FR2741358A1 - Production de vecteurs retroviraux par l'intermediaire de vecteurs viraux a base de virus a adn - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de production de vecteurs rétroviraux aptes pour le transfert de séquences d'acide nucléique dans des cellules eucaryotes, ledit procédé comprenant l'introduction dans une cellule eucaryote d'au moins un rétroviral dit "vecteur" et/ou d'au moins un composant rétroviral dit "transcomplémentant", le composant vecteur comportant, outre le transgène, tous les signaux agissant en cis nécessaires pour l'accomplissement du cycle rétroviral, et le composant transcomplémentant comportant les gènes rétroviraux gag, pol et env et étant dépourvu de signal d'encapsidation rétroviral, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'introduction du ou des composant(s) rétroviral(aux) dans la cellule est effectuée par l'intermédiaire d'au moins un vecteur viral dérivé d'un virus à ADN double brin capable d'infecter la cellule et contenant, intégré(s) dans son génome, ledit ou lesdits composant(s) rétroviral (aux), la cellule eucaryote étant alors capable de synthétiser et de relâcher des vecteurs rétroviraux.

Description

PRODUCTION DE VECTEURS RETROVIRAUX PAR L'INTERMEDIAIRB
DE VECTEURS VIRAUX A BASE DE VIRUS A ADN
L'invention concerne un procédé de production de vecteurs rétroviraux aptes pour le transfert de séquences d'acides nucléiques dans différents types de cellules et organismes. L'invention concerne également les acides nucléiques et les vecteurs viraux utilisés dans le procédé. Par ailleurs, l'invention vise l'utilisation des vecteurs en thérapie génique et les composants pharmaceutiques correspondants.

Les vecteurs rétroviraux sont souvent utilisés en thérapie génique pour le transfert de gènes dans des cellules et organismes. En effet, grâce à leur activité intégrase, ils permettent le transfert et l'intégration stable d'une séquence codante ou noncodante ayant une taille pouvant aller jusqu'à 7 Kb.

Les vecteurs rétroviraux sont couramment produits à partir de lignées cellulaires encapsidantes (ou transcomplémentantes), dans lesquelles les deux éléments fondamentaux qui permettent la formation du vecteur rétroviral sont intégrés dans les chromosomes cellulaires (figure 1). Ces éléments sont, d'une part, la "composante transcomplémentante", unité transcriptionnelle capable d'exprimer les gènes rétroviraux Gag-Pol-Env (GPE), ou bien Gag-Pol et Env, permettant la synthèse des constituants protéiques de la particule rétrovirale, et d'autre part, la "composante vecteur", unité transcriptionnelle capable d'exprimer et de faire encapsider le "transgène" dans les particules virales formées par la "composante transcomplémentante".Pour cela, le transgène est entouré d'un ensemble de séquences d'origines rétrovirales qui lui permettent d'être encapsidé, rétrotranscrit puis intégré et exprimé dans les chromosomes cellulaires de la cellule cible.

Les lignées encapsidantes posent cependant de nombreux problèmes : elles produisent des titres trop faibles de vecteurs, dépassant rarement 105 pfu/ml.

Pour réaliser des protocoles de thérapie génique en utilisant des vecteurs rétroviraux, chez l'homme et même chez des modèles animaux, il faut des quantités de particules rétrovirales autrement plus importantes que celles que l'on est en mesure de produire aujourd'hui en utilisant les méthodes classiques.

Cette limitation est d'autant plus grave que les vecteurs rétroviraux ne peuvent pas être concentrés sans perte de pouvoir infectieux.

Par ailleurs, les lignées encapsidantes génèrent souvent des rétrovirus recombinants, qui sont parfois compétents pour la réplication. Ce phénomène est tout à fait indésirable dans un protocole de thérapie génique.

De plus, pour différentes raisons, ces systèmes ne peuvent généralement pas être utilisés pour une production de vecteurs rétroviraux in vivo.

Des procédures de production transitoire ont été également développées : elles se basent toutes sur la cotransfection de différents plasmides portant les différentes composantes d'un vecteur rétroviral. Ces plasmides peuvent parfois être amplifiés dans les cellules, mais ils sont dans tous les cas introduits dans celles-ci par transfection, ce qui limite considérablement leur utilisation et leur efficacité.

Récemment, Flamant et al. (Virology, 211, 234-240, 1995) ont décrit une méthode "one-step" (désignée "virofection") pour la production de vecteurs rétroviraux. La méthode implique la co transfection d'une cellule eucaryote avec d'une part, un composant rétroviral "vecteur" et d'autre part, un composant rétroviral "transcomplémentant". L'obtention de vecteurs rétroviraux est décrite. Cette méthode repose néanmoins sur la transfection des cellules, limitant son utilisation et son efficacité.

Le problème que se propose de résoudre la présente invention est donc de fournir une méthode de production de vecteurs rétroviraux permettant l'obtention de vecteurs, à partir d'un grand nombre de types cellulaires différents (même ceux normalement non-infectables par des rétrovirus), à des titres élevés, et réduisant la probabilité de générer des rétrovirus recombinants.

Ces objectifs sont atteints par le procédé de l'invention qui permet la production de vecteurs rétroviraux par l'infection de cellules eucaryotes par des vecteurs viraux comportant, intégrés dans le génome, les éléments nécessaires pour la synthèse d'un vecteur rétroviral.

Le procédé de l'invention repose sur l'utilisation de virus en tant que source d'ADN. Selon l'invention, au lieu d'être intégrées dans les chromosomes cellulaires, les deux composantes rétrovirales "transcomplémentante" et "vecteur" sont introduites dans le génome d'un vecteur viral sous le contrôle de promoteurs appropriés (figure 2). Les composants rétroviraux (sous forme d'ADN) sont donc transcrits à partir d'éléments génétiques extrachromosiques (le génome du vecteur viral) et le vecteur rétroviral est assemblé dans la cellule.

Celle-ci relâche alors les vecteurs rétroviraux et ils peuvent infecter les cellules avoisinantes.

La technique de 11 invention permet d'améliorer la production des vecteurs rétroviraux. D'abord, la productivité des vecteurs rétroviraux est améliorée, car l'infection des cellules avec le vecteur viral à haute multiplicité d'infection permet d'augmenter la synthèse des protéines rétrovirales. En effet, selon l'invention, les titres de production de vecteurs rétroviraux sont supérieurs à 108 pfu/ml, par exemple entre 109 et 1011 pfu/ml. Ensuite, la probabilité de générer des rétrovirus recombinants est fortement réduite puisque la production de vecteurs rétroviraux par l'intermédiaire du vecteur viral n'a lieu que de manière transitoire et/ou inductible.Enfin, cette procédure ouvre la possibilité que les vecteurs rétroviraux soient synthétisés directement in vivo, à l'intérieur de l'organisme receveur, par la simple inoculation, éventuellement localisée, du vecteur viral : ce dernier infecte les cellules de l'organisme receveur et ces cellules se voient alors produire des vecteurs rétroviraux qui peuvent faire intégrer le transgène dans les cellules avoisinantes. Le procédé permet donc d'infecter, avec les vecteurs viraux, des cellules dans l'organisme animal afin de produire directement les vecteurs rétroviraux in situ, à partir des neurones, myotubes, hépatocytes ou virtuellement tout autre type cellulaire, post-mitotique ou pas.

Ceci n'est possible actuellement qu'en réalisant des re-implantations des cellules autologues génétiquement modifiées ex vivo et est limité aux seules cellules capables de réaliser des mitoses.

Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé de production de vecteurs rétroviraux aptes pour le transfert de séquences d'acide nucléique dans des cellules eucaryotes, ledit procédé comprenant l'introduction dans une cellule eucaryote d'au moins un composant rétroviral dit "vecteur" et/ou d'au moins un composant rétroviral dit ',transcomplémentant", le composant vecteur comportant, outre la séquence à transférer, tous les signaux agissant en cis nécessaires pour l'accomplissement du cycle rétroviral, et le composant transcomplémentant comportant les gènes rétroviraux gag, pol et env et étant dépourvu de signal d'encapsidation rétroviral, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'introduction du ou des composant(s) rétroviral(aux) dans la cellule est effectuée par l'intermédiaire d'au moins un vecteur viral dérivé d'un virus à ADN double brin capable d'infecter la cellule et contenant, intégré(s) dans son génome, ledit ou lesdits composant(s) rétroviral (aux), la cellule eucaryote étant alors capable de synthétiser et de relâcher des vecteurs rétroviraux.

En d'autres termes, le procédé de l'invention comprend l'infection d'une cellule eucaryote par au moins un vecteur viral, contenant lui-même un composant rétroviral "vecteur" et/ou un composant rétroviral "transcomplémentant".

Dans le contexte de l'invention, l'expression "vecteur rétroviral" signifie un rétrovirus recombinant, (qui peut être défectif pour la réplication), c'est-à-dire une molécule d'ARN portant une ou plusieurs séquence(s) à transférer ainsi que les signaux rétroviraux de rétrotranscription, intégration, transcription et encapsidation, cette molécule étant encapsidée dans une particule rétrovirale. Le vecteur rétroviral est incapable de se répliquer.

Le terme "vecteur viral" signifie un virus recombinant (qui peut être défectif) et, en particulier, un virus à ADN double brin, c'est-à-dire une molécule d'ADN portant les signaux nécessaires à la réplication, à la transcription et à l'encapsidation, cette molécule étant encapsidée dans une particule virale typique d'un virus à ADN. Le vecteur est incapable de se répliquer en dehors d'un système (viral ou cellulaire) transcomplémentant.

Les termes "les signaux agissant en cis nécessaires pour l'accomplissement du cycle rétroviral" signifient les signaux rétroviraux nécessaires à l'encapsidation, la rétrotranscription, l'intégration et la régulation de la transcription/expression. Les séquences agissant en trans sont celles codant pour les protéines rétrovirales, par exemple les gènes gag, pol et env.

Selon le procédé de l'invention, les vecteurs viraux sont défectifs, apathogènes et n'induisent pas la mort cellulaire rapide, ni ne donnent lieu à la production des virus à ADN, en dehors d'un système (viral ou cellulaire) transcomplémentant.

Le génome des vecteurs viraux de l'invention comporte d'une part des séquences propres à un virus à ADN, et d'autre part des séquences propres à un rétrovirus. Normalement, les séquences génomiques propres à un virus à ADN double brin incluent au moins une séquence d'encapsidation et une origine de réplication.

Lorsque les séquences propres au virus d'ADN ne correspondent pas à la totalité du génome mais incluent au moins les séquences d'encapsidation et l'origine de réplication, le génome du vecteur viral est en fait plasmidique. Le plasmide comprend, en outre, des séquences d'origine bactérienne permettant son clonage et sa sélection dans un hôte bactérien, par exemple E. coli, notamment une origine de réplication et un gène de sélection. Le vecteur viral, souvent appelé "amplicon", est alors un concatamère composé de répétitions du plasmide linéarisé et encapsidé.

Selon une approche alternative, le génome du vecteur viral peut contenir la totalité du génome du virus à ADN, à l'exception d'au moins un gène essentiel, pour la réplication. Dans ce cas, le vecteur viral est réellement un virus recombinant défectif.

Les virus à ADN qui forment la base des vecteurs viraux de l'invention sont choisis parmi tous les virus à ADN double brin capable d'infecter des cellules animales et de préférence de vertébrés. On peut citer comme exemple les virus herpétiques, les adénovirus et les pox-virus.

Parmi la famille des virus herpétiques (Herpesviridae), il peut s'agir d'alphaherpesvirinae, betaherpesvirinae ou gammaherpesvirinae.

Les virus herpétiques préférés peuvent être d'origine humaine ou animale, par exemple HSV-1,
HSV-2, le virus cytomégalique humain (HCMV), les virus humains HHV-6 et HHV-7, le virus d'Epstein-Barr, le virus Varicella Zoster (VZV), ou le virus de la pseudorage porcine (PRV).

Les virus herpétiques sont particulièrement préférés en raison de leur grande taille (génome de 120 à 200 Kb environ) permettant l'inclusion de séquences hétérologues de taille importante. De plus, leur spectre d'hôtes cellulaire est très large.

Certains virus de cette famille sont neurotropes, permettant l'infection de cellules nerveuses, tissus que ne peuvent atteindre le rétrovirus. Cette propriété est donc particulièrement avantageuse dans la thérapie génique de maladies nerveuses du CNS.

D'autres membres de la famille des virus herpétiques sont lymphotropes. Ces virus peuvent être rendus défectifs par la délétion ou l'inactivation d'au moins un gène essentiel tel le gène IE3 chez HSV-1 ou leurs homologues chez d'autres virus herpétiques.

Les adénovirus, par exemple ceux du groupe C ou autres, peuvent également être utilisés. Ces virus ont une taille moins importante que celles des virus herpétiques (un génome d'environ 35 à 40 Kb). Ils ont un tropisme naturel pour l'épithélium respiratoire, la cornée et le tractus digestif Ces virus peuvent être rendus défectifs par la délétion de tout ou partie des gènes régulateurs E1A et E1B.

Les poxvirus peuvent également être mis en oeuvre dans la construction de vecteurs viraux selon l'invention. Ces virus ont une taille génomique d'environ 120 à 300 Kb. Ils ont un spectre de cellules hôtes large. Parmi cette famille de virus, le virus de la vaccine est préféré.

Selon l'invention, le vecteur viral comprend dans son génome, outre les séquences propres au virus à ADN décrit ci-dessus, des séquences d'origine rétrovirale c'est-à-dire un "composant rétroviral" qui comprend en particulier, au moins une unité de transcription rétrovirale.

Dans le contexte de l'invention, l'expression "unité de transcription rétrovirale" signifie une séquence d'ADN, comprenant un premier élément constitué des séquences régulatrices nécessaires à la transcription et un deuxième élément constitué d'au moins une séquence à transcrire, l'un ou l'autre de ces éléments étant au moins en partie d'origine rétrovirale. De préférence, l'élément d'origine rétrovirale correspond soit à la partie du génome rétroviral agissant en cis, soit à la partie du génome rétroviral agissant en trans pour l'accomplissement du cycle rétroviral.

Plus particulièrement, l'une des unités de transcription rétrovirale (dit "unité de transcription transcomplémentante") comporte des séquences codant pour les protéines Gag, Pol et/ou Env sous le contrôle de séquences régulatrices fonctionnelles dans la cellule eucaryote. Il est possible d'introduire des variantes des gènes gag, pol et env, ces variantes comportant des substitutions, délétions ou insertions de nucléotides par rapport aux gènes sauvages, à condition que les fonctions essentielles des protéines soient maintenues. Ces fonctions sont les suivantes gag code pour le précurseur des protéines de capside ; pol donne lieu à la transcriptase inverse et à une enzyme impliquée dans l'intégration provirale et env code pour le précurseur de la glycoprotéine d'enveloppe.

Il est possible d'inclure le gène env sur une unité de transcription indépendante de celle contenant gag et pol. Cette unité de transcription indépendante peut elle-même être incluse dans la même molécule d'ADN et par conséquent dans le même vecteur viral, ou peut en revanche être incluse dans un vecteur viral séparé.

Les séquences régulatrices mises en oeuvre dans l'unité de transcription transcomplémentante comprennent des séquences d'initiation et de terminaison de transcription, fonctionnelles dans la cellule hôte. Ces séquences peuvent être d'origine animale ou virale. Comme promoteur, on peut citer des promoteurs fort et constitutif, par exemple le promoteur HCMV, le promoteur du gène herpétique Ive3, ou celui de la thymidine kinase herpétique. On peut également avoir recours à des promoteurs spécifiques de tissus ou à des promoteurs inductibles. Comme exemple de promoteur spécifique de tissu, on peut citer le promoteur du préproenképhaline, le promoteur de l'énolase-neurospécifique, et les promoteurs de n'importe quel gène s'exprimant dans un tissu particulier.Comme exemple de promoteur inductible, on peut citer les promoteurs des protéines de choc thermique, etc..

L'unité de transcription "vecteur" comporte une séquence dite "hétérologue" sous le contrôle de séquences régulatrices de transcription, fonctionnelles dans la cellule eucaryote
- une séquence d'origine rétrovirale permettant l'encapsidation du transcrit et sa rétrotranscription
- au moins une partie des LTR 5' et 3' d'un rétrovirus, ladite partie conférant la capacité d'encapsidation, de rétrotranscription et d'intégration.

La séquence "hétérologue" comprise au sein de cette unité de transcription peut être toute séquence dont le transfert dans la cellule ou organisme cible est désiré. Il s'agit de toute séquence transcriptible codant pour une ou plusieurs protéine(s) ou pour une partie d'une protéine, ou qui donne lieu, après transcription, à une séquence complémentaire d'un produit de transcription endogène ou exogène à la cellule, par exemple complémentaire d'une séquence virale. La séquence hétérologue peut comprendre une ou plusieurs séquence(s) codante(s) ou non-codante(s), ou un mélange des deux. Elle peut être hétérologue ou homologue vis-à-vis de la cellule et hétérologue ou homologue vis-à-vis du vecteur. La séquence hétérologue peut aussi être désignée "transgène". La taille de la séquence hétérologue doit être compatible avec l'encapsidation des particules rétrovirales (environ 7 Kb).

La séquence hétérologue est souvent une séquence dont le produit de transcription ou de traduction exerce un effet thérapeutique dans une cellule ou dans un organisme. Comme exemple de séquences hétérologues, on peut citer un gène thérapeutique de maladie à caractère mono- ou multigénique, un gène codant pour une cytokine, un gène suicide, un gène suicide conditionnel, un gène à activité antivirale, un gène à activité antitumorale, un gène thérapeutique de maladie neurodégénérative, ou un gène marqueur.

Plus particulièrement, la séquence hétérologue peut être une séquence codant pour une enzyme, un dérivé sanguin, une hormone, une lymphokine (interleukines, interférons, INF etc..), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs, la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, la thymidine kinase, la cytosine déaminase. Il peut s'agir d'une protéine antigénique capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire.

La séquence hétérologue peut aussi donner lieu, après transcription, à une séquence antisense ou à un ribozyme.

Il est également possible d'utiliser des séquences hétérologues codant pour des marqueurs cellulaires. Ces séquences peuvent être employées seules ou en association avec une autre séquence hétérologue.

Selon une variante de l'invention, il est possible d'inclure dans l'unité de transcription "vecteur", une partie du gène rétroviral gag pour améliorer l'encapsidation du transcrit. Il s'agit normalement d'un fragment d'environ 600 nucléotides à partir du codon initiateur de gag.

Pour cette unité de transcription, les séquences régulatrices de la transcription peuvent être celles présentes au sein des LTR rétroviraux ou peuvent etre apportées par d'autres séquences. Il est donc possible d'inclure tout autre promoteur, fort, constitutive, spécifique de tissu ou inductible, à condition d'être fonctionnel dans la cellule hôte.

Il est néanmoins important d'inclure dans cette unité de transcription toutes les séquences rétrovirales permettant l'encapsidation, la rétrotranscription et l'intégration. Ces séquences se trouvent en partie au sein des LTR. D'autres séquences qui se trouvent le long du génome rétroviral sont aussi indispensables pour 1 'encapsidation (signaux appelés "g") et la rétrotranscription.

Les séquences rétrovirales mises en oeuvre dans les vecteurs de la présente invention proviennent d'un ou plusieurs rétrovirus, par exemple MoMLV, RD114,
BaEV, MLV-A ; des rétrovirus de mammifères de type D, par exemple MPMV, SRV ; Spuma rétrovirus, par exemple
HFV ; HIV, SIV, ASLV.

Les caractéristiques d'enveloppe, et donc le spectre d'hôtes cellulaires, sont largement déterminées par la nature de Env. Selon l'invention, il est possible de choisir l'origine de Env pour obtenir les caractéristiques souhaitées. Gag, Pol et
Env peuvent provenir du même rétrovirus, par exemple
MoMLV. Dans ce cas, l'enveloppe du vecteur rétroviral est écotrope. Le gène Env du virus MoMLV peut être remplacé aisément par tous les gènes Env des virus mammifères de type C (amphotrope, xénotrope, RD114) ou encore par le gène Env d'autres rétrovirus non apparentés, incluant le virus HIV, ou encore par des gènes codant pour des enveloppes non-rétrovirales, par exemple VSV-G. Il en va de même pour les gènes Gag
Pol. Ceci permet au système de s'adapter aisément & BR< une grande diversité de situations rencontrées dans les applications potentielles.

Pour le traitement de maladies d'origine rétrovirale telle que le SIDA, il est possible d'utiliser Gag, Pol et Env du rétrovirus en question, par exemple HIV, afin que le vecteur rétroviral atteigne les cellules infectées. Le choix appropriée de virus à ADN comme vecteur viral, et le choix d'éléments rétroviraux, confère une très grande souplesse au système de transfert de gène de 1' invention.

Le type de cellule susceptible d'être infectée par les vecteurs de l'invention varie selon le choix du vecteur viral. Normalement, il s'agit d'une cellule de vertébré, plus particulièrement de mammifère, par exemple des cellules de lignéage hématopoïétiques, cellules souches y compris des cellules souches fibroblastiques, épithéliales, hématopoïétiques et nerveuses, ou des cellules différenciées d'origine ectodermique, mésodermique ou endodermique.

La production de vecteurs rétroviraux selon l'invention peut avoir lieu in vivo ou in vitro. Pour la production in vivo et in vitro, on introduit dans la cellule eucaryote à la fois un composant rétroviral vecteur et un composant rétroviral transcomplémentant, ces différents composants rétroviraux étant compris, soit dans les génomes de deux vecteurs viraux différents, soit dans le génome d'un seul vecteur viral.

Si les composants rétroviraux sont compris dans le même vecteur viral, il est recommandé d'utiliser, pour la construction du vecteur viral, un virus à ADN de grande taille, par exemple un virus herpétique ou un poxvirus. Selon cette variante, le vecteur viral est de préférence de type "virus recombinant" et non pas de type "plasmide encapsidé" (souvent appelé "amplicon").

In vitro, il est possible de mettre en oeuvre un autre protocole selon lequel l'on introduit dans la cellule eucaryote un seul composant rétroviral contenu dans un vecteur viral et choisi parmi le composant vecteur ou le composant transcomplémentant, la cellule eucaryote ayant déjà, intégré dans son génome, l'autre des deux composants. Cette variante de l'invention met donc en oeuvre des cellules eucaryotes apportant elles-mêmes le composant complémentaire.

Le procédé in vitro comprend normalement une étape de récupération, et éventuellement de purification, des vecteurs rétroviraux ainsi obtenus.

La purification peut être faite par exemple par filtrage du surnageant des cellules, le filtre laissant passer les vecteurs et retenant tout le matériel indésirable.

Outre le procédé de production de vecteurs rétroviraux, l'invention vise également les molécules d'ADN utilisées pour la construction des vecteurs viraux et les vecteurs viraux et rétroviraux ainsi obtenus.

Les molécules d'ADN de l'invention comprennent des séquences propres au génome d'un virus à ADN double brin et incluant au moins un signal d'encapsidation et une origine de réplication, et au moins une unité de transcription rétrovirale telle que définie précédemment.

Plus particulièrement, ces molécules comprennent
I : au moins un signal d'encapsidation et une origine de réplication d'un virus à ADN, et
II : au moins un composant rétroviral constitué de
i) au moins une unité de transcription dite "unité transcomplémentante" comportant des séquences codant pour les protéines rétrovirales Gag, Pol et/ou
Env, sous le contrôle de séquences régulatrices de transcription, fonctionnelles dans une cellule eucaryote, cette unité de transcription étant dépourvue de signaux d'encapsidation rétroviraux et de
LTR rétroviraux, et/ou
ii) une unité de transcription dite "unité vecteur" comportant - une séquence dite "hétérologue" sous le contrôle de séquences régulatrices de transcription, fonctionnelles dans la cellule eucaryote ;;
- une séquence d'origine rétrovirale permettant l'encapsidation du transcrit et sa rétrotranscription
- au moins une partie des LTR 5' et 3' d'un rétrovirus, ladite partie conférant la capacité d'encapsidation, de rétrotranscription et d'intégration.

Les différentes variantes selon cet aspect de l'invention sont décrites précédemment et comprennent notamment des modes de réalisation préférés en ce qui concerne la nature des différentes séquences.

L'invention vise également les cellules eucaryotes infectées par un ou plusieurs vecteurs viraux de l'invention. Ces cellules peuvent être in vivo ou des cultures cellulaires in vitro.

Selon une variante préférée de l'invention, les vecteurs viraux sont utilisés en thérapie génique.

L'invention vise, par conséquent, une composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur viral de l'invention en association avec un véhicule acceptable du point de vue physiologique.

La composition comprend souvent deux vecteurs viraux, l'un de type "transcomplémentant" et l'autre de type "vecteur". Les compositions peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, intracranienne etc..

De préférence, la composition pharmaceutique comprend un véhicule approprié pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc.. ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.

Les doses des vecteurs viraux utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, de la séquence hétérologue à exprimer ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les vecteurs viraux selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de vecteur, et est déterminé selon des techniques classiques par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 3 à 5 jours, du nombre de plages de cellules infectées.

Les vecteurs viraux de l'invention peuvent être utilisés dans le traitement d'un grand nombre de pathologies, par exemple les cancers, les maladies d'origine virale (SIDA, hépatites, etc..), les maladies à caractères mono- ou multigénique (dystrophie, fibrose cystique etc..), les maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson, ALS, etc..).

L'invention vise également un procédé pour obtenir l'expression d'une séquence d'acide nucléique dans une cellule eucaryote, notamment à partir des chromosomes de celle-ci, ce procédé comprenant l'infection d'une première cellule eucaryote par au moins un vecteur viral selon l'invention, cette cellule étant alors capable de synthétiser et relâcher des vecteurs rétroviraux, et l'infection d'une deuxième cellule eucaryote par les vecteurs rétroviraux ainsi obtenus. Ce procédé peut être effectué in vivo ou in vitro.

L'invention vise également un procédé de production de vecteurs viraux. Ce procédé varie selon la nature de la molécule d'ADN de départ, c'est-à-dire qu'il s'agit d'une molécule qui ne comprend pas la totalité du génome d'un virus d'ADN mais qui comprend au moins les signaux d'encapsidation et l'origine de réplication (approche "amplicon"), ou s'il s'agit d'une molécule qui correspond à la totalité du génome d'un virus recombinant défectif (approche "virus recombinant").

Pour l'approche "amplicon", le procédé de production du vecteur viral comprend les étapes suivantes a) la transfection d'une cellule eucaryote avec un plasmide contenant i) une partie du génome d'un virus à ADN double brin, cette partie incluant au moins les signaux d'encapsidation et une origine de réplication, et ii) une unité de transcription telle que définie précédemment, et b) surinfection de la cellule eucaryote avec un virus à ADN auxiliaire, les étapes a) et b) pouvant être remplacées par la co-transfection du plasmide avec le génome du virus auxiliaire, c) récupération des vecteurs viraux produits par la cellule.

Pour l'approche "virus recombinant", le procédé de production des vecteurs viraux comprend les étapes suivantes a) la transfection d'une cellule eucaryote avec un plasmide contenant i) une unité de transcription rétrovirale telle que définie précédemment, et ii) de part et d'autre de cette unité de transcription, des séquences permettant la recombinaison homologue de l'unité avec le génome d'un virus à ADN, et b) surinfection de la cellule avec le virus à ADN, les étapes a) et b) pouvant être remplacées par la cotansfection du plasmide avec le génome du virus à ADN, c) récupération des vecteurs viraux produits par la cellule.

Il est également possible de produire le vecteur viral par recombinaison spécifique de site en utilisant un système tel que le système Cre/Lox P du phage P1, par exemple.

Légendes des figures
Différents aspects de l'invention sont illustrés dans les figures
Figure 1 : Stratégie classique de construction de vecteurs rétroviraux.

Figure 2 : Stratégie de construction in vivo et in vitro de vecteurs rétroviraux selon l'invention.

Figure 3 : Plasmides amplicons pA-HCMV-GPE et pA-VCT.

TRANSG = transgène
Figure 4 : Préparation du vecteur pA-HCMV-GPE/D30EBA.

Figure 5 : Protocole expérimental décrit dans les exemples.

Figure 6 : Des cellules NIH3T3 sont infectées par le surnageant de cellules TE/LacZ. Ces dernières cellules avaient été infectées pendant 48 Heures (a) par le virus D30EBA seul ou (b) par le vecteur pA-HCM
GPE/D30EBA. Les foyers de cellules bleues montrent que les vecteurs rétroviraux s'intègrent correctement dans l'ADN cellulaire.

Figure 7 : Production de vecteurs rétroviraux par le vecteur pA-HCMV-GPE/D30EBA. Des cellules NIH3T3 ont été infectées par le surnageant de cellules TE/LacZ.

Ces dernières cellules avaient été infectées pendant 24 ou 48 Heures par 3, 6, 12 et 24 Ml de vecteurs pA
HCMV-GPE/D30EBA. Aucun vecteur rétroviral n'est détecté après infection de cellules TL/LacZ par le virus D30EBA seul (voir "Protocole expérimental" figurant dans les exemples).

EXEMPLES
Les inventeurs ont d'abord construit un plasmide amplicon, appelé pA-HCMV-GPE, qui, outre les séquences bactériennes et herpétiques mentionnées plus haut, porte la composante transcomplémentante rétrovirale l'unité de transcription Gag-Pol-Env (écotrope) du rétrovirus de MoMLV (écotrope : n'infecte que les cellules de rongeurs), exprimée sous contrôle du promoteur HCMV (promoteur très précoce du virus cytomégalique humain) et possédant le signal de polyadénylation de la thymidine kinase (TK) herpétique (figure 3). Cette unité de transcription ne possède aucune LTR, le signal d'encapsidation g a été préalablement délété, et, une fois introduite dans un vecteur herpétique, devrait théoriquement s'exprimer comme un gène herpétique très précoce.

Nous avons montré que cette unité de transcription est bien fonctionnelle car, après transfection du plasmide dans des cellules contenant la composante vecteur (cellules TE-LacZ, exprimant constitutivement l'ARN génomique d'un vecteur rétroviral portant le gène lacZ), ces cellules se mettent à produire des vecteurs rétroviraux.

Le virus herpétique auxiliaire utilisé pour préparer les populations d'amplicons pA-HCMV-GPE est lui-même défectif (le vecteur amplicon est donc produit dans des cellules transcomplémentantes), afin de ne pas contaminer les éventuelles préparations de vecteurs rétroviraux avec des virus herpétiques. En particulier, les inventeurs ont utilisé la souche herpétique HSV-1 D30EBA, défective pour le gène essentiel IE3, et les cellules E5, qui contiennent et expriment le gène IE3, permettant donc la multiplication du virus herpétique défectif (figure 4).

Cellules
Les lignées cellulaires utilisées sont les cellules E5 (1), les cellules TE-lacZ (2), les cellules TEL-GPE (3) et les cellules NIH3T3. Toutes ces lignées cellulaires sont multipliées dans du milieu DMEM (GIBCO) contenant 10 % serum de veau foetal décomplémenté (FCS) (GIBCO).

Virus et mode d'infection
Le virus HSV-1 D30EBA (4) est produit & faible multiplicité d'infection et titré dans les cellules
E5, comme décrit précédemment (5). Les cellules E5 infectées par HSV-1 sont entretenues dans du milieu 199 (GIBCO) contenant 1% FCS. Les cellules TE-lacZ infectées par HSV-1 ou par le vecteur herpétique sont entretenues dans du milieu DMEM contenant 10 % FCS.

Les vecteurs rétroviraux utilisés en tant que témoins positifs sont produits de manière stable par les cellules TEL-GPE (3). Les cellules NIH3T3 sont infectées par ces vecteurs rétroviraux, ou par les vecteurs rétroviraux éventuellement produits par les cellules TE-lacZ, dans du milieu DMEM contenant 10 %
FCS plus 8 g/ml de polybrène (SIGMA). Après 12 heures, le polybrène est éliminé du milieu de culture.

Plasmides
Les plasmides de base utilisés dans ce travail sont le plasmide pSK+ (Stratagène Cloning Systems), pUT535 (CAYLA, Toulouse), pCRIP (6), pAGO (7) et pA
SF1 (8). Ces plasmides ont été produits selon une méthodologie standard (9) dans des bactéries E. coli
DH5a (GIBCO).

Biochimie
Toutes les enzymes de restriction et de modification de l'ADN (Boehringer Mannheim) ont été utilisées suivant les recommandations du fabricant.

L'extraction, la purification et l'analyse de l'ADN, viral ou plasmidique, ont été réalisées suivant des procédures standard (9).

Transfection
Toutes les transfections ont été effectuées par précipitation de l'ADN en phosphate de calcium selon la méthode de Graham et van der Eb (10), suivie d'un choc au glycerol 15 % quatre heures plus tard.

Fixation et coloration X-Gal
Les cellules transfectées ou infectées par des vecteurs rétroviraux ou herpétiques sont fixées en temps voulu. La présence d'une activité s- galactosidase est mise en évidence par coloration des cellules en utilisant le chromogène X-Gal. La fixation et la coloration des cellules est réalisée comme décrit précédemment (11).

Construction du plasmide pA-HCMV-GPE
L'unité de transcription permettant l'expression des gènes gag, pol et env sous contrôle du promoteur du gène très précoce du virus cytomégalique humain (IE-HCMV) et des séquences de polyadénylation du gène de la thymidine kinase (TK) du virus HSV-1 a été construite en plusieurs étapes. Les inventeurs ont d'abord cloné le fragment PvuII/PvuII du plasmide pAGO, contenant le gène TK de HSV-1, dans le site
EcoRV du plasmide pSK+, créant ainsi le plasmide pSK
TK. Les inventeurs ont créé par PCR un site BglII dans la région leader du plasmide pCRIP, 36 nucléotides en amont du site donneur d'épissage. Ce site BglII et le site NheI, situé en aval du gène env de pCRIP, ont été utilisés pour cloner les gènes rétroviraux gag, pol et env, entre les sites BglII et MscI du plasmide pSK-TK.

Le site BglII se trouve dans le promoteur du gène TK, le site MscI se trouve près de l'extrémité 3' du gène
TK. Dans ce plasmide appelé pTK-GPE, les gènes gag, pol et env sont donc sous contrôle du promoteur et du signal de polyadénylation du gène TK. Le plasmide pTK-GPE a été transformé en plasmide pHCMV-GPE après échange du promoteur TK par les séquences de promotion et d'activation du gène IE-HCMV. Pour ceci le fragment
SpeI/PstI de pUT535, contenant les séquences de régulation du gène IE-HCMV, a été cloné entre les sites SspI et MluI de pTK-GPE. Le site MluI se trouve dans le promoteur TK.De ce fait la plupart des séquences du promoteur TK disparaissent et sont remplacées par celles du gène IE-HCMV, donnant le plasmide pHCMV-GPE. Finalement, le petit fragment
NruI/NruI de pA-SFl, contenant l'origine de réplication (ori-S) et le signal d'encapsidation "a" herpétiques, a été cloné dans le site Eco47III de pHCMV-GPE, donnant lieu au plasmide amplicon pA-HCMV
GPE. Dans les cas où les sites de restriction utilisés pour les clonages ne sont pas compatibles, ils ont été préalablement rendus à bords francs par traitement avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E.

coli (9).

Construction du vecteur pA-HCMV-GPE/D30EBA
Des cellules E5 sont transfectées avec 10 Ag de pA-HCMV-GPE et surinfectées le jour suivant par HSV-1
D30EBA à une multiplicité d'infection de 1 pfu/cellule. Lorsque l'effet cytopathogène est total, les cellules infectées sont récoltées, centrifugées et reprises dans du milieu 199. Les cellules sont ensuite éclatées par congélation/décongélation rapide dans l'azote liquide, afin de libérer le virus intracellulaire. La moitié du stock viral obtenu est utilisé pour infecter des cellules E5 afin d'essayer d'augmenter le titre du vecteur amplicon. Cette opération peut être répétée plusieurs fois consécutives. Les populations virales obtenues sont hétérogènes, car composées de particules vecteurs et de particules auxiliaires (HSV-1 D30EBA).Le nombre de particules auxiliaires est déterminé par titrage sur cellules E5. Le nombre de particules vecteurs ne peut pas être déterminé par titrage, mais il a été estimé de manière approximative par comparaison avec le titre d'un amplicon, dérivé du plasmide pA-SFl, produit en parallèle. La qualité de l'ADN du vecteur amplicon, démontrant qu'il contient l'intégralité des séquences rétrovirales, est vérifiée selon la méthode de
Southern (9).

Protocole expérimental
Des aliquotes du stock de vecteur pA-HCMV
GPE/D30EBA sont utilisées pour infecter des cellules
TE-lacZ à faible multiplicité d'infection (moins de 1 pfu/cell de virus auxiliaire). A différents temps post-infection, des aliquotes du surnageant de ces cellules sont prélévées, filtrées sur des filtres
Acrodisc (0.2 mm) et utilisées pour infecter des cellules NIH3T3, en présence de polybrène, tel qu'il est décrit plus haut. Quarante huit heures plus tard, un test X-Gal est réalisé sur les cellules NIH3T3.

Résultats
Le vecteur amplicon ainsi construit (pA-HCMV
GPE/D30EBA), produit dans les cellules E5 avec le virus auxiliaire HSV-1 D30EBA, a été utilisé pour infecter les cellules TE-LacZ. Ceci aboutit & BR< l'expression de la composante transcomplémentante dans ces cellules, et à la production et libération de vecteurs rétroviraux dans leur milieu de culture des cellules. Pour montrer cela, des échantillons du milieu de culture des cellules TE-LacZ infectées par cet amplicon ont été testés pour la présence de vecteurs rétroviraux capables d'infecter des cellules
NIH3T3 et d'y induire l'expression du gène LacZ (Figure 5). Les inventeurs ont montré que ces vecteurs rétroviraux s'intègrent correctement dans 1'ADN cellulaire car il donnent lieu à des foyers des cellules bleues (Figure 6).Dans l'expérience témoin, les inventeurs n'ont pas détecté de vecteurs rétroviraux dans le surnageant des cellules TE-LacZ infectées par le virus herpétique auxiliaire seul (donc en l'absence de la composante transcomplémentante) (Figure 6). La quantité de vecteurs rétroviraux produits par les cellules TE-LacZ est directement proportionnelle à la quantité de vecteur amplicon utilisée pour infecter les cellules
TE-LacZ, et ceci pendant les deux jours qui suivent l'infection (Figure 7).

Ce résultat montre qu'il est possible d'infecter des cellules par un virus herpétique défectif et faire que ces cellules se mettent à produire des particules rétrovirales, grâce aux protéines Gag, Pol et Env exprimées à partir du vecteur herpétique. Ces protéines semblent être maturées de manière correcte, donnant lieu à la formation de particules rétrovirales infectieuses. L'infection herpétique n'inhibe pas l'expression de la composante vecteur intégrée dans les cellules TE-LacZ. Cet ARN vecteur est incorporé dans les particules rétrovirales formées et les particules ainsi produites sont relâchées dans le milieu de culture et sont infectieuses. Les cellules
TE-LacZ infectées par les amplicons GPE produisent des particules rétrovirales pendant au moins deux jours et le titre des vecteurs rétroviraux produits augmente avec la multiplicité d'infection des amplicons.

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for early gene expression. J Virol 52, 767-776.

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and Collins XKL (1994). C-type retroviral inactivation
by humain complement is determined by both the viral
genome and the producer cell. J Virol 68, 8001-8007.

3. Cosset FL, Takeuchi Y, Battini JL, Weiss RA and Collins
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recombinant retroviruses resistant to human serum. J
Virol, 69, in press.

4. Paterson T and Everett RD (1990). A prominent serine
rich region in Vmwl75, the major regulatory protein of
herpes simplex virus type 1, is not essential for
virus growth in tissue culture. J. Gen. Virol 71,
1775-1783.

5. Bpstein A, Jacquemont B and Machuca I (1984). Infection
of a restrictive cell line (XC cells) by intratypic
recombinants of HSV-1: relationship between
penetration of the virus and relative amounts of
glycoprotein C. Virology 132, 315-324.

6. Danos O and Mulligan RC (1988). Safe and efficient
generation of recombinant retroviruses with
amphotropic and ecotrpic host ranges. Proc Natl Acad
Sci USA 85, 6460-6464.

7. Colbere-Garapin F, Chousterman s, Horodniceanu F,
Kourilsky P and Garapin AC (1979). Cloning of the
active thumidine kinase gene of herpes simplex virus
type 1 in Escherichia coli K-12. Proc Natl Acad Sci
USA 76, 3755-3759 8. Lowenstein PR, Fournel 8, Bain D, Tomasec P, Clisnold P,
Castro MG and Epstein A (1994). Herpes simplex virus 1
helper co-infection affects the distribution of an
amplicon encoded protein in glia. NeuroReport 5,
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9. Sambrook J, Fritsch EF and naniatisT (1989). Molecular
cloning, A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

10. Grahu FL and van der Eb AJ (1973). A new technique for
the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA.

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11. Dobson AT, Margolis TP, 8edarati F, Stevens, JG and
Feldman LT (1990). A latent, non pathogenic HSV-1
derived vector stably expresses beta-galactosidase in
mouse neurons. Neuron 5, 353-360.

Claims (36)

REVENDICATIONS

1. Procédé de production de vecteurs rétroviraux aptes pour le transfert de séquences d'acide nucléique dans des cellules eucaryotes, ledit procédé comprenant l'introduction dans une cellule eucaryote d'au moins un composant rétroviral dit "vecteur" et/ou d'au moins un composant rétroviral dit "transcomplémentant", le composant vecteur comportant, outre la séquence & BR< transférer, tous les signaux agissant en cis nécessaires pour l'accomplissement du cycle rétroviral, et le composant transcomplémentant comportant les gènes rétroviraux gag, pol et env et étant dépourvu de signal d'encapsidation rétroviral, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'introduction du ou des composant(s) rétroviral(aux) dans la cellule est effectuée par l'intermédiaire d'au moins un vecteur viral dérivé d'un virus à ADN double brin capable d'infecter la cellule et contenant, intégré(s) dans son génome, ledit ou lesdits composant(s) rétroviral(aux), la cellule eucaryote étant alors capable de synthétiser et de relâcher des vecteurs rétroviraux.

2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le génome du vecteur viral comprend, outre les composants rétroviraux, des séquences génomiques propres à un virus à ADN double brin et incluant au moins une séquence d'encapsidation et une origine de réplication.

3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que les séquences génomiques propres au virus à

ADN comprennent essentiellement la totalité du génome d'un virus à ADN défectif.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le vecteur viral dérivé d'un virus à ADN double brin est dérivé d'un virus capable d'infecter des cellules de vertébrés, par exemple un virus herpétique, un adénovirus, ou un poxvirus.

5. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le composant rétroviral transcomplémentant est composé d'au moins une unité de transcription comportant des séquences codant pour les protéines rétrovirales Gag, Pol et/ou Env sous le contrôle de séquences régulatrices de transcription fonctionnelles dans la cellule eucaryote.

6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que les séquences régulatrices comprennent au moins un promoteur fort constitutif d'origine animale ou virale, ou un promoteur spécifique de tissu ou encore un promoteur inductible.

7. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que la séquence codant pour Env se trouve au sein d'une unité de transcription indépendante de celle contenant les séquences codant pour Gag et Pol.

8. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le composant rétroviral vecteur est composé d'au moins une unité de transcription comportant

- une séquence dite "hétérologue" sous le contrôle de séquences régulatrices de transcription, fonctionnelles dans la cellule eucaryote ;

- des séquences d'origine rétrovirale permettant l'encapsidation du transcrit et sa rétrotranscription ;

- au moins une partie des LTR 5' et 3' d'un rétrovirus, ladite partie conférant la capacité d'encapsidation, de rétrotranscription et d'intégration.

9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que les séquences régulatrices de la transcription sont présentes au sein des LTR 5' et 3' rétroviraux.

10. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que la séquence hétérologue est une séquence codant pour un polypeptide ou une séquence qui, après transcription, donne lieu à une séquence complémentaire d'un produit de transcription endogène à la cellule.

11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que la séquence hétérologue comprend un gène thérapeutique de maladie à caractère mono- ou multigénique, un gène codant pour une cytokine, un gène suicide, un gène suicide conditionnel, un gène à activité antivirale, un gène à activité antitumorale, un gène thérapeutique de maladie neurodégénérative, ou un gène marqueur.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la cellule eucaryote est une cellule de vertébré, plus particulièrement de mammifère, par exemple des cellules de lignéage hématopoïétiques, cellules souches y compris des cellules souches fibroblastiques, épithéliales, hématopoïétiques et nerveuses, ou des cellules différenciées d'origine ectodermique, mésodermique ou endodermique.

13. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on introduit dans la cellule eucaryote & BR< la fois un composant rétroviral vecteur et un composant rétroviral transcomplémentant, ces différents composants rétroviraux étant compris, soit dans les génomes de deux vecteurs viraux différents, soit dans le génome d'un seul vecteur viral.

14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un procédé in vivo ou in vitro.

15. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un procédé in vitro et en ce que l'on introduit dans la cellule eucaryote un seul composant rétroviral, contenu dans le génome du vecteur viral et choisi parmi le composant vecteur ou le composant transcomplémentant, la cellule eucaryote ayant déjà, intégré dans son génome, l'autre des deux composants.

16. Procédé selon la revendication 13 ou 15 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un procédé in vitro et que le procédé comprend en outre une étape de récupération des vecteurs rétroviraux ainsi obtenus.

17. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les séquences rétrovirales proviennent d'un ou plusieurs rétrovirus choisi(s) parmi les rétrovirus de mammifères de type C, par exemple MoMLV, RD114,

BaEV, MLV-A ; des rétrovirus de mammifères de type D, par exemple MPMV, SRV ; Spuma rétrovirus, par exemple

HFV ; HIV, SIV, ASLV.

18. Molécule d'ADN comprenant

I : des séquences propres au génome d'un virus à ADN double brin et incluant au moins un signal d'encapsidation et une origine de réplication, et II : au moins une unité de transcription rétrovirale, ledit unité de transcription comprenant,

- un premier élément constitué de séquences régulatrices de transcription et

- un deuxième élément constitué d'au moins une séquence à transcrire, l'un ou l'autre de ces éléments étant d'origine rétrovirale.

19. Molécule d'ADN selon la revendication 18, comprenant

I : au moins un signal d'encapsidation et une origine de réplication d'un virus à ADN, et

II : au moins un composant rétroviral constitué de

i) au moins une unité de transcription dite "unité transcomplémentante" comportant des séquences codant pour les protéines rétrovirales Gag, Pol et/ou

Env, sous le contrôle de séquences régulatrices de transcription, fonctionnelles dans une cellule eucaryote, cette unité de transcription étant dépourvue de signaux d'encapsidation rétroviraux et de

LTR rétroviraux, et/ou

ii) une unité de transcription dite "unité vecteur" comportant - une séquence dite "hétérologue" sous le contrôle de séquences régulatrices de transcription, fonctionnelles dans la cellule eucaryote ; ;

- une séquence d'origine rétrovirale permettant l'encapsidation du transcrit et sa rétrotranscription ;

- au moins une partie des LTR 5' et 3' d'un rétrovirus, ladite partie conférant la capacité d'encapsidation, de rétrotranscription et d'intégration.

20. Molécule d'ADN selon la revendication 18 ou 19 caractérisée en ce que les séquences propres au génome d'un virus à ADN comprennent essentiellement la totalité du génome d'un virus à ADN défectif.

21. Molécule d'ADN selon la revendication 18 ou 19 caractérisée en ce que les séquences propres au génome d'un virus à ADN proviennent d'un virus capable d'infecter les cellules de vertébrés, par exemple un virus herpétique, un adénovirus, ou un pox-virus.

22. Molécule d'ADN selon la revendication 19 caractérisée en ce qu'au sein de l'unité transcomplémentante, les séquences régulatrices comprennent au moins un promoteur fort constitutif d'origine animale ou virale, ou un promoteur spécifique de tissu ou encore un promoteur inductible.

23. Molécule d'ADN selon la revendication 22 caractérisée en ce que la séquence codant pour Env se trouve au sein d'une unité de transcription indépendante de celle contenant les séquences codant pour Gag et Pol.

24. Molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 19 à 23 caractérisée en ce que dans l'unité vecteur, les séquences régulatrices de la transcription sont comprises au sein des LTR 5' et 3' rétroviraux.

25. Molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 19 à 24 caractérisée en ce que la séquence hétérologue est une séquence codant pour un polypeptide ou une séquence qui, après transcription, donne lieu à une séquence complémentaire d'un produit de transcription endogène ou exogène à la cellule.

26. Molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 19 à 25 caractérisée en ce que la séquence hétérologue comprend un gène thérapeutique de maladie à caractère mono- ou multigénique, un gène codant pour une cytokine, un gène suicide, un gène suicide conditionnel, un gène à activité antivirale, un gène à activité antitumorale, un gène thérapeutique de maladie neurodégénérative, un gène marqueur.

27. Vecteur viral comportant une molécule d'ADN selon l'une quelconque des revendications 18 à 26 encapsidée dans une particule virale dérivé d'un virus à ADN double brin.

28. Cellule eucaryote infectée par un ou plusieurs vecteur(s) viral(aux) selon la revendication 27.

29. Cellule selon la revendication 28 caractérisée en ce qu'il s'agit de cellules de mammifères, et plus particulièrement de cellules humaines, par exemple des cellules de lignéage hématopoïétiques, cellules souches y compris des cellules souches fibroblastiques, épithéliales, hématopoïétiques et nerveuses, ou des cellules différenciées d'origine ectodermique, mésodermique ou endodermique.

30. Composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur viral selon la revendication 27 en association avec un véhicule acceptable du point de vue physiologique.

31. Composition pharmaceutique selon la revendication 29 caractérisée en ce qu'elle comprend à la fois au moins un vecteur viral "transcomplémentant", et au moins un vecteur viral "vecteur".

32. Vecteur viral selon la revendication 27 pour utilisation en thérapie, particulièrement en thérapie génique.

33. Vecteur viral selon la revendication 27 pour utilisation dans le traitement des maladies suivantes : cancer, maladies d'origine virale telle que le SIDA, maladies à caractère mono- ou multigéniques, maladies neurodégénératives.

34. Utilisation du vecteur viral selon la revendication 27 pour la préparation d'un médicament pour le traitement des maladies suivantes : cancer, maladies d'origine virale telle que le SIDA, maladies à caractère mono- ou multigéniques, maladies neurodégénératives.

35. Procédé de production d'un vecteur viral selon la revendication 27 caractérisé par a) la transfection d'une cellule eucaryote avec un plasmide contenant i) une partie du génome d'un virus à ADN double brin, cette partie incluant au moins les signaux d'encapsidation et une origine de réplication, et ii) une unité de transcription telle que définie dans la revendication 18, et b) surinfection de la cellule eucaryote avec un virus à ADN auxiliaire, les étapes a) et b) pouvant être remplacées par la co-transfection du plasmide avec le génome du virus auxiliaire, c) récupération des vecteurs viraux produits par la cellule.

36. Procédé de production d'un vecteur viral selon la revendication 27 caractérisé par a) la transfection d'une cellule eucaryote avec un plasmide contenant i) une unité de transcription rétrovirale telle que définie dans la revendication 18, et ii) de part et d'autre de cette unité de transcription, des séquences permettant la recombinaison homologue de l'unité avec le génome d'un virus à ADN, et b) surinfection de la cellule avec le virus à ADN, les étapes a) et b) pouvant être remplacées par la cotansfection du plasmide avec le génome du virus à ADN, c) récupération des vecteurs viraux produits par la cellule.