JPH04227000A - ヒトパピローマウイルス１８のタンパク質における血清反応性エピトープ - Google Patents
ヒトパピローマウイルス１８のタンパク質における血清反応性エピトープInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】本発明はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ
）１８のタンパク質Ｅ１、Ｅ６及びＥ７における血清反
応性領域に関する。
）１８のタンパク質Ｅ１、Ｅ６及びＥ７における血清反
応性領域に関する。
【０００２】本発明は上記ウイルスタンパク質の血清反
応性領域のアミノ酸配列を有するペプチドを含有したワ
クチン及び上記ペプチドを含有した診断用キットにも関
する。
応性領域のアミノ酸配列を有するペプチドを含有したワ
クチン及び上記ペプチドを含有した診断用キットにも関
する。
【０００３】ＨＰＶ１８は最初にＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，３８１３−３８１５
（１９８３） で記載された特定タイプのヒトパピロー
マウイルスである。
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，３８１３−３８１５
（１９８３） で記載された特定タイプのヒトパピロー
マウイルスである。
【０００４】ＨＰＶ１８のウイルスゲノムのＤＮＡ配列
及び構成はＶｉｒｏｌｏｇｙ，１４５，１８１−１８５
（１９８５）で公表された。
及び構成はＶｉｒｏｌｏｇｙ，１４５，１８１−１８５
（１９８５）で公表された。
【０００５】ＨＰＶ１８は肛門性器路の良性病変ばかり
でなく子宮頸部、ペニス及び膣の悪性腫瘍をも誘導する
。しかしながら、ＨＰＶ１８は臨床的症状のない個体か
らの生殖器切片でもみられる。現在まで、ＨＰＶ１８及
び他のパピローマウイルスによる感染に対する免疫応答
性に関してはほとんど知られていない。
でなく子宮頸部、ペニス及び膣の悪性腫瘍をも誘導する
。しかしながら、ＨＰＶ１８は臨床的症状のない個体か
らの生殖器切片でもみられる。現在まで、ＨＰＶ１８及
び他のパピローマウイルスによる感染に対する免疫応答
性に関してはほとんど知られていない。
【０００６】最初の実験では、ＳＴＤ患者、頸部腫瘍の
ある患者及び健康体からのヒト血清がウイルスタンパク
質に対する抗体の存在に関して試験された。これらのウ
イルスタンパク質は様々な原核生物ペプチドにそれらの
Ｎ末端を介して共有結合した融合タンパク質として発現
された。そこでこのタイプの融合タンパク質がウェスタ
ーンブロット実験で抗原として用いられた。しかしなが
ら、この試験は比較的時間浪費的かつ複雑であって、多
大な費用でのみ行うことができ、そのため多量のヒト血
清の定量分析には適さないようである。加えて、様々な
パピローマウイルスタイプがそれらのタンパク質コアの
面でも関連し合い、このため異なるパピローマウイルス
タイプからのタンパク質又は融合タンパク質と抗体との
交差反応が除外しえないことから、この試験はさほど特
異的でない。
ある患者及び健康体からのヒト血清がウイルスタンパク
質に対する抗体の存在に関して試験された。これらのウ
イルスタンパク質は様々な原核生物ペプチドにそれらの
Ｎ末端を介して共有結合した融合タンパク質として発現
された。そこでこのタイプの融合タンパク質がウェスタ
ーンブロット実験で抗原として用いられた。しかしなが
ら、この試験は比較的時間浪費的かつ複雑であって、多
大な費用でのみ行うことができ、そのため多量のヒト血
清の定量分析には適さないようである。加えて、様々な
パピローマウイルスタイプがそれらのタンパク質コアの
面でも関連し合い、このため異なるパピローマウイルス
タイプからのタンパク質又は融合タンパク質と抗体との
交差反応が除外しえないことから、この試験はさほど特
異的でない。
【０００７】したがって、本発明の目的はヒトにおける
ＨＰＶ１８起因性疾患の予防、診断及び治療における補
助として適したＨＰＶ１８のウイルス構造を確認するこ
とである。このような構造（タンパク質ドメイン）に関
する知識は、多量のヒト血清が特定ＨＰＶの存在に関し
て検査されうる試験の確立上必須である。
ＨＰＶ１８起因性疾患の予防、診断及び治療における補
助として適したＨＰＶ１８のウイルス構造を確認するこ
とである。このような構造（タンパク質ドメイン）に関
する知識は、多量のヒト血清が特定ＨＰＶの存在に関し
て検査されうる試験の確立上必須である。
【０００８】従って、本発明は下記アミノ酸配列：
【化
４】 を有するＨＰＶ１８のＥ１タンパク質における血清反応
性エピトープ、下記アミノ酸配列：
４】 を有するＨＰＶ１８のＥ１タンパク質における血清反応
性エピトープ、下記アミノ酸配列：
【化５】
のうち１つを有するＨＰＶ１８のＥ６タンパク質におけ
る血清反応性エピトープ、及び下記アミノ酸配列：
る血清反応性エピトープ、及び下記アミノ酸配列：
【化
６】 のうち１つを有するＨＰＶ１８のＥ７タンパク質におけ
る血清反応性エピトープ、に関する。
６】 のうち１つを有するＨＰＶ１８のＥ７タンパク質におけ
る血清反応性エピトープ、に関する。
【０００９】本発明は前記血清反応性エピトープの本発
明によるアミノ酸配列のいずれか１種またはそれ以上を
含んだペプチドにも関する。
明によるアミノ酸配列のいずれか１種またはそれ以上を
含んだペプチドにも関する。
【００１０】本発明はＨＰＶ１８のタンパク質の前記血
清反応性エピトープの１種またはそれ以上のアミノ酸配
列を含んだペプチドに基づくワクチンにも関する。
清反応性エピトープの１種またはそれ以上のアミノ酸配
列を含んだペプチドに基づくワクチンにも関する。
【００１１】ＨＰＶ１８ Ｅ１、Ｅ６及びＥ７タンパ
ク質に対する特異的抗体は本発明による診断用キットを
用いて患者血清において検出することができる。このキ
ットは本発明によるペプチドを含有している。
ク質に対する特異的抗体は本発明による診断用キットを
用いて患者血清において検出することができる。このキ
ットは本発明によるペプチドを含有している。
【００１２】更に、血清反応性領域を含んだ特定ウイル
スタンパク質がこれらの領域に対するポリクローナル抗
体又はモノクローナル抗体を用いて適時に血清中で同定
されることも予防目的から可能である。したがって、本
発明はＨＰＶ１８の血清反応性領域に特異的なポリクロ
ーナル又はモノクローナル抗体を含有した診断用キット
にも関する。
スタンパク質がこれらの領域に対するポリクローナル抗
体又はモノクローナル抗体を用いて適時に血清中で同定
されることも予防目的から可能である。したがって、本
発明はＨＰＶ１８の血清反応性領域に特異的なポリクロ
ーナル又はモノクローナル抗体を含有した診断用キット
にも関する。
【００１３】下記の相互に独立した方法は血清反応性エ
ピトープを同定するために用いられた：Ａ．ショットガ
ン発現バンクのスクリーニング：細菌プラスミドベクタ
ーｐＳＰ６５でクローニングされたＨＰＶ１８ ＤＮ
Ａは超音波剪断しかる後ＤＮアーゼ処理で平均サイズ１
００塩基対の断片に変換された。これら断片の末端はＴ
４ＤＮＡポリメラーゼで補充され、ファージ発現ベクタ
ーｆｕｓｅ１に結合された。ｆｕｓｅ１はバクテリオフ
ァージｆｄから誘導され、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８，１
３１５−１３１７（１９８５）で記載されている。その
ファージは大腸菌Ｋ９１と共にプレーティングされ、レ
プリカがニトロセルロースフィルターで作製され、フィ
ルターが適切なポリクローナルウサギ血清と共にインキ
ュベートされた。陽性クローンはいくつかの選抜ステッ
プで単離され、免疫反応性ペプチド配列はＤＮＡ配列決
定により確認された。
ピトープを同定するために用いられた：Ａ．ショットガ
ン発現バンクのスクリーニング：細菌プラスミドベクタ
ーｐＳＰ６５でクローニングされたＨＰＶ１８ ＤＮ
Ａは超音波剪断しかる後ＤＮアーゼ処理で平均サイズ１
００塩基対の断片に変換された。これら断片の末端はＴ
４ＤＮＡポリメラーゼで補充され、ファージ発現ベクタ
ーｆｕｓｅ１に結合された。ｆｕｓｅ１はバクテリオフ
ァージｆｄから誘導され、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８，１
３１５−１３１７（１９８５）で記載されている。その
ファージは大腸菌Ｋ９１と共にプレーティングされ、レ
プリカがニトロセルロースフィルターで作製され、フィ
ルターが適切なポリクローナルウサギ血清と共にインキ
ュベートされた。陽性クローンはいくつかの選抜ステッ
プで単離され、免疫反応性ペプチド配列はＤＮＡ配列決
定により確認された。
【００１４】Ｂ．ペプチド重複
ＨＰＶ１８ Ｅ６及びＥ７タンパク質の短いセグメン
トに相当する１２７の重複ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学を
用いてポリエチレンピン上で合成した〔Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２，１７８（１９８５）〕
。Ｅ６及びＥ７タンパク質のタンパク質配列は次のペプ
チドと８アミノ酸で一致する１０マー（ｍｅｒ）に分割
された。そのペプチドは適切な抗血清中でＥＬＩＳＡに
より調べられた。
トに相当する１２７の重複ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学を
用いてポリエチレンピン上で合成した〔Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２，１７８（１９８５）〕
。Ｅ６及びＥ７タンパク質のタンパク質配列は次のペプ
チドと８アミノ酸で一致する１０マー（ｍｅｒ）に分割
された。そのペプチドは適切な抗血清中でＥＬＩＳＡに
より調べられた。
【００１５】
【実施例】例 １
線維状ファージｆｄの誘導体を用いて、ＨＰＶ１８
ＤＮＡ断片に関する発現系を得た。このため、ｆｕ
ｓｅ１〔ｆｄ‐ｔｅｔ‐Ｊ６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８
，１３１５−１３１７（１９８５）；Ｇｅｎｅ，７３，
３０５−３１８（１９８８）〕を単一ＰｖｕＩＩ開裂部
位で切断した。ＤＮＡ修復後のＤＮアーゼＩ消化による
ゲノムＨＰＶ１８ ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ
で平滑末端結合させた。ｆｕｓｅ１ベクターを形質転換
するため、大腸菌Ｋ８０２株〔Ｆ− ｇａｌＫ２ ｇａ
ｌＴ２２ ｍｅｔＢ１ ｓｕｐＥ４４ ｈｓｄｒ（２）
；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，１６，１１８−１３３（１９６６） 〕をＪｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，１６６，５５７−５８０（１９８８）におけるＨａ
ｎａｈａｎ の方法で用いた。ｔｅｔ耐性コロニーは、
それらのＦ− 表現型のために細菌に感染しないバクテ
リオファージを産生する。ファージを培養するため、大
腸菌Ｋ９１株〔Ｆ＋ ，大腸菌Ｋ３８の誘導体，Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ，４９，４５−６０（１９７２）〕を用いた
。
ＤＮＡ断片に関する発現系を得た。このため、ｆｕ
ｓｅ１〔ｆｄ‐ｔｅｔ‐Ｊ６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８
，１３１５−１３１７（１９８５）；Ｇｅｎｅ，７３，
３０５−３１８（１９８８）〕を単一ＰｖｕＩＩ開裂部
位で切断した。ＤＮＡ修復後のＤＮアーゼＩ消化による
ゲノムＨＰＶ１８ ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ
で平滑末端結合させた。ｆｕｓｅ１ベクターを形質転換
するため、大腸菌Ｋ８０２株〔Ｆ− ｇａｌＫ２ ｇａ
ｌＴ２２ ｍｅｔＢ１ ｓｕｐＥ４４ ｈｓｄｒ（２）
；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，１６，１１８−１３３（１９６６） 〕をＪｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，１６６，５５７−５８０（１９８８）におけるＨａ
ｎａｈａｎ の方法で用いた。ｔｅｔ耐性コロニーは、
それらのＦ− 表現型のために細菌に感染しないバクテ
リオファージを産生する。ファージを培養するため、大
腸菌Ｋ９１株〔Ｆ＋ ，大腸菌Ｋ３８の誘導体，Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ，４９，４５−６０（１９７２）〕を用いた
。
【００１６】例 ２
前記ランダムバンクから約５０，０００の組換えフ
ァージを最少寒天プレート上で１０ｍＭＭｇＳＯ４含有
０．５％アガロース３．５ｍｌ中指数的増殖大腸菌Ｋ９
１細胞０．２ｍｌと共にプレーティングした。プレート
のレプリカをニトロセルロースフィルターで作製し、し
かる後シグナルを高めるため新鮮最少寒天上３７℃で更
に６時間インキュベートした。次いでフィルターをＰＢ
Ｓ中１０％低脂肪ミルクで６０分間ブロックし、１：１
００〜１：１０００のＨＰＶ特異性抗血清希釈の５％ミ
ルク／ＰＢＳ中において一夜インキュベートした。特異
的ＨＰＶ抗血清の代わりにモノクローナル抗体を用いる
ことも可能である。抗血清を音波処理Ｋ９１細胞で前吸
着させた。次いでフィルターを特にＰＢＳ／０．１％ツ
イーン２０で５分間しかる後ヤギ抗ウサギ抗体と共に室
温で３時間、で５回洗浄するか、又はモノクローナル抗
体が用いられる場合には５％低脂肪ミルク中で抗マウス
ペルオキシダーゼ抗体（１：１０００）と共にインキュ
ベートした。フィルターを洗浄した後、それらをジアミ
ノベンジジン３０ｍｇ、３０％強度Ｈ２Ｏ２３０μｌ及
び１％強度ＮｉＳＯ４１．５ｍｌ含有ＰＢＳ５０ｍｌで
染色した。次いでフィルターをＨ２Ｏで３０分間洗浄し
、しかる後濾紙上で乾燥させた。最初に２５のファージ
をＨＰＶ１８ Ｅ７に対するポリクローナルウサギ血
清を用いて単離し、そのうち１８が次の精製ステップで
陽性とわかった。次いでファージ粒子を培養増殖させ、
一本鎖ＤＮＡを得た。
ァージを最少寒天プレート上で１０ｍＭＭｇＳＯ４含有
０．５％アガロース３．５ｍｌ中指数的増殖大腸菌Ｋ９
１細胞０．２ｍｌと共にプレーティングした。プレート
のレプリカをニトロセルロースフィルターで作製し、し
かる後シグナルを高めるため新鮮最少寒天上３７℃で更
に６時間インキュベートした。次いでフィルターをＰＢ
Ｓ中１０％低脂肪ミルクで６０分間ブロックし、１：１
００〜１：１０００のＨＰＶ特異性抗血清希釈の５％ミ
ルク／ＰＢＳ中において一夜インキュベートした。特異
的ＨＰＶ抗血清の代わりにモノクローナル抗体を用いる
ことも可能である。抗血清を音波処理Ｋ９１細胞で前吸
着させた。次いでフィルターを特にＰＢＳ／０．１％ツ
イーン２０で５分間しかる後ヤギ抗ウサギ抗体と共に室
温で３時間、で５回洗浄するか、又はモノクローナル抗
体が用いられる場合には５％低脂肪ミルク中で抗マウス
ペルオキシダーゼ抗体（１：１０００）と共にインキュ
ベートした。フィルターを洗浄した後、それらをジアミ
ノベンジジン３０ｍｇ、３０％強度Ｈ２Ｏ２３０μｌ及
び１％強度ＮｉＳＯ４１．５ｍｌ含有ＰＢＳ５０ｍｌで
染色した。次いでフィルターをＨ２Ｏで３０分間洗浄し
、しかる後濾紙上で乾燥させた。最初に２５のファージ
をＨＰＶ１８ Ｅ７に対するポリクローナルウサギ血
清を用いて単離し、そのうち１８が次の精製ステップで
陽性とわかった。次いでファージ粒子を培養増殖させ、
一本鎖ＤＮＡを得た。
【００１７】例 ３
例２の場合と同じ方法をでＨＰＶ１８ Ｅ６タン
パク質に関しても選択した。用いられたポリクローナル
ウサギ血清は非ウイルスエピトープと交差反応したため
、ウェスターンブロット法以外ではすべての反応性組換
え体の中からＨＰＶ１８ Ｅ６部分のあるものを同定
するために特定ＤＮＡ断片がプローブとして用いられた
。７０，０００の組換えファージから１５を単離し、最
後に配列決定した。エピトープＨＰＶ１８ Ｅ６ Ｎ
ｏ．１は、例えば調べられたファージバンクの中で合計
１０回みつけられた。
パク質に関しても選択した。用いられたポリクローナル
ウサギ血清は非ウイルスエピトープと交差反応したため
、ウェスターンブロット法以外ではすべての反応性組換
え体の中からＨＰＶ１８ Ｅ６部分のあるものを同定
するために特定ＤＮＡ断片がプローブとして用いられた
。７０，０００の組換えファージから１５を単離し、最
後に配列決定した。エピトープＨＰＶ１８ Ｅ６ Ｎ
ｏ．１は、例えば調べられたファージバンクの中で合計
１０回みつけられた。
【００１８】例 ４
ｆｕｓｅ１組換え体からの一本鎖ＤＮＡの製造このため
にＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７
４，５４６３−５４６７（１９７７） の操作を用いた
。ＬＭ５０ｍｌをｆｕｓｅ１プラスミドを有するｔｅｔ
耐性大腸菌Ｋ９１細胞と共にインキュベートし、この混
合物を３７℃で１６時間インキュベートした。次いで細
菌を６０００ｒｐｍ で３０分間かけてペレット化した
。上澄に４０％強度ＰＥＧ６０００の２ｍｌ及びｐＨ６
．５の５Ｍ酢酸ナトリウム２ｍｌの添加後、ファージを
０℃で６０分間かけて沈降させ、沈降物を６０００ｒｐ
ｍ で６０分間遠心した。ペレットをＴＥ０．３ｍｌに
再懸濁した。２回のフェノール抽出の後、ＤＮＡ沈降さ
せた。次いで約２５％の調製物を配列決定に用いた。
にＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７
４，５４６３−５４６７（１９７７） の操作を用いた
。ＬＭ５０ｍｌをｆｕｓｅ１プラスミドを有するｔｅｔ
耐性大腸菌Ｋ９１細胞と共にインキュベートし、この混
合物を３７℃で１６時間インキュベートした。次いで細
菌を６０００ｒｐｍ で３０分間かけてペレット化した
。上澄に４０％強度ＰＥＧ６０００の２ｍｌ及びｐＨ６
．５の５Ｍ酢酸ナトリウム２ｍｌの添加後、ファージを
０℃で６０分間かけて沈降させ、沈降物を６０００ｒｐ
ｍ で６０分間遠心した。ペレットをＴＥ０．３ｍｌに
再懸濁した。２回のフェノール抽出の後、ＤＮＡ沈降さ
せた。次いで約２５％の調製物を配列決定に用いた。
【００１９】例 ５
配列決定
標準ＵＳＢ〔ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカル
ズ（Ｕｎｉｔｅｄ ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ） 〕法（ＵＳＢ，１９８７） をＤＮＡ配列決定
に用いた。ユニバーサルプライマーを２０マーオリゴヌ
クレオチド（５’−ＴＣＣＡＧＡＣＧＴＴＡＧＴＡＡＡ
ＴＧＡＡ−３’）に代えた。
ズ（Ｕｎｉｔｅｄ ＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ） 〕法（ＵＳＢ，１９８７） をＤＮＡ配列決定
に用いた。ユニバーサルプライマーを２０マーオリゴヌ
クレオチド（５’−ＴＣＣＡＧＡＣＧＴＴＡＧＴＡＡＡ
ＴＧＡＡ−３’）に代えた。
【００２０】例 ６
ペプチド合成
短いセグメントでＯＲＦのＨＰＶ１８ Ｅ６及びＥ７
を表す１２７の重複ペプチドをＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，１７８（１９８５）
及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，３
９９８（１９８５）で記載されたようにポリエチレンピ
ン上でＦｍｏｃ化学により合成した。β‐アラニンで誘
導されたポリエチレンピンはＣＲＢイングランド（ＣＲ
ＢＥｎｇｌａｎｄ） から得た。前記文献とは異なり、
タンパク質配列は隣接ペプチドと８アミノ酸で重複した
デカペプチドに分割した。合成はＦｍｏｃ化学及びＢＯ
Ｐ〔カストロ（Ｃａｓｔｒｏ）試薬〕によるｉｎ ｓｉ
ｔｕ 活性化を利用して行った〔Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１４，１２１９（１９７５） 〕
。Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（６μｍｏｌ）、ＢＯＰ及び
Ｎ‐メチルモルホリン溶液を合成されるペプチド配列に
応じてポリエチレンピン（ＣＲＢ）に分配した。すべて
の他の反応はＣＲＢプロトコールに従い行った。
を表す１２７の重複ペプチドをＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，１７８（１９８５）
及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，３
９９８（１９８５）で記載されたようにポリエチレンピ
ン上でＦｍｏｃ化学により合成した。β‐アラニンで誘
導されたポリエチレンピンはＣＲＢイングランド（ＣＲ
ＢＥｎｇｌａｎｄ） から得た。前記文献とは異なり、
タンパク質配列は隣接ペプチドと８アミノ酸で重複した
デカペプチドに分割した。合成はＦｍｏｃ化学及びＢＯ
Ｐ〔カストロ（Ｃａｓｔｒｏ）試薬〕によるｉｎ ｓｉ
ｔｕ 活性化を利用して行った〔Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１４，１２１９（１９７５） 〕
。Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（６μｍｏｌ）、ＢＯＰ及び
Ｎ‐メチルモルホリン溶液を合成されるペプチド配列に
応じてポリエチレンピン（ＣＲＢ）に分配した。すべて
の他の反応はＣＲＢプロトコールに従い行った。
【００２１】例 ７
ポリエチレンピンをＥＬＩＳＡアッセイ法で前記ポ
リクローナルウサギ血清と共にインキュベートし、結合
抗体をプロテインＡペルオキシダーゼを用いて検出した
。 非特異的結合で生じるバックグラウンドは第一抗体なし
にプロテインＡインキュベーションで定量した。反応性
ペプチドは血清反応性エピトープとしてファージスクリ
ーニングにより確認された領域に位置する。すべてのア
ッセイはポリエチレンピンに共有結合されたペプチドで
行われ、また、そのピン上にそれらが最初に合成されて
いた。マイクロタイタープレートのウェルに導入されう
るような配置で固定された９６ピンを有するラックを用
いた。ＥＬＩＳＡのためのインキュベーションを行い、
一方でピンをウェルに浸漬した。ピンをメタノール及び
ＰＢＳで洗浄し、次いでＰＢＳ中０．２５％ゼラチン、
０．１％ツイーン２０により３７℃で２時間かけてブロ
ックし、しかる後０．１２５％ゼラチン及び０．０５％
ツイーン２０で１：２００〜１：４０００希釈された血
清と共に３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／
０．１％ツイーン２０によるもう１回の洗浄ステップ後
、ピンをプロテインＡ‐ペルオキシダーゼ１：４０００
と共に３７℃で１時間インキュベートし、しかる後もう
１回洗浄ステップ及びテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ
）で１５分間染色を行った。染色ステップは染色溶液か
らピンを引上げて０．２モルＨ２ＳＯ４溶液１００μｌ
を加えることにより停止させた。次いで吸着量を自動Ｅ
ＬＩＳＡ読取機で測定した。ＥＬＩＳＡ法の後に抗体‐
酵素複合体を除去するため、ピンをＰＢＳ／１％ＳＤＳ
／０．１％β‐メルカプトエタノール中６０℃で１時間
超音波（水浴、３０Ｗ、４８ＫＨｚ）下でインキュベー
トし、最後にメタノールで洗浄した。この操作の効率は
一次血清を含むことなしにプロテインＡ／ペルオキシダ
ーゼを用いてＥＬＩＳＡにより試験した。同じペプチド
は下記ＥＬＩＳＡで４０回以上調べた。
リクローナルウサギ血清と共にインキュベートし、結合
抗体をプロテインＡペルオキシダーゼを用いて検出した
。 非特異的結合で生じるバックグラウンドは第一抗体なし
にプロテインＡインキュベーションで定量した。反応性
ペプチドは血清反応性エピトープとしてファージスクリ
ーニングにより確認された領域に位置する。すべてのア
ッセイはポリエチレンピンに共有結合されたペプチドで
行われ、また、そのピン上にそれらが最初に合成されて
いた。マイクロタイタープレートのウェルに導入されう
るような配置で固定された９６ピンを有するラックを用
いた。ＥＬＩＳＡのためのインキュベーションを行い、
一方でピンをウェルに浸漬した。ピンをメタノール及び
ＰＢＳで洗浄し、次いでＰＢＳ中０．２５％ゼラチン、
０．１％ツイーン２０により３７℃で２時間かけてブロ
ックし、しかる後０．１２５％ゼラチン及び０．０５％
ツイーン２０で１：２００〜１：４０００希釈された血
清と共に３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／
０．１％ツイーン２０によるもう１回の洗浄ステップ後
、ピンをプロテインＡ‐ペルオキシダーゼ１：４０００
と共に３７℃で１時間インキュベートし、しかる後もう
１回洗浄ステップ及びテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ
）で１５分間染色を行った。染色ステップは染色溶液か
らピンを引上げて０．２モルＨ２ＳＯ４溶液１００μｌ
を加えることにより停止させた。次いで吸着量を自動Ｅ
ＬＩＳＡ読取機で測定した。ＥＬＩＳＡ法の後に抗体‐
酵素複合体を除去するため、ピンをＰＢＳ／１％ＳＤＳ
／０．１％β‐メルカプトエタノール中６０℃で１時間
超音波（水浴、３０Ｗ、４８ＫＨｚ）下でインキュベー
トし、最後にメタノールで洗浄した。この操作の効率は
一次血清を含むことなしにプロテインＡ／ペルオキシダ
ーゼを用いてＥＬＩＳＡにより試験した。同じペプチド
は下記ＥＬＩＳＡで４０回以上調べた。
【００２２】
【表１】
Claims (7)
- 【請求項１】下記アミノ酸配列を有するヒトパピローマ
ウイルス１８のＥ１タンパク質における血清反応性エピ
トープ。 【化１】 - 【請求項２】下記アミノ酸配列のうち１つを有するヒト
パピローマウイルス１８のＥ６タンパク質における血清
反応性エピトープ。 【化２】 - 【請求項３】下記アミノ酸配列のうち１つを有するヒト
パピローマウイルス１８のＥ７タンパク質における血清
反応性エピトープ。 【化３】 - 【請求項４】請求項１〜３に記載された血清反応性エピ
トープの１種またはそれ以上を含むペプチド。 - 【請求項５】請求項４に記載されたペプチドの１種また
はそれ以上を含むワクチン。 - 【請求項６】ヒトパピローマウイルス１８のタンパク質
Ｅ１、Ｅ６又はＥ７に対する特異的抗体を同定するため
の診断用組成物であって、請求項４に記載されたペプチ
ドの１種またはそれ以上を含むことを特徴とする組成物
。 - 【請求項７】患者血清中のウイルスタンパク質を同定す
るための診断用組成物であって、請求項１〜３のいずれ
か一項に記載されたエピトープに特異的な及び／又は請
求項４に記載されたペプチドに特異的なポリクローナル
又はモノクローナル抗体を含むことを特徴とする組成物
。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4015044A DE4015044A1 (de) | 1990-05-10 | 1990-05-10 | Seroreaktive epitope auf proteinen des menschlichen papillomavirus (hpv) 18 |
| DE4015044.5 | 1990-05-10 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000171081A Division JP3676195B2 (ja) | 1990-05-10 | 2000-06-07 | ヒトパピローマウイルス１８のタンパク質における血清反応性エピトープ |
| JP2000170971A Division JP3717755B2 (ja) | 1990-05-10 | 2000-06-07 | ヒトパピローマウイルス１８のタンパク質における血清反応性エピトープ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP3401022B2 JP3401022B2 (ja) | 2003-04-28 |
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|---|---|---|---|
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| JP2000171081A Expired - Fee Related JP3676195B2 (ja) | 1990-05-10 | 2000-06-07 | ヒトパピローマウイルス１８のタンパク質における血清反応性エピトープ |
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|---|---|---|---|
| JP2000171081A Expired - Fee Related JP3676195B2 (ja) | 1990-05-10 | 2000-06-07 | ヒトパピローマウイルス１８のタンパク質における血清反応性エピトープ |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0456197A1 (ja) |
| JP (3) | JP3401022B2 (ja) |
| KR (1) | KR100203547B1 (ja) |
| AU (1) | AU650648B2 (ja) |
| CA (1) | CA2042236C (ja) |
| DE (1) | DE4015044A1 (ja) |
| IE (1) | IE911584A1 (ja) |
| PT (1) | PT97621B (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10197529A (ja) * | 1996-12-27 | 1998-07-31 | Fujitsu Ltd | タンパク質の抗原決定基予測方法及びシステム |
| JPH10510989A (ja) * | 1994-12-20 | 1998-10-27 | シーエスエル、リミテッド | ヒトパピローマウイルス抗原の変異体 |
| JPH11501804A (ja) * | 1995-02-24 | 1999-02-16 | キャンタブ ファーマシューティカルズ リサーチ リミティド | 免疫治療剤として役立つポリペプチド及びポリペプチド調製の方法 |
| JP2003509035A (ja) * | 1999-09-16 | 2003-03-11 | ザイコス インク． | ポリエピトープポリペプチドをコードする核酸 |
| JP2004512814A (ja) * | 1999-12-10 | 2004-04-30 | エピミューン インコーポレイテッド | ペプチドおよび核酸組成物を使用する、ヒトパピローマウイルスに対する細胞性免疫応答の誘導 |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9207701D0 (en) * | 1992-04-08 | 1992-05-27 | Cancer Res Campaign Tech | Papillomavirus e7 protein |
| IL105554A (en) * | 1992-05-05 | 1999-08-17 | Univ Leiden | Peptides of human papillomavirus for use in preparations elicit a human T cell response |
| GB9503570D0 (en) * | 1995-02-23 | 1995-04-12 | Kodak Ltd | Process and apparatus for the development of photographic materials |
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