SK137797A3 - Recombinant viral vector, pharmaceutical composition containing the same and corresponding transformed cells - Google Patents

Recombinant viral vector, pharmaceutical composition containing the same and corresponding transformed cells Download PDF

Info

Publication number
SK137797A3
SK137797A3 SK1377-97A SK137797A SK137797A3 SK 137797 A3 SK137797 A3 SK 137797A3 SK 137797 A SK137797 A SK 137797A SK 137797 A3 SK137797 A3 SK 137797A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
virus according
sequence
promoter
expression signal
virus
Prior art date
Application number
SK1377-97A
Other languages
English (en)
Inventor
Ruihuan Chen
Bruno Doiron
Axel Kahn
Original Assignee
Inst Nat Sante Rech Med
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Nat Sante Rech Med filed Critical Inst Nat Sante Rech Med
Publication of SK137797A3 publication Critical patent/SK137797A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka rekombinantných vektorov vírusového pôvodu, prípravy týchto vektorov, farmaceutickej kompozície obsahujúcej tieto vektory a ich terapeutického použitia, predovšetkým v génovej terapii a na liečenie alebo/a prevenciu hyperglykémie.
Doterajší stav techniky
Génová terapia spočíva v korekcii zníženej schopnosti alebo anomálie (mutácia, aberantná expresia atď.) vložením genetickej informácie do bunky alebo postihnutého orgánu. Táto genetická informácia môže byť vložená, dajme tomu, in vitro do bunky extrahovanej z organizmu, modifikovaná bunka sa potom zavedie opäť. do organizmu, priamo do vhodného tkaniva in vivo. Boli popísané rôzne techniky na vkladanie tejto genetickej informácie. Rôzne techniky transfekcie zahŕňajú komplexy DNA a DEAE-dextrán (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), DNA a jadrové proteíny (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375),
DNA a lipidy (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), použitie lipozómov (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), atď. .
Použitie vírusov ako vektorov na prenos génov sa ukázalo ako sl'ubná alternatíva k týmto fyzikálnym technikám transfekcie. V tomto ohľade boli testované rôzne vírusy na schopnosť infikovať určitú populáciu buniek. Obzvlášť retrovírusy (RSV, HMS, MMS atď.), vírus HSV a adenovírusy.
Podstata vynálezu
Predložený vynález sa vzťahuje predovšetkým na nové vírusové vektory na liečenie hypoglykémie ako je diabetes.
Diabetes je syndróm obvykle chronický, ktorého najcharakteristickejší symptóm je hyperglykémia, v neprítomnosti zvýšenia renálneho prahu pre glukózu, glykozúria. Principiálnou príčinou je absolútny alebo relatívny nedostatok inzulínu majúci za následok anomáliu nielen metabolizmu uhľovodíkov, ale tiež bielkovín a tukov.
Diabetes je všeobecne liečená podávaním inzulínu, táto liečba však pacienta silne obmedzuje.
Predložený vynález sa týka vektorov vírusového pôvodu dovoľujúcich nahradiť túto dezorganizáciu metabolizmu glukózy v organizme obnovením vhodného spôsobu riadenia koncentrácie inzulínu in vivo.
Je známe, že glukóza je faktorom regulácie transkripcie génov vo väčšine živých organizmov. Predovšetkým sa ukázalo, že glukóza je schopná stimulovať transkripciu kódovaného génu pre glykolytické enzýmy a lipogenické enzýmy v hepatocytoch a adipocytoch ako napríklad gén pyruvátkinázy typu L, špecifický tkanivový glykolytický enzým, ktorý hrá dôležitú úlohu v regulácii glykolýzy a glukoneogenézy v pečeni. Expresia proteínu L-PK v pečeni je pod potravinovou a hormonálnou kontrolou. Je indukovaný diétou bohatou na glukózu a naopak inhibovaný stratou glukózy a objavuje sa u diabetikov. Vie sa tiež, že expresiou svojho génu je pozitívne regulovaný dvojicou glukóza/inzulín a negatívne glukagónom prostredníctvom svojho druhého prenášača cyklického cAMP (A. Kahn, J.Bio.Chem. 264, (1989) , 11584-11590) .
Nedávno boli charakterizované rôzne väzobné miesta (prvky
Ll až L4) odpovede na promótorom J.Mol.Biol.
pre faktory transkripcie a obzvlášť elementu obsah glukóza/inzulín alebo GIRE v oblasti pred génu tohto enzýmu L-PK (A. Kahn et al.,
209, (1989), 205-219). Promótor bol tiež identifikovaný v zmysle 3' až 5' od TATA boxu, element Ll, väzobné miesto pre nukleárny faktor 1 hepatocytu (HNF1), element L2, väzobné miesto pre nukleárny faktor 1 (NF1), element L3, väzobné miesto pre nukleárny faktor 4 hepatocytov (HNF4) a element L4, väzobné miesto pre transkripčný faktor (MLFT)/USF (Obrázok 1). Špecifický element odpovede na glukóza/inzulín bol presne lokalizovaný v géne kódujúcom L-PK vo forme perfektného palindrómu medzi nukleotidmi -168 až -144 od miesta cap, dajme tomu v elemente L4 (Obrázok 2). Element GIRE sa javí ako schopný udeliť transkripčnú odpoveď na glukózu k minimálnemu promótoru L-PK, ktorý je tvorený TATA a elementom L1.
Jasne sa ukázalo, že je možné zhodnotiť schopnosť elementu GIRE, k odpovedi na glukózu vo vírusovom kontexte pre modulovanie expresie zainteresovaného proteínu v génovej terapii.
Predložený vynález sa vzťahuje na defektné rekombinantné vírusy, obsahujúce aspoň heterológny gén pod riadením expresívneho signálu indukovaného glukózou alebo jej analógmi.
Analógy glukózy sú všetky zlúčeniny predstavujúce štruktúrnu homológiu s glukózou a sú schopné indukovať aktiváciu expresného signálu. Vhodnými analógmi, ktoré boli použité podľa predloženého vynálezu sú predovšetkým fruktóza, galaktóza, cukróza, laktóza a všetky cukry, ktoré môžu byť hydrolyzované na tieto zložky.
V zmysle predloženého vynálezu expresný signál indukovateľný glukózou pokrýva všetky sekvencie expresného signálu, jeho aktivácia, ktorá podmieňuje subsekvenčnú transkripciu heterológneho génu, je obzvlášť indukovaná v prítomnosti glukózy alebo ich analógov.
Jedná sa predovšetkým o rekombinantný defektný vírus, v ktorom expresia heterologického génu je umiestnená pod riadením expresného signálu odvodeného úplne alebo čiastočne od promótora génu kódujúceho pyruvátkinázu typu L, L-PK. Tento expresný signál odvodzuje celok alebo časť fragmentu obsahujúceho 183 bp umiestneného na 5' konci kódovaného génu kódujúceho L-PK.
Expresný signál podľa vynálezu obsahuje celú alebo časť. sekvencie SEQ ID N° 1.
Podľa spôsobu preferovanej realizácie expresný signál obsahuje celok alebo časť elementu L4 tohto promótora.
Element L4 je obzvlášť predstavovaný úplne alebo čiastočne sekvenciou ISEQ ID N° 2, sekvenciou hybridizujúcu s časťou alebo celkom tejto sekvencie alebo sekvenciou, ktorá je od nej odvodená a schopnou vstúpiť do interakcie s faktorom MLTF/USF.
V zmysle predloženého vynálezu sa očakáva, že odvodením všetkých sekvencií získaných jednou alebo viacerými modifikáciami si tieto sekvencie zachovávajú aspoň jednu z biologických vlastností pôvodnej sekvencie a predovšetkým svoju schopnosť vstúpiť do interakcie so svojím alebo svojimi faktorom (faktormi) a vytvoriť špecifické väzby, v tomto prípade vytvárané sa ide o faktor MLTF/USF. Modifikáciou sa rozumie všetky mutácie, substitúcie, delécie, adície alebo modifikácie povahy genetickej alebo/a chemickej. Tieto modifikácie môžu byť uskutočňované známymi technikami.
V obmene vynálezu element L4 je opakovaný vo forme štyroch súvislých oligomérov v expresnom signále.
Podľa vynálezu expresný signál obsahuje okrem častice L4 celok alebo časť elementu L3 promótora génu kódujúceho L-PK.
Ukázalo sa, že element L3 prispieva k lepšej účinnosti elementu L4. (A. Kahn, et al. Nucleic Acids Research 20, (1992) , N° 8 pl871) . Element L3 predstavuje čiastočnú alebo úplnú sekvenciu SEQ ID N° 3, sekvenciu hybridizujúcu s časťou alebo celkom danej sekvencie alebo sekvencie, ktorá je od nej odvodená, schopná interagovať s faktorom HNF 4.
Podlá spôsobu preferovanej realizácie expresný signál obsahuje element L4 promótora génu kódujúceho L-PK, naväzujúci sa pred elementom L3 rovnakého promótora. Je tak popísaný ako L4-L3. Expresný signál podľa vynálezu obsahuje 4 súvislé oligoméry L4-L3.
Tento expresný signál obsahuje okrem toho takzvaný minimálny promótor.
V zmysle predloženého vynálezu minimálny promótor označuje všetky iniciačné sekvencie, ktoré samé nie sú schopné účinne zaistiť transkripciu heterológnej sekvencie, ktorá mu je pridružená. Aktivita takéhoto promótora sa javí úplne závislá od aktivácie elementu zodpovedajúceho glukóze Minimálny promótor má hlavnú funkciu zameranú na transkripciu. V tejto perspektíve je obzvlášť umiestnený v mieste cap heterológnej sekvencie, a tak vytvára kontinuálnu nukleotidovú sekvenciu.
Podľa vynálezu je tiež možné použitie minimálneho promótora odvodeného od konvenčného promótora, ako napríklad promótor aktivujúci transkripciu génu typu tymidínkináza, chloramfenikolacetyltransferáza, β-galaktozidáza alebo luciferáza alebo odvodeného od promótora génu kódujúceho pyruvátkinázu typu L. Tento minimálny promótor môže byť odvodený od ľudského CMV. V prípade potreby takýto promótor môže byť minimálny .
Podľa rovnakého princípu minimálny promótor môže byť odvodený od prirodzeného promótora zodpovedajúceho expresii zainteresovaného heterologického génu.
Názov minimálny promótor bol úspešne · použitý podľa vynálezu pre sekvenciu zodpovedajúcu fragmentu -119 až 11 umiestnenú na 5' konci génu kódujúceho L-PK.
Všeobecne tento minimálny promótor je umiestnený na mieste cap nukleotidovej sekvencie, v ktorej riadi expresiu svojho prírodného promótora. Vlastný promótor nukleovej kyseliny môže naozaj zostať prítomný, ale v inaktívnej forme alebo zbavený funkcie rôznymi známymi technikami, predovšetkým deléciou alebo/a adíciou jednej alebo viacerých báz.
Expresný signál odpovedá SEQ ID N° 4 alebo jednej z jej úplne alebo čiastočne sekvencií derivátov.
promótora), charakteru.
Iniciačná oblasť môže byť modifikovaná adíciou aktivačnej sekvencie alebo reguláciou (predovšetkým sekvenciou dovoľujúcou zväčšiť silu promótora induktívneho S cieľom vylepšovať silu promótora sa vytvorí hybridný vektor, v ktorom promótor 183 bp génu PK-L sa nachádza pred fragmentom 402 bp lokalizovanom v prvom intróne génu krysej aldolázy B od nukleotidu 1920 k nukleotidu 2321 v mieste iniciácie transkripcie (SEQ ID N° 6 zodpovedajúca nukleotidom 1915 až 2379). Prezentované výsledky v tomto príklade ukazujú, že táto konštrukcia zvyšuje expresiu génu faktora 5, v odpovedi na glukózu.
Čo sa týka sekvencie heterológnych nukleových kyselín umiestnených pod kontrolou expresného signálu podľa vynálezu obsahuje táto sekvencia jeden alebo viac terapeutických génov, ktorého prenos alebo/a expresia v bunke, orgáne alebo organizme sa skúma.
Terapeutické gény, ktoré môžu byť tiež prenášané, sú všetky gény, ktorých transkripcia a eventuálne transdukcia v cieľovej bunke vytvára produkty majúce terapeutický efekt.
Môže sa obzvlášť jednať o gény kódujúce proteínové produkty, majúce terapeutický efekt. Proteínové produkty tiež kódujú protein, peptid, aminokyselinu atď.. Tieto proteínové produkty môžu byť homologické voči, cieľovým bunkám (môže sa povedať produkt, ktorý je normálne vyjadrený v cieľovej bunke, ktorý nereprezentuje žiadnu patológiu). V tom prípade expresia proteínu napríklad zmierňuje nedostatočnú expresiu v bunke alebo dovoľuje expresiu inaktívneho proteínu alebo slabo aktívneho vzhľadom na modifikáciu, alebo exprimovať vyššie uvedený protein. Terapeutický gén môže tiež kódovať mutantný bunkový protein majúci stabilitu, modifikovanú aktivitu atď. . Proteínové produkty môžu byť heterologické voči cieľovej bunke. V tom prípade vyjadrený protein môže napríklad doplniť alebo niesť aktivitu so zníženou schopnosťou do bunky dovoľujúcou bojovať proti patológii.
Medzi terapeutické produkty v zmysle predloženého vynálezu môžeme zaradiť predovšetkým enzýmy, krvné deriváty, hormóny ako je inzulín, lymfokíny: interleukíny, interferóny, TNF atď. (FR 9203120), rastové faktory alebo ich prekurzory alebo enzýmy syntézy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 atď., apolipoproteíny: ApoAI, ApoAIV, ApoE atď. (FR 93 05125), dystrofín alebo minidystrofín (FR 91 11947) atď..
Podľa obmeny vynálezu heterologická sekvencia obsahuje aspoň gén kódujúci inzulín alebo obmenu inzulínu. V zmysle vynálezu obmena pokrýva predovšetkým rôzne formy maturácie inzulínu ako napríklad proinzulín (Vollenweider et al., J.Biol.Chem. 267, (1992) 14629-14636 a Groskreutz et al. ,
J.Biol.Chem. 269, (1994), 6241-6245).
Gén kódujúci inzulín prítomný vo vektore podľa vynálezu obsahuje celok alebo časť sekvencie SEQ ID N° 5.
Vektory podľa vynálezu môžu byť pripravené z rôznych typov vírusov. Predovšetkým sa používajú vektory odvodené od adenovírusov alebo retrovírusov.
Vírusy podľa vynálezu sú defektné, môže sa povedať, že sú neschopné sa replikovať autonómnym spôsobom v cieľovej bunke. Všeobecne, genóm defektného vírusu použitého v oblasti predloženého vynálezu je' tak zbavený aspoň jednej sekvencie nutnej na replikáciu vyššie uvedeného vírusu v infikovanej bunke.
Tieto oblasti môžu byť vylúčené (úplne alebo čiastočne), zbavené funkcií, substituované ďalšími sekvenciami, a to predovšetkým sekvenciami DNA kódujúcimi gén ako napríklad gén inzulínu. Defektný vírus si zachováva sekvenciu svojho genómu, ktorá je nevyhnutná na kapsidáciu vírusových častíc.
Bol charakterizovaný účinný adenovírus a rôzne sérotypy, ktorých štruktúra a vlastnosti boli rôzne. Medzi týmito sérotypmi sa s výhodou používajú v oblasti predloženého vynálezu l'udské adenovírusy typu 2 alebo 5 (Ad 2 alebo Ad 5) alebo adenovírusy zvieracieho pôvodu (viď FR 93 05954). Medzi adenovírusy zvieracieho pôvodu použité v rámci predloženého vynálezu sa môžu citovať. adenovírusy pôvodu psieho, hovädzieho, myšieho (príklad Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčieho, prasačieho, vtáčieho alebo opičieho (príklad: SAV). Obzvlášť sa používajú adenovírusy zvieracieho pôvodu ako je adenovírus psí, obzvlášť, adenovírus CAV2 (napríklad kmeň manhattan alebo A26-61 (ATCC VR-800)). V rámci predloženého vynálezu sa obzvlášť, používa adeovírus pôvodu ľudského alebo psieho alebo zmiešaný.
Defektné adeovírusy vynálezu obsahujú ITR sekvencie dovoľujúce enkapsidáciu a sekvencie kódujúce terapeutický proteín. V genóme adenovírusu vynálezu gén E1 a gény E2, E4, L1-L5 sú nefunkčné. Vírusový gén môže byť. zbavený funkcií všetkými známymi technikami a obzvlášť totálnym zrušením substitúciou, · deléciou alebo adíciou jednej alebo viacerých báz v géne alebo skúmaných génoch. Takéto modifikácie môžu byť získané in vitro (na izolovanej DNA) alebo in vivo napríklad prostredníctvom techník genetickej povahy alebo pôsobením mutagénnych činiteľov. Defektné rekombinantné adenovírusy podľa vynálezu môžu byť. pripravené odborníkmi všetkými známymi technikami (Levrero et al., Gene 101 (1991), 195, EP 185 573, Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917).
Čo sa týka retrovírusov - konštrukcia rekombinantných vektorov bola široko popísaná v literatúre: viď predovšetkým Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203, EP 453242, EP
178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235, McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 atď.. Retrovírusy sú vírusy, ktoré infektujú selektívne bunky počas delenia. Genóm retrovírusov obsahuje obzvlášť dve LTR, sekvenciu kapsidácie a tri kódované oblasti (gag, pol a env) . V rekombinantných vektoroch odvodených od retrovírusov gény gag, pol a env sú všeobecne deletované úplne alebo čiastočne a nahradené sekvenciou heterologickej nukleovej kyseliny. Tieto vektory môžu byť tvorené z rôznych typov retrovírusov takých, ako sú predovšetkým MoMuLV (murine moloney leukémia vírus, tiež popísaný ako MoMLV), MSV (murine moloney sarcoma vírus), HaSV (harvey sarcoma virus), SNV (spleen necrosis vírus), RSV (rous sarcoma virus) alebo Friendov virus.
Pre konštrukciu rekombinantných retrovírusov je potrebný retrovírus obsahujúci zainteresovanú sekvenciu, plazmid obsahujúci predovšetkým LTR a sekvenciu kapsídácie. Vyššie uvedená zainteresovaná sekvencia je všeobecne vytvorená, potom použitá pre transfekciu vhodných buniek a tak pôsobiť na trans funkcie defektných retrovírusov v plazmide. Všeobecne pôvodcovia kapsidácie sú tak schopný exprimovať gény gag, pol a env. Potomstvo kapsidácie bolo popísané v pôvodných prácach a to predovšetkým PA317 (US4, 861,719), PsiCRIP (W090/02806) a GP+envAm-12 (W089/07150). Môžeme predovšetkým citovať bunkové psi-2, ktoré pochádzajú z NIH-3T3 (myšieho fibroblastu) transfekcie plazmidom pMOV-psi“, plazmid obsahujúci genóm vírusu myšej leukémie Moloney (MoMuLV), ktorého sekvencia enkapsidácie psi je deletovaná (Mann et al. , Celí, (1983), 33, 153-159). Z iného hľadiska rekombinantné retrovírusy môžu obsahovať modifikácie na úrovni LTR pre vyjadrenie transkripčnej aktivity tak, že sekvencia kapsidácie obsahuje časť génu gag (Bender et al., J.Virol. (1987) 61, 163 9) . Rekombinantné vírusy sú potom čistené klasickými technikami.
V prípade predloženého vynálezu retrovírusy môžu byť pripravené transfekciou retrovírusového plazmidu obsahujúceho expresný signál podľa vynálezu a dvojicu génu kódujúceho proteín v transkomplementárnych bunkách, ktoré dovolia produkciu vírusových častíc, ktorého transgén kóduje genóm.
Predložený vynález sa týka výhody použitia adenovírusov alebo rekombinantných defektných retrovírusov, retrovírusov, ktoré sú výhodné na exprimovanie inzulínu.
Podľa vynálezu expresia génu kódujúceho inzulín je pod kontrolou expresného signálu kontrolovaného glukózou a transfektujúce bunky in vivo pomocou tohto typu vektora indukujú produkciu inzulínu pod vplyvom svojho fyziologického glukózového promótora. Tieto bunky musia byť. schopné exprimovať transgén inzulínu za prítomnosti fyziologickej koncentrácie glukózy.
Podľa predloženého vynálezu transfektované bunky majú interný systém detekcie glukózy, popísaný senzorovým glukózovým vybavením, schopný indukovať aktiváciu expresného signálu. Určité typy buniek, ako sú napríklad hepatocyty a β bunky pankreasu majú túto schopnosť. Ide o systém špecifických enzýmov a zlúčenín, napríklad Glu-2-glukóza. Bunky bez tohto typu senzorového vybavenia môžu byť vybavené týmto systémom umelo. V tom prípade sú bunky pred aplikáciou vopred alebo súčasne s infektáciou vírusu podľa vynálezu transfektované pomocou genetickej konštrukcie určujúcej syntézu transportéra Glut-2 enzýmu glukokinázy.
Napríklad infekcia buniek hepatocytov rekombinantnými vírusmi podľa vynálezu môže byť realizovaná ex vivo alebo/a in vivo a transfektované bunky sú tiež schopné vylučovať inzulín. Miesta infekcie v oblasti predloženého vynálezu sú miesta prírodnej sekrécie inzulínu ako je krvné riečište.
Predložený vynález sa týka, predovšetkým cicavčích buniek, predovšetkým ľudských, a predovšetkým o hepatocytov alebo/a buniek β infikovaného pankreasu jedným alebo viacerými nárokovanými vírusmi.
Kapacita schopnosti indukcie expresie inzulínu in vivo pomocou vektora podľa vynálezu je výhodne regulovaná priamou blokádou tejto sekrécie pod vplyvom glukagónu a vytvoreného AMP. A tak sa zabráni nebezpečiu hypoglykémie.
Nárokované vektory majú výhodne na riadenie in vivo fenomén indukcie glukózy, produkcie v danej oblasti organizmu, najmä v mieste, kde je normálne sekretován portálnym systémom.
Infikované bunky jedným alebo viacerými nárokovanými vírusmi by mohli byť tiež implantované do pečene, krysy, pankreasu alebo čreva.
Predložený vynález tiež opisuje nový prístup pre liečenie predovšetkým diabetických problémov, závislých od konzistentného inzulínu pre indukciu syntézy in vivo inzulínu v odpovedi na fyziologický obsah glukózy.
V prípade, keď transfektované bunky s vektorom podľa vynálezu nemajú tento fyziologický promótor glukózy, iniciácia expresie heterologického génu iného než inzulín sa napríklad môže vytvoriť nasledovne: koncentrácia glukózy alebo koncentrácia analógov majúcich rovnaký vplyv na sekvenciu zodpovedajúcu glukóze (L4-L3) , sa upraví spôsobom k indukcii expresie proteínu prostredníctvom aktivity expresného signálu podľa vynálezu. Je jasné, že táto koncentrácia je určená funkciou kvantity injektovaného vektora, povahou miesta infekcie a expresnou rešeršou proteínu.
Ako bolo naznačené, predložený vynález sa zameriava najmä na použitie vírusu, ktorý je opísaný na prípravu farmaceutickej kompozície, určenej najmä na liečenie alebo/a prevenciu ochorení spojených s hyperglykémiou.
Predložený vynález sa týka použitia vírusov tak, že popisuje ďalej prípravu farmaceutickej kompozície obsahujúcej jeden alebo viac rekombinantných defektných vírusov takých, ktoré sú skôr popísané. Farmaceutické kompozície môžu byť formulované z pohľadu podávania cestou topickou, orálnou, parenterálnou, intranasálnou, intravenóznou, intramuskulárnou, subkutánne, intraokulárne, transdermicky atď.. Farmaceutická kompozícia podľa vynálezu obsahuje farmaceutické vehikulum vhodné na injektovatelnú formuláciu. Môže sa jednať obzvlášť o sterilné roztoky, o roztoky izotonické alebo o látky suché, predovšetkým lyofilizované, ktoré sa riadia podaním podľa okolností. Sterilizovaná voda alebo fyziologické sérum vytvára injekovatelné zloženie roztoku.
Dávky defektných rekombinantných vírusov použitých pre injekciu môžu byť prispôsobené funkcii rôznych parametrov, predovšetkým funkcii vírusového vektora, spôsobu použitého podávania týkajúci sa patológie alebo dĺžky skúmaného podávania. Všeobecne rekombinantné vírusy podľa vynálezu sú formulované a podávané vo forme dávok pohybujúce sa medzi 104 a 1014 pfu/ml, predovšetkým 10® až 101® pfu/ml. Termín pfu (plaque forming unit) odpovedá infekčnej schopnosti roztoku vírusov a je určený infekciou vhodnej bunkovej kultúry a počtom plakov infikovaných buniek po 48 hodinách. Techniky pre určenie veľkosti pfu vírusového roztoku sú dobre zdokumentované v literatúre. Kompozície podľa vynálezu môžu obsahovať priamo produkujúce (tvorivé) bunky z pohľadu ich implantácie.
Nasledujúce príklady a obrázky bližšie ilustrujú vynález, bez toho, aby obmedzili v akomkoľvek smere rozsah vynálezu.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1: Schéma postupnosti elementov Ll až L4 identifikovaných v promótore génu L-PK a ich spojovacie proteíny
Obrázok 2: Palindróm elementu L4
Obrázok 3: Retrovírusový plazmid pHSG(L4L3)4PKCAT a klony F6 A B8
Obrázok 4: Určenie množstva mhATIIIF transformovaných klonom injektovanej glukózy aktivity CAT v bunkách B8, k funkcii množstva
Obrázok 5: Určenie množstva aktivity CAT v bunkách mhATIIIF transformovaných klonom B8 v rôznych časoch inkubácie
Obrázok 6: pHSG/AL-PK-CAT
Konštrukcia plazmidov pHSG/PK-CAT a
Obrázok 7: Indukcia glukózou v rôznych dávkach v závislosti od použitých plazmidov pHSG/PK-CAT a pHSG/AL-PK-CAT
Všeobecné techniky molekulárnej biológie
Klasické metódy použité v molekulárnej biológii také, ako extrakcia izolovanej plazmidovej DNA, centrifugácia plazmidovej DNA v gradiente chloridu cézneho, elektroforéza na agarózových géloch alebo akrylamidových, čistenie fragmentov DNA elektroelúciou, extrakcia proteínov fenolom alebo fenol-chloroformom, zrážanie DNA v prostredí solí etanolom alebo izopropanolom, transformácia do Escherichia coli atď. sú dobre známe odborníkom a sú dostatočne popísané v literatúre (Maniatis T et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1982, Ausubel F. M. et al. (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1987) .
Plazmidy typu pBR322, pUC a fága série M13 sú komerčného pôvodu (Bethesda Research Laboratoires).
Fragmenty DNA môžu byť. oddeľované podľa ich veľkosti elektroforézou na agarózovom géli alebo na akrylamide, extrahované fenolom alebo zmesou fenol-chloroform, zrážané etanolom, potom inkubované za prítomnosti DNA-ligázy fága T4 (Biolabs) podľa odporúčania dodávateľa.
Doplnenie prečnievajúceho 5' konca môže byť uskutočnené Klenowovým fragmentom DNA-polymerázy I z Escherichia coli (Biolabs) podľa špecifikácie dodávateľa. Zatupenie prečnievajúceho 3' konca je uskutočnené za prítomnosti DNA-polymerázy fága T4 (Biolabs) podľa odporúčania výrobcu. Zatupenie prečnievajúceho 5' konca je uskutočnené pôsobením nukleázy SI.
Mutagenéza riadená in vitro syntetickými oligodeoxynukleotidmi môže byť uskutočnená podľa metódy vyvinutej Taylor-om et al. (Nukleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764) za použitia súpravy distribuovanej Amershanom.
Enzýmová amplifikácia fragmentov DNA technikou nazývanou PCR (Polymerase-catalysed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354, Mullis K. B. et Faloona F. A., Math. Enzým. 155 (1987) 335-350) môže byť. uskutočnená za použitia DNA thermal cycler (Perkin Elmer Cetus) podľa špecifikácie výrobcu.
Overenie sekvencie nukleotidov môže byť uskutočnené metódou vyvinutou Sanger-om et al. (Proc.Natl.Acad.Sci USA, 74 (1977) 5463-5467) použitím súpravy distribuovanej Amershanom.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1: Konštrukcia retrovírusového vektora
Všetky plazmidy sú konštruované podľa štandardných techník klonovania DNA. Konštrukcia plazmidu pHSG(L4L3)4-PKCAT (uvedený na Obrázku 3), obsahuje konštruktívnu časť MMLV plazmidu pHSGHeo a sekvenciu kódujúcu gén CAT pod kontrolou promótora krysieho génu pyruvátkinázy typu L (bp -119 až +11), pred ktorým sú oligomerné fragmenty L4L3 4krát (GIRE a miesto väzby HNF4) zligované. Fragment L4L3, zodpovedajúci fragmentu vymedzenom medzi bp -172 až -123 pred miestom iniciácie transkripcie L-PK bol získaný PCR. Použitá signálna sekvencia polyA je prítomná v LTR na 3' konci MMLV. Plazmid pHSGNeo (Gruid et al. J.Virol. 1988, 62, 3795-3801), retrovírusový plazmid odvodený od MMLV, psi-CRIP, amfotropická komplementárna bunková kultúra, ktorá prináša štruktúrne proteíny MMLV boli získané od Dr. A. Weber-a (Inštitút Cochin de Genetique Moleculaire, Paríž), plazmid pRSVNeo, v ktorom je gén aminoglykozidfosfotransferázy pod kontrolou promótora LTR RSV bol použitý na kotransfekciu.
Príklad 2: Bunková kultúra a transfekcia
Bunky mhATIIIF sú bunkami nádorového tkaniva myšej pečene exprimujúce gény prekokov SV40 pod kontrolou promótora Špecifického antitrombínu III pečene (ATIII-SV40) (Kahn A. et al. Exp. Celí. Res., 200, 175-185). Tieto bunky sú kultivované v živnom prostredí DMEM F12/NUT.MIX. (1:1 obj./obj.) s prídavkom glutamax-1 alebo DMEM/HamF12 (1:1 obj./obj.) (Gibco-BRL) s D+glukózou (Sigma) alebo bez jej prídavku, doplnenom 1 uM dexametazónom, 1 uM triodotyronínom, 20 uM ľudského inzulínu, 5 % (obj./obj.) SVF. Bunky NIH3T3 a psi-CRIP sú kultivované v: DMEM (5,5 mM glukózy, 1,0 mM pyruvátu sodného) doplnené 10 % (obj./obj.) teľacieho séra. Do tohto prostredia sa pridá ampicilín, streptomycín a glutamín a bunky sa inkubujú pri 37 °C s 5 % (obj./obj.) C02. Bunky psi-CRIP sa kotransfektujú s plazmidom pHSG (L3L4)4-PKCAT a pRSV Neo (molárny pomer obidvoch plazmidov bol 10:1) metódou katiónového lipozómu (DOTAP, Boeringer Mannheim) a selektuje za prítomnosti G418 (800 ug/ml). Klony rezistentné na G418 sa oddelia na test produkcie retrovírusov.
Príklad 3: Príprava vírusovej RNA a PCR-RT v jednej etape
Bunkové klony rezistentné ku G418 sa naočkujú do 90 mm nádobky a kultivujú až do 100 % spojenia. Plávajúci povrch bunkovej kultúry sa filtruje na membráne, ktorá má póry s veľkosťou 0,22 um, inkubuje s DNA-zou I (10 ug/ml) pri 37 °C v priebehu 30 minút potom odstredí pri 65000 rpm v priebehu 20 minút pri 4 °C. Retrovírusová RNA sa extrahuje a čistí od usadeniny po zrážaní proteinázou K a zmesou fenol/chloroform potom spoločne vyzráža tRNA. Vzorka sa rozpustí v dietylpyrokarbonáte v zmesi s vodou, zmes obsahuje ešte 1 mM ditiotritol (DTT), 40 U RNAsin/100 um, potom sa podrobí reverznej transkriptáze a PCR zároveň. Pre amplifikáciu sa použijú dve nasledujúce priméry:
- 5'ACTCAAATGCCCAATGAAGTC 3'(SEQ ID N° 7), zodpovedajúci oblasti Gag MMLV (bp 1524 až 1544),
- 5'TCAACGGTGGTATATCCAGAT 3' (SEQ ID N° 8), zodpovedajúci oblasti kódujúcej- gén CAT (bp 53 až 15 zodpovedajúce miestu iniciácie transdukcie).
Inverzná transkripcia od antisens sondy PCR sa katalyzuje inverznou transkriptázou 8U AMV (Promega) v priebehu 1 hodiny pri teplote 42 °C a nasleduje PCR s DNA-polymerázou Taq25U, tá sa uskutoční v 35 až 40 cykloch. Zväčšený fragment je dlhý 44 0 bp a obsahuje časť. génu gag, 4 opakujúce sa motívy L3L4, promótor -119 L-PK a 65 bp génu CAT. Ak je nutné, fragmenty sa klonujú a sekvenujú.
Príklad 4: Produkcia rekombinantných retrovírusov
Retrovírusové vektory pHSG(L4L3)4 -119PKCAT a pRSVNeo sú použité pre kontransfekciu bunkovej kultúry psi-CRIP. Bolo analyzovaných 70 klonov rezistentných na G418. 8 pozitívnych klonov v RT-PCR preukazuje schopnosť produkcie infikovaných rekombinantných retrovírusov, tieto klony sú determinované PCR špecifickým fragmentom vzhľadom na génomické DNA buniek NIH3T3. Jasne sa ukázalo, že produkcia retrovírusov je signifikantná u nasledujúcich dvoch klonov.
kloň F6 (5.104) infikovaného retrovírusu, produkt retrovírusu s oblasťou signálnej sekvencie (4 opakujúce sa fragmenty L4L3 (Obrázok 3)) kloň B8 (2.10^) so signálnou sekvenciou čiastočne deletovanou (jeden celý motív L4L3 alebo malá časť druhého motívu L3 (Obrázok 3))
Čistota retrovírusov sa určí semikvantitatívnou PCR-RT používajúcou rozličné delécie pHSG(L4L3)4199PKCAT ako štandard.
Príklad 5: Infekcia rekombinantnými retrovírusmi, stanovenie čistoty retrovírusov a dávkovanie proteínu CAT
Pozitívne klony sa použijú na infekciu buniek NIH3T3, aby sa odhadla schopnosť infekcie retrovírusov.
ml plávajúceho povrchu bunkovej kultúry 100 % spojenej sa použije na infekciu buniek NIH3T3 v logaritmickej fáze rastu s 8 ug/ml polybrénu. Po troch hodinách inkubácie sa polybrén v prostredí zriedi na 2 ug/ml a kultúra sa nechá ešte 48 hodín inkubovať. Genomická DNA infikovaných buniek NIH3T3 sa extrahuje a použije na amplifikáciu PCR za použitia primárov popísaných v príklade 3. Detekcia špecifického fragmentu dokazuje integráciu retrovírusových sekvencií v genóme infikovaných buniek. Čistota sa určí množstvom DNA vznikajúcej z genomickej DNA infikovaných buniek s rôznym zriedením retrovírusov (102 až 106 molekúl). Klony, ktoré sú produkované infikovanými vírusmi sú spoločne inkubované s bunkami mhATIIIF podľa nasledujúceho protokolu:
do 90 mm nádobky sa umiestni 60 mm nádobka, ktorej základňa bola odstránená, steny sa napustia silikónovým olejom, priestor sa tak rozdelí na dve časti,
- do centra sa vložia bunky mhATIIIF, bunky produkujúce retrovírus sa vložia do okrajového priestoru, a tak sa nezmiesia tieto dva typy buniek, keď sa bunky dobre fixujú v nádobke po šiestich hodinách inkubácie, malá nádobka sa vyberie. Prostredie sa tak zmení pre novú 16-hodinovú inkubáciu, potom sa pridá 8 ug polybrénu a bunky sa kultivujú ďalších 48 hodín,
- aktivita CAT sa meria chromatograficky na tenkej vrstve a kvantifikuje v cpm scintiláciou.
Príklad 6: Indukcia glukózou v dávkach a rôznych časoch expresie
Bunky mhATIIIT asimilované k hepatocytom u krýs, udržujú svoju schopnosť odpovedať aktiváciou génu L-PK odpovede transgénu na glukózu transkripcionálnou a sú tak prispôsobené na testovanie CAT, transferovaného retrovírusovým vektorom v dôsledku aktivity L-PK GIRE v retrovírusovom prostredí.
Pre zväčšenie účinnosti transfekcie, bunky mhATIIIF sa kultivujú dvakrát s bunkami produkujúcimi retrovírusy, a to vedie k uspokojivému stupňu infekcie s klonom B8. Ako je ukázané na obrázkoch 4 a 5 expresia transgénu L-PK/CAT v infikovaných bunkách mhATIIIF je dobre indukovaná glukózou. Polovica maximálnej indukcie sa získa pri koncentrácii 3-4 mM glukózy a maximálna indukcia pri 8 mM glukóze. Pre vyššiu koncentráciu glukózy aktivita CAT zostáva relatívne stabilná.
Bunky mhATIIIF sa kultivujú v prostredí obsahujúcom 17 mM glukózu, indukcia génu je pozorovaná od ôsmej hodiny inkubácie, polovičná indukcia pred 24. hodinou a maximálna indukcia v 48. hodine.
Príklad 7: Konštrukcia plazmidov pHSG/PK-CAT a pHSG/AL-PK-CAT
Plazmidy sú konštruované podľa štandardných techník klonovania ADN. Spojenie sa overuje sekvenovaním DNA. Konštrukcia plazmidu pHSG/PK-CAT obsahuje časť MMLV pHSG umiestneného medzi nukleotidmi od 1 až 2015 a od 3888 až 4445, pre plazmid pHSG/AL-PK-CAT, sekvencie MMLV sú umiestnené medzi nukleotidmi od 1 až 2015 a od 4290 až 4847 (Obrázok 6). Sekvencia kódujúca gén CAT pod kontrolou promótora krysieho génu pyruvátkinázy typu L (-183 až +11 bp) je umiestnená medzi nukleotidmi 2048 až 3033 pre plazmid pHSG/PK-CAT a medzi 2450 a 3435 pre plazmid pHSG/AL-PK-CAT. Použitá signálna sekvencia polyA je sekvencia SV40 umiestnená medzi nukleotidmi 3033 a 3873 v pHSG/PK-CAT a medzi 3435 a 4275 v pHSG/AL-PK-CAT. Nukleotidy od 2015 až 2048, 2242 až 2452 a 3873 až 3888 sú adaptéry medzi rôznymi fragmentárni pre plazmid pHSG/PK-CAT a sú situované pre plazmid pHSG/AL-PK-CAT od 2015 až 2035, 2435 až 2450, 2544 až 2654 a 4275 až 4290.
Príklad 8: Indukcia glukózou v rôznych dávkach v závislosti od expresie plazmidov pHSG/PK-CAT a pHSG/AL-PK-CAT
Bunky mhAT3F pochádzajú z pečeňového myšieho nádora ktoré exprimujú gény SV40 pod kontrolou promótora špecifického antitrombínu III pečene (Kahn A. et al. Exp, Celí, Res., 200, 175-185) . Tieto bunky sa kultivujú pri teplote 37 °C s 5 % (obj./obj.) CO2 v živnom prostredí DMEM F12/NUT.MIX. (1:1 obj./obj.) s glutamaxom-1 (Gibco-BRL) s prídavkom D-glukózy (Sigma) alebo bez tohto prídavku, doplnené 1 uM dexametazónom, 1 uM triodotironínom a 20 nM ľudského inzulínu. 5 ug plazmidu pHSG/PK-CAT alebo plazmidu pHSG/AL-PK-CAT sa transfektuje metódou katiónového lipozómu (DOPAP, Boehringer Mannheim). Bunky sa následne kultivujú za prítomnosti rôznych koncentrácii glukózy v priebehu 24 hodín s cieľom indukcie promótora PK-L. Aktivita CAT sa meria chromatograficky na tenkej vrstve a kvantifikuje v jednotkách cpm scintiláciou. Výsledky sú uvedené na obrázku 7. Po 24 hodinách indukcie za prítomnosti rôznych koncentrácií glukózy je expresia plazmidu pHSG/PK-L za prítomnosti promótora aldolázy B päťkrát silnejšia za prítomnosti 8mM glukózy, než indukcia plazmidu bez promótora aldolázy B.
Promótor hybridu aldolázy B/PK-L je tak najmä výhodný pri porovnaní s génom na zvýšenie expresie, zostáva citlivý na glukózu, je teda výhodný najmä v oblasti vývoja metódy genetickej terapie diabetes, zameranej na produkciu vhodnej koncentrácie inzulínu in vivo, najmä pri glykémii.
Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie:
(i) podávateľ:
(A) Meno: INSERM (B) Ulica: 101, Rue de Tolbiac (C) Mesto: Paríž (D) Zem: Francúzsko (E) Smerovacie číslo: 75654 Paríž Cedex 13 (ii) názov vynálezu:
(iii) počet sekvencií: 8 (iv) spôsob lúštenia počítačom:
(A) Typ nosiča: tápe (B) počítač: IBM PC kompatibilný (C) systém využitia: PC-DOS/MS-DOS (D) logika: Patentln Relase =1.0, Version =1.30 (OEB) (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID N° 1:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 194 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (iii) hypotetický: nie (iii) antimediátorová: nie (xi) popis sekvencie: SEQ ID N° 1:
GATCCAGCAG CATGGGCGCA CGGGGCACTC CCGTGGTTCC TGGACTCTGG CCCCCAGTGT -- '“s ou
ACAAGGGTTC CGTTGGCAAG AGAGATGCTA GCTGGTTATA CTTTAACCAG GACTCATCTC 1 2 C
ATCTGAGCGA GGCCCCATCC CACTGACAAA GGCGCAGTAT AAAGCAGACC CACAGACACA 1 SO
GCAGGTAAGC AACG 1 94
(2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID N° 2:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 24 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (iii) hypotetický: nie (iii) antimediátorvá: nie (xi) popis sekvencie: SEQ ID N° 2:
GCGCACGGGG CACTCCCGTG GTTC 24 (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID N° 3 :
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 19 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (iii) hypotetický: nie (iii) antimediátorová: nie (xi) popis sekvencie: SEQ ID N° 3:
CTGGACTCTG GCCCCCAGT (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID N° 4:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 129 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (iii) hypotetický: nie (iii) antimediátorová: nie (xi) popis sekvencie: SEQ ID N° 4:
GGCTTGGGTT GGCAAGAGAG ATGCTAGCTG GTTATACTTT AACCAGGACT CATCTCATCT
GAGCCAGGCC CATCCCACTG ACAAAGGCGC AGTATAAAGC AGACCCACAG ACACAGCAGG
TAAGCAACG (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID N° 5:
i 20
29 (i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 416 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: DNA (iii) hypotetický: nie (iii) antimediátorová: nie (xi) popis sekvencie: SEQ ID N° 5:
TCCTTCTGCC ATGGCCCTGT GGATGCGCCT CCTGCCCCTG CTGGCGCTGC TGGCCCTCTG 60
GGGACCTGAC CCAGCCGCAG CCTTTGTGAA CCAACACCTG TGCGGCTCAC ACCTGGTGGA 1 20
AGCTCTCTAC CTAGTGTGCG GGGAACGAGG CTTCTTCTAC ACACCCAAGA CCCGCCGGGA 1 30
GGCAGAGGAC CTGCAGGTGG GGC AG<jTGo A GCTGGGCGGG GGCCCTGGTG CAGGCAGCCT 240
GCAGCCCTTG GCCCTGGAGG GGTCCCTGCA GAAGCGTGGC ATTGTGGAAC AATGCTGTAC 300
CAGCATCTGC TCCCTCTACC AG^TGoAGAA CTACTGCAAC TAGACGCAGC CCGCAGGCAG 360
CCCCCCACCC GCCGCCTCCT GCACCGAGAG agatggaata AAGCCCTTGA ACCAGC 416
(2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID N° 6:
(i) charakteristika sekvencie: (A) dĺžka: .4 64 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna
(ii) typ molekuly: DNA (iii) hypotetický: nie (iii) antimediátorová: nie
(xi) popis sekvencie: SEQ ID N° 6:
AGGCCTCCAC ACTCTATTGC ACTCTGCAGA AGTAACACTA GAGTGACCTT TCTTTAGATT 60
TAGAÄAGACT AACACATAAT ATATTGCTGT AATTTCTTTT GTAGTTTTTT AAGTAGGACA 1 20
ATAAATATTT ATTACAGATT TCTCTGGAAG TTTTTCATTT GATAATTAAT GAAAATTTTC 1 80
CATCATACTT GTAAAAATGA AGTGACTTGG GACCTTAGAA ATCAGAAGTT TAAAGGAGTA 240
AAGTTCATTA TGTGACTCTG TTGTTAAGTA TTCCAGGCTG TGTTCTGTCT CCCAGTGACA TTTTATGATT AACTGAGGGG CAAAATTTGT GCTGATGTGG AACATTGACC TACAGACCTT 300 360
TAGTCCCTTT GTAGAAGTTT AACTTCCTGT AAACAGGACG AGTTTGACTT GACTTTTCCC 420
TGTAATTCTT GTTGAGTTGG CATACCCAGA ATGGAGCAAA TGGC 464
(2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID N° 7:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 21 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iii) antimediátorová: nie (xi) popis sekvencie: SEQ ID N° 7:
ACTCAAATGC CCAATGAAGT C (2) Informácia pre sekvenciu SEQ ID N° 8:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 21 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) počet vláken: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetický: nie (iii) antimediátorová: nie (xi) popis sekvencie: SEQ ID N° 8:
TCAACGGTGG TATATCCAGA T

Claims (29)

1. Defektivny rekombinantný virus obsahujúci aspoň jeden heterologický gén pod kontrolou expresného signálu indukovateľného glukózou alebo niektorým z jej analógov.
2. Defektivny rekombinantný vírus obsahujúci aspoň jeden heterologický gén pod kontrolou expresného signálu odvodeného od celého alebo časti promótora génu kódujúceho pyruvátkinázu typu L (L-PK).
3. Vírus podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že expresný signál je odvodený úplne alebo čiastočne od fragmentu tvoreného 183 bp umiestneného na 5' konci kódujúceho génu kódujúci L-PK.
4. Vírus podľa nároku 1, 2 alebo 3, vyznačujúci sa tým, že expresný signál obsahuje celok alebo časť sekvencie SEQ ID N° 1.
5. Vírus podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že expresný signál obsahuje aspoň element L4 promótora génu kódujúceho L-PK.
6. Vírus podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že sa ide o element L4 reprezentovaný celkom alebo čiastočne sekvenciou SEQ ID N° 2, sekvenciou hybridizujúcou s celkom alebo časťou tejto sekvencie alebo sekvencie, ktorá je odvodená, schopná interakcie s faktorom MLTF/USF.
7. Vírus podl'a nárokov 5 alebo 6 vyznačujúci sa t ý m , že element L4 sa opakuje vo forme 4 oligomérov po sebe idúcich v expresnom signále.
8. Vírus podľa jedného z nárokov 5 až 7, vyznačujúci sa tým, že obsahuje okrem toho element L3 promótora génu kódujúceho L-PK.
9. Vírus podľa nároku 8 vyznačujúci sa tým, že element L3 je reprezentovaný úplne alebo čiastočne sekvenciou SEQ ID N° 3, sekvenciou hybridizujúcou s celkom alebo s častou tejto sekvencie alebo sekvencie, ktorá je od nej odvodená, schopnou vstúpiť do interakcie s faktorom HNF 4.
10. Vírus podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že expresný signál obsahuje element L4 promótora génu kódujúceho L-PK fúzovaný s elementom L3 rovnakého promótora, L4-L3.
11. Vírus podľa nároku 10, vyznačujúci sa t ý m ,že expresný signál obsahuje 4 oligoméry nasledujúcej L4-L3.
12. Vírus podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že expresný signál obsahuje okrem toho minimálny promótor.
13. Vírus podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že sa s výhodou ide o sekvenciu zodpovedajúcu fragmentu -119 až 11 umiestneného na 5' konci génu kódujúceho L-PK.
14. Vírus podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že signál expresie je reprezentovaný SEQ ID N° 4 alebo jedným z jej derivátov.
15. Vírus podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že signál expresie obsahuje okrem toho transkripčný promótor.
16. Vírus podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že transkripčný promótor pochádza z prvého intrónu génu aldolázy B myši.
17. Vírus podľa nárokov 1 až 16, vyznačujúci sa tým, že je zbavený oblastí svojho genómu, ktoré sú nutné na replikáciu v cieľovej bunke.
18. Vírus podľa nárokov 1 až 17, vyznačujúci sa t ý m , že sa ide o adenovirus.
19. Vírus podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že ide o ľudský adenovirus typu Ad 2 alebo Ad 5 alebo psí adenovirus typu CAV-2.
20. Vírus podľa nárokov 1 až 17, vyznačujúci sa t ý m , že ide o retrovírus.
21. Vírus podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že sa ide o retrovírus rodu MoMuLV.
22. Vírus podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že heterologický gén kóduje inzulín alebo jeho varianty.
23. Použitie vírusu podľa nárokov 1 až 22 na prípravu farmaceutickej kompozície určenej k liečeniu a.lebo/a prevencie ochorení súvisiacich s hyperglykémiou.
24. Farmaceutická kompozícia obsahujúca jeden alebo viac defektných rekombinantných vírusov podľa nárokov 1 až 21.
25. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 24, vyznačujúca sa t ý m , že je v injikovateľnej forme.
26. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 24 alebo 25, vyznačujúca sa tým, že obsahuje medzi 104 a 1014 pfu/ml a s výhodou 106 až 1010 pfu/ml defektného rekombinantného adenovírusu.
27. Cicavčia bunka infikovaná jedným alebo viacerými defektnými rekombinantnými vírusmi podľa nárokov 1 až 21.
28. Bunka podľa nároku 27, vyznačujúca sa tým, že sa ide o ľudskú bunku.
29. Bunka podľa nároku 28, vyznačujúca sa tým, že sa ide o hepatocyt alebo o β-pankreatickú bunku.
SK1377-97A 1995-04-14 1996-04-12 Recombinant viral vector, pharmaceutical composition containing the same and corresponding transformed cells SK137797A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9504558A FR2732978B1 (fr) 1995-04-14 1995-04-14 Vecteur viral recombinant, composition pharmaceutique le contenant et cellules transformees correspondantes
PCT/FR1996/000560 WO1996032489A1 (fr) 1995-04-14 1996-04-12 Vecteur viral recombinant inductible par le glucose

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK137797A3 true SK137797A3 (en) 1998-05-06

Family

ID=9478162

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1377-97A SK137797A3 (en) 1995-04-14 1996-04-12 Recombinant viral vector, pharmaceutical composition containing the same and corresponding transformed cells

Country Status (14)

Country Link
US (1) US6309878B1 (sk)
EP (1) EP0821741A1 (sk)
JP (1) JPH11503608A (sk)
KR (1) KR19980703843A (sk)
AU (1) AU715377B2 (sk)
BR (1) BR9604938A (sk)
CA (1) CA2215987A1 (sk)
CZ (1) CZ292564B6 (sk)
FR (1) FR2732978B1 (sk)
HU (1) HUP9802587A3 (sk)
MX (1) MX9707910A (sk)
NO (1) NO974726D0 (sk)
SK (1) SK137797A3 (sk)
WO (1) WO1996032489A1 (sk)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998021363A1 (en) * 1996-11-15 1998-05-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating type ii diabetes involving hnf-4
US6537806B1 (en) 1998-06-02 2003-03-25 University Of Washington Compositions and methods for treating diabetes
EP1889914A1 (en) * 1999-02-19 2008-02-20 Engene, Inc. Compositions for gene therapy of diabetes
CA2364417C (en) * 1999-02-19 2013-11-05 Matthew John During Peroral gene therapy of diabetes and obesity
JP3406244B2 (ja) * 1999-04-30 2003-05-12 伊藤ハム株式会社 新規な融合蛋白質からの組み換えインスリンの製造方法
CZ20014212A3 (cs) 1999-05-27 2002-06-12 International Business Machines Corporation Diskové zařízení
WO2002089855A1 (en) * 2001-04-27 2002-11-14 Auckland Uniservices Limited Peroral transduction of hepatocytes in the treatment of disease
DE102005024884A1 (de) * 2005-05-31 2006-12-07 Linde Ag Arbeitsmaschine, insbesondere Flurförderzeug
CN101212977A (zh) * 2005-06-01 2008-07-02 国际创新生物技术研究所有限公司 葡萄糖可诱导的胰岛素表达和治疗糖尿病的方法
ES2325711B1 (es) * 2007-04-17 2010-06-17 Centro De Investigaciones Energeticas, Medioambientales Y Tecnologicas (Ciemat) Vectores de expresion que comprenden el promotor del gen pklr humano y su uso para la elaboracion de composiciones farmaceuticas destinadas a terapia genica somatica con expresion especifica en celulas eritroides.

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2007392A (en) * 1991-05-29 1993-01-08 United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The Eukaryotic expression vectors with regulation of rna processing
ATE237694T1 (de) * 1991-08-20 2003-05-15 Us Gov Health & Human Serv Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
GB9305759D0 (en) * 1993-03-19 1993-05-05 Medical Research Council And T Hiv therapy method and agents
EP0707646A1 (en) * 1993-06-28 1996-04-24 The Board Of Regents, The University Of Texas System Vectors for genetically engineered cells that produce insulin in response to glucose

Also Published As

Publication number Publication date
CA2215987A1 (fr) 1996-10-17
MX9707910A (es) 1997-11-29
US6309878B1 (en) 2001-10-30
NO974726L (no) 1997-10-13
KR19980703843A (ko) 1998-12-05
HUP9802587A2 (hu) 1999-02-01
CZ292564B6 (cs) 2003-10-15
JPH11503608A (ja) 1999-03-30
AU715377B2 (en) 2000-02-03
NO974726D0 (no) 1997-10-13
HUP9802587A3 (en) 1999-12-28
FR2732978B1 (fr) 1997-05-30
AU5652396A (en) 1996-10-30
CZ325197A3 (cs) 1998-01-14
FR2732978A1 (fr) 1996-10-18
EP0821741A1 (fr) 1998-02-04
WO1996032489A1 (fr) 1996-10-17
BR9604938A (pt) 1998-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2229631C (en) Gene therapy using ovine adenoviral vectors
JP5823969B2 (ja) 心臓特異的核酸調節因子ならびにこの方法および使用
WO1998032869A1 (en) Expression vectors and methods for in vivo expression of therapeutic polypeptides
JPH10507061A (ja) アデノウイルス中にパッケージされたプラスミドｄｎａを用いる遺伝子送達ベクターおよびパッケージング細胞株
US20050260164A1 (en) Gene regulation with aptamer and modulator complexes for gene therapy
US20020123146A1 (en) Highly productive packaging lines
US6806080B2 (en) Hybrid vectors for gene therapy
SK137797A3 (en) Recombinant viral vector, pharmaceutical composition containing the same and corresponding transformed cells
KR100246096B1 (ko) 유전자 요법을 위한 개선된 레트로바이러스 벡터
CN115803441A (zh) 用于恢复pah基因功能的腺相关病毒组合物和其使用方法
JPH11514881A (ja) Ｇａｘタンパク質の癌治療への応用
JP2001503279A (ja) ターゲットを定めて遺伝子を誘導発現させるための新規な構築物及びベクター
CN114934070A (zh) 间充质干细胞及其抗炎应用
US20020028212A1 (en) Recombinant viruses coding for a glutamate decarboxylase (gad) activity
AU766153B2 (en) Use of negative regulation elements for nerve-specific expression of transgenes
Rasmussen et al. Complementarity between RNA dimerization elements favors formation of functional heterozygous murine leukemia viruses
KR20000010608A (ko) 티로신 하이드록실라제 유전자로부터 유도된 발현 시스템
US20060233757A1 (en) Vectors with viral insulators
WO2022234051A1 (en) Split prime editing enzyme
JP2002291492A (ja) ペプチドベクター
EA047326B1 (ru) СИНЕРГЕТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ SMN1 И miR-23a ПРИ ЛЕЧЕНИИ СПИНАЛЬНОЙ МЫШЕЧНОЙ АТРОФИИ
MXPA00007617A (en) Use of negative regulation elements for nerve-specific expression of transgenes
AU4233499A (en) Recombinant viruses coding for a glutamate decarboxylase (GAD) activity
AU2928402A (en) Recombinant viruses coding for a glutamate decarboxylase (GAD) activity