KR20000071226A - 간세포 암의 예방 및 치료 방법 - Google Patents

간세포 암의 예방 및 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알파페토프로테인 분자의 일부 이상에 대한 포유동물의 면역 반응을 발생시킴으로써, 알파페토프로테인 분자의 일부 이상을 표면 상에 갖는, 포유동물의 간세포 암을 포함하는 암을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 알파페토프로텐인의 일부 이상을 포함하거나, 면역 반응을 강화시키기 위해 하나 이상의 아미노산이 천연 아미노산 대신 치환되어 있는 알파페토프로테인 분자의 일부 이상을 포함하는, 간세포 암을 포함하는 암의 예방 또는 치료용으로 사용하기 위해, 알파페토프로테인 분자의 일부 이상에 대한 포유동물의 면역 반응을 발생시키는 조성물에 관한 것이다.

Description

간세포 암의 예방 및 치료 방법 {PREVENTION AND TREATMENT OF HEPATOCELLULAR CANCER}
일차 간암은 세계적으로 암 사망의 주요 병인이다. 간세포 암(HCC)은 연간 약 1,200,000명의 환자를 발병시키는 일차 간암의 가장 통상적인 유형이다. 동남 아시아 및 남아프리카와 같은 일부 지역에서, 간세포 암은 암의 가장 통상적인 유형 중 하나이다. 질환의 높은 빈도수는 이들 지역에서 간염의 높은 발병율에 관련되는 것으로 보인다.
간세포 암의 치료는 현재 비전이성 질환에 걸린 환자로 제한되고, 간이 이식되거나 이식되지 않은 종양의 외과적 절제를 포함한다. 그러나, 외과적 절제 및 이식은 절제 후의 재발성 때문에 대부분의 종양을 치료하지 못한다. 지금까지, 화학치료제에 의한 치료는 거의 비효과적이었다. 지난 20년 동안 간세포 암의 치료 분야에서는 상당한 진전이 없었다.
따라서, 간세포 암의 효과적인 치료방법이 여전히 요구되고 있다. 치료방법은 이상적으로는, 질환의 가장 높은 발병율을 가진 후진국에서 사용하기에 적합해야 한다. 또한, 이러한 치료방법은 절제할 수 없는 종양 및 전이성 질환에 걸린 환자에게 사용하기에 적합해야 한다.
본 발명은 간세포 암의 예방 및 치료에 관한 것이다.
도 1은 사람 AFP49 펩티드를 사용하여 생성된 CTL의 상대적 세포독성을 보여주는 막대 그래프이다.
도 2는 펩티드 표적물 및 AFP 표적물 둘 모두에 대해 검정된 정상 HLA A2.1 도우너로부터의 펩티드-펄스화 PBMC로부터 생성된 CTL의 표준 크롬 방출 검정에 대한 표적물에 대한 비율 특이적 용해율을 보여주는 막대 그래프이다.
도 3은 쥐과동물 AFP로 면역된 마우스(□)와 면역되지 않은 마우스(●)에 대해, mAFP-포지티드 쥐과동물 종양 세포주인 BWIC3의 종양 항원투여 후의 일수에 대한 평균 종양 부피의 플롯이다.
도 4는 쥐과동물 AFP로 면역된 마우스(□)와 면역되지 않은 마우스(●)에 대해, mAFP-생성 쥐과동물 종양 세포주인 EL4(선조)의 종양 항원투여 후의 일수에 대한 평균 종양 부피의 플롯이다.
도 5는 쥐과동물 AFP로 면역된 마우스(□)와 면역되지 않은 마우스(●)에 대해, mAFP-생성 쥐과동물 종양 세포주인 EL4(AFP)의 종양 항원투여 후의 일수에 대한 평균 종양 부피의 플롯이다.
도 6은 마우스 AFP-AdVShuttle 벡터를 새로 함유하는 발현 플라스미드를 사용하여 플라스미드 DNA로 면역된 마우스(●, ■, ◆)와 면역되지 않은 마우스(■,▼)에 대해, AFP-발현 벡터로 안정하게 형질전환시킨 FSA C3H 백그라운드 섬유육종 세포 또는 신생 발현 벡터만으로 안정하게 형질전환시킨 FSA C3H 백그라운드 섬유육종 세포의 종양 항원투여 후의 일수에 대한 평균 종양 부피의 플롯이다.
도 7은 마우스 AFP 유전자를 합성시키는 플라스미드 벡터로 면역된 마우스(●)와 면역되지 않은 마우스(■)에 대해, BWIC3의 종양 항원투여 후의 일수에 대한 평균 종양 직경의 플롯이다.
도 8은 마우스 AFP 유전자를 합성시키는 플라스미드 벡터로 면역된 마우스(▲, ◆, ▼)와 면역되지 않은 마우스(●, ■)에 대해, BWIC의 종양 항원투여 후의 일수에 대한 평균 종양 직경의 플롯이다.
도 9는 다양한 대조군인 레인 2, 3, 8 뭉 9와 비교하여, 다양한 다중 감염(MOI) 레인 4-7에서 AdVmAFP로 형질도입시킨 쥐과동물 DC로부터 단리된 mRNA의 RT-PCR 분석을 나타내는 도면이다.
도 10은 AdVmAFP 형질도입 수상 세포로 감염된 마우스(■), 다양한 대조군 물질로 감염된 마우스(▲, ▼) 및 면역되지 않은 마우스(●)에 대해, mAFP-생성 쥐과동물 종양 세포주인 EL4(AFP)의 종양 항원투여 후의 일수에 대한 평균 종양 부피의 플롯이다.
도 11은 AdVmAFP 형질도입 수상 세포로 감염된 마우스(■)와 면역되지 않은 마우스(●)에 대해, mAFP-생성 쥐과동물 종양 세포주인 BWIC3의 종양 항원투여 후의 일수에 대한 평균 종양 부피의 플롯이다.
발명의 요약
본 발명의 한 양태에 따르면, 사람을 포함하는 포유동물의 간세포 암과 같은 암을 예방하거나 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 알파페토프로테인 분자의 아미노산 서열의 적어도 일부에 대한 포유동물의 면역반응을 발생시키는 단계를 포함한다.
면역반응을 발생시키는 단계는 알파페토프로테인 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하는 펩티드를 포함하는 하나 이상의 조성물, 또는 하나 이상의 아미노산으로 치환된 알파페토프로테인 아미노산의 일부 이상을 포함하는 펩티드를 포함하는 하나 이상의 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 면역반응을 발생시키는 단계는 또한 알파페토프로테인 분자에 대한 cDNA 서열의 일부 이상을 포함하는 하나 이상의 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 면역반응을 발생시키는 단계는 알파페토프로테인 cDNA를 발현시키는 재조합 벡터로 형질도입된 면역계 세포를 포함하는 하나 이상의 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 암을 치료하기 위해 사람을 면역시키기 위한 조성물이 제공된다. 조성물은 AFP5, AFP7, AFP13, AFP14, AFP18, AFP22, AFP23, AFP28 AFP38, AFP39, AFP45, AFP49, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3으로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 및 다른 특징, 양태 및 장점은 하기의 상세한 설명, 첨부한 청구의범위 및 첨부 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 알파페토프로테인 분자의 일부 이상에 대한 포유동물의 면역반응을 발생시킴으로써, 알파페토프로테인 분자의 일부 이상을 표면상에 갖는 사람과 같은 포유동물의 간세포 암을 포함하는 암을 예방하거나 치료하기 위한 방법이 제공된다. 이 방법은 암에 걸린 포유동물을 면역시키거나 유전적으로 조작하여 암세포의 표면 상에 존재하는 알파페토프로테인 분자의 일부 이상에 대한 면역반응을 발생시키는 것을 포함한다. 영향받은 포유동물의 면역계는 표면 마아커를 갖는 암세포를 파괴하여, 임상적 암을 예방하거나, 확정된 암을 치료하게 된다.
사람 간세포 암세포의 대부분은 출생시까지 태아 간세포에 의해 정상적으로 생성되는 609 아미노산 잔기 단백질인 사람 알파페토프로테인(hAFP) (SEQ ID NO:1)을 합성시킨다. 간세포 암세포는 알파페토프로테인 분자의 일부 이상을 표면상에 나타내려는 경향이 있다. 간세포 암에서의 알파페토프로테인의 존재는 스크리닝 및 진단을 위한 마아커를 사용하였다.
알파페토프로테인은 면역계의 발달 동안 정상적으로 존재하기 때문에, 자연적으로, 면역계가 단백질에 면역적으로 반응하기 위한 능력을 보유하지 않음이 가정된다. 본 발명의 한 양태는 포유동물의 면역계가 외인성 단백질로서 알파페토프로테인에 반응하고, 외인성 세포로서 알파페토프로테인 분자의 일부 이상을 표면상에 갖는 세포에 반응할 수 있다는 발견을 포함한다. 따라서, 이러한 면역계의 발생은 간세포 암을 예방하고, 포유동물 면역계로 하여금 간세포 암세포를 파괴하게 하여 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 알파페토프로테인에 대한 면역화는 알파페토프로테인 서열의 일부 이상을 기제로 하는 합성 펩티드를 포함하는 알파페토프로테인 서열의 일부 이상을 포함하는 합성 펩티드에 의한 면역화를 포함하는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있지만, 알파페토프로테인에 대한 cDNA 서열의 일부 이상에 의한 치환성 또는 다른 변형된 면역화를 가져서, 적합한 면역계 세포에 대한 알파페토프로테인의 일부 이상의 생성 및 제공, 포유동물 체내로의 일반적으로 조작된 항원 제공 세포의 도입, 및 알파페토프로테인 분자의 일부 이상의 발현을 야기시키기 위한 유전자 치료 바이러스 벡터의 사용을 야기시킨다. 이러한 면역화의 목적은 알파페토프로테인 펩티드 특이적 T 림프구를 활성화시켜서 이들 표면 마아커를 갖는 세포에 대한 면역반응을 발생시키고, 바람직하게는 세포독성 T 림프구를 활성화시켜서 간세포 암세포를 파괴시키는 것이다.
1) 사람의 면역반응을 발생시키는 사람 알파페토프로테인 펩티드의 결정 및 생성
사람 알파페토프로테인 분자의 임의의 부분이 사람의 면역반응을 발생시킬 수 있는 지를 결정하기 위해, 전체 사람 알파페토프로테인(hAFP) 분자로부터 유도된 일련의 펩티드(hAFP)가, 클라스 I-제한 펩티드로서 이들이 항종양 반응을 발생시킬 수 있고, 세포독성 림프구(CTL)에 대한 표적 분자로서 사용될 수 있는 지를 결정하기 위해 시험된다. 잠재적으로, hAFP로부터 유도되는 면역원성 펩티드가 HLA A2.1 클라스 I 결합 그로우브(grove)와의 이들의 잠재적 일치성을 기준으로 하여 선택된다. HLA A2.1(세계 보건 기구의 서브타입 명명법으로 HLA A 0201)는 이것이 코카서스 지방에서 가장 통상적인 대립유전자이고 또한 다른 지역에도 널리 분포되어 있기 때문에 선택된다. 결정은 다음과 같이 이루어진다.
첫번째로, 발표된 교감성 서열에 따라 HLA A2.1에 잠재적으로 결합하는 hAFP로부터의 펩티드 서열(SEQ ID NO:1)을 확인하였다. HLA A2.1은 아미노산의 수가 8개 내지 10개인 펩티드, 바람직하게는 9량체인 펩티드를 결합시키는 것으로 여겨진다. 펩티드 길이에 따라, 아미노산 이소로이신, 로이신 및 메티오닌은 펩티드 위치 2에서 중요한 앵커 잔기인 것으로 여겨지며, 아미노산 이소로이신, 로이신 및 발린은 펩티드 위치 9 또는 10에서 중요한 앵커 잔기인 것으로 여겨진다.
HLA A2.1 클라스 I 결합 모티브에 따르는 적합한 펩티드 서열은 hAFP(SEQ ID NO:1)을 스크리닝하기 위한 더 유니버시티 오브 위스콘신 제네틱스 컴퓨터 그룹 프로그램 "파인드 패턴"(the University of Wisconsin Genetics Computer Group Program "find patterns")를 사용하여 확인되었으며, 2개의 강한 결합 "앵커" 잔기를 함유하는 9량체 및 10량체 펩티드이며, 이들 "앵커" 잔기 중 하나는 위치 2에 있고 다른 하나는 9량체 및 10량체를 갖는 펩티드에 대해 위치 9 또는 10에 있거나("강한" 펩티드로 지정됨); 단지 하나만이 강한 결합 앵커 잔기이거나("중간" 펩티드로 지정됨); 강한 결합 앵커 잔기는 아니지만("약한" 펩티드로 지정됨), 다른 포지티브 결합 잔기를 갖는다. 결합을 파괴하는 것으로 여겨지는 하나보다 많은 잔기를 함유하는 펩티드는 제거된다.
스크리닝 연구는 HLA A2.1 클라스 I 결합 모티브에 잠재적으로 따르는 총 72개의 펩티드 서열을 확인하였지만, 이들 서열 중 6개는 이들을 고소수성으로 인해 합성시키기 어렵기 때문에 추가의 고려로부터 제거된다. 나머지 66개의 펩티드 서열은 당업자들에게 공지된 기술에 따라 키론 미메토프스(Chiron Mimetopes)(오스트레일리아, 빅토리아)에 의한 시험을 위해 합성된다. 이들은 10개의 "강한" 펩티드 서열, 43개의 "중간" 펩티드 서열 및 13개의 "약한" 펩티드 서열을 포함한다. 하기의 표 I에는, 좌측으로부터 우측으로, 펩티드 과 관련하여, 펩티드 지정 번호, 펩티드 서열에 의해 표시되는 hAFP 서열의 잔기(SEQ ID NO:1) 및 아미노산 서열이 기재되어 있으며, 펩티드는 각각 66개의 펩티드 서열을 포함한다. 펩티드 지정 번호는 키론으로부터의 펩티드의 수탁 순서를 기준으로 한 것이며, 따라서 hAFP 분자의 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)에 대해 비순차적이다.
표 I
사람 AFP 펩티드 서열
66개의 펩티드를 각각, HLA A2.1에 농도 의존 방식으로 결합하여, 하기와 같이 T2 세포 안정화 검정에서 HLA A2.1을 안정화시키는 능력에 대해 시험하였다. 각각의 펩티드를 전날 밤에 실온에서 인큐베이팅시켜서 세포 표면 MHC 클라스 I 분자 발현을 증가시킨 T2가 결여된 TAP1 및 TAP2로 밤새 인큐베이팅시켰다. 각각의 펩티드를 펩티드 농도 범위, 즉 0.1μM 내지 100μM에 걸쳐 HLA A2.1 분자에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. T2 세포주에서, 8량체 내지 9량체로 채워진 MHC 분자만이 세포 표면 상에서 안정하였다. HLA A2.1의 안정성은 항-HLA A2 항체 BB7.2(ATCC) 및 염소 안티마우스-FTTC로 T2를 염색시킨 후에 흐름 세포 계산에 의해 검정하였다. 결합을 위한 포지티브 대조군으로서, FLU 매트릭스 펩티드(FLU 매트릭스 1 단백질의 잔기 58-66, GILGFVFTL) 및 MART-1 펩티드(MART-1의 잔기 27-35, AAGIGILTV, 전단백질에 대한 진뱅크 수탁 번호 U06452)를 사용하였다. FLU 매트릭스 펩티드는 0.5μM의 농도에서 T2 세포 상에서 A2.1 분자에를 일관되게 안정화시켰다.
표 II에는, 66개의 hAFP 펩티드 중 22개의 목록이 기재되어 있다. 칼럼 1은 펩티드 지정 번호를 기재하고 있고, 칼럼 2는 펩티드 서열에 의해 표현되는 hAFP 서열(SEQ ID NO:1)의 잔기를 확인하는 것이며, 칼럼 3은 서열 내의 앵커 잔기의 수를 확인하는 것이다.
표 II의 칼럼 4는 T 세포 상에서 HLA 2.1을 결합시키는 데에 필요한 펩티드의 최소 농도를 기재하고 있다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, 10개의 "강한" 펩티드 서열 중 6개, 및 43개의 "중간" 펩티드 서열 중 7개가 HLA 2.1에 대한 결합 능력을 보여주었다. 또한, 13개의 "약한" 펩티드 서열 중 어느 것도 HLA 2.1에 대한 결합 능력을 보여주지 못했다.
또한, 66개의 펩티드를 각각, EBV 림포블라스토이드 세포 오프-키네틱스 검점으로 시간의 경과에 따라 클라스 I 분자로부터의 분해율에 대해 시험하였는데, 그 이유는 클라스 I 분자에 결합된 펩티드의 오프-키네틱스, 즉 분해율이 펩티드의 면역원성의 상당한 전조이기 때문이다. 예를 들어, 바이러스 펩티드 HPV 16 E7, EBV LMP2, FLU M1 및 HIV pol.과 같은 비-자체 결합 펩티드의 경우에, 가장 느린 오프-키네틱스를 나타내는 가장 강한 결합 펩티트가 가장 면역원성임이 밝혀졌다. 또한, gp 100과 같은 흑색종 항원으로부터의 면역원성 에피토프인 많은 공지된 자체-단백질, MART-1이 하나의 앵커 잔기 및 가용성 클라스 I 재구성 검정에 의해 덜 안정한 결합 친화성을 갖지만, 오프-키네틱스가 매우 느린 것으로 밝혀졌다. [참조예 : 본원에 참고문헌으로 인용된 Bakker, A.B., et al., Analogues of CTL epitopeswith improved MHC class-I binding capacity elicit anti-melanoma CTL recognizing the wild-type epitope, Int J Cancer, 1997. 70(3): p. 302-1; and van der Burg, S.H., et al., Do epitopes derived from autoantigens display low affinity for MHC class I? (letter), Immunol Today, 1997. 1982: p. 97-98].
표 II
사람 AFP 펩티드 서열 및 결합 특징
EBV 림포블라스토이드 세포 오프-키네틱스 검정은 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[van der Burg, S.H., et al., Immunogenicity of peptides bound to MHC class I molecules depends on the MHC-peptide complex stability. J. Immunology, 1996. 156(9): p. 3308-3314]에 기술된 바와 같이 수행된다. 간략하게, HLA A2.1 EBV 림포블라스토이드 세포는 마일드 pH 3.2 산 완충제 중의 표면 클라스 I 펩티드 및 β2 마이크로글로불린을 스트립핑시켜서, MHC 분자를 불안정하게 만든다. 각각의 펩티드는 β2 마이크로글로불린의 존재하에 1시간 동안 200μM으로 과량으로 스트립핑된 세포 상으로 즉시 펄스화된다. 과량의 비결합 펩티드는 세척되고, 세포는 37℃에서 0, 2, 4 및 6시간 동안 인큐베이팅된다. 세포는 각각의 시점에서 세척되고, HLA A2에 대해 BB7.2 항체로 염색된다. 펩티드-클라스 I 착물은 평균 형광 세기가 스트립핑되지만 펩티드로 펄스화되는 세포로부터 1.5배 이상으로 증가하는 경우에 안정한 것으로 간주된다.
T2 세포 안정화 검정과 EBV 림포블라스토이드 세포 오프-키네틱스 검정 둘 모두는 각각의 펩티드에 대해 2회 이상 수행된다. 표 II에서, 칼럼 5에는 EBV 림포블아스토이드 세포에 대한 펩티드 안정성의 시간이 기재되어 있다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, 강한 펩티드 중 3개(AFP5, AFP14 및 AFP22), 43개의 중간 펩티드 중 12개(AFP49를 포함함) 및 약한 펩티드 중 1개만이 느린 오프-키네틱스의 수준을 보여준다. T2 세포 안정화 검정과 EBV 림포블라스토이드 세포 오프-키네틱스 검정 둘 모두를 고려하여, 이들 검정 둘 모두에서 가장 양호한 결과를 제공하는 펩티드 서열 중 7개는 AFP5, AFP7, AFP13, AFP14, AFP28, AFP38 및 AFP45임을 알 수 있다.
하기의 표 III의 칼럼 1에 기재된 펩티드는 플레반스키(Plebanski) 등의 문헌[Induction of peptide-specific primary cytotoxic T lymphocyte responses from human peripheral blood. Eur J.Immunol. 1995. 25(6): p. 1783-7]에 기술된 방법에 의해 생체외에서 펩티드 특이적 CTL을 발생시키기 위해 사용되고, CTL은 A2.1-포지티브, AFP-포지티브 간세포 암세포를 용해시키는 능력에 대해 시험된다. 용해는 펩티드가 사람 AFP 및 잠재적으로 표적 항원의 자연 처리된 면역원성 에피토프임을 시사하는 것이다. HLA A2.1 도우너 및 세포주는 BB7.2(HLA A2) 항체(ATCC)로 스크리닝되고, 당업자들에게 공지된 기술에 따라 PCR 및 유씨엘에이 티슈 타이핑 래버러토리(UCLA Tissue Typing Laboratory)에 의한 직접 서열 분석에 의해 확인되고 서브타입화된다.
표 III
사람 AFP 펩티드 세포독성
간략하게, 펩티드 특이적 CTL은 하기와 같이 표 III AFP 펩티드에 기재된 펩티드에 대해 발생된다. 정상 A2.1 도우너로부터의 2x107개의 말초혈 단핵세포 (PBMC)가 피콜리(Ficoli) 그래디언트에 의해 정제된다. 이들 PBMC는 37℃에서 90분 동안 1㎖의 혈청 비함유 배지 중에서 50㎍/㎖ 펩티드로 펄스화된다. 세포는 1회 세정되고, RPMI/10% 자가 혈청 중의 IL-7(10ng/㎖l) 및 KLH(4.5㎍/㎖)을 사용하여 0일째에 웰 1개당 10% 자가 혈청 RPMI 배지 1.5㎖ 중에서 3x106PBMC로 24-웰 플레이트에 위치된다. CTL은 비접착성 세포를 분리해내고, 이들을 새포운 펩티드 펄스화되고, 세척되고 방사선 조사된 PBMC에 1:1의 PBMC:CTL 비로 첨가함으로써 약하게 재자극된다. IL-2는 10 단위/㎖로 약하게 2회 첨가된다.
배양 3주 후에, 추정되는 hAFP 펩티드 발생 CTL을 표준 4시간51Cr 방출 검정으로 세포독성에 대해 시험된다. CTL은 CTL을 발생시키기 위해 사요되는 특이적 hAFP 펩티드로 펄스화된 T2 세포에 대한 펩티드 특이적 사멸에 대해 시험되고, 대조군으로서 FLU 매트릭스 펩티드 또는 MART-1 펩티드로 펄스화된 T2 세포와 비교된다. 비특이적 NK 사멸은 NK 민감성 표적 K562로 평가된다. CTL은 또한 HLA A2.1-포지티브, AFP-포지티브 사람 간세포 암세포주, HepG2에 대해 시험된다.
표 III에는, 포지티브 펩티드 세포독성 결과를 제공하는 정상 도우너로부터 CTL을 발생시키기 위해 사용되는 12개의 AFP 펩티드 서열에 대한 시험의 세포독성 결과가 기재되어 있다. 칼럼 2에는 대부분의 림프구 배양물의 CD4/CD8 표현형이 기재되어 있다. 칼럼 3 및 4에는 각각, 이펙터(CTL) 대 표적 비(E:T)를 갖는 펩티드 펄스화 T2 세포와 HepG2 표적에 대한 세포독성 수준이 기재되어 있다.
표 III으로부터 알 수 있는 바와 같이, 펩티드 AFP22, AFP39, AFP45 및 AFP49는 AFP+, HLA A2.1+HepG2 세포의 특이적 사멸의 고수준을 보여준다. AFP22 및 AFP49는 4개의 아미노산 오버랩, 즉 hAFP SEQ ID NO:1의 잔기 547-550을 가짐을 알 수 있다. 또한, AFP22는 AFP23과 함께, 2개의 아미노산 오버랩, 즉 SEQ ID NO:1의 잔기 555-556을 가지며, 이는 여분의 HepG2 사멸을 보여주는 것이다.
AFP49를 사용하여 발생된 CTL은 재시험되고, HepG2 세포독성은 유지된다. 또한, 새로운 AFP49 펩티드 발생 CTL 배양물이 2개의 상이한 정상 HLA A2.1 도우너를 사용하여 제조된다. 추가의 표적이 사용되어 AFP49를 사용하여 관찰되는 세포독성이 AFP 항원 특이적이고 클라스 I 제한됨을 확인한다.
도 1에는, 이들 시험의 대표적 데이터가 도시되어 있다. 첫번째로, 관찰되는 세포독성이 클라스 I 제함되는 지를 확인하기 위해, 항-β2 마이크로글로불린 항테를 사용하여 HepG2 세포에 대한 CTL-T 세포 수용체 상호작용을 차단시켰다. 그 결과, HepG2 용해가 상당히 감소되었다. 그 다음, 비특이적 NK/LAK 사멸을 제거하기 위해, 40배 과량의 비표지(냉각) K562 세포를 첨가하였다. 그 결과, HepG2 용해는 상당히 감소되지 않았다. 또한, MHC 클라스 I 발현을 γIFN(50 단위/㎖)로 밤새 인큐베이팅시켜 HepG2 세포에 대해 상향조절하였다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, MHC 클라스 I 발현 상향조절은 HepG2 용해를 증가시켰다. 또한, AFP+, HLA A2.1-네가티브 간세포 암세포주, Hep3B, 즉 클라스 I-미스매치 간세포 암세포주를 표적으로서 사용하였다. AFP49는 이들 Hep3B 표적을 매우 저수준으로 용해시켰다. 이러한 소량의 관찰된 Hep3B 용해물을, 냉각 K562 세포를 첨가할 대에 HepG2의 특이적 사멸의 보유와는 대조적으로, 과량의 냉각 K562를 첨가함으로써 제거하였다.
도 2에는, 펩티드 표적과 AFP 표적 둘 모두에 대해 검정된 정상 HLA A2.1 도우너로부터의 펩티드-펄스화 PBMC로부터 발생되는 CTL의 표준 크롬 방출 검정에 대해 표적에 대한 % 특이적 용해율의 막대 그래프가 도시되어 있다. CTL의 펩티드 특이성을 확인하기 위해, 각각의 배양물을 CTL 배양물이 제조되는 특이적 펩티드로 펄스화된 T2 세포(좌측의 대부분의 막대)에 대해 시험하고, 대조군으로서 상이한 HLA A2.1 결합 펩티드로 펄스화된 T2 세포(좌측으로부터 막대의 제 2 그룹)와 비교하였다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, 대조군 AFP49 페티드 배양물, AFP49V9 펩티드 배양물, AFP5 펩티드 배양물 및 대조군 FLU 매트릭스 펩티드 배양물은 모두, 특이적 펩티드로 펄스화된 T2 세포의 용해에 의한 펩티드 특이성을 보여주었지만, 상이한 펩티드로 펄스화된 T2 세포에 대해서는 특이성을 보여주지 않았다.
도 2와 관련하여, 이들 펩티드 특이적 CTL 배양물을 각각, AdVhAFP 또는 대조군 AdVRR5로 형질도입된 M202(HLA A2.1+/AFP-) 흑색종 세포의 사멸에 대해 시험하였다. AFP 펩티드 AFP5 및 AFP49, 및 AFP49의 위치 9에서 단일 아미노산 치환체를 갖는 펩티드 AFP49L9, SEQ ID NO:2(GVALQTMKL) 및 AFP49V9, SEQ ID NO:3(GVALQTMKV)는 대조군 RR5로 형질도입된 M202 세포의 사멸보다 AdVhAFP로 형질도입된 M202 세포의 상당히 더 많은 사멸을 보여주었다. FLU 펩티드 특이적 CTL 배양물은 유사한 백그라운드 수준의 세포독성을 갖는 M202/AdVhAFP와 M202/RR5 둘 모두를 사멸시켰다.
M202 세포는 현재 HLA A2.1 제한된 면역 우성 MART-1 펩티드를 처리하고 제공하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 이들은 AdVhAEP로 형질도입시키기 위한 이상적 세포주이고, AFP로부터의 정확한 HLA A2.1 제한 에피토프가 표면상에서 처리되고 제공될 것으로 예측된다. 따라서, 상기 실험은 AFP5, AFP49, AFP49L9, SEQ ID NO:2 및 AFP49V9, SEQ ID NO:3이 AFP+ 종양을 사멸시키기 위해 CTL을 표적화시키기 위해 사용될 수 있는 자연적으로 처리되고 제공된 펩티드임을 입증하였다. 또한, 이로부터 알 수 있는 바와 같이, AFP49L9, SEQ ID NO:2, 및 AFP49V9, SEQ ID NO:3, 펩티드-특이적 CTL 배양물은 AFP49 펩티드-특이적 CTL 배양물보다 M202/AdVhAFP를 훨씬 더 효과적으로 사멸시키고, 따라서, AFP49L9, SEQ ID NO:2, 및 AFP49V9, SEQ ID NO:3는 AFP+ 세포에 대한 면역 반응을 표적화시키기 위한 개선된 펩티드이다.
상기 설명으로부터 인지될 수 있는 바와 같이, 본 발명은 암세포가 표면 마아커로서 알파페토프로테인 분자의 일부 이상을 가질 수 있는 경우에, 사람을 포함하는 포유동물의 암을 예방하거나 치료하는 방법을 포함한다. 예방 또는 치료는 알파페토프로테인 분자의 일부 이상에 대한 치환 또는 변형에 의해 생성되는 알파페토프로테인 분자 또는 펩티드의 일부 이상을 포함하는 펩티드를 포함하는 조성물을 포유동물 체내에 투여함으로써 수행된다. 이들 펩티드는 AFP5, AFP7, AFP13, AFP14, AFP18, AFP22, AFP23, AFP28, AFP38, AFP39, AFP45, AFP49, AFP49L9, SEQ ID NO:2, 및 AFP49V9, SEQ ID NO:3를 포함한다.
2) 간세포 암세포를 포함하는, 알파페토프로테인을 표면 상에 함유하는 세포에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 알파페토프로테인을 사용하는 포유동물의 면역화
포유동물을 알파페토프로테인으로 면역시키면, 간세포 암세포를 포함하는, 알파페토프로테인을 표면 상에 함유하는 종양 세포에 의한 항원 투여에 대해 부분적으로 또는 완전히 보호성인 면역 반응이 발생한다.
사람 알파페토프로테인 cDNA를 하기와 같이 생성시켰다. 첫번째로, 사람 알파페토프로테인 cDNA를 Trizol 방법[미들랜드, 게티스버그에 소재하는 라이프 테크놀로지(Life Technology)] 및 RNAzolB[텍사스, 프렌즈우드에 소재하는 텔테스트(TelTest)]에 의해 Hep3B(ATCC로부터 입수)로부터 제조한 전체 RNA로부터 PCR 기술에 의해 발생시켰다. 전체 RNA 중 약 1㎍을 발표된 서열을 기초로 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) RT-PCR 킷 및 AFP-특이적 프라이머를 사용하는 RT-PCR 반응에 사용하였다. 5' 프라이머는 5' GCA ACC ATG AAG TGG GT이다. 3' 프라이머는 5' AAC TCC CAA AGC AGC ACG AGT이다. 프라이머는 프라이머 내로 혼입되고, 6개의 염기(CTC TCT)로 코드화되어 PCR 후에 효소 분열을 촉진시키는 제한 엔도누클레아제 자리 XbaI를 갖는 전체 코드화 영역(중단 코돈에 대한 ATG)을 포함한다. 프라이머 서열을 오페론 테크놀로지스(Operon Technologies)에 의해 50nM 스케일로 합성하고, 정제하지 않았다.
이로부터 생성된 사람 알파페토프로테인 PCR cDNA 생성물을 아가로오스 겔 상에서 분석하여 그 크기를 체크하였다. 정확하게 크기를 측정한 생성물을 키아겐(Qiagen) PCR 신속 세척 칼럼에서 정제하고, 프라이머 내로 설계된 자리를 갖는 XbaI 효소로 절단시키고, 당업자들에게 공지된 기술에 따라 pRcCMV(사람) 또는 pCR3.1(쥐과동물) 포유동물 발현 벡터[캘리포니아, 칼스바드에 소재하는 인비트로겐(Invitrogen)] 내로의 클로닝 반응에 사용하였다. 포지티브 플라스미드를 미티프레프(miniprep) 분석에 의해 확인하였다. 이들 포지티브 플라스미드를 맥시프레핑시키고(maxiprepped), 분취량을 UCLA에서 DNA 서열 코아 장치에 의해 서열화시켜서 인서트의 서열 동일성을 확인하였다. 따라서, 클로닝된 사람 AFP cDNA는 발표된 사람 AFP 서열과 동일하였다 (진뱅크 수탁 번호 J00077, J00076, V01514, 염기 48-1877, SEQ ID NO:1).
쥐과동물 AFP cDNA(mAFP cDNA)를 사람 AFP cDNA를 클로닝시키기 위해 사용된 상기 기술된 방법에 상응하는 방법을 사용하지만, 마우스-특이적 프라이머를 사용하여 클로닝시켰다. 5' 쥐과동물 특이적 프라이머는 5' GCC ATG AAG TGG ATC ACA이다. 3' 쥐과동물 특이적 프라이머는 TTA AAC GCC CAA AGC ATC A이다. 전체 RNA를 단리시키기 위해 사용되는 마우스 AFP-포지티브 세포주는 Hepa16이다. 본원에 기술된 모든 안정한 형질전환체 및 근내 주입 실험을 단일 서열을 함유하는 cDNA 클론을 사용하여 수행하였다. 마우스 서열은 Embl V00743의 염기 42-1859, SEQ ID NO:4이다.
그 다음, mAFP cDNA를 진핵세포 발현 벡터 VR1012[캘리포니아, 샌 디에고에 소재하는 바이칼, 인코포레이티드(Viacal, Inc.)] 내에 넣었다. VR1012 발현 벡터는 강화된 발현을 위한 인트론, 생체내 발현을 위한 BGH 종결 및 폴리 A 서열을 포함하는, 강한 구조성 CMV 중간 초기 프로모터/인핸서를 함유한다.
C57BL/6 마우스에 3주일 동안 1주일에 한번씩 mAFP cDNA 또는 대조군으로서의 식염을 함유하는 100㎍ VR1012의 주입물을 제공하였다. 최종 주입 1주일 후에, VR1012 mAFP cDNA로 면역시킨 마우스와 비면역 대조군 마우스를 공통 유전자 마우스에서 점차적으로 성장하는 종양의 단일 세포 현탁액으로부터 수득한 4x106생존성 BWIC3 간세포 암세포로 항원 투여하였다. BWIC3은 mAFP-포지티브 쥐과동물 세포주이다.
도 3으로부터, 면역된 동물((□)이 대조군 동물(●)과 비교하여 지연된 종양 성장 또는 완전한 보호를 나타냄을 알 수 있다. 이러한 발견은 수회 반복되었다. 상응하는 실험에서, MART-1 흑색종 항원을 발현시키는 플라스미드 벡터의 주입물은 BWIC3 간세포 암세포 항원 투여(도시되지 않음)로부터 동물을 보호하지 못하였다.
또 다른 실험군에서, 대용 쥐과동물 간세포 암세포주를 EL4(H-2b) 림프종을 mAFP cDNA로 안정하게 형질전환시킴으로써 구성하였다. 종양 세포주 EL4(mAFP)는 선조 EL4 세포주와 동일한 생체내 성장 키네틱스를 갖는다. RT-PCR을 사용하면, EL4(mAFP) 종양 세포주는 BEIC3 간세포 암세포주로서 AFP의 수준의 1% 이하를 생성시키는 것으로 보인다.
C57BL/6 마우스에 3주일 동안 1주일에 한번씩 mAFP cDNA 또는 대조군으로서의 식염을 함유하는 100㎍ VR1012의 주입물을 제공하였다. 최종 주입 1주일 후에, VR1012 mAFP cDNA로 면역시킨 마우스와 비면역 대조군 마우스를 7.5x105생존성 EL4(선조) 또는 EL4(mAFP) 세포로 항원 투여하였다.
도 4로부터, 면역된 동물(□)과 대조군 동물(●)이 EL4(선조) 세포(p=0.07, 연구원의 T 시험)로 항원 투여할 때에 차이를 나타내지 않음을 알 수 있다. 그러나, 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 면역된 동물(□)은 EL4(mAFP) 세포(p=0.07, 연구원의 T 시험)로 항원 투여할 때에, 대조군 동물(●)과 비교하여 부분적 호호를 나타내었다.
추가의 일련의 실험에서, 암포페토프로테인을 표면상에 함유하는 세포에 의한 항원 투여에 대한 보호를 대용물로서 안정하게 형질전환된 마우스 섬유종 세포주를 사용하여 입증하였다. 첫번째로, 안정하게 형질전환된 마우스 섬유종 세포주를 제조업자의 지시에 따라 DOTAP 리포펙션 방법(뵈링거 만하임)을 사용하거나, CaPO4침전법(당업자들에게 널리 공지된 기술에 따라)을 사용하여 생성시켰다. 요약하면, DOTAP 리포펙션 방법은 전날 밤에 밤새 점착시킨 6-웰 플레이트에서 웰 1개당 1x105개 세포를 사용하였다. 2.5ug 플라스미드(쥐과동물 AFP pCR3.1)를 25㎕의 20mM Hepes 및 50㎕ Hepes 중의 15㎕ 지질 중에서 15분 동안 실온에서 혼합시켰다. 이것을 1㎖의 배양기(10% 소 태아 혈청 및 항생물질을 함유하는 RPMI1640) 중에서 희석시키고, 웰 내의 세포에 첨가하였다. 4 내지 6시간 후에, 용액을 2㎖의 새로운 배양기로 교체하였다. 48 내지 72시간 후에, G418(제네티신)@ 500㎍/㎖를 사용하여 선택을 개시하였다 (총 농도, 75% 활성). 선택 2 내지 3일 후, 임의의 잠재적 형질전환체를 마우스 AFP RNA, 네오-RNA의 발현을 위해 RT-PCR에 의해 시험하고, 쥐과동물 APRT 유전자 발현으로 반정량화시켰다.
포유동물에서 종양 생성을 방지하는 데에 있어서 AFP 면역화의 효능은 하기와 같이 설명된다. 마우스 AFP-pCR3.1 플라스미드 및 마우스 AFP-AdVShuttle 벡터 플라스미드(pLpA CMV)를 당업자들에게 공지된 기술에 따라 제조하고, 마우스 AFP-바이칼 벡터 VR1-1012를 구성하였다. 쥐과동물 섬유종 세포주 FSA, NFSA, MCAK 및 SVEC를 상기와 같이 mAFP PCR3.1로 안정하게 형질전화시켰다.
C3H 마우스를 3주 동안 키아겐 플라스미드 프레프 킷(50㎕ PBS 중의 50㎍ 플라스미드)을 사용하여 엔도톡신 없이 제조한 마우스 AFP-AdVShuttle 벡터 네오-함유 발현 플라스미드를 사용하여 플라스미드 DNA를 약하게 근내 주입함으로써 명역화시켰다. C3H 마우스를 AFP-발현 벡터로 안정하게 형질전환시킨 FSA C3H 백그라운드 섬유종 세포 또는 네오-발현 벡터만으로 안정하게 형질전환시킨 FSA C3H 백그라운드 섬유종 세포로 항원 투여하여, AFP 항-자가 항원 반응이 발생될 수 있는 지 또는 안정한 형질전환체 발현 네오마이신이 AFP 반응을 차단하는 항-네오(비-자가 항원)을 발생시키는 지를 결정하였다. 종양 세포를 생체내로 통과시키고, 단일 세포 현탁액을 종양 항원 투여를 위해 사용하였다.
도 6으로부터 18일 후-종양 항원 투여에 의해, AFP-발현 벡터로 안정하게 형질전환시킨 FSA C3H 백그라운드 섬유종 세포로 항원 투여한 면역된 CH3 마우스(하부 ■) 중 하나만이 임의의 종양 성장(3mm x 3mm 종양)를 나타내는 반면, AFP-발현 벡터로 안정하게 형질전환시킨 FSA C3H 백그라운드 섬유종 세포로 항원 투여한 나머지 4마리의 면역된 CH3 마우스(●)는 종양 성장의 징후를 나타내지 않았다. 대조적으로, AFP-발현 벡터로 안정하게 형질전환시킨 FSA C3H 백그라운드 섬유종 세포로 항원 투여한 5마리의 면역되지 않은 CH3 마우스(상부 ■) 중 2마리는 임의의 종양 성장(평균 6.83 mm2)을 나타내었다. FSA 선조 종양 세포 및 네오-벡터-FSA 세포는 면역된 C3H 마우스(◆)와 면역되지 않은 C3H 마우스(▼) 둘 모두에서 유사하게 성장하였다. 상기 프로토콜을 반복하였으며, 유사한 결과가 얻어졌다 (데이터는 도시되지 않음).
제 2 실험을 잭슨 라브즈(Jackson Labs)[바아 하아버 메인(Bar Harbor Maine)]으로부터의 C57L/J("무력한") 마우스를 사용하여 수행하였다. 이들 마우스를 네오마이신을 함유하지 않은 바이칼로부터의 플라스미드 벡터(VR1012)로 면역시키고, 따라서, 마우스 AFP 유전자만을 합성시켰다. C57L/J 마우스를 쥐과 대용 종양 세포주인, ATCC로부터의 BEIC3로 항원 투여하였다. 이들 BEIC3 세포는 상기 기술된 바와 같이 생성된 안정하게 형질전환된 쥐과동물 섬유종 세포보다 훨씬 더 고수준의 마우스 AFP를 합성시킨다.
C57L/J 마우스를 mAFP-바이칼 벡터를 사용하여 상기 기술된 바와 같이 면역시키고, 마우스 1마리당 1x106BWIC3 세포의 종양 항원 투여를 피하에서 수행하였다. 도 7로부터, 14일 후-종양 항원 투여에 의해, 면역되지 않은 C57L/J 마우스(■)는 면역된 C57L/J 마우스(●)에서의 종양보다 평균 2배 더 큰 종양을 갖는다.
제 3 실험에서, 추가의 C57L/J 마우스를 마우스 AFP 유전자만을 합성시키는 플라스미드 벡터(VR1012)로 면역시키고, 상기 기술된 바와 같이 1x106BWIC3 세포로 항원 투여하였다. 도 8로부터, 17일 후 항원 투여에 의해, 모두 5마리의 면역되지 않은 마우스(●, ■)가 직경이 평균 11.4mm2인 종양을 가짐을 알 수 있다. 대조적으로, mAFP-바이칼로 면역된 5마리의 마우스 중 3마리(▲)는 평균 9mm2의 종양을 갖고, 한마리의 면역된 마우스(◆)는 작은 3mm2의 종양을 가지며, 한마리의 마우스(▼)는 종양을 나타내지 않았다.
따라서, 상기 설명으로 인지될 수 있는 바와 같이, 본 발명은 사람을 포함하는 포유동물의 암을 예방하거나 치료하는 것을 포함하며, 여기에서 암세포는 표면 마아커로서 알파페토프로테인 분자의 일부 이상을 갖는다. 예방 및 치료는 알파페토프로테인 분자의 일부 이상에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 알파페토프로테인 cDNA의 일부 이상을 포함하는 조성물을 포유 동물 체내에 투여함으로써 수행된다.
3) 간세포 암세포를 포함하는, 알파페토프로테인을 표면 상에 갖는 세포로 유전적으로 처리된 수상 세포를 사용하여 포유동물을 면역시키는 방법
쥐과동물 AFP(AdVAFP) 알파페토프로테인 cDNA를 발현시키는 재조합 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 수상 세포로 포유동물을 면역시키면, 간세포 암세포에 의한 항원 투여에 대해 부분적으로 또는 완전히 보호성인 면역 반응이 발생된다.
첫번째로, 쥐과동물 AFP(AdVmAFP)를 발현시키는 재조합 아데노바이러스를 당업자들에게 공지된 기술에 따라 구성하였다 [참조예 : Ribas, A., L. H. Butterfield, W. H. McBride, S. M. Jilani, L. A. Bui, C. M. Vollmer, R. Lau, V. B. Hu, A. Y. Chen, J. A. Glaspy, and J. S. Economou. 1997. Genetic immunization for the melanoma antigen MART-1/Melan-A using recombinant adenovirus-transduced murine dendritic cells. Cancer Res 57:2865; and Tolozan, E. M., K. Hunt, S. Swisher, W. McBride, R. Lau, S. Pang, K. Rhoades, T. Drake, A. Belldegrun, J. G;aspy, and J. S. Economou, 1996]]. 수상 세포를 당업자들에게 공지된 기술에 따라 GM-CSF 및 IL-4 중에서 7일 동안 분화된 C57BL/6 골수로부터 생성시켰다 [참조예 : Ribas, A., L. H. Butterfield, W. H. McBride, S. M. Jilani, L. A. Buli, C. M. Vollmer, R. Lau, V. B. Dissette, B. Hu, A. Y. Chen, J. A. Glaspy, and J. S. Economou. 1997. Genetic immunization for the melanoma antigen MART-1/Melan using recombinant adenovirus-transduced murine dendritic cells. Cancer Res 57:2865; and Inaba, K., M. Steinman. 1992. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med 176:1693; 이들 문헌은 본원에 참고문헌으로 인용되어 있음].
도 9에는, 다양한 다중 감염(MOI)에서 AdVmAFP로 형질도입된 쥐과동물 DC로부터 단리된 mRNA의 RT-PCR 분석이 도시되어 있다. 좌측으로부터 우측으로 읽어갈 때, 레인 1은 겔 크기 표준을 나타내며; 레인 2는 네가티브 대조군으로 사용된 mAFP에 대한 결과를 나타내며; 레인 3은 네가티브 대조군으로 사용된 쥐과동물 수상 세포에 대한 결과를 나타내며; 레인 4-7은 각각 10, 100, 1000 및 5000의 MOI에서 AdVmAFP로 형질도입된 쥐과동물 수상 세포에 대한 결과를 나타내며; 레인 8은 포지티브 대조군으로 사용된 BWIC3 세포에 대한 결과를 나타내며(약 1.9kb에서 최상의 라인); 레인 9는 PCR 오염에 대한 비-템플리트(no-template) 대조군으로서 이중 증류수(DDW)에 대한 결과를 나타낸다. 상기에서 알 수 있는 바와 같이, 쥐과동물 AFT(AdVmAFP)를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터는 수상 세포를 성공적으로 형질도입하였다.
다음으로, 다섯 마리의 C57BL/6 마우스로 구성된 3개 그룹을 준비하고, 100 MOI에서 AdVmAFP, RR5(빈 E1-결실 아데노바이러스)로 형질도입시킨 5×105수상 세포 또는 비처리된 수상 세포를 2주동안 주마다 주입하였다. 이들 3개의 마우스 그룹과 대조군으로서의 비주입된 하나의 마우스 그룹을 최종 주입으로부터 1주일 후에 7.5×105(AFP)로 감염시켰다. 결과는 도 10에 도시하였다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, RRS(▲), 처리되지 않은 수상 세포(▼) 및 대조군 마우스(●) 중 어느 것도 종양 항원 투여에 대한 보호를 나타내지 않았다.
또한, 다섯마리의 마우스로 구성된 또 다른 그룹을 준비하였고, 100 MOI에서 AdVmAFP로 형질도입시킨 5×105수상 세포를 2주동안 주당 주입하였다. 형질도입시킨 수상 세포의 최종주입으로부터 1주일 후, 4×106BWIC3 종양 세포에 의한 항원 투여에 대한 상기 그룹의 반응을 유사하지만 비주입된 대조군 마우스 그룹의 반응과 비교하였다. 상기 시험의 결과를 도 11에 도시하였다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, 면역된 마우스(■)는 대조군 마우스(●)와 비교하여, 종양 항원 투여에 대해 현저한 보호를 나타내었으며, 이는 이는 형질도입시킨 수상 세포에 의한 처리의 효능을 입증하는 것이다.
따라서, 본 명세서로부터 인지되는 바와 같이, 본 발명은 사람을 포함하는 포유동물의 암을 예방하거나 치료하는 방법을 포함하며, 여기에서 암세포는 표면 마아커로서 알파페토프로테인의 일부 이상을 함유한다. 예방 또는 치료는 알파페토프로테인 cDNA를 발현시키는 재조합 재조합 벡터로 형질도입시킨 수상 세포와 같은 면역계 세포를 포함하는 조성물을 포유동물 체내에 투여함으로써 달성된다.
포유동물의 간세포 암의 치료
본 발명의 한 양태에 따라, 알파페토프로테인의 일부 이상에 대한 사람의 면역 반응을 발생시킴으로써 사람의 간세포 암을 치료하는 방법을 제공하였다. 이 방법은 본원에 기술된 방법 또는 이에 상응하는 방법 중 하나와 유하한 방법으로 사람을 면역시키고, 알파페토프로테인에 대한 면역 반응을 발생시키도록 사람을 유전적으로 조작하는 것을 포함한다. 바람직한 양태에서, 간세포 암에 걸린 사람을 AFP5, AFP7, AFP13, AFP14, AFP18, AFP22, AFP23, AFP28, AFP38, AFP39, AFP45 또는 AFP49와 같은 사람 알파페토프로테인 분자의 일부 이상에 대한 면역 반응을 발생시키도록 면역화시켰다. 상기 면역화는 사람의 면역계가 알파페토프로테인 부분을 표면에 갖는 간세포 암세포를 공격하도록 하는 것이다.
본 발명은 바람직한 특정 양태와 관련하여 상당히 상세하게 설명되었지만, 그 밖의 양태도 가능하다. 따라서, 첨부된 청구의범위의 사상 및 범위는 본원에 포함된 바람직한 양태의 설명으로 제한되지 않아야 한다.
서열 목록
(1) 일반적 사항
(i) 출원인: 이코노모우, 제임스 에스.; 버터필드, 리사 에이치.
(ii) 발명의 명칭: 간세포 암의 예방 및 치료 방법
(iii) 서열의 수: 4
(iv) 연락처:
(A) 수신인: 쉘돈 & 맥
(B) 스트리트: 225 에스. 레이크 애비뉴, 나인쓰 플로어
(C) 도시: 파사도나
(D) 주: 캘리포니아
(E) 우편 번호: 91101
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 디스켓, 3.50 인치, 1.44 Mb 용량
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 작업 시스템: Windows 95
(D)소프트웨어: WordPerfect for Window version 8.0
(vi) 현재 출원 상황:
(A) 출원 번호: PCT/US98/02753
(B) 출원일: 1998년 2월 13일
(C) 분류: 미지정
(viii) 변리사/대리인 상황
(A) 성명: 파라, 데이비드 에이.
(B) 등록 번호: 38,134
(C) 참고/서류 번호: 11969-1PCT
(ix) 통신처
(A) 전화: (626) 796-4000
(B) 팩스: (626) 795-6321
(2) 서열 번호 1에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 2032
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2 본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 서열 설명: 서열 번호 1:
(2) 서열 번호 2에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(ix) 서열 설명: 서열 번호 2:
(2) 서열 번호 3에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 9
(B) 서열의 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(ix) 서열 설명: 서열 번호 3:
(2) 서열 번호 4에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 2009
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 서열 설명: 서열 번호 4:

Claims (16)

  1. 알파페토프로테인 분자의 아미노산 서열의 일부 이상에 대한 포유동물의 면역 반응을 발생시키는 단계를 포함하여 포유동물의 암을 예방하거나 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 알파페토프로테인 분자가 SEQ ID NO:1인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 알파페토프로테인 분자의 일부가 SEQ ID NO:1의 잔기 1-9, SEQ ID NO:1의 잔기 12-20, SEQ ID NO:1의 잔기 158-166, SEQ ID NO:1의 잔기 178-186, SEQ ID NO:1의 잔기 235-243, SEQ ID NO:1의 잔기 287-295, SEQ ID NO:1의 잔기 404-412, SEQ ID NO:1의 441-450, SEQ ID NO:1의 잔기 495-500, SEQ ID NO:1의 잔기 542-550, SEQ ID NO:1의 잔기 547-556 및 SEQ ID NO:1의 잔기 555-563으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 암이 간세포 암인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 포유동물이 사람인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 면역 반응을 발생시키는 단계가 알파페토프로테인 아미노산 서열의 일부 이상을 포함하는 펩티드를 포함하는 하나 이상의 조성물을 포유동물 체내에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 펩티드가 SEQ ID NO:1의 잔기 1-9, SEQ ID NO:1의 잔기 12-20, SEQ ID NO:1의 잔기 158-166, SEQ ID NO:1의 잔기 178-186, SEQ ID NO:1의 잔기 235-243, SEQ ID NO:1의 잔기 287-295, SEQ ID NO:1의 잔기 404-412, SEQ ID NO:1의 441-450, SEQ ID NO:1의 잔기 495-500, SEQ ID NO:1의 잔기 542-550, SEQ ID NO:1의 잔기 547-556 및 SEQ ID NO:1의 잔기 555-563으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 면역 반응을 발생시키는 단계가 하나 이상의 아미노산 치환체를 갖는 알파페토프로테인 아미노산 서열의 일부 이상을 포함하는 펩티드를 포함하는 하나 이상의 조성물을 포유동물 체내에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 펩티드가 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 면역 반응을 발생시키는 단계가 알파페토프로테인 분자에 대한 cDNA 서열의 일부 이상을 포함하는 하나 이상의 조성물을 포유동물 체내에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 알파페토프로테인 cDNA이 SEQ ID NO:1인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 면역 반응을 발생시키는 단계가 알파페토프로테인 cDNA를 발현시키는 재조합 벡터로 형질도입시킨 면역계 세포를 포함하는 하나 이상의 조성물을 포유동물 체내에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 면역계 세포가 수상 세포인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 알파페토프로테인 cDNA가 SEQ ID NO:1인 방법.
  15. SEQ ID NO:1의 잔기 1-9, SEQ ID NO:1의 잔기 12-20, SEQ ID NO:1의 잔기 158-166, SEQ ID NO:1의 잔기 178-186, SEQ ID NO:1의 잔기 235-243, SEQ ID NO:1의 잔기 287-295, SEQ ID NO:1의 잔기 404-412, SEQ ID NO:1의 441-450, SEQ ID NO:1의 잔기 495-500, SEQ ID NO:1의 잔기 542-550, SEQ ID NO:1의 잔기 547-556 및 SEQ ID NO:1의 잔기 555-563, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 포함하는, 암을 예방하거나 치료하기 위해 사람을 면역시키는 조성물.
  16. 사람 체내에 제13항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 사람의 암을 예방하거나 치료하는 방법.
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