KR100203547B1 - 사람 유두종 바이러스18의 단백질상의 혈청반응성 에피토프 - Google Patents
사람 유두종 바이러스18의 단백질상의 혈청반응성 에피토프 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 사람 유두종 바이러스 HPV18의 단백질상의 혈청반응성 에피토프에 관한 것이다.
또한 본 발명은 혈청반응성 에피토프 서열과 전체 또는 일부가 일치하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 이러한 펩타이드를 함유하는 백신에 관한 것이다.
Description
본 발명은 사람 유두종 바이러스(papillomavirus : HPV) 18의 단백질 E1, E6 및 E7 상의 혈청 반응성 영역에 관한 것이다.
본 발명은 또한 전술한 바이러스 단백질의 혈청 반응성 영역의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 함유하는 백신 및 상기 펩타이드를 함유하는 진단 키트에 관한 것이다.
HPV18은 문헌 [참조 : Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80. 3813-3815(1983)]에 최초로 기술된 사람 유두종 바이러스의 특정형이다. HPV18의 바이러스 게놈의 DNA 서열 및 조직체계가 문헌[참조 : Virology 145. 181-185(1985)]에 발표되었다.
HPV18은 비생식관의 양성 병변 뿐만 아니라 자궁 경부, 음경 및 질의 악성 종양도 유발시킨다. 그러나, HPV18은 임상학적으로 무증상인 개체의 생식기 소파물에서도 발견되었다. HPV18 및 기타 유두종 바이러스 감염에 대한 면역 반응에 관하여 현재까지는 별로 알려진 것이 없다.
초기의 실험에서는 STD 환자, 경부암에 걸린 환자 및 건강한 개체의 사람 혈청을 바이러스 단백질에 대해 지시된 항체 존재 유무에 대하여 시험 하였다. 이들 바이러스 단백질은 이들의 N 말단을 통해 각종 원핵세포성 펩타이드에 공유 결합된 융합 단백질로서 발현된다. 이어서, 이러한 유형의 융합 단백질은 웨스턴 블롯 실험에서 항원으로 사용된다. 그러나, 이러한 시험은 비교적 시간이 걸리고 복잡하며 많은 비용을 투자해야 수행할 수 있으므로, 다량의 사람 혈청을 정량 분석하기에는 부적합한 것으로 보인다. 더욱이, 이러한 시험은 각종 유형의 유두종 바이러스가 이들의 단백질 코어와도 관련 되어 있어 그다지 특이적이지 않으므로, 항체와 상이한 유형의 유두종 바이러스로부터의 단백질 또는 융합 단백질과의 가교 반응을 배제할 수 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 사람의 HPV18-유도된 질환의 예방, 진단 및 치료에서 보조수단으로 적합한 HPV18의 바이러스 구조를 동정하는 것이다. 이러한 구조(단백질 영역)에 관한 지식은 다량의 사람 혈청을 특이적 HPV의 존재 유무에 대해 검사할 수 있는 시험 설정에 있어 필수 전제 조건이다.
즉, 본 발명은 아미노산 서열
TENSPLGERLEVDTELSPRLQEISLNS
를 갖는, HPV18의 E1 단백질상의 혈청반응성 에피토프 및 아미노산 서열
I. DPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKT
II. MARFEDPTRRPYKL 및
III. AACHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLT
중 하나를 갖는, HPV18의 E6 단백질상의 혈청반응성 에피토프, 및 아미노산 서열
I. VLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQ HLPARRAEPQRH 및
II. IDGVNHQHLPARR
중 하나를 갖는, HPV18의 E7 단백질상의 혈청반응성 에피토프를 포함한다.
또한, 본 발명은 전술한 혈청반응성 에피토프의 본 발명에 따른 아미노산 서열(들)을 또는 하나이상 포함하는 펩타이드를 포함한다.
또한, 본 발명은 HPV18의 단백질의 전술한 혈청 반응성 에피토프중 하나 이상의 아미노산 서열(들)을 포함하는 펩타이드를 기본으로 하는 백신을 포함한다.
HPV18 E1, E6 및 E7 단백질에 대한 특이 항체는 본 발명에 따른 진단키트를 사용하여 환자의 혈청 중에서 검출 해낼 수 있다. 이러한 키트는 본 발명에 따른 펩타이드를 함유 한다.
더욱이, 예방차원에서 볼 때, 혈청반응성 영역을 포함하는 특이적 바이러스 단백질을 이들 영역에 대해 지시된 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 사용하여 적기에 혈청 중에서 동정해낼 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 HPV18의 혈청반응성 영역에 대해 특이적으로 지시된 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 함유하는 진단 키트도 포함한다.
다음의 상호 독립적인 방법을 사용하여 혈청반응성 에피토프를 동정한다 :
A. 숏건 발현 뱅크(shotgun expression bank)의 스크리닝
세균 플라스미드 백터 pSP 65내에 클로닝된 HPV18 DNA를 초음파 전단에 이어 계속해서 DNase 처리하여 평균 크기가 100 염기쌍인 단편으로 전환시킨다. 이들 단편의 말단을 T4 DNA 폴리머라제로 충진시킨 다음 파아지 발현 백터 fuse 1에 연결시킨다. fuse 1은 박테리오 파아지 fd로부터 유도되며 문헌[참조 : Science 228. 1315-1317 (1985)]에 기술되어 있다. 파아지를 이. 콜라이 K91과 함께 플레이팅하여 니트로셀룰로스 필터상에 레플리카를 만든 다음, 필터를 적합한 폴리클로날 토끼 혈청과 함께 배양한다. 양성 클론을 수회의 선발 단계를 거쳐 분리해내고, DNA 서열분석에 의해 면역 반응성 펩타이드 서열을 동정한다.
B. 펩타이드 오우버랩화
HPV18 E6 및 E7 단백질의 짧은 단편에 상응하는 127개의 오우버랩화 펩타이드를 Fmoc 화학법[참조 : Proc. Natl. Acad. Sci., 82. 178 (1985)]을 이용하여 폴리에틸렌 핀 상에서 합성한다. E6 및 E7 단백질의 단백질 서열을 다음 펩타이드와 8개의 아미노산이 일치하는 10량체로 세분한다. 이 펩타이드를 적절한 항혈청중에서 ELISA로 검정한다.
[실시예 1]
섬유상 파아지 fd의 유도체를 사용하여 HPV18 DNA 단편에 대한 발현 시스템을 수득한다. 이러한 목적을 위하여, fuse 1[참조 문헌 : fd-tet-J6, Science 228, 1315-1317(1985); Gene 73. 305-318 (1988)]를 단일 Pvu II 분해 부위에서 절단한다. DNA 수선 후 DNase I으로 분해하여 수득한 게놈성 HPV18 DNA 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 평활 말단 연결시킨다. fuse 1벡터를 형질전환시키기 위하여, 이.콜라이 균주 K802[참조 문헌 : F-galk2 gal T22 met B1 supE44 hsdr (2); Journal of Molecular Biology 16. 118-133 (1966)]를 문헌[참조 : Hanahan. Journal of Molecular Biology 166, 557-580 (1988)]의 방법중에 사용한다. tet-내성 콜로니는 F-표현형인 이유로 해서 세균에 대하여 감염성이 아닌 박테리오파아지를 생성한다. 파아지를 플레이팅하기 위하여, 이.콜라이 균주 K91[참조 문헌: F+이.콜라이 K38의 유도제. Virology 49. 45-60 (1972)]를 사용한다.
[실시예 2]
전술한 무작위 뱅크로부터 약 50,000개의 재조합 파아지를 10mM MgSO를 함유하는 3.5ml의 0.5％ 아가로스 내에서 대수적으로 생장하는 이.콜라이 K91 세포 02ml와 최소 아가 플레이트상에 플레이팅한다. 플레이트의 레플리카를 니트로셀룰로스 필터상에 만든 다음 시그날을 증진시키기 위하여 새로운 최소 아가상 37℃에서 6시간동안 추가 배양한다. 이어서, 필터를 PBS중의 10％ 저지방 우유로 60분간 차단시킨 다음 HPV-특이 항혈청을 1:100 내지 1:1000으로 희석시킨 5％ 우유/PBS 중에서 밤새 배양한다. 특이적 HPV 항혈청 대신에 모노클로날 항체를 사용하는 것도 가능하다. 항혈청은 음파 처리한 K91 세포와 예비흡착시킨다. 이어서, 필터를 특히 PBS/0.1％ Tween20 중에서 5분간 및 이어서 실온에서 3시간 동안 염소 항-토끼 항체로 5회 세척하거나, 모노클로날 항체가 사용될 경우, 5％ 저지방 우유중 항-마우스 퍼옥시다제 항체(1:1000)와 배양한다. 필터를 세척한 후에, 30mg의 디아미 노벤지딘, 30㎕의 30％ H2O2및 105ml의 1% NiSO4를 함유하는 50ml의 PBS 내에서 염색한다. 이어서, 필터를 H2O 중에서 30분간 세척한 다음 필터 페이퍼상에서 건조시킨다.
초기에 HPV18 E7에 대한 폴리클로날 토끼 혈청을 사용 하여 25개의 파아지를 분리해 냈으며 계속되는 정제 단계에서 이들중 18개가 양성인 것으로 판명되었다. 계속해서, 파아지 입자를 배양액중에서 생장시켜 일본쇄 DNA를 제조한다.
[실시예 3]
HPV18 E6 단백질에 대해서도 실시예 2에서와 동일한 시험을 한다. 사용된 폴리클로날 토끼 혈청이 비-바이러스성 에피토프와 가교 반응을 하므로, 웨스턴 블롯법외에도 특이적 DNA 단편을 프로브로서 사용하여 모든 반응성 재조합체 가운데서 HPV18 E6 부분을 함유하는 것들을 동정한다. 70,000개의 재조합 파아지로부터 15개를 분리하여 최종적으로 서열분석한다. 즉, 예를 들면, 에피토프 HPV18 E6 제1번은 조사된 파아지 뱅크에서 총 10배량으로 존재함이 밝혀졌다.
[실시예 4]
[fuse 1 재조합체로부터 일본쇄 DNA의 제조]
이러한 목적을 위하여 문헌[참조 : Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74. 5463-5467 (1977)]의 방법을 사용한다. 50ml의 LM을 fuse 1 플라스미드를 지니는 test-내성 이.콜라이 K91 세포와 배양하고, 이 혼합물을 37℃에서 16시간 동안 배양 한다. 이어서, 세균을 6000rpm에서 30분간 펠렛화한다. 2ml의 40% PEG 6000 및 2ml의 5M 나트륨 아세테이트(pH 6.5)를 상등액에 가하고, 파아지를 0℃에서 60분간 침전시킨 다음 침전물을 6000rpm에서 60분간 원심분리한다. 펠렛을 0.3ml의 TE에 재현탁시킨다. DNA를 2회 페놀 추출한 다음 침전 시킨다. 이어서, 제제중 약 25%를 서열분석에 사용한다.
[실시예 5]
[서열 분석]
DNA 서열분석에 표준 USB(United States Biochemicals) 법을 사용한다. 보편적인 프라이머를 20량체 올리고뉴클레오타이드(5'-TCCAGACGTTAGTAAATGAA-3')로 대치시킨다.
[실시예 6]
[펩타이드 합성]
짧은 단편에서 ORF HPV18 E6 및 E7을 나타내는 127개의 오우버랩화 펩타이드를 문헌[참조 : Proc. Natl. Acad. Sci. 82. 178 (1985) 및 Proc. Natl. Acad. Sci. 81. 3998 (1985)]에 기술된 바와 같이 폴리에틸렌 핀상에서 Fmoc 화학법으로 합성한다. β-알라닌으로부터 유도시킨 폴리에틸렌 핀은 CRB England로부터 구입한다. 상기 인용한 간행물로부터 벗어나서, 단백질 서열을 인접 펩타이드와 8개의 아미노산까지 오우버랩되는 데카펩타이드로 세분한다. Fmoc 화합법을 사용하여 동일 반응계에서 BOP(castro 시약)에 의한 활성화[참조 문헌 : Tetrahedron Letters. 14. 1219(1975)]에 의하여 합성한다. Fmoc-아미노산 유도체(6㎛ol). BOP 및 N-메틸모폴린 용액을 합성하고자 하는 펩타이드 서열에 상응하는 폴리에틸렌 핀(CRB)상에 분포시킨다. 모든 기타 반응은 CRB법에 따라 수행한다.
[실시예 7]
폴리에틸렌 핀을 ELISA 검정법에 의하여 전술한 폴리클로날 토끼 혈청과 함께 배양하고, 결합된 항체는 단백질 A-퍼옥시다제를 사용하여 검출한다. 비-특이적 결합에 의해 생성된 백그라운드는 제1항체 없이 단백질 A배양에 의하여 정량한다. 반응성 펩타이드는 파아지 스크린에 의해 혈청-반응성 에피토프로서 동정되는 영역내에 위치한다.
모든 검정과정은 폴리에틸렌 핀에 공유 결합된 펩타이드 및 또한 이들이 처음부터 합성된 펩타이드 상에서 수행한다. 미세역가 플레이트의 웰에 도입될 수 있는 배위로 고정된 96개 핀이 있는 랙(rack)을 사용한다. ELISA를 위한 배양은 핀을 웰에 침지시키면서 수행한다. 핀을 메탄올 및 PBS로 세척한 다음 37℃에서 2시간 동안 PBS중의 0.25% 젤라틴, 0.1% Tween 20으로 차단시키고 이어서 0.125% 젤라틴 및 0.05% Tween 20 중에서 1:200 내지 1:4000으로 희석시킨 혈청과 37℃에서 1시간 동안 배양한다. PBS/0.1% Tween 20으로 다시 세척한 후에, 핀을 단백질 A-퍼옥시다제 1:4000과 37℃에서 1시간 동안 배양한 다음 다시 세척하고 테트라메틸 벤지딘(TMB)으로 15분간 염색한다. 염색 용액으로부터 핀을 빼내고 100㎕의 0.2mol H2SO₄용액을 첨가함으로써 염색 과정을 정지한다. 이어서, 자동 ELISA 판독기 중에서 흡광도를 측정한다. ELISA 공정후 항체-효소 복합체를 제거 하기 위하여, 핀을 PBS/1% SDS/0.1% β-머캅토에탄올내 60℃에서 1시간 동안 초음파(수욕, 30W, 48KHz) 배양한다. 이러한 공정의 효율은 제1혈청을 사용함이 없이 단백질 A/퍼옥시다제를 사용하는 ELISA에 의하여 시험한다. 동일 펩타이드를 ELISA에 의해 40회 이상 검정한다.
Claims (5)
- 하기의 아미노산 서열(Ⅱ) 및 (Ⅲ)중 어느 하나를 갖는, HPV18의 E6 단백질상의 혈청반응성 에피토프.Ⅱ. MARFEDPTRRPYKLⅢ. AACHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLT
- 하기의 아미노산 서열(Ⅰ) 및 (Ⅱ)중 어느 하나를 갖는, HPV18의 E7 단백질상의 혈청반응성 에피토프.I. VLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHII. IDGVNHQHLPARR
- 제1항 또는 제2항에 따른 혈청반응성 에피토프를 하나 이상 포함하는 펩타이드.
- 제3항에 따른 펩타이드를 하나 이상 함유하는, HPV18의 단백질 E6 또는 E7에 대해 지시된 특이 항체를 동정하기 위한 진단 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 따른 에피토프에 대해 특이성이 있고/있거나 제3항에 따른 펩타이드에 대해 특이성이 있는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 함유하는, 환자 혈청중의 바이러스 단백질을 동정하기 위한 진단 조성물.
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