ES2252779T3 - Vectores adenovirales recombinantes para la terapia genetica de los tumores humanos. - Google Patents

Vectores adenovirales recombinantes para la terapia genetica de los tumores humanos.

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ES2252779T3 ES97914375T ES97914375T ES2252779T3 ES 2252779 T3 ES2252779 T3 ES 2252779T3 ES 97914375 T ES97914375 T ES 97914375T ES 97914375 T ES97914375 T ES 97914375T ES 2252779 T3 ES2252779 T3 ES 2252779T3
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO DE TRATAMIENTO DE LOS TUMORES HUMANOS POR TERAPIA GENICA. SE REFIERE, EN PARTICULAR, A VIRUS RECOMBINANTES DEFECTIVOS PORTADORES DE UNA SECUENCIA QUE CODIFICA UN ANTIGENO ESPECIFICO DE LOS TUMORES HUMANOS, Y SU UTILIZACION PARA EL TRATAMIENTO PREVENTIVO O CURATIVO DE LOS TUMORES HUMANOS, ASI COMO PARA GENERAR IN VITRO O EX VIVO CTL ESPECIFICAS. SE REFIERE ASIMISMO A LAS COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE CONTIENEN DICHOS VIRUS, EN ESPECIAL EN FORMA INYECTABLE.

Description

Vectores adenovirales recombinantes para la terapia genética de los tumores humanos.
La presente invención, se refiere a un procedimiento para el tratamiento de los tumores humanos, mediante la terapia genética. Ésta se refiere, de una forma particular, a la utilización de los virus recombinantes defectivos, que portan una secuencia que codifica para un antígeno específico de los tumores humanos, para el tratamiento preventivo, o curativo, de los tumores humanos, así como para generar, in vitro o ex vivo, CTL específicos. Ésta se refiere, igualmente, a composiciones farmacéuticas que comportan estos virus, especialmente, en forma inyectable.
La terapia genética, consiste en corregir una deficiencia o una anomalía, introduciendo una información genética en la célula o en el órgano afectado. Esta información, puede introducirse, bien ya sea in vitro, en una célula extraída del órgano y, a continuación, reinyectarse en el organismo, o bien ya sea in vivo, directamente en el tejido pretendido como diana. Tratándose de una molécula de alto peso molecular y de carga negativa, el ADN, tiene dificultades para atravesar espontáneamente las membranas celulares fosfolípidas. Se utilizan, por lo tanto, diferentes vectores, con la finalidad de permitir la transferencia del gen: por una parte, vectores víricos y, por otra parte, vectores químicos y/o bioquímicos, naturales o sintéticos. Los vectores químicos y/o bioquímicos son, por ejemplo, cationes (fosfato cálcico, DEAE-dextrano,...), los cuales actúan formando precipitados con el ADN, los cuales pueden fagocitarse por las células. Puede igualmente tratarse de liposomas, en los cuales, el ADN se incorpora, y que se fusionan con la membrana plásmica. Los vectores sintéticos de transferencia de genes, son generalmente lípidos o polímeros catiónicos, que se acomplejan con el ADN, formando, con éste, una partícula que porta cargas positivas en la superficie. Estas partículas, son capaces de interactuar con las cargas negativas de la membrana celular y, a continuación, de franquearla. Pueden citarse, como ejemplos de tales tipos de vectores, la dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS, Transfectam®), o el cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA, Lipofectin®). Se han desarrollado, también, proteínas quimeras: éstas se encuentran constituidas por una parte policatiónica, la cual condensa el ADN, ligado a un ligando que se fija sobre un receptor membrionario, y que arrastra el complejo al interior de las células, por endocitosis. Así, de esta forma, es teóricamente posible, el pretender como diana, un tejido o ciertas poblaciones celulares, con la finalidad de mejorar la biodisponibilidad in vivo, del gen transferido (para revisiones, véase Behr, 1993, Cotten et Wagner, 1993). Entre los virus potencialmente utilizables como vectores para la transferencia de genes, pueden citarse, de una forma más particular, los retrovirus (RSV, HMS, MMS, etc.), el virus HSV, los virus adeno-asociados, y los adenovirus. Estos virus, se han utilizado, todos ellos, para infectar diferentes tipos celulares.
Se han realizado estudios de terapia genética, enfocados al tratamiento de diferentes tipos de patologías, incluyendo los trastornos del sistema nervioso, las enfermedades cardiovasculares o los cánceres. En cuanto a lo concerniente, de una forma más particular, al sector de los cánceres, se han propuesto diferentes estudios, en el arte anterior de la técnica especializada. Así, de esta forma, existen estudios que describen la utilización de linfocitos activados ex vivo, mediante cultivo, en presencia de interleucina-2, ó mediante la transfección con el gen de interleucina-2. Se han llevado también a cabo, igualmente, estudios de inmunoterapia adoptiva, con monocitos macrófagos purificados y activados ex vivo, mediante el interferón, para aumentar el poder tumoricida y, después, reinyectados a los pacientes (Andressen et al., Cancer Res. 50 (1990) 7450). Se ha descrito, igualmente, la posibilidad de utilizar macrófagos genéticamente modificados (WO 95/06120). Otra serie de estudios, se basa en la transferencia de genes tóxicos, capaces de inducir, de una forma directa o indirecta, la muerte de las células cancerosas. Este tipo de estudio, se ha descrito, por ejemplo, con el gen de la timidina-quinasa, transferida in vivo, bien ya ser mediante un vector adenoviral (adenovírico), (PCT/FR 94/01284; PCT/FR 94/01285), o bien ya sea mediante injerto de células productoras de un vector retrovírico (Caruso et al., PNAS 90 (1973) 7024). Se han utilizado otros genes, por ejemplo, el gen de la citosina desaminasa.
La presente solicitud, se refiere a un nuevo procedimiento de tratamiento de los cánceres. Ésta está destinada, de una forma particular, al tratamiento de los melanomas. El procedimiento de la presente invención, se basa en el tratamiento de la expresión in vivo de antígenos específicos de los melanomas, capaces de inducir, (i) una protección inmunitaria contra la aparición de este tipo de cánceres y, (ii) una expansión de la población de células T citotóxicas (CTL) específicas de las células que presentan estos antígenos y, así, de este modo, una destrucción mediante el sistema inmunitario de las células tumorales correspondientes.
El sistema inmunitario tiene, entre otras funciones, la capacidad de asegurar una protección contra las infecciones víricas. Esta capacidad, está asegurada mediante linfocitos T citotóxicos (CTL). Los CTL presentan dos características remarcables: éstos son altamente específicos y de una gran eficacia. Éstos destruyen las células infectadas, después de haber identificado un antígeno viral en su superficie. El antígeno en cuestión, se manifiesta bajo la forma de un péptido asociado a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad de la clase I (CMH-I). En el ámbito de los tumores, se ha observado, inicialmente en los ratones, el hecho de que, estas células malignas, presentan complejos péptido-moléculas del CMH-I, capaces de provocar, como en el ámbito de las respuestas antivirales, una respuesta inmunitaria mediatizada por los CTL. Estos péptidos, provienen, especialmente, de proteínas codificadas por los genes mutantes o activados de una forma selectiva, en las células tumorales. Estas proteínas, se designan como antígenos específicos de tumores. Más recientemente, se han caracterizado antígenos de diferenciación reconocidos por CTL, sobre tumores humanos.
La presente invención, se refiere a un nuevo procedimiento para el tratamiento de los tumores humanos. Éste emana, de una forma particular, de la puesta a punto de los vectores de origen vírico, capaces de transferir y de expresar, in vivo, antígenos específicos de tumores humanos o melanomas. Éste se basa, de una forma más particular, en la demostración, en los modelos murinos, en cuanto al hecho de que, los adenovirus recombinantes defectivos, son capaces de inducir una inmunización contra este tipo de antígenos, que permite obtener, in vivo, respuestas linfocíticas contra estos antígenos y, especialmente, las células tumorales que los portan. Este procedimiento en concordancia con la presente invención, permite, por lo tanto, mediante la transferencia de estos genes, el poder actuar sobre la evolución de los tumores humanos, de una forma particularmente eficaz, parando su progresión, pudiendo conducir a la erradicación.
La presente invención, describe, por lo tanto, un adenovirus recombinante defectivo, el cual contiene, insertado en su genoma, un ácido nucleico que codifica para una proteína o un péptido específico de tumor y, de una forma más particular, para la totalidad o parte de un antígeno específico de un melanoma.
De una forma preferente, éste se trata de un antígeno específico de un melanoma humano. De una forma todavía más preferente, éste se trata de un fragmento de un antígeno específico de un melanoma humano, el cual comprende la parte presentada en los CTL, en asociación con las moléculas del CMH-I. Los antígenos específicos de tumores humanos, se han descrito por parte de Thierry Boon et al. (US 5.342.774; US 5.405.940; WO 92/20 356; WO 94/23 031; WO 94/21 126). Estos antígenos, designados con el término de MAGE, se expresan selectivamente, en las células tumorales, principalmente, los tumores humanos. Se han descrito diferentes genes MAGE humanos y, especialmente, los genes MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, MAGE-7, MAGE-8, MAGE-9, MAGE-10, MAGE-11, MAGE-12. A título representativo de genes murinos homólogos, puede también hacerse referencia a los genes S-MAGE-1, S-MAGE-2. En cuanto a lo concerniente, de una forma más particular, a los genes BAGE, GAGE y RAGE, éstos son representativos de otras familias de genes emparentados.
En el ámbito de la presente invención, se describe un adenovirus recombinante defectivo, el cual contiene, insertados en su genoma, un ácido nucleico que codifica para una proteína o un péptido que se deriva de ésta, seleccionada de entre las proteínas Mage-1, Mage-3, Bage, Gage y Rage. Estos antígenos son, efectivamente, los más selectivos, en el sentido de que éstos, no se han detectado, para la más grande mayoría, en ninguna célula somática no tumoral. Las secuencia del antígeno mage-1 y del gen correspondiente, se han descrito, especialmente, en Van Bruggen et al., Science 254 (1991) 1644). La secuencia del ADNc que codifica para Mage-1 y Mage-3, se ha descrito, por ejemplo, en Gaugler et al. (J. Exp. Med. 179 (1994) 921).
Tal y como se ha indicado anteriormente, arriba, se describe un adenonivurs recombinante defectivo, el cual contiene, insertado en su genoma, un ácido nucleico que codifica para un péptido de la proteína Mage-1, Mage-3, Bage ó Gage, que comprende la parte presentada en los CTL, en asociación con las molécula del CMH-I. Los genes Mage, Bage y Gage, codifican, en efecto, para proteínas de un tamaño importante. Estas proteínas, se degradan mediante digestión enzimática, en la célula, conduciendo, con ello, a la generación de péptidos. Éstos, son péptidos, los cuales, a continuación, se presentan en la superficie de las células, y que se reconocen por parte de los CTL en asociación con las moléculas CMH_I (véase la figura 2). De una forma todavía más preferente, la invención, se refiere a un adenovirus recombinante, el cual comprende, insertado en su genoma, un ácido nucleico que codifica para un péptido de la proteína Mage-1 ó Mage-2, que comprende la parte presentada en los CTL.
Según una forma de realización específica, se describe un adenovirus recombinante, el cual comprende, insertado en su genoma, la secuencia SEQ ID Nº 1. Esta secuencia, comprende la secuencia que codifica para el nonapéptido (27 pb) de Mage-1, el cual se presenta mediante la molécula HLA.A1, en los linfocitos T citotóxicos. De una forma más particular, ésta se trata de la secuencia comprendida entre los residuos 55 a 82 de la secuencia SEQ ID
nº 1.
Según otra forma de realización específica, se describe un adenovirus recombinante, el cual comprende, insertado en su genoma, la secuencia SEQ ID Nº 2. Esta secuencia, comprende la secuencia que codifica para el nonapéptido (27 pb) de Mage-3, el cual se presenta mediante la molécula HLA.A1, en los linfocitos T citotóxicos.
Según otra forma de realización, se describe un adenovirus recombinante, el cual comprende, insertado en su genoma, un ácido nucleico que codifica para el péptido antigénico del gen P1A del mastocitoma p815 del ratón DBA/2 (SEQ ID Nº 3).
Tal y como se ha indicado anteriormente, arriba, los adenovirus, permiten una transferencia y una expresión eficaz de estos péptidos antigénicos, in vivo. Así, de este modo, éstos permiten, de una forma del todo remarcable, el estimular, in vivo, la aparición de linfocitos T citotóxicos específicos de estos antígenos, que destruyen, de una forma selectiva, toda célula que presente este antígeno en su superficie.
Los virus descritos en el ámbito de la presente invención, son por lo tanto susceptibles de poderse utilizar para la preparación de composiciones farmacéuticas, destinadas al tratamiento de cánceres, en donde, las células, presentan antígenos Mage en su superficie. Para preparar composiciones de este tipo, las células tumorales (generalmente, de un melanoma), de un paciente, de una forma preferente, se extraen y se analizan para, (i) determinar la expresión de un gen Mage mediante, por ejemplo, por RT-PCR, y (ii) eventualmente, tipificar este antígeno Mage. Se construye un adenovirus que contiene un ácido nucleico que codifica para la totalidad o parte del antígeno correspondiente, y se utiliza para la administración.
Los virus, pueden igualmente utilizarse in vitro (o ex vitro), para generar poblaciones de células T citotóxicas específicas de un antígeno tumoral dado. Para ello, se procede a infectar una población de células, mediante un virus de la invención y, a continuación, ésta se pone en contacto con precursores de células CTL. Las células CTL específicas de los antígenos, pueden entonces seleccionarse, in vitro, amplificarse y, a continuación, utilizarse a título de medicamento, para destruir específicamente los tumores correspondientes. De una forma ventajosa, la población de células infectadas por un virus de la invención, comprende las células presentadoras de antígenos (APC). Puede tratarse, de una forma particular, de macrófagos (WO 95/06 120), ó de células B.
En los adenovirus descritos en el ámbito de la presente invención, el ácido nucleico insertado, puede ser un fragmento de ADN complementario (ADNc), de ADN genómico (ADNg), o una construcción híbrida, consistente, por ejemplo, en un ADNc, en el cual, se habrían insertado uno o varios intrones. Éste puede igualmente tratarse de secuencias sintéticas o semisintéticas. Tal y como se ha indicado anteriormente, arriba, éste se trata de una ácido nucleico que codifica para toda una proteína o péptido derivado de esta proteína, seleccionada de entre Mage-1, Mage-3, Bage y Gage. En el sentido de la presente invención, la expresión péptido que se deriva de esta proteína, significa el hecho de que, el ácido nucleico, puede codificar para un fragmento, únicamente de la proteína, debiendo ser, este fragmento, susceptible de poder generar CTLs. El fragmento en concordancia con la invención, porta, por lo tanto, por lo menos un determinado antígeno, reconocido por un CTL específico. Estos fragmentos, pueden obtenerse mediante toda técnica genética y/o química y/o enzimática, o también, mediante clonación por expresión, que permita la selección de variantes, en función de su actividad biológica. Las modificaciones genéticas, incluyen las supresiones, deleciones, mutaciones, etc.
El ácido nucleico insertado es, de una forma preferente, un ADNc ó un ADNg.
De una forma general, el ácido nucleico insertado, comprende igualmente secuencias que permiten la expresión, en la célula infectada, del antígeno o del fragmento de antígeno. Éste puede tratarse de las secuencias que son naturalmente responsables de la expresión del citado antígeno, cuando éstas secuencias son susceptibles de poder funcionar en la célula infectada. Éste puede igualmente tratarse de secuencias de origen diferente, designadas como secuencias heterólogas (responsables de la expresión de otras proteínas, o incluso sintéticas). Especialmente, éste puede tratarse de promotores de genes eucariotas o víricos, o de secuencias derivadas, que estimulan o reprimen la transfección de un gen, de una forma específica o no, y de forma inducible o no. A título de ejemplo, éste puede tratarse de secuencias promotoras nacidas del genoma de la célula que se pretende infectar, o del genoma de un virus y, especialmente, los promotores de los genes E1A, MLP de adenovirus, el promotor CMV, LTR-RSV, SR\alpha, etc. Entre los promotores eucariotas, pueden citarse, igualmente, los promotores ubiquitarios (HPRT, vimentina, \alpha-actina, tubulina, etc.), los promotores de los filamentos intermediarios (desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP, etc.), los promotores de genes terapéuticos (tipo MDC, CFTR, factor VIII, etc.), los promotores específicos de tejidos (piruvato, quinasa, villina, promotor de la proteína intestinal de enlace de los ácidos grasos, promotor de la actina \alpha de las células del músculo liso, promotores específicos del hígado; Apo AI, Apo AII, albúmina humana, etc.), o también, los promotores que responden a un estímulo (receptor de las hormonas esteroides, receptor del ácido retinoico, etc.). Además, estas secuencias de expresión, pueden modificarse mediante la adición de secuencias de activación, de regulación, etc. Por otro lado, además, cuando el ácido nucleico insertado, no comporta secuencias de expresión, éste puede insertarse en el genoma del virus defectivo, corriente debajo de una de tales tipos de secuencia.
Los virus utilizados en el ámbito de la presente invención, son defectivos, es decir, incapaces de replicarse de una forma autónoma, en la célula diana. Generalmente, el genoma de los virus defectivos utilizados en el ámbito de la presente invención, se encuentra por lo tanto desprovisto, por lo menos, de las secuencias necesarias para la replicación del citado virus, en la célula infectada. Estas regiones, pueden, bien ya sea eliminarse (en su totalidad o en parte), o bien convertirse en no funcionales, o bien substituirse por otras secuencias y, especialmente, por el gen insertado. De una forma preferente, el virus defectivo, conserva, no obstante, las secuencias de su genoma que son necesarias para la encapsidación de las partículas víricas.
Los virus utilizados en el ámbito de la presente invención, puede obtenerse a partir de diferentes serotipos de adenovirus. Existen diferentes serotipos de adenovirus, en donde, la estructura y las propiedades, varían muy poco. Entre estos serotipos, se prefiere utilizar, en el ámbito de la presente invención, los adenovirus humanos del tipo 2 ó 5 (Ad 2 ó Ad5), o los adenovirus de origen animal (véase el documento de solicitud de patente internacional WO 94/26 914). Entre los adenovirus de origen animal utilizables en el ámbito de la presente invención, pueden citarse los adenovirus de origen canino, bovino, murino (por ejemplo: Mav1, Beard et al, Virology 75 (1990) 81), ovino, porcino, aviar, o también símico (por ejemplo: SAV). De una forma preferente, el adenovirus de origen animal, es un adenovirus canino, de una forma más preferente, un adenovirus CAV2 [cepa Mannhattan ó A26/61 (ATCC VR-800), por ejemplo]. De una forma preferente, en el ámbito de la presente invención, se utilizan adenovirus de origen humano o canino, o mixto.
De una forma preferente, los adenovirus defectivos utilizados en el ámbito de la presente invención, comprenden las ITR, una secuencia que permite la encapsidación y el ácido nucleico de interés. De una forma todavía más preferente, en el genoma de los adenovirus utilizados en el ámbito de la presente invención, la región E1, por lo menos, es no funcional. El gen vírico considerado, puede convertirse en no funcional, mediante cualquier técnica conocida por la persona experta en el arte especializado de la técnica y, especialmente, mediante supresión total, substitución, deleción parcial, o adición, de una o varias base, en el gen o los genes considerados. Tales tipos de modificaciones, pueden obtenerse in vitro (sobre ADN aislado), o in situ, por ejemplo, por mediación de las técnicas de ingeniería genética, o también, mediante tratamiento por mediación de agentes mutágenos. Pueden también modificarse otras regiones y, especialmente, la región E3 (WO 95/02 697), E2 (WO 94/28 938), E4 (WO 94/28 152, WO 94/12 649, WO 95/02 697) y L5 (WO 95/02 697). Según una forma preferida de puesta en ejecución, el adenovirus utilizado en el ámbito de la presente invención, comprende una deleción en las regiones E1 y E4. Según otra forma preferida de realización, éste comprende una deleción en la región E1, al nivel de la cual, se insertan la región E4 y el ácido nucleico (véase la patente francesa FR 94 13 355). De una forma ventajosa, la deleción, en la región E1, se asienta en los nucleótidos 454 a 3328 (fragmento de PvuII-BgIII) ó 382 a 3446 (fragmento HinfII-Sau3A). De una forma ventajosa, la deleción en la región E4, comprende, por lo menos, las fases ORF3 y ORF6.
El ácido nucleico de interés, puede insertarse en diferentes regiones del genoma del adenovirus. El genoma de un adenovirus, está compuesto por un ADN de doble hebra, lineal, de un tamaño de 36 kb, aproximadamente. Éste comprende, especialmente, una secuencia inversa repetida (ITR), en cada extremo, una secuencia de encapsidación (Psi), genes precoces y genes tardíos (véase la figura 1). Los principales genes precoces, están contenidos en las regiones E1, E2, E3 y E4. Entre éstos, los genes contenidos en la región E1, son necesarios para la propagación vírica. Los principales genes tardíos, están contenidos en las regiones L1 a L5. El genoma del adenovirus Ad5, se ha secuenciado en su totalidad, y es accesible sobre base de datos (véase, especialmente, Genebank M73260). Además, se han secuenciado igualmente, partes, e incluso la totalidad, de otros genomas de adenovirus (Ad2, Ad7, Ad12, etc.). El ácido nucleico de interés, de una forma preferible, se inserta en una región no esencial para la producción de los virus recombinantes defectivos. Así, de esta forma, de una forma preferente, éste se inserta al nivel de la región E1, la cual es defectiva en el virus, y se complementa mediante la línea de producción, de la región E3, la cual no esencial para la producción de los virus recombinantes (su inactivación, no debe transcomplementarse), o también en la región E4. En este último caso, es necesario el proceder a complementar la funciones E4, en el momento de su producción, bien ya sea mediante co-transfección con un plásmido o virus helper, o bien ya sea por mediación de una línea apropiada. Está claro que pueden también utilizarse otros sitios. De una forma particular, el acceso a la secuencia nucleótida del genoma,, permite, a la persona experta en el arte de la técnica especializada, el identificar regiones que permiten insertar el ácido nucleico de interés.
Los adenovirus recombinantes defectivos utilizados en el ámbito de la presente invención, pueden prepararse mediante toda técnica conocida por parte de la persona experta en este arte especializado de la técnica (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Generalmente, los adenovirus, se producen por transfección del ADN del virus recombinante, en una línea celular de encapsidación que sea competente. Puede tratarse de una transfección simple, cuando se puede disponer de una construcción que porte el conjunto del genoma del virus recombinante o, como es el caso, en la mayoría de las veces, de una co-transfección de varios fragmentos de ADN que aporten las diferentes partes del genoma viral recombinante. En este caso, el procedimiento, implica una o varias etapas de recombinación homóloga, entre las diferentes construcciones, en la línea celular de encapsidación, para generar el ADN del virus recombinante. Los diferentes fragmentos utilizados para la producción del virus, pueden prepararse de diferentes formas. La técnica que es la que más se utiliza en general, consiste en aislar el ADN viral y, a continuación, en modificarlo in vitro, mediante los procedimientos clásicos de biología molecular (digestión, ligado, etc.). las construcciones obtenidas, se purifican, a continuación, y se utilizan para transfectar las líneas de encapsidación. Otra técnica, consiste en la utilización de un plásmido que porta una parte del genoma del virus recombinante, el cual se co-transfecta con un virus que aporta la parte que falta del genoma. Otra posibilidad, reside en la utilización de plásmidos procariotas, para preparar los ADN víricos utilizables para la transfección (véase Bett et al., PNAS 91 (1994) 8802; FR 95 01 632).
La línea celular utilizada, de una forma preferente (i) debe ser transformable mediante los citados elementos, y (ii) debe comportar las secuencias capaces de complementar la parte del genoma del adenovirus defectivo, de una forma preferente, en forma integrada, con objeto de evitar los riesgos de recombinación. A título de ejemplo de línea, puede mencionarse la línea del riñón embrionario humano 293 (Graham et al. J. Gen. Virol 36 (1997 59), la cual contiene, especialmente, integrada en su genoma, la parte izquierda del genoma de un adenovirus Ad5 (12%) o líneas capaces de complementar las funciones E1 y E4, tales como las que se describen, especialmente, en los documentos de solicitudes de patentes internacionales n^{os} WO 94/26 914 y WO 95/02 697.
A continuación, los adenovirus que se han multiplicado, se recuperan y se purifican, según las técnicas clásicas de biología molecular, tal y como se ilustra en los ejemplos.
La presente invención, describe igualmente toda composición farmacéutica que comprende uno o varios adenovirus recombinantes defectivos, tal y como se describe posteriormente, a continuación. Las composiciones farmacéuticas de la invención, pueden formularse en vistas a una administración por vía oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, sub-cutánea, transdérmica, intra-traqueal, intra-peritoneal, etc.
La presente invención, concierne igualmente a toda composición farmacéutica que comprende células infectadas por un adenovirus recombinante defectivo, tal y como se ha descrito anteriormente, arriba. De una forma ventajosa, la composición de la presente invención, comprende células presentadoras de antígenos (APC) infectadas por un adenovirus recombinate defectivo, tal y como se describe anteriormente, arriba. A título de ejemplo particular, se pueden citar los macrófagos o los linfocitos B. La invención, se refiere, aún, todavía, a una composición que comprende células T citotóxicas (CTL) específicas de un gen tumoral, preparadas mediante cultivo de células precursoras, en presencia de células presentadoras de antígenos (APC) infectadas por un adenovirus recombinante defectivo, tal y como se ha descrito anteriormente, arriba.
De una forma preferente, una composición farmacéutica de la invención, contiene vehículos farmacéuticamente aceptables, para una formulación inyectable. Puede tratarse, de una forma particular, de soluciones salinas (fosfato monosódico, disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, etc., o mezclas de tales sales), estériles, isotónicas, o composiciones secas, especialmente, liofilizadas, las cuales, mediante la adición, según el caso, de agua esterilizada o de suero fisiológico, permitan la constitución de soluciones inyectables.
Las dosis de virus utilizados para la inyección, pueden adaptarse, en función de diferentes parámetros y, especialmente, en función del modo de administración utilizado, de la patología concernida, del gen a expresar, o también, de la duración del tratamiento investigado. De una forma general, los adenovirus recombinantes según la invención, se formulan y se administran en forma de dosis comprendidas entre 10^{4} y 10^{14} pfu y, de una forma preferente, de 10^{6} a 10^{10} pfu. El término pfu ("plaque forming unit" -unidad de formación de placa-), corresponde al poder infeccioso de una solución de virus, y se determina mediante infección de un cultivo celular apropiado, y mediante la medición, de una forma general, después de un transcurso de tiempo de 15 días, del número de placas de células infectadas. Las técnicas de
determinación de la valoración o titración de las pfu, de una solución vírica, están bien documentadas en la literatura.
Según el antígeno concernido, los adenovirus de la invención, pueden utilizarse para el tratamiento o para la prevención de cánceres, incluyendo, de una forma especial, los tumores humanos (para los antígenos Mage-1 a Mage 12, Gage y Bage y Rage), los sarcomas (para los antígenos Mage-1).
La presente invención, se describirá de una forma más completa, con la ayuda de los ejemplos que se facilitan a continuación, los cuales deben considerarse como ilustrativos, y no limitativos.
Técnicas generales de clonación, de biología molecular
Los procedimientos clásicos de biología molecular, tales como la centrifugación de ADN plásmido en gradiente de cloruro de cesio-bromuro de etidio, las digestiones por las enzimas de restricción, la electroforesis sobre gel, la transformación en E. coli, la precipitación de los ácidos nucleicos, etc., se describen en la literatura (Maniatis et al., 1989).
Las enzimas, se proporcionaron por parte de la firma New-England Biolabs (Beverly, MA).
Para las ligaduras, los fragmentos de ADN, se separan según su tamaño, sobre geles de agarosa de 0,8 a 1,5%, se purifican mediante GenClean (BIO101), LaJolla CA), y se incuban, por la noche, a una temperatura de 14°C, en un tam-
pón Tris-HCl pH 7,4, 50 mMM, MgCl_{2} 10 mM, DDT 10 mM, ATP 2 mM, en presencia de ADN ligasa del fago T4.
Se procedió, también, a realizar la amplificación por PCR, según Maniatis et al., 1989, con las especificaciones siguientes:
- Concentración en MgCl_{2} llevada a 8 mM.
- Temperatura de desnaturalización 95°C, temperatura de hibridación 55°C, temperatura de alargamiento 72°C. Este ciclo, se repitió 25 veces, en un ciclador térmico del tipo PE9600 Thermalcycler (Perkin Elmer, Norwall, CO).
Los oligonucleótidos, se sintetizan utilizando la química de las fosforamiditas protegidas en \beta, mediante un grupo cianoetilo, (Sinha et al., 1984, Giles 1985), con un sintetizador automático de ADN Applied Biosystem, modelo 394 (Applied Biosystem, Foster City CA), según las recomendaciones del fabricante.
La secuenciación, se efectuó sobre matrices de doble hebra, mediante el procedimiento de terminación de cadenas, utilizando cebadores fluorescentes. Utilizamos el equipo transportable, a modo de kit de secuenciación, Taq Dye Primer Kit, de la firma Biosystem (Applied Biosystem, Foster City CA), según las recomendaciones del fabricante.
Ejemplo 1 Construcción de un adenovirus recombinante defectivo, que codifica para un fragmento de antígeno P1A
Este ejemplo, describe la construcción de un adenovirus recombinante defectivo según la invención, que codifica para un fragmento del antígeno P1A. De una forma más particular, el adenovirus, porta la secuencia SEQ ID Nº 3. El adenovirus construido, es un adenovirus de serotipo 5, que posee una deleción en las regiones E1 y E3, encontrándose insertado, el ácido nucleico de interés, en la región E1, al nivel de la deleción.
El ácido nucleico de interés insertado al nivel de la región E1, comprende, de una forma más particular:
- el promotor SR\alpha. El promotor SR\alpha, comprende el origen de replicación precoz de SV40, y una parte del LTR del HTLV1 (correspondiente a la región R y a una parte de U5), seguido de la unión de empalme 16S de SV40 (Tekebe et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 466).
- un minigén P1A de 44 pb (SEQ ID Nº3).
- el sitio de poliadenilación del virus SV40.
Este ácido nucleico, se extrajo del plásmido pcD-SR\alpha-P1A, correspondiente al plásmido pcD-SR\alpha, en el cual, el minigén P1A, se clonó en el sitio EcoRI. El inserto obtenido, se clonó, a continuación, en el plásmido pAd-RSV-\betaGal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626), en el lugar del fragmento que comporta el LTR de RSV y el gen LacZ.
El plásmido pAd-SR\alpha-P1A de esta forma obtenido, se utilizó, a continuación, para producir el adenovirus recombinante. Para ello, se procedió a co-transfectar las células de la línea 293, mediante 5 \mug del plásmido pAd-SR\alpha-P1A, y mediante 5 \mug del ADN del adenovirus mutante dl 324, en presencia de fosfato de calcio. Los adenovirus recombinantes producidos, se seleccionaron, a continuación, mediante purificación sobre placa. Después del aislamiento, el adenovirus recombinante, se amplificó en la línea celular 293, lo cual condujo a un sobrenadante de cultivo que contenía el adenovirus recombinante no purificado que tenía una valoración o título de aproximadamente 10^{10} pfu/ml.
Se procedió, a continuación, a purificar las partículas víricas, mediante centrifugación sobre gradiente de cloruro de cesio, según las técnicas conocidas (véase, especialmente, Graham et al., Virology 52 (1973) 456). El análisis del ADN vírico, mediante digestión con la ayuda de enzimas de restricción EcoRI, demuestra la presencia del inserto en el genoma. El adenovirus, puede conservarse a una temperatura de -80°C, en 10% de glicerol.
Ejemplo 2 Construcción de un adenovirus recombinante defectivo, que codifica para un fragmento de antígeno Mage-1
Este ejemplo, describe la construcción de un adenovirus recombinante defectivo según la invención, que codifica para un fragmento de antígeno Mage-1. De una forma más particular, el adenovirus, porta la secuencia SEQ ID Nº 1, que codifica para un fragmento que porta el nonapéptido antigénico de Mage-1. El adenovirus construido, es un adenovirus de serotipo 5, que posee una deleción en las regiones E1 y E3, insertándose, el ácido nucleico de interés, en la región E1, al nivel de la deleción.
El ácido nucleico insertado al nivel de la región E1, comprende, de una forma más particular:
- el promotor SR\alpha. El promotor SR\alpha, comprende el origen de replicación precoz de SV40, y una parte del LTR del HTLV1 (correspondiente a la región R y a una parte de U5), seguido de la unión de empalme 16S de SV40 (Tekebe et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 466).
- un minigén MAGE-1 de 116 pb (SEQ ID Nº1). Este fragmento, se obtuvo por PCR, a partir del gen Mage-1 completo. Éste comporta un ATG en posición 15, un codón de paro (stop) en la posición 121, y una parte del exón 3 del gen Mage-1. Éste comprende la secuencia correspondiente al nonapéptido (27 pb), que se presenta mediante la molécula HLA.A1, en los linfocitos T citotóxicos.
- el sitio de poliadenilación del virus SV40.
Este ácido nucleico, se extrajo del plásmido pcD-SR\alpha-MAGE-1, correspondiente al plásmido pcD-SR\alpha, en el cual, el minigén Mage-1, se clonó en el sitio EcoRI. El inserto obtenido, se clonó, a continuación, en el plásmido pAd-RSV-\betaGal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626), en el lugar del fragmento que comporta el LTR de RSV y el gen LacZ.
El plásmido pAd-SR\alpha-MAGE-1 de esta forma obtenido, se utilizó, a continuación, para producir el adenovirus recombinante. Para ello, se procedió a co-transfectar las células de la línea 293, mediante el plásmido pAd-SR\alpha-MAGE-1, y mediante el ADN del adenovirus mutante dl 324, en presencia de fosfato de calcio. Los adenovirus recombinantes producidos, se seleccionaron, a continuación, mediante purificación sobre placa. Después del aislamiento, el adenovirus recombinante, se amplificó en la línea celular 293, lo cual condujo a un sobrenadante de cultivo que contenía el adenovirus recombinante no purificado que tenía una valoración o título de aproximadamente 10^{10} pfu/ml.
Se procedió, a continuación, a purificar las partículas víricas, mediante centrifugación sobre gradiente de cloruro de cesio, según las técnicas conocidas (véase, especialmente, Graham et al., Virology 52 (1973) 456). El análisis del ADN vírico, mediante digestión con la ayuda de enzimas de restricción EcoRI, demuestra la presencia del inserto en el genoma. El adenovirus, puede conservarse a una temperatura de -80°C, en 10% de glicerol.
Ejemplo 3 Construcción de un adenovirus recombinante defectivo, que codifica para un fragmento de antígeno Mage-3
Este ejemplo, describe la construcción de un adenovirus recombinante defectivo según la invención, que codifica para un fragmento de antígeno Mage-3. De una forma más particular, el adenovirus, porta la secuencia SEQ ID Nº 2, que codifica para un fragmento que porta el nonapéptido antigénico de Mage-3. El adenovirus construido, es un adenovirus de serotipo 5, que posee una deleción en las regiones E1 y E3, insertándose, el ácido nucleico de interés, en la región E1, al nivel de la deleción.
El ácido nucleico insertado al nivel de la región E1, comprende, de una forma más particular:
- el promotor SR\alpha. El promotor SR\alpha, comprende el origen de replicación precoz de SV40, y una parte del LTR del HTLV1 (correspondiente a la región R y a una parte de U5), seguido de la unión de empalme 16S de SV40 (Tekebe et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 466).
- un minigén MAGE-3 de 44 pb (SEQ ID Nº2). Este fragmento, se obtuvo por PCR, a partir del gen Mage-3 completo. Éste comporta un ATG en posición 12, un codón de paro (stop) en la posición 44, y la secuencia correspondiente al nonapéptido (27 pb), que se presenta mediante la molécula HLA.A1, en los linfocitos T citotóxicos.
- el sitio de poliadenilación del virus SV40.
Este ácido nucleico, se extrajo del plásmido pcD-SR\alpha-MAGE-3, correspondiente al plásmido pcD-SR\alpha, en el cual, el minigén Mage-3, se clonó en el sitio EcoRI. El inserto obtenido, se clonó, a continuación, en el plásmido pAd-RSV-\betaGal, en el lugar del fragmento que comporta el LTR de RSV y el gen LacZ.
El plásmido pAd-SR\alpha-MAGE-3 de esta forma obtenido, se utilizó, a continuación, para producir el adenovirus recombinante. Para ello, se procedió a co-transfectar las células de la línea 293, mediante el plásmido pAd-SR\alpha-MAGE-3, y mediante el ADN del adenovirus mutante dl 324, en presencia de fosfato de calcio. Los adenovirus recombinantes producidos, se seleccionaron, a continuación, mediante purificación sobre placa. Después del aislamiento, el adenovirus recombinante, se amplificó en la línea celular 293, lo cual condujo a un sobrenadante de cultivo que contenía el adenovirus recombinante no purificado que tenía una valoración o título de aproximadamente 10^{10} pfu/ml.
Se procedió, a continuación, a purificar las partículas víricas, mediante centrifugación sobre gradiente de cloruro de cesio, según las técnicas conocidas (véase, especialmente, Graham et al., Virology 52 (1973) 456). El análisis del ADN vírico, mediante digestión con la ayuda de enzimas de restricción EcoRI, demuestra la presencia del inserto en el genoma. El adenovirus, puede conservarse a una temperatura de -80°C, en 10% de glicerol.
Ejemplo 4 Caracterización funcional de los adenovirus de la invención
Este ejemplo, demuestra el hecho de que, los virus según la invención, son capaces de inducir la expresión del gen de interés que codifica para una proteína, en donde, la degradación, conduce a la expresión de un péptido antigénico en la superficie de las células diana.
La expresión del minigén MAGE-1, y la presentación de péptido, se evidenciaron, sobre las células infectadas mediante el Ad-Mage (4.1.), mediante la determinación de la lisis específica (4.2) y la estimulación de la producción de TNF (4.3).
4.1 Líneas celulares
Las líneas celulares que se infectaron, son las siguientes:
- C1R.A1: línea linfocítica B, transformada por el EBV (ref. Storkus, W. J., Howell, D. N., Salter R. D., Dawson, J. R. y Cresswell, P.: NK susceptibility varies inversely with target cell class I HLA antigen expression, -La susceptibilidad NK, varía inversamente con la expresión del antígeno de la célula diana de la clase I HLA-, J. Immunol. 138: 1675-1659, 1987), y tranfectada por el gen HLA.A1, clonado en el plásmido pHEBO.
- Gerl III \beta E^{-}F^{-}: células del melanoma humano HLA.A1 inmunoseleccionadas por la pérdida del antígeno MAGE-1. (designadas como Gerlach E, en las tablas 1 y 2).
Estas dos líneas, expresan, por lo tanto, la molécula HLA.A1, pero no el antígeno MAGE-1.
4.2 Determinación de las lisis específica
Este ejemplo, demuestra la existencia de una lisis específica de las células mediante un clon de CTL específico del antígeno, (test de ensayo de liberación del cromo radioactivo). Para ello, las células mencionadas en 4.1, se infectaron mediante el adenovirus Ad-Mage 1 (ejemplo 2) o mediante un adenovirus de control (Ad-\betaGAl), a una multiplicidad de infección de 500 pfu/célula. Las células infectadas, se marcaron, a continuación, mediante cromo 51 y, a continuación, se incubaron durante un transcurso de tiempo de 4 horas, a razón de 1000 células/hoyo, con el CTL específico (clon 82:30), a diferentes valores de relación células efectivas/células diana (E/T). Se procedió, a continuación, a determinar el porcentaje de lisis. Los resultados obtenidos, se presentan en la tabla 1. Éstos muestran claramente el hecho de que, las células infectadas por el virus según la invención, presentan una sensibilidad a la lisis, mediante los CTL específicos, netamente superior a la de las células infectadas por el adenovirus de control. Estas células, presentan, igualmente, una sensibilidad netamente acrecentada con relación a las células directamente transfectadas por el antígeno Mage-1, lo cual demuestra la eficacia terapéutica de los vectores de la invención.
Estos resultados, muestran por lo tanto, de una forma clara, el hecho de que, los virus de la invención, son capaces de conferir, a las células, una sensibilidad importante a la lisis mediante los CTL específicos.
4.3 Estimulación de la producción de TNF
En este ejemplo, se procedió a evaluar la capacidad de las células Gerl III \beta E^{-}F^{-}, para estimular la producción de TNF, mediante el mismo clon de CTL. Para ello, se procedió a infectar las células Gerl III \beta E^{-}F^{-}, mediante el adenovirus Ad-Mage 1 (ejemplo 2), o mediante un adenovirus de control (Ad-\betaGal) a una multiplicidad de infección de 50 ó 100 pfu/célula y, a continuación, se incubaron con el clon CTL. Después de un transcurso de tiempo de 24 horas, se procedió a medir la cantidad de TNF presente en los sobrenadantes, mediante la determinación de su citotoxicidad sobre una línea sensible al TNF (línea WEHI-164-13). La viabilidad celular, se medió por mediación de un test de ensayo calorimétrico (MTT). Los resultados obtenidos, se expresan en densidad óptica y, después, en cantidad de TNF (pg/ml). Este test de ensayo, no se efectuó sobre las células C1R.A1, debido al hecho de que, éstas, secretan TNF, de una forma natural. Las células de control Gerlach E^{+}, son células de melanoma que expresan Mage-1 y HLA-A1.
Los resultados obtenidos, se presentan en la tabla 2. Éstos muestran claramente el hecho de que, las células infectadas por el virus según la invención, inducen una producción de TNF por las CTL, lo cual confirma, sin ambigüedad, las propiedades biológicas y terapéuticas de los virus de la invención.
Ejemplo 5 Actividad in vivo de los virus P1A de la invención
El ejemplo 4, ha mostrado que, in vitro o ex vivo, las células infectadas por un adenovirus según la invención, se reconocen bien en un test de ensayo de TNF, y se lisan en un test de ensayo de liberación del cromo radioactivo, mediante un CTL específico.
Este ejemplo, demuestra, ahora, el hecho de que, in vivo, los adenovirus según la invención, son capaces de generar una respuesta CTL específica. De una forma más particular, este ejemplo, demuestra que 2 inyecciones, con un intervalo de tiempo de una semana, de 10^{9} partículas virales (pfu), en el ratón DBA/2, generan, en una parte de éstos, una respuesta CTL específica.
Se realizaron dos series de experiencias. En la primara serie de experiencias, las partículas víricas, se administraron, para una mitad, en la cavidad peritoneal y, para la otra mitad, bajo la piel (en 4 sitios). En la segunda serie de experiencias, las partículas víricas, se administraron mediante inyecciones sub-cutáneas, intra-peritoneales, intra-nasales e intra-traqueales. Estas dos series de experiencias, se realizaron según el protocolo siguiente. Los ratones, se sacrificaron 15 días después de la segunda serie de inyecciones del adenovirus. Los esplenocitos de estos ratones, se pusieron, a continuación, en presencia del antígeno P815A, por mediación de células L1210A+ (leucemia singénica transfectada con el gen P_{1}A del mastocitoma P815), irradiados por un período de 8 días. Al término de este cultivo mixto tumor-linfocitos (MLTC), los linfocitos dirigidos contra el antígeno P815A, proliferaron y se diferenciaron en linfocitos T asesinos. Éstos se ponen en presencia de células marcadas con cromo radioactivo. Se trata de células P511, una variante azaguanina-resistente del mastocitoma del ratón P815, que porta el antígeno A del PI.204, una variante de este mismo mastocito que ha perdido el antígeno A. Éste último, sirve de control negativo. Con el fin de eliminar toda posibilidad de reacción no específica, las células diana marcadas con cromo radioactivo, se ponen igualmente en presencia de células singénicas (L1210) que portan, en su superficie, los antígenos de la célula estimulante, en la MLTC, con la excepción del antígeno A de P815.
Los resultados obtenidos con la primera serie de experiencias, expresados en porcentajes de lisis específica, se presentan en las tablas 3A y 3B.
Los resultados obtenidos con la segunda serie de experiencias, expresados en porcentajes de lisis específica, se presentan en las tablas 4A y 4B.
En los dos casos, los resultados presentados, muestran, ratón por ratón, niveles de lisis proporcionales a las relaciones efectores/dianas (valores medios de duplicados). Se obtuvieron CTLs, sea cual fuere el sitio de inyección del adenovirus (Tabla 4A + B). Estos resultados, muestran claramente el hecho de que, los adenovirus de la invención, son capaces de generar, in vivo, una inmunidad contra las células portadoras de antígeno tumoral.
TABLA 1 
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1
TABLA 2 
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2
TABLA 3A 
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3
TABLA 3B 
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\vskip1.000000\baselineskip
4
TABLA 4A
Efector/diana P511 P1.204 P511 + frío L1210 P1.204 + frío L1210
50><1 relación 50><1 relación
Subcutáneo
Ratón No.1 490 9 2 0 1
163 5 3 0 0
54 3 1 0 0
18 3 0 0 0
8 2 1 0 0
2 0 0 0 0
Ratón No.2 50 5 0 0 1
27 3 0 0 0
9 5 0 3 0
3 6 0 0 0
1 4 0 1 0
0.3 2 0 0 0
Ratón No.3 300 73 18 68 0
100 71 15 72 0
33 92 10 75 1
11 73 8 57 8
4 56 3 25 0
1 25 2 8 0
Intraperitoneal
Ratón No.1 258 51 9 48 0
85 43 10 37 0
28 43 8 27 0
9 38 3 12 1
3 18 2 8 0
1 7 0 1 2
Ratón No.2 295 9 4 9 2
88 8 6 2 0
33 7 4 2 0
11 3 2 1 0
4 1 2 0 0
1 0 0 0 1
Ratón No.3 400 68 12 76 0
133 77 12 82 0
44 88 14 73 0
15 14 7 66 0
6 10 6 30 0
3 10 1 14 0
Ratón No.4 185 8 2 3 0
52 3 0 3 0
57 10 2 3 0
8 4 1 2 0
2 3 0 0 0
0.8 2 0 2 0
TABLA 4A (continuación)
Efector/diana P511 P1.204 P511 + frío L1210 P1.204 + frío L1210
50><1 relación 50><1 relación
Intratracheal
Ratón No.1 440 67 11 50 3
147 78 13 52 2
49 64 6 49 0
18 34 8 23 0
6 31 7 9 0
2 14 0 2 0
Ratón No.2 410 8 7 3 2
137 6 7 3 1
45 6 4 0 1
15 5 2 2 0
9 1 3 0 0
2 1 2 0 2
Ratón No.3 344 8 2 3 1
115 4 0 2 0
38 8 0 1 0
13 8 0 0 0
4 4 1 0 0
1 1 0 0 0
Ratón No.4 265 80 9 52 0
85 46 8 47 0
28 42 7 21 0
9 33 3 9 0
3 17 2 2 0
1 5 2 1 0
Ratón No.5 230 2 0 1 0
77 4 0 3 0
25 2 0 0 0
8 2 0 0 0
3 1 1 0 0
1 1 2 0 0
Ratón No.6 210 13 2 11 0
70 10 0 7 0
23 6 0 2 1
3 1 0 0 0
3 2 0 0 0
1 2 0 0 0
Intranasal
Ratón No.1 430 58 0 52 6
160 52 0 58 1
53 84 4 65 0
18 84 2 52 0
6 51 2 33 0
2 52 0 20 0
TABLA 4A (continuación)
Efector/diana P511 P1.204 P511 + frío L1210 P1.204 + frío L1210
50><1 relación 50><1 relación
Intranasal
Ratón No.2 205 4 0 0 2
69 4 0 0 0
83 1 0 0 0
8 5 0 0 0
2 3 0 0 0
0.8 2 0 0 0
Ratón No.3 250 1 0 0 0
83 0 0 0 0
28 1 0 0 0
9 1 0 0 0
3 1 0 0 0
1 1 0 0 0
Ratón No.4 280 2 0 1 0
87 8 1 0 0
29 1 0 0 0
10 2 0 1 0
3 0 0 0 0
1 1 1 0 0
Ratón No.5 240 3 0 0 2
80 1 0 0 0
27 1 0 0 1
9 1 1 0 0
3 1 0 0 0
1 1 1 1 0
Ratón No. 6 125 0 0 0 0
42 0 0 0 0
14 0 0 0 0
5 1 0 0 0
2 0 0 0 1
0.6 0 0 0 0
TABLA 4B 
\vskip1.000000\baselineskip
2°: Ad\betagal ratón inyectado
Efector/diana P511 P1.204 P511 + frío L1210 P1.204 + frío
50><1 relación L1210 50><1 relación
Subcutánea
Ratón No.1 300 0 0 0 0
100 0 0 0 0
33 0 0 0 0
11 0 0 0 0
4 0 0 0 1
1 0 0 0 0
Ratón No.2 230 4 3 0 1
77 1 1 0 0
25 1 4 0 0
8 0 0 0 0
3 0 0 0 0
1 0 0 0 0
Intraperitoneal
Ratón No.1 220 1 2 1 0
73 0 0 0 1
24 1 1 1 2
8 0 0 0 0
3 0 0 0 1
1 0 0 0 0
Ratón No.2 410 9 1 0 3
137 1 1 0 2
45 0 0 0 0
15 0 1 0 0
5 0 1 0 0
2 0 0 0 0
Intratraqueal
Ratón No.1 310 0 0 0 0
103 0 0 0 0
34 0 0 0 0
11 0 0 0 0
4 0 0 0 0
1 0 0 0 0
Ratón No.2 270 2 1 0 1
90 1 0 0 0
30 0 0 0 0
10 0 0 0 0
3 1 0 0 0
1 1 0 0 0
TABLA 4B (continuación)
2°: Ad\betagal ratón inyectado
Efector/diana P511 P1.204 P511 + frío L1210 P1.204 + frío
50><1 relación L1210 50><1 relación
Intranasal
Ratón No.1 400 0 0 0 0
18 1 0 0 1
5 0 0 0 0
2 0 0 0 0
Ratón No.2 230 3 0 0 1
77 2 0 0 0
25 0 0 0 0
9 0 0 0 0
3 1 0 0 0
1 0 0 0 0
expontáneo 106 127 122 110
máximo 1041 971 957 988
spont/max 10% 13% 13% 12%
(1) INFORMACIONES GENERALES
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: RHONE POULENC RORER S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 20, Avenue Raymond Aron
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: ANTONY
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 92165
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 40.91.69.22
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELECOPIA: (1) 40.91.72.96
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 1345, Avenue of the Americas
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: NEW YORK
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: ESTADOS UNIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 10105
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO MEDIANTE TERAPIA GENÉTICA DE LOS TUMORES HUMANOS, Y VIRUS RECOMBINANTES CORRESPONDIENTES.
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: Cinta
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
LOGICIAL: PatentIn Release #1,0, Versión #1.30 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 126 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCGCCGC CATGGAAGTG GACCCCATCG GCCACTTGTA CTAG 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCGCCGC CATGCTGCCT TATCTAGGGT GGCTGGTCTT CTAG 
\hfill
44

Claims (11)

1. Composición que comprende células infectadas por un adenovirus recombinante defectivo, que contiene, insertado en su genoma, un ácido nucleico que codifica para la totalidad o parte de un antígeno específico de un melanoma humano, elegido de entre las proteínas Mage-1, Mage-3, Bage, Rage y Gage, que comprende la parte presentada en los linfocito T citotóxicos, en asociación con las moléculas del CMH-I, capaz de inducir una protección inmunitaria y una destrucción, mediante el sistema inmunitario, de las células tumorales correspondientes.
2. Composición, según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que, las células infectadas, comprenden las células presentadoras de antígenos (APC).
3. Composición, según la reivindicación 1, caracterizada por el hecho de que, las células infectadas, comprenden los linfocitos citotóxicos específicos de tumores humanos.
4. Composición, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por el hecho de que, el adenovirus, comprende, insertada en su genoma, la secuencia SEQ ID NO: 1.
5. Composición, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por el hecho de que, el adenovirus, comprende, insertada en su genoma, la secuencia comprendida entre los residuos 55 a 82, de la SEQ ID NO: 1.
6. Composición, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por el hecho de que, el adenovirus, comprende, insertada en su genoma, la secuencia SEQ ID NO: 2.
7. Composición, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por el hecho de que, el adenovirus, se elige de entre los serotipos humanos Ad2 y Ad5.
8. Composición, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por el hecho de que, el adenovirus, se elige de entre los serotipos caninos.
9. Composición, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por el hecho de que, el adenovirus, comporta una deleción en la región E1.
10. Composición, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por el hecho de que, el adenovirus, comporta, además, una deleción en la región E4.
11. Composición, según una cualquiera de la reivindicaciones precedentes, caracterizada por el hecho de que, el ácido nucleico, se inserta en la región E1 ó E3 ó E4.
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