CZ325197A3

CZ325197A3 - Rekombinantní virální vektor, farmaceutická kompozice tento vektor obsahující a odpovídající transformované buňky

Info

Publication number: CZ325197A3
Application number: CZ973251A
Authority: CZ
Inventors: Ruihuan Chen; Bruno Doiron; Axel Kahn
Original assignee: Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Priority date: 1995-04-14
Filing date: 1996-04-12
Publication date: 1998-01-14
Also published as: CA2215987A1; MX9707910A; US6309878B1; NO974726L; KR19980703843A; HUP9802587A2; CZ292564B6; JPH11503608A; AU715377B2; NO974726D0; HUP9802587A3; FR2732978B1; AU5652396A; SK137797A3; FR2732978A1; EP0821741A1; WO1996032489A1; BR9604938A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká rekombinantních vektorů virového původu, přípravy těchto vektorů, farmaceutické kompozice tyto vektory obsahující a jejich terapeutického použití, zejména v genové terapii a pro léčení nebo/a prevenci hyperglykémie.

Dosavadní stav techniky

Genová terapie spočívá v opravě snížené schopnosti nebo anomálie (mutace, aberantní exprese, atd.) vložením genetické informace do buňky nebo postiženého orgánu. Tato genetická informace může být vložena, dejme tomu, in. vitro do buňce extrahované z organismu, modifikovaná buňka se pak zavede opět do organismu, přímo do vhodné tkáně in vivo. Byly popsány různé techniky pro vkládání této genetické informace. Různé techniky transfekce zahrnují komplexy DNA a DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), DNA a nukleární proteiny (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), DNA a lipidy (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), použití lipozomů (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), atd.

Použití virů jako vektorů pro přenos genů se ukázalo jako slibná alternativa k těmto fyzikálním technikám transfekce. V tomto ohledu byly testovány různé viry pro schopnost infikovat určitou populaci buněk. Zvláště retroviry (RSV, HMS, MMS, atd.), virus HSV a adenoviry.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se vztahuje zejména k novým virovým vektorům pro léčení hypoglykemií jako je diabetes.

Diabetes je syndrom obvykle chronický, jehož nejcharakterističtější sympton je hyperglykemie, v nepřítomnosti zvýšení renálního prahu pro glukózu, glykosurie. Principiální příčinou je absolutní nebo relativní nedostatek insulinu mající za následek anomálie nejenom metabolismu uhlovodíků, ale také bílkovin a tuků.

Diabetes je všeobecně léčena podáváním insulinu, tato léčba všaak silně omezuje pacienta.

Předložený vynález se týká vektorů virového původu dovolujících nahradit tuto desorganisaci metabolismu glukosy v organismu obnovením vhodného způsobu řízení koncentrace insulinu in vivo.

Ví se, že glukosa je faktorem regulace transkripce genů ve většině živých bytostí. Zejména se ukázalo, že glukosa je schopna stimulovat transkripci kódovaného genu pro glykolytické enzymy a lipogenické enzymy v hepatocytech a adipocytech jako např. gen pyruvatkinasy typu L, specifický tkáňový glykolytický enzym, který hraje důležitou roli v regulaci glykolýzy a glukoneogenese v játrech. Exprese proteinu L-PK v játrech je pod potravní a hormonální kontrolou. Je indukovaný dietou bohatou na glukosu a naopak inhibován ztrátou glukosy a objevuje se u diabetiků. Ví se také, že expresí svého genu je pozitivně regulován dvojicí glukosa/insulin a negativně glukagonem prostřednictvím svého druhého přenašeče cyklického cAMP (A. Kahn, J. Bio. Chem. 264, (1989), 11584-11590) .

Nedávno byla charakterisovánaa různá místa vázání (prvky LI až L4) pro faktory transkripce a zvláště elementu odpovědi na obsah glukosa/insulin nebo GIRE v oblasti před promotorem ···· • ·

genu tohoto enzymu L-PK (A. Kahn et al., J. Mol. Biol. 209, (1989), 205-219). Promotor byl také identifikován ve smyslu 3'až 5'od krabice TATA, element LI, místo vázání pro nukleární faktor 1 hepatocytu (HNF1), element L2, místo vázání pro nukleární faktor 1 (NF1), element L3, místo vázání pro nukleární faktor 4 hepatocytu (HNF4) a element L4, místo vázání pro faktor transkripcionální (MLFT)/USF (Obrázek 1). Specifický element odpovědi na glukosa/insulin byl přesně lokalizován v genu kódujícím L-PK ve formě perfektního palindromu mezi nukleotidy -168 až -144 od místa cap, dejme tomu v elementu L4 (Obrázek 2) . Element GIRE se jeví jako schopný udělit transkripční odpověď na glukosu k minimálnímu promotoru L-PK, který je tvořený TATA a elementem LI.

Jasně se ukázalo, že je možné zhodnotit schopnost elementu GIRE, k odpovědi na glukosu v virálním kontextu pro modulování exprese zainteresovaného proteinu v genové terapii.

Předložený vynález se vztahuje k defektním rekombinantním virům, obsahujícím alespoň heterologní gen pod řízením expresivního signálu indukovaného glukosou nebo jejími analogy.

Analogy glukosy jsou všechny prostředky představující strukturní homologii s glukosou a jsou schopné indukovat aktivaci expresního signálu. Vhodnými analogy, které byly použity podle předloženého vynálezu jsou zejména fruktosa, galaktosa, cukrosa, laktosa a všechny cukry, které mohou být hydrolyzovány na tyto složky.

Ve smyslu předloženého vynálezu expresní signál indukovatelný glukosou pokrývá všechny sekvence expresního signálu, jehož aktivace, která podmiňuje subsekvenční transkripci heterologického genu je zvláště indukovaná v přítomnosti glukosy nebo jejích analogů.

Jedná se zejména o rekombinantní defektní virus ve kterém exprese heterologického genu je umístěna pod řízením expresního signálu odvozeného úplně nebo částečně od promotoru genu kódujícího pyruvátkinasu typu L, L-PK. Tento expresní signál odvozuje celek nebo část fragmentu obsahujícího 183pb umístěného na 5'konci kočovaného genu kočujícího L-PK.

Expresní signál podle vynálezu obsahuje celou nebo část sekvence SEQ ID N°1.

Podle způsobu preferované realizace expresní signál obsahuje celou nebo část elementu L4 tohoto promotoru.

Element L4 je obzvláště představovaná úplně nebo částečně sekvencí SEQ ID N°2, sekvencí hybridující s částí nebo celkem této sekvence nebo sekvencí, která je od ní odvozena a schopnou vstoupit v interakci s faktorem MLTF/USF.

Ve smyslu předloženého vynálezu se očekává, že odvozením všech sekvencí získaných jednou nebo více modifikacemi si tyto sekvence zachovající alespoň jednu z biologických vlastností původní sekvence a zejména svoji schopnost vstoupit v interakci se svým nebo svými faktorem (faktory) a vytvořit specifické vazby, v tomto případě tvořené se jedná o faktor MLTF/USF. Modifikací se rozumí všechny mutace, substituce, delece, adice nebo modifikace povahy genetické nebo/a chemické. Tyto modifikace mohou být prováděny známými technikami.

V obměně vynálezu element L4 je opakován ve formě čtyř souvislých oligomerů v expresním signálu.

Podle vynálezu expresní signál obsahuje kromě částice L4 celek nebo část elementu L3 promotoru genu kódujícího L-PK.

Ukázalo se, že element L3 přispívá k lepší účinnosti elementu L4. (A. Kahn et al. Nucleic Acids Research 20, (1992), N°8 p!871). Element L3 je představen částečně nebo úplně sekvencí SEQ ID N°3, sekvence hybridující s částí nebo celkem toho nebo sekvence, která je odvozena, schopná

Podle způsobu preferované realizace expresní signál obsahuje element L4 promotoru genu kódujícího L-PK, vázaný před elementem L3 stejného promotoru. Je tak popsán jako L4-L3. Expresní signál podle vynálezu obsahuje 4 souvislé oligomery L4-L3.

Tento signál exprese obsahuje mimoto promotor řečený minimální.

Ve smyslu předloženého vynálezu minimální promotor označuje všechny iniciátory sekvence, které sami nejsou schopné účinně zajistit transkripci heterologigké sekvence, která je mu přidružená. Aktivita takového promotoru se jeví úplně závislá na aktivaci elementu odpovídajícího glukose. Minimální promotor má hlavně funkci zaměřenou na transkripci. V této perspektivě je obzvláště umístěn v místě cap heterologické sekvence, a tak vytváří kontinuální nukleotidovou sekvenci.

Podle vynálezu je také možné použití minimálního promotoru odvozeného od konvenčního promotoru jako například promotor aktivující transkripci genu typu thymidinkinasa, chloramfenikolacetyltransferasa, β-galaktosidasa nebo luciferasa nebo odvozeného od promotoru genu kódujícího pyruvatkinasu typu L. Tento minimální promotor může být odvozen od lidského CMV. V případě potřeby takový promotor může být minimální.

Podle stejného principu minimální promotor může být odvozen od promotoru přirozeně odpovídajícího expresi zainteresovaného heterologického genu.

Název minimální promotor byl úspěšně použit podle vynálezu pro sekvenci odpovídající fragmentu -119 až 11 umístěné na 5'konci genu kódujícího L-PK.

···· • · ··· ·

Všeobecně tento minimální promotor je umístěn místě cap nukleové sekvence, v níž řídí expresi svého přírodního promotoru. Vlastní promotor nuklevé sekvence může vskutku zůstat přítomný, ale ve formě inaktivní nebo zbaven funkce různými známými technikami, zejména delecí nebo/a adicí jedné nebo více basí.

Expresní signál odpovídá úplně nebo částečně sekvenci SEQ ID N°4 nebo jedné z jejích derivátů.

Oblast iniciátoru může být modifikována adicí aktivaační sekvence nebo regulací (zejména sekvencí promotoru), dovolující zvětšit sílu promotoru induktivního charakteru. Za cílem vylepšovat sílu promotoru se vytvoří hybridní vektor, ve kterém promotor 183 pb genu PK-L je předcházející fragmentu 402 pb umístěného v prvním intronu genu krysí aldolasy B nukleotidu 1920 k nukleotidu 2321 v místě iniciace transkripce (SEQ ID No6 odpovídající nukleotidům 1915 až 2379). Presentované výsledky v tomti příkladě ukazují, že tato konstrukce zvyšuje expresi genu faktoru 5, v odpovědi na glukosu.

Co se týče sekvence heterologických nukleových kyselin umístěných pod kontrolou expresního signálu podle vynálezu obsahuje tato sekvence jeden nebo více terapeutických genů, jejichž přenos nebo/a exprese v buňce, orgánu nebo organismu se zkoumá.

Terapeutické geny, které mohou také být přenášeny jsou všechny geny, jejichž transkripce a eventuelně transdukce v cílové buňce vytváří produkty mající terapeutický efekt.

Může se zvláště jednat o geny kódující proteinové produkty mající terapeutický efekt. Proteinové produkty také kódují protein, peptid, aminokyselinu atd. Tyto proteinové produkty mohou být homologické vůči cílovým buňkám (může se říci produkt, který je normálně vyjádřen v cílové buňce, který nerepresentuje žádnou patologii). V tom případě exprese • ···· · ·· ·· ···· ·· · ······ · proteinu např. zmírňuje nedostatečnou expresi v buňce nebo dovoluje expresi inaktivního proteinu nebo slabě aktivního vzhledem k modifikaci, nebo exprimovat výše uvedený protein. Terapeutický gen může také kodovat mutant buněčného proteinu majícího stabilitu, modifikovanou aktivitu atd. Proteinové produkty mohou být heterologické vůči cílové buňce. V tom případě vyjádřený protein může například doplnit nebo nést aktivitu se sníženou schopností do buňky dovolujícím bojovat proti patologii.

Mezi terapeutické produkty ve smyslu předloženého vynálezu můžeme citovat zejména enzymy, krevní deriváty, hormony jako je inzulín, lymfokiny: interleukiny, interferony, TNF, atd. (FR 9203120), růstové faktory nebo její prekurzory nebo enzymy syntézy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 atd., apolipoproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE atd. (FR 93 05125), dystrofin nebo minidistrofin (FR 91 11947) atd.

Podle obměny vynálezu heterologická sekvence obsahuje alespoň gen kódující insulin nebo obměnu insulinu. Ve smyslu vynálezu obměna pokrývá zejména různé formy maturace inzulínu jako například proinzulín (VOllenweider et al., J. Biol. Chem. 267, (1992) 14629-14636 a Groskreutz et al., J. Biol. Chem. 269, (1994), 6241-6245).

Gen kódující insulin přítomný ve vektoru podle vynálezu obsahuje celou nebo část sekvence SEQ ID N°5.

Vektory podle vynálezu mohou být připraveny od různých typů virů. Zejména se používají vektory odvozené od adenovirů nebo retrovirů.

Viry podle vynálezu jsou defektní, může se říci, že jsou neschopné se replikovat autonomním způsobem v cílové buňce. Všeobecně, genom defektního viru použitého v oblasti předloženého vynálezu je tak zbaven alespoň jedné sekvence nutné pro replikaci výše uvedeného viru v infikované buňce.

• · ·····* • ·· ········ • · · · · · · ·

.............

Tyto oblasti mohou být vyloučeny (úplně nebo částečně) zbavené funkcí, substituované dalšími sekvencemi a zejména sekvencí DNA kódující gen jako například gen insulinu. Defektní virus zachovává sekvencí svého genomu, který je nezbytný pro kapsidaci virových částí.

Byl charakterizován účinný adenovirus a různé serotypy, jejichž struktura a jakkoliv rozličné vlastnosti. Mezi těmito serotypy se s výhodou používají v oblasti předloženého vynálezu lidské adenoviry typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenoviry zvířecího původu (viz FR 93 05954). Mezi adenoviry zvířecího původu použitých v rámci předloženého vynálezu se mohou citovat adenoviry původu psího, hovězího, myšího (př. Mávl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčího, prasečího, ptačího nebo opičího (př.: SAV). Obzvláště se používají adenoviry zvířecího původu jako je adenovirus psí, zvláště adenovirus CAV2 (např. kmen manhattan nebo A26-61 (ATCC VR-800)). V rámci předloženého vynálezu se obzvláště používá adenovirus původu lidského nebo psího nebo smíšený.

Defektní adenoviry vynálezu obsahují ITR sekvence dovolující enkapsidaci a sekvence kódující terapeutický protein. V genomu adenoviru vynálezu gen El a geny E2, E4, L1-L5 jsou nefunkční. Virový gen může být zbaven funkceí všemi známými technikami a zvláště totálním zrušením substituce, delece nebo adice jedné nebo více basí v genu nebo genech zkoumaných. Takovéto modifikace mohou být získány in vitro (na izolované DNA) nebo v místě například prostřednictvím technik povahy genetické nebo působením mutageních činitelů. Defektní rekombinantní adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny odborníky všemi známými technikami (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917).

Co se týče retrovirů - konstrukce rekombinantních vektorů byla široce popsána v literatuře: viz zejména Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203, EP 453242, EP178220,

Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235, McCormick,

BioTechnology 3 (1985) 689, atd. Retroviry jsou viry, které infektijí selektivně buňky v dělení. Genom retrovirů obsahuje zvláště dva LTR, sekvenci kapsidace a tři kódované oblasti (gag, pol, a env) . V rekombinantní ch vektorech odvozených od retrovirů geny gag, pol a env jsou všeobecně deletovány úplně nebo částečně a umístěny sekvencí heterologické nukleové kyseliny. Tyto vektory mohou být tvořeny od různých typů retrovirů takových, jako jsou zejména MoMuLV (murine moloney leukemia virus, také popsán jako MoMLV), MSV (murine moloney sarcoma virus) HaSV (harvey sarcoma virus), SNV (spleen necrosis virus), RSV (rouš sarcoma virus) nebo Friendův virus.

Pro konstrukci rekombinantních retrovirů obsahuje yainteresovanou sekvenci, plazmid obsahující zejména LTR, sekvence kapsidace. Výše uvedená zainteresovaná sekvence je všeobecně vystavěná potom použitá pro transfekci buněk působit na trans funkce defektních retrovirů v Všeobecně původci kapsidace jsou tak schopné exprimovat geny gag, pol a env. Potomstvo kapsidace bylo popsáno v původních pracech a zejména PA317 (US4, 861,719), (W090/02806) a GP+envAm-12 citovat buněčné ψ-2, které (myšího fibroblastu) transfekci pMOV-ψ', plazmid obsahující genom viru leukemie myší Moloney (MoMuLV), jehož sekvence enkapsidace \\) je deletována (Mann et al., Cell, (1983), 33,

153-159). Z jiného hlediska rekombinantní retroviry mohou schopné a plazmidu.

PsiCRIP zejména (W089/07150) .

pocházejí z

Můžeme

NIH-3T3 obsahovat modifikace na transkripcionální aktivity obsahuje část genu gag (Bender et al., J. Virol. 1639). Rekombinantní viry jsou technikami.

úrovni LTR pro tak, že sekvence pak čištěny vyj ádření kapsidace (1987) 61, klasickými

V případě předloženého vynálezu retroviry mohou být připraveny transfekci retrovirálního plazmidu obsahujícího

4444 ·· 4 · ·4

expresní signál podle vynálezu, dvojici genu kódujícího protein v buňkách transkomplementárních, které dovolí produkci virálních částic, jehož genom kóduje transgen.

Předložený vynález se týká výhody použití adenovirů nebo rekombinantních defektních retrovirů, retrovirů, které jsou výhodné pro exprimaci insulinu.

Podle vynálezu exprese genu kódujícího inzulín pod kontrolou expresního signálu kontrolovaného glukosou a transfektující buněky in vivo pomocí tohoto typu vektoru se indukují tyto buňky k produkci insulinu pod vlivem svého fyziologického glukosového promotoru. Tyto buňky musí být schopny exprimovat transgen insulinu v přítomnosti fyzio

Infekce takových buněk hepatocytů rekombinantními viry podle vynálezu může být realizována ex vivo nebo/a in vivo transfektované buňky také jsou schopné vylučovat insulin. Místa infekce v oblasti předloženého vynálezu jsou místa přírodní sekrece inzulínu jako je krevní řečiště.

Předložený vynález pojednává zejména o savčích buňkách, zejména lidských a zejména o hepatocytech nebo/a buňkách β infikovaného pankreasu jedním nebo více nárokovanými viry.

Mezi schopnosti indukovat in vivo expresi insulinu vektory podle vynálezu dovolují výhodně přímou blokaci této sekrece pod vlivem glukagonu vytvořeného AMP. A tak se zabrání nebezpečí hypoglykemie.

Infektované buňky jedním nebo více viry nárokovanými by mohly být také implantovány do jater, krysy, slinivky břišní nebo střeva.

Předložený vynález také popisuje nový přístup pro léčení zejména problémů diabetických závislých na konzistentním inzulínu k indukování syntézy in vivo.

V případě, kde transfektové buňky s vektorem podle ·· ···* ···· ··

• * ··· « • · » vynálezu nemají tento fyziologický promotor glukosy, původce exprese heterologického genu jiného než insulin se například může vytvořit následovně: koncentrace glukosy nebo koncentrace analogů majících stejný vliv na sekvenci odpovídající glukose (L4-L3) , se upraví způsobem k indukci exprese proteinu prostřednictvím aktivity expresního signálu podle vynálezu. Je jasné, že tato koncentrace je určena funkcí kvantity v injektovaném vektoru povahou místa infekce a expresí v proteinu.. .

Předložený vynález se týká použití virů tak, že popisuje dále přípravu farmaceutické kompozice obsahující jeden nebo více rekombinantních defektních virů takových, které jsou dříve popsané. Farmaceutické kompozice mohou být formulovány z pohledu podávání cestou topikální, orální, parenterální, intranasální, intravenózní, intramuskulární, na kůži, intraokulárně, transškárově, atd. Farmaceutické kompozice podle vynálezu obsahují farmaceutické vehikulum vhodné pro injektovatelnou formulaci. Může se jednat zvláště o sterilní roztoky, o roztoky izotonické nebo o látky suché, zejména lyofilizované, které se řídí podáním podle okolnosti. Sterilovaná voda nebo fyziologické sérum dovoluje složení roztoku injektovatelné.

Dávky defektních rekombinantních virů použitých pro injekci mohou být přizpůsobeny funkci různých parametrů zejména funkci virálního vektoru, způsobu použitého podávání týkající se patologie nebo délky zkoumaného podávání. Všeobecně rekombinantní viry podle vynálezu jsou formulovány a podávány ve formě dávek pohybující se mezi 10⁴ a 10¹⁴pfu/ml, zejména 10^b až 1O¹⁰ pfu/ml. Termín pfu (plque forming unit) odpovídá infekční schopnosti roztoku virů a je určen infekcí vhodné buněčné kultury a počtem plaků infektovaných buněk po 48 hodinách. Techniky pro určení velikosti pfu virálního roztoku jsou dobře zdokumentovány v literatuře. Kompozice podle vynálezu mohou obsahovat přímo produkující • ·· · ···· (tvůrčí) buňky z pohledu jejich implantace.

Následující příklady a obrázky blíže ilustrují vynález, aniž by však omezily v jakémkoliv směru rozsah vynálezu.

Legendy k obrázkům

Obrázek 1: Schéma posloupnosti elementů LI až L4 identifikovaných v promotoru genu L-PK a jejich spojovací proteiny

Obrázek 2: Palindrom elementu L4

Obrázek 3: Retrovirální plazmid pHSG(L4L3)4PKCAT a klony F6 A B8

Obrázek 4: Určení množství aktivity CAT v buňkách mhATIIIF transformovaných klonem B8, funkce množství injektované glukosy

Obrázek 5: Určení množství aktivity CAT v buňkách mhATIIIF transformovaných klonem B8 v různých časech inkubace

Obrázek 6: Konstrukce plazmidů pHSG/PK-CAT a pHSG/AL-PK-CAT

Obrázek 7: Indukce glukosou v různých dávkách vyjádření plazmidů pHSG/PK-CAT a pHSG/AL-PK-CAT

0000 · ·0 ··

0 0 0000 ·· • <0 · I · 0 0000 • 0 · 000 · Λ

000 «0 ·00 00 «· 0

Všeobecné techniky molekulární biologie

Klasické metody použité v molekulární biologii takové, jako extrakce přípravy plazmidové DNA, odstřeďování plazmidvé DNA v gradientu chloridu cesnatého, elektroforéza na agarových gelech nebo akrylamidových, čištění fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinů fenolem nebo fenol-chloroformem, srážení DNA v prostředí šalinu ethanolen nebo isopropanolem, transformace v Escherichia coli atd... jsou dobře známé odborníky a jsou hojně popsány v literatuře (Maniatis T. et al., Molecular Cloning, a Loboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν. Y., 1982, Ausubel F. M. et al. (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1987) .

Plazmidy typu pBR322, pUC a fága serie M13 jsou komerčního původu (Bethesda Research Laboratoires).

Fragmenty DNA mohou být separovány podle jejich velikostí elektroforézou na agarovém gelu nebo na akrylamidu, extrahovány fenolem nebo směsí fenol-chloroform, sráženy ethanolem potom inkubovány v přítomnosti DNA-ligasy fágu T4 (Biolabs) podle doporučení dodavatele.

Plnění výstupujičího 5'konce může být uskutečněno Klenowým fragmentem DNA~polymerasy z Escherichia coli (Biolabs) podle specifikace dodavatele. Destrukce vystupujícího 3'konce je uskutečněna za přítomnosti DNA-polymerasy fága T4 (Biolabs) podle doporučení výrobce. Destrukce vystupujícího 5'konce je uskutečněna působením nukleasy Sl.

Mutagenese řízená in vitro syntetickými oligodeoxynukleotidy může být provedena podle metody vyvinuté Taylorem et al. (Nukleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764) za použití soupravy distribuovaného Amershanem.

Enzymová amplifikace fragmentů DNA technikou řečenou PCR (Polymerase-catalysed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., ····

Science 230 (1985) 1350-1354, Mullis Κ. B. et Faloona F. A., Math. Enzym. 155 (1987) 335-350) může být provedena za použití ''DNA thermal cycler'' (Perkin Elmer Cetus) podle specifikace výrobce.

Ověření sekvencí nukleotidů může být provedeno metodou vyvinutou Sangerem et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA., 74 (1977) 5463-5467) použití soupravy distribuovaného

Amershanem.

e

« ·· · ·· · · • · * · fr

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Konstrukce retrovirálního vektoru

Všechny plazmidy jsou konstruovány podle standardních technik klonování DNA. Konstrukce plazmidu pHSG(L4L3)4-PKCAT, (uveden na Obrázku 3), obsahuje konstruktivní část MMLV plazmidu pHSGNeo a sekvenci kódující gen CAT pod řízením promotoru krysího genu pyruvátkinasy typu L (bp -119 až +11) před nímž oligomerní fragmenty L4L3 4 krát (GIRE a místo vazby HNF4) jsou svázány. Fragment L4L3, odpovídající fragmentu vymezeném mezi pb -172 až -123 před místem iniciace transkripce L-PK byl získán PCR. Použitá signální sekvence polyA je přítomna v LTR na 3'konci MMLV. Plazmid pHSGNeo (Gruid et al. J. Virol. 1988, 62, 3795-3801), retrovirální plazmid odvozený od MMLV, psi-CRIP, amfotropická komplementární buněčná kultura, která přináší strukturní proteiny MMLV byly opatřené Dr. A. Weber (Institut Cochin de Genetique Moleculaire, Paříž), plazmid pRSVNeo, ve kterém gen aminoglykosidfosfotransferasy je pod kontrolou promotoru LTR RSV byl použit pro kotransfekci.

Příklad 2: Buněčná kultura a transfekce

Buňky mhATIIIF jsou buňkami nádorové tkáně myších jater exprimující geny prekoků SV40 pod řízením promotoru specifického antithrombinu III jater (ATIII-SV40) (Kahn A. et al. Exp. Cell. Res., 200, 175-185). Tyto buňky jsou kultivovány v živném prostředí DMEM F12/NUT.MIX. (1:1 obj./obj.) s přídavkem glutamax-1 nebo DMEM/HamF12 (1:1 obj./obj.) (Gibco-BRL) s D+glukosou (Sigma) nebo bez jejího triodothyroninu,

Buňky NIH3T3 a glukosy, 1,0 mM ♦ · ·· · • · 4 « 9 · · • · ·

444 4 4 přídavku, doplněném ΙμΜ dexamethasonu, 1μ Μ 20nM lidského insulinu, 5% (obj./obj.) SVF psi-CRIP jsou kultivovány v: DMEM (5,5 mM pyruvátu sodného) doplněné 10% (obj./obj.) telecího séra. Do tohoto prostředí se přidá ampicilín, streptomycín a glutamin a buňky se inkubují při 37°C s 5% (obj./obj.) C02. Buňky psi-CRIP se kotransfektuji s plazmidem pHSG (L3L4)4-PKCAT a pRSV Neo (molární poměr obou plazmidů byl 10 : 1) metodou kationického lipozomu (DOTAP, Boeringer Mannheim) a šlechtí v přítomnosti G418 (800 pg/ml). Klony rezistentní k G418 se oddělí pro test produkce retrovirů.

Příklad 3: Příprava virální RNA a PCR-RT v jedné etapě

Buněčné klony rezistentní k G418 se naočkují do 90 mm nádobky a kultivovují až do 100% spojení. Plavající povrch buněčné kultury se filtruje na membráně, která má póry o velikosti 0,22 μπι, inkubuje s DNasou I (10 μg/ml)při 37°C během 30 minut potom odstředí při 65000 rpm během 20 minut při 4°C. Retrovirální RNA se extrahuje a čistí od usazeniny po srážení proteinasou K a směs fenol/chloroform potom společně vysráží tRNA. Vzorek se rozpustí v dithylpyrokarbonu ve směsi s vodou, směs obsahuje ještě 1 mM dithiothretol (DTT) , 40 U RNAsin/100 μπι, pak se podrobí reverzní transkriptase a PCR zároveň. Pro amplifikaci se použijí dvě následující sondy:

- 5'ACTCAAATGCCCAATGAAGTC 3'(SEQ ID N°7), odpovídající oblasti Gag MMLV (pb 1524 až 1544),

5'TCAACGGTGGTATATCCAGAT 3'(SEQ ID N°8), odpovídající ·· · «· » i » e ·| ·····* • •fe ··· * ?

«»· ·♦ ··* ·· *· * oblasti kódující gen CAT (pb 53 až 15)

Inverzní transkripce od antimediátorové sondy PCR se katalyzuje inverzní transkriptasou 8U AMV (Promega) během 1 hodiny při teplotě 42°C a následuje PCR s DNA-polymerasou Taq25U, ta se uskuteční v 35 až 40 cyklech. Zvětšený fragment je dlouhý 440 pb a obsahuje část genu gag, 4 opakující se motivy L3L4, promotor -119 L-PK a 65 pb genu CAT. Je-li nutné, fragmenty se klonují a skvenují.

Příklad 4: Produkce rekombinantních retrovirů

Retrovirální vektory pHSG(L4L3)4-119PKCAT a pRSVNeo jsou použity pro kotransfekci buněčné kultury psi-CRIP. Je analyzováno 70 klonů resistentních k G418. 8 pozitivních klonů v RT-PCR prokazuje schopnost produkce infektovaných rekombinantních retrovirů, tyto klony jsou určeny PCR specifickým fragmentu vzhledem k genomické DNA buněk NIH3T3. Jasně se ukázalo, že produkce retrovirů je specifická u následujících dvou klonů.

klon F6 (5.10⁴) infektovaného retrovirů, produkt retrovirů s oblastí signální sekvence (4 opakující se fragmenty L4L3 (Obrázek 3))

- klon B8 (2.10⁵) se signální sekvencí částečně deletovaný (jeden celý motiv L4L3 nebo malá část druhého motivu L3(Obrázek 3)).

Čistota retrovirů se určí semikvantitativní PCR-RT používající pHSG(L4L3)4199PKCAT jako standard.

···· stanovení

4 4 ť

4 «4 4

Příklad 5: Infekce rekombinantními retroviry, čistoty retrovirů a dávkování proteinu CAT

Pozitivní klony se použijí pro infekci buněk NIH3T3, aby se odhadla schopnost infekce retrovirů.

ml plavajícího povrchu buněčné kultury 100% spojené se použije pro infekci buněk NIH3T3 v logaritmické fázi růstu s 8 μg/ml polybrenu. Po třech hodinách inkubace, se polybren v prostředí zředí na 2 μg/ml a kultura se nechá se ješte 48 hodin inkubovat. Genomická DNA infektovaných buněk NIH3T3 se extrahuje a použije pro amplifikaci PCR za použití sond popsaných v příkladu 3. Detekce specifického fragmentu dokazuje integraci retrovirálních sekvencí v genomu infektovaných buněk. Čistota se určí množstvím DNA vznikající z genomické DNA infektovaných buněk s různým zředěním retrovirů (10² až 10^s molekul). Klony, které jsou produkovány infektovanými viry jsou společně infubovány s buňkami mhATIIIF podle následujícího protokolu:

- do 90 mm nádobky se umístí 60 mm nádobka, jejíž základna byla odstraněna, stěny se napustí silikonovým olejem, prostor se tak rozdělí na dvě části.

- do centra se vloží buňky mhATIIIF, buňky produkující retrovirus se vloží do okrajního prostoru, a tak se nesmísí tyto dva typy buněk.

- když se buňky dobře fixují v nádobce po šesti hodinách inkubace, malá nádobka se vyjme. Prostředí se tak změní pro • ·· ·

novou 16 hodinovou inkubaci, potom se přidá 8 μg polybrenu a buňky se kultivují dalších 48 hodin.

- Aktivita CAT se měří chromatograficky na tenké vrstvě a kvantifikuje v cpm scintilací.

Příklad 6: exprese

Indukce glukosou v dávkách a různých časech

Buňky mhATIIIT přirovnatelné k hepatocytům u krys, udržují svou schopnost odpovídat glukose transkripcionální aktivací genu L-PK a jsou tak přizpůsobeny pro testování odpovědi transgenu CAT, transferovaného retrovirálním vektorem vdůsledku aktivity L-PK GIRE v retrovirálním prostředí.

Pro zvětšení účinnosti transfekce, buňky mhATIIIF se kultivují dvakrát s buňkami produkujícími retroviry a to vede k uspokojivému stupni infekce s klonem B8. Jak je ukázáno na obrázcích 4 a 5 exprese transgenu L-PK/CAT v infektovaných buňkách mhATIIIF je bobře indukována glukosou. Poloviční maximální indukce se získá pro koncentraci 3-4 mM glukosy a maximální indukce pro 8 mM glukosy. Pro vyšší koncentrace glukosy aktivita CAT zůstává relativně stabilní.

Buňky mhATIIIF se kultivují v prostředí obsahující 17 mM glukosy, indukce genu je pozorována od osmé hodiny inkubace, poloviční indukce před 24 hodinou a maximální indukce ve 48 hodině.

Příklad

7:

Konstrukce plazmidů pHSG/PK-CAT a

· ·· <·· ·

pHSG/AL-PK-CAT

Plazmidy jsou konstruovány podle standardních technik klonování ADN. Spojení se ověřuje sekvenovánín DNA. Konstrukce plazmidu pHSG/PK-CAT obsahuje část MMLV pHSG umístěné mezi nukletidy od 1 až 2015 a od 3888 až 4445, pro plazmid pHSG/AL-PK-CAT, sekvence MMLV jsou umístěny mezi nukleotidy od 1 až 2015 a od 4290 až 4847 (Obrázek 6) . Sekvence kódující gen CAT pod kontrolou promotoru krysího genu pyruvátkinasy typu L (-183 až +11 bp) je umístěn mezi nukleotidy 2048 až 3033 pro plazmid pHSG/PK-CAT a mezi 2450 a 3435 pro plazmid pHSG/AL-PK-CAT. Sekvence fragmentu genu aldolasy B (SEQ ID N°6) je situována mezi nukleotidy 2035 a 2437 v plazmidu pHSG/AL-PK-CAT.Použitá signální sekvence póly A je sekvence SV40 umístěna mezi nukleotidy 3033 a 3873 v pHSG/PK-CAT a mezi 3435 a 4275 v pHSG/AL-PK-CAT. Nukleotidy od 2015 až 2048, 2242 až 2452 a 3873 až 3888 jsou adaptéry mezi různými fragmenty pro plazmid pHSG/PK-CAT, jsou situovány pro plazmid pHSG/AL-PK-CAT jsou situovány od 2015 až 2035, 2435 až 2450, 2544 až 2654 a 4275 až 4290.

Příklad 8: Indukce glukosou v různých dávkách exprese plazmidů pHSG/PK-CAT a pHSG/AL-PK-CAT

Buňky mhAT3F pocházejí z jaterního myšího nádoru u exprimující geny. SV40 pod kontrolou promotoru specifického antithombinu III jater (Kahn A. et al. Exp, Cell, Res., 200, 175-185) . Tyto buňky se kultivují při teplotě 37°C s 5% (obj./obj.) CO2 v živném prostředí DMEM F12/NUT.MIX. (1:1 obj./obj.) s glutamaxem-1 (Gibco-BRL) s přídavkem D-glukosy bez tohoto přídavku, doplněné 1 μΜ μΜ triodothironinu a 20 nM lidského pg plazmidu pHSG/PK-CAT nebo plazmidu pHSG/AL-PK-CAT se transfektuje metodou kationického liposomu (DOPAP, Boehringer Mannheim). Buňky se následně kultivují v (Sigma) nebo dexamethasonu, insulinu. 5

·· ·

·· ··· · přítomnosti různých koncentrací glukosy během 24 hodin za účelem indukce promotoru PK-L. Aktivita CAT se měří chromatograficky na tenké vrstvě a kvantifikuje v jednotkách cpm scintilací. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 7. Po 24 hodinách indukce v přítomnosti různých koncentrací glukosy je exprese plazmidu pHSG/PK-L v přítomnosti promotoru aldolasy B pětkrát silnější v přítomnosti 8 mM glukosy, než indukce plazmidu bez promotoru aldolasy B.

9 9 9 • » · « « 9

99 · ·· ««··

Seznam sekvencí ’1) Všeobecné informace:

)i) podavatel

(A)	Jméno;	: INSERM
(B)	Ulice:	: 101, Rue
(C)	Město:	: Paříž
(D)	Země:	Francie
(E)	Směrovací číslo

(ii) název vynálezu:

(iii) počet sekvencí: 8 (iv) způsob luštění počítačem:

(A) Typ nosiče: tápe (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) systém využití: PC-DOS/MS-DOS (D) logika: Patentln Relase #1.0, Version #1.30 (OEB) ·♦·· *· ··· · ♦ · • · · · • 4 « * » (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 194 párů basí (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jednoduchý (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: DNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 1:

GATCCAGCAG	CATGGGCGCA	CGGGGCACTC	CCGTGGTTCC	TGGACTCTGG	50
CCCCCAGTGT	ACAAGGCTTC	CGTTGGCAAG	AGAGATGCTA	GCTGGTTATA	100
CTTTAACCAG	GACTCATCTC	ATCTGAGCCA	GGCCCCATCC	CACTGACAAA	150
GGCGCAGTAT	AAAGCAGACC	CACAGACACA GCAGGTAAGC AACG	194

(2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2:

(i) charakteristika sekvence:

• ···· · ·· ♦· ····

Η 9 99 9 · 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 • · * 9 9 9 9 ··♦ 9

9 9 9 9 9 9 9

9 99 99 9 99 9 9 9

(A) délka: 24 párů básí (B) typ: nukleová kyselina
(C)	počet vláken:	j ednoduchý
(D)	konfigurace:	lineární:

(ii) typ molekuly: DNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

GCGCACGGGG CACTCCCGTG GTTC 24 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 3:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 19 párů básí (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jednoduchý (D) konfigurace: lineární:

flfl·· • fl fl • 9 • fl • · fl flfl· flfl fl fl fl • · • fl fl * • fl flflflfl • fl fl flflfl • flfl ♦ • fl flfl fl (ii) typ molekuly: protein (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

CTGGACTCTG GCCCCCAGT 19 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 4:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 129 párů básí (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jednoduchý (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: DNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

GGCTTCCGTT GGCAAGAGAG ATGCTAGCTG GTTATACTTT AACCAGGACT 50

	26	• · ··· ·· · • < • © © • · · ♦ © · · *	• ·© *©·©·· ····©· · • · · » · « • · © © ··♦ ♦ • · · · · • · · ·· © ♦ ©
CATCTCATCT	GAGCCAGGCC CATCCCACTG	ACAAAGGCGC	AGTATAAAGC 100
AGACCCACAG	ACACAGCAGG TAAGCAACG		129

(2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 5:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 416 párů básí (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jednoduchý (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: DNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

TCCTTCTGCC	ATGGCCCTGT	GGATGCGCCT	CCTGCCCCTG	CTGGCGCTGC	50
TGGCCCTCTG	GGGACCTGAC	CCAGCCGCAG	CCTTTGTGAA	CCAACACCTG	100
TGCGGCTCAC	ACCTGGTGGA	AGCTCTCTAC	CTAGTGTGCG	GGGAACGAGG	150
CTTCTTCTAC	ACACCCAAGA	CCCGCCGGGA	GGCAGAGGAC	CTGCAGGTGG	200
GGCAGGTGGA	GCTGGGCGGG	GGCCCTGGTG	CAGGCAGCCT	GCAGCCCTTG	250
GCCCTGGAGG	GGTCCCTGCA	GAAGCGTGGC	ATTGTGGAAC	AATGCTGTAC	300
CAGCATCTGC	TCCCTCTACC	AGCTGGAGAA	CTACTGCAAC	TAGACGCAGC	350
CCGCAGGCAG	CCCCCCACCC	GCCGCCTCCT	GCACCGAGAG	AGARGGAATA	400
AAGCCCTTGA	ACCAGC				416

·*·* · 44 44 4444 * 44 4 4 4 4 4 • 4 4*4*44

44 4 4 4 ♦ 444 4

444 4 4 · 44

444 44 444 44 44 4 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 6:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 464 párů básí (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jednoduchý (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: DNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

AGGCCTCCAC	ACTCTAATTGC	ACTCTGCAGA	AGTAACACTA	GAGTGACCTT	50
TCTTTAGATT	TAGAAAGACT	AACACATAAT	ATATTGCTGT	AATTTCTTTT	100
GTAGTTTTTT	AAGTAGGACA	ATAAATATTT	ATTACAGATT	TCTCTGGAAG	150
TTTTTCATTT	GATAATTAAT	GAAAATTTTC	CATCATACTT	GTAAAAATGA	200
AGTGACTTGG	GACCTTAGAA	ATCAGAAGTT	TAAAGGAGTA	AAGTTCATTA	250
TTGTTAAGTA	TTCCAGGCTG	TGTTCTGTCT	CCCGTGACA	AACATTGACC	300
TGTGACTCTG	TTTTATGATT	AACTGAGGGG	CAAAATTTGT	GCTGATGTGG	350
TACAGACCTT	TAGTCCCTTT	GTAGAAGTTT	AACTTCCTGT	AAACAGGACG	400
AGTTTGACTT	GACTTTTCCC	TGTAATTCTT	GTTGAGTTGG	CATACCCAGA	450

···· ·♦ ···· * · ·

9 9

999 9

9

9 9

ATGGAGCAAA TGGC 464 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 7:

(i) charakteristika sekvence:

•

9

99

(A)	délka: 21 párů básí
(B)	typ: nukleová	kyselina
(C)	počet vláken:	j ednoduchý
(D)	konfigurace:	lineární:

(ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

ACTCAAATGC CCAATGAAGT C 21 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 8:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 21 párů básí (B) typ: nukleová kyselina ·· ··· · j ednoduchý lineární:

(C) počet vláken (D) konfigurace:

(ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

TCAACGGTGG TATATCCAGA T obsahující alespoň expresního signálu jejich analogů.

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY

1. Defetivní rekombinantní virus jeden heterologický gen pod kontrolou indukovatelného glukosou nebo některým z
2. Defetivní rekombinantní virus obsahující alespoň jeden heterologický gen pod kontrolou expresního signálu odvozený od celku nebo části promotoru genu kódujícího pyruvátkinasu typu L (L-PK).
3. Virus podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že expresní signál je odvozen úplně nebo částečně od fragmentu tvořeného 183pb umístěného na 5konci kódujícího genu kódující L-PK.
4. Virus podle nároku 1, 2 nebo 3, vyznačený t í m, že expresní signál obsahuje celou nebo část sekvence SEQ ID N°1.
5. Virus podle jednoho z předchozích nároků, vyznačený t í m, že expresní signál obsahuje alespoň element L4 promotoru genu kódujícího L-PK.
6. Virus podle nároku 5, vyznačený tím, že se jedná o element L4 representovaný zcela nebo částečně sekvencí SEQ ID N°2, sekvencí hybridizující s celým nebo částí této sekvence nebo sekvence, která je odvozená, schopná interakce s faktorem MLTF/USF.
7. Virus podle nároků 5 nebo 6 vyznačený tím, že element L4 se opakuje ve formě 4 oligomerů po sobě jdoucích v expresním signálu.
8. Virus podle jednoho z nároků 5 až 7, vyznačený t i m, že obsahuje mimoto element L3 promotoru genu kódujícího L-PK.
9. Virus podle nároku 8 vyznačený tím, že element L3 je representován úplně něho částečně sekvencí SEQ ID N°3, sekvencí hybridující s celkem nebo s částí této sekvence nebo sekvence, která je od ní odvozena, schopnou vstoupit v interakci s faktorem HNF 4.
10. Virus podle jednoho z předchozích nároků, v y~ značený tím, že expresní signál obsahuje element L4 promotoru genu kódujícího L-PK, spojený před elementem L4 stejného promotoru L4-L3.
11. Virus podle nárok 10, vyznačený tím, že expresní signál obsahuje 4 oligomery následující L4-L3.
12. Virus podle jednoho z předchozích nároků, v yznačený tím, že expresní signál obsahuje mimoto minimální promotor.
13.Virus podle nároku, vyznačený tím, že se s výhodou jedná o sekvenci odpovídající fragmentu -119 až 11 umístěného na 5'konci genu kódujícího L-PK.

4 44 4

44 4 4 4 *444 44 4

4 4 4 4 · 4 • 4444 *44 «

4 4 4 4 4

444 44 44 4
14. Virus podle jednoho z předchozích značený tím, že signál exprese je

ID N°4 nebo jedním z jejich derivátů.

nároků, v yrepresentován SEQ
15. Virus podle jednoho z předchozích nároků, v yznačený tím, že signál exprese obsahuje mimoto transkripční promotor.
16. Virus podle nároku 15, vyznačený tím, že transkripční promotor pochází z prvního intronu genu aldolasy B myši.
17. Virus podle nároků 1 až 16, vyznačený tím, že je zbaven oblastí svého genomu, které jsou nutné pro replikaci v cílové buňce.
18. Virus podle nároků 1 až 17, vyznačený tím, že se jedná o adenovirus.
19. Virus podle nároku 17, vyznačený tím, že se jedná o lidský adenovirus typu Ad 2 nebo Ad 5 nebo psí adenovirus typu CAV-2.
20. Virus podle nároků 1 až 17, vyznačený tím, že se jedná o retrovirus.
21. Virus podle nároku 20, vyznačený tím, že se jedná o retrovirus rodu MoMuLV.

• 4 · • · 4 • ·· · ·· ··« 4 4
22. Virus podle jednoho z předchozích nároků, v yznačený tím, že heterologický gen kóduje inzulín nebo jeho varianty.
23. Použití viru podle nároků 1 až 22 pro přípravu farmaceitické kompozice určené k léčení nebo/a prevenci nemocí související s hyperglykemií.
24. Farmaceutická kompozice obsahující jeden nebo více defektivních rekombinantních virů podle nároků 1 až 21.
25. Farmaceutická kompozice podle nároku 24, vyznačená tím, žejev injektovatelné formě.
26. Farmaceutická kompozice podle nároku 24 nebo 25, vyznačená tím, že obsahuje mezi 10⁴ a 10¹⁴ pfu/ml a s výhodou 10^s až 1O¹⁰ pfu/ml defektivního rekombínantního adenoviru.
27. Savčí buňka infektovaná jedním nebo více detektivními rekombinantními viry podle nároků 1 až 21.
28. Buňka podle nároku 27, vyznačená tím, že se jedná o lidskou buňku.
29. Buňka podle nároku 28, vyznačená tím, že se jedná o hepatocyt nebo o β pankreatickou buňku.