CZ292564B6

CZ292564B6 - Replikačně defektní rekombinantní virus, farmaceutická kompozice obsahující virus a buňky transformované virem

Info

Publication number: CZ292564B6
Application number: CZ19973251A
Authority: CZ
Inventors: Ruihuan Chen; Bruno Doiron; Axel Kahn
Original assignee: Institut National De La Sante Et De La Recherche M
Priority date: 1995-04-14
Filing date: 1996-04-12
Publication date: 2003-10-15
Also published as: HUP9802587A3; AU5652396A; NO974726L; WO1996032489A1; EP0821741A1; US6309878B1; BR9604938A; AU715377B2; CZ325197A3; FR2732978A1; JPH11503608A; MX9707910A; CA2215987A1; HUP9802587A2; SK137797A3; NO974726D0; KR19980703843A; FR2732978B1

Abstract

Řešení se týká defektních rekombinantních virů obsahujících alespoň jeden heterologický gen pod kontrolou expresního signálu indukovatelného glukózou, kterýžto signál obsahuje celý nebo část promotoru genu kódujícího pyruvátkinázu typu L (L-PK), farmaceutické kompozice, která obsahuje tento virus, a také buněk transformovaných tímto virem. Farmaceutická kompozice je užitečná pro prevenci nebo léčení nemocí souvisejících s hyperglykémií.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká replikačně defektních rekombinantních virů, přípravy těchto virů, farmaceutické kompozice obsahující tyto viry, a také buněk transformovaných virem. Farmaceutická kompozice podle vynálezu je užitečná pro prevenci nebo léčení nemocí souvisejících s hyperglykémií, zejména pro genovou terapii těchto nemocí.

Dosavadní stav techniky

Genová terapie spočívá v opravě snížené schopnosti nebo anomálie (mutace, aberantní exprese, atd.) vložením genetické informace do buňky nebo postiženého orgánu. Tato genetická informace může být vložena, dejme tomu, in vitro do buňce extrahované z organismu, modifikovaná buňka se pak zavede opět do organismu, přímo do vhodné tkáně in vivo. Byly popsány různé techniky pro vkládání této genetické informace. Různé techniky transfekce zahrnují komplexy DNA a DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967), DNA a nukleární proteiny (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), DNA a lipidy (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), použití lipozomů (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), atd.

Použití virů jako vektorů pro přenos genů se ukázalo jako slibná alternativa k těmto fyzikálním technikám transfekce. V tomto ohledu byly testovány různé viry pro schopnost infikovat určitou populaci buněk. Zvláště retroviry (RSV, HMS, MMS, atd.), virus HSV a adenoviry.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se vztahuje zejména k novým replikačně defektním virům, které jsou užitečné jako vektory pro léčení hypoglykemií, jako je např. diabetes.

Diabetes je syndrom obvykle chronický, jehož nejcharakterističtější symptom je hyperglykemie, v nepřítomnosti zvýšení renálního prahu pro glukózu, glykosurie. Principiální příčinou je absolutní nebo relativní nedostatek inzulínu mající za následek anomálie nejenom metabolismu uhlovodíků, ale také bílkovin a tuků.

Diabetes je všeobecně léčena podáváním inzulínu, tato léčba však silně omezuje pacienta.

Předložený vynález se týká vektorů virového původu, dovolujících nahradit tuto dezorganizaci metabolismu glukózy v organismu obnovením vhodného způsobu řízení koncentrace inzulínu in vivo.

Ví se, že glukóza je faktorem regulace transkripce genů ve většině živých bytostí. Zejména se ukázalo, že glukóza je schopna stimulovat transkripci kódovaného genu pro glykolytické enzymy a lipogenické enzymy v hepatocytech a adipocytech, jako např. gen pyruvatkinázy typu L, specifický tkáňový glykolytický enzym, který hraje důležitou roli v regulaci glykolýzy aglukoneogeneze v játrech. Exprese proteinu L-PK v játrech je pod potravní a hormonální kontrolou. Je indukovaný dietou bohatou na glukózu a naopak inhibován ztrátou glykózy a objevuje se u diabetiků. Ví se také, že expresí svého genu je pozitivně regulován dvojicí glukóza/inzulin a negativně glukagonem prostřednictvím svého druhého přenašeče cyklického cAMP (A. Kahn, J. Bio. Chem. 264, (1989), 11584-11590).

-1CZ 292564 B6

Nedávno byla charakterizována různá místa vázání (prvky LI až L4) pro faktory transkripce a zvláště elementu odpovědi na obsah glukóza/inzulin nebo GIRE v oblasti před promotorem genu tohoto enzymu L-PK (A. Kahn et al., J. Mol. Biol. 209, (1989), 205-219). Promotor byl také identifikován ve smyslu 3'až 5'od krabice TATA, element LI, místo vázání pro nukleární faktor 1 hapatocytu (NHF1), element L2, místo vázání pro nukleární faktor 1 (NF1), element L3, místo vázání pro nukleární faktor 4 hapatocytů (NHF4) a element L4, místo vázání pro faktor transkripcionální (MLFT)/USF (Obrázek 1). Specifický element odpovědi na glukóza/inzulin byl přesně lokalizován v genu kódujícím L-PK ve formě perfektního palindromu mezi nukleotidy -168 až -144 od místa cap, dejme tomu v elementu L4 (Obrázek 2). Element GIRE se jeví jako schopný udělit transkripční odpověď na glukózu k minimálnímu promotoru L-PK, který je tvořený TATA a elementem LI.

Jasně se ukázalo, že je možné zhodnotit schopnost elementu GIRE, k odpovědi na glukózu ve virálním kontextu pro modulování exprese zainteresovaného proteinu v genové terapii.

Předložený vynález se vztahuje kdefektním rekombinantním virům, obsahujícím alespoň heterologní gen pod řízením expresivního signálu indukovaného glukózou nebo jejími analogy.

Analogy glukózy jsou všechny prostředky představující strukturní homologii s glukózou a jsou schopné indukovat aktivaci expresního signálu. Vhodnými analogy, které byly použity podle předloženého vynálezu, jsou zejména fruktóza, galaktóza, cukróza, laktóza a všechny cukry, které mohou být hydrolyzovány na tyto složky.

Ve smyslu předloženého vynálezu expresní signál indukovatelný glukózou pokrývá všechny sekrece expresního signálu, jehož aktivace, která podmiňuje subsekvenční transkripci heterologického genu, je zvláště indukovaná v přítomnosti glukózy nebo jejích analogů.

Jedná se zejména o rekombinantní defektní virus, ve kterém exprese heterologického genu je umístěna pod řízením expresního signálu odvozeného úplně nebo částečně od promotoru genu kódujícího pyruvátkinázu typu L, L-PK. Tento expresní signál odvozuje celek nebo část fragmentu obsahujícího 183pb umístěného na 5'konci kódovaného genu kódujícího L-PK.

Expresní signál podle vynálezu obsahuje celou nebo část sekvence SEQ ID N°l.

Podle způsobu preferované realizace expresní signál obsahuje celou nebo část elementu L4 tohoto promotoru.

Element L4 je obzvláště představován úplně nebo částečně sekvencí SEQ ID N°2, sekvencí hybridující s částí nebo celkem této sekvence nebo sekvencí, která je od ní odvozena a schopnou vstoupit v interakci s faktorem MLTF/USF.

Ve smyslu předloženého vynálezu se očekává, že odvozením všech sekvencí získaných jednou nebo více modifikacemi si tyto sekvence zachovají alespoň jednu z biologických vlastností původní sekvence a zejména svoji schopnost vstoupit v interakci se svým nebo svými faktorem (faktory) a vytvořit specifické vazby, v tomto případě se jedná o faktor MLTF/USF. Modifikací se rozumí všechny mutace, substituce, delece, adice nebo modifikace povahy genetické nebo/a chemické. Tyto modifikace mohou být prováděny známými technikami.

V obměně vynálezu element L4 je opakován ve formě čtyř souvislých oligomerů v expresním signálu.

Podle vynálezu expresní signál obsahuje kromě částice L4 celek nebo část elementu L3 promotoru genu kódujícího L-PK.

-2CZ 292564 B6

Ukázalo se, že element L3 přispívá k lepší účinnosti elementu L4. (A. Kahn et al. Nucleic Acids

Research20, (1992), N°8pl871). Element L3 je představen částečně nebo úplně sekvencí

SEQIDN⁰3, sekvencí hybridující s částí nebo celkem toho nebo sekvencí, která je odvozena, schopná interagovat s faktorem HNF 4.

Podle způsobu preferované realizace expresní signál obsahuje element L4 promotoru genu kódujícího L-PK, vázaný před elementem L3 stejného promotoru. Je tak popsán jako L4-L3. Expresní signál podle vynálezu obsahuje 4 souvislé oligomeiy L4-L3.

Tento signál exprese obsahuje mimoto promotor řečený minimální.

Ve smyslu předloženého vynálezu minimální promotor označuje všechny iniciátory sekvence, které samy nejsou schopné účinně zajistit transkripci heterologické sekvence, která je mu přidružená. Aktivita takového promotoru se jeví úplně závislá na aktivaci elementu odpovídajícího glukóze. Minimální promotor má hlavně funkci zaměřenou na transkripci. V této perspektivě je obzvláště umístěn v místě cap heterologické sekvence, a tak vytváří kontinuální nukleotidovou sekvenci.

Podle vynálezu je také možné použití minimálního promotoru odvozeného od konvenčního promotoru jako například promotor aktivující transkripci genu typu thymidinkináza, chloramfenikolacetyltransferáza, β-galaktosidáza nebo luciferáza nebo odvozeného od promotoru genu kódujícího pyruvatkinázu typu L. Tento minimální promotor může být odvozen od lidského CMV. V případě potřeby takový promotor může být minimální.

Podle stejného principu minimální promotor může být odvozen od promotoru přirozeně odpovídajícího expresi zainteresovaného heterologického genu.

Název minimální promotor byl úspěšně použit podle vynálezu pro sekvenci odpovídající fragmentu -119 až 11 umístěného na 5'konci genu kódujícího L-PK.

Všeobecně tento minimální promotor je umístěn v místě cap nukleové sekvence, v níž řídí expresi svého přírodního promotoru. Vlastní promotor inaktivní nebo zbaven funkce různými známými technikami, zejména delecí nebo/a adicí jedné nebo více bází.

Expresní signál odpovídá úplně nebo částečně sekvenci SEQ ID N°4 nebo jedné z jejich derivátů.

Oblast iniciátoru může být modifikována adicí aktivační sekvence nebo regulací (zejména sekvencí promotoru), dovolující zvětšit sílu promotoru induktivního charakteru. Za cílem vylepšovat sílu promotoru se vytvoří hybridní vektor, ve kterém promotor 183 pb genu PK-L je předcházející fragmentu 402 pb umístěného v prvním intronu genu krysí aldolázy B nukleotidu 2321 v místě iniciace transkripce (SEQIDN°6 odpovídající nukleotidům 1915 až 2379). Prezentované výsledky v tomto příkladě ukazují, že tato konstrukce zvyšuje expresi genu faktoru 5, v odpovědi na glukózu.

Co se týče sekvence heterologických nukleových kyselin umístěných pod kontrolou expresního signálu podle vynálezu obsahuje tato sekvence jeden nebo více terapeutických genů, jejichž přenos nebo/a exprese v buňce, orgánu nebo organismu se zkoumá.

Terapeutické geny, které mohou také být přenášeny jsou všechny geny, jejichž transkripce a eventuálně transdukce v cílové buňce vytváří produkty mající terapeutický efekt.

Může se zvláště jednat o geny kódující proteinové produkty mající terapeutický efekt. Proteinové produkty také kódují protein, peptid, aminokyselinu atd. Tyto proteinové produkty mohou být homologické vůči cílovým buňkám (může se říci produkt, který je normálně vyjádřen v cílové buňce, který neprezentuje žádnou patologii). V tom případě exprese proteinu např. zmírňuje

-3CZ 292564 B6 nedostatečnou expresi v buňce nebo dovoluje expresi inaktivního proteinu nebo slabě aktivního vzhledem k modifikaci, nebo exprimovat výše uvedený protein. Terapeutický gen může také kódovat mutant buněčného proteinu majícího stabilitu, modifikovanou aktivitu atd. Proteinové produkty mohou být heterologické vůči cílové buňce. V tom případě vyjádřený protein může 5 například doplnit nebo nést aktivitu se sníženou schopností do buňky dovolující bojovat proti patologii.

Mezi terapeutické produkty ve smyslu předloženého vynálezu můžeme citovat zejména enzymy, krevní deriváty, hormony jako je inzulín, lymfokiny: interleukiny, interferony, TNF, atd. 10 (FR 9203120), růstové faktory nebo jejich prekurzory nebo enzymy syntézy, trofické faktory:

BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 atd., apolipoproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE atd. (FR 93 05125), dystrofin nebo minidistrofin (FR 91 11947) atd.

Podle obměny vynálezu heterologická sekvence obsahuje alespoň gen kódující inzulín nebo 15 obměnu inzulínu. Ve smyslu vynálezu obměna pokrývá zejména různé formy maturace inzulínu jako například proinzulin (VOUenweider et al., J. Biol. Chem. 267, (1992) 14629-14636 a Groskreutz et al., J. Biol. Chem. 269, (1994), 6241-6245).

Gen kódující inzulín přítomný ve vektoru podle vynálezu obsahuje celou nebo část sekvence 20 SEQIDN^O5.

Vektory podle vynálezu mohou být připraveny od různých typů virů. Zejména se používá vektory odvozené od adenovirů nebo retrovirů.

Viry podle vynálezu jsou defektní, může se říci, že jsou neschopné se replikovat autonomním způsobem v cílové buňce. Všeobecně, genom defektního viru použitého v oblasti předloženého vynálezu je tak zbaven alespoň jedné sekvence nutné pro replikaci výše uvedeného viru v infikované buňce. Tyto oblasti mohou být vyloučeny (úplně nebo částečně), zbavené funkcí, substituované dalšími sekvencemi a zejména sekvencí DNA kódující gen jako například gen 30 inzulínu. Defektní virus zachovává sekvencí svého genomu, který je nezbytný pro kapsilaci virových částí.

Byl charakterizován účinný adenovirus a různé sérotypy, jejich struktura a jakákoliv rozličné vlastnosti. Mezi těmito sérotypy se s výhodou používají v oblasti předloženého vynálezu lidské 35 adenoviry typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenoviiy zvířecího původu (viz FR 93 05954).

Mezi adenoviry zvířecího původu, použitými v rámci předloženého vynálezu, se mohou citovat adenoviry původu psího, hovězího, myšího (př. Mávl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčího, prasečího, ptačího nebo opičího (př.: SAV). Obzvláště se používají adenoviry zvířecího původu, jako je adenovirus psí, zvláště adenovirus CAV2, (např. kmen manthattan nebo A26-61 40 (ATCC VR-800)). V rámci předloženého vynálezu se obzvláště používá adenovirus původu lidského nebo psího nebo smíšený.

Defektní adenoviry vynálezu obsahují ITR sekvence dovolující enkapsilaci a sekvence kódující terapeutický protein. V genomu adenovirů vynálezu gen El a geny E2, E4, L1-L5 jsou 45 nefunkční. Virový gen může být zbaven funkcí všemi známými technikami a zvláště totálním zrušením substituce, delece nebo adice jedné nebo více bází v genu nebo genech zkoumaných. Takovéto modifikace mohou být získány in vitro (na izolované DNA) nebo v místě například prostřednictvím technik povahy genetické nebo působením mutagenních činitelů. Defektní rekombinantní adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny odborníky všemi známými 50 technikami (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917).

Co se týče retrovirů rekombinantních vektorů byla široce popsána v literatuře: viz zejména Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203, EP 453 242, EP 178 220, Bemstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235, McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, atd. Retroviry jsou viry, které 55 infektují selektivně buňky v dělení. Genom retrovirů obsahuje zvláště dva LTR, sekvenci

-4CZ 292564 B6 kapsilace a tři kódované oblasti (gag, pol, a env). V rekombinantních vektorech odvozených od retrovirů gens gag, pol a env jsou všeobecně deletovány úplně nebo částečně a umístěny sekvencí heterologické nukleové kyseliny. Tyto vektory mohou být tvořeny od různých typů retrovirů takových, jako jsou zejména MoMuLV (murine moloney leukemia virus, také popsán jako MoMLV), MSV (murine moloney sarcoma virus) HaSV (harvey sarcoma virus), SNV (spleen necrosis virus), RSV (rouš sarcoma virus) nebo Friendův virus.

Pro konstrukci rekombinantních retrovirlů obsahuje zainteresovanou sekvenci plazmid, obsahující zejména LTR, sekvence kapsilace. Výše uvedená zainteresovaná sekvence je všeobecně vystavěná a potom funkce defektivních retrovirů vplazmidu. Všeobecně původci kapsilace jsou tak schopné exprimovat geny gag, pol a env. Potomstvo kapsilace bylo popsáno v původních pracech a zejména PA317 (US4, 861, 719), PsiCRIP (W090/02806) a GP+envAm12 (W089/07150). Můžeme zejména citovat buněčné ψ-2, které pocházejí zNIH-3T3 (myšího fibroblastu) transfekcí pMOV-ψ^-, plazmid obsahující genom viru leukemie myší Moloney (MoMuLV), jehož sekvence enkapsidace ψ je deletována (Mann et al., Cell, (1983), 33, 153— 159). Z jiného hlediska rekombinantní retroviry mohou obsahovat modifikace na úrovni LTR pro vyjádření transkripcionální aktivity tak, že sekvence kapsidace obsahuje část genu gag (Bender et al., J. Virol. (1987) 61,1639). Rekombinantní viry jsou pak čištěny klasickými technikami.

V případě předloženého vynálezu retroviry mohou být připraveny transfekcí retrovirálního plazmidu obsahujícího protein v buňkách transkomplementámích, které dovolí produkci virálních částic, jehož genom kóduje transgen.

Předložený vynález se týká výhody použití adenovirů nebo rekombinantních defektních retrovirů, retrovirů, které jsou výhodné pro exprimaci inzulínu.

Podle vynálezu exprese genu kódujícího inzulín pod kontrolou expresního signálu kontrolovaného glukózou a transfektující buňky in vivo pomocí tohoto typu vektoru se indukují buňky k produkci inzulínu pod vlivem svého fyziologického glukózového promotoru. Tyto buňky musí být schopny exprimovat transgen inzulínu v přítomnosti fyziologické koncentrace glukózy.

Podle předloženého vynálezu transfektované buňky mají interní systém detekce glukózy popsán senzorovým glukózovým vybavením, schopný indukovat aktivaci expresního signálu. Určité typy buněk, jako jsou např. hepatocyty a β buňky pankreatu mají tuto schopnost. Jedná se o systém specifických enzymů a sloučenin, např. Glut-2-glukóza a glukokináza. Buňky bez tohoto typu senzorového vybavení mohou být vybaveny tímto systémem uměle. V tom případě jsou buňky před aplikací předem nebo současně s injektací viru podle vynálezu transfektovány pomocí genetické konstrukce určující syntézu transportéru Glut-2 enzymu glukokinázy.

Infekce takových buněk hepatocytů rekombinantními viry podle vynálezu může být realizována ex vivo nebo/a in vivo, transfektované buňky také jsou schopné vylučovat inzulín. Místa infekce v oblasti předloženého vynálezu jsou místa přírodní sekrece inzulínu, jako je krevní řečiště.

Předložený vynález pojednává zejména o savčích buňkách, zejména lidských a zejména o hepatocytech nebo/a buňkách β infikovaného pankreatu jedním nebo více nárokovanými viry.

Mezi schopnosti indukovat in vivo expresi inzulínu vektory podle vynálezu dovolují výhradně přímou blokaci této sekrece pod vlivem glukagonu vytvořeného AMP. A tak se zabrání nebezpečí hypoglykemie.

Nárokované vektory mají výhodně pro řízení in vivo fenomen indukce glukózy, produkce inzulínu v dané oblasti organismu, zejména v místě, kde je normálně sekretován portálním systémem. Infektované buňky jedním nebo více nárokovanými viry by mohly být také implantovány do jater krysy, slinivky břišní nebo střeva.

-5CZ 292564 B6

Předložený vynález také popisuje nový přístup pro léčení zejména problémů diabetických závislých na konzistentním inzulínu k indukování syntézy in vivo v odpovědi na fyziologický obsah glukózy.

V případě, kde transfektové buňky s vektorem podle vynálezu nemají tento fyziologický promotor glukózy, původce exprese heterologického genu jiného než inzulín se například může vytvořit následovně: koncentrace glukózy nebo koncentrace analogů majících stejný vliv na sekreci odpovídající glukóze (L4-L3), se upraví způsobem k indukci exprese proteinu prostřednictvím aktivity expresního signálu podle vynálezu. Je jasné, že tato koncentrace je určena funkcí kvantity v injektovaném vektoru povahou místa infekce a expresí v proteinu.

Jak bylo naznačeno, předložený vynález se soustředí zejména na použití viru, který je popsán pro přípravu farmaceutické kompozice, zvláště určené k léčení nebo/a prevenci nemocí spojených s hyperglykemií.

Předložený vynález se týká použití virů tak, že popisuje dále přípravu farmaceutické kompozice obsahující jeden nebo více rekombinantních defektních virů takových, které jsou dříve popsané. Farmaceutické kompozice mohou být formulovány z pohledu podávání cestou topikální, orální, parenterální, intranazální, intravenózní, intramuskulámí, na kůži, intraokulámě, transškárově, atd. Farmaceutické kompozice podle vynálezu obsahují farmaceutické vehikulum vhodné pro injektovatelnou formulaci. Může se jednat zvláště o sterilní roztoky, o roztoky izotonické nebo o látky suché, zejména lyofilizované, které se řídí podáním podle okolnosti. Sterilovaná voda nebo fyziologické sérum dovoluje složení roztoku injektovatelné.

Dávky defektních rekombinantních virů použitých pro injekci mohou být přizpůsobeny funkci různých parametrů zejména funkci virálního vektoru, způsobu použitého podávání týkající se patologie nebo délky zkoumaného podávání. Všeobecně rekombinantní viry podle vynálezu jsou formulovány a podávány ve formě dávek, pohybujících se mezi 10⁴ a 10¹⁴ pfu/ml, zejména 10⁶ až 10¹⁰ pfu/ml. Termín pfii (plque forming umit) odpovídá infekční schopnosti roztoku virů a je určen infekcí vhodné buněčné kultury a počtem plaků infektovaných buněk po 48 hodinách. Techniky pro určení velikosti pfu virálního roztoku jsou dobře zdokumentovány v literatuře. Kompozice podle vynálezu mohou obsahovat přímo produkující (tvůrčí) buňky z pohledu jejich implantace.

Následující příklady a obrázky blíže ilustrují vynález, aniž by však omezily v jakémkoliv směru rozsah vynálezu.

Legendy k obrázkům

Obrázek 1: Schéma posloupnosti elementů LI až L4 identifikovaných v promotoru genu L-PK a jejich spojovací proteiny.

Obrázek 2: Palindrom elementu L4.

Obrázek 3: Retrovirální plazmid pHSG(L4L3)4PKCAT a klony F6 A B8.

Obrázek 4: Určení množství aktivity CAT v buňkách mhaTUIF transformovaných klonem B8, funkce množství injektované glukózy.

Obrázek 5: Určení množství aktivity CAT v buňkách mhATIIIF transformovaných klonem B8 v různých časech inkubace.

Obrázek 6: Konstrukce plazmidů pHSG/PK-CAT a pHSG/AL-PK-CAT.

Obrázek 7: Indukce glukózou v různých dávkách vyjádření plazmidů pHSG/PK-CAT a pHSG/AL-PK-CAT.

-6CZ 292564 B6

Všeobecné techniky molekulární biologie

Klasické metody použité v molekulární biologii takové, jako extrakce přípravy plazmidové DNA, odstřeďování plazmidové DNA a gradientu chloridu ceznatého, elektroforéza na agarových gelech nebo akrylamidových, čištění fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinů fenolem nebo fenol-chloroformem, srážení DNA v prostředí šalinu ethanolem nebo izopropanolem, transformace v Escherichia coli atd. jsou dobře známé odborníky a jsou hojně popsány v literatuře (Maniatis T. et al., Molecular Cloning, a Laboratory anual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982. Ausubel F. M. et al. (eds), Current Protocols in Molecular »

Biology, John Wiley and Sons, New York, 1987).

I Plazmidy typu pBR322, pUC a fágy série Ml3 jsou komerčního původu (Bethesda Research Laboratoires).

Fragmenty DNA mohou být separovány podle jejich velikostí elektroforézou na agarovém gelu nebo na akrylamidu, extrahovány fenolem nebo směsí fenol-chloroform, sráženy ethanolem potom inkubovány v přítomnosti DNA-ligázy fágu T4 (Biolabs) podle doporučení dodavatele.

Plnění vystupujícího 5'konce může být uskutečněno Klenowým fragmentem DNA-polymerázy z Escherichia coli (Biolabs) podle specifikace dodavatele. Destrukce vystupujícího 3'konce je uskutečněna za přítomnosti DNA-polymerázy fágu T4 (Biolabs) podle doporučení výrobce. Destrukce vystupujícího 5'konce je uskutečněna působením nukleázy Sl.

Mutageneze řízená in vitro syntetickými oligodeoxynukleotidy může být provedena podle metody vyvinuté Taylorem et al. (Nuleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764) za použití soupravy distribuované Amershanem.

Enzymová amplifikace fragmentů DNA technikou řečenou PCR (Polymerase-catalysed Chain Reaction, Saiski R. K. et al., Science 230 (1985) 1350—1354, Mullis K. B. et Faloona F. A., Math. Enzym. 155 (1987) 335-350) může být provedena za použití DNA thermal cycler (Perkin Elmer Catus) podle specifikace výrobce.

Ověření sekvencí nukleotidů může být provedeno metodou vyvinutou Sengerem et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467) za použití soupravy distribuované Amershanem.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 Konstrukce retrovirálního vektoru

Všechny plazmidy jsou konstruovány podle standardních technik klonování DNA. Konstrukce plazmidu pHSG(L4L3)4-PKCAT, (uveden na obrázku 3), obsahuje konstruktivní část MMLV plazmidu pHSGNeo a sekvenci kódující gen CAT pod řízením promotoru krysího genu pyruvátkinázy typu L (bp -119 až +11) před nímž oligomemí fragmenty L4L3 4 krát (GIRE a místo vazby NHF4) jsou svázány. Fragment L4L3, odpovídající fragmentu vymezenému mezi pb -172 až-123 před místem iniciace transkripce L-PK byl získán PCR. Použitá signální sekvence polyA je přítomna v LIR na 3'konci MMLV. Plazmid pHSGNeo (Gruid et al. J. Virol. 1988,62,3795— 3801), retrovirální plazmid odvozený od MMLV, psi-CRIP, amfotropická komplementární buněčná kultura, která přináší strukturní proteiny MMLV, byly opatřené Dr. A. Weberem (Institut Cochin de Genetigue Moleculaire, Paříž), plazmid pRSVNeo, ve kterém gen aminoglykosidfosfotransferázy je pod kontrolou promotoru LTR RSV, byl použit pro kotransfekci.

-7CZ 292564 B6

Příklad 2 Buněčná kultura a transfekce

Buňky mhATIHF jsou buňkami nádorové tkáně myších jater exprimující geny prekoků SV40 pod řízením promotoru specifického antitrombinu EU jater (ATIII-SV40) (Kahn A. et al. Exp. Cell.

Res., 200, 175-185). Tyto buňky jsou kultivovány v živném prostředí DMEM F12/NUT.MIX.

(1:1 obj./obj.) s přídavkem glutamax-1 nebo DMEM/HamF12 (1:1 obj./obj.) (Gibco-BRL) sD+glukózou (Sigma) nebo bez jejího přídavku, doplněném ΙμΜ dexamethasonu, ΙμΜ Triodothyroninu, 20nM lidského inzulínu, 5 % (obj./obj.) SVF. Buňky NIH3T3 a psi-CRIP jsou kultivovány v: DMEM (5,5 mM glykózy, 1,0 mM pyruvátu sodného) doplněné 10 % (obj ./obj.) 10 telecího séra. Do tohoto prostředí se přidá ampicilin, streptomycin a glutamin a buňky se inkubují při 37 °C s 5 % (obj./obj.) CO2. Buňky psi-CRIP se kotransfektují s plazmidem pHSG (L3L4)4PKCAT a pRSV Neo (molámí poměr obou plazmidů byl 10:1) metodou kationického lipozomu (DOTAP, Boeringer Mannheim) a šlechtí v přítomnosti G418 (800 pg/ml). Klony rezistentní k G418 se oddělí pro test produkce retrovirů.

Příklad 3 Příprava virální RNA a PCR-RTZ v jedné etapě

Buněčné klony rezistentní k G418 se naočkují do 90mm nádobky a kultivují až do 100% spojení. 20 Plavající povrch buněčné kultury se filtruje na membráně, která má póry o velikosti 0,22 pm, inkubuje s DNasou 1(10 pg/ml) při 37 °C během 30 minut, potom odstředí při 65000 rpm během minut při 4 °C. Retrovirální RNA se extrahuje a čistí od usazeniny po srážení proteinázou K a směs fenol/chloroform potom společně vysráží tRNA. Vzorek se rozpustí v dithylpyrokarbonu ve směsi s vodou, směs obsahuje ještě 1 mM dithiothretolu (DTT), 40 U RNAsin/100 pm, pak se 25 podrobí reverzní transkriptáze a PCR zároveň. Pro amplifikaci se použijí dvě následující sondy:

- 5'ACTCAAATGCCCAATGAAGTC 3'(SEQ IDN°7), odpovídající oblasti Gag MMLV (pb 1524 až 1544),

- 5'TCAACGGTGGTATATCCAGAT3'(SEQIDN^O8), odpovídající oblasti kódující gen 30 CAT (pb 53 až 15 se vztahují k místu iniciace překladu genu)

Inverzní transkripce od antimediátorové sondy PCR se katalyzuje inverzní transkriptázou 8U AMV (Promega) během 1 hodiny při teplotě 42 °C a následuje PCR s DNA-polymerázou Taq25U, ta se uskuteční v 35 až 40 cyklech. Zvětšený fragment je dlouhý 440 pb a obsahuje část 35 genu gag, 4 opakující se motivy L3L4, promotor -119 L-PK a 65 pb genu CAT. Je-li nutné, fragmenty se klonují a sekvenují.

Příklad 4 Produkce rekombinantních retrovirů

Retrovirální vektoiy pHSG(L4L3)4-119PKCAT a pRSVNeo jsou použity pro kontransfekci buněčné kultury psi-CRIP. Je analyzováno 70 klonů rezistentních kG418. 8 pozitivních klonů v RT-PCR prokazuje schopnost produkce infektovaných rekombinantních retrovirů, tyto klony jsou určeny PCR specifickým fragmentem vzhledem k genomické DNA buněk NIH3T3. Jasně se 45 ukázalo, že produkce retrovirů je specifická u následujících dvou klonů.

- klon F6 (5.10⁴) infektovaného retrovirů, produkt retrovirů s oblastí signální sekvence (4 opakující se fragmenty L4L3 (obrázek 3))

- klon B8 (2.10⁵) se signální sekvencí částečně deletovaný (jeden celý motiv L4L3 nebo malá 50 část druhého motivu L3 (obrázek 3)).

Čistota retrovirů se určí semikvantitativní PCR-RT používající pHSG(L4L3)4199PKCAT jako standard.

-8CZ 292564 B6

Příklad 5 Infekce rekombinantními retroviry, stanovení čistoty retrovirů a dávkování proteinu

CAT

Pozitivní klony se použijí pro infekci buněk NIH3T3, aby se odhadla schopnost infekce retrovirů.

ml plavajícího povrchu buněčné kultury 100% spojené se použije pro infekci buněk NIH3T3 v logaritmické fázi růstu s 8 pg/ml polybrenu. Po třech hodinách inkubace se polybren v prostředí zředí na 2 pg/ml a kultura se nechá se ještě 48 hodin inkubovat. Genomická DNA infektovaných buněk NIH3T3 se extrahuje a použije pro amplifikaci PCR za použití sond popsaných v příkladu 3. detekce specifického fragmentu dokazuje integraci retrovirálních sekvencí v genomu infektovaných buněk. Čistota se určí množstvím DNA vznikající zgenomické DNA infektovaných buněk s různým zředěním retrovirů (10² až 10⁶ molekul). Klony, které jsou produkovány infektovanými viry, jsou společně inkubovány s buňkami mhATIHF podle následujícího protokolu:

- do 90mm nádobky se umístí 60mm nádobka, jejíž základna byla odstraněna, stěny se napustí silikovaným olejem, prostor se tak rozdělí na dvě části,

- do centra se vloží buňky mhAlIUF, buňky produkující retrovirus se vloží do okrajního prostoru, a tak se nesmísí tyto dva typy buněk,

- když se buňky dobře fixují v nádobce po šesti hodinách inkubace, malá nádobka se vyjme. Prostředí se tak změní pro novou 16hodinovou inkubaci, potom se přidá 8 pg polybrenu a buňky se kultivují dalších 48 hodin.

- Aktivita CAT se měří chromatograficky na tenké vrstvě a kvantifikuje v cpm scintilací.

Příklad 6 Indukce globusu v dávkách a různých časech exprese

Buňky mhATHIT přirovnatelné k hepatocytům u krys, udržují svou schopnost odpovídat glukóze transkripcionální aktivaci genu L-PK a jsou tak přizpůsobeny pro testování odpovědi transgenu CAT, transferovaného retrovirálním vektorem v důsledku aktivity L-PK GIRE v retrovirálním prostředí.

Pro zvětšení účinnosti transfekce, buňky mhATIHF se kultivují dvakrát s buňkami produkujícími retroviry to vede k uspokojivému stupni infekce s klonem B8. Jak je ukázáno na obrázcích 4 a 5, exprese transgenu L-PK/CAT v infektovaných buňkách mhATHIF je dobře indukována glukózou. Poloviční maximální indukce se získá pro koncentraci 3-4 mM glukózy a maximální indukce pro 8 mM glukózy. Pro vyšší koncentrace glukózy aktivita CAT zůstává relativně stabilní.

Buňky mhATHIF se kultivují v prostředí obsahujícím 17 mM glukózy, indukce genu je pozorována od osmé hodiny inkubace, poloviční indukce před 24 hodinou a maximální indukce ve 48 hodině.

Příklad 7 Konstrukce plazmidů HSGZPK-CAT a pHSG/AL-PK-CAT

Plazmidy jsou konstruovány podle standardních technik klonování ADN. Spojení se ověřuje sekvenováním DNA. Konstrukce plazmidů pHSG/PK-CAT obsahuje část MMLV pHSG umístěné mezi nukleotidy od 1 do 2015 a od 3888 do 4445, pro plazmid pHSG/AL-PK-CAT, sekvence MMLV jsou umístěny mezi nukleotidy od 1 do 2015 a od 4290 do 4847 (obrázek 6). Sekvence kódující gen CAT pod kontrolou promotoru krysího genu pyruvátkinázy typu L (-183 až +11 bp) je umístěna mezi nukleotidy 2048 až 3033 pro plazmid pHSG/PK-CAT a mezi 2450 až 3435 pro plazmid pHSG/AL-PK-CAT. Sekvence fragmentu genu aldokázy B (SEQ ID N°6)

-9CZ 292564 B6 je situována mezi nukleotidy 2035 a 2437 vplazmidu pHSG/AL-PK-CAT. Použité signální sekvence póly A je sekvence SV40 umístěna mezi nukleotidy 3033 a 3873 v pHSG/PK-CAT.

Nukleotidy od 2015 do 2048, 2242 do 2452 a 3873 do 3888 jsou adaptéry mezi různými fragmenty pro plazmid pHSG/PK-CAT, jsou situovány pro plazmid pHSG/AL-PK-CAT od

2015 do 2035,2435 do 2450,2544 do 2654 a 4275 do 4290.

Příklad 8 Indukce glukózou v různých dávkách exprese plazmidů pHSG/PK-CAT a pHSG/ALPK-CAT

Buňky mhAT3F pocházejí zjatemího myšího nádoru a exprimují geny SV40 pod kontrolou promotoru specifického antitrombinu ΙΠ jater (Kahn A. et al. Exp, Cell, Res., 200, 175-185). Tyto buňky se kultivují při teplotě 37 °C s 5% (obj./obj.) CO2 v živém prostředí DMEM F12/NUT.MIX. (1:1 obj./obj.) s glutamaxem-1 (Gibco-BRL) s přídavkem G-glukózy (Sigma) 15 nebo bez tohoto přídavku, doplněné 1 μΜ dexamethasonu, 1 μΜ triodothironinu a 20 nM lidského inzulínu. 5 μg plazmidů pHSG/PK-CAT nebo plazmidů pHSG/AL-PK-CAT se transfektuje metodou kationického liposomu (DOPAP, Boehringer Mannheim). Buňky se následně kultivují v přítomnosti různých koncentrací glukózy během 24 hodin za účelem indukce promotoru PK-1. Aktivita CAT se měří chromatograficky na tenké vrstvě a kvantifikuje v jednotkách 20 cpm scintilací. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 7. Po 24 hodinách indukce v přítomnosti různých koncentrací glukózy je exprese plazmidů pHSG/PK-L v přítomnosti promotoru aldolázy B pětkrát silnější v přítomnosti 8 mM glukózy, než indukce plazmidů bez promotoru aldolázy B.

Promotor hybridu aldolázy B/PK-L je tak zvláště výhodný při porovnání s genem pro zvýšení 25 exprese, zůstává citlivý na glukózu, je tedy výhodný zejména v oblasti vývoje metody genetické terapie diabetů zaměřené na produkci vhodné koncentrace inzulínu in vivo, zejména při glykemii.

Seznam sekvencí (1) Všeobecné informace:

(i) přihlašovatel:

(A) Jméno: INSERM (B) Ulice: 101, Rue de Tolbiac (C) Město: Paříž (D) Země: Francie (E) Směrovací číslo: 75654 Paříž Cedexl3 (ii) název vynálezu:

(iii) počet sekvencí: 8 (iv) způsob luštění počítačem:

(A) Typ nosiče: tápe (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) systém využití: PC-DOS/MS-DOS (D) logika: Patenťln Relase #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 194 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jednoduchý (D) konfigurace: lineární:

-10CZ 292564 B6 (ii) typ molekuly: DNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (iv) popis sekvence: SEQ ID NO 1:

GATCCAGCAG	CATGGGCGCA	CGGGGCACTC	CCGTGGTTCC	TGGACTCTGG	50
CCCCCAGTGT	ACAAGGCTTC	CGTTGGCAAG	AGAGATGCTA	GCTGGTTATA	100
CTTTAACCAG	GACTCATCTC	ATCTGAGCCA	GGCCCCATCC	CACTGACAAA	150
GGCGCAGTAT	AAAGCAGACC	CACAGACACA GCAGGTAAGC AACG	194

(2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 24 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jednoduchý (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: DNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

GCGCACGGGG CACTCCCGTG GTTC 24 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 3:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 19 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jednoduchý (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: protein (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

CTGGACTCTG GCCCCCAGT 19 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 4:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 129 párů bází

-11CZ 292564 B6 (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jednoduchý (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: DNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

GGCTTCCGTT GGCAAGAGAG ATGCTAGCTG GTTATACTTT AACCAGGACT 50

CATCTCATCT GAGCCAGGGC CATCCCACTG ACAAAGGCGC AGTATAAAGC 100

AGACCCACAG ACACAGGAGG TAAGCAACG 129 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 5:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 416 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jednoduchý (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: DNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorový: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

TCCTTCTGCC	ATGGCCCTGT	GGATGCGCCT	CCTGCCCCTG	CTGGCGCTGC	50
TGGCCCTCTG	GGGACCTGAC	CCAGCCGCAG	CCTTTGTGAA	CCAACACCTG	100
TGCGGCTCAC	ACCTGGTGGA	AGCTCTCTAC	CTAGTGTGCG	GGGAACGAGG	150
CTTCTTCTAC	ACACCCAAGA	CCCGCCGGGA	GGCAGAGGAC	CTGCAGGTGG	200
GGCAGGTGGA	GGTGGGCGGG	GGGCCTGGTG	CAGGGAGCCT	GCAGCCCTTG	250
GCCCTGGAGG	GGTCCCTGCA	GAAGCGTGGC	ATTGTGGAAC	AATGCTGTAC	300
CAGCATCTGC	TCCGTCTACC	AGCTGGAGAA	CTACTGCAAC	TAGACGCAGC	350
CCGCAGGCAG	CCCCCCACCC	GCCGCCTCCT	GCACCGAGAG	AGARGGAATA	400
AAGCCCTTGA	ACCAGC				416

(2) Informace pro sekvenci SEQ Π) NO: 6: 30 (i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 464 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jednoduchý (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: DNA

-12CZ 292564 B6 (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ LD NO: 6:

AGGCCTCCAC	ACTCTAATTGC	ACTCTGCAGA	AGTAACACTA	GAGTGACCTT	50
TCTTTAGATT	TAGAAAGACT	AACACATAAT	ATATTGCTGT	AATTTCTTTT	100
GTAGTTTTTT	AAGTAGGACA	ATAAATATTT	ATTACAGATT	TCTCTGGAAG	150
TTTTTCATTT	GATAATTAAT	GAAAATTTTC	CATCATACTT	GTAAAAATGA	200
AGTGACTTGG	GACCTTAGAA	ATCAGAAGTT	TAAAGGAGTA	AAGTTCATTA	250
TTGTTAAGTA	TTCCAGGCTG	TGTTCTGTCT	CCCGTGACA	AACATTGACC	300
TGTGACTCTG	TTTTATGATT	AACTGAGGGG	CAAAATTTGT	GCTGATGTGG	350
TACAGACCTT	TAGTCCCTTT	GTAGAAGTTT	AACTTCCTGT	AAACAGGACG	400
ÁGTTTGACTT	GACTTTTCCC	TGTAATTCTT	GTTGAGTTGG	CATACCCAGA	450
ATGGAGCAAA	TGGC				464

(2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 7:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 21 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jednoduchý (D) konfigurace: lineární:

(ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

ACTCAAATGC CCAATGAAGT C (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 8:

(i) charakteristika sekvence:

(ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: NE (iii) antimediátorová: NE (xi) popis sekvence: SEQ ED NO: 8:

TCAACGGTGG TATATCCAGA T

-13CZ 292564 B6

Claims

5 PATENTOVÉ NÁROKY

I. Replikačně defektní rekombinantní virus obsahující alespoň jeden heterologický gen pod kontrolou expresního signálu indukovatelného glukózou, kterýžto signál obsahuje celý nebo část ¹ ío promotoru genu kódujícího pyruvátkinázu typu L (L-PK).

i
2. Virus podle nároku 1, kde expresní signál je odvozen z celého nebo z části 183pb fragmentu umístěného na 5'konci genu kódujícího L-PK.

15
3. Virus podle nároku 1 nebo 2, kde expresní signál obsahuje celou nebo část sekvence

SEQIDN°1.
4. Virus podle jednoho z předchozích nároků, kde expresní signál obsahuje alespoň element L4 promotoru genu kódujícího L-PK.
5. Virus podle nároku 4, kde element L4 je reprezentovaný zcela nebo částečně sekvencí SEQ ID N°2, sekvencí hybridizující s celou nebo částí této sekvence nebo sekvencí z ní odvozené, která je schopná interakce s faktorem MLTF/USF.

25
6. Virus podle nároku 4 nebo 5, kde element L4 se opakuje ve formě 4 oligomerů po sobě jdoucích v expresním signálu.
7. Virus podle jednoho z nároků 5 až 6, který dále obsahuje element L3 promotoru genu kódujícího L-PK.
8. Virus podle nároku 7, kde element L3 je reprezentován úplně nebo částečně sekvencí SEQIDN^O3, sekvencí hybridizující scelou nebo sčástí této sekvence nebo sekvencí zní odvozenou, která je schopná interagovat s faktorem HNF 4.

35
9. Virus podle jednoho z předchozích nároků, kde expresní signál obsahuje element L4 promotoru genu kódujícího L-PK fúzovaný před elementem L3 stejného promotoru, takže vytvářejí oligomer L4-L3.
10. Virus podle nároku 9, kde expresní signál obsahuje 4 oligomery následující L4-L3.

II. Virus podle jednoho z předchozích nároků, kde expresní signál obsahuje mimoto minimální promotor.
12. Virus podle nároku 11, kde promotor výhodně obsahuje sekvenci odpovídající fragmentu ¹ 45 -119 až 11 umístěného na 5'konci genu kódujícího L-PK.
13. Virus podle jednoho z předchozích nároků, kde signál exprese je reprezentován SEQ ID N°4 nebo jedním z jejich derivátů.

50
14. Virus podle jednoho z předchozích nároků, kde signál exprese obsahuje mimoto transkripční promotor.
15. Virus podle nároku 14, kde transkripční promotor pochází z prvního intronu genu aldolázy B myši.

-14CZ 292564 B6
16. Virus podle nároků 1 až 15, který je zbaven oblastí svého genomu, které jsou nutné pro replikaci v cílové buňce.
17. Virus podle nároků 1 až 16, kterým je adenovirus.
18. Virus podle nároku 17, kterým je lidský adenovirus typu Ad 2 nebo Ad 5 nebo psí adenovirus typu CAV-2.
19. Virus podle nároků 1 až 16, kterým je retrovirus.
20. Virus podle nároku 19, kterým je retrovirus rodu MoMuLV.
21. Virus podle jednoho z předchozích nároků, kde heterologický gen kóduje inzulín nebo jeho varianty.
22. Použití viru podle nároků 1 až 21 pro přípravu farmaceutické kompozice určené k léčení nebo/a prevenci nemocí související s hyperglykemií.
23. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje jeden nebo více defektních rekombinantních virů podle nároků 1 až 21.
24. Farmaceutická kompozice podle nároku 23, vyznačující se tím, že je v injikovatelné formě.
25. Farmaceutická kompozice podle nároku 23 nebo 24, vyznačující se tím, že obsahuje mezi 10⁴ a 10¹⁴ pfu/ml, výhodně 10⁶ až 1O¹⁰ pfu/ml defektního rekombinantního adenoviru.
26. Savčí buňka infikovaná jedním nebo více defektními rekombinantními viry podle nároků 1 až21.
27. Buňka podle nároku 26, která je lidská buňka.
28. Buňka podle nároku 27, která je hepatocyt nebo β pankreatická buňka.