SK124698A3 - Recombinant adenoviral vectors for human tumour gene therapy - Google Patents
Recombinant adenoviral vectors for human tumour gene therapy Download PDFInfo
- Publication number
- SK124698A3 SK124698A3 SK1246-98A SK124698A SK124698A3 SK 124698 A3 SK124698 A3 SK 124698A3 SK 124698 A SK124698 A SK 124698A SK 124698 A3 SK124698 A3 SK 124698A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- mage
- cells
- nucleic acid
- defective recombinant
- recombinant adenovirus
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 34
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 title abstract description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 46
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 38
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims abstract description 35
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 8
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 98
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 73
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 53
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 35
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 19
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 14
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 24
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 11
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 7
- 101001005728 Homo sapiens Melanoma-associated antigen 1 Proteins 0.000 description 6
- 102100025050 Melanoma-associated antigen 1 Human genes 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 5
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 4
- 230000006433 tumor necrosis factor production Effects 0.000 description 4
- -1 α-lactin Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001005719 Homo sapiens Melanoma-associated antigen 3 Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102100025082 Melanoma-associated antigen 3 Human genes 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000006971 mastocytoma Diseases 0.000 description 2
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 2
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 1
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150008391 A1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 1
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 1
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 1
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 1
- 102100035526 B melanoma antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 1
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 1
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 1
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 1
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 1
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102100038909 Caveolin-2 Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-BJUDXGSMSA-N Chromium-51 Chemical compound [51Cr] VYZAMTAEIAYCRO-BJUDXGSMSA-N 0.000 description 1
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 102000030914 Fatty Acid-Binding Human genes 0.000 description 1
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 1
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 1
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 241000208680 Hamamelis mollis Species 0.000 description 1
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000874316 Homo sapiens B melanoma antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000740981 Homo sapiens Caveolin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000584314 Homo sapiens Myc target protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 1
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 1
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 description 1
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 1
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 241000701168 Murine adenovirus 1 Species 0.000 description 1
- 102100030625 Myc target protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 1
- GXDCMTODGPEUIW-UHFFFAOYSA-N N-[3-[4-(3-aminopropylamino)butylamino]propyl]-2-hydrazinyl-2-octadecylicosanamide Chemical group C(CCCCCCCCCCCCCCCCC)C(NN)(C(=O)NCCCNCCCCNCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC GXDCMTODGPEUIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 101710087110 ORF6 protein Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 1
- 208000034530 PLAA-associated neurodevelopmental disease Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 1
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 1
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 101710095001 Uncharacterized protein in nifU 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 1
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004611 cancer cell death Effects 0.000 description 1
- 201000011529 cardiovascular cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011124 ex vivo culture Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 108091022862 fatty acid binding Proteins 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 210000003963 intermediate filament Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Inorganic materials [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 102000003702 retinoic acid receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000064 retinoic acid receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 229940118846 witch hazel Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Rekombinantný adenovírus a jeho použitie na liečenie ľudských {
nádorov génovou terapiou
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka metódy liečenia ludských nádorov génovou terapiou. Menovite sa týka defektných rekombinantných vírusov, nesúcich sekvencie kódujúce špecifický antigén ľudských nádorov rovnako aj na vytvorenie špecifických CTL in vitro alebo ex vivo. Tiež sa týka farmaceutických kompozícií týchto vírusov, konkrétne v injikovatelnej forme.
Doterajší stav techniky
Génová terapia spočíva v oprave zníženia schopnosti alebo anomálie vložením genetickej informácie do bunky alebo do postihnutého orgánu. Táto informácia sa môže vložiť buď in vitro do bunkového extraktu orgánu a potom reinjikovať do organizmu alebo in vivo priamo do postihnutého tkaniva. Čo sa týka molekúl s vysokou molekulovou hmotnosťou a s negatívnym nábojom, DNA prechádza spontánne, ale ťažko, cez fosfolipidovú bunkovú membránu. Na prenos génu sa teda používajú rôzne vektory: používajú sa jednak vírusové vektory, jednak chemické alebo biochemické vektory, prírodné alebo syntetické. Chemické alebo biochemické vektory sú napríklad katióny (fosforečnan vápenatý, DEAE-dextrán, ...), ktoré vytvárajú s DNA zrazeninu, ktorú bunky môžu fagocytovať. Môže ísť tiež o lipozómy, do ktorých sa DNA zahrnie, ktoré prechádzajú cez plazmatickú membránu fúziou. Syntetické vektory na prenos génov sú všeobecne lipidy alebo katiónové polyméry, ktoré tvoria komplex s DNA a tvoria s ňou častice s pozitívnym nábojom na povrchu. Tieto častice sú schopné interagovať s negatívnym nábojom bunkovej membrány a potom sú schopné prejsť bunkovú membránu. Ako príklad vektora sa môžu uviesť dioktadecylaminoglycylspermín (DOGS, Transfectam™) alebo N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-Ν,Ν,Ν-trimetylamónium chlorid (DOTMA, Lipofectin™) . Vyvinuli sa tiež chimérne proteíny: sú tvorené polykatiónovou časťou, ktorá kondenzuje DNA viazanú na ligand, ktorý sa fixuje na membránovom receptore a vnáša komplex endocytózou do buniek. Teoreticky sa dá zamerať na tkanivo alebo určitú populáciu buniek na zvýšenie biodisponibility prenášaného génu in vivo (pozri Behr, 1993; Cotten a Wagner, 1993) . Ako vektory sa môžu uviesť konkrétne retrovírusy (RSV, HMS, MMS, atď.), vírus HSV, adeno-asociované vírusy a adenovírusy ako potenciálne použiteľné vírusy. Tieto vírusy sa použili na infikovanie rôznych typov buniek.
Vyvinuli sa postupy génovej terapie na liečenie rôznych typov patológií, vrátane porúch nervového systému, kardiovaskulárnych chorôb alebo rakoviny. Čo sa týka konkrétne oblasti rakoviny, vo vedlajších odboroch sa navrhli rôzne prístupy. Štúdia opisuje použitie lymfocytov kultiváciou ex vivo v prítomnosti 2-iriterleukínu alebo transfekciou s génom 2interleukínu. Prijaté imunoterapeutické štúdie boli takisto založené na purifikovaných makrofágových monocytoch, ktoré sa ex vivo aktivovali s interferónom, aby sa zvýšila ich tumorocídna schopnosť, a potom sa reinjikovali pacientovi (Anderssen a kol., Cancer Res. 50 (1990) 7450). Opísala sa tiež možnosť použitia geneticky modifikovaných makrofágov (WO95/06120). Ďalšia séria prístupov je založená na prenose toxických génov schopných, priamo alebo nepriamo, spôsobiť smrť rakovinových buniek. Tento typ prístupu sa opísal napríklad pre gén tymidínkinázy prenesenej buď in vivo adenovírusovým vektorom (PCT/FR94/01284, PCT/FR94/01285) alebo štepením buniek produkujúcich retrovírusový vektor (Caruso a kol., PNAS 90 (1993) 7024. Ďalší použitý gén je napríklad gén cytozíndeaminázy.
Podstata vynálezu
Predložený vynález sa týka novej metódy liečenia rakoviny. Táto metóda je zameraná na liečenie ľudských nádorov, predovšetkým melanómov. Metóda podľa vynálezu je založená na prenose a in vivo expresii špecifických antigénov ľudských nádorov, ako sú melanómy, schopných vyvolať (i) imunitnú ochranu proti vzniku tohto typu rakoviny a (ii) šírenie populácie špecifických cytotoxických T buniek (CTL) predstavujúcich tieto antigény a tiež deštrukciu zodpovedajúcich nádorových buniek imunitným systémom.
Imunitný systém má, okrem iných funkcií, schopnosť zaistiť ochranu proti vírusovým infekciám. Táto schopnosť je zaistená cytotoxickými T lymfocytmi (CTL). CTL majú dve výrazné charakteristiky: sú vysoko špecifické a vysoko účinné. Ničia infikované bunky po detekcii vírusového antigénu na ich povrchu. Antigén, o ktorý ide, sa prejavuje vo forme peptidu spojeného s molekulou histokompatibilného systému triedy I (CMH-I). V oblasti tumorov sa pozorovalo, najskôr na myšiach, že malígne bunky tvoria komplexy peptidových molekúl CMH-I schopných vyvolať v rámci antivírusovej odpovede imunitnú odpoveď riadenú CTL. Tieto peptidy pochádzajú konkrétne z proteínov kódovaných mutovanými génmi alebo selektívne aktivovanými génmi v nádorových bunkách. Tieto proteíny sú označené špecifickými antigénmi nádorov. Na ľudských nádoroch sa charakterizovali rôzne antigény rozpoznávané s CTL.
Predložený vynález sa týka novej metódy liečenia ľudských nádorov. Vyplýva konkrétne zo spresnenia vektorov vírusového pôvodu schopných preniesť a exprimovať in vivo špecifické antigény ľudských nádorov alebo melanómov. Je založený konkrétne na myšacích modeloch, ktoré ukazujú, že defektné rekombinantné adenovírusy sú schopné vyvolať imunizáciu proti tomuto typu antigénov umožňujúcich získať in vivo lymfocytovú odpoveď proti týmto antigénom, konkrétne nádorovým bunkám, ktoré ich nesú. Táto metóda podlá vynálezu umožňuje teda prenosom týchto génov účinným spôsobom pôsobiť na vývoj ľudských nádorov tým, že sa zastaví ich vývoj a že môžu sa odstrániť.
Prvý predmet vynálezu teda spočíva v rekombinantnom defektnom adenovíruse obsahujúcom vo svojom genóme nukleovú kyselinu kódujúcu proteín alebo špecifický peptid nádoru, konkrétne celok alebo časť špecifického antigénu alebo melanómu.
Ide konkrétne o antigén ľudského melanómu. Ide konkrétne o fragment špecifického antigénu ľudského melanómu, ktorý zodpovedá časti vyjadrenej CTL v spojení s molekulami CMH-I. Špecifické antigény ľudských nádorov už boli opísané (Thierry Boon a kol., US5,342,774; US5,405,940; WO92/20356; WO94/23031;
WO94/21126). Tieto antigény sú označené výrazom MAGE, konkrétne MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, MAGE-7, MAGE-8, MAGE-9, MAGE-10, MAGE-11, MAGE-12. Ako reprezentatívny príklad myšacích homologických génov sa môžu uviesť gény S-MAGE-1 a SMAGE-2. Čo sa týka menovite génov BAGE, GAGE a RAGE, sú to zástupcovia inej podobnej rodiny génov.
Podľa uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia vynálezu, predložený vynález sa dotýka defektného rekombinantného adenovírusu, ktorý obsahuje v svojom genóme vloženú nukleovú kyselinu kódujúcu proteín alebo peptid odvodený z proteínu vybraného z proteínov Mage-1, Mage-3, Bage, Gage a Rage. Tieto antigény sú vlastne naj selektívnejšie v tom zmysle, že neboli detegované na žiadnej nenádorovej somatickej bunke. Opísala sa sekvencia antigénu mage-1 a zodpovedajúceho génu (Van der Bruggen a kol., Science 254 (1991) 1644). Tiež sa opísala cDNA sekvencia, ktorá kóduje Mage-1 a Mage-3 (napríklad Gaugler a kol., J. Exp. Med. 179 (1994) 921).
Ako sa už naznačilo, uprednostňovaný spôsob uskutočnenia vynálezu je reprezentovaný defektným rekombinantným adenovírusom, ktorý obsahuje v svojom genóme zahrnutú nukleovú kyselinu kódujúcu peptid proteinu Mage-1, Mage-3, Bage alebo Gage obsahujúce časť vyjadrenú CTL v spojení s molekulami CMH-I. Gény Mage, Bage a Gage kódujú značné veľké proteiny. Tieto proteiny sú degradované enzýmovým štiepením v bunke, ktoré peptidy degeneruje. Sú to peptidy, ktoré sú umiestnené na povrchu buniek a ktoré sú rozpoznané CTL v spojení s molekulami CMH-I (pozri obrázok 2). Vynález sa týka konkrétne rekombinantných adenovírusov, ktoré obsahujú nukleovú kyselinu kódujúcu peptid proteinu Mage-1, Mage-3, Bage alebo Gage obsahujúci časť vyjadrenú CTL.
Podľa špecifického spôsobu uskutočnenia vynálezu, predložený vynález sa týka rekombinantných adenovírusov obsahujúcich vo svojom genóme sekvenciu SEQ ID NO: 1. Táto sekvencia obsahuje sekvenciu kódujúcu nonapeptid (27 bp) Mage-1, z ktorej sa exprimuje molekula HLA.A1 cytotoxických T lymfocytov. Ide o sekvenciu, ktorá je medzi zvyškami 55 až 82 sekvencie SEQ ID NO: 1.
Podľa iného špecifického spôsobu uskutočnenia vynálezu sa predložený vynález týka rekombinantných adenovírusov obsahujúcich vo svojom genóme zahrnutú sekvenciu SEQ ID NO: 2. Táto sekvencia obsahuje sekvenciu kódujúcu nonapeptid (27 bp) Mage-3, z ktorej sa exprimuje molekula HLA.A1 cytotoxických T lymfocytov.
Podlá iného spôsobu uskutočnenia vynálezu, predložený vynález sa týka rekombinantných adenovírusov obsahujúcich vo svojom genóme zahrnutú nukleovú kyselinu, ktorá, kóduje antigénny peptid génu P1A mastocytómu p815 myší DBA/2 (SEQ ID NO: 3) .
Ako sa už naznačilo, adenovírusy podía vynálezu umožňujú prenos a účinnú expresiu týchto antigénnych peptidov in vivo. Umožňujú tiež výrazne stimulovať in vivo vznik špecifických cytotoxických T lymfocytov týchto antigénov, ktorý selektívne ničí každú bunku, ktorá má na svojom povrchu tento antigén.
Vírusy podía vynálezu sú teda použiteľné na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na liečenie rakoviny, ktorej bunky majú antigén Mage na svojom povrchu. Na prípravu takýchto kompozícií, nádorové bunky pacienta (menovite melanómy) sa predtým odobrali a analyzovali na (i) určenie expresie génu Mage napríklad pomocou RT-PCR a (ii) prípadne typizovanie tohto antigénu Mage. Skonštruoval sa adenovírus, ktorý obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu celok alebo časť zodpovedajúceho antigénu, a použil sa na podanie pacientovi.
Vírusy sa podía vynálezu môžu použiť tiež in vitro (alebo ex vivo) na vytvorenie populácie špecifických cytotoxických T buniek určitého nádorového antigénu. Preto je populácia buniek infikovaná vírusom podía vynálezu, potom sa kontaktuje s prekurzorom CTL buniek. Špecifické bunky antigénu sa môžu teda selektovať in vitro, amplifikovať, potom použiť napríklad ako liečivo na špecifickú deštrukciu zodpovedajúcich nádorov. Bunková populácia infikovaná vírusom podía vynálezu výhodne obsahuje bunky, ktoré obsahujú antigény (APC). Môže ísť konkrétne o makrofágy (W095/06120) alebo B bunky.
V adenovírusoch podía vynálezu môže byť vložená nukleová kyselina fragment komplementárnej DNA (cDNA), genómová DNA (gDNA) alebo hybridná konštrukcia zložená napríklad z cDNA, do ktorej je vložený jeden alebo viac intrónov. Môže ísť tiež o syntetické alebo semisyntetické sekvencie. Ako sa už naznačilo, ide o nukleovú kyselinu, ktorá kóduje celý proteín alebo peptid, odvodený z proteinu, vybraný z Mage-1, Mage-3, Bage a Gage. V zmysle predloženého vynálezu, expresia peptidu odvodzujúceho tento proteín naznačuje, že nukleová kyselina kóduje fragment proteínu, a že tento fragment môže byť vhodný na vytvorenie CTL. Fragment podlá vynálezu teda minimálne nesie antigénny determinant rozpoznaný špecifickou CTL. Tieto fragmenty sa môžu získať známymi technikami všetkými . odborníkmi, konkrétne genetickou modifikáciou alebo chemickou modifikáciou alebo enzýmovou modifikáciou alebo tiež klonovaním expresiou, umožňujúcou selekciu variantov v závislosti na ich biologickej aktivite. Genetické modifikácie zahrňujú supresiu, deléciu, mutáciu, atď..
Vložená nukleová kyselina je predovšetkým cDNA alebo gDNA.
Vložená nukleová kyselina obsahuje tiež sekvencie umožňujúce expresiu antigénu alebo fragmentu antigénu v infikovaných bunkách. Môže ísť o sekvencie, ktoré sú prirodzene zodpovedné za expresiu uvedeného antigénu, keď tieto sekvencie sú schopné fungovať v infikovanej bunke. Môže ísť tiež o sekvencie iného pôvodu, označené ako heterologické sekvencie (zodpovedné za expresiu iných proteínov alebo rovnakých syntetických). Môže ísť konkrétne o promótory eukaryotických alebo vírusových génov alebo z odvodených sekvencií stimulujúcich alebo potláčajúcich transkripciu génu špecificky alebo nešpecifický, induktívne alebo neinduktívne. Napríklad môže ísť o sekvencie promótorov pochádzajúcich z genómu bunky, ktorú je žiaduce infikovať, alebo z genómu vírusu a menovite môže ísť o promótory génov E1A, MLP adenovírusov, promótor CMV, LTR-RSV, SRa, atd. Z eukaryotických promótorov sa môžu uviesť ubikvitínové promótory (HPRT, vimentín, α-laktín, tubulín, atď.), promótory stredných filamentov (dezmín, neurovlákna, keratín, GFAP, atd’.), promótory terapeutických génov (typ MDR, CFTR, faktor VIII, atd.), špecifické tkanivové promótory (pyruvátkináza, vilín, promótor črevného proteínu viazania mastných kyselín, promótor aktínu a buniek hladkého svalstva, špecifické promótory z pečene, Apo Al, Apo AII, ľudský albumín, atď.) alebo tiež promótory odpovedajúce na stimuly (receptory steroidných hormónov, receptor kyseliny retinovej, atď.). Tieto sekvencie sa môžu, okrem iného, modifikovať adíciou aktivačných sekvencií, regulačných sekvencií, atď. Keď vložená nukleová kyselina neobsahuje sekvencie expresie, môže sa vložiť do defektného vírusu v smere tejto sekvencie.
Vírusy podľa vynálezu sú defektné a teda nie sú schopné autonómne sa replikovať v cieľovej bunke. Genóm defektných vírusov použitých v rámci predloženého vynálezu má teda minimálne odstránenú sekvenciu nevyhnutnú pre replikáciu uvedeného vírusu v infikovanej bunke. Tieto oblasti sa môžu buď deletovať (úplne alebo čiastočne) alebo znefunkčniť substitúciou s inými sekvenciami, konkrétne s vloženým génom. Defektný vírus má však zachované sekvencie genómu, ktoré sú nevyhnutné na enkapsidáciu vírusových častíc.
Vírusy podľa vynálezu sa môžu získať z rôznych adenovírusových sérotypov. Existujú rôzne adenovírusové sérotypy, ktorých štruktúra a vlastnosti sa trochu líšia. Z týchto sérotypov sa prednostne používa v rámci predloženého vynálezu ludský adenovírus typ 2 alebo 5 (Ad2 alebo Ad5) alebo adenovírus zvieracieho pôvodu (pozri prihláška WO94/26914). Z adenovírusov zvieracieho pôvodu, použiteľných v rámci predloženého vynálezu, sa môžu uviesť adenovírusy psieho, hovädzieho, myšacieho (napr. Mavl, Beard a kol., Virology 75 (1990) 81), ovčieho, prasacieho, vtáčieho alebo tiež opičieho pôvodu (napríklad SAV). Adenovírus zvieracieho pôvodu je prednostne psí adenovírus, prednostne adenovírus CAV2 (souche manhattan alebo A26/61 (ATCC VR-800)). V rámci predloženého vynálezu sa prednostne používa adenovírus ľudského alebo psieho pôvodu alebo ich zmes.
Defektný adenovírus podlá vynálezu obsahuje ITR, sekvenciu, ktorá umožňuje enkapsidáciu a predmetnú nukleovú kyselinu. V genóme adenovírusu podlá vynálezu je nefunkčná minimálne oblasť El. Žiadaný vírusový gén môže známymi technikami znefunkčniť každý odborník, konkrétne čiastočnou deléciou alebo adíciou jednej alebo viacerých báz v žiadanom géne alebo žiadaných génoch. Tieto modifikácie sa môžu získať in vitro (z izolovanej DNA) alebo in situ, napríklad pomocou techník génovej terapie alebo tiež pôsobením mutagénnych činidiel. Môžu sa tiež modifikovať iné oblasti, konkrétne oblasť E3 (W095/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697) . Podlá uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia vynálezu, adenovírus obsahuje deléciu v oblastiach El a E4. Podľa iného uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia vynálezu, adenovírus obsahuje deléciu v oblasti El na úrovni, v ktorej sú vložené oblasť E4 a nukleová kyselina (pozri FR94 13355). Delécia v oblasti El zasahuje výhodne nukleotidy 454 až 3328 (PvuII-BglII fragment) alebo 382 až 3446 (HinfII-Sau3A fragment). Delécia v oblasti E4 výhodne zasahuje minimálne čítacie rámce 0RF3 a ORF6.
Nukleová kyselina záujmu sa môže vložiť do rôznych oblastí genómu adenovírusu. Genóm adenovírusu je zložený z lineárnej dvojvláknovej DNA s veľkosťou 36 kb. Obsahuje sekvencie obrátených repetícií (ITR) na oboch koncoch, sekvenciu enkapsidácie (Psi), skoré gény a neskoré gény (pozri obrázok 1). Esenciálne skoré gény sa nachádzajú v oblastiach El, E2, E3 a E4. Z nich gény nachádzajúce sa v oblasti El sú nevyhnutné na propagáciu vírusu. Hlavné neskoré gény sa nachádzajú v oblastiach L1 až L5. Genóm adenovírusu Ad5 sa úplne sekvenoval a je dostupný v banke dát (pozri konkrétne Genebank M73260). Takisto sa sekvenovali časti genómov a dokonca celý genóm adenovírusov Ad2, Ad7, Adl2, atď. Nukleový kyselina záujmu sa prednostne vložila do neesenciálnej oblasti, aby sa produkovali defektné rekombinantné vírusy. Prednostne sa vložila do oblasti El, ktorá je v defektnom víruse a doplnila sa produkovanou líniou v oblasti E3, ktorá ' nie je esenciálna na produkciu rekombinantných vírusov (jej inaktivácia sa nemusí transkomplementovatj alebo tiež v oblasti E4. V tomto poslednom prípade je nevyhnutné doplniť funkciu E4 počas produkcie buď spoločnou transfekciou s plazmidom alebo pomocným vírusom alebo pomocou prijateľnej línie. Je jasné, že sa môžu použiť aj iné miesta. Prístup k nukleovej kyseline umožňuje odborníkovi identifikovať oblasti umožňujúce vložiť nukleovú kyselinu záujmu.
Defektné rekombinantné vírusy podlá vynálezu sa môžu pripraviť známymi technikami každým odborníkom (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195, EO 185 573, Graham, EMBO J.. 3 (1984) 2917). Adenovírusy sú produkované transfekciou DNA rekombinantného vírusu v zodpovedajúcej bunkovej enkapsidačnej línii. Môže ísť tiež o jednoduchú transfekciu, keď sa môže pripraviť konštrukcia nesúca spoločne genóm rekombinantného adenovírusu, alebo, ako je to najčastejšie, spoločnou transfekciou viacerých DNA fragmentov nesúcich rôzne časti rekombinantného vírusového genómu. V tom prípade proces zahŕňa jednu alebo viac etáp všeobecnej rekombinácie medzi rôznymi konštrukciami v bunkovej enkapsidačnej línii na vytvorenie DNA rekombinantného vírusu. Rôznymi spôsobmi sa môžu pripraviť rôzne fragmenty použité na produkciu vírusu. Najvšeobecnejšie používaná technika spočíva v izolácii vírusovej DNA a potom in vitro modifikácii klasickými metódami molekulárnej biológie (štiepenie, ligácia, atď.). Získané konštrukcie sa potom purifikujú a použijú na transfekciu plazmidu nesúceho časť genómu rekombinantného vírusu, ktorý sa spoločne transfekuje s vírusom nesúcim chýbajúcu časť genómu. Iné možnosti spočívajú v použití prokaryotických plazmidov na prípravu vírusových DNA použiteľných na transfekciu (pozri Bett a kol., PNAS 91 (1994) 8802, FR95 01632).
Použitá bunková línia sa musí prednostne (i) transformovať uvedenými elementmi a (ii) musí obsahovať sekvencie schopné doplniť časť genómu defektného adenovírusu prednostne v integrovanej forme aby sa predišlo nebezpečenstvu rekombinácie. Ako príklad takejto línie sa môže uviesť obličková línia ľudského embrya 293 (Graham a kol.z J . Gen.· Virol. 36 (1977) 59), ktorá obsahuje začlenenú v svojom genóme lavú časť genómu adenovírusu Ad5 (12%) alebo línia schopná doplniť funkcie E1 a E4 tak, ako je to opísané konkrétne v prihláškach vynálezov WO94/26914 a WO95/02697.
Adenovírusy sa získali namnožením a purifikovali sa podlá klasických techník molekulárnej biológie, ako je uvedené v príkladoch.
Predložený vynález sa týka tiež každej farmaceutickej kompozície obsahujúcej jeden alebo viac defektných rekombinantných adenovírusov tak ako je opísané. Farmaceutické kompozície podlá vynálezu sa môžu formulovať z pohľadu podávania, a to orálne, parenterálne, intranazálne, intravenózne, intramuskulárne, podkožné, transdermikálne ... .
Predložený vynález sa, tak ako sa opísalo, dotýka každej farmaceutickej kompozície obsahujúcej bunky infikované defektným rekombinantným adenovírusom. Kompozícia podľa vynálezu výhodne obsahuje bunky poskytujúce antigén (APC) infikované defektným adenovírusom tak, ako sa už opísalo. Ako príklad sa môžu uviesť makrofágy alebo B lymfocyty. Vynález sa tiež dotýka kompozície obsahujúcej cytotoxické T bunky (CTL) špecifické k nádorovému antigénu, pripravené kultiváciou bunkových prekurzorov v prítomnosti buniek poskytujúcich antigény (APC) infikované efektnými adenovírusmi tak, ako sa opísalo.
Farmaceutická kompozícia podľa vynálezu obsahuje vhodný farmaceutický nosič pre injikovateľnú formu. Môže ísť konkrétne o roztoky solí (dihydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý alebo horečnatý, atď., alebo zmes týchto solí), sterilné, izotonické, alebo suché kompozície lyofilizované, ktoré, podľa prípadu, po pridaní sterilizovanej vody alebo fyziologického roztoku vytvárajú injikovateľnú formu kompozície.
Dávka vírusu použitá na injekciu sa môže prispôsobiť rôznym parametrom, konkrétne použitému spôsobu podávania, patológii, génu určenému na expresiu alebo tiež dĺžke liečenia. Rekombinantné vírusy podľa vynálezu sú všeobecne formulované a podávané vo forme dávok, ktorá obsahuje 104 až 1014 pfu, prednostne 106 až 1014 pfu. Termín pfu (plaque forming units) zodpovedá infekčnej schopnosti vírusového roztoku, ktorá je určená infekciou určitej bunkovej kultúry a následným meraním počtu plakov infikovaných buniek po 15 dňoch. Techniky určenia veľkosti pfu vírusového roztoku sú v odbornej literatúre dobre opísané.
Adenovírusy podľa vynálezu sa môžu použiť na liečenie alebo prevenciu rakoviny, predovšetkým ľudských nádorov (pre antigény Mage-1 až Mage-12, Gage, Bage a Rage) a sarkómov (pre antigény Mage-1).
Nasledujúce obrázky a príklady bližšie opisujú vynález, pritom však v akomkoľvek smere neobmedzujú jeho rozsah.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1: Genetické usporiadanie adenovírusu Ad5
Obrázok 2: Expresia a opracovanie antigénov mage
Obrázok 3: | Konštrukcia plazmidov pAd.SRa-MAGE | |||
Obrázok 4: | Protokol č.l imunizácie myši | DBA/2 | a ad-PlA | alebo |
kontrola | ||||
Obrázok 5: | Protokol č.2 imunizácie myši | DBA/2 | a ad-PlA | alebo |
kontrola |
Príklady uskutočnenia vynálezu
Všeobecné techniky klonovania, molekulárnej biológie
Klasické metódy molekulárnej biológie, ako sú napríklad centrifugácia plazmidovej DNA v gradiente chloridu cézneho s etídiumbromidom, štiepenie s reštrikčnými enzýmami, gélová elektroforéza, transformácia E. coli, zrážanie nukleových kyselín, atď., sú opísané v odbornej literatúre (Maniatis a kol., 1989).
Enzýmy dodala firma New England Biolabs (Beverly, MA).
Na ligáciu sa DNA fragmenty rozdelili na základe veľkosti v 0,8% - 1,5% agarózových géloch, purifikovali sa s GeneClean (BIO101, LaJolla, CA) a inkubovali sa cez noc pri teplote 14 °C v pufri 50mM Tris-HCl pH 7,4, lOmM MgCl2, lOmM DTT, 2mM ATP v prítomnosti DNA ligázy fága T4.
Uskutočnila sa tiež amplifikácia s PCR (Polymerase Chain Reaction) podľa Maniatis a kol. 1989 s nasledovnými úpravami:
- koncentrácia MgCl2 8 mM
- teplota denaturácie 95 °C, teplota hybridizácie 55 ’C, teplota elongácie 72 eC, tento cyklus sa 25x opakoval v PE9600 Thermocycler (Perkin Elmer, Norwalk, CO)
Oligonukleotidy, chránené β-kyanoetylovou skupinou, sa syntetizovali s použitím fosforamidovej chémie (Sinha a kol., 1984, Giles 1985) automatickým DNA syntetizátorom firmy Applied Biosystems model 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA) podlá odporúčania dodávateľa.
Sekvenovanie sa uskutočnilo na dvojvláknovej matrici metódou terminácie reťazca s použitím fluorescenčných nástrojov. Použila sa sekvenačná súprava Taq Dye Primer Kit od firmy Applied Biosystem (Applied Biosystems, Foster City, CA) podlá odporúčania výrobcu.
Príklad 1: Konštrukcia defektného rekombinantného adenovírusu, ktorý kóduje fragment antigénu P1A
Tento príklad opisuje konštrukciu defektného rekombinantného adenovírusu podlá vynálezu, ktorý kóduje fragment antigénu P1A. Adenovírus nesie sekvenciu SEQ ID NO: 3. Skonštruovaný adenovírus je adenovírus sérotypu 5, ktorý má deléciu v oblastiach E1 a E3 a nukleovú kyselinu záujmu vloženú do oblasti E1 v mieste delécie.
Nukleová kyselina vložená do oblasti E1 obsahuje konkrétne:
- promótor SRa, promótor SRa obsahuje skorý začiatok replikácie SV40 a časť LTR HTLV1 (zodpovedajúcu oblasti R a časti U5) , nasleduje spojenie 16S SV40 (Takebe a kol., Mol. Celí. Biol. 8 (1988) 466)
- minigén P1A 44 bp (SEQ ID NO: 3)
- polyadenylačné miesto vírusu SV40
Táto nukleová kyselina sa extrahovala z plazmidu pcD-SRaP1A, zodpovedajúceho plazmidu pcD-SRa, v ktorom sa minigén klonoval do miesta EcoRI. Získaný inzert sa následne klonoval v plazmide pAd.RSV-pGal (Strátford-Perricaudet a kol., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) namiesto fragmentu obsahujúceho LTR RSV a gén lacZ.
Takto získaný plazmid pAd-SRa-PlA sa potom použil na tvorbu rekombinantného adenovírusu. Preto sa bunky línie 293 spoločne transfekovali s 5 gg pAd-SRa-PlA a 5 gg DNA adeno vírusového mutanta dl 324 v prítomnosti fosforečnanu vápenatého. Vytvorené rekombinantné adenovírusy sa selektovali purifikáciou z plakov. Po izolácii sa rekombinantný adenovírus amplifikoval v bunkovej línii 293 čím sa získal kultivačný supernatant, ktorý obsahuje nepurifikovaný rekombinantný adenovírus , ktorý má asi 101θ pfu/ml.
Vírusové častice sa potom purifikovali centrifugáciou v gradiente chloridu cézneho podía známych techník (pozri konkrétne Graham a kol., Virology 52 (1973) 456) . Analýza vírusovej DNA štiepením s reštrikčným enzýmom ' EcoRI dokázala prítomnosť inzertu v genóme. Adenovírusy sa môžu uchovávať pri 80 ’C v 10% glycerole.
Príklad 2: Konštrukcia defektného rekombinantného adenovírusu, ktorý kóduje fragment antigénu Mage-1
Tento príklad opisuje konštrukciu defektného rekombinantného adenovírusu podía vynálezu, ktorý kóduje fragment antigénu Mage-1. Adenovírus nesie sekvenciu SEQ ID NO: 1, ktorá kóduje fragment nesúci antigénový nonapeptid Mage-1. Konštruovaný adenovírus je adenovírus sérotypu 5, ktorý má deléciu v oblastiach E1 a E3 a nukleovú kyselinu záujmu vloženú do oblasti E1 v mieste delécie.
Nukleová kyselina vložená v oblasti E1 obsahuje konkrétne:
- promótor SRa, promótor SRa obsahuje skorý začiatok replikácie SV40 a časť LTR HTLV1 (zodpovedajúcu oblasti R a časti U5) , nasleduje spojenie 16S SV40 (Takebe a kol., Mol. Celí. Biol. 8 (1988) 466)
- minigén MAGE-1 116 bp (SEQ ID NO: 1), tento fragment sa získal pomocou PCR z úplného génu Mage-1 a obsahuje ATG v polohe 15, terminačný kodón v polohe 121 a časť exónu 3 génu Mage-1, obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu nonapeptidu (27 bp), ktorý je vyjadrený molekulou HLA.A1 cytotoxických T lymfocytov (obrázok 2)
- polyadenylačné miesto vírusu SV40
Táto nukleová kyselina sa extrahovala z plazmidu pcD-SRaMage-1, zodpovedajúceho plazmidu pcD-SRa, v ktorom sa minigén Mage-1 klonoval do miesta EcoRI. Získaný inzert sa potom klonoval v plazmide pAd.RSV-pGal (Stratford-Perricaudet a kol., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) namiesto fragmentu obsahujúceho LTR RSV a gén lacZ (obrázok 3).
Takto získaný plazmid pAd-SRa-MAGE-1 sa , potom použil na tvorbu rekombinantného adenovírusu. Preto sa bunky línie 293 spoločne transfekovali s plazmidom pAd-SRa-MAGE-1 a DNA mutantného adenovírusu dl 324 v prítomnosti fosforečnanu vápenatého. Vytvorené rekombinantné adenovírusy sa selektovali purifikáciou z plakov. Po izolácii sa rekombinantný adenovírus amplifikoval v bunkovej línii 293 čím sa získal supernatant, ktorý obsahuje nepurifikovaný rekombinantný adenovírus, ktorý má asi 1O10 pfu/ml.
Vírusové častice sa potom purifikovali centrifugáciou v gradiente chloridu cézneho podlá známych techník (pozri konkrétne Graham a kol., Virology 52 (1973) 456). Analýza vírusovej DNA štiepením s reštrikčným enzýmom EcoRI dokázala prítomnosť inzertu v genóme. Adenovírusy sa môžu uchovávať pri 80 ’C v 10% glycerole.
Príklad 3: Konštrukcia defektného rekombinantného adenovírusu, ktorý kóduje fragment antigénu Mage-3
Tento príklad opisuje konštrukciu defektného rekombinantného adenovírusu podlá vynálezu, ktorý kóduje fragment antigénu Mage-3. Adenovírus nesie sekvenciu SEQ ID NO: 2, ktorá kóduje fragment nesúci antigénový nonapeptid Mage-3. Skonštruovaný adenovírus je adenovírus sérotypu 5, ktorý má deléciu v oblastiach E1 a E3, nukleovú kyselinu záujmu, ktorá je vložená v oblasti E1 v mieste delécie.
Nukleová kyselina vložená v oblasti E1 obsahuje konkrétne:
- promótor SRa, promótor SRa obsahuje skorý začiatok replikácie SV40 a časť LTR HTLV1 (zodpovedajúcu oblasti R a časti U5), nasleduje spojenie 16S SV40 (Takebe a kol., Mol. Celí. Biol. 8 (1988) 466)
- minigén MAGE-3 44 bp (SEQ ID NO: 2), tento fragment sa získal pomocou PCR z úplného génu Mage-3 a obsahuje ATG v polohe 12, terminačný kodón v polohe 44 a sekvenciu zodpovedajúcu nonapeptidu (27 bp), ktorý je vyjadrený molekulou HLA.A1 cytotoxických T lymfocytov (obrázok 2)
- polyadenylačné miesto vírusu SV40
Táto nukleová kyselina sa extrahovala z plazmidu pcD-SRaMage-3, zodpovedajúceho plazmidu pcD-SRa, v ktorom sa minigén
Mage-2 klonoval do miesta EcoRI. Získaný inzert sa potom klonoval v plazmide pAd.RSV-pGal namiesto fragmentu obsahujúceho LTR RSV a gén LacZ (obrázok 3).
Takto získaný plazmid pAd-SRa-Mage-3 sa potom použil na tvorbu rekombinantného adenovírusu. Preto sa bunky línie 293 spoločne transfekovali s plazmidom pAd-SRa-Mage-3 s DNA mutantného adenovírusu dl 324 v prítomnosti fosforečnanu vápenatého. Vytvorené rekombinantné adenovírusy sa selektovali purifikáciou z plakov. Po izolácii rekombinantného adenovírusu sa amplifikoval v bunkovej línii 293 čím sa získal kultivačný supernatant, ktorý obsahuje nepurifikovaný rekombinantný adenovírus, ktorý má okolo 1O10 pfu/ml.
Vírusové častice sa potom purifikovali centrifugáciou v gradiente chloridu cézneho podlá známych techník (pozri konkrétne Graham a kol., Virology 52 (1973) 456). Analýza vírusovej DNA štiepením s reštrikčným enzýmom EcoRI dokázala prítomnosť inzertu v genóme. Adenovírusy sa môžu uchovávať pri -80 °C v 10% glycerole.
Príklad 4: Funkčná charakteristika adenovírusov podlá vynálezu
Tento príklad ukazuje, že vírusy podľa vynálezu sú schopné indukovať expresiu génu záujmu kódujúceho proteín, ktorého degradácia vedie ku expresiu antigénneho peptidu na povrchu cieľovej bunky.
Expresia minigénu MAGE-1 a prítomnosť peptidu sa dokázali v bunkách Ad-Mage (4.1.) určením špecifickej lýzy (4.2.) a stimulácie produkcie TNF (4.3).
4.1. Bunková línia
Bunkové línie sa identifikovali nasledovným spôsobom:
- C1R.A1: línia B lymfocytov transformovaná s EBV (Storkus, W. J., Howell, D. N., Salter, R. D., Dawson, J. R., Creswell, P.: NK susceptibility varies inversely with target celí class I HLA antigéne expression. J. Immunol. 138: 1675-1659, 1987) a transfekovaná s génom HLA.A1 klonovaným v plazmide pHEBO
Gerl III β EF“: Bunky ľudského melanómu HLA.Al imunoselektované na stratu antigénu MAGE-1 (označené Gerlach E- v tabuľkách 1 a 2)
Tieto dve línie teda exprimujú molekulu HLA.Al, ale neexprimujú antigén MAGE-1.
4.2. Určenie špecifickej lýzy
Tento príklad ukazuje existenciu špecifickej lýzy buniek špecifickým klonom CTL antigénu (test uvoľňovania rádioaktívneho chrómu). Preto sa bunky, uvedené v 4.1., infikovali adenovírusom Ad-Mage-1 (príklad 2) alebo s kontrolným adenovírusom (Ad-pGal) pri niekoľkonásobnej infekcii pfu/bunku. Infikované bunky sa označili chrómom 51, inkubovali sa 4 hodiny v pomere 1000 buniek/jamka so špecifickým CTL (kloň 82:30) v rôznych pomeroch účinné bunky/cieľové bunky (E/T). Stanovilo sa percento lýzy. Získané výsledky sú uvedené v Tabuľke 1. Jasne ukazujú, že bunky infikované vírusom podľa vynálezu vyjadrujú citlivosť vzhľadom na bunky priamo transfekovaným antigénom Mage-1, tým ukazuje terapeutickú účinnosť vektorov vynálezu.
Tieto výsledky jasne ukazujú, že vírusy podľa vynálezu sú schopné dodať bunkám veľkú citlivosť k lýze špecifickým CTL.
4.3. Stimulácia produkcie TNF
V tomto prípade sa určila schopnosť buniek Gerl III β E“F” stimulovať produkciu TNF rovnakým klonom CTL. Preto sa bunky Gerl III β E'F infikovali s adenovírusom Ad-Mage-1 (príklad 2) alebo s kontrolným adenovírusom (Αά-βσβΐ) pri niekoľkonásobnej infekcii 50 až 100 pfu/bunku a potom sa inkubovali s klonom CTL. Po 24 hodinách sa meralo množstvo TNF prítomné v supernatante stanovením ich cytotoxicity na línii citlivej ku TNF (línia WEHI-164-13) . Životaschopnosť buniek sa merala kolorimetrickým testom (MTT). Výsledky sú vyjadrené v optickej denzite v množstve TNF (pg/ml). Tento test sa neuskutočňoval na bunkách C1R.A1, pretože prirodzene vylučujú TNF. Kontrolné bunky Gerlach E+ sú melanómové bunky melanómu exprimujúce Mage-1 a HLA.A1.
Tieto získané výsledky sú uvedené v tabulke 2. Jasne ukazujú, že bunky infikované vírusom podlá vynálezu indukujú produkciu TNF CTL a to jasne potvrdzuje biologické a terapeutické vlastnosti vírusov podlá vynálezu.
Príklad 5: Aktivita in vivo vírusov P1A vynálezu
Príklad 4 ukázal, že in vitro alebo ex vivo, bunky infikované adenovírusom podľa vynálezu sú dobre rozpoznané v teste TNF a lyzované v teste uvoľňovania rádioaktívneho chrómu špecifickou CTL.
Tento príklad ukazujem že in vivo sú adenovírusy podlá vynálezu schopné vytvoriť špecifickú odpoveď CTL. Tento príklad ukazuje, že dve injekcie 109 vírusových častíc (pfu) do myší DBA/2 v týždennom intervale vytvárajúcom u časti z nich silnú špecifickú odpoveď.
Uskutočnili sa dve pokusné série. Postup obidvoch sérií je uvedený na obrázku 4 a 5. V prvej pokusnej sérii (pozri obrázok
4) sa vírusové častice podávali jednej polovici v peritoneálnej kavite a druhej polovici sa podávali pod kožu (v štyroch miestach). V druhej pokusnej sérii (pozri obrázok 5) sa vírusové častice podávali podkožné injekciami, intraperitoneálne, intranazálne a intratracheálne. Tieto dve série pokusov sa uskutočnili podía nasledovného postupu. Myši sa usmrtili 15 dní po druhej sérii injekcií adenovírusom. Splenocyty týchto myší sa skontaktovali s antigénom P815A prostredníctvom buniek L1210A1 (syngenická leukémia transfekovaná s génom PXA mastocytómu P815) a ožiarili v osemdennej perióde. Ako príklad tejto kultivácie sa môže uviesť zmes tumor-lymfocyty (MLTC) , lymfocyty riadené proti antigénu P815A, ktoré sa proliferovali a diferencovali v zabi j ačs kých T lymfocytoch. Tieto sa kontaktujú s bunkami značenými rádioaktívnym chrómom. Ide o bunky P511, variant azaguanínu, ktorý je rezistentný voči myšacím mastocytom, ktorý stratil antigén A. Tento posledný bude pre kontrolu negatívny. Aby sa vylúčila každá možnosť nešpecifickej reakcie, cielové bunky kontaktované so synergickými bunkami (L1.210), ktoré nesú na svojom povrchu antigén stimulačných buniek v MTLC, okrem antigénu A P815, sa označili s rádioaktívnym chrómom
Získané výsledky v prvej pokusnej sérii, vyjadrené v percentách špecifickej lýzy, sú uvedené v tabulkách 3A a 3B.
Získané výsledky v druhej pokusnej sérii, vyjadrené percentách špecifickej lýzy, sú uvedené v tabulkách 4A a 4B.
V obidvoch prípadoch uvedené výsledky ukazujú úrovne lýzy v pomerných priemerných hodnotách výkonných/cielových (E/T) v závislosti od myši. CTL sa získali z akéhokolvek miesta injikovania adenovírusu (tabulka 4A A 4B) . Výsledky jasne ukazujú, že adenovírusy podía vynálezu sú schopné vytvoriť in vivo imunitu proti bunkám, ktoré nesú nádorový antigén.
G
N
Φ rH
ΊΤ3
C >t >
C a
> _ ~ O <3 o ·* o •C c Φ T Ό m <
- sP tí· m o o
O m *3- O o n — r-' — — ks (0 rH
Ό
O
SX
Φ θ'
Φ
S i
ΛΖ
Φ •H c
G
JO
Ä υ
'>
ť (0 >
o λζ •H
MH
G •H
J
H
U >1
N *>s C —. >
j= o «c 5 — c Ο ’T Ό ow<
->.
c o
^z <2 w
C « rr “ Q £ « U Í c
o ^z _ «Β « •S O tí — Ό u <
O co ¢3
Zl 1Λ fH — — — SO
O \O O CI θ' so pH O
KS Cl OO 00 —
O o
ks
WW xO
Os — θ'
PHOKSOKSOSOSOfH ρπ ’T ph cs ·—1 rt — -— ph n ph χβ
PH KS χΟ θ' O r- os A* o o n ·— r- os τ m
-m
Φ λ:
u
-rH
MH •H υ
φ a
Xfl
'>> | |
c | |
ra | |
> | |
0 | p·* |
jz | ó |
<3 | en |
C | m |
tí r-*
U o
<
n os —> -3- Ίso ks sp TT -rr
en | fC 'O s.o | o | |
00 | m | o | |
CM | O\ | KS |
Φ •H c
Φ >o
G
O
Λ λ:
ο ο PH rr ρη c ra m
ΟΜ
Ο 3
Ο Ο —1 w
ΡΗ
Λ (0
Η <υ
Έ
X)
X ο
•θ' ε-2
Φ
C c
*ra rr
C o
cx m
fc | ra |
3 | g |
E | |
S | c O |
3 | cx |
Tabulka 2: Určenie schopnosti buniek infikovaných s Ad-Mage podľa vynálezu stimulovať produkciu TNF ►4
H
O e
o c
o
E—
Q.
Cl </3
U-l m
o.
o o
o cn •J
Ευ
I
Ε- | E- | E- | E— | E— | |
00 | 00 | oo | 00 | oo | 00 |
cu | o. | o. | Q. | a. | Q. |
o | o | o | © | O | © |
II | II | II | II | II | II |
Cl | 1/3 | 1/3 | 00 | Cl | |
T | 00 | T | F | Cl | O |
©λ | O | © | O | O | .-H |
·» f-f | ,-Γ | w-* | Λ |
O
C' >N <0 ta n
C
Í3 «5 a
o.
o
W3 +
<u ta
T3 <
'>»
C ca >
O tc c
+ 1 ω w | 1 w | 1 w | 1 w |
x x | X | x | fC |
u o | Q | o | O |
ja JS | cä | ca | J2 |
Uf Uf <u ω | <5 | Uf <D | Uf <U |
O O | O | O | O |
ε .□ •5 .aj
E
X
U
JS <3
O ta cS
O.
©
1/3
O
1/3 >N ca sO o'
O •^r x
o
J8 <3
O o
m či
Ph
J
Ευ ca
Ô
Uf
4-» c
o
Pd
4Z <u
Έ x!
•s t?
Ό1
O
E
Tabulka 3: Určenie imunizácie myši DBA/2 injekciou podlá protokolu č.l, Ad-PIA (tabulka 3A) alebo adenovírusové kontroly, Ad-Qgal (tabulka 3B) o
d
Zj <;
o d
Zj tn $-1
Ή >
O
C
Φ
Ό
Λ
M o
4-1 tí fO tí o
Φ sr>
— d so
-o c
ω
-o
S en +
° d d >-4 _] o d o o o
-<u c
<u o
í o o d d i—* r—»
I—1 hU V d o o o ’T o
d
5Z •H SD >tn CU >1 e
-Φ c
(Ú >
o •H
n (0 (H tí
Λ <0
E-<
ττ V) Q 1/1 o d ό sn m sO sO 00 sO θ' OS d σ> d — Os oo o
O 00 so Os O — d «ZS d d xr so izs rr so vs c-ί oo os sn
Ό — O d so 00 Ό ΤΓ τΓ rj- ~ so
STi TT d d d oo d ττ d d sn
MTD/CW 5A94 tT d
sr d
Vi o 00 o -'r -sr d d
CI
V ddOsosdTrsoddvsTj· so «s — m o) — sovsdTfddooOvsd — dso'srd — dsovsTfd'— so in 00 O Od —· —' •'ú- d o so d sn d oo m co — o d d d oo d — m ~ d - — d m π o\ d -« sn — so ct d d >Ó
ΧΛ
CI | d | |
xJ | >ó | >ó |
κη | >CO | xo |
>s | >s | |
E | ε | ε |
o
2- oj U
OJVOrO — — ^O— 0-0
ΤΓ — cc v ·<τ _ o τ \o
V OJ í
2~SOOl
J ei m n o oo — o m o o 22 o ei ό o x m oi o oj o o
OJ ai +
O
OJ □
OOOOOOOOOOOJOOOOOOOOOOOOO
-o ~ OJ ýj
Tabuľka 3B: Injikované myši rekombinantným adenovírusom Pgal
O
OJ
J
M-j cn <:
o
OJ u
oj o — o o o ’T o
rl. OJ to o o
F“* cu
Ό cu,
OOO — OOOwiOOOOlOOo o
O O ’T 00 o
OOOmOOOOOJOOOOOJ — O O O O Č\ 2 5o — »n οι Tj· oj o Z2 vo m οι oi m tj· r* o oj o oj Ό oo o tfi oj Ti- <*1 'f 00 Ό tn 00 <*> .+· <*>
t'-ejS’^ínoitoOľr^OeirOTí-Sxv-íOJootoľíSSoej m — tj· tj· _ 'τ — >ó ><Λ >>
ε
04 | cn | |
>6 | >ó | >ó |
xn | ><ZJ | |
ε | E | ε |
<u c | ε | κ ta |
c | □ | ε |
.(0 — | ε | š |
c | S | c |
o | cú | o |
o. | c | o. |
(Λ | c | 03 |
Tabuľka 4: Určenie imunizácie myši DBA/2 injekciou podľa protokolu č.2, Ad-PIA (tabuľka 4A) alebo adenovírusové kontroly,
Ad-Pgal | (tabulka 4B) | |||||||
Tabulka | 4A | |||||||
E/T | P511 | P1.204 | P511 + | st. | P511 + st. | |||
L1210 | 50x1 | L1210 50x1 | ||||||
podkožné | myš | č. | 1 490 | 9 | 2 | 0 ' | 1 | |
163 | 5 | 3 | 0 | 0 | ||||
54 | 3 | 1 | 0 | 0 | ||||
18 | 3 | 0 | 0 | 0 | ||||
8 | 2 | 1 | 0 | 0 | ||||
2 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||||
myš | č. | 2 50 | 5 | 0 | 0 | 0 | ||
27 | 3 | 0 | 0 | 0 | ||||
9 | 5 | 0 | 3 | 1 | ||||
3 | 6 | 0 | 0 | 8 | ||||
1 | 4 | 0 | 1 | 0 | ||||
0, 3 | 2 | 0 | 0 | 0 |
intraperitoneálne
myš | č. | 1 | 258 | 51 | 9 | 48 | 0 |
85 | 43 | 10 | 37 | 0 | |||
28 | 43 | 8 | 27 | 0 | |||
9 | 38 | 3 | 12 | 1 | |||
3 | 18 | 2 | 8 | 0 | |||
1 | 7 | 0 | 1 | 0 | |||
myš | č. | 2 | 295 | 9 | 4 | 9 | 2 |
88 | 8 | 6 | 2 | 0 | |||
33 | 7 | 4 | 2 | 0 | |||
11 | 3 | 2 | 1 | 0 | |||
4 | 1 | 2 | 0 | 0 | |||
1 | 0 | 0 | 0 | 1 | |||
myš | č. | 3 | 400 | 68 | 12 | 76 | 0 |
133 | 77 | 12 | 82 | 0 | |||
44 | 88 | 14 | 73 | 0 | |||
15 | 14 | 7 | 66 | 0 | |||
6 | 10 | 6 | 30 | 0 | |||
3 | 10 | 1 | 14 | 0 | |||
myš | č. | 4 | 185 | 8 | 2 | 3 | 0 |
5 | 3 | 0 | 3 | 0 | |||
57 | 10 | 2 | 3 | 0 | |||
8 | 4 | 1 | 2 | 0 | |||
2 | 3 | 0 | 0 | 0 | |||
0,8 | 2 | 0 | 2 | 0 |
Intratracheálne myš č.
myš č.
myš č.
intranazálne myš č.
myš č.
E/T | P511 | PI.204 | P511 + st. L1210 50X1 | P511 + st. L1210 50X1 |
440 | 67 | 11 | 50 | 3 |
247 | 78 | 13 | 52 | 2 |
49 | 64 | 6 | 49 | 0 |
18 | 34 | 8 | 23 | 0 |
6 | 31 | 7 | 9 | 0 |
2 | 14 | 0 | 2 | 0 |
410 | 6 | 7 | 3 | 2 |
137 | 6 | 7 | 3 | 1 |
45 | 6 | 4 | 0 | 1 |
15 | 5 | 2 | 2 | 0 |
9 | 1 | 3 | 0 | 0 |
2 | 1 | 2 | 0 | 2 |
344 | 8 | 2 | 3 | 1 |
115 | 4 | 0 | 2 | 0 |
38 | 8 | 0 | 1 | 0 |
13 | 8 | 0 | 0 | 0 |
4 | 4 | 1 | 0 | 0 |
1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
265 | 80 | 9 | 52 | 0 |
85 | 46 | 8 | 47 | 0 |
28 | 42 | 7 | 21 | 0 |
9 | 33 | 3 | 9 | 0 |
3 | 17 | 2 | 2 | 0 |
1 | 5 | 2 | 1 | 0 |
230 | 2 | 0 | 1 | 0 |
77 | 4 | 0 | 3 | 0 |
25 | 2 | 0 | 0 | 0 |
8 | 2 | 0 | 0 | 0 |
3 | 1 | 1 | 0 | 0 |
1 | 1 | 3 | 0 | 0 |
210 | 13 | 2 | 11 | 0 |
70 | 10 | 0 | 7 | 0 |
23 | 6 | 0 | 2 | 1 |
3 | 1 | 0 | 0 | 0 |
3 | 2 | 0 | 0 | 0 |
1 | 2 | 0 | 0 | 0 |
430 | 58 | 0 | 52 | 6 |
160 | 52 | 0 | 58 | 1 |
53 | 84 | 4 | 65 | 0 |
18 | 84 | 2 | 52 | 0 |
6 | 51 | 2 | 33 | 0 |
2 | 52 | D | 20 | 0 |
205 | 4 | 0 | 0 | 2 |
69 | 4 | 0 | 0 | 0 |
83 | 1 | 0 | 0 | 0 |
8 | 5 | 0 | 0 | 0 |
2 | 3 | 0 | 0 | 0 |
0, 8 | 2 | 0 | 0 | 0 |
myš č.
myš č.
E/T | P511 | PI . 204 | P511 + st. L1210 50X1 | P511 + st. L1210 50X1 |
250 | 1 | 0 | 0 | 0 |
83 | 0 | 0 | 0 | 0 |
28 | 1 | 0 | 0 | 0 |
9 | 1 | 0 | 0 | 0 |
3 | 1 | 0 | 0 | 0 |
1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
280 | 2 | 0 | 1 | 0 |
87 | 8 | 1 | 0 | 0 |
29 | 1 | 0 | 0 | 0 |
10 | 2 | 0 | 1 | 0 |
3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
1 | 1 | 1 | 0 | 0 |
240 | 3 | 0 | 0 | 2 |
80 | 1 | 0 | 0 | 0 |
27 | 1 | 0 | 0 | 1 |
9 | 1 | 1 | 0 | 0 |
3 | 1 | 0 | 0 | 0 |
1 | 1 | 1 | 1 | 0 |
125 | 0 | 0 | 0 | 0 |
42 | 0 | 0 | 0 | 0 |
14 | 0 | 0 | 0 | 0 |
5 | 1 | 0 | 0 | 0 |
2 | 0 | 0 | 0 | 1 |
0, 6 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Tabuľka 4B: | ||
E/T | P511 |
podkožné myš č. | 1 | 300 | 0 |
100 | 0 | ||
33 | 0 | ||
11 | 0 | ||
4 | 0 | ||
1 | 0 | ||
myš č. | 2 | 230 | 4 |
77 | 1 | ||
25 | 1 | ||
8 | 0 | ||
3 | 0 | ||
1 | 0 | ||
intraperitoneálne | |||
myš č. | 1 | 220 | 1 |
73 | 0 | ||
24 | 1 | ||
8 | 0 | ||
3 | 0 | ||
1 | 0 | ||
myš č. | 2 | 410 | 9 |
137 | 1 | ||
45 | 0 | ||
15 | 0 | ||
5 | 0 | ||
2 | 0 | ||
intratracheálne | |||
myš č. | 1 | 310 | 0 |
103 | 0 | ||
34 | 0 | ||
11 | 0 | ||
4 | 0 | ||
1 | 0 | ||
myš č. | 2 | 270 | 2 |
90 | 1 | ||
30 | 0 | ||
10 | 0 | ||
3 | 1 | ||
1 | 1 | ||
intranazálne | |||
myš č. | 1 | 400 | 0 |
18 | 1 | ||
5 | 0 | ||
2 | 0 |
PI.204 | P511 + st. L1210 50x1 | PI.204 + st | |
L1210 | 50X1 | ||
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 1 | |
0 | 0 | 0 | |
3 | 0 | 1 | |
1 | 0 | 0 | |
4 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | |
2 | 1 | 0 | |
0 | 0 | 1 | |
1 | 1 | 2 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 1 | |
0 | 0 | 0 | |
1 | 0 | 3 | |
1 | 0 | 2 | |
0 | 0 | 0 | |
1 | 0 | 0 | |
1 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | |
1 | 0 | 1 | |
0 | 0 | 1 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 1 | |
0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 |
myš č.
P511
PI.204 P511 + st. PI.204 + st
L1210 50X1 L1210 50X1
E/T
230 | 3 | 0 | 0 | 1 |
77 | 2 | 0 | 0 | 0 |
25 | 0 | 0 | 0 | 0 |
3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
spont | 106 | 127 | 122 | 110 |
max | 1 041 | 971 | 957 | 988 |
spont /max | 10% | 13% | 13% | 12% |
Zoznam sekvencií (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 126 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: dve (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 1:
TTGAATTCGC CGCCATGGAG TCCTTGCAGC TGGTCTTTGG CATTGACGTG AAGGAAGCAG ACCCCACCGG CCACTCCTAT GTCCTTGTCA CCTGCCTAGG TCTCTCCTAT GATGGCTAGA ATTCTT
100
126 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 2: i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 44 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: dve (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 2:
AATTCGCCGC CATGGAAGTG GACCCCATCG GCCACTTGTA CTAG 44 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 3: i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 44 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: dve (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 3:
AATTCGCCGC CATGCTGCCT TATCTAGGGT GGCTGGTCTT CTAG 44
Claims (19)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Defektný rekombinantný adenovírus obsahujúci vo svojom genóme zahrnutú nukleovú kyselinu kódujúcu proteín alebo špecifický peptid nádoru, schopný indukovať imunitnú ochranu a deštrukciu zodpovedajúcich nádorových buniek imunitným systémom.
- 2. Defektný rekombinantný adenovírus podía nároku 1, v y z - . načujúci sa tým, že obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu proteín alebo špecifický peptid ludského nádoru.
- 3. Defektný rekombinantný adenovírus podía nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina vložená do genómu kóduje celok alebo časť špecifického antigénu melanómu.
- 4. Defektný rekombinantný adenovírus podía nároku 3, vyznačujúci sa tým, že ide o nukleovú kyselinu kódujúcu fragment špecifického antigénu ludského melanómu, ktorý obsahuje časť vyjadrenú CTL v spojení s molekulami CMJ-I.
- 5. Defektný rekombinantný adenovírus podía jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina kóduje proteín, alebo peptid z neho odvodený, vybraný z proteínov Mage-1, Mage-3, Bage, Rage a Gage.
- 6. Defektný rekombinantný adenovírus vo svojom genóme obsahujúci nukleovú kyselinu, ktorá kóduje peptid proteínu Mage-1 alebo Mage-3 obsahujúci časť vyjadrenú CTL.
- 7. Defektný rekombinantný adenovírus obsahujúci sekvenciu SEQ ID NO: 1 vloženú vo svojom genóme.
- 8. Defektný rekombinantný adenovírus obsahujúci obsiahnutú medzi zvyškami 55 až 85 sekvencie SEQ vloženú vo svojom genóme.sekvenciuID NO: 1
- 9. Defektný rekombinantný adenovírus obsahujúci sekvenciu SEQ ID NO: 2 vloženú vo svojom genóme.
- 10. Adenovírus podlá jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že je vybraný, z ľudských sérotypov Ad2 a Ad5.
- 11. Adenovírus podľa jedného z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa t ý m, že je vybraný zo psích sérotypov.
- 12. Adenovírus podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že obsahuje deléciu v oblasti El.
- 13. Adenovírus podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že okrem iného obsahuje deléciu v oblasti El.
- 14. Adenovírus podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina je vložená do oblasti El alebo E3 alebo E4.
- 15. Farmaceutická kompozícia obsahujúca aspoň adenovírus podľa jedného z predchádzajúcich nárokov.
- 16. Použitie adenovírusu podľa jedného z predchádzajúcich nárokov 1 až 14 na produkciu in vitro alebo ex vivo špecifických cytotoxických lymfocytov ľudských nádorov.
- 17. Kompozícia obsahujúca bunky infikované defektným rekombinantným adenovírusom podľa jedného z predchádzajúcich nárokov 1 až 14.
- 18. Kompozícia podlá nároku 17, vyznačujúca sa tým, že obsahuje bunky nesúce antigén (APC) infikované defektným rekombinantným adenovírusom podlá jedného predchádzajúcich nárokov 1 až 14.
- 19. Postup prípravy špecifických cytotoxických T buniek nádorového antigénu obsahujúci skontaktovanie prekurzora CTL buniek s populáciou buniek infikovaných vírusom podlá jedného z nárokov 1 až 14.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9603207A FR2746110B1 (fr) | 1996-03-14 | 1996-03-14 | Methode de traitement par therapie genique des tumeurs humaines et virus recombinants correspondants |
PCT/FR1997/000435 WO1997034009A1 (fr) | 1996-03-14 | 1997-03-12 | Vecteurs adenoviraux recombinants pour la therapie genique des tumeurs humaines |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK124698A3 true SK124698A3 (en) | 1999-05-07 |
Family
ID=9490181
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK1246-98A SK124698A3 (en) | 1996-03-14 | 1997-03-12 | Recombinant adenoviral vectors for human tumour gene therapy |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20030082150A1 (sk) |
EP (1) | EP0889969B1 (sk) |
JP (1) | JP2000507229A (sk) |
KR (1) | KR19990087718A (sk) |
CN (1) | CN1218512A (sk) |
AT (1) | ATE309382T1 (sk) |
AU (1) | AU732288B2 (sk) |
BR (1) | BR9707994A (sk) |
CA (1) | CA2248612A1 (sk) |
CZ (1) | CZ295967B6 (sk) |
DE (1) | DE69734574T2 (sk) |
DK (1) | DK0889969T3 (sk) |
ES (1) | ES2252779T3 (sk) |
FR (1) | FR2746110B1 (sk) |
HU (1) | HUP9902150A3 (sk) |
IL (1) | IL126152A0 (sk) |
NO (1) | NO984052L (sk) |
SK (1) | SK124698A3 (sk) |
WO (1) | WO1997034009A1 (sk) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU4668797A (en) * | 1996-10-07 | 1998-05-05 | Ludwig Institute For Cancer Research | Replication-defective adenoviruses for cancer immunotherapy |
AU1013601A (en) | 1999-10-22 | 2001-05-08 | Aventis Pasteur Limited | Method of inducing and/or enhancing an immune response to tumor antigens |
CA2408328C (en) * | 2000-05-10 | 2012-04-17 | Aventis Pasteur Limited | Immunogenic polypeptides encoded by mage minigenes and uses thereof |
EP1383513B1 (en) * | 2001-03-27 | 2010-10-20 | New York University | Tumor therapy with sindbis virus-based vectors |
US7786278B2 (en) | 2002-04-09 | 2010-08-31 | Sanofi Pasteur Limited | Modified CEA nucleic acid and expression vectors |
EP1497412A4 (en) * | 2002-04-30 | 2006-11-22 | Avior Therapeutics Inc | ADENOVIRUS VECTORS FOR IMMUNOTHERAPY |
CN1327000C (zh) * | 2002-09-06 | 2007-07-18 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 靶向黑色素瘤的可复制性腺病毒穿梭载体及腺病毒 |
US20040223949A1 (en) * | 2002-10-22 | 2004-11-11 | Sunnybrook And Women's College Health Sciences Center Aventis Pasteur, Ltd. | Vaccines using high-dose cytokines |
JP4668919B2 (ja) * | 2003-10-08 | 2011-04-13 | サノフィ パストゥール インコーポレイテッド | 修飾cea/b7ベクター |
WO2014153204A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Salk Institute For Biological Studies | Oncolytic adenovirus compositions |
WO2017147265A1 (en) | 2016-02-23 | 2017-08-31 | Salk Institute For Biological Studies | High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics |
EP3390645B1 (en) | 2016-02-23 | 2022-09-14 | Salk Institute for Biological Studies | Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics |
EP3532082A4 (en) | 2016-12-12 | 2020-08-26 | Salk Institute for Biological Studies | SYNTHETIC ADENOVIRUS TUMOR TARGETING AND THEIR USES |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5342774A (en) * | 1991-05-23 | 1994-08-30 | Ludwig Institute For Cancer Research | Nucleotide sequence encoding the tumor rejection antigen precursor, MAGE-1 |
US6235525B1 (en) * | 1991-05-23 | 2001-05-22 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof |
US5620886A (en) * | 1993-03-18 | 1997-04-15 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2 |
EP0667912B1 (fr) * | 1993-07-13 | 2008-07-02 | Centelion | Vecteurs adenoviraux defectifs et utilisation en therapie genique |
-
1996
- 1996-03-14 FR FR9603207A patent/FR2746110B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-03-12 CN CN97193960A patent/CN1218512A/zh active Pending
- 1997-03-12 AT AT97914375T patent/ATE309382T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-03-12 US US09/125,887 patent/US20030082150A1/en not_active Abandoned
- 1997-03-12 CZ CZ19982915A patent/CZ295967B6/cs unknown
- 1997-03-12 DE DE69734574T patent/DE69734574T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-12 ES ES97914375T patent/ES2252779T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-12 SK SK1246-98A patent/SK124698A3/sk unknown
- 1997-03-12 CA CA002248612A patent/CA2248612A1/fr not_active Abandoned
- 1997-03-12 KR KR1019980707186A patent/KR19990087718A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-03-12 JP JP9532334A patent/JP2000507229A/ja not_active Ceased
- 1997-03-12 WO PCT/FR1997/000435 patent/WO1997034009A1/fr active IP Right Grant
- 1997-03-12 EP EP97914375A patent/EP0889969B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-12 DK DK97914375T patent/DK0889969T3/da active
- 1997-03-12 AU AU21641/97A patent/AU732288B2/en not_active Ceased
- 1997-03-12 BR BR9707994A patent/BR9707994A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-03-12 IL IL12615297A patent/IL126152A0/xx unknown
- 1997-03-12 HU HU9902150A patent/HUP9902150A3/hu unknown
-
1998
- 1998-09-03 NO NO984052A patent/NO984052L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2746110B1 (fr) | 1998-04-17 |
WO1997034009A1 (fr) | 1997-09-18 |
EP0889969B1 (fr) | 2005-11-09 |
EP0889969A1 (fr) | 1999-01-13 |
CZ295967B6 (cs) | 2005-12-14 |
ATE309382T1 (de) | 2005-11-15 |
US20030082150A1 (en) | 2003-05-01 |
DK0889969T3 (da) | 2006-03-27 |
FR2746110A1 (fr) | 1997-09-19 |
DE69734574T2 (de) | 2006-07-13 |
HUP9902150A2 (hu) | 1999-11-29 |
AU732288B2 (en) | 2001-04-12 |
CZ291598A3 (cs) | 1998-12-16 |
CN1218512A (zh) | 1999-06-02 |
IL126152A0 (en) | 1999-05-09 |
KR19990087718A (ko) | 1999-12-27 |
BR9707994A (pt) | 1999-07-27 |
JP2000507229A (ja) | 2000-06-13 |
NO984052D0 (no) | 1998-09-03 |
CA2248612A1 (fr) | 1997-09-18 |
HUP9902150A3 (en) | 2000-12-28 |
AU2164197A (en) | 1997-10-01 |
ES2252779T3 (es) | 2006-05-16 |
DE69734574D1 (de) | 2005-12-15 |
NO984052L (no) | 1998-09-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SK124698A3 (en) | Recombinant adenoviral vectors for human tumour gene therapy | |
RU2234942C2 (ru) | Выделенный опухолевый полипептид предстательной железы и кодирующий его полинуклеотид | |
WO1998046769A1 (en) | Composition and method for inducing an immune response against tumour-related antigens | |
KR20000071226A (ko) | 간세포 암의 예방 및 치료 방법 | |
US20070104685A1 (en) | Synthetic gene encoding human carcinoembryonic antigen and uses thereof | |
KR20080098585A (ko) | 엡스타인-바르 바이러스 관련 질환의 치료 | |
CN1526012A (zh) | 一种高效表达抗癌基因的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒及其用途 | |
NZ544543A (en) | Synthetic gene encoding human epidermal growth factor 2/neu antigen and uses thereof | |
US7282365B2 (en) | Rhesus HER2/neu, nucleotides encoding same, and uses thereof | |
US20020177547A1 (en) | Pharmaceutical compositions for treating or preventing cancer | |
MXPA98007290A (en) | Recombinant adenoviral vectors for the genuine therapy of the huma tumors | |
US20060286114A1 (en) | Synthetic gene encoding rhesus monkey carcinoembryonic antigen and uses thereof | |
EP1597370B1 (en) | Rhesus carcino embryonic antigen, nucleotides encoding same, and uses thereof | |
JP4459060B2 (ja) | ポリヌクレオチドからなるワクチン | |
ES2247594T3 (es) | Proteina antivirica. | |
CN116948005A (zh) | 一种病毒递送的新型细胞因子及在肿瘤治疗中的应用 | |
ZA200508013B (en) | Synthetic gene encoding human carcinoembryonic antigen and use thereof | |
WO2004015098A2 (en) | Rhesus epithelial cell adhesion molecule, nucleic acid encoding the same, and uses thereof | |
JP2002369685A (ja) | アポトーシス遺伝子1のヒトインヒビター |