WO1996032489A1 - Vecteur viral recombinant inductible par le glucose - Google Patents

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WO1996032489A1
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expression signal
virus
promoter
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Ruihuan Chen
Bruno Doiron
Axel Kahn
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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Definitions

  • the present invention relates to recombinant vectors of viral origin, the preparation of these vectors, the pharmaceutical compositions containing them and their therapeutic use, in particular in gene therapy and more particularly for the treatment and / or prevention of pathologies linked to hyperglycemia.
  • Gene therapy consists of correcting a deficiency or an anomaly (mutation, aberrant expression, etc.) by introducing genetic information into the affected cell or organ.
  • this genetic information can be introduced either in vitro into a cell extracted from the organ, the modified cell then being reintroduced into the organism, or directly in vivo into the appropriate tissue.
  • Different techniques have been described for the introduction of this genetic information, among which various transfection techniques involving complexes of DNA and DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol.
  • viruses as vectors for gene transfer has emerged as a promising alternative to these physical transfection techniques.
  • different viruses have been tested for their ability to infect certain cell populations.
  • retroviruses RSV, HMS, MMS, etc.
  • the HSV virus adeno-associated viruses
  • adenoviruses adenoviruses
  • the present invention relates more particularly to the development of new viral vectors of particular interest for the treatment of pathologies linked to hyperglycaemia such as diabetes.
  • Diabetes mellitus is a usually chronic syndrome, the most characteristic symptom of which is hyperglycemia causing, in the absence of elevation of the renal threshold for glucose, glycosuria. Its main cause is a deficiency, absolute or relative, insulin causing abnormalities not only of the metabolism of carbohydrates but also of those of proteins and fats.
  • Diabetes is generally treated by administration of insulin, a treatment which is very restrictive for the patient.
  • the object of the present invention is precisely to propose an original viral vector making it possible to compensate for this disorganization of glucose metabolism in an organism by restoring in a controlled manner a suitable concentration of insulin in vivo.
  • glucose is a factor in regulating the transcription of genes in the majority of living beings. It has in particular been demonstrated that glucose is capable of stimulating the transcription of genes coding for glycolytic and lipogenic enzymes in hepatocytes and adipocytes such as for example the gene of pyruvate kinase type L, a tissue specific glycolytic enzyme which plays a role. determinant in the regulation of glycolysis and gluconeogenesis in the liver. The expression of the L-PK protein in the liver is under food and hormonal control. It is induced by a diet rich in glucose and on the contrary inhibited by deprivation and in diabetics.
  • L-PK A. Kahn et al .; J. Mol. Biol. 209, (1989), 205-219).
  • the element Ll a binding site for the nuclear factor 1 of hepatocytes (HNF1), the element L2, a binding site for nuclear factor 1 (NF1), the element L3, a binding site for nuclear factor 4 for hepatocytes (HNF 4) and the element L4, a site link for major late transcrpional factor (MLFT) / USF (see Figure 1).
  • HNF1 nuclear factor 1 of hepatocytes
  • NF1 nuclear factor 1
  • HNF4 nuclear factor 4 for hepatocytes
  • MLFT major late transcrpional factor
  • the specific element of glucose / insulin response has been precisely located in the gene coding for L-PK, in the form of a perfect palindrome between nucleotides -168 to -144 from the cap site, ie in the element L4 (see figure 2).
  • This IWRM has been shown to be able to confer a transcriptional response to glucose to a minimal promoter of L-PK consisting of the TATA box and of the element L1.
  • the present invention relates to a defective recombinant virus comprising at least one heterologous gene under the control of an expression signal inducible by glucose or one of its analogs.
  • glucose analog is meant to cover any compound having structural homologies with glucose and being capable of inducing activation of the expression signal.
  • analogs capable of being used according to the present invention mention may in particular be made of fructose, galactose, sucrose, lactose and all the sugars which can be hydrolyzed into these substances.
  • a glucose-inducible expression signal covers any expression signal sequence whose activation, which conditions the subsequent transcription of the associated heterologous gene, is essentially induced in the presence of glucose or one of its analogs.
  • the expression signal is placed under the control of an expression signal derived in whole or in part from the promoter of the gene coding for the pyruvate kinase of type L, L-PK. More specifically, this expression signal derives in whole or in part from the fragment consisting of 183 bp located 5 ′ from the coding phase of the gene coding for L-PK.
  • the expression signal according to the invention comprises all or part of the sequence SEQ ID No. 1.
  • this expression signal comprises at least all or part of the L4 element of this promoter.
  • the element L4 is preferably represented by all or part of the sequence
  • SEQ ID No. 2 of a sequence hybridizing with all or part thereof or of a sequence derived therefrom, and capable of interacting with the factor MLTF USF.
  • the term “derivative” means any sequence obtained by one or more modifications and retaining at least one of the biological properties of the original sequence and in particular its ability to interact with its factor (s) ) specific binding (s), in this case constituted by the factor MLTF USF.
  • Modification means any mutation, substitution, deletion, addition or modification of a genetic and / or chemical nature. These modifications can be carried out by techniques known to those skilled in the art.
  • the element L4 is repeated in the form of 4 successive oligomers in the expression signal.
  • the expression signal comprises, in addition to the L4 element, all or part of the L3 element of the promoter of the gene coding for L-PK.
  • the element L3 is preferably represented in whole or in part by the sequence SEQ ID NO: 1
  • the expression signal comprises the element L4 of the promoter of the gene coding for L-PK, fused upstream of the element L3 of this same promoter. It is then designated by L4-L3. More preferably, the expression signal according to the invention comprises 4 successive L4-L3 oligomers.
  • This expression signal also comprises a so-called minimal promoter.
  • minimal promoter designates any promoter sequence which alone is not capable of efficiently ensuring the transcription of the heterologous sequence which is associated with it.
  • the activity of such a promoter turns out to be totally dependent on the activation of the element responding to glucose.
  • this minimal promoter mainly has the function of directing transcription. In this perspective, it is preferably located upstream of the heterologous sequence so as to form with it a continuous nucleotide sequence.
  • a minimal promoter deriving from a conventional promoter such as for example those activating the transcription of gene of thymidine kinase, acetyl transferase chloramphenicol, ⁇ galactosidase or luciferase type or in particular deriving from the promoter of the gene coding for pyruvate kinase type L.
  • This minimal promoter can also be derived from human CMV. If necessary, such a promoter can be minimized by means of one or more genetic mutations which render it incapable of ensuring the transcription of the heterologous gene alone.
  • the minimal promoter can derive from the promoter naturally responsible for the expression of the heterologous gene considered.
  • a minimal promoter capable of being used according to the invention one can more particularly cite the sequence corresponding to the fragment - 119 to 11 located 5 ′ of the gene coding for L-PK.
  • this minimal promoter is placed upstream of the nucleic sequence whose expression it controls, in substitution or not for its natural promoter.
  • the promoter of the nucleic acid sequence can in fact remain present but in an inactivated form or made non-functional by various techniques known to those skilled in the art and in particular by deletion, deletion and / or addition of one or more bases.
  • the expression signal responds in whole or in part to SEQ ID No. 4 or one of its derivatives.
  • the promoter region can be modified by adding activation or regulation sequences (enhancer sequences in particular), making it possible to increase the strength of the promoter without affecting its inducible nature.
  • activation or regulation sequences in particular
  • SEQ ID No. 6 corresponding to nucleotides 1915 to 2379.
  • heterologous nucleic acid sequence placed under the control of the expression signal comprises one or more therapeutic genes whose transfer and / or expression in a cell, an organ or an organism is research.
  • the therapeutic genes which can thus be transferred are any gene whose transcription and possibly translation into the target cell generate products having a therapeutic effect.
  • the protein product thus coded can be a protein, a peptide, an amino acid, etc.
  • This protein product can be homologous with respect to target cell (i.e. a product which is normally expressed in the target cell when the latter presents no pathology).
  • target cell i.e. a product which is normally expressed in the target cell when the latter presents no pathology.
  • the expression of a protein makes it possible for example to compensate for an insufficient expression in the cell or the expression of an inactive or weakly active protein due to a modification, or else to overexpress said protein.
  • the therapeutic gene can also code for a mutant of a cellular protein, having increased stability, modified activity, etc.
  • the protein product can also be heterologous towards the target cell.
  • an expressed protein can for example supplement or provide a deficient activity in the cell allowing it to fight against a pathology.
  • trophic factors BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; apolipoproteins: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc. (FR 93 05125), dystrophin or a minidystrophin (FR 91 11947), etc.
  • the heterologous sequence comprises at least one gene coding for insulin or a variant of insulin.
  • variant notably covers the various forms of maturation of insulin such as, for example, proinsulin, (Vollenweider et al., J. Biol. Chem. 267, (1992) 14629-14636 and Groskreutz et al. , J. Biol. Chem. 269, (1994), 6241-6245).
  • the gene coding for insulin and present in a vector according to the invention comprises all or part of the sequence SEQ ID No. 5.
  • the vectors of the invention can be prepared from different types of virus.
  • vectors derived from adenoviruses or retroviruses are used.
  • the viruses according to the invention are defective, that is to say that they are unable to replicate autonomously in the target cell.
  • the genome of the defective viruses used in the context of the present invention is therefore devoid of at least the sequences n-necessary for the replication of said virus in the infected cell. These regions can be either eliminated (in whole or in part), or made non-functional, or substituted by other sequences and in particular by the DNA sequence coding for the gene of interest such as that of insulin .
  • the defective virus nevertheless retains the sequences of its genome which are necessary for the packaging of the viral particles.
  • adenoviruses As regards more particularly adenoviruses, different serotypes, whose structure and properties vary somewhat, have been characterized. Among these serotypes, it is preferred to use, within the framework of the present invention, human adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or adenoviruses of animal origin (see application FR 93 05954).
  • adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention, mention may be made of adenoviruses of canine, bovine, murine origin (example: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine , avian or even simian (example: after-sales service).
  • the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR-800) for example].
  • adenoviruses of human or canine or mixed origin are used.
  • the defective adenoviruses of the invention comprise ITRs, a sequence allowing the packaging and the sequence coding for the protein of therapeutic interest.
  • the El gene and at least one of the E2, E4, L1-L5 genes are non-functional.
  • the viral gene considered can be made non-functional by any technique known to those skilled in the art, and in particular by total suppression, substitution, partial deletion, or addition of one or more bases in the gene or genes considered. Such modifications can be obtained in vitro (on isolated DNA) or in situ, for example, using genetic engineering techniques, or by treatment with mutagenic agents.
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917).
  • retroviruses are integrative viruses, selectively infecting dividing cells.
  • the genome of retroviruses essentially comprises two LTRs, an encapsidation sequence and three coding regions (gag, pol and env).
  • the gag, pol and env genes are generally deleted, in whole or in part, and replaced by a heterologous nucleic acid sequence of interest.
  • These vectors can be produced from different types of retroviruses such as in particular MoMuLV ("murine moloney leukemia virus”; also designated MoMLV), MSV ("murine moloney sarcoma virus"), HaSV ("harvey sarcoma virus”) ; SNV (“spleen necrosis virus”); RSV ("rous sarcoma virus”) or the Friend virus.
  • the packaging sequence and said sequence of interest is generally constructed, then used to transfect a cell line called packaging, capable of providing in trans retroviral functions deficient in the plasmid.
  • packaging lines are therefore capable of expressing the gag, pol and env genes.
  • packaging lines have been described in the prior art, and in particular the line PA317 (US4,861,719); the PsiCRIP line (WO90 / 02806) and the GP + envAm-12 line (WO89 / 07150).
  • the ⁇ -2 cell line which comes from the NIH-3T3 line (mouse fibroblastic line) by transfection with pMOV- ⁇ " , a plasmid containing the genome of the Moloney murine leukemia virus (MoMuLV) whose packaging sequence" ⁇ "is deleted (Mann et al., Cell, (1983), 33, 153-
  • the recombinant retroviruses may include modifications at the level of the LTRs to suppress transcriptional activity, as well as extended packaging sequences comprising a part of the gag gene (Bender et al., J. Viral. (1987) 61, 1639) The recombinant retroviruses produced are then purified by conventional techniques.
  • the retroviruses can be prepared by transfection of a retroviral plasmid containing the expression signal according to the invention coupled to the gene coding for the protein of interest in a transcomplementing cell line which will make it possible to produce viral particles whose genome codes for the transgene.
  • the retrovirus being very particularly advantageous for expressing insulin.
  • the expression of the gene coding for insulin under the control of an expression signal controlled by glucose and by transfecting cells in vivo using this type of vector these cells are induced to produce insulin under the effect of their physiological glucose content. These cells become capable of expressing the insulin transgene in the presence of a physiological and sufficient concentration of glucose.
  • the transfected cells have an internal glucose detection system, also designated by glucose sensor machinery, capable of inducing the activation of the expression signal.
  • glucose detection system also designated by glucose sensor machinery
  • Certain cell types, such as hepatocytes and ⁇ cells of the pancreas are naturally provided with it. It is a system notably composed of specific enzymes such as the Glut-2-glucose transporter and glucokinase. As for cells deprived of this type of sensory machinery, it is entirely possible to supply them artificially.
  • the cells to be treated are, either prior to or simultaneously with the injection of virus according to the invention, transfected using genetic constructs controlling the synthesis of the Glut-2 transporter of the enzyme glucokinase.
  • Infection of cells such as hepatocytes with recombinant viruses according to the invention can be carried out ex vivo and / or in vivo making the cells thus transfected capable of secreting insulin.
  • the preferred infection sites in the context of the present invention are the natural sites of insulin secretion, such as the portal vein.
  • the present invention also relates to mammalian cells, preferably human and more preferably to hepatocytes and / or pancreatic ⁇ cells infected with one or more viruses claimed.
  • the vectors according to the invention advantageously allow the immediate blocking of this secretion under the effect of glucagon due to the classic AMP. This eliminates the risk of hypoglycemia induced by excessive insulin secretion.
  • the claimed vectors are particularly advantageous for controlling in vivo via a phenomenon of glucose induction, the production of insulin in a precise region of the organism, preferably in a site where it is normally secreted like the circulating portal .
  • Cells infected with one or more of the claimed viruses could thus be implanted in the liver, spleen, pancreas or intestine.
  • the present invention thus describes a new approach for the treatment in particular of insulin-dependent diabetic disorders consisting in inducing in vivo synthesis of insulin in response to a physiological glucose content.
  • the concentration of glucose or of an analog having the same influence on the glucose response sequence would be there adjusted so as to induce the expression of the protein of interest via the activity of the expression signal according to the invention. It is clear that this concentration is determined according to the quantity of vectors injected, the nature of the site of infection and the desired expression of protein.
  • the present invention also relates to any use of a virus as described above for the preparation of a pharmaceutical composition in particular intended for the treatment and / or prevention of diseases linked to hyperglycemia.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising one or more defective recombinant viruses as described above.
  • These pharmaceutical compositions can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
  • the pharmaceutical compositions of the invention contain a pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation. They may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • the doses of defective recombinant virus used for injection can be adapted as a function of various parameters, and in particular as a function of the viral vector, of the mode of administration used, of the pathology concerned or also of the duration of the treatment sought.
  • the recombinant viruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 ⁇ and 10 ⁇ 4 pfu / ml, and preferably 10 ⁇ to 10 * 0 pfu / ml.
  • the term pfu (“plaque forming unit”) corresponds to the infectious power of a virus solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measurement, generally after 48 hours, the number of ranges of infected cells. The techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.
  • the compositions according to the invention can directly comprise the producer cells, with a view to their implantation.
  • Figure 1 Schematic representation of the order of succession of elements L1 to L4 identified in the promoter of the L-PK gene and their respective binding proteins.
  • Figure 2 Representation of the palindrome of element L4.
  • Figure 3 Partial representation of the retroviral plasmid pHSG (L4L3) 4PKCAT and clones F6 and B8.
  • Figure 4 Quantitative determination of CAT activity in mhATTIIF cells transformed with the clone B8, as a function of the amount of glucose injected.
  • Figure 5 Quantitative determination of CAT activity in mhATIIIF cells transformed with clone B8 at different induction times.
  • Figure 6 Construction of pHSG / PK-CAT and pHSG / AL-PK-CAT plamids.
  • Figure 7 Induction by glucose at different doses of the expression of the plasmids pHSG / PK-CAT and pHSG / AL-PK-CAT.
  • the plasmids of the pBR322, pUC type and the phages of the Ml 3 series are of commercial origin (Bethesda Research Laboratories).
  • the DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in agarose or acrylamide gels, extracted with phenol or with a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol and then incubated in the presence of the DNA ligase from phage T4 (Biolabs) according to the supplier's recommendations.
  • the destruction of the protruding 3 ′ ends is carried out in the presence of the DNA polymerase of phage T4 (Biolabs) used according to the manufacturer's recommendations.
  • the destruction of the protruding 5 ′ ends is carried out by gentle treatment with nuclease SI.
  • Mutagenesis directed in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides can be carried out according to the method developed by Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13. (1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham.
  • Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2 ⁇ (1977) 5463-5467] using the kit distributed by Amersham.
  • All plasmids are constructed using standard DNA cloning techniques. The junctions are verified by DNA sequencing.
  • the construction of the plasmid pHSG (L4L3) 4-PKCAT, (represented in FIG. 3), contains the constructive part MMLV of pHSGNeo and the coding sequence for the CAT gene under the control of the promoter of the rat type L pyruvate kinase gene (bp - 119 to + 11) upstream of which L4L3 fragments oligomerized 4 times (ie the IWRM and the contiguous HNF4 binding site) are ligated.
  • the L4L3 fragment corresponding to the fragment delimited between bp -172 to- 123, upstream of the site of initiation of L-PK transcription was obtained by PCR.
  • the polyA signal sequence used is that present in the LTR of the 3 'end of MMLV.
  • the plasmid pHSGNeo (Guild et al. J. Virol. 1988, 62, 3795-3801), a retroviral plasmid derived from MMLV, the psi-CRIP line, a complementary amphotropic cell line which provides trans structural proteins of MMLV, have were provided by Dr. A. Weber (Cochin Institute of Molecular Genetics, Paris); the plasmid pRSVNeo, in which the aminoglycoside phosphotransferase gene is under the control of the RSV LTR promoter, is used for cotransfection.
  • the cell line mhATIIIF is derived from a liver tumor in a transgenic mouse expressing the early SV40 genes under the control of the liver-specific antithrombin III promoter, (ATIII-SV40) (Kahn A. et al. Exp; Cell. Res;
  • MIX (1: 1 vol / vol) with glutamax-1 or DMEM / HamF12 (1: 1 vol / vol) (Gibco- BRL) with or without D + glucose (Sigma), supplemented with 1 ⁇ M dexamethasone, 1 ⁇ M triodothyronine, 20 nM human insulin, 5% (vol / vol) of FCS.
  • the NIH3T3 and psi-CRIP cells are cultured in: DMEM (5.5 mM of glucose, l.OmM sodium pyruvate) supplemented with 10% (vol / vol) of newborn calf serum. Ampicillin, streptomycin and glutamine are added to all the media and the cultures are incubated at 37 ° C.
  • the psi-CRIP cells are cotransfected with the plasmids pHSG (L3L4) 4- PKCAT and pRSV Neo (the molar ratio of the two plamisdes being 10: 1) by the cationic liposome method (DOTAP, Boeringer Mannheim) and selected in the presence of G418 (800 ⁇ g ml).
  • the clones resistant to G418 are separated for the test of production of the retroviruses.
  • the cell clones resistant to G418 are seeded in 90 mm wells and cultured up to 100% confluence.
  • the cell culture supernatant is filtered through a membrane having pores of 0.22 ⁇ m, incubated with DNase I (10 ⁇ g / ml) at 37 ° C for 30 min and then centrifuged at 65,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C .
  • the retroviral RNA is extracted and purified from precipitation pellets by proteinase K and a phenol / chloroform mixture then co-precipitated with t RNA.
  • the sample is dissolved in diethyl pyrocarbonate treated with water and containing 1 mM of dithiothreitol (DTT), 40 U of RNAsin / 100 ⁇ m, then subjected to reverse transcriptase and to PCR in a single step.
  • DTT dithiothreitol
  • - 5 'TCAACGGTGGTATATCCAGAT 3' (SEQ ID No. 8), corresponding to the coding region of the CAT gene (bp 35 to 15 considering the site of initiation of translation).
  • Reverse transcription from the antisense PCR probe is catalyzed by 8U AMV reverse transcriptase (Promega) for 1 hour at 42 ° C and the following PCR with Taq25U DNA polymerase is carried out in 35 to 40 cycles.
  • the expected amplified fragment is 440 bp long and contains part of the gag gene, 4 repeat motifs L3L4, the -119 L-PK promoter and the first 69 bp of the CAT gene. If necessary, the RT-PCR fragments are cloned and sequenced.
  • the retroviral vectors pHSG (L4L3) 4-119PKCAT and pRSVNeo are used to co-transfect psi-CRIP cell lines. 70 clones resistant to G418 are analyzed. 8 positive RT-PCR clones demonstrate an ability to produce infectious recombinant retroviruses, determined by PCR specific for the expected fragment of the genomic DNA of NIH3T3 cells. The production of retrovirus has been demonstrated to be significant in two clones.
  • the clone F6 (5.10 ⁇ ) infectious retrovirus, produces a retrovirus with the complete region of the signal sequence (4 repetitions of the whole L4L3 fragments (see FIG. 3)) and
  • the retrovirus titers were estimated by semiquantitative PCR-RT using different deletions in pHSG (L4L3) 4199PKCAT as standards.
  • Positive clones are used to infect NIH3T3 cells in order to estimate the infectious capacities of the retroviruses produced.
  • 1 ml of cell culture supernatant at 100% confluence is used to infect NIH3T3 cells growing logarithmically with 8 ⁇ g / ml of polybrene. After 3 hours of incubation, the polybrene is diluted to 2 ⁇ g ml with medium and the culture is continued for 48 hours.
  • the genomic DNA of the infected NIH3T3 cells is extracted and used for PCR amplification using the probes described in example 3. The detection of the specific amplified fragment proves the integration of the retroviral sequences in the genome of the infected cells.
  • the titer is estimated by comparing the intensities of the amplified DNA bands from the genomic DNA of the infected cells with those from different dilutions of the retrovirus (10 ⁇ to 10 ⁇ molecules).
  • the clones which produce infectious retroviruses are co-cultivated with mhATIIIF cells according to the following protocol:
  • the small well is removed.
  • the medium is changed for a further 16 hour incubation, the polybrene is then added (8 ⁇ g) and the cells are cultured for 48 hours.
  • the mhATIIIF cell line assimilable to hepatocytes in rats retains its ability to respond to glucose by transcriptional activation of the L-PK gene and is therefore suitable for testing the response of the CAT transgene, transferred by the retroviral vector and consequently the activity of the L-PK IWRM in a retroviral environment.
  • the mhATIIIF cells are cultured twice with cells producing the retroviruses, which leads to a satisfactory infection rate with the clone B8.
  • the expression of the L-PK / CAT transgene in infected mhATIIIF cells is well induced by glucose with half of the maximum induction obtained for 3-4 mM of glucose and the induction maximum for 8mM glucose.
  • the CAT activity remains relatively stable.
  • MhATIIIF the cells are cultured in a medium containing 17 mM glucose, induction of the gene is observed from the 8 ⁇ I hour of incubation, induction to half before the 24th hour and maximal induction at the 48 ⁇ me time.
  • Plasmids are constructed using standard DNA cloning techniques. The junctions are verified by DNA sequencing.
  • the construction of the plasmid pHSG / PK-CAT contains the MMLV part of pHSG located between the nucleotides from 1 to 2015 and from 3888 to 4445; for the plasmid pHSG / AL-PK-CAT, the MMLV sequences are located between the nucleotides from 1 to 2015 and from 4290 to 4847 (FIG. 6).
  • sequence coding for the CAT gene under the control of the promoter of the rat type L pryruvate kinase gene (-183 to + 11 bp) is located between nucleotides 2048 and 3033 for the plasmid pHSG / PK-CAT and between 2450 and 3435 for the plasmid pHSG / AL-PK-CAT.
  • sequence of the enhancer fragment of the aldolase B gene (SEQ ID No. 6), is located between nucleotides 2035 and 2437 in the plasmid pHSG / AL-PK-CAT.
  • the poly A signal sequence used is that of SV40 located between nucleotides 3033 and 3873 in pHSG / PK-CAT and between 3435 and 4275 in pHSG / AL-PK-CAT.
  • Nucleotides from 2015 to 2048; 2242 to 2452 and 3873 to 3888 are adapters between the different fragments for the plasmid pHSG / PK-CAT; they are located for the plasmid pHSG / AL-PK-CAT from 2015 to 2035; 2437 to 2450; 26-44 to 2654 and 4275 to 4290.
  • EXAMPLE 8 Induction by Glucose at Different Doses of the Expression of the Plasmids pHSG / PK-CAT and pHSG / AL-PK-CAT
  • the cell line mhAT3F originates from a liver tumor in a transgenic mouse expressing the pre-exposed SV40 genes under the control of the liver-specific antithrombin III promoter (Kahn A. et al. Exp; Cell.Res; 200, 175-185) . These cells were cultured at 37 ° C. with 5% (vol / vol) CO2 in a DMEM F12 / NUT.MIX nutrient medium. (1: 1 vol / vol) with glutamax-1 (Gibco-BRL) with or without D-glucose (Sigma), supplemented with 1 ⁇ M dexamethasone, 1 ⁇ M triodothyronine and 20 nM human insulin.
  • the expression of the plasmid pHSG / PK-L in the presence of the enhancer of aldolase B is 5 times stronger in the presence 8 mM glucose than that of the plasmid lacking the aldolase B enhancer (FIG. 7).
  • This hybrid aldolase B / PK-L promoter is therefore particularly advantageous for conferring on a gene a high level of expression while remaining sensitive to glucose, in particular within the framework of the development of a gene therapy method for diabetes intended to produce, depending blood sugar, a suitable in vivo insulin concentration.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un virus recombinant défectif comprenant au moins un gène hétérologue sous contrôle d'un signal d'expression inductible par le glucose. Elle concerne également toute composition pharmaceutique le contenant et des cellules transformées avec ledit vecteur.

Description

Vecteur viral recombi nant Inductible par le glucose
La présente invention concerne des vecteurs recombinants d'origine virale, la préparation de ces vecteurs, les compositions pharmaceutiques les contenant et leur utilisation thérapeutique, notamment en thérapie génique et plus particulièrement pour le traitement et/ou la prévention de pathologies liées à une hyperglycémie.
La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Classiquement, cette information génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Différentes techniques ont été décrites pour l'introduction de cette information génétique, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc.
Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS. etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
La présente invention se rapporte plus particulièrement à la mise au point de nouveaux vecteurs viraux présentant notamment un intérêt particulier pour le traitement des pathologies liées aux hyperglycémies comme le diabète.
Le diabète sucré est un syndrome habituellement chronique, dont le symptôme le plus caractéristique est une hyperglycémie provoquant, en l'absence d'élévation du seuil rénal pour le glucose, une glycosurie. Sa cause principale est une carence, absolue ou relative, en insuline entraînant des anomalies non seulement du métabolisme des hydrates de carbone mais aussi de ceux des protéines et des graisses.
Le diabète est généralement traité par administration d'insuline, traitement qui s'avère très contraignant pour le patient.
La présente invention a précisément pour objet de proposer un vecteur viral original permettant de suppléer à cette désorganisation du métabolisme du glucose dans un organisme via la restauration de manière contrôlée d'une concentration convenable in vivo en insuline.
On sait que le glucose est un facteur de régulation de la transcription de gènes dans la majorité des être vivants. Il a notamment été démontré que le glucose est capable de stimuler la transcription de gènes codant pour des enzymes glycolytiques et lipogéniques dans les hépatocytes et adipocytes comme par exemple le gène de la pyruvate kinase de type L, une enzyme glycolytique tissus spécifique qui joue un rôle déterminant dans la régulation de la glycolyse et la gluconéogénèse dans le foie. L'expression de la protéine L-PK, au niveau du foie, est sous contrôle alimentaire et hormonal. Elle est induite par un régime riche en glucose et au contraire inhibée par privation et chez les diabétiques. Il a ainsi été démontré que l'expression de son gène est régulée positivement par le couple glucose/insuline et négativement par le glucagon via son second messager L'AMP cyclique (A. Kahn; J. Bio. Chem. 264, (1989), 11584-11590).
Récemment, la demanderesse a caractérisé différents sites de liaisons (éléments Ll à L4) pour des facteurs de transcription et en particulier un élément de réponse au glucose/insuline, ou encore "GIRE", dans la région amont du promoteur du gène de cette enzyme L-PK (A. Kahn et al.; J. Mol. Biol. 209, (1989), 205-219). Il a ainsi été identifié dans le sens 3' à 5' à partir de la boîte TATA, respectivement l'élément Ll, un site de liaison pour le facteur nucléaire 1 des hépatocytes (HNF1), l'élément L2, un site de liaison pour le facteur nucléaire 1 (NF1), l'élément L3, un site de liaison pour le facteur nucléaire 4 des hépatocytes (HNF 4) et l'élément L4, un site de liaison pour le facteur transcrpitionnel major late (MLFT)/USF (voir figure 1). L'élément spécifique de réponse au glucose/insuline, a précisément été localisé dans le gène codant pour la L-PK, sous la forme d'un palindrome parfait entre les nucléotides -168 à -144 à partir du site cap, soit dans l'élément L4 (voir figure 2). Ce GIRE s'est avéré capable de conférer une réponse transcriptionnel au glucose à un promoteur minimal de L-PK constitué de la boîte TATA et de l'élément Ll.
De manière inattendue, la demanderesse a mis en évidence qu'il était possible de valoriser l'aptitude de cet élément GIRE, à répondre au glucose, dans un contexte viral pour moduler l'expression d'un protéine d'intérêt en thérapie génique.
Plus précisément, la présente invention se rapporte à un virus recombinant défectif comprenant au moins un gène hétérologue sous contrôle d'un signal d'expression inductible par le glucose ou un de ses analogues.
Par analogue du glucose, on entend couvrir tout composé présentant des homologies structurales avec le glucose et étant capable d'induire l'activation du signal d'expression. A titre d'analogues susceptibles d'être utilisés selon la présente invention on peut notamment citer le fructose, le galactose, le sucrose, le lactose et tous les sucres pouvant être hydrolyses en ces substances.
Au sens de la présente invention, un signal d'expression inductible au glucose couvre toute séquence signal d'expression dont l'activation, qui conditionne la transcription subséquente du gène hétérologue associé, est essentiellement induite en présence de glucose ou un de ses analogues.
Plus particulièrement il s'agit d'un virus défectif recombinant dans lequel l'expression d'au moins un gène hétérologue est placée sous contrôle d'un signal d'expression dérivant en tout ou partie du promoteur du gène codant pour la pyruvate kinase de type L, L-PK. Plus précisément, ce signal d'expression dérive en tout ou partie du fragment constitué des 183pb situé en 5' de la phase codante du gène codant pour L-PK. De préférence, le signal d'expression selon l'invention comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID N°l.
Selon un mode de réalisation préféré, ce signal d'expression comprend au moins tout ou partie de l'élément L4 de ce promoteur.
L'élément L4 est de préférence représenté par tout ou partie de la séquence
SEQ ID N°2, d'une séquence hybridant avec tout ou partie de celle-ci ou d'une séquence qui en dérive, et capable d'interagir avec le facteur MLTF USF.
Au sens de la présente invention, on entend par dérivé, toute séquence obtenue par une ou plusieurs modifications et conservant l'une au moins des propriétés biologiques de la séquence d'origine et notamment sa capacité d'interagir avec son ou ses facteur (s) de liaison spécifique (s), dans le cas présent constitué par le facteur MLTF USF. Par modification, on doit entendre toute mutation, substitution, délétion, addition ou modification de nature génétique et/ou chimique. Ces modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier.
Dans une variante de l'invention, l'élément L4 est répété sous la forme de 4 oligomères successifs dans le signal d'expression.
Selon un mode préféré de l'invention, le signal d'expression comprend outre l'élément L4, tout ou partie de l'élément L3 du promoteur du gène codant pour la L- PK.
Il a en effet été monté que cet élément L3 contribue à une meilleure efficacité de l'élément L4. ( A. Kahn et al; Nucleic Acids Research 20, (1992), N°8 pl871).
L'élément L3 est de préférence représenté en tout ou partie par la séquence SEQ ID
N°3, une séquence hybridant avec tout ou partie de celle-ci ou d'une séquence qui en dérive, capable d'interagir avec le facteur HNF 4. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le signal d'expression comprend l'élément L4 du promoteur du gène codant pour la L-PK, fusionné en amont de l'élément L3 de ce même promoteur. Il est alors désigné par L4-L3. Plus préférentiellement, le signal d'expression selon l'invention comprend 4 oligomères successifs L4-L3.
Ce signal d'expression comprend en outre un promoteur dit minimal.
Au sens de la présente invention, promoteur minimal désigne toute séquence promotrice qui seule n'est pas capable d'assurer efficacement la transcription de la séquence hétérologue qui lui est associée. L'activité d'un tel promoteur s'avère totalement dépendante de l'activation de l'élément répondant au glucose. En fait, ce promoteur minimal a surtout pour fonction d'orienter la transcription. Dans cette perspective, il est de préférence situé en amont de la séquence hétérologue de manière à former avec elle une séquence nucléotidique continue.
Il est possible d'employer selon l'invention un promoteur minimal dérivant d'un promoteur conventionnel comme par exemple ceux activant la transcription de gène de type thymidine kinase, acétyle transférase chloramphénicol, βgalactosidase ou luciférase ou notamment dérivant du promoteur du gène codant pour la pyruvate kinase de type L. Ce promoteur minimal peut également dériver du CMV humain. Le cas échéant, un tel promoteur peut être rendu minimal par le biais d'une ou plusieurs mutations génétiques qui le rendent incapable d'assurer seul la transcription du gène hétérologue.
Selon le même principe, le promoteur minimal peut dériver du promoteur naturellement responsable de l'expression du gène hétérologue considéré.
A titre de promoteur minimal susceptible d'être utilisé selon l'invention on peut plus particulièrement citer la séquence correspondant au fragment - 119 à 11 situé en 5' du gène codant pour la L-PK. De manière générale, ce promoteur minimal est placé en amont de la séquence nucléique dont il contrôle l'expression, en substitution ou non de son promoteur naturel. Le propre promoteur de la séquence nucléique peut en effet demeurer présent mais sous une forme inactivée ou rendue non fonctionnelle par différentes techniques connues de l'homme de l'art et notamment par suppression, délétion et/ou addition d'une ou plusieurs bases.
Plus préférentiellement, le signal d'expression répond en tout ou partie à la SEQ ID N°4 ou l'un de ses dérivés.
Par ailleurs, la région promotrice peut être modifiée par addition de séquences d'activation ou de régulation (séquences enhancer notamment), permettant d'augmenter la force du promoteur sans affecter son caractère inductible. En particulier, dans le but d'améliorer la force du promoteur, nous avons contruit un vecteur hybride dans lequel le promoteur de 183 pb du gène PK-L est précédé d'un fragment de 402 pb situé dans le premier intron du gène de l'aldolase B de rat, du nucléotide 1920 au nucléotide 2321 par rapport au site d'initiation de la transcription (SEQ ID N°6 correspondant aux nucléotides 1915 à 2379). Les résultats présentés dans les exemples montrent que cette construction augmente l'expression d'un gène d'un facteur 5, en réponse au glucose.
En ce qui concerne la séquence d'acides nucléiques hétérologue placée sous contrôle du signal d'expression selon l'invention, elle comporte un ou plusieurs gènes thérapeutiques dont le transfert et/ou l'expression dans une cellule, un organe ou un organisme est recherché.
Les gènes thérapeutiques qui peuvent ainsi être transférés sont tout gène dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des produits ayant un effet thérapeutique.
Il peut s'agir en particulier de gènes codant pour des produits protéiques ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide, un acide aminé, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule lui permettant de lutter contre une pathologie.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones comme l'insuline, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apolipoprotéines : ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91 11947), etc.
Selon une variante préférée de l'invention, la séquence hétérologue comporte au moins un gène codant pour l'insuline ou un variant de l'insuline. Au sens de l'invention, variant couvre notamment les différentes formes de maturation de l'insuline comme par exemple la proinsuline, (Vollenweider et al., J. Biol. Chem. 267, (1992) 14629-14636 et Groskreutz et al., J. Biol. Chem.269, (1994), 6241- 6245).
Plus préférentiellement, le gène codant pour l'insuline et présent dans un vecteur selon l'invention comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID N°5.
Les vecteurs de l'invention peuvent être préparés à partir de différents types de virus. Préférentiellement, on utilise des vecteurs dérivés des adénovirus ou des rétrovirus. Les virus selon l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences n-écessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non- fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence d'ADN codant pour le gène d'intérêt comme par exemple celui de l'insuline. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, αont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et la séquence codant pour la protéine d'intérêt thérapeutique. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène El et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917).
Concernant les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein et al. Genêt. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus" ; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus") ; le SNV ("spleen necrosis virus") ; le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence d'intérêt, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence d'intérêt est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4.861.719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150). A titre d'exemple de lignée on peut notamment citer la lignée cellulaire ψ-2 qui provient de la lignée NIH-3T3 (lignée fibroblastique de souris) par transfection par pMOV-ψ", un plasmide contenant le génome du virus de la leucémie murine de Moloney (MoMuLV) dont la séquence d'encapsidation "ψ" est délétée (Mann et al. , Cell, (1983), 33, 153-159, ). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Viral. (1987) 61, 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Dans le cas particulier de la présente invention, les rétrovirus peuvent être préparés par transfection d'un plasmide rétroviral contenant le signal d'expression selon l'invention couplé au gène codant pour la protéine d'intérêt dans une lignée cellulaire transcomplémentante qui va permettre de produire des particules virales dont le génome code pour le transgène.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un rétrovirus recombinant défectif, le rétrovirus étant tout particulièrement avantageux pour exprimer de l'insuline.
En plaçant, au sein d'un vecteur selon l'invention, l'expression du gène codant pour l'insuline sous contrôle d'un signal d'expression contrôlé par le glucose et en transfectant des cellules in vivo à l'aide de ce type de vecteur on induit ces cellules-ci à produire de l'insuline sous l'effet de leur teneur physiologique en glucose. Ces cellules deviennent capables d'exprimer le transgène de l'insuline en présence d'une concentration physiologique et suffisante en glucose.
Selon un mode préféré de l'invention, les cellules transfectées possèdent un système interne de détection du glucose, encore désigné par machinerie senseur de glucose, susceptible d'induire l'activation du signal d'expression. Certains types cellulaires, comme les hépatocytes et les cellules β du pancréas en sont naturellement pourvues. Il s'agit d'un système notamment composé d'enzymes spécifiques comme le transporteur Glut-2-glucose et la glucokinase. Pour ce qui est des cellules démunies de ce type de machinerie senseur, il est tout à fait envisageable d'y suppléer artificiellement. Dans ce cas particulier, les cellules devant être traitées sont, soit préalablement ou simultannement, à l'injection de virus selon l'invention, transfectées à l'aide de constructions génétiques commandant la synthèse du transporteur Glut-2 de l'enzyme glucokinase.
L'infection des cellules telles les hépatocytes par des virus recombinants selon l'invention peut être réalisée ex vivo et/ou in vivo rendant les cellules ainsi transfectées capables de sécréter de l'insuline. Les sites d'infection privilégiés dans le cadre de la présente invention sont les sites naturels de sécrétion de l'insuline, comme la veine porte.
La présente invention se rapporte également aux cellules de mammifères, de préférence humaines et plus préférentiellement aux hépatocytes et/ou cellules β pancréatiques infectées par un ou plusieurs virus revendiqués.
Outre leur capacité à induire in vivo l'expression de l'insuline, les vecteurs selon l'invention permettent avantageusement le blocage immédiat de cette sécrétion sous l'effet du glucagon du fait de l'AMP classique. On s'affranchit de cette manière du risque d'une hypoglycémie induite par une sécrétion excessive en insuline.
En conséquence, les vecteurs revendiqués sont particulièrement avantageux pour contrôler in vivo via un phénomène d'induction au glucose, la production d'insuline dans une région précise de l'organisme, de préférence dans un site ou elle est normalement sécrétée comme la cirulation porte. Des cellules infectées par un ou plusieurs virus revendiqués pourraient ainsi être inplantées dans le foie, la rate, le pancréas ou l'intestin.
La présente invention décrit ainsi une approche nouvelle pour le traitement notamment des troubles diabétiques dépendant de l'insuline consistant à induire la synthèse in vivo d'insuline en réponse à une teneur physiologique en glucose.
Dans le cas particulier, où les cellules transfectées avec un vecteur selon l'invention ne posséderaient pas cette teneur physiologique en glucose, initiatrice de l'expression d'un gène hétérologue autre que l'insuline par exemple, on peut envisager le protocole suivant: la concentration en glucose ou en un analogue ayant la même influence sur la séquence de réponse au glucose (L4-L3), y serait ajustée de manière à induire l'expression de la protéine d'intérêt via l'activité du signal d'expression selon l'invention. Il est clair que cette concentration est déterminée en fonction de la quantité en vecteurs injectée, de la nature du site d'infection et de l'expression recherchée en protéine..
Comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne également toute utilisation d'un virus tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique notamment destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies liées à une hyperglycémie.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceu- tiquement acceptable pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur viral, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 10^ et 10^4 pfu/ml, et de préférence 10^ à 10*0 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Concernant les rétrovirus, les compositions selon l'invention peuvent comporter directement les cellules productrices, en vue de leur implantation.
Les exemples et figures, présentés ci-après à titre non limitatif de la présente invention, permettront de mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention.
LEGENDES DES FIGURES
Figure 1 : Représentation schématique de l'ordre de succession des éléments Ll à L4 identifiés dans le promoteur du gène L-PK et leurs protéines de liaison respectives.
Figure 2 : Représentation du palindrome de l'élément L4.
Figure 3 : Représentation partielle du plasmide rétroviral pHSG(L4L3)4PKCAT et des clones F6 et B8. Figure 4 : Détermination quantitative de l'activité CAT dans des cellules mhATTIIF transformées avec le clone B8, en fonction de la quantité de glucose injectée.
Figure 5 : Détermination quantitative de l'activité CAT dans des cellules mhATIIIF transformées avec le clone B8 à des temps d"induction différents.
Figure 6 : Construction des plamides pHSG/PK-CAT et pHSG/AL-PK-CAT.
Figure 7 : Induction par le glucose à des doses différentes de l'expression des plasmides pHSG/PK-CAT et pHSG/AL-PK-CAT.
Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroelution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série Ml 3 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
Le remplissage des extrémités ,5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase SI.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13. (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed £hain Eeaction, Saiki R.K. et al., Science 2____ (1985)
1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 15j> (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2ά (1977) 5463- 5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
EXEMPLE 1 : Construction d'un vecteur rétroviral
Tous les plasmides sont construits selon des techniques de clonage d'ADN standard. Les jonctions sont vérifiées par séquencage ADN. La construction du plasmide pHSG(L4L3)4-PKCAT, (représentée en Fig. 3), contient la partie constructive MMLV de pHSGNeo et la séquence codant pour le gène CAT sous contrôle du promoteur du gène pyruvate kinase de type L de rat (bp - 119 to + 11) en amont duquel des fragments L4L3 oligomérisés 4 fois (c.à.d le GIRE et le site de liaison HNF4 contigu) sont ligaturés. Le fragment L4L3, correspondant au fragment délimité entre les pb -172 à- 123, en amont du site d'initiation de la transcription L-PK a été obtenu par PCR. La séquence signal polyA utilisée, est celle présente dans le LTR de l'extrémité 3' du MMLV. Le plasmide pHSGNeo (Guild et al. J. Virol. 1988, 62, 3795-3801), un plasmide rétroviral dérivé du MMLV, la lignée psi-CRIP, une lignée cellulaire complémentaire amphotropique qui apporte en trans les protéines structurales de MMLV, ont été procurés par le Dr. A. Weber (Institut Cochin de Génétique Moléculaire, Paris); le plasmide pRSVNeo, dans lequel le gène aminoglycoside-phosphotransférase est sous contrôle du promoteur du LTR du RSV, est utilisé pour la cotransfection.
EXEMPLE 2 : Culture cellulaire et transfection
La lignée cellulaire mhATIIIF, est issue d'une tumeur du foie chez une souris transgénique exprimant les gènes précoces SV40 sous contrôle du promoteur antithrombine III spécifique du foie, (ATIII-SV40) (Kahn A. et al. Exp ; Cell. Res ;
200, 175-185). Ces cellules sont cultivées dans un milieu nutritif DMEM F12/NUT.
MIX. (1:1 vol/vol) avec du glutamax-1 ou DMEM/HamF12 (1:1 vol/vol) (Gibco- BRL) avec ou sans D+glucose (Sigma), complémenté avec 1 μM de dexamethasone, 1 μM triodothyronine, 20nM d'insuline humaine, 5 % (vol/vol) de SVF. Les cellules NIH3T3 et psi-CRIP sont cultivées dans : DMEM (5.5mM de glucose, l.OmM pyruvate de sodium) complémentée avec 10 % (vol/vol) de sérum de veau nouveau- né. Tous les milieux sont additionnés d'ampicilline, de streptomycine et de glutamine et les cultures sont incubées à 37°C avec 5 % (vol/vol) CO2. Les cellules psi-CRIP sont cotransfectées avec les plasmides pHSG (L3L4)4- PKCAT et pRSV Neo (le rapport molaire des deux plamisdes étant de 10:1) par la méthode liposome cationique (DOTAP, Boeringer Mannheim) et sélectionnées en présence de G418 (800 μg ml). Les clones résistants à G418 sont séparés pour le test de production des rétrovirus.
EXEMPLE 3 : Préparation de l'ARN viral et PCR-RT en une étape
Les clones cellulaires résistants à G418 sont ensemencés dans des puits de 90 mm et cultivés jusqu'à 100 % de confluence. Le surnageant de la culture cellulaire est filtré sur une membrane possédant des pores de 0,22 μm, incubé avec de la DNase I (lOμg/ml) à 37°C pendant 30 min puis centrifugé à 65000 rpm pendant 20 minutes à 4°C. L'ARN rétroviral est extrait et purifié de culots de précipitation par la protéinase K et un mélange phénol/chloroforme puis co-précipité avec de l'ARN t. L'échantillon est dissous dans du pyrocarbonate de diéthyle traité avec de l'eau et contenant 1 mM de dithiothreitol (DTT), 40 U de RNAsin/lOOμm, puis soumis à une transcriptase réverse et à une PCR en une seule étape. Les deux sondes utilisées pour l'amplification sont :
- 5'ACTCAAATGCCCAATGAAGTC 3' (SEQ ID N°7), correspondant à la région Gag de MMLV (pb 1524 à 1544) ;
- 5' TCAACGGTGGTATATCCAGAT 3'(SEQ ID N°8), correspondant à la région codante du gène CAT (pb 35 to 15 en considérant le site d'initiation de la traduction). La transcription inverse à partir de la sonde PCR antisens est catalysée par la transcriptase inverse 8U AMV (Promega) pendant 1 heure à 42°C et la PCR suivante avec l'ADN polymérase Taq25U est réalisée en 35 à 40 cycles. Le fragment amplifié attendu est long de 440 pb et contient une partie du gène gag, 4 motifs répétés L3L4, le promoteur -119 L-PK et les 69 premières pb du gène CAT. Si nécessaire, les fragments RT-PCR sont clones et séquences.
EXEMPLE 4 : Production de rétrovirus recombinants
Les vecteurs rétroviraux pHSG(L4L3)4-119PKCAT et pRSVNeo sont utilisés pour co-transfecter des lignées cellulaires psi-CRIP. 70 clones résistants à G418 sont analysés. 8 clones positifs en RT-PCR témoignent d'une capacité à produire des rétrovirus recombinants infectueux, déterminée par PCR spécifique du fragment attendu de l'ADN génomique des cellules NIH3T3. Il a été mis en évidence la production de rétrovirus à un titre significatif chez deux clones.
- Le clone F6 (5.10^) rétrovirus infectueux, produit un rétrovirus avec la région complète de la séquence signal (4 répétitions des fragments L4L3 entier (voir figure 3)) et
- le clone B8 (2.10^) avec une séquence signal partiellement délété (un seul motif L4L3 entier et une petite partie de la cassette L3 d'un second motif (voir figure 3)).
Les titres en rétrovirus ont été estimés par PCR-RT semiquantitative en utilisant différentes délétions en pHSG(L4L3)4199PKCAT comme standards.
EXEMPLE 5 : Infection par un rétrovirus recombinant, estimation du titre en rétrovirus et dosage de la protéine CAT
Les clones positifs sont utilisés pour infecter les cellules NIH3T3 afin d'estimer les capacités infectueuses des rétrovirus produits. 1 ml de surnageant de culture cellulaire à 100 % de confluence est utilisé pour infecter des cellules NIH3T3 en croissance logarithmique avec 8 μg/ml de polybrène. Après 3 heures d'incubation, le polybrène est dilué à 2 μg ml avec du milieu et la culture est poursuivie 48 heures. L'ADN génomique des cellules NIH3T3 infectées est extrait et utilisé pour une amplification PCR en employant les sondes décrites en exemple 3. La détection du fragment amplifié spécifique prouve l'intégration des séquences rétrovirales dans le génome des cellules infectées. Le titre en est estimé en comparant les intensités des bandes d'ADN amplifiées issu de l'ADN génomique des cellules infectées avec celles issues de différentes dilutions du rétrovirus (10^ à 10^ molécules). Les clones qui produisent des rétrovirus infectueux sont co-cultivés avec des cellules mhATIIIF selon le protocole suivant:
- On place à l'intérieur d'un puit de 90 mm, un puit de 60 mm dont la base a été retirée et les parois enduites avec de l'huile de silicone, de manière à le diviser en deux parties. - On y introduit les cellules mhATIIIF et les cellules produisant le rétrovirus respectivement au centre et en périphérie, et en prenant soin de ne pas mélanger les deux types de cellules.
- Lorsque les cellules sont bien fixées au puits après 6 heures d'incubation, le petit puit est retiré. Le milieu est changé pour une nouvelle incubation de 16 heures, le polybrène est ensuite ajouté (8 μg) et les cellules sont cultivées pendant 48 heures.
- L'activité CAT est mesurée par chromatographie sur couche fine et quantifiée en cpm par scintillation.
EXEMPLE 6 : Induction par le glucose à des doses et temps différents de l'expression de la chimère
La lignée cellulaire mhATIIIF assimilable aux hépatocytes chez le rat, conserve sa capacité à répondre au glucose par activation transcriptionnelle du gène L-PK et est donc appropriée pour tester la réponse du transgène CAT, transféré par le vecteur rétroviral et en conséquence l'activité du L-PK GIRE dans un environnement rétroviral. Pour accroître l'efficacité de la transfection, les cellules mhATIIIF sont cultiv-ées deux fois avec des cellules produisant les rétrovirus, ce qui conduit à un taux d'infection satisfaisant avec le clone B8. Comme le montrent les figures 4 et 5, l'expression du transgène L-PK/CAT dans les cellules infectées mhATIIIF est bien induite par le glucose avec la moitié de l'induction maximale obtenue pour 3-4 mM de glucose et l'induction maximale pour 8mM de glucose. Pour des concentrations supérieures en glucose, l'activité CAT demeure relativement stable.
Les cellules mhATIIIF sont cultivées dans un milieu contenant 17 mM de glucose, l'induction du gène est observée à partir de la 8^me heure d'incubation, l'induction à moitié avant la 24eme heure et l'induction maximale à la 48^me heure.
EXEMPLE 7 : Construction des plamides pHSG/PK-CAT et pHSG/AL- PK-CAT
Les plasmides sont construits selon des techniques de clonage d'ADN standard. Les jonctions sont vérifiées par séquencage ADN. La construction du plasmide pHSG/PK-CAT contient la partie MMLV de pHSG située entre les nucléotides de 1 à 2015 et de 3888 à 4445; pour le plasmide pHSG/AL-PK-CAT, les séquences MMLV sont situées entre les nucléotides de 1 à 2015 et de 4290 à 4847 (figure 6). La séquence codant pour le gène CAT sous contrôle du promoteur du gène pryruvate kinase de type L de rat (-183 à + 11 bp) est situé entre les nucléotides 2048 et 3033 pour le plasmide pHSG/PK-CAT et entre 2450 et 3435 pour le plasmide pHSG/AL-PK-CAT. La séquence du fragment enhancer du gène de l'aldolase B (SEQ ID N°6), est située entre les nucléotides 2035 et 2437 dans le plasmide pHSG/AL-PK-CAT. La séquence signal poly A utilisée est celle de SV40 située entre les nucléotides 3033 et 3873 dans le pHSG/PK-CAT et entre 3435 et 4275 dans le pHSG/AL-PK-CAT. Les nucléotides de 2015 à 2048; 2242 à 2452 et 3873 à 3888 sont des adaptateurs entre les différents fragments pour le plasmide pHSG/PK-CAT; ils sont situés pour le plasmide pHSG/AL-PK-CAT de 2015 à 2035; 2437 à 2450; 26-44 à 2654 et 4275 à 4290. EXEMPLE 8 : Induction par le glucose à des doses différentes de l'expression des plasmides pHSG/PK-CAT et pHSG/AL-PK-CAT
La lignée cellulaire mhAT3F est issue d'une tumeur du foie chez une souris transgénique exprimant les gènes précoses SV40 sous le contrôle du promoteur antithrombine III spécifique du foie (Kahn A. et al. Exp; Cell.Res; 200, 175-185). Ces cellules ont été cultivées à 37°C avec 5 % (vol/vol) CO2 dans un milieu nutritif DMEM F12/NUT.MIX. (1:1 vol/vol) avec du glutamax-1 (Gibco-BRL) avec ou sans D-glucose (Sigma), complémenté avec 1 μM de dexamethasone, 1 μM triodothyronine et 20 nM d'insuline humaine. 5 μg du plasmide pHSG/PK-CAT ou du plasmide pHSG/AL-PK-CAT ont été transfectés par la méthode liposome cationique (DOPAP, Boehringer Mannheim). Les cellules ont été par la suite cultivées en présence de différentes concentrations de glucose pendant 24 heures pour induire le promoteur de la PK-L. L'activité CAT est mesurée par chromatographie sur couche fine et quantifiée en cpm par scintillation. Les résultat sont présentés sur la figure 7. Après 24 heures d'induction en présence de différentes concentrations de glucose, l'expression du plasmide pHSG/PK-L en présence de l' enhancer de l'aldolase B est 5tfois plus forte en présence de 8 mM glucose que celle du plasmide dépourvu de l' enhancer de l'aldolase B (figure 7).
Ce promoteur hybride aldolase B/PK-L est donc particulièrement avantageux pour conférer à un gène un niveau d'expression élevé tout en restant sensible au glucose, notamment dans le cadre du développement de méthode de thérapie génique du diabète destinées à produire, en fonction de la glycémie, une concentration convenable in vivo en insuline.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE: (î) DEPOSANT:
(A) NOM: INSERM
(B) RUE: 101, Rue de Tolbiac
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75654 PARIS Cedex 13
(il) TITRE DE L' INVENTION : VECTEUR VIRAL RECOMBINANT, COMPOSITION PHARMACEUTIQUE LE CONTENANT ET CELLULES TRANSFORMEES CORRESPONDANTES.
Un) NOMBRE DE SEQUENCES:8
(IV) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1 :
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 194 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS:simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (n) TYPE DE MOLECULE: ADN
(m) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1 : GATCCAGCAG CATGGGCGCA CGGGGCACTC CCGTGGTTCC TGGACTCTGG CCCCCAGTGT 60
ACAAGGCTTC CGTTGGCAAG AGAGATGCTA GCTGGTTATA CTTTAACCAG GACTCATCTC 120
ATCTGAGCCA GGCCCCATCC CACTGACAAA GGCGCAGTAT AAAGCAGACC CACAGACACA 180
GCAGGTAAGC AACG 194
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(1) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(n) TYPE DE MOLECULE: ADN (ni) HYPOTHETIQUE: NON (ni) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: GCGCACGGGG CACTCCCGTG GTTC 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS:simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (n) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ni) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: CTGGACTCTG GCCCCCAGT 19
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4 (î) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 129 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS Simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(11) TYPE DE MOLECULE: ADN
(m) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
GGCTTCCGTT GGCAAGAGAG ATGCTAGCTG GTTATACTTT AACCAGGACT CATCTCATCT 60
GAGCCAGGCC CATCCCACTG ACAAAGGCGC AGTATAAAGC AGACCCACAG ACACAGCAGG 120 TAAGCAACG 129
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 416 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
TCCTTCTGCC ATGGCCCTGT GGATGCGCCT CCTGCCCCTG CTGGCGCTGC TGGCCCTCTG 60
GGGACCTGAC CCAGCCGCAG CCTTTGTGAA CCAACACCTG TGCGGCTCAC ACCTGGTGGA 120
AGCTCTCTAC CTAGTGTGCG GGGAACGAGG CTTCTTCTAC ACACCCAAGA CCCGCCGGGA 180
GGCAGAGGAC CTGCAGGTGG GGCAGGTGGA GCTGGGCGGG GGCCCTGGTG CAGGCAGCCT 240 GCAGCCCTTG GCCCTGGAGG GGTCCCTGCA GAAGCGTGGC ATTGTGGAAC AATGCTGTAC 300
CAGCATCTGC TCCCTCTACC AGCTGGAGAA CTACTGCAAC TAGACGCAGC CCGCAGGCAG 360
CCCCCCACCC GCCGCCTCCT GCACCGAGAG AGATGGAATA AAGCCCTTGA ACCAGC 416
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 464 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS:simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: AGGCCTCCAC ACTCTATTGC ACTCTGCAGA AGTAACACTA GAGTGACCTT TCTTTAGATT 60
TAGAAAGACT AACACATAAT ATATTGCTGT AATTTCTTTT GTAGTTTTTT AAGTAGGACA 120
ATAAATATTT ATTACAGATT TCTCTGGAAG TTTTTCATTT GATAATTAAT GAAAATTTTC 180
CATCATACTT GTAAAAATGA AGTGACTTGG GACCTTAGAA ATCAGAAGTT TAAAGGAGTA 240
AAGTTCATTA TTGTTAAGTA TTCCAGGCTG TGTTCTGTCT CCCAGTGACA AACATTGACC 300 TGTGACTCTG TTTTATGATT AACTGAGGGG CAAAATTTGT GCTGATGTGG TACAGACCTT 360
TAGTCCCTTT GTAGAAGTTT AACTTCCTGT AAACAGGACG AGTTTGACTT GACTTTTCCC 420 TGTAATTCTT GTTGAGTTGG CATACCCAGA ATGGAGCAAA TGGC 464
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS:simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
ACTCAAATGC CCAATGAAGT C 21
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS:simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: TCAACGGTGG TATATCCAGA T 21

Claims

REVENDICATIONS
1. Virus recombinant défectif comprenant au moins un gène hétérologue sous contrôle d'un signal d'expression inductible par le glucose ou un de ses analogues.
2. Virus recombinant défectif comprenant au moins un gène hétérologue sous contrôle d'un signal d'expression dérivant en tout ou partie du promoteur du gène codant pour la pyruvate kinase de type L (L-PK).
3. Virus selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le signal d'expression dérive en tout ou partie du fragment constitué des 183pb situé en 5' de la phase codante du gène codant pour la L-PK.
4. Virus selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisé en ce que le signal d'expression comprend tout ou partie de la séquence représentée en SEQ ID N°l.
5. Virus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le signal d'expression comprend au moins l'élément L4 du promoteur du gène codant pour la L-PK.
6. Virus selon la revendication 5 en ce qu'il s'agit de l'élément L4 représenté en tout ou partie par la séquence SEQ ID N°2, une séquence hybridant avec tout ou partie de celle-ci ou d'une séquence qui en dérive, capable d'interagir avec le facteur MLTF/USF.
7. Virus selon la revendication 5 ou 6 caractérisé en ce que l'élément L4 est répété sous la forme de 4 oligomères consécutifs dans le signal d'expression.
8. Virus selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'élément L3 du promoteur du gène codant pour la L-PK.
9. Virus selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'élément L3 est représenté en tout ou partie par la séquence SEQ ID N°3, une séquence hybridant avec tout ou partie de celle-ci ou d'une séquence qui en dérive, capable d'interagir avec le facteur HNF 4.
10. Virus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le signal d'expression comprend l'élément L4 du promoteur du gène codant pour la L- PK fusionné en amont de l'élément L3 de ce même promoteur, L4-L3.
11. Virus selon la revendication 10 caractérisé en ce que le signal d'expression comprend 4 oligomères, successifs L4-L3.
12. Virus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en que le signal d'expression comprend en outre un promoteur minimal.
13. Virus selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il s'agit de préférence de la séquence correspondant au fragment - 119 à 11 situé en 5' du gène codant pour la L-PK.
14. Virus selon l'une des revendications précédentes caractérisé en que le signal d'expression est représenté par la SEQ ID N°4 ou l'un de ses dérivés.
15. Virus selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en que le signal d'expression comprend en outre un enhancer transcriptionnel.
16. Virus selon la revendication 15 caractérisé en que l'enhancer transcriptionnel est issu du premier intron du gène de l'aldolase B du rat.
17. Virus selon l'une des revendications 1 à 16 caractérisé en ce qu'il est dépourvu des régions de son génome qui sont nécessaires à sa réplication dans la cellule cible.
18. Virus selon l'une des revendications 1 à 17 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus.
19. Virus selon la revendication 17 caractérisé en ce qu'il sagit d'un adénovirus humain de type Ad 2 ou Ad 5 ou canin de type CAV-2.
20. Virus selon l'une des revendications 1 à 17 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un rétrovirus.
21. Virus selon la revendication 20 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un rétrovirus de la famille MoMuLV.
22. Virus selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le gène hétérologue code pour l'insuline ou un de ses variants.
23. Utilisation d'un virus selon l'une des revendications 1 à 22 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies liées à une hyperglycémie.
24. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 21.
25. Composition pharmaceutique selon la revendication 24 caractérisée en ce qu'elle est sous forme injectable.
26. Composition pharmaceutique selon la revendication 24 ou 25 caractérisée en ce qu'elle comprend entre 10^ et 10* pfu/ml, et de préférence 10^ à 10^ pfu/ml adénovirus recombinants défectifs.
27. Cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs virus recombinants défectifs selon l'une des revendications 1 à 21.
28. Cellule selon la revendication 27 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule humaine.
29. Cellule selon la revendication 28 caractérisée en ce qu'il s'agit d'un hépatocyte ou d'une cellule β pancréatique.
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