WO1997019182A1 - Production de vecteurs retroviraux par l'intermediaire de vecteurs herpetiques - Google Patents

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Alberto Luis Epstein
François-Loïc Cosset
Nathalie Savard
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Centre National De La Recherche Scientifique
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Definitions

  • the invention relates to a method for producing retroviral vectors capable of transferring nucleic acid sequences into different types of cells and organisms.
  • the invention also relates to the nucleic acids and viral vectors used in the method.
  • the invention relates to the use of vectors in gene therapy and the corresponding pharmaceutical components.
  • Retroviral vectors are often used in gene therapy for the transfer of genes into cells and organisms. Indeed, thanks to their integrase activity, they allow the transfer and the stable integration of a coding or non-coding sequence having a size which can go up to 7 Kb.
  • Retroviral vectors are commonly produced from encapsidante (or transcomplementing) cell lines, in which the two fundamental elements which allow the formation of the retroviral vector are integrated into cell chromosomes ( Figure 1). These elements are, on the one hand, the "transcomplementing component”, transcriptional unit capable of expressing the retroviral genes Gag-Pol-Env (GPE), or else Gag-Pol and Env, allowing the synthesis of the protein constituents of the particle retroviral, and on the other hand, the "vector component”, a transcriptional unit capable of expressing and encapsulating the "transgene” in the viral particles formed by the "transcomplementing component”. For this, the transgene is surrounded by a set of sequences of retroviral origins which allow it to be packaged, retranscribed then integrated and expressed in the cellular chromosomes of the target cell.
  • the transgene is surrounded by a set of sequences of retroviral origins which allow it to be packaged, retranscribed then
  • packaging lines often generate recombinant retroviruses, which are sometimes competent for replication. This phenomenon is completely undesirable in a gene therapy protocol.
  • Transient production procedures have also been developed: they are all based on the cotransfection of different plasmids carrying the different components of a retroviral vector. These plasmids can sometimes be amplified in cells, but in all cases they are introduced into them by transfection, which considerably limits their use and their effectiveness.
  • the problem which the present invention proposes to solve is therefore to provide a method for producing retroviral vectors making it possible to obtain vectors, from a large number of different cell types (even those normally non-infectable by retroviruses) , at high titers, and reducing the probability of generating recombinant retroviruses.
  • the method of the invention is based on the use of viruses, and in particular herpesvirus, as a source of DNA.
  • viruses and in particular herpesvirus
  • the two retroviral components "transcomplementing" and “vector” are introduced into the genome of a herpes viral vector under the control of appropriate promoters (FIG. 2).
  • the retroviral components in the form of DNA, or proviral
  • the retroviral components are therefore transcribed from extrachromosic genetic elements (the genome of the viral vector) and the retroviral vector is assembled in the cell. This then relaxes the retroviral vectors and they can infect neighboring cells.
  • the technique of the invention improves the production of retroviral vectors.
  • the productivity of the retroviral vectors is improved, since infection of the cells with the viral vector at high multiplicity of infection increases the synthesis of retroviral proteins.
  • the production titles of vectors are provided.
  • Q retrovirals can be greater than 10 pfu / ml, for example between 10 9 and 1011 pfu / ml.
  • the probability of generating recombinant retroviruses is greatly reduced since the production of retroviral vectors via the viral vector takes place only in a transient and / or inducible manner.
  • this procedure opens the possibility that the retroviral vectors may be synthesized directly in vivo, inside the recipient organism, by the simple inoculation, possibly localized, of the viral vector; the latter infects the cells of the recipient organism and these cells are then produced retroviral vectors which can cause the transgene to integrate into neighboring cells.
  • the method therefore makes it possible to infect, with the viral vectors, cells in the animal organism in order to directly produce the retroviral vectors in situ, from neurons, myotubes, hepatocytes or virtually any other cell type, post-mitotic or not. .
  • This is currently only possible by re-implanting autologous genetically modified cells ex vivo and is limited to only cells capable of achieving mitosis.
  • the method of the invention allows the production of retroviral vectors in cells which are normally not infectable by retroviruses.
  • the invention relates to a method for producing ritroviral vectors capable of transferring nucleic acid sequences into eukaryotic cells, said method comprising the introduction into a eukaryotic cell of at least one so-called “vector” retroviral component and / or at least one retroviral component called “transcomplementing", the vector component comprising, in addition to the sequence to be transferred, the signals acting in cis necessary for the completion of the retroviral cycle, and the transcomplementing component comprising the sequences acting in trans necessary for the completion of the retroviral cycle, said method being characterized in that the introduction of the retroviral component (s) into the cell is carried out by infection of the cell with at least one viral vector derived from a virus with double-stranded DNA, in particular herpetic, and containing, integrated into its genome, said retroviral component (s), the eukary cell ote then being able to synthesize and release retroviral vectors.
  • vector component comprising, in addition to the sequence to
  • the method of the invention comprises, or consists of, infection of a eukaryotic cell with at least one viral vector, preferably herpetic, the retroviral elements necessary for the completion of the retroviral cycle being provided either by the herpetic vector (s), or by the herpetic vector (s) in combination with retroviral elements included within the genome of the eukaryotic cell.
  • the retroviral elements necessary for the completion of the retroviral cycle being provided either by the herpetic vector (s), or by the herpetic vector (s) in combination with retroviral elements included within the genome of the eukaryotic cell.
  • the viral vector contains a "vector" retroviral component (that is to say one or more elements of retroviral origin) and / or a “transcomplementing" retroviral component.
  • the invention relates to a method for producing retroviral vectors suitable for the transfer of nucleic acid sequences into eukaryotic cells, said method comprising the introduction into a eukaryotic cell of at least one retroviral component known as a "vector "and / or at least one so-called" transcomplementing "retroviral component, the vector component comprising, in addition to the sequence to be transferred, all the cis-acting signals necessary for the completion of the retroviral cycle, and the transcomplementing component comprising the retroviral genes gag, pol and env and being devoid of retroviral packaging signal, said method being characterized in that the introduction of the retroviral component (s) into the cell is carried out via at least one viral vector derived from a double-stranded DNA virus, in particular a herpetic vector, capable of infecting the cell and containing, integrated into its genome, said retroviral component (s), the eukaryotic cell then being able to synthesize and release retrovir
  • the expression “retroviral vector” means a recombinant retrovirus (which may be defective for replication), that is to say an RNA molecule carrying one or more sequence (s) to be transferred as well as the retroviral signals for retrotranscription, integration, transcription and packaging, this molecule being encapsulated in a retroviral particle.
  • the retroviral vector is normally unable to replicate.
  • viral vector means a herpetic vector (which may be defective), that is to say a DNA molecule carrying the signals necessary for replication, transcription and packaging, this molecule being packaged in a viral particle typical of a DNA virus.
  • the vector is unable to replicate outside a transcomplementing system (viral or cellular).
  • Herpetic vector means a vector derived from a virus of the Herpesviridae family.
  • trans-acting signals necessary for the completion of the retroviral cycle mean the retroviral signals necessary for packaging, retrotranscription, integration and regulation of transcription / expression.
  • sequences acting in trans are those encoding the retroviral proteins, for example the gag, pol and env genes.
  • sequences acting in cis and those acting in trans are normally comprised within two independent transcription units.
  • the transcription units can, in turn, be included either in the genomes of two different herpetic vectors, or in the genome of a single herpetic vector. It is also possible that some of the sequences acting in trans (for example gag-pol) are included in the same transcription unit as that coding for the retroviral components acting in cis.
  • the viral vectors are defective, apathogenic and do not induce rapid cell death, nor do they give rise to the production of DNA viruses, outside of a transcomplementing system (viral or cellular).
  • the genome of the viral vectors of the invention comprises on the one hand sequences specific to a DNA virus, and on the other hand sequences specific to a retrovirus. Normally, the genomic sequences specific to a double-stranded DNA virus include at least one packaging sequence and an origin of replication.
  • the genome of the viral vector is in fact plasmid.
  • the plasmid further comprises sequences of bacterial origin allowing its cloning and its selection in a bacterial host, for example E. coli. in particular an origin of replication and a selection gene.
  • the viral vector often called "amplicon", is then a concatamer composed of repeats of the linearized and packaged plasmid.
  • the genome of the viral vector may contain the entire genome of the DNA virus, with the exception of at least one gene essential for replication.
  • the viral vector is actually a defective recombinant virus.
  • the DNA viruses which form the basis of the viral vectors of the invention are chosen from all the double-stranded DNA viruses capable of infecting animal cells and preferably vertebrate cells. Herpes viruses are particularly preferred.
  • the herpesviruses capable of being used according to the invention include all members of the Herpesviridae family. It can be alphaherpesvirinae, betaherpesvirinae or gammaherpesvirinae.
  • the preferred herpesviruses are of human or animal origin, for example HSV-1, HSV-2, human cytomegalic virus (HCMV), human viruses HHV-6 and HHV-7, Epstein-Barr virus, Varicella Zoster virus (VZV), or swine pseudo-throat virus (PRV), or BHV-1 (Bovine Herpes Virus) or EHV-1 (Equine Herpes virus) etc.
  • Herpesviruses are particularly preferred because of their large size (genome from 120 to 200 Kb approximately) allowing the inclusion of heterologous sequences of large size. In addition, their spectrum of cellular hosts is very broad. Some viruses of this family are neurotropic, allowing the infection of nerve cells, tissues that cannot be reached by the retrovirus. This property is therefore particularly advantageous in the gene therapy of nervous diseases of the CNS. Other members of the herpes virus family are lymphotropic. These viruses can be made defective by deletion or inactivation of at least one essential gene such as the IE3 gene in HSV-1 or their counterparts in other herpesviruses.
  • a virus capable of being used as a viral vector mention may also be made of adenoviruses and pox-viruses.
  • Adenoviruses for example those of group C or others, can also be used. These viruses have a smaller size than those of herpes viruses (a genome of approximately 35 to 40 Kb). They have a natural tropism for the respiratory epithelium, the cornea and the digestive tract. These viruses can be made defective by deleting all or part of the regulatory genes E1A and E1B.
  • the poxviruses can also be used in the construction of viral vectors according to the invention. These viruses have a genomic size of around 120 to 300 Kb. They have a broad host cell spectrum. Among this family of viruses, the vaccinia virus is preferred. According to the invention, the viral vector comprises in its genome, in addition to the sequences specific to the DNA virus described above, sequences of retroviral origin, that is to say a "retroviral component" which comprises in particular, at minus one retroviral transcription unit.
  • the expression "retroviral transcription unit” means a DNA sequence, comprising a first element consisting of the regulatory sequences necessary for transcription and a second element consisting of at least one sequence to be transcribed, either of these elements being at least partly of retroviral origin.
  • the element of retroviral origin corresponds either to the part of the retroviral genome acting in cis, or to the part of the retroviral genome acting in trans for the completion of the retroviral cycle.
  • one of the retroviral transcription units comprises sequences coding for the Gag, Pol and / or Env proteins under the control of functional regulatory sequences in the eukaryotic cell. It is possible to introduce variants of the gag, pol and env genes, these variants comprising substitutions, deletions or insertions of nucleotides with respect to wild-type genes, provided that the essential functions of the proteins are maintained. These functions are: gag code for the precursor of capsid proteins; pol gives rise to reverse transcriptase and to an enzyme involved in proviral integration and env codes for the precursor of the envelope glycoprotein.
  • env gene on a transcription unit independent of that containing gag and pol.
  • This independent transcription unit can itself be included in the same DNA molecule and therefore in the same viral vector, or can on the other hand be included in a separate viral vector.
  • the regulatory sequences implemented in the transcomplementing transcription unit comprise transcription initiation and termination sequences, which are functional in the host cell. These sequences can be of animal or viral origin.
  • promoter mention may be made of strong and constitutive promoters, for example the HCMV promoter, the promoter of the herpetic gene IE3, or that of the herpetic thymidine kinase.
  • tissue promoters or inducible promoters mention may be made of the preproenkephalin promoter, the enolase-neurospecific promoter, and the promoters of any gene expressed in a particular tissue.
  • an inducible promoter mention may be made of the promoters of heat shock proteins, etc.
  • the “vector” transcription unit comprises: a so-called “heterologous” sequence under the control of transcription regulatory sequences, which are functional in the eukaryotic cell;
  • At least part of the LTR 5 ′ and 3 ′ of a retrovirus conferring the capacity for packaging, retrotranscription and integration.
  • the "heterologous" sequence included within this transcription unit can be any sequence the transfer of which into the target cell or organism is desired. It is any transcribable sequence encoding one or more protein (s) or part of a protein, or which gives rise, after transcription, to a sequence complementary to an endogenous or exogenous transcription product at the cell, for example complementary to a sequence viral.
  • the heterologous sequence is normally of non-retroviral origin and can comprise one or more coding or non-coding sequence (s), or a mixture of the two. It can be heterologous or homologous vis-à-vis the cell and heterologous or homologous vis-à-vis the vector.
  • the heterologous sequence can also be designated "transgene".
  • the size of the heterologous sequence must be compatible with the packaging of the retroviral particles (approximately 7 Kb).
  • the heterologous sequence is often a sequence the transcription or translation product of which exerts a therapeutic effect in a cell or in an organism.
  • a therapeutic gene for a mono- or multigenic character there may be mentioned a gene coding for a cytokine, a suicide gene, a conditional suicide gene, a gene with antiviral activity, a gene with antitumor activity, a therapeutic gene for neurodegenerative disease, or a marker gene.
  • the heterologous sequence may be a sequence coding for an enzyme, a blood derivative, a hormone, a lymphokine (interleukins, interferons, INF etc.), growth factors, neurotransmitters or their precursors, the CFTR protein associated with cystic fibrosis, thymidine kinase, cytosine deaminase. It may be an antigenic protein capable of generating an immune response in humans or animals.
  • the heterologous sequence can also give rise, after transcription, to an antisense sequence or to a ribozyme.
  • heterologous sequences coding for cellular markers can be used alone or in combination with another heterologous sequence.
  • part of the retroviral gag gene to improve the packaging of the transcript. It is normally a fragment of about 600 nucleotides from the gag initiator codon.
  • gag-pol part of the retroviral components acting in trans, for example gag-pol.
  • the transcription regulatory sequences may be those present within the retroviral LTRs or may be provided by other sequences. It is therefore possible to include any other promoter, strong, constitutive, tissue specific or inducible, provided that it is functional in the host cell.
  • retroviral sequences used in the vectors of the present invention come from one or more retroviruses, for example MoMLV, RD114, BaEV, MLV-A; mammalian type D retroviruses, for example MPMV, SRV; Spuma retrovirus, for example HFV; HIV, SIV, ASLV.
  • retroviruses for example MoMLV, RD114, BaEV, MLV-A
  • mammalian type D retroviruses for example MPMV, SRV
  • Spuma retrovirus for example HFV
  • HIV, SIV, ASLV retroviral sequences used in the vectors of the present invention.
  • the envelope characteristics, and therefore the spectrum of cellular hosts, are largely determined by the nature of Env. According to the invention, it is possible to choose the origin of Env to obtain the desired characteristics.
  • Gag, Pol and Env can come from the same retrovirus, for example MoMLV.
  • the envelope of the retroviral vector is ecotropic.
  • the Env gene of the MoMLV virus can be easily replaced by all the Env genes of mammalian type C viruses (amphotropic, xenotropic, RD114) or by the Env gene of other unrelated retroviruses, including the HIV virus, or even by genes encoding non-retroviral envelopes, for example VSV-G.
  • retroviral vector For the treatment of diseases of retroviral origin such as AIDS, it is possible to use Gag, Pol and Env of the retrovirus in question, for example HIV, so that the retroviral vector reaches the infected cells.
  • Gag, Pol and Env of the retrovirus for example HIV
  • the type of cell capable of being infected with the vectors of the invention varies according to the choice of the viral vector. Normally, it is a vertebrate cell, more particularly a mammalian cell, for example hematopoietic lineage cells, stem cells including fibroblast, epithelial, hematopoietic and nervous stem cells, or differentiated cells of ectodermal origin, mesodermal or endodermal.
  • a vertebrate cell more particularly a mammalian cell, for example hematopoietic lineage cells, stem cells including fibroblast, epithelial, hematopoietic and nervous stem cells, or differentiated cells of ectodermal origin, mesodermal or endodermal.
  • the production of retroviral vectors according to the invention can take place in vivo, ex vivo or in vitro.
  • retroviral vector element a retroviral vector element (s) and a transcomplementing retroviral element (s) and element (s) are introduced into the eukaryotic cell. (s), these different retroviral components being included either in the genomes of two different viral vectors, or in the genome of a single viral vector.
  • the retroviral components are included within the same viral vector, it is recommended to use, for the construction of the viral vector, a large DNA virus, for example a herpes virus or a pox virus.
  • the viral vector is preferably of the "recombinant virus” type and not of the "packaged plasmid” type (often called "amplicon").
  • a single retroviral component is introduced into the eukaryotic cell, via the viral vector.
  • This component can be the vector component or the transcomplementing component, the eukaryotic cell already having, integrated into its genome, the other of the two components.
  • This variant of the invention therefore uses eukaryotic cells which themselves provide the complementary component.
  • This variant of the method can be used in vivo, ex vivo or in vitro. In vivo, it makes it possible to "re-mobilize" a retroviral vector already integrated into the genomes of a population of cells.
  • the in vitro method normally includes a step of recovery, and optionally of purification, of the retroviral vectors thus obtained. Purification can be done for example by filtering of the cell supernatant, the filter allowing the vectors to pass and retaining all the undesirable material.
  • the invention also relates to the DNA molecules used for the construction of the viral vectors and the viral and retroviral vectors thus obtained.
  • the DNA molecules of the invention comprise sequences specific to the genome of a double-stranded DNA virus and including at least one packaging signal and an origin of replication, and at least one retroviral transcription unit as defined above. .
  • these molecules include:
  • I at least one packaging signal and an origin of replication of a DNA virus, preferably herpetic, and
  • At least one retroviral component consisting of: i) at least one transcription unit called "transcomplementing unit” comprising sequences coding for the retroviral proteins Gag, Pol and / or Env, under the control of transcription regulatory sequences, functional in a eukaryotic cell, this transcription unit being devoid of retroviral packaging signals and retroviral LTRs, and / or ii) a transcription unit called "vector unit” comprising:
  • heterologous sequence under the control of transcription regulatory sequences, functional in the eukaryotic cell; a sequence of retroviral origin allowing the packaging of the transcript and its retrotranscription; - At least part of the 5 ′ and 3 ′ LTRs of a retrovirus, said part conferring the capacity for packaging, retrotranscription and integration.
  • the invention also relates to eukaryotic cells injected with one or more viral vectors of the invention. These cells can be in vivo or cell cultures in vitro.
  • the viral vectors are used in gene therapy.
  • the invention therefore relates to a pharmaceutical composition comprising at least one viral vector of the invention in "association with a physiologically acceptable vehicle.
  • compositions often comprises two viral vectors, one of the "transcomplementing” type and the other of the "vector” type.
  • the compositions can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, intracranial, etc. administration.
  • the pharmaceutical composition comprises a vehicle suitable for an injectable formulation.
  • vehicle suitable for an injectable formulation may be in particular saline solutions (monosodium phosphate, disodium, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc. or mixtures of such salts), sterile, isotonic, or dry compositions, in particular lyophilized, which , by addition, as appropriate, of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • the doses of the viral vectors used for the injection can be adapted according to different parameters, and in particular depending on the mode of administration used, the pathology concerned, the heterologous sequence to be expressed or even the duration of the treatment sought.
  • the viral vectors according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 and 10 pfu / ml, and preferably 10 to 10 pfu / ml.
  • the term pfu (“plaque forming unit”) corresponds to the infectious power of a vector solution, and is determined according to conventional techniques by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 3 to 5 days, the number of ranges of infected cells.
  • the viral preparations of the invention are free of helper virus, or contain a minority proportion of helper virus.
  • the viral vectors of the invention can be used in the treatment of a large number of pathologies, for example cancers, diseases of viral origin (AIDS, hepatitis, etc.), diseases of mono- or multigenic characters ( dystrophy, cystic fibrosis etc.), neurodegenerative diseases (Alzheimer, Parkinson, ALS, etc.).
  • diseases of viral origin AIDS, hepatitis, etc.
  • diseases of mono- or multigenic characters dystrophy, cystic fibrosis etc.
  • neurodegenerative diseases Alzheimer's syndrome, Parkinson, ALS, etc.
  • the invention also relates to a method for obtaining the expression of a nucleic acid sequence in a eukaryotic cell, in particular from the chromosomes thereof, this method comprising the infection of a first eukaryotic cell with at least a viral vector according to the invention, this cell then being able to synthesize and release retroviral vectors, and the infection of a second eukaryotic cell by the retroviral vectors thus obtained.
  • This process can be carried out in vivo or in vitro.
  • the invention also relates to a method for producing viral vectors.
  • This process varies according to the nature of the starting DNA molecule, that is to say that it is a molecule which does not comprise the entire genome of a DNA virus but which comprises at least the packaging signals and the origin of replication ("amplicon” approach), or if it is a molecule which corresponds to the entire genome of a defective recombinant virus ("recombinant virus” approach ).
  • the process for producing the viral vector comprises the following steps: a) transfection of a eukaryotic cell with a plasmid containing i) part of the genome of a double-stranded DNA virus, this part including at least the packaging signals and an origin of replication, and ii) a transcription unit as defined above, and b) superinfection of the eukaryotic cell with a helper DNA virus, steps a) and b) being able to be replaced by the co-transfection of the plasmid with the genome of the helper virus, c) recovery of the viral vectors produced by the cell.
  • the process for producing viral vectors comprises the following steps: a) transfection of a eukaryotic cell with a plasmid containing i) a retroviral transcription unit as defined above, and ii) on either side of this transcription unit, sequences allowing homologous recombination of the unit with the genome of a DNA virus, and b) superinfection of the cell with the DNA virus, steps a) and b) being able to be replaced by cotransfection of the plasmid with the genome of the DNA virus, c) recovery of the viral vectors produced by the cell. It is also possible to produce the viral vector by site-specific recombination using a system such as the Cre / Lox P system of phage PI, for example.
  • Figure 1 Classic strategy for the construction of retroviral vectors.
  • Figure 2 In vivo and in vitro construction strategy of retroviral vectors according to the invention.
  • FIG. 3 pA-HCMV-GPE and pA-VCT amplifying plasmids.
  • TRANSG transgene
  • VCT vector.
  • Figure 4 Preparation of the transcomplementing vector pA-HCMV-GPE / D30EBA.
  • FIG. 6 NIH3T3 cells are infected with the TE / LacZ cell supernatant. These latter cells had been infected for 48 hours (a) by the virus D30EBA alone or (b) by the vector pA-HCM-GPE / D30EBA. The blue cell foci show that the retroviral vectors integrate correctly into cellular DNA.
  • Figure 7 Production of retroviral vectors by the vector pA-HCMV-GPE / D30EBA.
  • NIH3T3 cells were infected with the TE / LacZ cell supernatant. These latter cells had been infected for 24 or 48 Hours per 3, 6, 12 and 24 ⁇ l of pA-HCMV- GPE / D30EBA vectors. No retroviral vector is detected after infection of TL / LacZ cells with the D30EBA virus alone (see "Experimental protocol" appearing in the examples).
  • Figure 8 Detection by RT-PCR of the genome of the retroviral vector.
  • Lanes 5 and 6 total RNA extracted from TE-lac2 cells
  • Lanes 3 and 4 supernatants taken from TE-lac2 cells infected with the amplicon-GPE;
  • Lane 7 supernatants taken from TE-lac2 cells infected with the helper virus D30EBA;
  • Lane 8 supernatants taken from non-infected TE-lac2 cells (control);
  • Lane 2 plasmid used to construct the TE-lac2 cells
  • Lane 1 Molecular weight marker.
  • Figure 9 NIH3T3 cells infected with supernatants of TE-lac2 cells infected with amplicon-GPE.
  • Tracks 2 to 5 the population of GPE amplicons was brought into contact with neutralizing anti-HSV-1 antibodies (lane 2), with non-specific HSV-1 antibodies (lane 3), with antibodies specific for MoMlV (lane 4), with antibodies specific for the RD114 virus (lane 5), before infecting the TE-lac2 cells.
  • Lanes 6 and 7 the supernatants taken from TE-lac2 cells infected with amplicon-GPE, were brought into contact with antibodies specific for MoMLV (lane 6) or the RD114 virus (lane 7), before infecting NIH3T3 cells. .
  • Lane 1 without addition of antibodies.
  • Figure 10 Amplicon plasmid pA-IRVlacZ.
  • Figure 11 • X-gal test carried out on NIH3T3 cells infected with the supernatant of TE-GPE cells infected with pA-IRV-LacZ / D30EBA.
  • the inventors first constructed an amplicon plasmid, called pA-HCMV-GPE, which, in addition to the bacterial and herpetic sequences mentioned above, carries the retroviral transcomplementing component: the Gag-Pol-Env (ecotropic) transcription unit of the MoMLV retrovirus (ecotropic: only infects rodent cells), expressed under the control of the HCMV promoter (very early promoter of the human cytomegalic virus) and possessing the herpetic thymidine kinase (TK) polyadenylation signal (Figure 3).
  • This transcription unit has no LTR, the packaging signal has been previously deleted, and, once introduced into a herpetic vector, should theoretically be expressed as a very early herpetic gene.
  • This transcription unit has been shown to be very functional because, after transfection of the plasmid into cells containing the vector component (TE-lac2 cells, constitutively expressing the genomic RNA of a retroviral vector carrying the lacZ gene), these cells begin to produce retroviral vectors.
  • helper helper virus used to prepare populations of amplicons pA-HCMV-GPE is itself defective (the amplicon vector is therefore produced in transcomplementing cells), so as not to contaminate any preparations of retroviral vectors with herpesviruses.
  • the inventors used the herpes strain HSV-1 D30EBA, defective for the essential gene IE3, and the cells E5 ov M64A, which contain and express the gene IE3, thus allowing the multiplication of the defective herpes virus (FIG. 4).
  • the cell lines used are: cell lines which transcomplement the IE3 gene absent in the D30EBA virus, for example E5 (1) and M64A (12); TE-lac2 cells (2), TE-GPE cells (3) and NIH3T3 cells. All these cell lines are multiplied in DMEM medium (GIBCO) containing 10% decomplemented fetal calf serum (FCS) (GIBCO).
  • the HSV-1 D30EBA virus (4) is produced with low multiplicity of infection and titrated in E5 or M64A cells, as described previously (5).
  • the E5 or M64A cells infected with HSV-1 are maintained in medium 199 (GIBCO) containing 1% FCS.
  • TE-lac2 cells infected with HSV-1 or with the herpetic vector are maintained in DMEM medium containing 10% FCS.
  • the retroviral vectors used as positive controls are produced stably by TE-GPE cells (3).
  • NIH3T3 cells are infected with these retroviral vectors, or with retroviral vectors possibly produced by TE-lac2 cells, in DMEM medium containing 10% FCS plus 8 ⁇ g / ml of polybrene (SIGMA). After 12 hours, the polybrene is removed from the culture medium.
  • SIGMA polybrene
  • the basic plasmids used in this work are the plasmid pSK + (Stratagene Cloning Systems), pUT535 (CAYLA, Toulouse), pCRIP (6), pAGO (7) and pA-SFl (8). These plasmids were produced according to a standard methodology (9) in E. coli DH5a bacteria (GIBCO).
  • Cells transfected or infected with retroviral or herpetic vectors are fixed in due time.
  • the presence of ⁇ -galactosidase activity is demonstrated by staining the cells using the X-Gal chromogen.
  • the fixing and staining of the cells is carried out as described above (11).
  • the transcription unit allowing the expression of the gag, pol and env genes under the control of the promoter of the very early gene of the human cytomegalic virus (IE- HCMV) and polyadenylation sequences of the thymidine kinase (TK) gene of the HSV-1 virus was constructed in several stages.
  • the inventors first cloned the PvuII / PvuII fragment of the plasmid pAGO, containing the TK gene from HSV-1, into the EeoRV site of the plasmid pSK +, thus creating the plasmid pSK-TK.
  • the inventors created by PCR a BglII site in the leader region of the plasmid pCRIP, 36 nucleotides upstream of the splicing donor site.
  • the BglII site is located in the promoter of the TK gene, the Mscl site is located near the 3 'end of the TK gene.
  • pTK-GPE the gag, pol and env genes are therefore under the control of the promoter and of the polyadenylation signal of the TK gene.
  • the plasmid pTK-GPE was transformed into plasmid pHCMV-GPE after exchange of the TK promoter by the promotion and activation sequences of the IE-HCMV gene.
  • the Spel / PstI fragment of pUT535, containing the regulatory sequences of the IE-HCMV gene was cloned between the Sspl and MluI sites of pTK-GPE.
  • the MluI site is located in the TK promoter.
  • E5 or M64A cells are transfected with 10 ⁇ g of pA-HCMV-GPE and superinfected the next day with HSV-1 D30EBA at a multiplicity of infection of 1 pfu / cell.
  • the infected cells are harvested, centrifuged and taken up in 199 medium. The cells are then burst by rapid freezing / thawing in liquid nitrogen, in order to release the intracellular virus.
  • Half of the viral stock obtained is used to infect E5 or M64A cells in an attempt to increase the titer of the amplicon vector. This operation can be repeated several consecutive times.
  • the viral populations obtained are heterogeneous because they are composed of vector particles and auxiliary particles (HSV-1 D30EBA).
  • the number of auxiliary particles is determined by titration on E5 or M64A cells.
  • the number of vector particles cannot be determined by titration, but it was estimated approximately by comparison with the titer of an amplicon, derived from the plasmid pA-SF1, produced in parallel.
  • the quality of the DNA of the amplicon vector, demonstrating that it contains all of the retroviral sequences, is verified according to the method of Southern (9).
  • Aliquots of the vector stock pA-HCMV-GPE / D30EBA are used to infect TE-lac2 cells with low multiplicity of infection (less than 1 pfu / cell of helper virus). At different post-infection times, aliquots of the supernatant of these cells are removed, filtered through Acrodisc filters (0.2 mm) and used to infect NIH3T3 cells, in the presence of polybrene, as described above. Forty eight hours later, an X-Gal test is performed on the NIH3T3 cells.
  • the amplicon vector thus constructed (pA-HCMV-GPE / D30EBA), produced in E5 or M64A cells with the HSV-1 D30EBA helper virus, was used to infect TE-lac2 cells. This results in the expression of the transcomplementing component in these cells, and in the production and release of retroviral vectors in their cell culture medium. To show this, samples of the culture medium of TE-lac2 cells infected with this amplicon were tested for the presence of retroviral vectors capable of infecting NIH3T3 cells and of inducing therein the expression of the LacZ gene (FIG. 5) . The inventors have shown that these retroviral vectors integrate correctly into cellular DNA because they give rise to foci of blue cells (Figure 6).
  • the inventors did not detect retroviral vectors in the supernatant of TE-lac2 cells infected with the herpes helper virus alone (therefore in the absence of the transcomplementing component) (Figure 6).
  • the quantity of retroviral vectors produced by TE-lac2 cells is directly proportional to the quantity of amplicon vector used to infect TE-lac2 cells, and this for at least the three days following the infection (Figure 7).
  • the herpetic vector transcomplementing pA-HCMV-GPE / D30EBA was produced as described in Example I.
  • RT-PCR experiments were carried out in order to demonstrate that the retroviral RNA present in the retroviral particles produced by the infected TE-lac2 cells is identical to the retroviral RNA synthesized (but not packaged) by the TE-lac2 cells non-infected.
  • RNA extracted from the pellets and purified by phenol / chloroform was subjected to a reverse transcription step followed by amplification by PCR, using two primers specific to the lacZ retroviral vector (see FIG. 8).
  • a 977 nucleotide fragment was detected, which is identical to both the RT-PCR band generated from total RNA extracted from uninfected TE-lac2 cells, and to the PCR band generated from a plasmid containing the lacZ retroviral vector.
  • No DNA fragment could be detected from the control supernatants taken from uninfected TE-lac2 cells, or from TE-lac2 cells infected with the only helper virus D30EBA.
  • Antibody neutralization experiments were carried out to confirm that the agent inducing the formation of retroviral particles is a herpetic virus, and that the agent induced is an ecotropic retrovirus.
  • Anti-HSV-1 antibodies (but not antiretroviral antibodies) have been shown to be able to inhibit the synthesis of retroviral particles when the herpetic vectors are brought into contact with the antibodies before infecting the TE-lac2 cells.
  • Anti-retrovirus antibodies (but not anti-HSV-1 antibodies) are capable of inhibiting infection of NIH3T3 cells by the supernatants of TL-lacZ cells.
  • anti-retrovirus antibodies were goat antisera obtained against the Rauscher's leukemia virus (RLV), or against the protein RD114 gp70-SU.
  • Anti-HSV-1 antibodies were purified polyclonal rabbit immunoglobulins obtained against HSV-1 (B-114, DAKO). Purified rabbit, non-immune immunoglobulins (Z-182, DAKO), were used as a control.
  • Human and murine monoclonal antibodies specific for HSV-1 glycoprotein D (gD) have also been used with similar results.
  • the neutralization experiments were carried out by incubating dilutions of virus, for 1 hour at room temperature, with appropriate dilutions of each antiserum. The virus-serum mixtures were then used to infect the corresponding target cells (TE-lac2 OR NIH3T3).
  • TE-lac2 cells infected with the GPE amplicon (pA-CMV-GPE / D30EBA) were brought into contact with NIH3T3 or human TE671 murine cells (ATCC CRL 8805), in the presence of polybrene (to improve the effectiveness of retroviral infection).
  • the expression of ⁇ -galactosidase was determined 48 hours later.
  • NIH3T3 cells exhibited foci of lacZ-expressing cells, indicating that the supernatants used to carry out the infection contained ecotropic lacZ retroviral vectors.
  • TE671 cells did not exhibit such colonies.
  • the ecotropic character of the LacZ vectors produced by TE-lac2 cells infected with the GPE amplicon has been confirmed by neutralization experiments, using either antibodies directed against the ecotropic envelope glycoprotein, or antibodies against the RD114 retovirus. which belongs to a distinct group of receptors (reference 13).
  • Anti-RLV anti-retroviral antibodies are capable of inhibiting infection of 3T3 cells by the supernatants of infected TE-lac2 cells. This demonstrates that the induced agent is an ecotropic retrovirus.
  • helper viruses for example D30EBA. Amplicon vector preparations are then often contaminated by the presence of helper virus particles.
  • the inventors have found that the higher the proportion of amplicon vectors compared to that of the helper virus, the higher the titles of retroviral vectors obtained.
  • the helper virus: vector ratio is enriched by the experimental addition of helper virus particles, an inhibition of the formation of retroviral vectors is observed, suggesting that an excess of contaminating helper virus can inhibit the production of retroviruses. It is therefore possible that the production of retroviral vectors takes place only in TE-lac2 cells infected only with amplicon particles, and not in cells co-infected with a combination of amplicon and auxiliary particles (reference 8 ).
  • TE-lac2 cell cultures produce relatively high retrovirus titers
  • helper virus present in the viral preparation. This can be done using known techniques to obtain helper-free preparations (Reference 16). Alternatively, helper viruses that have undergone additional modifications to reduce their cytotoxicity can be used.
  • the amplicon pA-IRV LacZ plasmid 12041 bp, illustrated in FIG. 10, was constructed by the insertion of the herpetic "amplicon module" (oris and "a") into the Seal restriction site of the plasmid pIRV-Neo- Act-LacZ (reference 14). This site is located downstream of the LTR 3 'box.
  • the amplicon plasmid pA-IRV LacZ contains the 5 'and 3' LTRs and the packaging signals of MoMulv, the NeoR gene under the control of the LTR and the LacZ gene under the control of the rat ⁇ -actin promoter, and the herpes oris and "a" sequences.
  • TE-GPE cells which have been constructed by integrating into the chromosomes of TE671 cells (ATCC CRL 8805) two distinct transcription units, l 'one containing the gagpol retroviral genes and the other containing the env (ecotropic) gene.
  • the three transcomplementing genes belong to the Moloney leukemia virus (MoMLV).
  • NIH3T3 cells were fixed and subjected to an X-Gal test 48 hours after infection. The results are illustrated in Figure 11.
  • the foci of blue NIH3T3 cells show that the retroviral vectors produced by TE-GPE cells infected with pA-IRV-LacZ / D30EBA integrate into cellular DNA.
  • the supernatant of TE-GPE cells infected with a control amplicon not containing retroviral sequences does not give rise to blue foci when it is brought into contact with NIH3T3 cells.
  • An amplicon plasmid comprising both the “transcomplementing” and “vector” retroviral elements was constructed by the insertion of the herpetic amplicon module (oris and “a”) into the pBMC-6 plasmid.
  • This plasmid is a “plasmovirus” derived from the plasmid pV-lacZ-env (reference 15), containing two distinct transcription units, one containing the genes Gag, Pol, LacZ and the packaging signals, retroviral, and the another containing the Env gene under the control of the HCMV promoter.
  • the plasmid pBMC-6 contains an ecotropic Env gene, while that of pV-lacZ-env is amphotropic.
  • the 18 kb amplicon pA-BMC-6 plasmid is then used in the protocol, as described in Examples I and III, to produce amplicon vectors in M64A cells using D30EBA as helper virus. Then TE671 cells are infected with this vector. The X-Gal test is carried out on 3T3 cells which have been brought into contact with the supernatant of infected TE cells. Blue foci have been detected, confirming that lacZ-expressing retroviral particles are present in the supernatant of infected TE cells, and that the retroviral vector integrates into the genome of NIH3T3 cells. References
  • Cosset FL Takeuchi Y, Battini JL, Weiss RA and Collins MKL (1995). High titer packaging cell producing recombinant retroviruses resistant to human serum. J Virol, 69, in press.
  • Herpes simplex virus 1 helper co-infection affects the distribution of an amplicon encoded protein in glia. NeuroReport 5, 1625-1630.

Abstract

L'invention concerne un procédé de production de vecteurs rétroviraux aptes pour le transfert de séquences d'acide nucléique dans des cellules eucaryotes, caractérisé par l'infection d'une cellule eucaryote par au moins un vecteur viral herpétique, les éléments rétroviraux nécessaires pour l'accomplissement du cycle rétroviral étant fournis soit par le ou les vecteur(s) herpétique(s), soit par le(s) vecteur(s) herpétique(s) en association avec des éléments rétroviraux compris au sein du génome de la cellule eucaryote.

Description

PRODUCTION DE VECTEURS RETROVIRAUX PAR L'INTERMEDIAIRE DE VECTEURS HERPETIQUES
L'invention concerne un procédé de production de vecteurs rétroviraux aptes pour le transfert de séquences d'acides nucléiques dans différents types de cellules et organismes. L'invention concerne également les acides nucléiques et les vecteurs viraux utilisés dans le procédé. Par ailleurs, l'invention vise l'utilisation des vecteurs en thérapie génique et les composants pharmaceutiques correspondants.
Les vecteurs rétroviraux sont souvent utilisés en thérapie génique pour le transfert de gènes dans des cellules et organismes. En effet, grâce à leur activité intégrase, ils permettent le transfert et l'intégration stable d'une séquence codante ou non-codante ayant une taille pouvant aller jusqu'à 7 Kb.
Les vecteurs rétroviraux sont couramment produits à partir de lignées cellulaires encapsidanteε (ou transcomplémentantes) , dans lesquelles les deux éléments fondamentaux qui permettent la formation du vecteur retroviral sont intégrés dans les chromosomes cellulaires (figure 1). Ces éléments sont, d'une part, la "composante transcomplémentante", unité transcriptionnelle capable d'exprimer les gènes rétroviraux Gag-Pol-Env (GPE) , ou bien Gag-Pol et Env, permettant la synthèse des constituants protéiques de la particule rétrovirale, et d'autre part, la "composante vecteur", unité transcriptionnelle capable d'exprimer et de faire encapsider le "transgène" dans les particules virales formées par la "composante transcomplémentante". Pour cela, le transgène est entouré d'un ensemble de séquences d'origines rétrovirales qui lui permettent d'être encapsidé, rétrotranscrit puis intégré et exprimé dans les chromosomes cellulaires de la cellule cible.
Les lignées encapsidantes posent cependant de nombreux problèmes : elles produisent des titres trop
5 faibles de vecteurs, dépassant rarement 10 pfu/ml.
Pour réaliser des protocoles de thérapie génique en utilisant des vecteurs rétroviraux, chez l'homme et même chez des modèles animaux, il faut des quantités de particules rétrovirales autrement plus importantes que celles que l'on est en mesure de produire aujourd'hui en utilisant les méthodes classiques. Cette limitation est d'autant plus grave que les vecteurs rétroviraux ne peuvent pas être concentrés sans perte de pouvoir infectieux.
Par ailleurs, les lignées encapsidantes génèrent souvent des rétrovirus recombinants, qui sont parfois compétents pour la réplication. Ce phénomène est tout à fait indésirable dans un protocole de thérapie génique.
De plus, pour différentes raisons, ces systèmes ne peuvent généralement pas être utilisés pour une production de vecteurs rétroviraux in vivo.
Des procédures de production transitoire ont été également développées : elles se basent toutes sur la cotransfection de différents plasmides portant les différentes composantes d'un vecteur retroviral. Ces plasmides peuvent parfois être amplifiés dans les cellules, mais ils sont dans tous les cas introduits dans celles-ci par transfection, ce qui limite considérablement leur utilisation et leur efficacité.
Récemment, Flamant et al. (Virology, 211, 234- 240, 1995) ont décrit une méthode "one-step" (désignée "virofection") pour la production de vecteurs rétroviraux. La méthode implique la co-transfection d'une cellule eucaryote avec d'une part, un composant retroviral "vecteur" et d'autre part, un composant retroviral "transcomplémentant". L'obtention de vecteurs rétroviraux est décrite, cette méthode repose néanmoins sur la transfection des cellules, limitant son utilisation et son efficacité.
Le problème que se propose de résoudre la présente invention est donc de fournir une méthode de production de vecteurs rétroviraux permettant l'obtention de vecteurs, à partir d'un grand nombre de types cellulaires différents (même ceux normalement non-infectableF par des rétrovirus) , à des titres élevés, et réduisant la probabilité de générer des rétrovirus recombinants.
Ces objectifs sont atteints par le procédé de 1'invention qui vise la production de vecteurs rétroviraux par l'infection de cellules eucaryotes par des vecteurs viraux comportant, intégrés dans le génome, les éléments nécessaires pour la synthèse d'un vecteur retroviral.
Le procédé de l'invention repose sur l'utilisation de virus, et notamment de virus herpétique, en tant que source d'ADN. Selon l'invention, au lieu d'être intégrées dans les chromosomes cellulaires, les deux composants rétroviraux "transcomplémentant" et "vecteur" sont introduits dans le génome d'un vecteur viral herpétique sous le contrôle de promoteurs appropriés (figure 2) . Les composants rétroviraux (sous forme d'ADN, ou proviral) sont donc transcrits à partir d'éléments génétiques extrachromosiques (le génome du vecteur viral) et le vecteur retroviral est assemblé dans la cellule. Celle-ci relâche alors les vecteurs rétroviraux et ils peuvent infecter les cellules avoisinantes.
La technique de l'invention permet d'améliorer la production des vecteurs rétroviraux. Tout d'abord, la productivité des vecteurs rétroviraux est améliorée, car l'infection des cellules avec le vecteur viral à haute multiplicité d'infection permet d'augmenter la synthèse des protéines retrovirales. En effet, selon l'invention, les titres de production de vecteurs
Q rétroviraux peuvent être supérieurs à 10 pfu/ml, par exemple entre 10 9 et 1011 pfu/ml.
De plus, la probabilité de générer des rétrovirus recombinants est fortement réduite puisque la production de \ecteurs rétroviraux par l'intermédiaire du vecteur viral n'a lieu que de manière transitoire et/ou inductible.
En outre, cette procédure ouvre la possibilité que les vecteurs rétroviraux soient synthétisés directement in vivo, à l'intérieur de l'organisme receveur, par la simple inoculation, éventuellement localisée, du vecteur viral ; ce dernier infecte les cellules de l'organisme receveur et ces cellules se voient alors produire des vecteurs rétroviraux qui peuvent faire intégrer le transgène dans les cellules avoisinantes. Le procédé permet donc d'infecter, avec les vecteurs viraux, des cellules dans l'organisme animal afin de produire directement les vecteurs rétroviraux in situ, à partir des neurones, myotubes, hépatocytes ou virtuellement tout autre type cellulaire, post-mitotique ou pas. Ceci n'est possible actuellement qu'en réalisant des re-implantations des cellules autologues génétiquement modifiées ex vivo et est limité aux seules cellules capables de réaliser des mitoses. Le procédé de l'invention permet la production de vecteurs rétroviraux dans des cellules qui normalement ne sont pas infectable par des rétrovirus.
Selon l'invention, il a été constaté que toutes les étapes nécessaires à la production de particules retrovirales (expression, épissage, traduction, modifications post-traductionelles, assemblage, encapsidation, relâchage de virus) ont lieu correctement dans un contexte d'infection herpétique, utilisant les produits d'expression codés par le virus herpétique. Les vecteurs herpétiques défectifs permettent donc la synthèse et l'assemblage fonctionnel de toutes les protéines et acides nucléiques nécessaires pour la production de particules infectieuses de virus appartenant à une famille virale distincte.
L'invention concerne un procédé de production de vecteurs ritroviraux aptes pour le transfert de séquences d'acide nucléique dans des cellules eucaryotes, ledit procédé comprenant l'introduction dans une cellule eucaryote d'au moins un composant retroviral dit "vecteur" et/ou d'au moins un composant retroviral dit "transcomplémentant", le composant vecteur comportant, outre la séquence à transférer, les signaux agissant en cis nécessaires pour l'accomplissement du cycle retroviral, et le composant transcomplémentant comportant les séquences agissant en trans nécessaires pour l'accomplissement du cycle retroviral, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'introduction du ou des composant(s) retroviral(aux) dans la cellule est effectuée par l'infection de la cellule par au moins un vecteur viral dérivé d'un virus à ADN double brin, notamment herpétique, et contenant, intégré(s) dans son génome, ledit ou lesdits composant(s) retroviral(aux) , la cellule eucaryote étant alors capable de synthétiser et de relâcher des vecteurs rétroviraux.
En d'autres termes, le procédé de l'invention comprend, ou consiste en, l'infection d'une cellule eucaryote par au moins un vecteur viral, de préférence herpétique, les éléments rétroviraux nécessaires pour l'accomplissement du cycle retroviral étant fournis soit par le ou les vecteur(s) herpétique(s) , soit par le(s) vecteur(s) herpétique(s) en association avec des éléments rétroviraux compris au sein du génome de la cellule eucaryote.
Normalement, le vecteur viral contient un composant retroviral "vecteur" (c'est-à-dire un ou plusieurs éléments d'origine retrovirale) et/ou un composant retroviral "transcomplémentant".
Selon cette variante, l'invention concerne un procédé de production de vecteurs rétroviraux aptes pour le transfert de séquences d'acide nucléique dans des cellules eucaryotes, ledit procédé comprenant l'introduction dans une cellule eucaryote d'au moins un composant retroviral dit "vecteur" et/ou d'au moins un composant retroviral dit "transcomplémentant", le composant vecteur comportant, outre la séquence à transférer, tous les signaux agissant en cis nécessaires pour l'accomplissement du cycle retroviral, et le composant transcomplémentant comportant les gènes rétroviraux gag, pol et env et étant dépourvu de signal d'encapsidation retroviral, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'introduction du ou des composant(s) retroviral(aux) dans la cellule est effectuée par l'intermédiaire d'au moins un vecteur viral dérivé d'un virus à ADN double brin, notamment un vecteur herpétique, capable d'infecter la cellule et contenant, intégré(s) dans son génome, ledit ou lesdits composant(s) retroviral(aux) , la cellule eucaryote étant alors capable de synthétiser et de relâcher des vecteurs rétroviraux.
Dans le contexte de l'invention, l'expression "vecteur retroviral" signifie un rétrovirus recombinant, (qui peut être défectif pour la réplication), c'est-à-dire une molécule d'ARN portant une ou plusieurs séquence(s) à transférer ainsi que les signaux rétroviraux de rétrotranscription, intégration, transcription et encapsidation, cette molécule étant encapsidée dans une particule retrovirale. Le vecteur retroviral est normalement incapable de se répliquer.
Le terme "vecteur viral" signifie un vecteur herpétique (qui peut être défectif), c'est-à-dire une molécule d'ADN portant les signaux nécessaires à la réplication, à la transcription et à l'encapsidation, cette molécule étant encapsidée dans une particule virale typique d'un virus à ADN. Le vecteur est incapable de se répliquer en dehors d'un système (viral ou cellulaire) transcomplémentant. « Vecteur herpétique » signifie un vecteur dérivé d'un virus de la famille des Herpesviridae.
Les termes "les signaux agissant en cis nécessaires pour l'accomplissement du cycle retroviral" signifient les signaux rétroviraux nécessaires à l'encapsidation, la rétrotranscription, l'intégration et la régulation de la transcription/expression.
Les séquences agissant en trans sont celles codant pour les protéines retrovirales, par exemple les gènes gag, pol et env.
Les séquences agissant en cis et celles agissant en trans sont normalement comprises au sein de deux unités de transcription indépendentes. Dans ce cas, les unités de transcription peuvent, à leur tour, être comprises, soit dans les génomes de deux vecteurs herpétiques différents, soit dans le génome d'un seul vecteur herpétique. Il est également possible que certaines des séquences agissant en trans (par exemple gag-pol) soient incluses dans la même unité de transcription que celle codant pour les composants rétroviraux agissant en cis.
Selon le procédé de l'invention, les vecteurs viraux sont défectifs, apathogènes et n'induisent pas la mort cellulaire rapide, ni ne donnent lieu à la production des virus à ADN, en dehors d'un système (viral ou cellulaire) transcomplémentant. Le génome des vecteurs viraux de l'invention comporte d'une part des séquences propres à un virus à ADN, et d'autre part des séquences propres à un rétrovirus. Normalement, les séquences génomiques propres à un virus à ADN double brin incluent au moins une séquence d'encapsidation et une origine de réplication.
Lorsque les séquences propres au virus d'ADN ne correspondent pas à la totalité du génome mais incluent au moins les séquences d'encapsidation et l'origine de réplication, le génome du vecteur viral est en fait plasmidique. Le plasmide comprend, en outre, des séquences d'origine bactérienne permettant son clonage et sa sélection dans un hôte bactérien, par exemple E. coli. notamment une origine de réplication et un gène de sélection. Le vecteur viral, souvent appelé "amplicon", est alors un concatamère composé de répétitions du plasmide linéarisé et encapsidé.
Selon une approche alternative, le génome du vecteur viral peut contenir la totalité du génome du virus à ADN, à l'exception d'au moins un gène essentiel, pour la réplication. Dans ce cas, le vecteur viral est réellement un virus recombinant défectif.
Les virus à ADN qui forment la base des vecteurs viraux de l'invention sont choisis parmi tous les virus à ADN double brin capable d'infecter des cellules animales et de préférence de vertébrés. Les virus herpétiques sont particulièrement préférés.
Les virus herpétiques susceptibles d'être utilisés selon l'invention, comprennent tous les membres de la famille des Herpesviridae. Il peut s'agir d'alphaherpesvirinae, de betaherpesvirinae ou de gammaherpesvirinae.
Les virus herpétiques préférés sont d'origine humaine ou animale, par exemple HSV-l, HSV-2, le virus cytomégalique humain (HCMV) , les virus humains HHV-6 et HHV-7, le virus d'Epstein-Barr, le virus Varicella Zoster (VZV) , ou le virus de la pseuάorage porcine (PRV) , ou encore le BHV-1 (Bovine Herpès Virus) ou le EHV-1 (Equine Herpès virus) etc.
Les virus herpétiques sont particulièrement préférés en raison de leur grande taille (génome de 120 à 200 Kb environ) permettant l'inclusion de séquences hétérologues de taille importante. De plus, leur spectre d'hôtes cellulaire est très large. Certains virus de cette famille sont neurotropes, permettant l'infection de cellules nerveuses, tissus que ne peuvent atteindre le rétrovirus. Cette propriété est donc particulièrement avantageuse dans la thérapie génique de maladies nerveuses du CNS. D'autres membres de la famille des virus herpétiques sont lymphotropes. Ces virus peuvent être rendus défectifs par la délétion ou l'inactivation d'au moins un gène essentiel tel le gène IE3 chez HSV-l ou leurs homologues chez d'autres virus herpétiques.
Comme exemple de virus susceptibles d'être utilisés comme vecteur viral, on peut également citer les adénovirus et les pox-virus.
Les adénovirus, par exemple ceux du groupe C ou autres, peuvent également être utilisés. Ces virus ont une taille moins importante que celles des virus herpétiques (un génome d'environ 35 à 40 Kb) . Ils ont un tropisme naturel pour l'épithélium respiratoire, la cornée et le tractus digestif. Ces virus peuvent être rendus défectifs par la délétion de tout ou partie des gènes régulateurs E1A et E1B.
Les poxvirus peuvent également être mis en oeuvre dans la construction de vecteurs viraux selon l'invention. Ces virus ont une taille génomique d'environ 120 à 300 Kb. Ils ont un spectre de cellules hôtes large. Parmi cette famille de virus, le virus de la vaccine est préféré. Selon l'invention, le vecteur viral comprend dans son génome, outre les séquences propres au virus à ADN décrit ci-dessus, des séquences d'origine retrovirale c'est-à-dire un "composant retroviral" qui comprend en particulier, au moins une unité de transcription retrovirale.
Dans le contexte de l'invention, l'expression "unité de transcription retrovirale" signifie une séquence d'ADN, comprenant un premier élément constitué des séquences régulatrices nécessaires à la transcription et un deuxième élément constitué d'au moins une séquence à transcrire, l'un ou l'autre de ces éléments étant au moins en partie d'origine retrovirale. De préférence, l'élément d'origine retrovirale correspond soit à la partie du génome retroviral agissant en cis, soit à la partie du génome retroviral agissant en trans pour l'accomplissement du cycle retroviral.
Plus particulièrement, l'une des unités de transcription retrovirale (dit "unité de transcription transcomplémentante") comporte des séquences codant pour les protéines Gag, Pol et/ou Env sous le contrôle de séquences régulatrices fonctionnelles dans la cellule eucaryote. Il est possible d'introduire des variantes des gènes gag, pol et env, ces variantes comportant des substitutions, délétions ou insertions de nucleotides par rapport aux gènes sauvages, à condition que les fonctions essentielles des protéines soient maintenues. Ces fonctions sont les suivantes : gag code pour le précurseur des protéines de capside ; pol donne lieu à la transcriptase inverse et à une enzyme impliquée dans l'intégration provirale et env code pour le précurseur de la glycoproteine d'enveloppe.
Il est possible d'inclure le gène env sur une unité de transcription indépendante de celle contenant gag et pol. Cette unité de transcription indépendante peut elle-même être incluse dans la même molécule d'ADN et par conséquent dans le même vecteur viral, ou peut en revanche être incluse dans un vecteur viral séparé.
Les séquences régulatrices mises en oeuvre dans l'unité de transcription transcomplémentante comprennent des séquences d'initiation et de terminaison de transcription, fonctionnelles dans la cellule hôte. Ces séquences peuvent être d'origine animale ou virale. Comme promoteur, on peut citer des promoteurs fort et constitutif, par exemple le promoteur HCMV, le promoteur du gène herpétique IE3, ou celui de la thymidine kinase herpétique. On peut également avoir recours à deε promoteurs spécifiques de tissus ou à des promoteurs inductibles. Comme exemple de promoteur spécifique de tissu, on peut citer le promoteur du préproenképhaline, le promoteur de l'énolase-neurospécifique, et les promoteurs de n'importe quel gène s'exprimant dans un tissu particulier. Comme exemple de promoteur inductible, on peut citer les promoteurs des protéines de choc thermique, etc..
L'unité de transcription "vecteur" comporte : une séquence dite "hétérologue" sous le contrôle de séquences régulatrices de transcription, fonctionnelles dans la cellule eucaryote ;
- une séquence d'origine retrovirale permettant 1'encapsidation du transcrit et sa rétrotranscription ;
- au moins une partie des LTR 5' et 3' d'un rétrovirus, ladite partie conférant la capacité d'encapsidation, de rétrotranscription et d'intégration.
La séquence "hétérologue" comprise au sein de cette unité de transcription peut être toute séquence dont le transfert dans la cellule ou organisme cible est désiré. Il s'agit de toute séquence transcriptible codant pour une ou plusieurs protéine(s) ou pour une partie d'une protéine, ou qui donne lieu, après transcription, à une séquence complémentaire d'un produit de transcription endogène ou exogène à la cellule, par exemple complémentaire d'une séquence virale. La séquence hétérologue est normalement d'origine non-rétrovirale et peut comprendre une ou plusieurs séquence(s) codante(s) ou non-codante(s) , ou un mélange des deux. Elle peut être hétérologue ou homologue vis-à-vis de la cellule et hétérologue ou homologue vis-à-vis du vecteur. La séquence hétérologue peut aussi être désignée "transgène". La taille de la séquence hétérologue doit être compatible avec 1'encapsidation des particules retrovirales (environ 7 Kb) .
La séquence hétérologue est souvent une séquence dont le produit de transcription ou de traduction exerce un effet thérapeutique dans une cellule ou dans un organisme. Comme exemple de séquences hétérologues, on peut citer un gène thérapeutique de maladie à caractère mono- ou multigénique, un gène codant pour une cytokine, un gène suicide, un gène suicide conditionnel, un gène à activité antivirale, un gène à activité antitumorale, un gène thérapeutique de maladie neurodégénérative, ou un gène marqueur.
Plus particulièrement, la séquence hétérologue peut être une séquence codant pour une enzyme, un dérivé sanguin, une hormone, une lymphokine (interleukines, interférons, INF etc.), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs, la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, la thymidine kinase, la cytosine déaminase. Il peut s'agir d'une protéine antigenique capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. La séquence hétérologue peut aussi donner lieu, après transcription, à une séquence antisense ou à un ribozyme.
Il est également possible d'utiliser des séquences hétérologues codant pour des marqueurs cellulaires. Ces séquences peuvent être employées seules ou en association avec une autre séquence hétérologue.
Selon une variante de l'invention, il est possible d'inclure dans l'unité de transcription "vecteur", une partie du gène retroviral gag pour améliorer l'encapsidation du transcrit. Il s'agit normalement d'un fragment d'environ 600 nucleotides à partir du codon initiateur de gag.
Il est également possible d'inclure dans l'unité de transcription « vecteur », une partie des composants rétroviraux agissant en trans, par exemple gag-pol.
Pour cette unité de transcription, les séquences régulatrices de la transcription peuvent être celles présentes au sein des LTR rétroviraux ou peuvent être apportées par d'autres séquences. Il est donc possible d'inclure tout autre promoteur, fort, constitutive, spécifique de tissu ou inductible, à condition d'être fonctionnel dans la cellule hôte.
Il est néanmoins important d'inclure dans cette unité de transcription toutes les séquences retrovirales permettant l'encapsidation, la rétrotranscription et l'intégration. Ces séquences se trouvent en partie au sein des LTR. D'autres séquences qui se trouvent le long du génome retroviral sont aussi indispensables pour l'encapsidation (signaux appelés
"ψ") et la rétrotranscription.
Les séquences retrovirales mises en oeuvre dans les vecteurs de la présente invention proviennent d'un ou plusieurs rétrovirus, par exemple MoMLV, RD114, BaEV, MLV-A ; des rétrovirus de mammifères de type D, par exemple MPMV, SRV ; Spuma rétrovirus, par exemple HFV ; HIV, SIV, ASLV.
Les caractéristiques d'enveloppe, et donc le spectre d'hôtes cellulaires, sont largement déterminées par la nature de Env. Selon l'invention, il est possible de choisir l'origine de Env pour obtenir les caractéristiques souhaitées. Gag, Pol et Env peuvent provenir du même rétrovirus, par exemple MoMLV. Dans ce cas, l'enveloppe du vecteur retroviral est écotrope. Le gène Env du virus MoMLV peut être remplacé aisément par tous les gènes Env des virus mammifères de type C (amphotrope, xénotrope, RD114) ou encore par le gène Env d'autres rétrovirus non apparentés, incluant le virus HIV, ou encore par des gènes codant pour des enveloppes non-rétrovirales, par exemple VSV-G. Il en va de même pour les gènes Gag-Pol. Ceci permet au système de s'adapter aisément à une grande diversité de situations rencontrées dans les applications potentielles.
Pour le traitement de maladies d'origine retrovirale telle que le SIDA, il est possible d'utiliser Gag, Pol et Env du rétrovirus en question, par exemple HIV, afin que le vecteur retroviral atteigne les cellules infectées. Le choix approprié de virus à ADN comme vecteur viral, et le choix d'éléments rétroviraux, confère une très grande souplesse au système de transfert de gène de l'invention.
Le type de cellule susceptible d'être infectée par les vecteurs de l'invention varie selon le choix du vecteur viral. Normalement, il s'agit d'une cellule de vertébré, plus particulièrement de mammifère, par exemple des cellules de lignéage hématopoiétiques, cellules souches y compris des cellules souches fibroblastiques, épithéliales, hématopoiétiques et nerveuses, ou des cellules différenciées d'origine ectodermique, mésodermique ou endodermique. La production de vecteurs rétroviraux selon l'invention peut avoir lieu in vivo, ex vivo ou in vitro.
Pour la production de vecteurs rétroviraux in vivo, ex vivo et in vitro, l'on introduit dans la cellule eucaryote à la fois un élément ou des deléments retroviral(aux) vecteur(s) et un élément ou des éléments retroviral(aux) transcomplémentant(s) , ces différents composants rétroviraux étant compris, soit dans les génomes de deux vecteurs viraux différents, soit dans le génome d'un seul vecteur viral.
Si les composants rétroviraux sont compris au sein du même vecteur viral, il est recommandé d'utiliser, pour la construction du vecteur viral, un virus à ADN de grande taille, par exemple un virus herpétique ou un poxvirus. Selon cette variante, le vecteur viral est de préférence de type "virus recombinant" et non pas de type "plasmide encapsidé" (souvent appelé "amplicon") .
Il est également possible de mettre en oeuvre un autre protocole selon lequel l'on introduit dans la cellule eucaryote, par le biais du vecteur viral, un seul composant retroviral. Ce composant peut être le composant vecteur ou le composant transcomplémentant, la cellule eucaryote ayant déjà, intégré dans son génome, l'autre des deux composants. Cette variante de l'invention met donc en oeuvre des cellules eucaryotes apportant elles-mêmes le composant complémentaire. Cette variante du procédé peut être utilisée in vivo, ex vivo ou in vitro. In vivo, elle permet de « re¬ mobiliser » un vecteur retroviral déjà intégré dans les génomes d'une population de cellules.
Le procédé in vitro comprend normalement une étape de récupération, et éventuellement de purification, des vecteurs rétroviraux ainsi obtenus. La purification peut être faite par exemple par filtrage du surnageant des cellules, le filtre laissant passer les vecteurs et retenant tout le matériel indésirable.
Outre le procédé de production de vecteurs rétroviraux, l'invention vise également les molécules d'ADN utilisées pour la construction des vecteurs viraux et les vecteurs viraux et rétroviraux ainsi obtenus.
Les molécules d'ADN de l'invention comprennent des séquences propres au génome d'un virus à ADN double brin et incluant au moins un signal d'encapsidation et une origine de réplication, et au moins une unité de transcription retrovirale telle que définie précédemment.
Plus particulièrement, ces molécules comprennent :
I : au moins un signal d'encapsidation et une origine de réplication d'un virus à ADN, de préférence herpétique, et
II : au moins un composant retroviral constitué de : i) au moins une unité de transcription dite "unité transcomplémentante" comportant des séquences codant pour les protéines retrovirales Gag, Pol et/ou Env, sous le contrôle de séquences régulatrices de transcription, fonctionnelles dans une cellule eucaryote, cette unité de transcription étant dépourvue de signaux d'encapsidation rétroviraux et de LTR rétroviraux, et/ou ii) une unité de transcription dite "unité vecteur" comportant :
- une séquence dite "hétérologue" sous le contrôle de séquences régulatrices de transcription, fonctionnelles dans la cellule eucaryote ; une séquence d'origine retrovirale permettant 1'encapsidation du transcrit et sa rétrotranscription ; - au moins une partie des LTR 5' et 3' d'un rétrovirus, ladite partie conférant ia capacité d'encapsidation, de rétrotranscription et d'intégration.
Les différentes variantes selon cet aspect de l'invention sont décrites précédemment et comprennent notamment des modes de réalisation préférés en ce qui concerne la nature des différentes séquences.
L'invention vise également les cellules eucaryotes injectées par un ou plusieurs vecteurs viraux de l'invention. Ces cellules peuvent être in vivo ou des cultures cellulaires in vitro.
Selon une variante préférée de l'invention, les vecteurs viraux sont utilisés en thérapie génique. L'invention vise, par conséquent, une composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur viral de l'invention en «association avec un véhicule acceptable du point de vue physiologique.
La composition comprend souvent deux vecteurs viraux, l'un de type "transcomplémentant" et l'autre de type "vecteur". Les compositions peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, intracranienne etc..
De préférence, la composition pharmaceutique comprend un véhicule approprié pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc.. ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
Les doses des vecteurs viraux utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, de la séquence hétérologue à exprimer ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les vecteurs viraux selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 10 et 10 pfu/ml, et de préférence 10 à 10 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de vecteur, et est déterminé selon des techniques classiques par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 3 à 5 jours, du nombre de plages de cellules infectées.
De préférence, les préparations virales de l'invention sont dépourvues de virus auxiliaire, ou contiennent une proportion minoritaire de virus auxiliaire.
Les vecteurs viraux de l'invention peuvent être utilisés dans le traitement d'un grand nombre de pathologies, par exemple les cancers, les maladies d'origine virale (SIDA, hépatites, etc.), les maladies à caractères mono- ou multigénique (dystrophie, fibrose cystique etc.), les maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson, ALS, etc.).
L'invention vise également un procédé pour obtenir l'expression d'une séquence d'acide nucléique dans une cellule eucaryote, notamment à partir des chromosomes de celle-ci, ce procédé comprenant l'infection d'une première cellule eucaryote par au moins un vecteur viral selon l'invention, cette cellule étant alors capable de synthétiser et relâcher des vecteurs rétroviraux, et l'infection d'une deuxième cellule eucaryote par les vecteurs rétroviraux ainsi obtenus. Ce procédé peut être effectué in vivo ou in vitro. L'invention vise également un procédé de production de vecteurs viraux. Ce procédé varie selon la nature de la molécule d'ADN de départ, c'est-à-dire qu'il s'agit d'une molécule qui ne comprend pas la totalité du génome d'un virus d'ADN mais qui comprend au moins les signaux d'encapsidation et l'origine de réplication (approche "amplicon") , ou s'il s'agit d'une molécule qui correspond à la totalité du génome d'un virus recombinant défectif (approche "virus recombinant") .
Pour l'approche "amplicon", le procédé de production du vecteur viral comprend les étapes suivantes : a) la transfection d'une cellule eucaryote avec un plasmide contenant i) une partie du génome d'un virus à ADN double brin, cette partie incluant au moins les signaux d'encapsidation et une origine de réplication, et ii) une unité de transcription telle que définie précédemment, et b) surinfection de la cellule eucaryote avec un virus à ADN auxiliaire, les étapes a) et b) pouvant être remplacées par la co-transfection du plasmide avec le génome du virus auxiliaire, c) récupération des vecteurs viraux produits par la cellule.
Pour l'approche "virus recombinant", le procédé de production des vecteurs viraux comprend les étapes suivantes : a) la transfection d'une cellule eucaryote avec un plasmide contenant i) une unité de transcription retrovirale telle que définie précédemment, et ii) de part et d'autre de cette unité de transcription, des séquences permettant la recombinaison homologue de l'unité avec le génome d'un virus à ADN, et b) surinfection de la cellule avec le virus à ADN, les étapes a) et b) pouvant être remplacées par la co- tansfection du plasmide avec le génome du virus à ADN, c) récupération des vecteurs viraux produits par la cellule. Il est également possible de produire le vecteur viral par recombinaison spécifique de site en utilisant un système tel que le système Cre/Lox P du phage PI, par exemple.
Différents aspects de 1 ' invention sont illustrés dans les figures :
Figure 1 : Stratégie classique de construction de vecteurs rétroviraux.
Figure 2 : Stratégie de construction in vivo et in vitro de vecteurs rétroviraux selon l'invention.
Figure 3 : Plasmides amplicons pA-HCMV-GPE et pA-VCT. TRANSG = transgène ; VCT = vecteur.
Figure 4 : Préparation du vecteur transcomplémentant pA-HCMV-GPE/D30EBA.
Figure 5 : Protocole expérimental décrit dans les exemples.
Figure 6 : Des cellules NIH3T3 sont infectées par le surnageant de cellules TE/LacZ. Ces dernières cellules avaient été infectées pendant 48 Heures (a) par le virus D30EBA seul ou (b) par le vecteur pA-HCM- GPE/D30EBA. Les foyers de cellules bleues montrent que les vecteurs rétroviraux s' intègrent correctement dans l'ADN cellulaire.
Figure 7 : Production de vecteurs rétroviraux par le vecteur pA-HCMV-GPE/D30EBA. Des cellules NIH3T3 ont été infectées par le surnageant de cellules TE/LacZ. Ces dernières cellules avaient été infectées pendant 24 ou 48 Heures par 3, 6, 12 et 24 μl de vecteurs pA-HCMV- GPE/D30EBA. Aucun vecteur retroviral n'est détecté après infection de cellules TL/LacZ par le virus D30EBA seul (voir "Protocole expérimental" figurant dans les exemples) .
Figure 8 :Détection par RT-PCR du génome du vecteur retroviral.
Pistes 5 et 6 : ARN total extrait de cellules TE-lac2 ;
Pistes 3 et 4 : surnageants prélevés de cellules TE- lac2 infectées par 1 'amplicon-GPE ;
Piste 7 : surnageants prélevés de cellules TE-lac2 infectées par le virus auxiliaire D30EBA ;
Piste 8 : surnageants prélevés de cellules TE-lac2 non- infectees (témoin) ;
Piste 2 :plasmide utilisé pouuuur construire les cellules TE-lac2 ;
Piste 1 : Marqueur de poids moléculaire.
Figure 9 : Cellules NIH3T3 infectées par les surnageants de cellules TE-lac2 infectées par amplicon- GPE. Pistes 2 à 5 : la population de amplicons-GPE a été mise en contact avec des anticorps anti-HSV-1 neutralisants (piste 2) , avec des anticorps non- spécifiques de HSV-l (lane 3), avec des anticorps spécifiques du MoMlV (piste 4) , avec des anticorps spécifiques du virus RD114 (lane 5) , avant d'infecter les cellules TE-lac2. Pistes 6 et 7 : les surnageants prélevés de cellules TE-lac2 infectées par amplicon- GPE, ont été mis en contact avec des anticorps spécifiques du MoMLV (piste 6) ou du virus RD114 (piste 7), avant d'infecter des cellulues NIH3T3. Piste 1 : sans addition d'anticorps.
Figure 10 : Plasmide amplicon pA-IRVlacZ. Figure 11 :• Test X-gal effectué sur des cellules NIH3T3 infectées par le surnageant de cellules TE-GPE infectées par pA-IRV-LacZ/D30EBA.
EXEMPLES
I. Production de vecteurs rétroviraux par infection de cellules TE-lac2 par le vecteur herpétique transcomplémentant pA-HCMV-GPE/D30EBA :
Les inventeurs ont d'abord construit un plasmide amplicon, appelé pA-HCMV-GPE, qui, outre les séquences bactériennes et herpétiques mentionnées plus haut, porte la composante transcomplémentante retrovirale : l'unité de transcription Gag-Pol-Env (écotrope) du rétrovirus de MoMLV (écotrope : n'infecte que les cellules de rongeurs) , exprimée sous contrôle du promoteur HCMV (promoteur très précoce du virus cytomégalique humain) et possédant le signal de polyadénylation de la thymidine kinase (TK) herpétique (figure 3) . Cette unité de transcription ne possède aucune LTR, le signal d'encapsidation a été préalablement délété, et, une fois introduite dans un vecteur herpétique, devrait théoriquement s'exprimer comme un gène herpétique très précoce.
Il a été démontré que cette unité de transcription est bien fonctionnelle car, après transfection du plasmide dans des cellules contenant la composante vecteur (cellules TE-lac2, exprimant constitutivement l'ARN génomique d'un vecteur retroviral portant le gène lacZ) , ces cellules se mettent à produire des vecteurs rétroviraux.
Le virus herpétique auxiliaire utilisé pour préparer les populations d'amplicons pA-HCMV-GPE est lui-même défectif (le vecteur amplicon est donc produit dans des cellules transcomplémentantes) , afin de ne pas contaminer les éventuelles préparations de vecteurs rétroviraux avec des virus herpétiques. En particulier, les inventeurs ont utilisé la souche herpétique HSV-l D30EBA, défective pour le gène essentiel IE3, et les cellules E5 ov M64A, qui contiennent et expriment le gène IE3, permettant donc la multiplication du virus herpétique défectif (figure 4).
Cellules :
Les lignées cellulaires utilisées sont : des lignées cellulaires qui transcomplémentent le gène IE3 absent dans le virus D30EBA, par exemple E5 (1) et M64A (12) ; les cellules TE-lac2 (2), les cellules TE-GPE (3) et les cellules NIH3T3. Toutes ces lignées cellulaires sont multipliées dans du milieu DMEM (GIBCO) contenant 10 % sérum de veau foetal décomplémenté (FCS) (GIBCO) .
Virus et mode d'infection :
Le virus HSV-l D30EBA (4) est produit à faible multiplicité d'infection et titré dans les cellules E5 ou M64A, comme décrit précédemment (5) . Les cellules E5 ou M64A infectées par HSV-l sont entretenues dans du milieu 199 (GIBCO) contenant 1% FCS. Les cellules TE- lac2 infectées par HSV-l ou par le vecteur herpétique sont entretenues dans du milieu DMEM contenant 10 % FCS.
Les vecteurs rétroviraux utilisés en tant que témoins positifs sont produits de manière stable par les cellules TE-GPE (3) . Les cellules NIH3T3 sont infectées par ces vecteurs rétroviraux, ou par les vecteurs rétroviraux éventuellement produits par les cellules TE-lac2, dans du milieu DMEM contenant 10 % FCS plus 8 μg/ml de polybrène (SIGMA) . Après 12 heures, le polybrène est éliminé du milieu de culture. Plasmides :
Les plasmides de base utilisés dans ce travail sont le plasmide pSK+ (Stratagène Cloning Systems) , pUT535 (CAYLA, Toulouse), pCRIP (6), pAGO (7) et pA-SFl (8) . Ces plasmides ont été produits selon une méthodologie standard (9) dans des bactéries E. coli DH5a (GIBCO) .
Biochimie :
Toutes les enzymes de restriction et de modification de l'ADN (Boehringer Mannheim) ont été utilisées suivant les recommandations du fabricant. L'extraction, la purification et l'analyse de l'ADN, viral ou plasmidique, ont été réalisées suivant des procédures standard (9) .
Transfection :
Toutes les transfections ont été effectuées par précipitation de l'ADN en phosphate de calcium selon la méthode de Graham et van der Eb (10), suivie d'un choc au glyeérol 15 % quatre heures plus tard.
Fixation et coloration X-Gal ;
Les cellules transfectees ou infectées par des vecteurs rétroviraux ou herpétiques sont fixées en temps voulu. La présence d'une activité β-galactosidase est mise en évidence par coloration des cellules en utilisant le chromogène X-Gal. La fixation et la coloration des cellules est réalisée comme décrit précédemment (11) .
Construction du plasmide pA-HCMV-GPE :
L'unité de transcription permettant l'expression des gènes gag, pol et env sous contrôle du promoteur du gène très précoce du virus cytomégalique humain (IE- HCMV) et des séquences de polyadenylation du gène de la thymidine kinase (TK) du virus HSV-l a été construite en plusieurs étapes. Les inventeurs ont d'abord clone le fragment PvuII/PvuII du plasmide pAGO, contenant le gène TK de HSV-l, dans le site EeoRV du plasmide pSK+, créant ainsi le plasmide pSK-TK. Les inventeurs ont créé par PCR un site Bglll dans la région leader du plasmide pCRIP, 36 nucleotides en amont du site donneur d'épissage. Ce site Bglll et le site Nhel, situé en aval du gène env de pCRIP, ont été utilisés pour cloner les gènes rétroviraux gag, pol et env, entre les sites Bglll et Mscl du plasmide pSK-TK. Le site Bglll se trouve dans le promoteur du gène TK, le site Mscl se trouve près de l'extrémité 3' du gène TK. Dans ce plasmide appelé pTK-GPE, les gènes gag, pol et env sont donc sous contrôle du promoteur et du signal de polyadenylation du gène TK. Le plasmide pTK-GPE a été transformé en plasmide pHCMV-GPE après échange du promoteur TK par les séquences de promotion et d'activation du gène IE-HCMV. Pour ceci le fragment Spel/PstI de pUT535, contenant les séquences de régulation du gène IE-HCMV, a été clone entre les sites Sspl et MluI de pTK-GPE. Le site MluI se trouve dans le promoteur TK. De ce fait la plupart des séquences du promoteur TK disparaissent et sont remplacées par celles du gène IE-HCMV, donnant le plasmide pHCMV-GPE. Finalement, le petit fragment NruI/NruI de pA-SFl, contenant l'origine de réplication (ori-S) et le signal d'encapsidation "a" herpétiques, a été clone dans le site Eco47III de pHCMV-GPE, donnant lieu au plasmide amplicon pA-HCMV-GPE. Dans les cas où les sites de restriction utilisés pour les clonages ne sont pas compatibles, ils ont été préalablement rendus à bords francs par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymerase I d'E. coli (9) . Construction du vecteur PA-HCMV-GPE/D30EBA :
Des cellules E5 ou M64A sont transfectees avec 10 μg de pA-HCMV-GPE et surinfectées le jour suivant par HSV-l D30EBA à une multiplicité d'infection de 1 pfu/cellule. Lorsque l'effet cytopathogène est total, les cellules infectées sont récoltées, centrifugées et reprises dans du milieu 199. Les cellules sont ensuite éclatées par congélation/décongélation rapide dans l'azote liquide, afin de libérer le virus intracellulaire. La moitié du stock viral obtenu est utilisé pour infecter des cellules E5 ou M64A afin d'essayer d'augmenter le titre du vecteur amplicon. Cette opération peut être répétée plusieurs fois consécutives. Les populations virales obtenues sont hétérogènes, car composées de particules vecteurs et de particules auxiliaires (HSV-l D30EBA) . Le nombre de particules auxiliaires est déterminé par titrage sur cellules E5 ou M64A. Le nombre de particules vecteurs ne peut pas être déterminé par titrage, mais il a été estimé de manière approximative par comparaison avec le titre d'un amplicon, dérivé du plasmide pA-SFl, produit en parallèle. La qualité de l'ADN du vecteur amplicon, démontrant qu'il contient l'intégralité des séquences retrovirales, est vérifiée selon la méthode de Southern (9).
Protocole expérimental :Infection des cellules TE-lac2 comportant le composant retroviral LTR-w-LacZ-LTR :
Des aliquotes du stock de vecteur pA-HCMV- GPE/D30EBA sont utilisées pour infecter des cellules TE-lac2 à faible multiplicité d'infection (moins de 1 pfu/cell de virus auxiliaire) . A différents temps post¬ infection, des aliquotes du surnageant de ces cellules sont prélevées, filtrées sur des filtres Acrodisc (0.2 mm) et utilisées pour infecter des cellules NIH3T3, en présence de polybrène, tel qu'il est décrit plus haut. Quarante huit heures plus tard, un test X-Gal est réalisé sur les cellules NIH3T3.
Résultats :
Le vecteur amplicon ainsi construit (pA-HCMV- GPE/D30EBA) , produit dans les cellules E5 ou M64A avec le virus auxiliaire HSV-l D30EBA, a été utilisé pour infecter les cellules TE-lac2. Ceci aboutit à l'expression de la composante transcomplémentante dans ces cellules, et à la production et libération de vecteurs rétroviraux dans leur milieu de culture des cellules. Pour montrer cela, des échantillons du milieu de culture des cellules TE-lac2 infectées par cet amplicon ont été testés pour la présence de vecteurs rétroviraux capables d'infecter des cellules NIH3T3 et d'y induire l'expression du gène LacZ (Figure 5) . Les inventeurs ont montré que ces vecteurs rétroviraux s'intègrent correctement dans l'ADN cellulaire car il donnent lieu à des foyers des cellules bleues (Figure 6) . Dans l'expérience témoin, les inventeurs n'ont pas détecté de vecteurs rétroviraux dans le surnageant des cellules TE-lac2 infectées par le virus herpétique auxiliaire seul (donc en l'absence de la composante transcomplémentante) (Figure 6) . La quantité de vecteurs rétroviraux produits par les cellules TE-lac2 est directement proportionnelle à la quantité de vecteur amplicon utilisée pour infecter les cellules TE-lac2, et ceci pendant au moins les trois jours qui suivent l'infection (Figure 7) .
Ce résultat montre qu'il est possible d'infecter des cellules par un virus herpétique défectif et faire que ces cellules se mettent à produire des particules retrovirales, grâce aux protéines Gag, Pol et Env exprimées à partir du vecteur herpétique. Ces protéines semblent être maturées de manière correcte, donnant lieu à la formation de particules retrovirales infectieuses. L'infection herpétique n'inhibe pas l'expression de la composante vecteur intégrée dans les cellules TE-lac2. Cet ARN vecteur est incorporé dans les particules retrovirales formées et les particules ainsi produites sont relâchées dans le milieu de culture et sont infectieuses. Les cellules TE-lac2 infectées par les amplicons GPE produisent des particules retrovirales pendant au moins deux jours et le titre des vecteurs rétroviraux produits augmente avec la multiplicité d'infection des amplicons.
II. Confirmation de la production de vecteurs rétroviraux par des cellules TE-lac2 infectées par le vecteur herpétique transcomplémentant pA-HCMV- GPE/D30EBA
Le vecteur herpétique transcomplémentant pA-HCMV- GPE/D30EBA a été produit de la manière décrite dans l'exemple I.
1. Expériences de RT-PCR (Reverse Transcription- Polvmerase Chain Reaction)
Des expériences de RT-PCR ont été réalisées afin de démontrer que l'ARN retroviral présent dans les particules retrovirales produites par les cellules TE- lac2 infectées, est identique à l'ARN retroviral synthétisé (mais pas encapsidé) par les cellules TE- lac2 non-infectees.
Pour ces expériences, le surnageant des cellules TE-lac2 a été récupéré, filtré et centrifugé à 1000 rpm. Les surnageants ont été ensuite centrifugés à 35000 rpm pendant 1 heure afin d'obtenir des culots de particules retrovirales. L'ARN extrait des culots et purifié par phénol/chloroform a été soumis à une étape de transcription-inverse suivie d'une amplification par PCR, utilisant deux amorces spécifiques au vecteur retroviral lacZ (voir figure 8). un fragment de 977 nucleotides a été détecté, qui est identique à la fois à la bande RT-PCR générée à partir de l'ARN total extrait de cellules TE-lac2 non-infectees, et à la bande PCR générée à partir d'un plasmide contenant le vecteur retroviral lacZ. Aucun fragment d'ADN n'a pu être détecté à partir des surnageants témoins prélevés de cellules TE-lac2 non-infectees, ou de cellules TE- lac2 infectées par le seul virus auxiliaire D30EBA.
Ces résultats montrent que le génome du rétrovirus défectif lacZ exprimé par les cellules TE- lac2 ne peut être encapsidé qu'après infection de ces cellules par les amplicons GPE.
2. Expériences de neutralisation par anticorps
Des expériences de neutralisation par anticorps ont été réalisées pour confirmer que l'agent inducteur de la formation de particules retrovirales est un virus herpétique, et que l'agent induit est un rétrovirus écotrope.
Il a été démontré que les anticorps anti-HSV-1 (mais pas les anticorps antirétroviraux) sont capables d'inhiber la synthèse de particules retrovirales lorsque les vecteurs herpétiques sont mis en contact avec les anticorps avant d'infecter les cellules TE- lac2. Les anticorps anti-rétrovirus (mais pas les anticorps anti-HSV-1) sont capables d'inhiber l'infection des cellules NIH3T3 par les surnageants des cellules TL-lacZ.
Pour ces expériences, les anticorps anti- rétrovirus étaient des antisera de chèvre obtenus contre le virus de la leucémie de Rauscher (RLV) , ou contre la protéine RD114 gp70-SU. Les anticorps anti- HSV-l étaient des immunoglobulines polyclonales purifiées de lapin obtenues contre HSV-l (B-114, DAKO) . Des immunoglobulines purifiées de lapin, non-immunes (Z-182, DAKO) , étaient employées comme témoin. Des anticorps monoclonaux humains et murins spécifiques à la glycoproteine D (gD) de HSV-l ont également été utilisés avec des résultats similaires.
Les expériences de neutralisation ont été effectuées en incubant des dilutions de virus, pendant 1 heure à température ambiante, avec des dilutions appropriées de chaque antiserum. Les mélanges virus- sérum ont alors été utilisés pour infecter les cellules cibles correspondantes (TE-lac2 OU NIH3T3) .
i) Vecteur herpétique et anticorps anti-HSV-1 en contact avec das cellules TE-lac2
Il a été démontré que la mise en contact préalable du mélange virus herpétique (pA-HCMV- GPE/D30EBA) / anti-HSV-1 (polyclonaux et monoclonaux) avant l'infection de cellules TE-lac2 conduit à l'inhibition de la synthèse de particules retrovirales. Des anticorps non-spécifiques, ou des anticorps spécifiques du virus RLV (type de MoMLV) ou du virus RD114 ne donnent pas lieu à une inhibition de génération de particules retrovirales (voir figure 9D, pistes 2 à 5) . Ceci démontre que l'agent inducteur est un virus herpétique et non pas un rétrovirus contaminant.
ii) Vecteur retroviral et anticorps anti-rétrovirus en contact avec des cellules NIH3T3
Des aliquotes du surnageant des cellules TE-lac2 infectées par l'amplicon GPE (pA-CMV-GPE/D30EBA) ont été mis en contact avec des cellules murines NIH3T3 ou humaines TE671 (ATCC CRL 8805) , en présence de polybrène (pour améliorer l'efficacité de l'infection retrovirale) . L'expression de β-galactosidase a été déterminée 48 heures plus tard. Les cellules NIH3T3 présentaient des foyers de cellules exprimant lacZ, indiquant que les surnageants utilisés pour effectuer 1'infection contenaient des vecteurs rétroviraux lacZ écotropiques. Les cellules TE671 ne présentaient pas de telles colonies.
Les cellules NIH3T3 infectées par des surnageants témoins prélevés de cellules TE-lac2 non-infectees, ou de cellules TE-lac2 infectées par le virus auxiliaire D30EBA, seul, ne présentaient pas d'activité lacZ.
Le caractère écotropique des vecteurs LacZ produits par les cellules TE-lac2 infectées par l'amplicon GPE a été confirmé par des expérience de neutralisation, mettant en oeuvre soit des anticorps dirigés contre la glycoproteine d'enveloppe écotropique, soit des anticorps contre le rétovirus RD114 qui appartient à un groupe distinct de récepteurs (référence 13) .
Seuls les anticorps spécifiques à la glycoproteine d'enveloppe écotropique montrent une activité de neutralisation, lorsqu'ils sont ajoutés avant infection de cellules NIH3T3 (figure 9D, pistes 6 et 7) . Les anticorps anti-rétroviraux anti-RLV (mais pas les anticorps anti RD114 ou anti-HSV-1) sont capables d'inhiber l'infection des cellules 3T3 par les surnageants des cellules TE-lac2 infectées. Ceci démontre que l'agent induit est un rétrovirus écotrope.
3. Vérification, dans le surnageant des cellules TE- lac2 infectées par l'amplicon GPE. de l'absence de vecteurs rétroviraux compétents pour la réplication :
L'epérience suivante a été effectuée afin de confirmer que les surnageants des cellules TE-lac2 infectées par 1'amplicon GPE étaient exemptes de vecteurs rétroviraux compétents pour la réplication. En effet, des événements de recombinaison auraient pu éventuellement conduire à la formation de vecteurs rétroviraux compétents pour la réplication.
Des aliquotes de surnageant ont été mis en contact avec des cellules 3T3-LacZ (réf. 2) , exprimant un rétrovirus-LacZ, défectif. La présence de vecteurs rétroviraux capables de transduire l'expression de β- galactosidase dans des cellules NIH3T3 a été testé trois jours plus tard. Aucune formation de vecteurs LacZ n'a pu être observée, indiquant que les vecteurs rétroviraux produits par l'amplicon GPE étaient dépourvus de rétrovirus compétent pour la réplication.
4. Aspects Quantitatifs :
La production de vecteurs amplicons est dépendente de l'utilisation de virus auxiliaire (par exemple D30EBA) . Les préparations de vecteurs amplicons sont alors souvent contaminées par la présence de particules de virus auxiliaire.
Les inventeurs ont constaté que plus la proportion de vecteurs amplicon est élevée par rapport à celle du virus auxiliaire, plus les titres de vecteurs rétroviraux obtenus sont élevés. De plus, lorsque le rapport virus auxiliaire : vecteur est enrichi par l'addition expérimentale de particules de virus auxiliaire, on observe une inhibition de la formation de vecteurs rétroviraux, suggérant qu'un excès de virus auxiliaire contaminant peut inhiber la production de rétrovirus. Il est donc possible que la production de vecteurs rétroviraux n'ait lieu que dans les cellules TE-lac2 infectées seulement par des particules amplicon, et non pas dans des cellules co- infectees par une combinaison d'amplicon et de particules auxiliaires (référence 8) .
Dans les conditions expérimentales appliquées ici, il est estimé qu'environ 1% des cellules TE-lac2 étaient infectées par le vecteur amplicon seul.
Néanmoins, les cultures des cellules TE-lac2 produisent des titres de rétrovirus relativement élevés
4 (supérieure à 10 lacZ-CFU/ml - voir Figure 9)
Afin d'optimiser les titres de vecteurs rétroviraux susceptibles d'être obtenus selon l'invention, il est donc avantageux de minimiser, ou d'éliminer, la proportion de virus auxiliaire présente dans la préparation virale. Ceci peut êttre fait en ayant recours aux techniques connues pour obtenir des préparations dépourvues de virus auxiliaire («helper- free») (Référence 16) . Alternativement, des virus auxiliaires ayant subis des modifications supplémentaires pour réduire leur cytotoxicité peuvent être utilisés.
III. Production de vecteurs rétroviraux par infection de cellules TE-GPE par le vecteur herpétique « vecteur » pA-IRV LacZ/D30EBA
1. Construction de plasmide amplicon pA-IRV LacZ
Le plasmide amplicon pA-IRV LacZ (12041 pb) , illustré dans la figure 10, a été construit par l'insertion du « module amplicon » herpétique (oris et « a ») dans le site de restriction Seal du plasmide pIRV-Neo-Act-LacZ (référence 14) . Ce site se situe en aval de la boîte LTR 3' . Le plasmide amplicon pA-IRV LacZ contient les LTR 5' et 3' et les signaux d'encapsidation du MoMulv, le gène NeoR sous le contrôle du LTR et le gène LacZ sous le contrôle du promoteur de β-actine du rat, et les séquences oris et « a » herpétiques.
2. Construction du vecteur pA-IRV LacZ/D30EBA Des cellules M64A sont transfectees avec 10 μg de pA-IRV LacZ, et surinfectees le lendemain par HSV-l D30EBA. Ensuite, le même protocole que celui mis en oeuvre pour la production du vecteur pA-HCMV-GPE/D30EBA (voir exemple I et figure 4) a été mis en oeuvre, à la seule différence qu'au lieu de transfecter le plasmide pA-HCMV-GPE, l'on a transfecté le plasmide pA-IRV LacZ.
3. Production de vecteurs rétroviraux
Des aliquotes du stock de vecteur pA-IRV LacZ/D30EBA sont utilisées pour infecter des cellules transcomplémentantes TE-GPE, qui ont été construites par intégration, dans les chromosomes des cellules TE671 (ATCC CRL 8805) , de deux unités de transcription distinctes, l'une contenant les gènes rétroviraux gag- pol et l'autre contenant le gène env (écotrope). Les trois gènes transcomplémentants appartiennent au virus de la leucémie de Moloney (MoMLV) . A différent temps post-infection, des aliquotes de surnageant de cellules TE-GPE infectées par le vecteur amplicon pA-IRV LacZ/D30EBA sont prélevées, filtrées et utilisées pour infecter des cellules NIH3T3, en présence de polybrène, tel que décrit dans l'exemple I. Les cellules NIH3T3 ont été fixées et soumises à un test X-Gal 48 heures après l'infection. Les résultats sont illustrés dans la figure 11.
Les foyers de cellules NIH3T3 bleues montrent que les vecteurs rétroviraux produits par les cellules TE- GPE infectées par pA-IRV-LacZ/D30EBA s'intègrent dans l'ADN cellulaire. Le surnageant de cellules TE-GPE infectées par un amplicon contrôle ne contenant pas de séquences retrovirales ne donne pas lieu à des foyers bleus lorsqu'il est mis en contact avec des cellules NIH3T3. IV. Induction de synthèse de vecteurs rétroviraux par un vecteur herpétique portant simultanément les éléments « vecteur » et « transcomplémentant » d'un vecteur retroviral
Un plasmide amplicon comportant à la fois les éléments rétroviraux « transcomplémentant » et « vecteur » a été construit par l'insertion du module amplicon herpétique (oris et « a ») dans le plasmide pBMC-6. Ce plasmide est un « plasmovirus » dérivé du plasmide pV-lacZ-env (référence 15) , contenant deux unités de transcription distinctes, l'une contenant les gènes Gag, Pol, LacZ et les signaux d'encapsidation, rétroviraux, et l'autre contenant le gène Env sous le contrôle du promoteur HCMV. Le plasmide pBMC-6 contient un gène Env écotrope, tandis que celui de pV-lacZ-env est amphotrope.
La configuration du plasmide amplicon résultant (pA-BMC-6) est la suivante :
LTR-ψ-Gag-Pol-LacZ-LTR//—"a"-oriS—//—prom ENV—
Le plasmide amplicon pA-BMC-6 de 18 kb est ensuite utilisé dans le protocole, tel que décrit dans les exemples I et III, pour produire des vecteurs amplicons dans des cellules M64A en utilisant D30EBA comme virus auxiliaire. Ensuite des cellules TE671 sont infectées par ce vecteur. Le test X-Gal est effectué sur des cellules 3T3 ayant été mises en contact avec le surnageant des cellules TE infectées. Des foyers bleus ont été détectés, confirmant que des particules retrovirales exprimant lacZ sont présentes dans le surnageant des cellules TE infectées, et que le vecteur retroviral s'intègre dans le génome des cellules NIH3T3. Références
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3. Cosset FL, Takeuchi Y, Battini JL, Weiss RA and Collins MKL (1995) . High titer packaging cell producing recombinant retroviruses résistant to human sérum. J Virol, 69, in press.
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5. Epstein A, Jacquemont B and Machuca I (1984). Infection of a restrictive cell line (XC cells) by intratypic recombinants of HSV-l: relationship between pénétration of the virus and relative amounts of glycoprotein C. Virology 132, 315-324.
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8. Lowenstein PR, Fournel S, Bain D, Tomasec P, Clissold P, Castro MG and Epstein A (1994) . Herpès simplex virus 1 helper co-infection affects the distribution of an amplicon encoded protein in glia. NeuroReport 5, 1625-1630.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de production de vecteurs rétroviraux aptes pour le transfert de séquences d'acide nucléique dans des cellules eucaryotes, caractérisé par l'infection d'une cellule eucaryote par au moins un vecteur viral herpétique, les éléments rétroviraux nécessaires pour l'accomplissement du cycle retroviral étant fournis soit par le ou les vecteur(s) herpétique(s) , soit par le(s) vecteur(s) herpétique(s) en association avec des éléments rétroviraux compris au sein du génome de la cellule eucaryote.
2. Procédé de production de vecteurs rétroviraux aptes pour le transfert de séquences d'acide nucléique dans des cellules eucaryotes, ledit procédé comprenant l'introduction dans une cellule eucaryote d'au moins un composant retroviral dit "vecteur" et/ou d'au moins un composant retroviral dit "transcomplémentant", le composant vecteur comportant, outre la séquence à transférer, tous les signaux agissant en cis nécessaires pour l'accomplissement du cycle retroviral, et le composant transcomplémentant comportant toutes les séquences agissant en trans nécessaires pour l'accomplissement du cycle retroviral, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'introduction du ou des composant(s) retroviral(aux) dans la cellule est effectuée par l'infection de la cellule par au moins un vecteur viral dérivé d'un virus herpétique et contenant, intégré(s) dans son génome, ledit ou lesdits composant(s) retroviral(aux) , la cellule eucaryote étant alors capable de synthétiser et de relâcher des vecteurs rétroviraux.
3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le génome du vecteur viral comprend, outre les composants rétroviraux, des séquences génomiques propres à un virus herpétique et incluant au moins une séquence d'encapsidation et une origine de réplication.
4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que les séquences génomiques propres au virus herpétique comprennent essentiellement la totalité du génome d'un virus herpétique défectif.
5. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que le composant retroviral transcomplémentant est composé d'au moins une unité de transcription comportant des séquences codant pour les protéines retrovirales Gag, Pol et/ou Env sous le contrôle de séquences régulatrices de transcription fonctionnelles dans la cellule eucaryote, et est dépourvu de signal d'encapsidation retrovirale.
6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que les séquences régulatrices comprennent au moins un promoteur fort constitutif d'origine animale ou virale, ou un promoteur spécifique de tissu ou encore un promoteur inductible.
7. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que la séquence codant pour Env se trouve au sein d'une unité de transcription indépendante de celle contenant les séquences codant pour Gag et Pol.
8. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que le composant retroviral vecteur est composé d'au moins une unité de transcription comportant : une séquence dite "hétérologue" sous le contrôle de séquences régulatrices de transcription, fonctionnelles dans la cellule eucaryote ; des séquences d'origine retrovirale permettant l'encapsidation du transcrit et sa rétrotranscription ;
- au moins une partie des LTR 5' et 3' d'un rétrovirus, ladite partie conférant la capacité d'encapsidation, de rétrotranscription et d'intégration.
9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que les séquences régulatrices de la transcription sont présentes au sein des LTR 5' et 3 ' rétroviraux.
10. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que la séquence hétérologue est une séquence codant pour un polypeptide ou une séquence qui, après transcription, donne lieu à une séquence complémentaire d'un produit de transcription endogène à la cellule.
11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que la séquence hétérologue comprend un gène thérapeutique de maladie à caractère mono- ou multigénique, un gène codant pour une cytokine, un gène suicide, un gène suicide conditionnel, un gène à activité antivirale, un gène à activité antitumorale, un gène thérapeutique de maladie neurodegenerative, ou un gène marqueur.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la cellule eucaryote est une cellule de vertébré, plus particulièrement de mammifère, par exemple des cellules de lignéage hématopoôétiques, cellules souches y compris des cellules souches fibroblastiques, épithéliales, hématopoôétiques et nerveuses, ou des cellules différenciées d'origine ectodermique, mésodermique ou endodermique.
13. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que l'on introduit dans la cellule eucaryote à la fois un composant retroviral vecteur et un composant retroviral transcomplémentant, ces différents composants rétroviraux étant compris, soit dans les génomes de deux vecteurs viraux différents, soit dans le génome d'un seul vecteur viral.
14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un procédé in vivo, in vitro, ou ex vivo.
15. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un procédé in vitro et en ce que l'on introduit dans la cellule eucaryote un seul composant retroviral, contenu dans le génome du vecteur viral et choisi parmi le composant vecteur ou le composant transcomplémentant, la cellule eucaryote ayant déjà, intégré dans son génome, l'autre des deux composants.
16. Procédé selon la revendication 14 ou 15 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un procédé in vitro et que le procédé comprend en outre une étape de récupération des vecteurs rétroviraux ainsi obtenus.
17. Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un procédé ex-vivo et en ce que l'on introduit dans la cellule eucaryote le composant retroviral vecteur et le composant retroviral transcomplémentant.
18. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que les séquences retrovirales proviennent d'un ou plusieurs rétrovirus choisi(s) parmi les rétrovirus de mammifères de type C, par exemple MoMLV, RD114, BaEV, MLV-A ; des rétrovirus de mammifères de type D, par exemple MPMV, SRV ; Spuma rétrovirus, par exemple HFV ; HIV, SIV, ASLV.
19. Molécule d'ADN comprenant :
I : des séquences propres au génome d'un virus herpétique et incluant au moins un signal d'encapsidation et une origine de réplication, et
II : au moins une unité de transcription retrovirale, ladite unité de transcription comprenant : un premier élément constitué de séquences régulatrices de transcription et
- un deuxième élément constitué d'au moins une séquence à transcrire, l'un ou l'autre de ces éléments étant d'origine retrovirale.
20. Molécule d'ADN selon la revendication 19, comprenant :
I : au moins un signal d'encapsidation et une origine de réplication d'un virus herpétique, et
II : au moins un composant retroviral constitué de : i) au moins une unité de transcription dite "unité transcomplémentante" comportant des séquences codant pour les protéines retrovirales Gag, Pol et/ou Env, sous le contrôle de séquences régulatrices de transcription, fonctionnelles dans une cellule eucaryote, cette unité de transcription étant dépourvue de signaux d'encapsidation rétroviraux et de LTR rétroviraux, et/ou ii) une unité de transcription dite "unité vecteur" comportant :
- une séquence dite "hétérologue" sous le contrôle de séquences régulatrices de transcription, fonctionnelles dans la cellule eucaryote ; une séquence d'origine retrovirale permettant 1'encapsidation du transcrit et sa rétrotranscription ;
- au moins une partie des LTR 5' et 3' d'un rétrovirus, ladite partie conférant la capacité d'encapsidation, de rétrotranscription et d'intégration.
21. Molécule d'ADN selon la revendication 19 ou 20 caractérisée en ce que les séquences propres au génome d'un virus herpétique comprennent essentiellement la totalité du génome d'un virus herpétique défectif.
22. Molécule d'ADN selon la revendication 20 caractérisée en ce qu'au sein de l'unité trans¬ complémentante, les séquences régulatrices comprennent au moins un promoteur fort constitutif d'origine animale ou virale, ou un promoteur spécifique de tissu ou encore un promoteur inductible.
23. Molécule d'ADN selon la revendication 22 caractérisée en ce que la séquence codant pour Env se trouve au sein d'une unité de transcription indé¬ pendante de celle contenant les séquences codant pour Gag et Pol.
24. Molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 20 à 23 caractérisée en ce que dans l'unité vecteur, les séquences régulatrices de la transcription sont comprises au sein des LTR 5' et 3' rétroviraux.
25. Molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 20 à 24 caractérisée en ce que la séquence hétérologue est une séquence codant pour un polypeptide ou une séquence qui, après transcription, donne lieu à une séquence complémentaire d'un produit de transcription endogène ou exogène à la cellule.
26. Molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 20 à 25 ccaractérisée en ce que la séquence hétérologue comprend un gène thérapeutique de maladie à caractère mono- ou multigénique, un gène codant pour une cytokine, un gène suicide, un gène suicide conditionnel, un gène à activité antivirale, un gène à activité antitumorale, un gène thérapeutique de maladie neurodegenerative, un gène marqueur.
27. Vecteur viral comportant une molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 19 à 26 encapsidée dans une particule virale dérivée d'un virus herpétique.
28. Cellule eucaryote infectée par un ou plusieurs vecteur(s) viral(aux) selon la revendication 27.
29. Cellule selon la revendication 28 caractérisée en ce qu'il s'agit de cellules de mammifères, et plus particulièrement de cellules humaines, par exemple des cellules de lignéage hématopoiétiques, cellules souches y compris des cellules souches fibroblastiques, épithéliales, hématopoiétiques et nerveuses, ou des cellules différenciées d'origine ectodermique, mésodermique ou endodermique.
30. Composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur viral selon la revendication 27 en association avec un véhicule acceptable du point de vue physiologique.
31. Composition pharmaceutique selon la revendication 29 caractérisée en ce qu'elle comprend à la fois au moins un vecteur viral "transcomplémentant", et au moins un vecteur viral "vecteur".
32. Composition pharmaceutique selon la revendication 30 caractérisée en ce qu'elle comprend un vecteur viral comportant à la fois un composant retroviral transcomplémentant et un composant retroviral vecteur.
33. Vecteur viral selon la revendication 27 pour utilisation en thérapie, particulièrement en thérapie génique.
34. Vecteur viral selon la revendication 27 pour utilisation dans le traitement des maladies suivantes : cancer, maladies d'origine virale telle que le SIDA, maladies à caractère mono- ou multigéniques, maladies neurodégénératives.
35. Utilisation du vecteur viral selon la revendication 27 pour la préparation d'un médicament pour le traitement des maladies suivantes : cancer, maladies d'origine virale telle que le SIDA, maladies à caractère mono- ou multigéniques, maladies neurodégénératives.
36. Procédé de production d'un vecteur viral selon la revendication 27 caractérisé par : a) la transfection d'une cellule eucaryote avec un plasmide contenant i) une partie du génome d'un virus herpétique, cette partie incluant au moins les signaux d'encapsidation et une origine de réplication, et ii) une unité de transcription telle que définie dans la revendication 18, et b) surinfection de la cellule eucaryote avec un virus à ADN auxiliaire, les étapes a) et b) pouvant être remplacées par la co-transfection du plasmide avec le génome du virus auxiliaire, c) récupération des vecteurs viraux produits par la cellule.
37. Procédé de production d'un vecteur viral selon la revendication 27 caractérisé par : a) la transfection d'une cellule eucaryote avec un plasmide contenant i) une unité de transcription retrovirale telle que définie dans la revendication 18, et ii) de part et d'autre de cette unité de transcription, des séquences permettant la recombinaison homologue de l'unité avec le génome d'un virus herpétique, et b) surinfection de la cellule avec le virus à ADN, les étapes a) et b) pouvant être remplacées par la co- transfection du plasmide avec le génome du virus à ADN, c) récupération des vecteurs viraux produits par la cellule.
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