séquence qui en dérive, capable d'interagir avec le facteur HNF 4.
CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 . PCT/~h~ r~~o Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le signal d'expression comprend l'élément L4 du promoteur du gène codant pour la L-PK, fllsi~)nn~ en amont de l'élément L3 de ce même promoteur. Il est alors f~igné par L4-L3. Plus pieré.enLiellement, le signal d'expression selon l'invention co~ d 4 oligomères st1cc~ if~ L4-L3.
Ce signal d'expression comprend en ouke un promoteur dit minim~l Au sens de la présente invention, promoteur minim:~l désigne toute séquence promotrice qui seule n'est pas capable d'assurer efficacement la transcription de la séquence hétérologue qui lui est associée. L'activité d'un tel promoteur s'avèretotalement dépendante de l'activation de l'élément répondant au glucose. En fait, ce promoteur minim~l a surtout pour fonction d'orienter la transcription. Dans cette perspective, il est de préférence situé en amont de la séquence hétérologue de manière à former avec elle une séquence nucléotidique c~-ntinue Il est possible d'employer selon l'invention un promoteur minim~l dérivant d'un promoteur conventionnel comme par exemple ceux activant la transcription degène de type thymidine kinase, acétyle transférase chloramphénicol, 13galactosidase ou luciférase ou notamment dérivant du promoteur du gène codant pour la pyruvatekinase de type L. Ce promoteur minim~l peut également dériver du CMV hl1mz~in Lecas échéant, un tel promoteur peut être rendu minimal par le biais d'une ou plusieurs mutations génétiques qui le rendent incapable d'assurer seul la transcription du gène hétérologue.
Selon le même principe, le promoteur minim~l peut dériver du promoteur naturellement responsable de l'expression du gène hétérologue considéré.
A titre de promoteur minim~l susceptible d'être utilisé selon l'invention on peut plus particulièrement citer la séquence correspondant au fragment - 119 à 11 situé en 5' du gène codant pour la L-PK.
CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCTA~R~ '60 De manière générale, ce promoteur minim~l est placé en amont de la séquence nucléique dont il contrôle l'e~pie~ion, en substitution ou non de son promoteur naturel. Le propre promoteur de la séquence nucléique peut en effet demeurer présent - mais sous une forme inactivée ou rendue non fon( tionnelle par différentes techniques 5 connues de l'homme de l'art et nct~mm~nt par suppression, fleléti~n et/ou a~ n d'une ou plusieurs bases.
Plus pl~ré-elltiellement, le signal d'expression répond en tout ou partie à la SEQ ID N~4 ou l'un de ses dérivés.
Par ailleurs, la région promotrice peut être modifiée par addition de séquences 10 d'activation ou de régulation (séquences enhancer notamment), permettant d'augmenter la force du promoteur sans affecter son caractère in~luctihle. En particulier, dans le but d'améliorer la force du promoteur, nous avons contruit un vecteur hybride dans lequel le promoteur de 183 pb du gène PK-L est précédé d'unfragment de 402 pb situé dans le premier intron du gène de l'aldolase B de rat, du nucléotide 1920 au nucléotide 2321 par rapport au site d'initiation de la transcription (SEQ ID N~6 correspondant aux nucléotides 1915 à 2379). Les résultats présentés dans les exemples montrent que cette construction augmente l'expression d'un gène d'un facteur 5, en réponse au glucose.
En ce qui concerne la séquence d'acides nucléiques hétérologue placée sous 20 contrôle du signal d'expression selon l'invention, elle comporte un ou plusieurs gènes thérapeutiques dont le transfert et/ou l'expression dans une cellule, un organe ou un organisme est recherché.
Les gènes thérapeutiques qui peuve.lL ainsi être transférés sont tout gène dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des 25 produits ayant un effet thérapeutique.
Il peut s'agir en particulier de gènes codant pour des produits protéiques ayantun effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, un acide aminé, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCT/~h~ r~o cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'uneprotéine permet par exemple de pallier une expression in~-ffie~nte dans la cellule ou ie~ion d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une m~ificati~)nJ
5 ou encore de sure~.imer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cell~ ire, ayant une st~hilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible.
Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule lui permettant de lutter contre une pathologie.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones comme l'insuline, les lymphokines: interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotr~n~metteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apolipo~ téines: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91 11947), etc.
Selon une variante préférée de l'invention, la séquence hétérologue comporte au moins un gène codant pour l'insuline ou un variant de l'insuline. Au sens de l'invention, variant couvre notamment les différentes formes de maturation de 20 l'insuline comme par exemple la proinsuline, (Vollenweider et al., J. Biol. Chem.
267, (1992) 14629-14636 et Groskreutz et al., J. Biol. Chem.269, (1994), 6241-6245).
Plus préférentiellement, le gène codant pour l'insuline et présent dans un vecteur selon l'invention comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID N~5.
Les vecteurs de l'invention peuvent être préparés à partir de différents types de virus. Préférentiellement, on utilise des vecteurs dérivés des adénovirus ou desrétrovirus.
CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 P~1/1'K~-.~00560 Les virus selon l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont in~p~hles de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences n~c~s.s~ires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
5 Ces régions peuvell~ être soit é-limin~es (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit ~hstitlléçs par d'autres séquences et not~mment par la séquence d'ADN codant pour le gène d'intérêt comme par exemple celui de l'in~line Préférentiellement, le virus défectif conserve nézlnmoins les séquences de son génome qui sont néce~ires à l'encapsidation des particules virales.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, dirr~ i sérotypes, ~lont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi cessérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans lecadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De préférence, l'adénovirus d'origineanimale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche m~nh~ n ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine hl~m~ine ou canine ou mixte.
PieféL~.ltiellement, les adénovirus défectifs de l'invention co~ ent les ITR, une séquence permettant l'~nc~p~ tion et la séquence codant pour la protéine d'intérêt thérapeutique. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène E1 et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCTA~R96/00560 l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par tr~item~nt au moyen d'agents mutagènes. Les adénovirus recomhin~nt~
défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917) .
C~ncçrn~nt les ~e~Lovil us, la construction de vecteurs recombinants a été
largement décrite dans la liLL~lu.~: voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, B~ t~in et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235;
McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les I~Llovilus sont des 10 virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Le génome des r~kovi.us comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'~?nc~rsi~tion et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des reL.ovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs15 peuvent être réalisés à partir de dirr~ types de rétrovirus tels que not~mm~nt le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV
("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV
("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence d'intérêt, un pl~mi~e comportant notamment les LTR, la séquence d'~n~psiti~tion et ladite séquence d'intéret est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'enc~rsi-1~tion~ capable d'apporter en trans les fonctions reLrvvildles déficientes dans le pl~mi~le Généralement, les lignées d'~nc~r~iA~ti~)n sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et not~mment la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150). A titre d'exemple de lignée on peut notamment citer la lignée cellulaire ~-2 qui provient de la lignée NIH-3T3 (lignée fibroblastique de souris) par CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCTn~R~r'~r'~0 transfection par pMOV-~-, un plasmide contenSInt le génome du virus de la leucémie murine de Moloney (MoMuLV) dont la séquence d'~-ncapsi(1~tion "~" est délétée (Mann et al., Cell, (1983), 33, 153-159, ). Par ailleurs, les I~LI~Vil~lS recomhin~nts peuvellL comporter des mo lific~tion~ au niveau des LTR pour supprimer l'activité
5 transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'~nc~p~iA~ion étenr~ s, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. (1987) 61, 1639). Les lel~-~villl recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Dans le cas particulier de la présente invention, les l~LI~)vi~S peuvent être préparés par transfection d'un plasmide reLIvvil~l contenant le signal d'expression 10 selon l'invention couplé au gène codant pour la protéine= d'intérêt dans une lignée cellulaire transcomplémentante qui va permettre de produire des particules virales dont le génome code pour le transgène.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un ~eLL~vil~lS recombinant défectif, le 15 I~L}~vil lls étant tout particulièrement avantageux pour exprimer de l'insuline.
En plaçant, au sein d'un vecteur selon l'invention, l'expression du gène codant pour l'insuline sous contrôle d'un signal d'expression contrôlé par le glucose et en transfectant des cellules in vivo à l'aide de ce type de vecteur on induit ces cellules-ci à
produire de l'insuline sous l'effet de leur teneur physiologique en glucose. Ces cellules 20 deviennent capables d'exprimer le transgène de l'insuline en présence d'une concentration physiologique et sufflsante en glucose.
Selon un mode préféré de l'invention, les cellules transfectées possèdent un système interne de détection du glucose, encore désigné par m~hin~ri~ senseur deglucose, susceptible d'induire l'activation du signal d'expression. Certains types 25 cell~ ires, comme les hépatocytes et les cellules ~ du pancréas en sont naturellement pourvues. Il s'agit d'un système notamment composé d'enzymes spécifiques comme le transpol leur Glut-2-glucose et la glucokinase. Pour ce qui est des cellules ~émlmi~-~ de ce type de m~hin~rie senseur, il est tout à fait envisageable d'y suppléer CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCT~R96/00560 artificiellement. Dans ce cas particulier, les cellules devant être traitées sont, soit préalablement ou ~iml1lt~nném~nt, à l'injection de virus selon l'invention, transfectées à
l'aide de constructions génétiques comm~ntl~nt la synthèse du kansporteur Glut-2 de l'enzyme ~ltl-rlkin~e L'infection des cellules telles les hépatocytes par des virus recombinants selonl'invention peut être réalisée ex vivo et/ou in vivo rendant les cellules ainsi transfectées capables de secréter de l'insuline. Les sites d'infection privilégiés dans le cadre de la présente invention sont les sites naturels de secrétion de l'in~l-line, comme la veine porte.
La présente invention se rapporte également aux cellules de m~mmifères, de préférence hllm~ines et plus pleré.~nLiellement aux hépatocytes et/ou cellules 13 pancréatiques infectées par un ou plusieurs virus revendiqués.
Outre leur capacité à induire in vivo l'expression de l'insuline, les vecteurs selon l'invention permettent avantage--~ement le blocage immédiat de cette secrétion sous l'effet du glucagon du fait de l'AMP classique. On s'affranchit de cette manière du risque d'une hypoglycémie induite par une secrétion excessive en in~llline.
En conséquence, les vecteurs revendiqués sont particulièrement avantageux pour contrôler in vivo via un pht?n~)mène d'induction au glucose, la production d'in~llline dans une région précise de l'organisme, de préférence dans un site ou elle est normalement secrétée comme la cirulation porte. Des cellules infectées par un ou plusieurs virus revendiqués pourraient ainsi être inplantées dans le foie, la rate, le pancréas ou l'int~stin La présente invention décrit ainsi une approche nouvelle pour le traitement notamment des troubles diabétiques dépendant de l'insuline con.~i~t~lnt à induire la synthèse in vivo d'in~uline en réponse à une teneur physiologique en glucose.
Dans le cas particulier, où les cellules transfectées avec un vecteur selon l'invention ne possèderaient pas cette teneur physiologique en glucose, initiatrice de CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCT~h~ 5~0 l'expression d'un gène hétérologue autre que l'in~llline par exemple, on peut envisager le protocole SUiV~llL~; la concentration en glucose ou en un analogue ayant la même influence sur la séquence de réponse au glucose (L4-L3), y serait ajustée de manière à
induire l'expression de la protéine d'intérêt via l'activité du signal d'expression selon 5 l'invention. Il est clair que cette cnneentration est déterminée en fonction de la quantité en v~:leuL~ injectée, de la nature du site d'infection et de l'expression recherchée en protéine..
Comme indiqué ci-avant, la présente invention cnnc~rne également toute lltili~tinn d'un virus tel que décrit ci-dessus pour la ~.~paLa~ion d'une compcsition 10 pharmaceutique not~mment destinée au traitement et/ou à la pL~v~ ion des m~ r1içs liées à une hyper~lycelllie.
La présente invention concerne é~lement une composition pharmaceutique com~ ant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précé~emment C~es compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue 15 d'~ministrations par voie topique, orale, pa.en~.dle, intranasale, h~LIdv~iLleuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De ~ierelellce, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceu-tiquement acceptable pour une formulation injectable. Il peut s'agir en par~iculier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, 20 qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de dirr~ paramètres, et notamment en fonction du vecteur viral, du mode dl~mini~tration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la 25 durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les virus recombirlants selon l'invention sont formulés et ~flmini~trés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de pL~;:fél~llce 106 à 101~ pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire ap~lvpliée, et mesure, généralement après 48 CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCTn~R96/00560 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Conc~rn~nt les .c:L,ovirlls, les compositions selon l'invention peuvent comporter directem~nt les cellules productrices, en vue de leur impl~nt~tion Les exemples et figures, présentés ci-après à titre non l;.. ,;l~l;r de la présente invention, permettront de mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention.
LEGENDES DES FIGURES
Fi~ure l: Représentation ~rh~m~titlue de l'ordre de succession des éléments 10 Ll à L4 identifiés dans le promoteur du gène L-PK et leurs protéines de liaison respectives.
Fi~ure 2: Représentation du palindrome de l'élément L4.
Fi~ure 3: Représentation partielle du plasmide rétroviral pHSG(L4L3)4PKCAT et des clones F6 et B8.
Fi~ure 4: Détermination q~ ;ve de l'activité CAT dans des cellules mhATIIIF transformées avec le clone B8, en fonction de la quantité de glucose injectée.
Fi~ure 5: Dét~rmin~tion ql~"lil~liv~ de l'activité CAT dans des cellules rnhATIIIF transformées avec le clone B8 à des temps d"induction différents.
Fi~ure 6: Construction des pl~mitlels pHSG/PK-CAT et pHSG/AL-PK-CAT.
Fi~ure 7: Induction par le glucose à des doses lirr~ Les de l'expression des pl~mi~les pHSG/PK-CAT et pHSG/AL-PK-CAT.
Techniques ~énérales de biolopie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les 25 extractions ~ pald~ives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en CA 022l~987 l997-l0-08 W O 96132489 l~~ r~o gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloi~rolllle, la précipitation d'ADN en milieu salin par del'éthanol ou de l'isopiopallol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien 5 c-mmles de l'homme de métier et sont ab~n~l~m~nt décrites dans la liU~la~ule ~Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Lal~olaloly, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "CurrentProtocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les pl~cmi~s de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont 10 d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fra~m~ntc d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recomm~n~l~tions du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proémin~ntes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d' E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proémin~ntf~s est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recomm~n~tions du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nnclézl~e S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en ~1tili~nt le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [~olymérase-catalyzed_hain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCT~R96/00560 être effectuée en utili~nt un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérific~tion des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la m~tho l~ développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5 5467] en lltili~nt le kit distribué par Am.?rsh~m EXEMPLE 1: Construction d'un vecteur, cl- ovirdl Tous les pl~mifl~s sont co~ selon des techniques de clonage d'ADN
standard. Les jonctions sont vérifiées par séquencage ADN. La construction du plasmide pHSG(L4L3)4-PKCAT, (représentée en Fig. 3), contient la partie 10 constructive MMLV de pHSGNeo et la séquence codant pour le gène CAT sous contrôle du promoteur du gène pyruvate kinase de type L de rat (bp - 119 to + 11) en amont duquel des fr~gm~ntc L4L3 oligomérisés 4 fois (c.à.d le GIRE et le site deliaison HNF4 contigu) sont ligaturés. Le fragment L4L3, correspondant au fragment ~ limité entre les pb -172 à- 123, en amont du site d'initi~ti-~n de la transcription L-PK
15 a été obtenu par PCR. La séquence signal polyA utilisée, est celle présente dans le LTR de l'~LLe~lliLé 3' du MMLV. Le plasmide pHSGNeo (Guild et al. J. Virol. 1988, 62; 3795-3801), un plasmide rétroviral dérivé du MMLV, la lignée psi-CRIP, une lignée cellulaire complémentaire amphotropique qui apporte en trans les protéines structurales de MMLV, ont été procurés par le Dr. A. Weber (Institut Cochin de 20 Génétique Moléculaire, Paris); le plasmide pRSVNeo, dans lequel le gène aminoglycoside-phosphotransférase est sous contrôle du promoteur du LTR du RSV, est utilisé pour la cotransfection.
EXEMPLE 2: Culture cellulaire et transfection La lignée cellulaire mhATIIIF, est issue d'une tumeur du foie chez une souris 25 tr~n~nique exprimant les gènes précoces SV40 sous contrôle du promoteur a ILiLhl..lllbine III spécifique du foie, (ATIII-SV40) (Kahn A. et al. Exp; Cell. Res;
200, 175-185). Ces cellules sont cultivées dans un milieu nutritif DMEM F12/NUT.MIX. (1:1 vol/vol) avec du glutamax-1 ou DMEM/HamF12 (1:1 vol/vol) (Gibco-CA 022l5987 l997-l0-08 W 096/32489 PCTn~R~C~'60 BRL) avec ou sans D+glucose (Sigma), complementé avec 1 ,uM de dexamethasone, 1 ~M triodoLhy-u~ e, 20nM d'insuline hllm~ine 5 5~o (vovvol) de SVF. Les cellules NIH3T3 et psi-CRIP sont cultivées dans: DMEM (5.5mM de glucose, 1.0mM
~y.uv~ de sodium) comrlfi-menté~ avec 10 % (vol/vol) de sérum de veall nouveau-5 né. Tous les milieux sont ~ 1iti(~nn~s d'~mpi~illin~, de ~L~Lolllycl~le et de ~ ;..,.;ne etles cultures sont inrllhe~.e à 37~C avec 5 ~o (vol~vol) C02. Les cellules psi-CRIP sont cotransfectées avec les pl~emi~les pHSG (L3L4)4- PKCAT et pRSV Neo (le rapport molaire des deux pl~miecles étant de 10:1) par la méthode liposome cationique (DOTAP, Boeringer M~nnheim) et sélectionnées en présence de G418 (800 ,ug~ml).
10 Les clones réei~t~nte à G418 sont séparés pour le test de production des ~eLlovillls.
EXEMPLE 3: Préparation de l'ARN viral et PCR-RT en une étape Les clones cellulaires résistants à G418 sont ~ne~m~nf~e dans des puits de 90 mm et cultivés jusqu'à 100 'rO de confluence. Le sl~rn~nt de la culture cellulaire est filtré sur une membrane poe.sé~l~nt des pores de 0,22 ~m, incubé avec de la DNase I (10~g/ml) à 37~C pendant 30 min puis centrifugé à 65000 rpm pendant 2Q minutes à
4~C. L'ARN ~ vi~l est extrait et purifié de culots de précipitation par la protéinase K et un mélange phénol/chlo.~,ro~llle puis co-précipité avec de l'ARNt. L'~h~ntillon est dissous dans du pyrocarbonate de diéthyle traité avec de l'eau et contenant 1 mM
de dithiothreitol (DTT), 40 U de RNAsin/100~m, puis soumis à une transcriptase 20 réverse et à une PCR en une seule étape. Les deux sondes l1tili~éf~ pour l'amplification sont:
- 5'ACTCAAATGCCCAATGAAGTC 3' (SEQ ID N~7), correspondant à la région Gag de MMLV (pb 1524 à 1544);
- 5' TCAACGGTGGTATATCCAGAT 3'(SEQ ID N~8), correspondant à la 25 région codante du gène CAT (pb 35 to 15 en considérant le site d'initiz~ti~n de la tr~ ction).
CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCTA~Rg6/00560 La transcription inverse à partir de la sonde PCR zlnti~n~ est catalysée par la transcriptase inverse 8U AMV (Promega) pendant 1 heure à 42~C et la PCR suivanteavec l'ADN polymérase Taq25U est réalisée en 35 à 40 cycles. Le fragment ;lmplifié
attendu est long de 440 pb et contient une partie du gène gag, 4 motifs répétés L3L4, 5 le promoteur -119 L-PK et les 69 premières pb du gène CAT. Si n~c~s~ire, les fr~ment.~ RT-PCR sont clonés et séquencés.
EXEMPLE 4: Production de rétrovirus recombinants Les vecteurs rétroviraux pHSG(L4L3)4-119PKCAT et pRSVNeo sont utilisés pour co-transfecter des lignées cellulaires psi-CRIP. 70 clones résistants à G418 sont 10 analysés. 8 clones positifs en RT-PCR témoignent d'une c~racité à produire des rétrovirus recombinants infectueux, determinée par PCR spécifique du fragment attendu de l'ADN génomique des cellules NIH3T3. Il a été mis en évidence la production de ~ )VilllS à un titre ~ignific~tif chez deux clones.
- Le clone F6 (5.104) ~~Llovil~lS infectueux, produit un i~Llovii~ls avec la 15 région complète de la séquence signal (4 répétitions des fr~gm~nt.c L4L3 entier (voir figure 3)) et - le clone B8 (2.105) avec une séquence signal partiellement délété (un seul motif L4L3 entier et une petite partie de la cassette L3 d'un second motif (voir figure 3~).
Les titres en rétrovirus ont été estimés par PCR-RT semiqtlz~ntit~tive en tili~nt difré-e,lL~s délétions en pHSG(L4L3)4199PKCAT comme standards.
EXEMPLE 5: Infection par un ~ vil ls recombinant. estimation du titre en rétrovirus et dosa~e de la protéine CAT
Les clones positifs sont utilisés pour infecter les cellules NIH3T3 afin d'estimer les capacités infectueuses des rétrovirus produits.
CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 P~1i~h~-'00560 1 ml de s~rn~Ee~nt de culture cell~ ire à 100 ~o de confluence est utilisé pour infecter des cellules NIH3T3 en cloi~sance lo~iLLIl.ique avec 8 ~uglml de polybrène.
Après 3 heures d'inruh~tion, le polybrène est dilué à 2 ~glml avec du milieu et la culture est ~o~L:,uivie 48 heures. L'ADN ~n~mitlue des cellules NIH3T3 infectées est 5 extrait et utilisé pour une amplifi~tion PCR en employant les sondes ~ rit~e en exemple 3. La détection du fragment ~mrlifié spé~ifique prouve l'intégration desséquences l~Ll~)vhdles dans le génome des cellules infectées. Le titre en est estimé en comparant les inteneit~e des bandes d'ADN ~mplifié~,e issu de l'ADN génomique des cellules infectées avec celles issues de dirr~l~llLes flilllti~)ne du lell~vilLls (102 à 106 10 molécules). Les clones qui prc~ ie~nt des I~Ll~vh~lS infectueux sont co-cultivés avec des cellules mhATIIIF selon le protocole suivant:
- On place à l'intérieur d'un puit de 90 mm, un puit de 60 m~n dont la base a été
retirée et les parois enrillit~s avec de l'huile de silicone, de manière à le diviser en deux parties.
- On y introdu* les cellules mhATIIIF et les cellules prc~ liez~nt le l~LL~)vilLls respectivement au centre et en périphérie, et en prenant soin de ne pas melanger les deux types de cellules.
- Lorsque les cellules sont bien fixées au puits après 6 heures d'incubation, lepetit puit est retiré. Le milieu est changé pour une nouvelle incubation de 16 heures, le 20 polybrène est ensuite ajouté (8 ,ug) et les cellules sont cultivées pendant 48 heures.
- L'activité CAT est mesurée par chromatographie sur couche fine et quantifiée en cpm par scintill~tion.
EXEMPLE 6: Induction par le ~lucose à des doses et temps dir~ ell~ de l'expression de la chimère La lignée cellulaire mhATIIIF ~eeimil~ble aux hépatocytes chez le rat, conserve sa capacité à répondre au glucose par activation transcriptionnelle du gène L-PK et est donc ap~l~r;ée pour tester la réponse du transgène CAT, transféré par le vecteurr~ vildl et en conséquence l'activité du L-PK GIRE dans un ellvir n~ m~nt l~lL~)Vildl.
CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 P~l/~h_-/00~60 Pour accroître l'efficacité de la transfection, les cellules mhATIIIF sont cultivées deux fois avec des cellules produisant les rétrovirus, ce qui conduit à un taux d'infection satisfaisant avec le clone B8. Comme le montrent les figures 4 et 5,ion du tr~n.egène L-PK/CAT dans les cellules infectées mhATIIIF est bien induite par le glucose avec la moitié de l~in~ ction maximale obtenue pour 3-4 mM de glucose et l'induction maximale pour 8mM de glucose. Pour des concentrations supérieures en glucose, l'activité CAT demeure relativement stable.
Les cellules mhATIIIF sont cultivées dans un milieu c~nten~nt 17 mM de glucose~ l'induction du gène est observée à partir de la 8ème heure d'incllh~tion, l'induction à moitié avant la 24ème heure et l'induction maximale à la 48ème heure.
EXEMPLE 7: Constrllction des plamides p~SG/PK-CAT et pHSG/AL-PK-CAT
Les pl~mi(les sont construits selon des techniques de clonage d'ADN
standard. Les jonctions sont vérifiées par séquencage ADN. La construction du plasmide pHSG/PK-CAT contient la partie MMLV de pHSG située entre les nucléotides de 1 à 2015 et de 3888 à 4445; pour le plasmide pHSG/AL-PK-CAT, les séquences MMLV sont situées entre les nucléotides de 1 à 2015 et de 4290 à 4847 ffigure 6). La séquence codant pour le gène CAT sous contrôle du promoteur du gène pryruvate kinase de type L de rat (-183 à + 11 bp) est situé entre les nucléotides 2048 et 3033 pour le plasmide pHSG/PK-CAT et entre 2450 et 3435 pour le pl~mille pHSG/AL-PK-CAT. La séquence du fragment enhancer du gène de l'aldolase B
(SEQ ID N~6), est située entre les nucléotides 2035 et 2437 dans le plasmide pHSG/AL-PK-CAT. La séquence signal poly A utilisée est celle de SV40 située entre les nucléotides 3033 et 3873 dans le pHSG/PK-CAT et entre 3435 et 4275 dans le pHSG/AL-PK-CAT. Les nucléotides de 2015 à 2048; 2242 à 2452 et 3873 à 3888 sont des adaptateurs entre les différents fragments pour le pl~mi(l~ pHSG/PK-CAT;
ils sont situés pour le plasmide pHSG/AL-PK-CAT de 2015 à 2035; 2437 à 2450;
2644 à 2654 et 4275 à 4290.
W 096/32489 PCTn~R96/00560 EXEMPLE 8: Induction par le ~lucose à des doses différentes de l'expression des plasmides pHSG/PK-CAT et pHSG/AL-PK-CAT
La lignée cellulaire mhAT3F est issue d'une tumeur du foie chez une souris tr~n~nique ~p~ ;...~..l les gènes précoses SV40 sous le contrôle du promoteur anLilhr.,.l,bine III spécifique du foie (Kahn A. et al. Exp; Cell.Res; 200, 175 185). Ces cellules ont été cultivées à 37~C avec 5 ~o (volfvol) C02 dans un milieu nutritif DMEM F12/NUT.MIX. (1:1 vol/vol) avec du glllt~m~x-1 (Gibco-BRL) avec ou sans D-glucose (Sigma), complémenté avec 1 ~M de dexameth~one, 1 ,uM
triodolhylu~ e et 20 nM d'insuline hllm~in~ 5 ~g du pl~mi~le pHSG/PK-CiAT ~u du plasmide pHSG/AL-PK-CAT ûnt été transfectés par la méthode liposome cationique (DOPAP, Boehringer Mannheim). Les cellules ont été par la suite cultivées en présence de dirré.ellLes concentrations de glucose pendant 24 heures pour induire le promoteur de la PK-L. L'activité CAT est mesurée par chromatographie sur couche fine et quantifiée en cpm par s~intill~tion. Les résultat sont présentés sur la figure 7.
Après 24 heures d'induction en présence de différentes conc~ntrations de glucose, l'expression du plasmide pHSG/PK-L en présence de l'enh~n~er de l'aldolase B est5tfois plus forte en présence de 8 mM glucose que celle du plasmide dépourvu de l'enhancer de l'aldolase B (figure 7).
Ce promoteur hybride aldolase B/PK-L est donc particulièrement avantageux pour conférer à un gène un niveau d'expression élevé tout en restant sensible auglucose, notamment dans le cadre du développement de méthode de thérapie géniquedu diabète destinées à produire, en fonction de la glycémie, une concentration convenable in vivo en insuline.
CA 022l~987 l997-l0-08 W 096/32489 PCTA~R96/00560 LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSERM
(B) RUE: 101, Rue de Tolbiac (C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75654 PARIS Cedex 13 (ii) TITRE DE L' INVENTION : VECTEUR VIRAL RECOMBINANT, COMPOSITION
PHARMACEUTIQUE LE CONTENANT ET CELLULES TRANSFORMEES CORRESPONDANTES.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES:8 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version ~1.25 (OEB)
La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une ~n~)m~lie (mutation, expression aberrante, etc) par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. ClassiquPm~nt, cette information génétique peut 10 être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu ~ )p~ ié. Différentes techniques ont été décrites pour l'introduction de cette information génétique, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989)375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc.
Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS.
etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
La présente invention se rapporte plus particulièrement à la mise au point de nouveaux vecteurs viraux présentant notamment un intérêt particulier pour le ~ 25 traitement des pathologies liées aux hyperglycémies comme le diabète.
Le diabète sucré est un syndrome habituellPmPnt chronique, dont le symptôme le plus caractéristique est une hypetglycé~l,ie provoquant, en l'absence d'élévation du seuil rénal pour le glucose, une glycosurie. Sa cause principale est une carence, CA 0221~987 1997-10-08 W 096132489 PCTAFRg6/00560 absolue ou relative, en insuline entrâînant des anomalies non seulement du métabolisme des hydrates de carbone mais aussi de ceux des protéines et des graisses.
Le diabète est génér~lemPnt traité par ~rlmini~tration d'in~llin~, traitement qui s'avère très contraignant pour le patient.
La présente invention a précisément pour objet de proposer un vecteur viral original permettant de suppléer à cette désorg~ni~tion du métabolisme du glucosedans un organisme via la restauration de manière contrôlée d'une concentration convenable in vivo en insuline.
On sait que le glucose est un facteur de régulation de la transcription de gènesdans la majorité des être vivants. Il a notamment été démontré que le glucose est capable de stimuler la transcription de gènes codant pour des enzymes glycolytiques et lipogéniques dans les hépatocytes et adipocytes comme par exemple le gène de la pyruvate kinase de type L, une enzyme glycolytique tissus spécifique qui joue un rôle déterminant dans la régulation de la glycolyse et la gluconéogénèse dans le foie.
L'expression de la protéine L-PK, au niveau du foie, est sous contrôle alimentaire et hormonal. Elle est induite par un régime riche en glucose et au contraire inhibée par privation et chez les diabétiques. Il a ainsi été démontré que l'expression de son gène est régulée positivement par le couple glucose/insuline et négativement par le glucagon via son second messager L'AMP cyclique (A. Kahn; J. Bio. Chem. 264, (1989), 11584-11590).
Récemment, la c~em~3nfl.?resse a caractérisé différents sites de liaisons (éléments L1 à LA) pour des facteurs de transcription et en particulier un élément de réponse au glucose/insuline, ou encore "GIRE", dans la région amont du promoteurdu gène de cette enzyme L-PK (A. Kahn et al.; J. Mol. Biol. 209, (1989), 205-219). Il 25 a ainsi été identifié dans le sens 3' à 5' à partir de la boîte TATA, respectivement l'élément L1, un site de liaison pour le facteur nllcle~ire 1 des hépatocytes (HNF1), l'~lément L2, un site de liaison pour le facteur nucléaire 1 (NF1), l'élément L3, un site de liaison pour le facteur nucléaire 4 des hépatocytes (HNF 4) et l'élément IA, un site CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCTA~R96/00560 de liaison pour le facteur transcrpitionnel major late (MLFT)/USF (voir figure 1).
L'élément spécifique de réponse au glucose/insuline, a préci~émt~nt été localisé dans le gène codant pour la L-PK, sous la forme d'un palindrome parfait entre les nucléotides -168 à -144 à partir du site cap, soit dans l'élément L4 (voir figure 2). Ce 5 GIRE s'est avéré capable de collfér~r une réponse transcriptionnel au glucose à un promoteur minim~l de L-PK c-)n~titt-e de la boîte TATA et de l'élément L1.
De manière in~tten~ e, la ~em~n~l~resse a mis en évidence qu'il était possible de valoriser l'aptitude de cet élément GIRE, à répondre au glucose, dans un contexte viral pour moduler l'expression d'un protéine d'intérêt en thérapie génique.
Plus précisément, la présente invention se rapporte à un virus recombinant défectif comprenant au moins un gène hétérologue sous contrôle d'un signal d'expression inductible par le glucose ou un de ses analogues.
Par analogue du glucose, on entend couvrir tout composé prés~nt~nt des homologies structurales avec le glucose et étant capable d'induire l'activation du 15 signal d'expression. A titre d'analogues susceptibles d'être utilisés selon la présente invention on peut notamment citer le fructose, le galactose, le sucrose, le lactose et tous les sucres pouvant être hydrolysés en ces substances.
Au sens de la présente invention, un signal d'expression inductible au glucose couvre toute séquence signal d'expression dont l'activation, qui conditionne la 20 transcription subséquente du gène hétérologue associé, est ~ nti~llement induite en présence de glucose ou un de ses analogues.
Plus particulièrement il s'agit d'un virus défectif recombinant dans lequel l'expression d'au moins un gène hétérologue est placée sous contrôle d'un signald'expression dérivant en tout ou partie du promoteur du gène codant pour la pyruvate 25 kinase de type L, L-PK. Plus précisement, ce signal d'expression dérive en tout ou partie du fragment constitué des 183pb situé en 5' de la phase codante du gène codant pour L-PK.
CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCTn~R96/00560 De pl~f~L~;:nce, le signal d'expression selon l'invention co~llp-elld tOtlt ou partie de la séquence SEQ ID N~l.
Selon un mode de réalisation préféréJ ce signal d'expression comprend au moins tout ou partie de l'élément L4 de ce promoteur.
L'élément L4 est de p-er~ ce représenté par tout ou partie de la séquence SEQ ID N~2, d'une séquence hybridant avec tout ou partie de celle-ci ou d'une séquence qui en dérive, et capable d'interagir avec le facteur MLTF/USF.
Au sens de la présente invention, on entend par dérivé, toute sé~uence obtenue par une ou plusieurs modifications et conservant l'une au moins des propriétés biologiques de la séquence d'origine et notamment sa capacité d'interagir avec son ou ses facteur(s) de liaison spécifique(s), dans le cas présent constitué par le facteur MLTF/USF. Par modification, on doit entendre toute mutation, substitution, délétion, addition ou modification de nature génétique et/ou chimique. Ces modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier.
Dans une variante de l'invention, l'élément L4 est répété sous la forme de 4 oligomères successifs dans le signal d'expression.
Selon un mode préféré de l'invention, le signal d'expression comprend outre l'élément L4, tout ou partie de l'élément L3 du promoteur du gène codant pour la L-PK.
Il a en effet été monté que cet élément L3 contribue à une meilleure efficacité
de l'élément L4. ( A. Kahn et al; Nucleic Acids Research 20, (1992)J N''8 pl871).
L'élément L3 est de preré.el-ce représenté en tout ou partie par la séquence SEQ ID
N~3, une séquence hybridant avec tout ou partie de celle-ci ou d'une séquence qui en dérive, capable d'interagir avec le facteur HNF 4.
CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 . PCT/~h~ r~~o Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le signal d'expression comprend l'élément L4 du promoteur du gène codant pour la L-PK, fllsi~)nn~ en amont de l'élément L3 de ce même promoteur. Il est alors f~igné par L4-L3. Plus pieré.enLiellement, le signal d'expression selon l'invention co~ d 4 oligomères st1cc~ if~ L4-L3.
Ce signal d'expression comprend en ouke un promoteur dit minim~l Au sens de la présente invention, promoteur minim:~l désigne toute séquence promotrice qui seule n'est pas capable d'assurer efficacement la transcription de la séquence hétérologue qui lui est associée. L'activité d'un tel promoteur s'avèretotalement dépendante de l'activation de l'élément répondant au glucose. En fait, ce promoteur minim~l a surtout pour fonction d'orienter la transcription. Dans cette perspective, il est de préférence situé en amont de la séquence hétérologue de manière à former avec elle une séquence nucléotidique c~-ntinue Il est possible d'employer selon l'invention un promoteur minim~l dérivant d'un promoteur conventionnel comme par exemple ceux activant la transcription degène de type thymidine kinase, acétyle transférase chloramphénicol, 13galactosidase ou luciférase ou notamment dérivant du promoteur du gène codant pour la pyruvatekinase de type L. Ce promoteur minim~l peut également dériver du CMV hl1mz~in Lecas échéant, un tel promoteur peut être rendu minimal par le biais d'une ou plusieurs mutations génétiques qui le rendent incapable d'assurer seul la transcription du gène hétérologue.
Selon le même principe, le promoteur minim~l peut dériver du promoteur naturellement responsable de l'expression du gène hétérologue considéré.
A titre de promoteur minim~l susceptible d'être utilisé selon l'invention on peut plus particulièrement citer la séquence correspondant au fragment - 119 à 11 situé en 5' du gène codant pour la L-PK.
CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCTA~R~ '60 De manière générale, ce promoteur minim~l est placé en amont de la séquence nucléique dont il contrôle l'e~pie~ion, en substitution ou non de son promoteur naturel. Le propre promoteur de la séquence nucléique peut en effet demeurer présent - mais sous une forme inactivée ou rendue non fon( tionnelle par différentes techniques 5 connues de l'homme de l'art et nct~mm~nt par suppression, fleléti~n et/ou a~ n d'une ou plusieurs bases.
Plus pl~ré-elltiellement, le signal d'expression répond en tout ou partie à la SEQ ID N~4 ou l'un de ses dérivés.
Par ailleurs, la région promotrice peut être modifiée par addition de séquences 10 d'activation ou de régulation (séquences enhancer notamment), permettant d'augmenter la force du promoteur sans affecter son caractère in~luctihle. En particulier, dans le but d'améliorer la force du promoteur, nous avons contruit un vecteur hybride dans lequel le promoteur de 183 pb du gène PK-L est précédé d'unfragment de 402 pb situé dans le premier intron du gène de l'aldolase B de rat, du nucléotide 1920 au nucléotide 2321 par rapport au site d'initiation de la transcription (SEQ ID N~6 correspondant aux nucléotides 1915 à 2379). Les résultats présentés dans les exemples montrent que cette construction augmente l'expression d'un gène d'un facteur 5, en réponse au glucose.
En ce qui concerne la séquence d'acides nucléiques hétérologue placée sous 20 contrôle du signal d'expression selon l'invention, elle comporte un ou plusieurs gènes thérapeutiques dont le transfert et/ou l'expression dans une cellule, un organe ou un organisme est recherché.
Les gènes thérapeutiques qui peuve.lL ainsi être transférés sont tout gène dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des 25 produits ayant un effet thérapeutique.
Il peut s'agir en particulier de gènes codant pour des produits protéiques ayantun effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, un acide aminé, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCT/~h~ r~o cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'uneprotéine permet par exemple de pallier une expression in~-ffie~nte dans la cellule ou ie~ion d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une m~ificati~)nJ
5 ou encore de sure~.imer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cell~ ire, ayant une st~hilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible.
Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule lui permettant de lutter contre une pathologie.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones comme l'insuline, les lymphokines: interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotr~n~metteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apolipo~ téines: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91 11947), etc.
Selon une variante préférée de l'invention, la séquence hétérologue comporte au moins un gène codant pour l'insuline ou un variant de l'insuline. Au sens de l'invention, variant couvre notamment les différentes formes de maturation de 20 l'insuline comme par exemple la proinsuline, (Vollenweider et al., J. Biol. Chem.
267, (1992) 14629-14636 et Groskreutz et al., J. Biol. Chem.269, (1994), 6241-6245).
Plus préférentiellement, le gène codant pour l'insuline et présent dans un vecteur selon l'invention comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID N~5.
Les vecteurs de l'invention peuvent être préparés à partir de différents types de virus. Préférentiellement, on utilise des vecteurs dérivés des adénovirus ou desrétrovirus.
CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 P~1/1'K~-.~00560 Les virus selon l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont in~p~hles de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences n~c~s.s~ires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
5 Ces régions peuvell~ être soit é-limin~es (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit ~hstitlléçs par d'autres séquences et not~mment par la séquence d'ADN codant pour le gène d'intérêt comme par exemple celui de l'in~line Préférentiellement, le virus défectif conserve nézlnmoins les séquences de son génome qui sont néce~ires à l'encapsidation des particules virales.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, dirr~ i sérotypes, ~lont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi cessérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans lecadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De préférence, l'adénovirus d'origineanimale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche m~nh~ n ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine hl~m~ine ou canine ou mixte.
PieféL~.ltiellement, les adénovirus défectifs de l'invention co~ ent les ITR, une séquence permettant l'~nc~p~ tion et la séquence codant pour la protéine d'intérêt thérapeutique. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène E1 et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCTA~R96/00560 l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par tr~item~nt au moyen d'agents mutagènes. Les adénovirus recomhin~nt~
défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917) .
C~ncçrn~nt les ~e~Lovil us, la construction de vecteurs recombinants a été
largement décrite dans la liLL~lu.~: voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, B~ t~in et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235;
McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les I~Llovilus sont des 10 virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Le génome des r~kovi.us comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'~?nc~rsi~tion et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des reL.ovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs15 peuvent être réalisés à partir de dirr~ types de rétrovirus tels que not~mm~nt le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV
("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV
("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence d'intérêt, un pl~mi~e comportant notamment les LTR, la séquence d'~n~psiti~tion et ladite séquence d'intéret est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'enc~rsi-1~tion~ capable d'apporter en trans les fonctions reLrvvildles déficientes dans le pl~mi~le Généralement, les lignées d'~nc~r~iA~ti~)n sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et not~mment la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150). A titre d'exemple de lignée on peut notamment citer la lignée cellulaire ~-2 qui provient de la lignée NIH-3T3 (lignée fibroblastique de souris) par CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCTn~R~r'~r'~0 transfection par pMOV-~-, un plasmide contenSInt le génome du virus de la leucémie murine de Moloney (MoMuLV) dont la séquence d'~-ncapsi(1~tion "~" est délétée (Mann et al., Cell, (1983), 33, 153-159, ). Par ailleurs, les I~LI~Vil~lS recomhin~nts peuvellL comporter des mo lific~tion~ au niveau des LTR pour supprimer l'activité
5 transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'~nc~p~iA~ion étenr~ s, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. (1987) 61, 1639). Les lel~-~villl recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Dans le cas particulier de la présente invention, les l~LI~)vi~S peuvent être préparés par transfection d'un plasmide reLIvvil~l contenant le signal d'expression 10 selon l'invention couplé au gène codant pour la protéine= d'intérêt dans une lignée cellulaire transcomplémentante qui va permettre de produire des particules virales dont le génome code pour le transgène.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un ~eLL~vil~lS recombinant défectif, le 15 I~L}~vil lls étant tout particulièrement avantageux pour exprimer de l'insuline.
En plaçant, au sein d'un vecteur selon l'invention, l'expression du gène codant pour l'insuline sous contrôle d'un signal d'expression contrôlé par le glucose et en transfectant des cellules in vivo à l'aide de ce type de vecteur on induit ces cellules-ci à
produire de l'insuline sous l'effet de leur teneur physiologique en glucose. Ces cellules 20 deviennent capables d'exprimer le transgène de l'insuline en présence d'une concentration physiologique et sufflsante en glucose.
Selon un mode préféré de l'invention, les cellules transfectées possèdent un système interne de détection du glucose, encore désigné par m~hin~ri~ senseur deglucose, susceptible d'induire l'activation du signal d'expression. Certains types 25 cell~ ires, comme les hépatocytes et les cellules ~ du pancréas en sont naturellement pourvues. Il s'agit d'un système notamment composé d'enzymes spécifiques comme le transpol leur Glut-2-glucose et la glucokinase. Pour ce qui est des cellules ~émlmi~-~ de ce type de m~hin~rie senseur, il est tout à fait envisageable d'y suppléer CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCT~R96/00560 artificiellement. Dans ce cas particulier, les cellules devant être traitées sont, soit préalablement ou ~iml1lt~nném~nt, à l'injection de virus selon l'invention, transfectées à
l'aide de constructions génétiques comm~ntl~nt la synthèse du kansporteur Glut-2 de l'enzyme ~ltl-rlkin~e L'infection des cellules telles les hépatocytes par des virus recombinants selonl'invention peut être réalisée ex vivo et/ou in vivo rendant les cellules ainsi transfectées capables de secréter de l'insuline. Les sites d'infection privilégiés dans le cadre de la présente invention sont les sites naturels de secrétion de l'in~l-line, comme la veine porte.
La présente invention se rapporte également aux cellules de m~mmifères, de préférence hllm~ines et plus pleré.~nLiellement aux hépatocytes et/ou cellules 13 pancréatiques infectées par un ou plusieurs virus revendiqués.
Outre leur capacité à induire in vivo l'expression de l'insuline, les vecteurs selon l'invention permettent avantage--~ement le blocage immédiat de cette secrétion sous l'effet du glucagon du fait de l'AMP classique. On s'affranchit de cette manière du risque d'une hypoglycémie induite par une secrétion excessive en in~llline.
En conséquence, les vecteurs revendiqués sont particulièrement avantageux pour contrôler in vivo via un pht?n~)mène d'induction au glucose, la production d'in~llline dans une région précise de l'organisme, de préférence dans un site ou elle est normalement secrétée comme la cirulation porte. Des cellules infectées par un ou plusieurs virus revendiqués pourraient ainsi être inplantées dans le foie, la rate, le pancréas ou l'int~stin La présente invention décrit ainsi une approche nouvelle pour le traitement notamment des troubles diabétiques dépendant de l'insuline con.~i~t~lnt à induire la synthèse in vivo d'in~uline en réponse à une teneur physiologique en glucose.
Dans le cas particulier, où les cellules transfectées avec un vecteur selon l'invention ne possèderaient pas cette teneur physiologique en glucose, initiatrice de CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCT~h~ 5~0 l'expression d'un gène hétérologue autre que l'in~llline par exemple, on peut envisager le protocole SUiV~llL~; la concentration en glucose ou en un analogue ayant la même influence sur la séquence de réponse au glucose (L4-L3), y serait ajustée de manière à
induire l'expression de la protéine d'intérêt via l'activité du signal d'expression selon 5 l'invention. Il est clair que cette cnneentration est déterminée en fonction de la quantité en v~:leuL~ injectée, de la nature du site d'infection et de l'expression recherchée en protéine..
Comme indiqué ci-avant, la présente invention cnnc~rne également toute lltili~tinn d'un virus tel que décrit ci-dessus pour la ~.~paLa~ion d'une compcsition 10 pharmaceutique not~mment destinée au traitement et/ou à la pL~v~ ion des m~ r1içs liées à une hyper~lycelllie.
La présente invention concerne é~lement une composition pharmaceutique com~ ant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précé~emment C~es compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue 15 d'~ministrations par voie topique, orale, pa.en~.dle, intranasale, h~LIdv~iLleuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De ~ierelellce, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceu-tiquement acceptable pour une formulation injectable. Il peut s'agir en par~iculier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, 20 qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de dirr~ paramètres, et notamment en fonction du vecteur viral, du mode dl~mini~tration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la 25 durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les virus recombirlants selon l'invention sont formulés et ~flmini~trés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de pL~;:fél~llce 106 à 101~ pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire ap~lvpliée, et mesure, généralement après 48 CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCTn~R96/00560 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Conc~rn~nt les .c:L,ovirlls, les compositions selon l'invention peuvent comporter directem~nt les cellules productrices, en vue de leur impl~nt~tion Les exemples et figures, présentés ci-après à titre non l;.. ,;l~l;r de la présente invention, permettront de mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention.
LEGENDES DES FIGURES
Fi~ure l: Représentation ~rh~m~titlue de l'ordre de succession des éléments 10 Ll à L4 identifiés dans le promoteur du gène L-PK et leurs protéines de liaison respectives.
Fi~ure 2: Représentation du palindrome de l'élément L4.
Fi~ure 3: Représentation partielle du plasmide rétroviral pHSG(L4L3)4PKCAT et des clones F6 et B8.
Fi~ure 4: Détermination q~ ;ve de l'activité CAT dans des cellules mhATIIIF transformées avec le clone B8, en fonction de la quantité de glucose injectée.
Fi~ure 5: Dét~rmin~tion ql~"lil~liv~ de l'activité CAT dans des cellules rnhATIIIF transformées avec le clone B8 à des temps d"induction différents.
Fi~ure 6: Construction des pl~mitlels pHSG/PK-CAT et pHSG/AL-PK-CAT.
Fi~ure 7: Induction par le glucose à des doses lirr~ Les de l'expression des pl~mi~les pHSG/PK-CAT et pHSG/AL-PK-CAT.
Techniques ~énérales de biolopie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les 25 extractions ~ pald~ives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en CA 022l~987 l997-l0-08 W O 96132489 l~~ r~o gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloi~rolllle, la précipitation d'ADN en milieu salin par del'éthanol ou de l'isopiopallol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien 5 c-mmles de l'homme de métier et sont ab~n~l~m~nt décrites dans la liU~la~ule ~Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Lal~olaloly, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "CurrentProtocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les pl~cmi~s de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont 10 d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fra~m~ntc d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recomm~n~l~tions du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proémin~ntes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d' E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proémin~ntf~s est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recomm~n~tions du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nnclézl~e S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en ~1tili~nt le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [~olymérase-catalyzed_hain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCT~R96/00560 être effectuée en utili~nt un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérific~tion des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la m~tho l~ développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5 5467] en lltili~nt le kit distribué par Am.?rsh~m EXEMPLE 1: Construction d'un vecteur, cl- ovirdl Tous les pl~mifl~s sont co~ selon des techniques de clonage d'ADN
standard. Les jonctions sont vérifiées par séquencage ADN. La construction du plasmide pHSG(L4L3)4-PKCAT, (représentée en Fig. 3), contient la partie 10 constructive MMLV de pHSGNeo et la séquence codant pour le gène CAT sous contrôle du promoteur du gène pyruvate kinase de type L de rat (bp - 119 to + 11) en amont duquel des fr~gm~ntc L4L3 oligomérisés 4 fois (c.à.d le GIRE et le site deliaison HNF4 contigu) sont ligaturés. Le fragment L4L3, correspondant au fragment ~ limité entre les pb -172 à- 123, en amont du site d'initi~ti-~n de la transcription L-PK
15 a été obtenu par PCR. La séquence signal polyA utilisée, est celle présente dans le LTR de l'~LLe~lliLé 3' du MMLV. Le plasmide pHSGNeo (Guild et al. J. Virol. 1988, 62; 3795-3801), un plasmide rétroviral dérivé du MMLV, la lignée psi-CRIP, une lignée cellulaire complémentaire amphotropique qui apporte en trans les protéines structurales de MMLV, ont été procurés par le Dr. A. Weber (Institut Cochin de 20 Génétique Moléculaire, Paris); le plasmide pRSVNeo, dans lequel le gène aminoglycoside-phosphotransférase est sous contrôle du promoteur du LTR du RSV, est utilisé pour la cotransfection.
EXEMPLE 2: Culture cellulaire et transfection La lignée cellulaire mhATIIIF, est issue d'une tumeur du foie chez une souris 25 tr~n~nique exprimant les gènes précoces SV40 sous contrôle du promoteur a ILiLhl..lllbine III spécifique du foie, (ATIII-SV40) (Kahn A. et al. Exp; Cell. Res;
200, 175-185). Ces cellules sont cultivées dans un milieu nutritif DMEM F12/NUT.MIX. (1:1 vol/vol) avec du glutamax-1 ou DMEM/HamF12 (1:1 vol/vol) (Gibco-CA 022l5987 l997-l0-08 W 096/32489 PCTn~R~C~'60 BRL) avec ou sans D+glucose (Sigma), complementé avec 1 ,uM de dexamethasone, 1 ~M triodoLhy-u~ e, 20nM d'insuline hllm~ine 5 5~o (vovvol) de SVF. Les cellules NIH3T3 et psi-CRIP sont cultivées dans: DMEM (5.5mM de glucose, 1.0mM
~y.uv~ de sodium) comrlfi-menté~ avec 10 % (vol/vol) de sérum de veall nouveau-5 né. Tous les milieux sont ~ 1iti(~nn~s d'~mpi~illin~, de ~L~Lolllycl~le et de ~ ;..,.;ne etles cultures sont inrllhe~.e à 37~C avec 5 ~o (vol~vol) C02. Les cellules psi-CRIP sont cotransfectées avec les pl~emi~les pHSG (L3L4)4- PKCAT et pRSV Neo (le rapport molaire des deux pl~miecles étant de 10:1) par la méthode liposome cationique (DOTAP, Boeringer M~nnheim) et sélectionnées en présence de G418 (800 ,ug~ml).
10 Les clones réei~t~nte à G418 sont séparés pour le test de production des ~eLlovillls.
EXEMPLE 3: Préparation de l'ARN viral et PCR-RT en une étape Les clones cellulaires résistants à G418 sont ~ne~m~nf~e dans des puits de 90 mm et cultivés jusqu'à 100 'rO de confluence. Le sl~rn~nt de la culture cellulaire est filtré sur une membrane poe.sé~l~nt des pores de 0,22 ~m, incubé avec de la DNase I (10~g/ml) à 37~C pendant 30 min puis centrifugé à 65000 rpm pendant 2Q minutes à
4~C. L'ARN ~ vi~l est extrait et purifié de culots de précipitation par la protéinase K et un mélange phénol/chlo.~,ro~llle puis co-précipité avec de l'ARNt. L'~h~ntillon est dissous dans du pyrocarbonate de diéthyle traité avec de l'eau et contenant 1 mM
de dithiothreitol (DTT), 40 U de RNAsin/100~m, puis soumis à une transcriptase 20 réverse et à une PCR en une seule étape. Les deux sondes l1tili~éf~ pour l'amplification sont:
- 5'ACTCAAATGCCCAATGAAGTC 3' (SEQ ID N~7), correspondant à la région Gag de MMLV (pb 1524 à 1544);
- 5' TCAACGGTGGTATATCCAGAT 3'(SEQ ID N~8), correspondant à la 25 région codante du gène CAT (pb 35 to 15 en considérant le site d'initiz~ti~n de la tr~ ction).
CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 PCTA~Rg6/00560 La transcription inverse à partir de la sonde PCR zlnti~n~ est catalysée par la transcriptase inverse 8U AMV (Promega) pendant 1 heure à 42~C et la PCR suivanteavec l'ADN polymérase Taq25U est réalisée en 35 à 40 cycles. Le fragment ;lmplifié
attendu est long de 440 pb et contient une partie du gène gag, 4 motifs répétés L3L4, 5 le promoteur -119 L-PK et les 69 premières pb du gène CAT. Si n~c~s~ire, les fr~ment.~ RT-PCR sont clonés et séquencés.
EXEMPLE 4: Production de rétrovirus recombinants Les vecteurs rétroviraux pHSG(L4L3)4-119PKCAT et pRSVNeo sont utilisés pour co-transfecter des lignées cellulaires psi-CRIP. 70 clones résistants à G418 sont 10 analysés. 8 clones positifs en RT-PCR témoignent d'une c~racité à produire des rétrovirus recombinants infectueux, determinée par PCR spécifique du fragment attendu de l'ADN génomique des cellules NIH3T3. Il a été mis en évidence la production de ~ )VilllS à un titre ~ignific~tif chez deux clones.
- Le clone F6 (5.104) ~~Llovil~lS infectueux, produit un i~Llovii~ls avec la 15 région complète de la séquence signal (4 répétitions des fr~gm~nt.c L4L3 entier (voir figure 3)) et - le clone B8 (2.105) avec une séquence signal partiellement délété (un seul motif L4L3 entier et une petite partie de la cassette L3 d'un second motif (voir figure 3~).
Les titres en rétrovirus ont été estimés par PCR-RT semiqtlz~ntit~tive en tili~nt difré-e,lL~s délétions en pHSG(L4L3)4199PKCAT comme standards.
EXEMPLE 5: Infection par un ~ vil ls recombinant. estimation du titre en rétrovirus et dosa~e de la protéine CAT
Les clones positifs sont utilisés pour infecter les cellules NIH3T3 afin d'estimer les capacités infectueuses des rétrovirus produits.
CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 P~1i~h~-'00560 1 ml de s~rn~Ee~nt de culture cell~ ire à 100 ~o de confluence est utilisé pour infecter des cellules NIH3T3 en cloi~sance lo~iLLIl.ique avec 8 ~uglml de polybrène.
Après 3 heures d'inruh~tion, le polybrène est dilué à 2 ~glml avec du milieu et la culture est ~o~L:,uivie 48 heures. L'ADN ~n~mitlue des cellules NIH3T3 infectées est 5 extrait et utilisé pour une amplifi~tion PCR en employant les sondes ~ rit~e en exemple 3. La détection du fragment ~mrlifié spé~ifique prouve l'intégration desséquences l~Ll~)vhdles dans le génome des cellules infectées. Le titre en est estimé en comparant les inteneit~e des bandes d'ADN ~mplifié~,e issu de l'ADN génomique des cellules infectées avec celles issues de dirr~l~llLes flilllti~)ne du lell~vilLls (102 à 106 10 molécules). Les clones qui prc~ ie~nt des I~Ll~vh~lS infectueux sont co-cultivés avec des cellules mhATIIIF selon le protocole suivant:
- On place à l'intérieur d'un puit de 90 mm, un puit de 60 m~n dont la base a été
retirée et les parois enrillit~s avec de l'huile de silicone, de manière à le diviser en deux parties.
- On y introdu* les cellules mhATIIIF et les cellules prc~ liez~nt le l~LL~)vilLls respectivement au centre et en périphérie, et en prenant soin de ne pas melanger les deux types de cellules.
- Lorsque les cellules sont bien fixées au puits après 6 heures d'incubation, lepetit puit est retiré. Le milieu est changé pour une nouvelle incubation de 16 heures, le 20 polybrène est ensuite ajouté (8 ,ug) et les cellules sont cultivées pendant 48 heures.
- L'activité CAT est mesurée par chromatographie sur couche fine et quantifiée en cpm par scintill~tion.
EXEMPLE 6: Induction par le ~lucose à des doses et temps dir~ ell~ de l'expression de la chimère La lignée cellulaire mhATIIIF ~eeimil~ble aux hépatocytes chez le rat, conserve sa capacité à répondre au glucose par activation transcriptionnelle du gène L-PK et est donc ap~l~r;ée pour tester la réponse du transgène CAT, transféré par le vecteurr~ vildl et en conséquence l'activité du L-PK GIRE dans un ellvir n~ m~nt l~lL~)Vildl.
CA 0221~987 1997-10-08 W 096/32489 P~l/~h_-/00~60 Pour accroître l'efficacité de la transfection, les cellules mhATIIIF sont cultivées deux fois avec des cellules produisant les rétrovirus, ce qui conduit à un taux d'infection satisfaisant avec le clone B8. Comme le montrent les figures 4 et 5,ion du tr~n.egène L-PK/CAT dans les cellules infectées mhATIIIF est bien induite par le glucose avec la moitié de l~in~ ction maximale obtenue pour 3-4 mM de glucose et l'induction maximale pour 8mM de glucose. Pour des concentrations supérieures en glucose, l'activité CAT demeure relativement stable.
Les cellules mhATIIIF sont cultivées dans un milieu c~nten~nt 17 mM de glucose~ l'induction du gène est observée à partir de la 8ème heure d'incllh~tion, l'induction à moitié avant la 24ème heure et l'induction maximale à la 48ème heure.
EXEMPLE 7: Constrllction des plamides p~SG/PK-CAT et pHSG/AL-PK-CAT
Les pl~mi(les sont construits selon des techniques de clonage d'ADN
standard. Les jonctions sont vérifiées par séquencage ADN. La construction du plasmide pHSG/PK-CAT contient la partie MMLV de pHSG située entre les nucléotides de 1 à 2015 et de 3888 à 4445; pour le plasmide pHSG/AL-PK-CAT, les séquences MMLV sont situées entre les nucléotides de 1 à 2015 et de 4290 à 4847 ffigure 6). La séquence codant pour le gène CAT sous contrôle du promoteur du gène pryruvate kinase de type L de rat (-183 à + 11 bp) est situé entre les nucléotides 2048 et 3033 pour le plasmide pHSG/PK-CAT et entre 2450 et 3435 pour le pl~mille pHSG/AL-PK-CAT. La séquence du fragment enhancer du gène de l'aldolase B
(SEQ ID N~6), est située entre les nucléotides 2035 et 2437 dans le plasmide pHSG/AL-PK-CAT. La séquence signal poly A utilisée est celle de SV40 située entre les nucléotides 3033 et 3873 dans le pHSG/PK-CAT et entre 3435 et 4275 dans le pHSG/AL-PK-CAT. Les nucléotides de 2015 à 2048; 2242 à 2452 et 3873 à 3888 sont des adaptateurs entre les différents fragments pour le pl~mi(l~ pHSG/PK-CAT;
ils sont situés pour le plasmide pHSG/AL-PK-CAT de 2015 à 2035; 2437 à 2450;
2644 à 2654 et 4275 à 4290.
W 096/32489 PCTn~R96/00560 EXEMPLE 8: Induction par le ~lucose à des doses différentes de l'expression des plasmides pHSG/PK-CAT et pHSG/AL-PK-CAT
La lignée cellulaire mhAT3F est issue d'une tumeur du foie chez une souris tr~n~nique ~p~ ;...~..l les gènes précoses SV40 sous le contrôle du promoteur anLilhr.,.l,bine III spécifique du foie (Kahn A. et al. Exp; Cell.Res; 200, 175 185). Ces cellules ont été cultivées à 37~C avec 5 ~o (volfvol) C02 dans un milieu nutritif DMEM F12/NUT.MIX. (1:1 vol/vol) avec du glllt~m~x-1 (Gibco-BRL) avec ou sans D-glucose (Sigma), complémenté avec 1 ~M de dexameth~one, 1 ,uM
triodolhylu~ e et 20 nM d'insuline hllm~in~ 5 ~g du pl~mi~le pHSG/PK-CiAT ~u du plasmide pHSG/AL-PK-CAT ûnt été transfectés par la méthode liposome cationique (DOPAP, Boehringer Mannheim). Les cellules ont été par la suite cultivées en présence de dirré.ellLes concentrations de glucose pendant 24 heures pour induire le promoteur de la PK-L. L'activité CAT est mesurée par chromatographie sur couche fine et quantifiée en cpm par s~intill~tion. Les résultat sont présentés sur la figure 7.
Après 24 heures d'induction en présence de différentes conc~ntrations de glucose, l'expression du plasmide pHSG/PK-L en présence de l'enh~n~er de l'aldolase B est5tfois plus forte en présence de 8 mM glucose que celle du plasmide dépourvu de l'enhancer de l'aldolase B (figure 7).
Ce promoteur hybride aldolase B/PK-L est donc particulièrement avantageux pour conférer à un gène un niveau d'expression élevé tout en restant sensible auglucose, notamment dans le cadre du développement de méthode de thérapie géniquedu diabète destinées à produire, en fonction de la glycémie, une concentration convenable in vivo en insuline.
CA 022l~987 l997-l0-08 W 096/32489 PCTA~R96/00560 LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSERM
(B) RUE: 101, Rue de Tolbiac (C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75654 PARIS Cedex 13 (ii) TITRE DE L' INVENTION : VECTEUR VIRAL RECOMBINANT, COMPOSITION
PHARMACEUTIQUE LE CONTENANT ET CELLULES TRANSFORMEES CORRESPONDANTES.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES:8 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version ~1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 194 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: 1; n~A; re (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
CA 022l~987 l997-l0-08 W 096/32489 P~~ n~ 00560 (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
(Z) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4 ( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A~ LONGUEUR:129 paires de bases (B) TYPE: acide nucleique (C) NOMBRE DE BRINS si~ple (D) CONFIGURATION: lineaire ....
~ (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
. CA 022l~987 l997-l0-08 W 096/32489 PCTn~R96/00560 (i~ CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 416 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 464 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
TAGAAAGACT AACACATAAT ATATTGCTGT AATTTCTTTT GTA~ AAGTAGGACA 120 CA 022l~987 l997-l0-08 W 096~2489 PCT~R96/00560 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: lineaire -40 (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 194 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: 1; n~A; re (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
CA 022l~987 l997-l0-08 W 096/32489 P~~ n~ 00560 (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
(Z) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4 ( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A~ LONGUEUR:129 paires de bases (B) TYPE: acide nucleique (C) NOMBRE DE BRINS si~ple (D) CONFIGURATION: lineaire ....
~ (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
. CA 022l~987 l997-l0-08 W 096/32489 PCTn~R96/00560 (i~ CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 416 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 464 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
TAGAAAGACT AACACATAAT ATATTGCTGT AATTTCTTTT GTA~ AAGTAGGACA 120 CA 022l~987 l997-l0-08 W 096~2489 PCT~R96/00560 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: lineaire -40 (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Claims (29)
1. Virus recombinant défectif comprenant au moins un gène hétérologue sous contrôle d'un signal d'expression inductible par le glucose ou un de ses analogues.
2. Virus recombinant défectif comprenant au moins un gène hétérologue sous contrôle d'un signal d'expression dérivant en tout ou partie du promoteur du gène codant pour la pyruvate kinase de type L (L-PK).
3. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le signal d'expression dérive en tout ou partie du fragment constitué des 183pb situé en 5' de la phase codante du gène codant pour la L-PK.
4. Virus selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisé en ce que le signal d'expression comprend tout ou partie de la séquence représentée en SEQ ID N°1.
5. Virus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le signal d'expression comprend au moins l'élément L4 du promoteur du gène codant pour la L-PK.
6. Virus selon la revendication 5 en ce qu'il s'agit de l'élément L4 représenté
en tout ou partie par la séquence SEQ ID N°2, une séquence hybridant avec tout ou partie de celle-ci ou d'une séquence qui en dérive, capable d'interagir avec le facteur MLTF/USF.
en tout ou partie par la séquence SEQ ID N°2, une séquence hybridant avec tout ou partie de celle-ci ou d'une séquence qui en dérive, capable d'interagir avec le facteur MLTF/USF.
7. Virus selon la revendication 5 ou 6 caractérisé en ce que l'élément L4 est répété sous la forme de 4 oligomères consécutifs dans le signal d'expression.
8. Virus selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 caractérisé en ce qu'ilcomprend en outre l'élément L3 du promoteur du gène codant pour la L-PK.
9. Virus selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'élément L3 est représenté en tout ou partie par la séquence SEQ ID N°3, une séquence hybridant avec tout ou partie de celle-ci ou d'une séquence qui en dérive, capable d'interagir avec le facteur HNF 4.
10. Virus selon l'une des revendication précédentes caractérisé en ce que le signal d'expression comprend l'élément L4 du promoteur du gène codant pour la L-PK fusionné en amont de l'élément L3 de ce même promoteur, L4-L3.
11. Virus selon la revendication 10 caractérisé en ce que le signal d'expressioncomprend 4 oligomères, successifs L4-L3.
12. Virus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en que le signal d'expression comprend en outre un promoteur minimal.
13. Virus selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il s'agit de préférencede la séquence correspondant au fragment - 119 à 11 situé en 5' du gène codant pour la L-PK.
14. Virus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en que le signal d'expression est représenté par la SEQ ID N°4 ou l'un de ses dérivés.
15. Virus selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en que le signal d'expression comprend en outre un enhancer transcriptionnel.
16. Virus selon la revendication 15 caractérisé en que l'enhancer transcriptionnel est issu du premier intron du gène de l'aldolase B du rat.
17. Virus selon l'une des revendications 1 à 16 caractérisé en ce qu'il est dépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans lacellule cible.
18 Virus selon l'une des revendications 1 à 17 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus.
19. Virus selon la revendication 17 caractérisé en ce qu'il sagit d'un adénovirus humain de type Ad 2 ou Ad 5 ou canin de type CAV-2.
20. Virus selon l'une des revendications 1 à 17 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un rétrovirus.
21. Virus selon la revendication 20 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un rétrovirus de la famille MoMuLV.
22. Virus selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le gène hétérologue code pour l'insuline ou un de ses variants.
23. Utilisation d'un virus selon l'une des revendications 1 à 22 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies liées à une hyperglycémie.
24. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 21.
25. Composition pharmaceutique selon la revendication 24 caractérisée en ce qu'elle est sous forme injectable.
26. Composition pharmaceutique selon la revendication 24 ou 25 caractérisée en ce qu'elle comprend entre 10 4 et 10 14 pfu/ml, et de préférence 10 6 à 10 10 pfu/ml adénovirus recombinants défectifs.
27. Cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs virus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 21.
28. Cellule selon la revendication 27 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule humaine.
29. Cellule selon la revendication 28 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un hépatocyte ou d'une cellule .beta. pancréatique.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR95/04558 | 1995-04-14 | ||
| FR9504558A FR2732978B1 (fr) | 1995-04-14 | 1995-04-14 | Vecteur viral recombinant, composition pharmaceutique le contenant et cellules transformees correspondantes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2215987A1 true CA2215987A1 (fr) | 1996-10-17 |
Family
ID=9478162
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA002215987A Abandoned CA2215987A1 (fr) | 1995-04-14 | 1996-04-12 | Vecteur viral recombinant, composition pharmaceutique le contenant et cellules transformees correspondantes |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6309878B1 (fr) |
| EP (1) | EP0821741A1 (fr) |
| JP (1) | JPH11503608A (fr) |
| KR (1) | KR19980703843A (fr) |
| AU (1) | AU715377B2 (fr) |
| BR (1) | BR9604938A (fr) |
| CA (1) | CA2215987A1 (fr) |
| CZ (1) | CZ292564B6 (fr) |
| FR (1) | FR2732978B1 (fr) |
| HU (1) | HUP9802587A3 (fr) |
| MX (1) | MX9707910A (fr) |
| NO (1) | NO974726D0 (fr) |
| SK (1) | SK137797A3 (fr) |
| WO (1) | WO1996032489A1 (fr) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998021363A1 (fr) * | 1996-11-15 | 1998-05-22 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions et therapies utilisables contre le diabete de type ii lie au hnf-4 |
| US6537806B1 (en) | 1998-06-02 | 2003-03-25 | University Of Washington | Compositions and methods for treating diabetes |
| EP1889914A1 (fr) * | 1999-02-19 | 2008-02-20 | Engene, Inc. | Compositions de thérapie génétique pour le diabète |
| EP1153131B1 (fr) | 1999-02-19 | 2007-09-26 | enGene, Inc. | Compositions pour la thérapie génique des diabetes |
| JP3406244B2 (ja) * | 1999-04-30 | 2003-05-12 | 伊藤ハム株式会社 | 新規な融合蛋白質からの組み換えインスリンの製造方法 |
| JP3581346B2 (ja) | 1999-05-27 | 2004-10-27 | ヒタチグローバルストレージテクノロジーズネザーランドビーブイ | ディスク装置 |
| WO2002089855A1 (fr) * | 2001-04-27 | 2002-11-14 | Auckland Uniservices Limited | Transduction perorale d'hepatocytes dans le traitement d'une maladie |
| DE102005024884A1 (de) * | 2005-05-31 | 2006-12-07 | Linde Ag | Arbeitsmaschine, insbesondere Flurförderzeug |
| CN101212977A (zh) * | 2005-06-01 | 2008-07-02 | 国际创新生物技术研究所有限公司 | 葡萄糖可诱导的胰岛素表达和治疗糖尿病的方法 |
| ES2325711B1 (es) * | 2007-04-17 | 2010-06-17 | Centro De Investigaciones Energeticas, Medioambientales Y Tecnologicas (Ciemat) | Vectores de expresion que comprenden el promotor del gen pklr humano y su uso para la elaboracion de composiciones farmaceuticas destinadas a terapia genica somatica con expresion especifica en celulas eritroides. |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2109579A1 (fr) * | 1991-05-29 | 1992-12-10 | Julianna Lisziewicz | Vecteurs d'expression eucaryotiques avec regulation de la maturation de l'arn |
| DE69233013T2 (de) * | 1991-08-20 | 2004-03-04 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer | Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt |
| GB9305759D0 (en) * | 1993-03-19 | 1993-05-05 | Medical Research Council And T | Hiv therapy method and agents |
| AU687836B2 (en) * | 1993-06-28 | 1998-03-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Vectors for genetically engineered cells that produce insulin in response to glucose |
-
1995
- 1995-04-14 FR FR9504558A patent/FR2732978B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-04-12 MX MX9707910A patent/MX9707910A/es not_active IP Right Cessation
- 1996-04-12 CA CA002215987A patent/CA2215987A1/fr not_active Abandoned
- 1996-04-12 JP JP8530778A patent/JPH11503608A/ja not_active Withdrawn
- 1996-04-12 EP EP96913579A patent/EP0821741A1/fr not_active Withdrawn
- 1996-04-12 CZ CZ19973251A patent/CZ292564B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-04-12 SK SK1377-97A patent/SK137797A3/sk unknown
- 1996-04-12 BR BR9604938A patent/BR9604938A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-04-12 KR KR1019970707243A patent/KR19980703843A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-04-12 HU HU9802587A patent/HUP9802587A3/hu unknown
- 1996-04-12 US US08/945,140 patent/US6309878B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-04-12 WO PCT/FR1996/000560 patent/WO1996032489A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1996-04-12 AU AU56523/96A patent/AU715377B2/en not_active Ceased
-
1997
- 1997-10-13 NO NO974726A patent/NO974726D0/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1996032489A1 (fr) | 1996-10-17 |
| EP0821741A1 (fr) | 1998-02-04 |
| BR9604938A (pt) | 1998-06-09 |
| JPH11503608A (ja) | 1999-03-30 |
| NO974726L (no) | 1997-10-13 |
| CZ325197A3 (cs) | 1998-01-14 |
| NO974726D0 (no) | 1997-10-13 |
| US6309878B1 (en) | 2001-10-30 |
| MX9707910A (es) | 1997-11-29 |
| FR2732978B1 (fr) | 1997-05-30 |
| KR19980703843A (ko) | 1998-12-05 |
| AU5652396A (en) | 1996-10-30 |
| SK137797A3 (en) | 1998-05-06 |
| HUP9802587A3 (en) | 1999-12-28 |
| HUP9802587A2 (hu) | 1999-02-01 |
| AU715377B2 (en) | 2000-02-03 |
| FR2732978A1 (fr) | 1996-10-18 |
| CZ292564B6 (cs) | 2003-10-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0698108B2 (fr) | Vecteurs adenoviraux d'origine animale et utilisation en therapie genique | |
| EP1071804B1 (fr) | Utilisation de sequences d'adn de structure triplex pour le transfert de sequences nucleotidiques | |
| EP0752004B1 (fr) | Adenovirus recombinants codant pour le facteur neurotrophique des cellules gliales (gdnf) | |
| EP0912723A1 (fr) | Lignees d'encapsidation hautement productrices | |
| WO1996005320A1 (fr) | Adenovirus comprenant un gene codant pour la glutathion peroxydase | |
| CA2215987A1 (fr) | Vecteur viral recombinant, composition pharmaceutique le contenant et cellules transformees correspondantes | |
| WO1997019182A1 (fr) | Production de vecteurs retroviraux par l'intermediaire de vecteurs herpetiques | |
| WO1996010087A1 (fr) | Methode de traitement des cancers par regulation de l'activite des proteines ras | |
| EP1078094B1 (fr) | Methodes et compositions pour la production de particules virales | |
| CA2184297C (fr) | Virus recombinants codant pour une activite glutamate decarboxylase (gad) | |
| WO1995025803A1 (fr) | ADENOVIRUS RECOMBINANTS CODANT POUR LE FACTEUR DE CROISSANCE DES FIBROBLASTES ACIDES (aFGF) | |
| EP1129204A1 (fr) | Nouveau systeme de regulation de l'expression d'un transgene | |
| EP0750676A1 (fr) | Adenovirus recombinants codant pour le facteur neurotrophique derive du cerveau (bdnf) | |
| EP0734447A1 (fr) | Modele animal de la maladie d'alzheimer, preparation et utilisations | |
| FR2726575A1 (fr) | Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique | |
| CA2321220A1 (fr) | Utilisation d'elements de regulation negative pour l'expression neurospecifique de transgenes | |
| FR2717823A1 (fr) | Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique. | |
| EP0750674A1 (fr) | ADENOVIRUS RECOMBINANTS POUR LE FACTEUR DE MATURATION DES CELLULES GLIALES DE TYPE BETA (GMF-$g(b)) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EEER | Examination request | ||
| FZDE | Discontinued |