SK124698A3 - Recombinant adenoviral vectors for human tumour gene therapy - Google Patents

Recombinant adenoviral vectors for human tumour gene therapy Download PDF

Info

Publication number
SK124698A3
SK124698A3 SK1246-98A SK124698A SK124698A3 SK 124698 A3 SK124698 A3 SK 124698A3 SK 124698 A SK124698 A SK 124698A SK 124698 A3 SK124698 A3 SK 124698A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
mage
cells
nucleic acid
defective recombinant
recombinant adenovirus
Prior art date
Application number
SK1246-98A
Other languages
English (en)
Inventor
Falleur Boon
Marie-Therese Duffour
Hedi Haddada
Christophe Lurquin
Michel Perricaudet
Catherine Uyttenhoveghesquiere
Guy Warnier
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer Sa
Ludwig Inst Cancer Res
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer Sa, Ludwig Inst Cancer Res filed Critical Rhone Poulenc Rorer Sa
Publication of SK124698A3 publication Critical patent/SK124698A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Rekombinantný adenovírus a jeho použitie na liečenie ľudských {
nádorov génovou terapiou
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka metódy liečenia ludských nádorov génovou terapiou. Menovite sa týka defektných rekombinantných vírusov, nesúcich sekvencie kódujúce špecifický antigén ľudských nádorov rovnako aj na vytvorenie špecifických CTL in vitro alebo ex vivo. Tiež sa týka farmaceutických kompozícií týchto vírusov, konkrétne v injikovatelnej forme.
Doterajší stav techniky
Génová terapia spočíva v oprave zníženia schopnosti alebo anomálie vložením genetickej informácie do bunky alebo do postihnutého orgánu. Táto informácia sa môže vložiť buď in vitro do bunkového extraktu orgánu a potom reinjikovať do organizmu alebo in vivo priamo do postihnutého tkaniva. Čo sa týka molekúl s vysokou molekulovou hmotnosťou a s negatívnym nábojom, DNA prechádza spontánne, ale ťažko, cez fosfolipidovú bunkovú membránu. Na prenos génu sa teda používajú rôzne vektory: používajú sa jednak vírusové vektory, jednak chemické alebo biochemické vektory, prírodné alebo syntetické. Chemické alebo biochemické vektory sú napríklad katióny (fosforečnan vápenatý, DEAE-dextrán, ...), ktoré vytvárajú s DNA zrazeninu, ktorú bunky môžu fagocytovať. Môže ísť tiež o lipozómy, do ktorých sa DNA zahrnie, ktoré prechádzajú cez plazmatickú membránu fúziou. Syntetické vektory na prenos génov sú všeobecne lipidy alebo katiónové polyméry, ktoré tvoria komplex s DNA a tvoria s ňou častice s pozitívnym nábojom na povrchu. Tieto častice sú schopné interagovať s negatívnym nábojom bunkovej membrány a potom sú schopné prejsť bunkovú membránu. Ako príklad vektora sa môžu uviesť dioktadecylaminoglycylspermín (DOGS, Transfectam™) alebo N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-Ν,Ν,Ν-trimetylamónium chlorid (DOTMA, Lipofectin™) . Vyvinuli sa tiež chimérne proteíny: sú tvorené polykatiónovou časťou, ktorá kondenzuje DNA viazanú na ligand, ktorý sa fixuje na membránovom receptore a vnáša komplex endocytózou do buniek. Teoreticky sa dá zamerať na tkanivo alebo určitú populáciu buniek na zvýšenie biodisponibility prenášaného génu in vivo (pozri Behr, 1993; Cotten a Wagner, 1993) . Ako vektory sa môžu uviesť konkrétne retrovírusy (RSV, HMS, MMS, atď.), vírus HSV, adeno-asociované vírusy a adenovírusy ako potenciálne použiteľné vírusy. Tieto vírusy sa použili na infikovanie rôznych typov buniek.
Vyvinuli sa postupy génovej terapie na liečenie rôznych typov patológií, vrátane porúch nervového systému, kardiovaskulárnych chorôb alebo rakoviny. Čo sa týka konkrétne oblasti rakoviny, vo vedlajších odboroch sa navrhli rôzne prístupy. Štúdia opisuje použitie lymfocytov kultiváciou ex vivo v prítomnosti 2-iriterleukínu alebo transfekciou s génom 2interleukínu. Prijaté imunoterapeutické štúdie boli takisto založené na purifikovaných makrofágových monocytoch, ktoré sa ex vivo aktivovali s interferónom, aby sa zvýšila ich tumorocídna schopnosť, a potom sa reinjikovali pacientovi (Anderssen a kol., Cancer Res. 50 (1990) 7450). Opísala sa tiež možnosť použitia geneticky modifikovaných makrofágov (WO95/06120). Ďalšia séria prístupov je založená na prenose toxických génov schopných, priamo alebo nepriamo, spôsobiť smrť rakovinových buniek. Tento typ prístupu sa opísal napríklad pre gén tymidínkinázy prenesenej buď in vivo adenovírusovým vektorom (PCT/FR94/01284, PCT/FR94/01285) alebo štepením buniek produkujúcich retrovírusový vektor (Caruso a kol., PNAS 90 (1993) 7024. Ďalší použitý gén je napríklad gén cytozíndeaminázy.
Podstata vynálezu
Predložený vynález sa týka novej metódy liečenia rakoviny. Táto metóda je zameraná na liečenie ľudských nádorov, predovšetkým melanómov. Metóda podľa vynálezu je založená na prenose a in vivo expresii špecifických antigénov ľudských nádorov, ako sú melanómy, schopných vyvolať (i) imunitnú ochranu proti vzniku tohto typu rakoviny a (ii) šírenie populácie špecifických cytotoxických T buniek (CTL) predstavujúcich tieto antigény a tiež deštrukciu zodpovedajúcich nádorových buniek imunitným systémom.
Imunitný systém má, okrem iných funkcií, schopnosť zaistiť ochranu proti vírusovým infekciám. Táto schopnosť je zaistená cytotoxickými T lymfocytmi (CTL). CTL majú dve výrazné charakteristiky: sú vysoko špecifické a vysoko účinné. Ničia infikované bunky po detekcii vírusového antigénu na ich povrchu. Antigén, o ktorý ide, sa prejavuje vo forme peptidu spojeného s molekulou histokompatibilného systému triedy I (CMH-I). V oblasti tumorov sa pozorovalo, najskôr na myšiach, že malígne bunky tvoria komplexy peptidových molekúl CMH-I schopných vyvolať v rámci antivírusovej odpovede imunitnú odpoveď riadenú CTL. Tieto peptidy pochádzajú konkrétne z proteínov kódovaných mutovanými génmi alebo selektívne aktivovanými génmi v nádorových bunkách. Tieto proteíny sú označené špecifickými antigénmi nádorov. Na ľudských nádoroch sa charakterizovali rôzne antigény rozpoznávané s CTL.
Predložený vynález sa týka novej metódy liečenia ľudských nádorov. Vyplýva konkrétne zo spresnenia vektorov vírusového pôvodu schopných preniesť a exprimovať in vivo špecifické antigény ľudských nádorov alebo melanómov. Je založený konkrétne na myšacích modeloch, ktoré ukazujú, že defektné rekombinantné adenovírusy sú schopné vyvolať imunizáciu proti tomuto typu antigénov umožňujúcich získať in vivo lymfocytovú odpoveď proti týmto antigénom, konkrétne nádorovým bunkám, ktoré ich nesú. Táto metóda podlá vynálezu umožňuje teda prenosom týchto génov účinným spôsobom pôsobiť na vývoj ľudských nádorov tým, že sa zastaví ich vývoj a že môžu sa odstrániť.
Prvý predmet vynálezu teda spočíva v rekombinantnom defektnom adenovíruse obsahujúcom vo svojom genóme nukleovú kyselinu kódujúcu proteín alebo špecifický peptid nádoru, konkrétne celok alebo časť špecifického antigénu alebo melanómu.
Ide konkrétne o antigén ľudského melanómu. Ide konkrétne o fragment špecifického antigénu ľudského melanómu, ktorý zodpovedá časti vyjadrenej CTL v spojení s molekulami CMH-I. Špecifické antigény ľudských nádorov už boli opísané (Thierry Boon a kol., US5,342,774; US5,405,940; WO92/20356; WO94/23031;
WO94/21126). Tieto antigény sú označené výrazom MAGE, konkrétne MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, MAGE-7, MAGE-8, MAGE-9, MAGE-10, MAGE-11, MAGE-12. Ako reprezentatívny príklad myšacích homologických génov sa môžu uviesť gény S-MAGE-1 a SMAGE-2. Čo sa týka menovite génov BAGE, GAGE a RAGE, sú to zástupcovia inej podobnej rodiny génov.
Podľa uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia vynálezu, predložený vynález sa dotýka defektného rekombinantného adenovírusu, ktorý obsahuje v svojom genóme vloženú nukleovú kyselinu kódujúcu proteín alebo peptid odvodený z proteínu vybraného z proteínov Mage-1, Mage-3, Bage, Gage a Rage. Tieto antigény sú vlastne naj selektívnejšie v tom zmysle, že neboli detegované na žiadnej nenádorovej somatickej bunke. Opísala sa sekvencia antigénu mage-1 a zodpovedajúceho génu (Van der Bruggen a kol., Science 254 (1991) 1644). Tiež sa opísala cDNA sekvencia, ktorá kóduje Mage-1 a Mage-3 (napríklad Gaugler a kol., J. Exp. Med. 179 (1994) 921).
Ako sa už naznačilo, uprednostňovaný spôsob uskutočnenia vynálezu je reprezentovaný defektným rekombinantným adenovírusom, ktorý obsahuje v svojom genóme zahrnutú nukleovú kyselinu kódujúcu peptid proteinu Mage-1, Mage-3, Bage alebo Gage obsahujúce časť vyjadrenú CTL v spojení s molekulami CMH-I. Gény Mage, Bage a Gage kódujú značné veľké proteiny. Tieto proteiny sú degradované enzýmovým štiepením v bunke, ktoré peptidy degeneruje. Sú to peptidy, ktoré sú umiestnené na povrchu buniek a ktoré sú rozpoznané CTL v spojení s molekulami CMH-I (pozri obrázok 2). Vynález sa týka konkrétne rekombinantných adenovírusov, ktoré obsahujú nukleovú kyselinu kódujúcu peptid proteinu Mage-1, Mage-3, Bage alebo Gage obsahujúci časť vyjadrenú CTL.
Podľa špecifického spôsobu uskutočnenia vynálezu, predložený vynález sa týka rekombinantných adenovírusov obsahujúcich vo svojom genóme sekvenciu SEQ ID NO: 1. Táto sekvencia obsahuje sekvenciu kódujúcu nonapeptid (27 bp) Mage-1, z ktorej sa exprimuje molekula HLA.A1 cytotoxických T lymfocytov. Ide o sekvenciu, ktorá je medzi zvyškami 55 až 82 sekvencie SEQ ID NO: 1.
Podľa iného špecifického spôsobu uskutočnenia vynálezu sa predložený vynález týka rekombinantných adenovírusov obsahujúcich vo svojom genóme zahrnutú sekvenciu SEQ ID NO: 2. Táto sekvencia obsahuje sekvenciu kódujúcu nonapeptid (27 bp) Mage-3, z ktorej sa exprimuje molekula HLA.A1 cytotoxických T lymfocytov.
Podlá iného spôsobu uskutočnenia vynálezu, predložený vynález sa týka rekombinantných adenovírusov obsahujúcich vo svojom genóme zahrnutú nukleovú kyselinu, ktorá, kóduje antigénny peptid génu P1A mastocytómu p815 myší DBA/2 (SEQ ID NO: 3) .
Ako sa už naznačilo, adenovírusy podía vynálezu umožňujú prenos a účinnú expresiu týchto antigénnych peptidov in vivo. Umožňujú tiež výrazne stimulovať in vivo vznik špecifických cytotoxických T lymfocytov týchto antigénov, ktorý selektívne ničí každú bunku, ktorá má na svojom povrchu tento antigén.
Vírusy podía vynálezu sú teda použiteľné na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na liečenie rakoviny, ktorej bunky majú antigén Mage na svojom povrchu. Na prípravu takýchto kompozícií, nádorové bunky pacienta (menovite melanómy) sa predtým odobrali a analyzovali na (i) určenie expresie génu Mage napríklad pomocou RT-PCR a (ii) prípadne typizovanie tohto antigénu Mage. Skonštruoval sa adenovírus, ktorý obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu celok alebo časť zodpovedajúceho antigénu, a použil sa na podanie pacientovi.
Vírusy sa podía vynálezu môžu použiť tiež in vitro (alebo ex vivo) na vytvorenie populácie špecifických cytotoxických T buniek určitého nádorového antigénu. Preto je populácia buniek infikovaná vírusom podía vynálezu, potom sa kontaktuje s prekurzorom CTL buniek. Špecifické bunky antigénu sa môžu teda selektovať in vitro, amplifikovať, potom použiť napríklad ako liečivo na špecifickú deštrukciu zodpovedajúcich nádorov. Bunková populácia infikovaná vírusom podía vynálezu výhodne obsahuje bunky, ktoré obsahujú antigény (APC). Môže ísť konkrétne o makrofágy (W095/06120) alebo B bunky.
V adenovírusoch podía vynálezu môže byť vložená nukleová kyselina fragment komplementárnej DNA (cDNA), genómová DNA (gDNA) alebo hybridná konštrukcia zložená napríklad z cDNA, do ktorej je vložený jeden alebo viac intrónov. Môže ísť tiež o syntetické alebo semisyntetické sekvencie. Ako sa už naznačilo, ide o nukleovú kyselinu, ktorá kóduje celý proteín alebo peptid, odvodený z proteinu, vybraný z Mage-1, Mage-3, Bage a Gage. V zmysle predloženého vynálezu, expresia peptidu odvodzujúceho tento proteín naznačuje, že nukleová kyselina kóduje fragment proteínu, a že tento fragment môže byť vhodný na vytvorenie CTL. Fragment podlá vynálezu teda minimálne nesie antigénny determinant rozpoznaný špecifickou CTL. Tieto fragmenty sa môžu získať známymi technikami všetkými . odborníkmi, konkrétne genetickou modifikáciou alebo chemickou modifikáciou alebo enzýmovou modifikáciou alebo tiež klonovaním expresiou, umožňujúcou selekciu variantov v závislosti na ich biologickej aktivite. Genetické modifikácie zahrňujú supresiu, deléciu, mutáciu, atď..
Vložená nukleová kyselina je predovšetkým cDNA alebo gDNA.
Vložená nukleová kyselina obsahuje tiež sekvencie umožňujúce expresiu antigénu alebo fragmentu antigénu v infikovaných bunkách. Môže ísť o sekvencie, ktoré sú prirodzene zodpovedné za expresiu uvedeného antigénu, keď tieto sekvencie sú schopné fungovať v infikovanej bunke. Môže ísť tiež o sekvencie iného pôvodu, označené ako heterologické sekvencie (zodpovedné za expresiu iných proteínov alebo rovnakých syntetických). Môže ísť konkrétne o promótory eukaryotických alebo vírusových génov alebo z odvodených sekvencií stimulujúcich alebo potláčajúcich transkripciu génu špecificky alebo nešpecifický, induktívne alebo neinduktívne. Napríklad môže ísť o sekvencie promótorov pochádzajúcich z genómu bunky, ktorú je žiaduce infikovať, alebo z genómu vírusu a menovite môže ísť o promótory génov E1A, MLP adenovírusov, promótor CMV, LTR-RSV, SRa, atd. Z eukaryotických promótorov sa môžu uviesť ubikvitínové promótory (HPRT, vimentín, α-laktín, tubulín, atď.), promótory stredných filamentov (dezmín, neurovlákna, keratín, GFAP, atd’.), promótory terapeutických génov (typ MDR, CFTR, faktor VIII, atd.), špecifické tkanivové promótory (pyruvátkináza, vilín, promótor črevného proteínu viazania mastných kyselín, promótor aktínu a buniek hladkého svalstva, špecifické promótory z pečene, Apo Al, Apo AII, ľudský albumín, atď.) alebo tiež promótory odpovedajúce na stimuly (receptory steroidných hormónov, receptor kyseliny retinovej, atď.). Tieto sekvencie sa môžu, okrem iného, modifikovať adíciou aktivačných sekvencií, regulačných sekvencií, atď. Keď vložená nukleová kyselina neobsahuje sekvencie expresie, môže sa vložiť do defektného vírusu v smere tejto sekvencie.
Vírusy podľa vynálezu sú defektné a teda nie sú schopné autonómne sa replikovať v cieľovej bunke. Genóm defektných vírusov použitých v rámci predloženého vynálezu má teda minimálne odstránenú sekvenciu nevyhnutnú pre replikáciu uvedeného vírusu v infikovanej bunke. Tieto oblasti sa môžu buď deletovať (úplne alebo čiastočne) alebo znefunkčniť substitúciou s inými sekvenciami, konkrétne s vloženým génom. Defektný vírus má však zachované sekvencie genómu, ktoré sú nevyhnutné na enkapsidáciu vírusových častíc.
Vírusy podľa vynálezu sa môžu získať z rôznych adenovírusových sérotypov. Existujú rôzne adenovírusové sérotypy, ktorých štruktúra a vlastnosti sa trochu líšia. Z týchto sérotypov sa prednostne používa v rámci predloženého vynálezu ludský adenovírus typ 2 alebo 5 (Ad2 alebo Ad5) alebo adenovírus zvieracieho pôvodu (pozri prihláška WO94/26914). Z adenovírusov zvieracieho pôvodu, použiteľných v rámci predloženého vynálezu, sa môžu uviesť adenovírusy psieho, hovädzieho, myšacieho (napr. Mavl, Beard a kol., Virology 75 (1990) 81), ovčieho, prasacieho, vtáčieho alebo tiež opičieho pôvodu (napríklad SAV). Adenovírus zvieracieho pôvodu je prednostne psí adenovírus, prednostne adenovírus CAV2 (souche manhattan alebo A26/61 (ATCC VR-800)). V rámci predloženého vynálezu sa prednostne používa adenovírus ľudského alebo psieho pôvodu alebo ich zmes.
Defektný adenovírus podlá vynálezu obsahuje ITR, sekvenciu, ktorá umožňuje enkapsidáciu a predmetnú nukleovú kyselinu. V genóme adenovírusu podlá vynálezu je nefunkčná minimálne oblasť El. Žiadaný vírusový gén môže známymi technikami znefunkčniť každý odborník, konkrétne čiastočnou deléciou alebo adíciou jednej alebo viacerých báz v žiadanom géne alebo žiadaných génoch. Tieto modifikácie sa môžu získať in vitro (z izolovanej DNA) alebo in situ, napríklad pomocou techník génovej terapie alebo tiež pôsobením mutagénnych činidiel. Môžu sa tiež modifikovať iné oblasti, konkrétne oblasť E3 (W095/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697) . Podlá uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia vynálezu, adenovírus obsahuje deléciu v oblastiach El a E4. Podľa iného uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia vynálezu, adenovírus obsahuje deléciu v oblasti El na úrovni, v ktorej sú vložené oblasť E4 a nukleová kyselina (pozri FR94 13355). Delécia v oblasti El zasahuje výhodne nukleotidy 454 až 3328 (PvuII-BglII fragment) alebo 382 až 3446 (HinfII-Sau3A fragment). Delécia v oblasti E4 výhodne zasahuje minimálne čítacie rámce 0RF3 a ORF6.
Nukleová kyselina záujmu sa môže vložiť do rôznych oblastí genómu adenovírusu. Genóm adenovírusu je zložený z lineárnej dvojvláknovej DNA s veľkosťou 36 kb. Obsahuje sekvencie obrátených repetícií (ITR) na oboch koncoch, sekvenciu enkapsidácie (Psi), skoré gény a neskoré gény (pozri obrázok 1). Esenciálne skoré gény sa nachádzajú v oblastiach El, E2, E3 a E4. Z nich gény nachádzajúce sa v oblasti El sú nevyhnutné na propagáciu vírusu. Hlavné neskoré gény sa nachádzajú v oblastiach L1 až L5. Genóm adenovírusu Ad5 sa úplne sekvenoval a je dostupný v banke dát (pozri konkrétne Genebank M73260). Takisto sa sekvenovali časti genómov a dokonca celý genóm adenovírusov Ad2, Ad7, Adl2, atď. Nukleový kyselina záujmu sa prednostne vložila do neesenciálnej oblasti, aby sa produkovali defektné rekombinantné vírusy. Prednostne sa vložila do oblasti El, ktorá je v defektnom víruse a doplnila sa produkovanou líniou v oblasti E3, ktorá ' nie je esenciálna na produkciu rekombinantných vírusov (jej inaktivácia sa nemusí transkomplementovatj alebo tiež v oblasti E4. V tomto poslednom prípade je nevyhnutné doplniť funkciu E4 počas produkcie buď spoločnou transfekciou s plazmidom alebo pomocným vírusom alebo pomocou prijateľnej línie. Je jasné, že sa môžu použiť aj iné miesta. Prístup k nukleovej kyseline umožňuje odborníkovi identifikovať oblasti umožňujúce vložiť nukleovú kyselinu záujmu.
Defektné rekombinantné vírusy podlá vynálezu sa môžu pripraviť známymi technikami každým odborníkom (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195, EO 185 573, Graham, EMBO J.. 3 (1984) 2917). Adenovírusy sú produkované transfekciou DNA rekombinantného vírusu v zodpovedajúcej bunkovej enkapsidačnej línii. Môže ísť tiež o jednoduchú transfekciu, keď sa môže pripraviť konštrukcia nesúca spoločne genóm rekombinantného adenovírusu, alebo, ako je to najčastejšie, spoločnou transfekciou viacerých DNA fragmentov nesúcich rôzne časti rekombinantného vírusového genómu. V tom prípade proces zahŕňa jednu alebo viac etáp všeobecnej rekombinácie medzi rôznymi konštrukciami v bunkovej enkapsidačnej línii na vytvorenie DNA rekombinantného vírusu. Rôznymi spôsobmi sa môžu pripraviť rôzne fragmenty použité na produkciu vírusu. Najvšeobecnejšie používaná technika spočíva v izolácii vírusovej DNA a potom in vitro modifikácii klasickými metódami molekulárnej biológie (štiepenie, ligácia, atď.). Získané konštrukcie sa potom purifikujú a použijú na transfekciu plazmidu nesúceho časť genómu rekombinantného vírusu, ktorý sa spoločne transfekuje s vírusom nesúcim chýbajúcu časť genómu. Iné možnosti spočívajú v použití prokaryotických plazmidov na prípravu vírusových DNA použiteľných na transfekciu (pozri Bett a kol., PNAS 91 (1994) 8802, FR95 01632).
Použitá bunková línia sa musí prednostne (i) transformovať uvedenými elementmi a (ii) musí obsahovať sekvencie schopné doplniť časť genómu defektného adenovírusu prednostne v integrovanej forme aby sa predišlo nebezpečenstvu rekombinácie. Ako príklad takejto línie sa môže uviesť obličková línia ľudského embrya 293 (Graham a kol.z J . Gen.· Virol. 36 (1977) 59), ktorá obsahuje začlenenú v svojom genóme lavú časť genómu adenovírusu Ad5 (12%) alebo línia schopná doplniť funkcie E1 a E4 tak, ako je to opísané konkrétne v prihláškach vynálezov WO94/26914 a WO95/02697.
Adenovírusy sa získali namnožením a purifikovali sa podlá klasických techník molekulárnej biológie, ako je uvedené v príkladoch.
Predložený vynález sa týka tiež každej farmaceutickej kompozície obsahujúcej jeden alebo viac defektných rekombinantných adenovírusov tak ako je opísané. Farmaceutické kompozície podlá vynálezu sa môžu formulovať z pohľadu podávania, a to orálne, parenterálne, intranazálne, intravenózne, intramuskulárne, podkožné, transdermikálne ... .
Predložený vynález sa, tak ako sa opísalo, dotýka každej farmaceutickej kompozície obsahujúcej bunky infikované defektným rekombinantným adenovírusom. Kompozícia podľa vynálezu výhodne obsahuje bunky poskytujúce antigén (APC) infikované defektným adenovírusom tak, ako sa už opísalo. Ako príklad sa môžu uviesť makrofágy alebo B lymfocyty. Vynález sa tiež dotýka kompozície obsahujúcej cytotoxické T bunky (CTL) špecifické k nádorovému antigénu, pripravené kultiváciou bunkových prekurzorov v prítomnosti buniek poskytujúcich antigény (APC) infikované efektnými adenovírusmi tak, ako sa opísalo.
Farmaceutická kompozícia podľa vynálezu obsahuje vhodný farmaceutický nosič pre injikovateľnú formu. Môže ísť konkrétne o roztoky solí (dihydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý alebo horečnatý, atď., alebo zmes týchto solí), sterilné, izotonické, alebo suché kompozície lyofilizované, ktoré, podľa prípadu, po pridaní sterilizovanej vody alebo fyziologického roztoku vytvárajú injikovateľnú formu kompozície.
Dávka vírusu použitá na injekciu sa môže prispôsobiť rôznym parametrom, konkrétne použitému spôsobu podávania, patológii, génu určenému na expresiu alebo tiež dĺžke liečenia. Rekombinantné vírusy podľa vynálezu sú všeobecne formulované a podávané vo forme dávok, ktorá obsahuje 104 až 1014 pfu, prednostne 106 až 1014 pfu. Termín pfu (plaque forming units) zodpovedá infekčnej schopnosti vírusového roztoku, ktorá je určená infekciou určitej bunkovej kultúry a následným meraním počtu plakov infikovaných buniek po 15 dňoch. Techniky určenia veľkosti pfu vírusového roztoku sú v odbornej literatúre dobre opísané.
Adenovírusy podľa vynálezu sa môžu použiť na liečenie alebo prevenciu rakoviny, predovšetkým ľudských nádorov (pre antigény Mage-1 až Mage-12, Gage, Bage a Rage) a sarkómov (pre antigény Mage-1).
Nasledujúce obrázky a príklady bližšie opisujú vynález, pritom však v akomkoľvek smere neobmedzujú jeho rozsah.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1: Genetické usporiadanie adenovírusu Ad5
Obrázok 2: Expresia a opracovanie antigénov mage
Obrázok 3: Konštrukcia plazmidov pAd.SRa-MAGE
Obrázok 4: Protokol č.l imunizácie myši DBA/2 a ad-PlA alebo
kontrola
Obrázok 5: Protokol č.2 imunizácie myši DBA/2 a ad-PlA alebo
kontrola
Príklady uskutočnenia vynálezu
Všeobecné techniky klonovania, molekulárnej biológie
Klasické metódy molekulárnej biológie, ako sú napríklad centrifugácia plazmidovej DNA v gradiente chloridu cézneho s etídiumbromidom, štiepenie s reštrikčnými enzýmami, gélová elektroforéza, transformácia E. coli, zrážanie nukleových kyselín, atď., sú opísané v odbornej literatúre (Maniatis a kol., 1989).
Enzýmy dodala firma New England Biolabs (Beverly, MA).
Na ligáciu sa DNA fragmenty rozdelili na základe veľkosti v 0,8% - 1,5% agarózových géloch, purifikovali sa s GeneClean (BIO101, LaJolla, CA) a inkubovali sa cez noc pri teplote 14 °C v pufri 50mM Tris-HCl pH 7,4, lOmM MgCl2, lOmM DTT, 2mM ATP v prítomnosti DNA ligázy fága T4.
Uskutočnila sa tiež amplifikácia s PCR (Polymerase Chain Reaction) podľa Maniatis a kol. 1989 s nasledovnými úpravami:
- koncentrácia MgCl2 8 mM
- teplota denaturácie 95 °C, teplota hybridizácie 55 ’C, teplota elongácie 72 eC, tento cyklus sa 25x opakoval v PE9600 Thermocycler (Perkin Elmer, Norwalk, CO)
Oligonukleotidy, chránené β-kyanoetylovou skupinou, sa syntetizovali s použitím fosforamidovej chémie (Sinha a kol., 1984, Giles 1985) automatickým DNA syntetizátorom firmy Applied Biosystems model 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA) podlá odporúčania dodávateľa.
Sekvenovanie sa uskutočnilo na dvojvláknovej matrici metódou terminácie reťazca s použitím fluorescenčných nástrojov. Použila sa sekvenačná súprava Taq Dye Primer Kit od firmy Applied Biosystem (Applied Biosystems, Foster City, CA) podlá odporúčania výrobcu.
Príklad 1: Konštrukcia defektného rekombinantného adenovírusu, ktorý kóduje fragment antigénu P1A
Tento príklad opisuje konštrukciu defektného rekombinantného adenovírusu podlá vynálezu, ktorý kóduje fragment antigénu P1A. Adenovírus nesie sekvenciu SEQ ID NO: 3. Skonštruovaný adenovírus je adenovírus sérotypu 5, ktorý má deléciu v oblastiach E1 a E3 a nukleovú kyselinu záujmu vloženú do oblasti E1 v mieste delécie.
Nukleová kyselina vložená do oblasti E1 obsahuje konkrétne:
- promótor SRa, promótor SRa obsahuje skorý začiatok replikácie SV40 a časť LTR HTLV1 (zodpovedajúcu oblasti R a časti U5) , nasleduje spojenie 16S SV40 (Takebe a kol., Mol. Celí. Biol. 8 (1988) 466)
- minigén P1A 44 bp (SEQ ID NO: 3)
- polyadenylačné miesto vírusu SV40
Táto nukleová kyselina sa extrahovala z plazmidu pcD-SRaP1A, zodpovedajúceho plazmidu pcD-SRa, v ktorom sa minigén klonoval do miesta EcoRI. Získaný inzert sa následne klonoval v plazmide pAd.RSV-pGal (Strátford-Perricaudet a kol., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) namiesto fragmentu obsahujúceho LTR RSV a gén lacZ.
Takto získaný plazmid pAd-SRa-PlA sa potom použil na tvorbu rekombinantného adenovírusu. Preto sa bunky línie 293 spoločne transfekovali s 5 gg pAd-SRa-PlA a 5 gg DNA adeno vírusového mutanta dl 324 v prítomnosti fosforečnanu vápenatého. Vytvorené rekombinantné adenovírusy sa selektovali purifikáciou z plakov. Po izolácii sa rekombinantný adenovírus amplifikoval v bunkovej línii 293 čím sa získal kultivačný supernatant, ktorý obsahuje nepurifikovaný rekombinantný adenovírus , ktorý má asi 101θ pfu/ml.
Vírusové častice sa potom purifikovali centrifugáciou v gradiente chloridu cézneho podía známych techník (pozri konkrétne Graham a kol., Virology 52 (1973) 456) . Analýza vírusovej DNA štiepením s reštrikčným enzýmom ' EcoRI dokázala prítomnosť inzertu v genóme. Adenovírusy sa môžu uchovávať pri 80 ’C v 10% glycerole.
Príklad 2: Konštrukcia defektného rekombinantného adenovírusu, ktorý kóduje fragment antigénu Mage-1
Tento príklad opisuje konštrukciu defektného rekombinantného adenovírusu podía vynálezu, ktorý kóduje fragment antigénu Mage-1. Adenovírus nesie sekvenciu SEQ ID NO: 1, ktorá kóduje fragment nesúci antigénový nonapeptid Mage-1. Konštruovaný adenovírus je adenovírus sérotypu 5, ktorý má deléciu v oblastiach E1 a E3 a nukleovú kyselinu záujmu vloženú do oblasti E1 v mieste delécie.
Nukleová kyselina vložená v oblasti E1 obsahuje konkrétne:
- promótor SRa, promótor SRa obsahuje skorý začiatok replikácie SV40 a časť LTR HTLV1 (zodpovedajúcu oblasti R a časti U5) , nasleduje spojenie 16S SV40 (Takebe a kol., Mol. Celí. Biol. 8 (1988) 466)
- minigén MAGE-1 116 bp (SEQ ID NO: 1), tento fragment sa získal pomocou PCR z úplného génu Mage-1 a obsahuje ATG v polohe 15, terminačný kodón v polohe 121 a časť exónu 3 génu Mage-1, obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu nonapeptidu (27 bp), ktorý je vyjadrený molekulou HLA.A1 cytotoxických T lymfocytov (obrázok 2)
- polyadenylačné miesto vírusu SV40
Táto nukleová kyselina sa extrahovala z plazmidu pcD-SRaMage-1, zodpovedajúceho plazmidu pcD-SRa, v ktorom sa minigén Mage-1 klonoval do miesta EcoRI. Získaný inzert sa potom klonoval v plazmide pAd.RSV-pGal (Stratford-Perricaudet a kol., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) namiesto fragmentu obsahujúceho LTR RSV a gén lacZ (obrázok 3).
Takto získaný plazmid pAd-SRa-MAGE-1 sa , potom použil na tvorbu rekombinantného adenovírusu. Preto sa bunky línie 293 spoločne transfekovali s plazmidom pAd-SRa-MAGE-1 a DNA mutantného adenovírusu dl 324 v prítomnosti fosforečnanu vápenatého. Vytvorené rekombinantné adenovírusy sa selektovali purifikáciou z plakov. Po izolácii sa rekombinantný adenovírus amplifikoval v bunkovej línii 293 čím sa získal supernatant, ktorý obsahuje nepurifikovaný rekombinantný adenovírus, ktorý má asi 1O10 pfu/ml.
Vírusové častice sa potom purifikovali centrifugáciou v gradiente chloridu cézneho podlá známych techník (pozri konkrétne Graham a kol., Virology 52 (1973) 456). Analýza vírusovej DNA štiepením s reštrikčným enzýmom EcoRI dokázala prítomnosť inzertu v genóme. Adenovírusy sa môžu uchovávať pri 80 ’C v 10% glycerole.
Príklad 3: Konštrukcia defektného rekombinantného adenovírusu, ktorý kóduje fragment antigénu Mage-3
Tento príklad opisuje konštrukciu defektného rekombinantného adenovírusu podlá vynálezu, ktorý kóduje fragment antigénu Mage-3. Adenovírus nesie sekvenciu SEQ ID NO: 2, ktorá kóduje fragment nesúci antigénový nonapeptid Mage-3. Skonštruovaný adenovírus je adenovírus sérotypu 5, ktorý má deléciu v oblastiach E1 a E3, nukleovú kyselinu záujmu, ktorá je vložená v oblasti E1 v mieste delécie.
Nukleová kyselina vložená v oblasti E1 obsahuje konkrétne:
- promótor SRa, promótor SRa obsahuje skorý začiatok replikácie SV40 a časť LTR HTLV1 (zodpovedajúcu oblasti R a časti U5), nasleduje spojenie 16S SV40 (Takebe a kol., Mol. Celí. Biol. 8 (1988) 466)
- minigén MAGE-3 44 bp (SEQ ID NO: 2), tento fragment sa získal pomocou PCR z úplného génu Mage-3 a obsahuje ATG v polohe 12, terminačný kodón v polohe 44 a sekvenciu zodpovedajúcu nonapeptidu (27 bp), ktorý je vyjadrený molekulou HLA.A1 cytotoxických T lymfocytov (obrázok 2)
- polyadenylačné miesto vírusu SV40
Táto nukleová kyselina sa extrahovala z plazmidu pcD-SRaMage-3, zodpovedajúceho plazmidu pcD-SRa, v ktorom sa minigén
Mage-2 klonoval do miesta EcoRI. Získaný inzert sa potom klonoval v plazmide pAd.RSV-pGal namiesto fragmentu obsahujúceho LTR RSV a gén LacZ (obrázok 3).
Takto získaný plazmid pAd-SRa-Mage-3 sa potom použil na tvorbu rekombinantného adenovírusu. Preto sa bunky línie 293 spoločne transfekovali s plazmidom pAd-SRa-Mage-3 s DNA mutantného adenovírusu dl 324 v prítomnosti fosforečnanu vápenatého. Vytvorené rekombinantné adenovírusy sa selektovali purifikáciou z plakov. Po izolácii rekombinantného adenovírusu sa amplifikoval v bunkovej línii 293 čím sa získal kultivačný supernatant, ktorý obsahuje nepurifikovaný rekombinantný adenovírus, ktorý má okolo 1O10 pfu/ml.
Vírusové častice sa potom purifikovali centrifugáciou v gradiente chloridu cézneho podlá známych techník (pozri konkrétne Graham a kol., Virology 52 (1973) 456). Analýza vírusovej DNA štiepením s reštrikčným enzýmom EcoRI dokázala prítomnosť inzertu v genóme. Adenovírusy sa môžu uchovávať pri -80 °C v 10% glycerole.
Príklad 4: Funkčná charakteristika adenovírusov podlá vynálezu
Tento príklad ukazuje, že vírusy podľa vynálezu sú schopné indukovať expresiu génu záujmu kódujúceho proteín, ktorého degradácia vedie ku expresiu antigénneho peptidu na povrchu cieľovej bunky.
Expresia minigénu MAGE-1 a prítomnosť peptidu sa dokázali v bunkách Ad-Mage (4.1.) určením špecifickej lýzy (4.2.) a stimulácie produkcie TNF (4.3).
4.1. Bunková línia
Bunkové línie sa identifikovali nasledovným spôsobom:
- C1R.A1: línia B lymfocytov transformovaná s EBV (Storkus, W. J., Howell, D. N., Salter, R. D., Dawson, J. R., Creswell, P.: NK susceptibility varies inversely with target celí class I HLA antigéne expression. J. Immunol. 138: 1675-1659, 1987) a transfekovaná s génom HLA.A1 klonovaným v plazmide pHEBO
Gerl III β EF“: Bunky ľudského melanómu HLA.Al imunoselektované na stratu antigénu MAGE-1 (označené Gerlach E- v tabuľkách 1 a 2)
Tieto dve línie teda exprimujú molekulu HLA.Al, ale neexprimujú antigén MAGE-1.
4.2. Určenie špecifickej lýzy
Tento príklad ukazuje existenciu špecifickej lýzy buniek špecifickým klonom CTL antigénu (test uvoľňovania rádioaktívneho chrómu). Preto sa bunky, uvedené v 4.1., infikovali adenovírusom Ad-Mage-1 (príklad 2) alebo s kontrolným adenovírusom (Ad-pGal) pri niekoľkonásobnej infekcii pfu/bunku. Infikované bunky sa označili chrómom 51, inkubovali sa 4 hodiny v pomere 1000 buniek/jamka so špecifickým CTL (kloň 82:30) v rôznych pomeroch účinné bunky/cieľové bunky (E/T). Stanovilo sa percento lýzy. Získané výsledky sú uvedené v Tabuľke 1. Jasne ukazujú, že bunky infikované vírusom podľa vynálezu vyjadrujú citlivosť vzhľadom na bunky priamo transfekovaným antigénom Mage-1, tým ukazuje terapeutickú účinnosť vektorov vynálezu.
Tieto výsledky jasne ukazujú, že vírusy podľa vynálezu sú schopné dodať bunkám veľkú citlivosť k lýze špecifickým CTL.
4.3. Stimulácia produkcie TNF
V tomto prípade sa určila schopnosť buniek Gerl III β E“F” stimulovať produkciu TNF rovnakým klonom CTL. Preto sa bunky Gerl III β E'F infikovali s adenovírusom Ad-Mage-1 (príklad 2) alebo s kontrolným adenovírusom (Αά-βσβΐ) pri niekoľkonásobnej infekcii 50 až 100 pfu/bunku a potom sa inkubovali s klonom CTL. Po 24 hodinách sa meralo množstvo TNF prítomné v supernatante stanovením ich cytotoxicity na línii citlivej ku TNF (línia WEHI-164-13) . Životaschopnosť buniek sa merala kolorimetrickým testom (MTT). Výsledky sú vyjadrené v optickej denzite v množstve TNF (pg/ml). Tento test sa neuskutočňoval na bunkách C1R.A1, pretože prirodzene vylučujú TNF. Kontrolné bunky Gerlach E+ sú melanómové bunky melanómu exprimujúce Mage-1 a HLA.A1.
Tieto získané výsledky sú uvedené v tabulke 2. Jasne ukazujú, že bunky infikované vírusom podlá vynálezu indukujú produkciu TNF CTL a to jasne potvrdzuje biologické a terapeutické vlastnosti vírusov podlá vynálezu.
Príklad 5: Aktivita in vivo vírusov P1A vynálezu
Príklad 4 ukázal, že in vitro alebo ex vivo, bunky infikované adenovírusom podľa vynálezu sú dobre rozpoznané v teste TNF a lyzované v teste uvoľňovania rádioaktívneho chrómu špecifickou CTL.
Tento príklad ukazujem že in vivo sú adenovírusy podlá vynálezu schopné vytvoriť špecifickú odpoveď CTL. Tento príklad ukazuje, že dve injekcie 109 vírusových častíc (pfu) do myší DBA/2 v týždennom intervale vytvárajúcom u časti z nich silnú špecifickú odpoveď.
Uskutočnili sa dve pokusné série. Postup obidvoch sérií je uvedený na obrázku 4 a 5. V prvej pokusnej sérii (pozri obrázok
4) sa vírusové častice podávali jednej polovici v peritoneálnej kavite a druhej polovici sa podávali pod kožu (v štyroch miestach). V druhej pokusnej sérii (pozri obrázok 5) sa vírusové častice podávali podkožné injekciami, intraperitoneálne, intranazálne a intratracheálne. Tieto dve série pokusov sa uskutočnili podía nasledovného postupu. Myši sa usmrtili 15 dní po druhej sérii injekcií adenovírusom. Splenocyty týchto myší sa skontaktovali s antigénom P815A prostredníctvom buniek L1210A1 (syngenická leukémia transfekovaná s génom PXA mastocytómu P815) a ožiarili v osemdennej perióde. Ako príklad tejto kultivácie sa môže uviesť zmes tumor-lymfocyty (MLTC) , lymfocyty riadené proti antigénu P815A, ktoré sa proliferovali a diferencovali v zabi j ačs kých T lymfocytoch. Tieto sa kontaktujú s bunkami značenými rádioaktívnym chrómom. Ide o bunky P511, variant azaguanínu, ktorý je rezistentný voči myšacím mastocytom, ktorý stratil antigén A. Tento posledný bude pre kontrolu negatívny. Aby sa vylúčila každá možnosť nešpecifickej reakcie, cielové bunky kontaktované so synergickými bunkami (L1.210), ktoré nesú na svojom povrchu antigén stimulačných buniek v MTLC, okrem antigénu A P815, sa označili s rádioaktívnym chrómom
Získané výsledky v prvej pokusnej sérii, vyjadrené v percentách špecifickej lýzy, sú uvedené v tabulkách 3A a 3B.
Získané výsledky v druhej pokusnej sérii, vyjadrené percentách špecifickej lýzy, sú uvedené v tabulkách 4A a 4B.
V obidvoch prípadoch uvedené výsledky ukazujú úrovne lýzy v pomerných priemerných hodnotách výkonných/cielových (E/T) v závislosti od myši. CTL sa získali z akéhokolvek miesta injikovania adenovírusu (tabulka 4A A 4B) . Výsledky jasne ukazujú, že adenovírusy podía vynálezu sú schopné vytvoriť in vivo imunitu proti bunkám, ktoré nesú nádorový antigén.
G
N
Φ rH
ΊΤ3
C >t >
C a
> _ ~ O <3 o ·* o •C c Φ T Ό m <
- sP tí· m o o
O m *3- O o n — r-' — — ks (0 rH
Ό
O
SX
Φ θ'
Φ
S i
ΛΖ
Φ •H c
G
JO
Ä υ
'>
ť (0 >
o λζ •H
MH
G •H
J
H
U >1
N *>s C —. >
j= o «c 5 — c Ο ’T Ό ow<
->.
c o
^z <2 w
C « rr “ Q £ « U Í c
o ^z _ «Β « •S O tí — Ό u <
O co ¢3
Zl 1Λ fH — — — SO
O \O O CI θ' so pH O
KS Cl OO 00 —
O o
ks
WW xO
Os — θ'
PHOKSOKSOSOSOfH ρπ ’T ph cs ·—1 rt — -— ph n ph χβ
PH KS χΟ θ' O r- os A* o o n ·— r- os τ m
-m
Φ λ:
u
-rH
MH •H υ
φ a
Xfl
'>>
c
ra
>
0 p·*
jz ó
<3 en
C m
tí r-*
U o
<
n os —> -3- Ίso ks sp TT -rr
en fC 'O s.o o
00 m o
CM O\ KS
Φ •H c
Φ >o
G
O
Λ λ:
ο ο PH rr ρη c ra m
ΟΜ
Ο 3
Ο Ο —1 w
ΡΗ
Λ (0
Η <υ
Έ
X)
X ο
•θ' ε-2
Φ
C c
*ra rr
C o
cx m
fc ra
3 g
E
S c O
3 cx
Tabulka 2: Určenie schopnosti buniek infikovaných s Ad-Mage podľa vynálezu stimulovať produkciu TNF ►4
H
O e
o c
o
E—
Q.
Cl </3
U-l m
o.
o o
o cn •J
Ευ
I
Ε- E- E- E— E—
00 00 oo 00 oo 00
cu o. o. Q. a. Q.
o o o © O ©
II II II II II II
Cl 1/3 1/3 00 Cl
T 00 T F Cl O
©λ O © O O .-H
·» f-f ,-Γ w-* Λ
O
C' >N <0 ta n
C
Í3 «5 a
o.
o
W3 +
<u ta
T3 <
'>»
C ca >
O tc c
+ 1 ω w 1 w 1 w 1 w
x x X x fC
u o Q o O
ja JS cä ca J2
Uf Uf <u ω <5 Uf <D Uf <U
O O O O O
ε .□ •5 .aj
E
X
U
JS <3
O ta cS
O.
©
1/3
O
1/3 >N ca sO o'
O •^r x
o
J8 <3
O o
m či
Ph
J
Ευ ca
Ô
Uf
4-» c
o
Pd
4Z <u
Έ x!
•s t?
Ό1
O
E
Tabulka 3: Určenie imunizácie myši DBA/2 injekciou podlá protokolu č.l, Ad-PIA (tabulka 3A) alebo adenovírusové kontroly, Ad-Qgal (tabulka 3B) o
d
Zj <;
o d
Zj tn $-1
Ή >
O
C
Φ
Ό
Λ
M o
4-1 tí fO tí o
Φ sr>
— d so
-o c
ω
-o
S en +
° d d >-4 _] o d o o o
-<u c
<u o
í o o d d i—* r—»
I—1 hU V d o o o ’T o
d
5Z •H SD >tn CU >1 e
-Φ c
(Ú >
o •H
n (0 (H tí
Λ <0
E-<
ττ V) Q 1/1 o d ό sn m sO sO 00 sO θ' OS d σ> d — Os oo o
O 00 so Os O — d «ZS d d xr so izs rr so vs c-ί oo os sn
Ό — O d so 00 Ό ΤΓ τΓ rj- ~ so
STi TT d d d oo d ττ d d sn
MTD/CW 5A94 tT d
sr d
Vi o 00 o -'r -sr d d
CI
V ddOsosdTrsoddvsTj· so «s — m o) — sovsdTfddooOvsd — dso'srd — dsovsTfd'— so in 00 O Od —· —' •'ú- d o so d sn d oo m co — o d d d oo d — m ~ d - — d m π o\ d -« sn — so ct d d >Ó
ΧΛ
CI d
xJ >ó >ó
κη >CO xo
>s >s
E ε ε
o
2- oj U
OJVOrO — — ^O— 0-0
ΤΓ — cc v ·<τ _ o τ \o
V OJ í
2~SOOl
J ei m n o oo — o m o o 22 o ei ό o x m oi o oj o o
OJ ai +
O
OJ □
OOOOOOOOOOOJOOOOOOOOOOOOO
-o ~ OJ ýj
Tabuľka 3B: Injikované myši rekombinantným adenovírusom Pgal
O
OJ
J
M-j cn <:
o
OJ u
oj o — o o o ’T o
rl. OJ to o o
F“* cu
Ό cu,
OOO — OOOwiOOOOlOOo o
O O ’T 00 o
OOOmOOOOOJOOOOOJ — O O O O Č\ 2 5o — »n οι Tj· oj o Z2 vo m οι oi m tj· r* o oj o oj Ό oo o tfi oj Ti- <*1 'f 00 Ό tn 00 <*> .+· <*>
t'-ejS’^ínoitoOľr^OeirOTí-Sxv-íOJootoľíSSoej m — tj· tj· _ 'τ — >ó ><Λ >>
ε
04 cn
>6 >ó >ó
xn ><ZJ
ε E ε
<u c ε κ ta
c □ ε
.(0 — ε š
c S c
o cú o
o. c o.
(Λ c 03
Tabuľka 4: Určenie imunizácie myši DBA/2 injekciou podľa protokolu č.2, Ad-PIA (tabuľka 4A) alebo adenovírusové kontroly,
Ad-Pgal (tabulka 4B)
Tabulka 4A
E/T P511 P1.204 P511 + st. P511 + st.
L1210 50x1 L1210 50x1
podkožné myš č. 1 490 9 2 0 ' 1
163 5 3 0 0
54 3 1 0 0
18 3 0 0 0
8 2 1 0 0
2 0 0 0 0
myš č. 2 50 5 0 0 0
27 3 0 0 0
9 5 0 3 1
3 6 0 0 8
1 4 0 1 0
0, 3 2 0 0 0
intraperitoneálne
myš č. 1 258 51 9 48 0
85 43 10 37 0
28 43 8 27 0
9 38 3 12 1
3 18 2 8 0
1 7 0 1 0
myš č. 2 295 9 4 9 2
88 8 6 2 0
33 7 4 2 0
11 3 2 1 0
4 1 2 0 0
1 0 0 0 1
myš č. 3 400 68 12 76 0
133 77 12 82 0
44 88 14 73 0
15 14 7 66 0
6 10 6 30 0
3 10 1 14 0
myš č. 4 185 8 2 3 0
5 3 0 3 0
57 10 2 3 0
8 4 1 2 0
2 3 0 0 0
0,8 2 0 2 0
Intratracheálne myš č.
myš č.
myš č.
intranazálne myš č.
myš č.
E/T P511 PI.204 P511 + st. L1210 50X1 P511 + st. L1210 50X1
440 67 11 50 3
247 78 13 52 2
49 64 6 49 0
18 34 8 23 0
6 31 7 9 0
2 14 0 2 0
410 6 7 3 2
137 6 7 3 1
45 6 4 0 1
15 5 2 2 0
9 1 3 0 0
2 1 2 0 2
344 8 2 3 1
115 4 0 2 0
38 8 0 1 0
13 8 0 0 0
4 4 1 0 0
1 1 0 0 0
265 80 9 52 0
85 46 8 47 0
28 42 7 21 0
9 33 3 9 0
3 17 2 2 0
1 5 2 1 0
230 2 0 1 0
77 4 0 3 0
25 2 0 0 0
8 2 0 0 0
3 1 1 0 0
1 1 3 0 0
210 13 2 11 0
70 10 0 7 0
23 6 0 2 1
3 1 0 0 0
3 2 0 0 0
1 2 0 0 0
430 58 0 52 6
160 52 0 58 1
53 84 4 65 0
18 84 2 52 0
6 51 2 33 0
2 52 D 20 0
205 4 0 0 2
69 4 0 0 0
83 1 0 0 0
8 5 0 0 0
2 3 0 0 0
0, 8 2 0 0 0
myš č.
myš č.
E/T P511 PI . 204 P511 + st. L1210 50X1 P511 + st. L1210 50X1
250 1 0 0 0
83 0 0 0 0
28 1 0 0 0
9 1 0 0 0
3 1 0 0 0
1 1 0 0 0
280 2 0 1 0
87 8 1 0 0
29 1 0 0 0
10 2 0 1 0
3 0 0 0 0
1 1 1 0 0
240 3 0 0 2
80 1 0 0 0
27 1 0 0 1
9 1 1 0 0
3 1 0 0 0
1 1 1 1 0
125 0 0 0 0
42 0 0 0 0
14 0 0 0 0
5 1 0 0 0
2 0 0 0 1
0, 6 0 0 0 0
Tabuľka 4B:
E/T P511
podkožné myš č. 1 300 0
100 0
33 0
11 0
4 0
1 0
myš č. 2 230 4
77 1
25 1
8 0
3 0
1 0
intraperitoneálne
myš č. 1 220 1
73 0
24 1
8 0
3 0
1 0
myš č. 2 410 9
137 1
45 0
15 0
5 0
2 0
intratracheálne
myš č. 1 310 0
103 0
34 0
11 0
4 0
1 0
myš č. 2 270 2
90 1
30 0
10 0
3 1
1 1
intranazálne
myš č. 1 400 0
18 1
5 0
2 0
PI.204 P511 + st. L1210 50x1 PI.204 + st
L1210 50X1
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 1
0 0 0
3 0 1
1 0 0
4 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
2 1 0
0 0 1
1 1 2
0 0 0
0 0 1
0 0 0
1 0 3
1 0 2
0 0 0
1 0 0
1 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
1 0 1
0 0 1
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 1
0 0 0
0 0 0
myš č.
P511
PI.204 P511 + st. PI.204 + st
L1210 50X1 L1210 50X1
E/T
230 3 0 0 1
77 2 0 0 0
25 0 0 0 0
3 0 0 0 0
1 1 0 0 0
spont 106 127 122 110
max 1 041 971 957 988
spont /max 10% 13% 13% 12%
Zoznam sekvencií (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 126 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: dve (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 1:
TTGAATTCGC CGCCATGGAG TCCTTGCAGC TGGTCTTTGG CATTGACGTG AAGGAAGCAG ACCCCACCGG CCACTCCTAT GTCCTTGTCA CCTGCCTAGG TCTCTCCTAT GATGGCTAGA ATTCTT
100
126 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 2: i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 44 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: dve (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 2:
AATTCGCCGC CATGGAAGTG GACCCCATCG GCCACTTGTA CTAG 44 (1) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 3: i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 44 bázových párov (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: dve (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (ix) opis sekvencie SEQ ID NO: 3:
AATTCGCCGC CATGCTGCCT TATCTAGGGT GGCTGGTCTT CTAG 44

Claims (19)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Defektný rekombinantný adenovírus obsahujúci vo svojom genóme zahrnutú nukleovú kyselinu kódujúcu proteín alebo špecifický peptid nádoru, schopný indukovať imunitnú ochranu a deštrukciu zodpovedajúcich nádorových buniek imunitným systémom.
  2. 2. Defektný rekombinantný adenovírus podía nároku 1, v y z - . načujúci sa tým, že obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu proteín alebo špecifický peptid ludského nádoru.
  3. 3. Defektný rekombinantný adenovírus podía nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina vložená do genómu kóduje celok alebo časť špecifického antigénu melanómu.
  4. 4. Defektný rekombinantný adenovírus podía nároku 3, vyznačujúci sa tým, že ide o nukleovú kyselinu kódujúcu fragment špecifického antigénu ludského melanómu, ktorý obsahuje časť vyjadrenú CTL v spojení s molekulami CMJ-I.
  5. 5. Defektný rekombinantný adenovírus podía jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina kóduje proteín, alebo peptid z neho odvodený, vybraný z proteínov Mage-1, Mage-3, Bage, Rage a Gage.
  6. 6. Defektný rekombinantný adenovírus vo svojom genóme obsahujúci nukleovú kyselinu, ktorá kóduje peptid proteínu Mage-1 alebo Mage-3 obsahujúci časť vyjadrenú CTL.
  7. 7. Defektný rekombinantný adenovírus obsahujúci sekvenciu SEQ ID NO: 1 vloženú vo svojom genóme.
  8. 8. Defektný rekombinantný adenovírus obsahujúci obsiahnutú medzi zvyškami 55 až 85 sekvencie SEQ vloženú vo svojom genóme.
    sekvenciu
    ID NO: 1
  9. 9. Defektný rekombinantný adenovírus obsahujúci sekvenciu SEQ ID NO: 2 vloženú vo svojom genóme.
  10. 10. Adenovírus podlá jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že je vybraný, z ľudských sérotypov Ad2 a Ad5.
  11. 11. Adenovírus podľa jedného z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa t ý m, že je vybraný zo psích sérotypov.
  12. 12. Adenovírus podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že obsahuje deléciu v oblasti El.
  13. 13. Adenovírus podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že okrem iného obsahuje deléciu v oblasti El.
  14. 14. Adenovírus podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina je vložená do oblasti El alebo E3 alebo E4.
  15. 15. Farmaceutická kompozícia obsahujúca aspoň adenovírus podľa jedného z predchádzajúcich nárokov.
  16. 16. Použitie adenovírusu podľa jedného z predchádzajúcich nárokov 1 až 14 na produkciu in vitro alebo ex vivo špecifických cytotoxických lymfocytov ľudských nádorov.
  17. 17. Kompozícia obsahujúca bunky infikované defektným rekombinantným adenovírusom podľa jedného z predchádzajúcich nárokov 1 až 14.
  18. 18. Kompozícia podlá nároku 17, vyznačujúca sa tým, že obsahuje bunky nesúce antigén (APC) infikované defektným rekombinantným adenovírusom podlá jedného predchádzajúcich nárokov 1 až 14.
  19. 19. Postup prípravy špecifických cytotoxických T buniek nádorového antigénu obsahujúci skontaktovanie prekurzora CTL buniek s populáciou buniek infikovaných vírusom podlá jedného z nárokov 1 až 14.
SK1246-98A 1996-03-14 1997-03-12 Recombinant adenoviral vectors for human tumour gene therapy SK124698A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9603207A FR2746110B1 (fr) 1996-03-14 1996-03-14 Methode de traitement par therapie genique des tumeurs humaines et virus recombinants correspondants
PCT/FR1997/000435 WO1997034009A1 (fr) 1996-03-14 1997-03-12 Vecteurs adenoviraux recombinants pour la therapie genique des tumeurs humaines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK124698A3 true SK124698A3 (en) 1999-05-07

Family

ID=9490181

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1246-98A SK124698A3 (en) 1996-03-14 1997-03-12 Recombinant adenoviral vectors for human tumour gene therapy

Country Status (19)

Country Link
US (1) US20030082150A1 (sk)
EP (1) EP0889969B1 (sk)
JP (1) JP2000507229A (sk)
KR (1) KR19990087718A (sk)
CN (1) CN1218512A (sk)
AT (1) ATE309382T1 (sk)
AU (1) AU732288B2 (sk)
BR (1) BR9707994A (sk)
CA (1) CA2248612A1 (sk)
CZ (1) CZ295967B6 (sk)
DE (1) DE69734574T2 (sk)
DK (1) DK0889969T3 (sk)
ES (1) ES2252779T3 (sk)
FR (1) FR2746110B1 (sk)
HU (1) HUP9902150A3 (sk)
IL (1) IL126152A0 (sk)
NO (1) NO984052L (sk)
SK (1) SK124698A3 (sk)
WO (1) WO1997034009A1 (sk)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4668797A (en) * 1996-10-07 1998-05-05 Ludwig Institute For Cancer Research Replication-defective adenoviruses for cancer immunotherapy
AU1013601A (en) 1999-10-22 2001-05-08 Aventis Pasteur Limited Method of inducing and/or enhancing an immune response to tumor antigens
CA2408328C (en) * 2000-05-10 2012-04-17 Aventis Pasteur Limited Immunogenic polypeptides encoded by mage minigenes and uses thereof
EP1383513B1 (en) * 2001-03-27 2010-10-20 New York University Tumor therapy with sindbis virus-based vectors
US7786278B2 (en) 2002-04-09 2010-08-31 Sanofi Pasteur Limited Modified CEA nucleic acid and expression vectors
EP1497412A4 (en) * 2002-04-30 2006-11-22 Avior Therapeutics Inc ADENOVIRUS VECTORS FOR IMMUNOTHERAPY
CN1327000C (zh) * 2002-09-06 2007-07-18 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 靶向黑色素瘤的可复制性腺病毒穿梭载体及腺病毒
US20040223949A1 (en) * 2002-10-22 2004-11-11 Sunnybrook And Women's College Health Sciences Center Aventis Pasteur, Ltd. Vaccines using high-dose cytokines
JP4668919B2 (ja) * 2003-10-08 2011-04-13 サノフィ パストゥール インコーポレイテッド 修飾ｃｅａ／ｂ７ベクター
WO2014153204A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Salk Institute For Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
WO2017147265A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
EP3390645B1 (en) 2016-02-23 2022-09-14 Salk Institute for Biological Studies Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics
EP3532082A4 (en) 2016-12-12 2020-08-26 Salk Institute for Biological Studies SYNTHETIC ADENOVIRUS TUMOR TARGETING AND THEIR USES

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5342774A (en) * 1991-05-23 1994-08-30 Ludwig Institute For Cancer Research Nucleotide sequence encoding the tumor rejection antigen precursor, MAGE-1
US6235525B1 (en) * 1991-05-23 2001-05-22 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof
US5620886A (en) * 1993-03-18 1997-04-15 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2
EP0667912B1 (fr) * 1993-07-13 2008-07-02 Centelion Vecteurs adenoviraux defectifs et utilisation en therapie genique

Also Published As

Publication number Publication date
FR2746110B1 (fr) 1998-04-17
WO1997034009A1 (fr) 1997-09-18
EP0889969B1 (fr) 2005-11-09
EP0889969A1 (fr) 1999-01-13
CZ295967B6 (cs) 2005-12-14
ATE309382T1 (de) 2005-11-15
US20030082150A1 (en) 2003-05-01
DK0889969T3 (da) 2006-03-27
FR2746110A1 (fr) 1997-09-19
DE69734574T2 (de) 2006-07-13
HUP9902150A2 (hu) 1999-11-29
AU732288B2 (en) 2001-04-12
CZ291598A3 (cs) 1998-12-16
CN1218512A (zh) 1999-06-02
IL126152A0 (en) 1999-05-09
KR19990087718A (ko) 1999-12-27
BR9707994A (pt) 1999-07-27
JP2000507229A (ja) 2000-06-13
NO984052D0 (no) 1998-09-03
CA2248612A1 (fr) 1997-09-18
HUP9902150A3 (en) 2000-12-28
AU2164197A (en) 1997-10-01
ES2252779T3 (es) 2006-05-16
DE69734574D1 (de) 2005-12-15
NO984052L (no) 1998-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK124698A3 (en) Recombinant adenoviral vectors for human tumour gene therapy
RU2234942C2 (ru) Выделенный опухолевый полипептид предстательной железы и кодирующий его полинуклеотид
WO1998046769A1 (en) Composition and method for inducing an immune response against tumour-related antigens
KR20000071226A (ko) 간세포 암의 예방 및 치료 방법
US20070104685A1 (en) Synthetic gene encoding human carcinoembryonic antigen and uses thereof
KR20080098585A (ko) 엡스타인-바르 바이러스 관련 질환의 치료
CN1526012A (zh) 一种高效表达抗癌基因的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒及其用途
NZ544543A (en) Synthetic gene encoding human epidermal growth factor 2/neu antigen and uses thereof
US7282365B2 (en) Rhesus HER2/neu, nucleotides encoding same, and uses thereof
US20020177547A1 (en) Pharmaceutical compositions for treating or preventing cancer
MXPA98007290A (en) Recombinant adenoviral vectors for the genuine therapy of the huma tumors
US20060286114A1 (en) Synthetic gene encoding rhesus monkey carcinoembryonic antigen and uses thereof
EP1597370B1 (en) Rhesus carcino embryonic antigen, nucleotides encoding same, and uses thereof
JP4459060B2 (ja) ポリヌクレオチドからなるワクチン
ES2247594T3 (es) Proteina antivirica.
CN116948005A (zh) 一种病毒递送的新型细胞因子及在肿瘤治疗中的应用
ZA200508013B (en) Synthetic gene encoding human carcinoembryonic antigen and use thereof
WO2004015098A2 (en) Rhesus epithelial cell adhesion molecule, nucleic acid encoding the same, and uses thereof
JP2002369685A (ja) アポトーシス遺伝子１のヒトインヒビター