JP2001026600A - ヒトパピローマウイルス１８のタンパク質における血清反応性エピトープ - Google Patents
ヒトパピローマウイルス１８のタンパク質における血清反応性エピトープInfo
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトにおけるＨＰＶ１８起因性疾患の予防、
診断及び治療における補助として適したＨＰＶ１８のウ
イルス構造を確認する。 【解決手段】 ヒトパピローマウイルスＨＰＶ１８のタ
ンパク質Ｅ１、Ｅ６およびＥ７における血清反応性エピ
トープ。血清反応性エピトープの配列と全部又は一部一
致するアミノ酸配列を有するペプチド及びこのようなペ
プチドを含有したワクチン。
診断及び治療における補助として適したＨＰＶ１８のウ
イルス構造を確認する。 【解決手段】 ヒトパピローマウイルスＨＰＶ１８のタ
ンパク質Ｅ１、Ｅ６およびＥ７における血清反応性エピ
トープ。血清反応性エピトープの配列と全部又は一部一
致するアミノ酸配列を有するペプチド及びこのようなペ
プチドを含有したワクチン。
Description
【０００１】本発明はヒトパピローマウイルス（ＨＰ
Ｖ）１８のタンパク質Ｅ１、Ｅ６及びＥ７における血清
反応性領域に関する。
Ｖ）１８のタンパク質Ｅ１、Ｅ６及びＥ７における血清
反応性領域に関する。
【０００２】本発明は上記ウイルスタンパク質の血清反
応性領域のアミノ酸配列を有するペプチドを含有したワ
クチン及び上記ペプチドを含有した診断用キットにも関
する。
応性領域のアミノ酸配列を有するペプチドを含有したワ
クチン及び上記ペプチドを含有した診断用キットにも関
する。
【０００３】ＨＰＶ１８は最初にProc.Natl.Acad.Sci.U
SA,80,3813-3815(1983) で記載された特定タイプのヒト
パピローマウイルスである。
SA,80,3813-3815(1983) で記載された特定タイプのヒト
パピローマウイルスである。
【０００４】ＨＰＶ１８のウイルスゲノムのＤＮＡ配列
及び構成はVirology,145,181-185(1985)で公表された。
及び構成はVirology,145,181-185(1985)で公表された。
【０００５】ＨＰＶ１８は肛門性器路の良性病変ばかり
でなく子宮頸部、ペニス及び膣の悪性腫瘍をも誘導す
る。しかしながら、ＨＰＶ１８は臨床的症状のない個体
からの生殖器切片でもみられる。現在まで、ＨＰＶ１８
及び他のパピローマウイルスによる感染に対する免疫応
答性に関してはほとんど知られていない。
でなく子宮頸部、ペニス及び膣の悪性腫瘍をも誘導す
る。しかしながら、ＨＰＶ１８は臨床的症状のない個体
からの生殖器切片でもみられる。現在まで、ＨＰＶ１８
及び他のパピローマウイルスによる感染に対する免疫応
答性に関してはほとんど知られていない。
【０００６】最初の実験では、ＳＴＤ患者、頸部腫瘍の
ある患者及び健康体からのヒト血清がウイルスタンパク
質に対する抗体の存在に関して試験された。これらのウ
イルスタンパク質は様々な原核生物ペプチドにそれらの
Ｎ末端を介して共有結合した融合タンパク質として発現
された。そこでこのタイプの融合タンパク質がウェスタ
ーンブロット実験で抗原として用いられた。しかしなが
ら、この試験は比較的時間浪費的かつ複雑であって、多
大な費用でのみ行うことができ、そのため多量のヒト血
清の定量分析には適さないようである。加えて、様々な
パピローマウイルスタイプがそれらのタンパク質コアの
面でも関連し合い、このため異なるパピローマウイルス
タイプからのタンパク質又は融合タンパク質と抗体との
交差反応が除外しえないことから、この試験はさほど特
異的でない。
ある患者及び健康体からのヒト血清がウイルスタンパク
質に対する抗体の存在に関して試験された。これらのウ
イルスタンパク質は様々な原核生物ペプチドにそれらの
Ｎ末端を介して共有結合した融合タンパク質として発現
された。そこでこのタイプの融合タンパク質がウェスタ
ーンブロット実験で抗原として用いられた。しかしなが
ら、この試験は比較的時間浪費的かつ複雑であって、多
大な費用でのみ行うことができ、そのため多量のヒト血
清の定量分析には適さないようである。加えて、様々な
パピローマウイルスタイプがそれらのタンパク質コアの
面でも関連し合い、このため異なるパピローマウイルス
タイプからのタンパク質又は融合タンパク質と抗体との
交差反応が除外しえないことから、この試験はさほど特
異的でない。
【０００７】したがって、本発明の目的はヒトにおける
ＨＰＶ１８起因性疾患の予防、診断及び治療における補
助として適したＨＰＶ１８のウイルス構造を確認するこ
とである。このような構造（タンパク質ドメイン）に関
する知識は、多量のヒト血清が特定ＨＰＶの存在に関し
て検査されうる試験の確立上必須である。
ＨＰＶ１８起因性疾患の予防、診断及び治療における補
助として適したＨＰＶ１８のウイルス構造を確認するこ
とである。このような構造（タンパク質ドメイン）に関
する知識は、多量のヒト血清が特定ＨＰＶの存在に関し
て検査されうる試験の確立上必須である。
【０００８】従って、本発明は下記アミノ酸配列：
【化３】 を有するＨＰＶ１８のＥ１タンパク質における血清反応
性エピトープ、下記アミノ酸配列：
性エピトープ、下記アミノ酸配列：
【化４】 のうち１つを有するＨＰＶ１８のＥ６タンパク質におけ
る血清反応性エピトープ、及び下記アミノ酸配列：
る血清反応性エピトープ、及び下記アミノ酸配列：
【化５】 のうち１つを有するＨＰＶ１８のＥ７タンパク質におけ
る血清反応性エピトープ、に関する。
る血清反応性エピトープ、に関する。
【０００９】本発明は前記血清反応性エピトープの本発
明によるアミノ酸配列のいずれか１種またはそれ以上を
含んだペプチドにも関する。
明によるアミノ酸配列のいずれか１種またはそれ以上を
含んだペプチドにも関する。
【００１０】本発明はＨＰＶ１８のタンパク質の前記血
清反応性エピトープの１種またはそれ以上のアミノ酸配
列を含んだペプチドに基づくワクチンにも関する。
清反応性エピトープの１種またはそれ以上のアミノ酸配
列を含んだペプチドに基づくワクチンにも関する。
【００１１】ＨＰＶ１８ Ｅ１、Ｅ６及びＥ７タンパク
質に対する特異的抗体は本発明による診断用キットを用
いて患者血清において検出することができる。このキッ
トは本発明によるペプチドを含有している。
質に対する特異的抗体は本発明による診断用キットを用
いて患者血清において検出することができる。このキッ
トは本発明によるペプチドを含有している。
【００１２】更に、血清反応性領域を含んだ特定ウイル
スタンパク質がこれらの領域に対するポリクローナル抗
体又はモノクローナル抗体を用いて適時に血清中で同定
されることも予防目的から可能である。したがって、本
発明はＨＰＶ１８の血清反応性領域に特異的なポリクロ
ーナル又はモノクローナル抗体を含有した診断用キット
にも関する。
スタンパク質がこれらの領域に対するポリクローナル抗
体又はモノクローナル抗体を用いて適時に血清中で同定
されることも予防目的から可能である。したがって、本
発明はＨＰＶ１８の血清反応性領域に特異的なポリクロ
ーナル又はモノクローナル抗体を含有した診断用キット
にも関する。
【００１３】下記の相互に独立した方法は血清反応性エ
ピトープを同定するために用いられた： Ａ．ショットガン発現バンクのスクリーニング：細菌プ
ラスミドベクター ｐＳＰ６５でクローニングされたＨＰＶ１８ ＤＮＡは
超音波剪断しかる後ＤＮアーゼ処理で平均サイズ１００
塩基対の断片に変換された。これら断片の末端はＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで補充され、ファージ発現ベクターｆ
ｕｓｅ１に結合された。ｆｕｓｅ１はバクテリオファー
ジｆｄから誘導され、Science,228,1315-1317(1985)で
記載されている。そのファージは大腸菌Ｋ９１と共にプ
レーティングされ、レプリカがニトロセルロースフィル
ターで作製され、フィルターが適切なポリクローナルウ
サギ血清と共にインキュベートされた。陽性クローンは
いくつかの選抜ステップで単離され、免疫反応性ペプチ
ド配列はＤＮＡ配列決定により確認された。
ピトープを同定するために用いられた： Ａ．ショットガン発現バンクのスクリーニング：細菌プ
ラスミドベクター ｐＳＰ６５でクローニングされたＨＰＶ１８ ＤＮＡは
超音波剪断しかる後ＤＮアーゼ処理で平均サイズ１００
塩基対の断片に変換された。これら断片の末端はＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで補充され、ファージ発現ベクターｆ
ｕｓｅ１に結合された。ｆｕｓｅ１はバクテリオファー
ジｆｄから誘導され、Science,228,1315-1317(1985)で
記載されている。そのファージは大腸菌Ｋ９１と共にプ
レーティングされ、レプリカがニトロセルロースフィル
ターで作製され、フィルターが適切なポリクローナルウ
サギ血清と共にインキュベートされた。陽性クローンは
いくつかの選抜ステップで単離され、免疫反応性ペプチ
ド配列はＤＮＡ配列決定により確認された。
【００１４】Ｂ．ペプチド重複 ＨＰＶ１８ Ｅ６及びＥ７タンパク質の短いセグメント
に相当する１２７の重複ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学を用
いてポリエチレンピン上で合成した〔Proc.Natl.Acad.S
ci.82,178(1985)〕。Ｅ６及びＥ７タンパク質のタンパ
ク質配列は次のペプチドと８アミノ酸で一致する１０マ
ー（mer)に分割された。そのペプチドは適切な抗血清中
でＥＬＩＳＡにより調べられた。
に相当する１２７の重複ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学を用
いてポリエチレンピン上で合成した〔Proc.Natl.Acad.S
ci.82,178(1985)〕。Ｅ６及びＥ７タンパク質のタンパ
ク質配列は次のペプチドと８アミノ酸で一致する１０マ
ー（mer)に分割された。そのペプチドは適切な抗血清中
でＥＬＩＳＡにより調べられた。
【００１５】
【実施例】例 １ 線維状ファージｆｄの誘導体を用いて、ＨＰＶ１８ Ｄ
ＮＡ断片に関する発現系を得た。このため、ｆｕｓｅ１
〔ｆｄ‐ｔｅｔ‐Ｊ６，Science,228,1315-1317(1985);
Gene,73,305-318(1988)〕を単一ＰｖｕII開裂部位で切
断した。ＤＮＡ修復後のＤＮアーゼＩ消化によるゲノム
ＨＰＶ１８ ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで平滑末
端結合させた。ｆｕｓｅ１ベクターを形質転換するた
め、大腸菌Ｋ８０２株〔Ｆ- galK2 galT22 metB1 supE4
4 hsdr(2);Journal ofMolecular Biology,16,118-133(1
966) 〕をJournal of Molecular Biology,166,557-580
(1988)におけるHanahan の方法で用いた。ｔｅｔ耐性コ
ロニーは、それらのＦ- 表現型のために細菌に感染しな
いバクテリオファージを産生する。ファージを培養する
ため、大腸菌Ｋ９１株〔Ｆ+ ，大腸菌Ｋ３８の誘導体,V
irology,49,45-60(1972)〕を用いた。
ＮＡ断片に関する発現系を得た。このため、ｆｕｓｅ１
〔ｆｄ‐ｔｅｔ‐Ｊ６，Science,228,1315-1317(1985);
Gene,73,305-318(1988)〕を単一ＰｖｕII開裂部位で切
断した。ＤＮＡ修復後のＤＮアーゼＩ消化によるゲノム
ＨＰＶ１８ ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで平滑末
端結合させた。ｆｕｓｅ１ベクターを形質転換するた
め、大腸菌Ｋ８０２株〔Ｆ- galK2 galT22 metB1 supE4
4 hsdr(2);Journal ofMolecular Biology,16,118-133(1
966) 〕をJournal of Molecular Biology,166,557-580
(1988)におけるHanahan の方法で用いた。ｔｅｔ耐性コ
ロニーは、それらのＦ- 表現型のために細菌に感染しな
いバクテリオファージを産生する。ファージを培養する
ため、大腸菌Ｋ９１株〔Ｆ+ ，大腸菌Ｋ３８の誘導体,V
irology,49,45-60(1972)〕を用いた。
【００１６】例 ２ 前記ランダムバンクから約５０，０００の組換えファー
ジを最少寒天プレート上で１０mMＭｇＳＯ４含有０．５
％アガロース３．５ml中指数的増殖大腸菌Ｋ９１細胞
０．２mlと共にプレーティングした。プレートのレプリ
カをニトロセルロースフィルターで作製し、しかる後シ
グナルを高めるため新鮮最少寒天上３７℃で更に６時間
インキュベートした。次いでフィルターをＰＢＳ中１０
％低脂肪ミルクで６０分間ブロックし、１：１００〜
１：１０００のＨＰＶ特異性抗血清希釈の５％ミルク／
ＰＢＳ中において一夜インキュベートした。特異的ＨＰ
Ｖ抗血清の代わりにモノクローナル抗体を用いることも
可能である。抗血清を音波処理Ｋ９１細胞で前吸着させ
た。次いでフィルターを特にＰＢＳ／０．１％ツイーン
２０で５分間しかる後ヤギ抗ウサギ抗体と共に室温で３
時間、で５回洗浄するか、又はモノクローナル抗体が用
いられる場合には５％低脂肪ミルク中で抗マウスペルオ
キシダーゼ抗体（１：１０００）と共にインキュベート
した。フィルターを洗浄した後、それらをジアミノベン
ジジン３０mg、３０％強度Ｈ２Ｏ２３０μｌ及び１％強
度ＮｉＳＯ４１．５ml含有ＰＢＳ５０mlで染色した。次
いでフィルターをＨ２Ｏで３０分間洗浄し、しかる後濾
紙上で乾燥させた。最初に２５のファージをＨＰＶ１８
Ｅ７に対するポリクローナルウサギ血清を用いて単離
し、そのうち１８が次の精製ステップで陽性とわかっ
た。次いでファージ粒子を培養増殖させ、一本鎖ＤＮＡ
を得た。
ジを最少寒天プレート上で１０mMＭｇＳＯ４含有０．５
％アガロース３．５ml中指数的増殖大腸菌Ｋ９１細胞
０．２mlと共にプレーティングした。プレートのレプリ
カをニトロセルロースフィルターで作製し、しかる後シ
グナルを高めるため新鮮最少寒天上３７℃で更に６時間
インキュベートした。次いでフィルターをＰＢＳ中１０
％低脂肪ミルクで６０分間ブロックし、１：１００〜
１：１０００のＨＰＶ特異性抗血清希釈の５％ミルク／
ＰＢＳ中において一夜インキュベートした。特異的ＨＰ
Ｖ抗血清の代わりにモノクローナル抗体を用いることも
可能である。抗血清を音波処理Ｋ９１細胞で前吸着させ
た。次いでフィルターを特にＰＢＳ／０．１％ツイーン
２０で５分間しかる後ヤギ抗ウサギ抗体と共に室温で３
時間、で５回洗浄するか、又はモノクローナル抗体が用
いられる場合には５％低脂肪ミルク中で抗マウスペルオ
キシダーゼ抗体（１：１０００）と共にインキュベート
した。フィルターを洗浄した後、それらをジアミノベン
ジジン３０mg、３０％強度Ｈ２Ｏ２３０μｌ及び１％強
度ＮｉＳＯ４１．５ml含有ＰＢＳ５０mlで染色した。次
いでフィルターをＨ２Ｏで３０分間洗浄し、しかる後濾
紙上で乾燥させた。最初に２５のファージをＨＰＶ１８
Ｅ７に対するポリクローナルウサギ血清を用いて単離
し、そのうち１８が次の精製ステップで陽性とわかっ
た。次いでファージ粒子を培養増殖させ、一本鎖ＤＮＡ
を得た。
【００１７】例 ３ 例２の場合と同じ方法をでＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質
に関しても選択した。用いられたポリクローナルウサギ
血清は非ウイルスエピトープと交差反応したため、ウェ
スターンブロット法以外ではすべての反応性組換え体の
中からＨＰＶ１８ Ｅ６部分のあるものを同定するため
に特定ＤＮＡ断片がプローブとして用いられた。７０，
０００の組換えファージから１５を単離し、最後に配列
決定した。エピトープＨＰＶ１８ Ｅ６ No.１は、例え
ば調べられたファージバンクの中で合計１０回みつけら
れた。
に関しても選択した。用いられたポリクローナルウサギ
血清は非ウイルスエピトープと交差反応したため、ウェ
スターンブロット法以外ではすべての反応性組換え体の
中からＨＰＶ１８ Ｅ６部分のあるものを同定するため
に特定ＤＮＡ断片がプローブとして用いられた。７０，
０００の組換えファージから１５を単離し、最後に配列
決定した。エピトープＨＰＶ１８ Ｅ６ No.１は、例え
ば調べられたファージバンクの中で合計１０回みつけら
れた。
【００１８】例 ４ ｆｕｓｅ１組換え体からの一本鎖ＤＮＡの製造 このためにProc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463-5467(197
7) の操作を用いた。ＬＭ５０mlをｆｕｓｅ１プラスミ
ドを有するｔｅｔ耐性大腸菌Ｋ９１細胞と共にインキュ
ベートし、この混合物を３７℃で１６時間インキュベー
トした。次いで細菌を６０００rpm で３０分間かけてペ
レット化した。上澄に４０％強度ＰＥＧ６０００の２ml
及びｐＨ６．５の５Ｍ酢酸ナトリウム２mlの添加後、フ
ァージを０℃で６０分間かけて沈降させ、沈降物を６０
００rpm で６０分間遠心した。ペレットをＴＥ０．３ml
に再懸濁した。２回のフェノール抽出の後、ＤＮＡ沈降
させた。次いで約２５％の調製物を配列決定に用いた。
7) の操作を用いた。ＬＭ５０mlをｆｕｓｅ１プラスミ
ドを有するｔｅｔ耐性大腸菌Ｋ９１細胞と共にインキュ
ベートし、この混合物を３７℃で１６時間インキュベー
トした。次いで細菌を６０００rpm で３０分間かけてペ
レット化した。上澄に４０％強度ＰＥＧ６０００の２ml
及びｐＨ６．５の５Ｍ酢酸ナトリウム２mlの添加後、フ
ァージを０℃で６０分間かけて沈降させ、沈降物を６０
００rpm で６０分間遠心した。ペレットをＴＥ０．３ml
に再懸濁した。２回のフェノール抽出の後、ＤＮＡ沈降
させた。次いで約２５％の調製物を配列決定に用いた。
【００１９】例 ５ 配列決定 標準ＵＳＢ〔ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカル
ズ(United StatesBiochemicals) 〕法（USB,1987) をＤ
ＮＡ配列決定に用いた。ユニバーサルプライマーを２０
マーオリゴヌクレオチド(5´-TCCAGACGTTAGTAAATGAA-3
´)に代えた。
ズ(United StatesBiochemicals) 〕法（USB,1987) をＤ
ＮＡ配列決定に用いた。ユニバーサルプライマーを２０
マーオリゴヌクレオチド(5´-TCCAGACGTTAGTAAATGAA-3
´)に代えた。
【００２０】例 ６ ペプチド合成 短いセグメントでＯＲＦのＨＰＶ１８ Ｅ６及びＥ７を
表す１２７の重複ペプチドをProc.Natl.Acad.Sci.USA,8
2,178(1985) 及びProc.Natl.Acad.Sci.81,3998(1985)で
記載されたようにポリエチレンピン上でＦｍｏｃ化学に
より合成した。β‐アラニンで誘導されたポリエチレン
ピンはＣＲＢイングランド(CRB England) から得た。前
記文献とは異なり、タンパク質配列は隣接ペプチドと８
アミノ酸で重複したデカペプチドに分割した。合成はＦ
ｍｏｃ化学及びＢＯＰ〔カストロ(Castro)試薬〕による
in situ 活性化を利用して行った〔Tetrahedron Letter
s,14,1219(1975) 〕。Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（６μmo
l)、ＢＯＰ及びＮ‐メチルモルホリン溶液を合成される
ペプチド配列に応じてポリエチレンピン（ＣＲＢ）に分
配した。すべての他の反応はＣＲＢプロトコールに従い
行った。
表す１２７の重複ペプチドをProc.Natl.Acad.Sci.USA,8
2,178(1985) 及びProc.Natl.Acad.Sci.81,3998(1985)で
記載されたようにポリエチレンピン上でＦｍｏｃ化学に
より合成した。β‐アラニンで誘導されたポリエチレン
ピンはＣＲＢイングランド(CRB England) から得た。前
記文献とは異なり、タンパク質配列は隣接ペプチドと８
アミノ酸で重複したデカペプチドに分割した。合成はＦ
ｍｏｃ化学及びＢＯＰ〔カストロ(Castro)試薬〕による
in situ 活性化を利用して行った〔Tetrahedron Letter
s,14,1219(1975) 〕。Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（６μmo
l)、ＢＯＰ及びＮ‐メチルモルホリン溶液を合成される
ペプチド配列に応じてポリエチレンピン（ＣＲＢ）に分
配した。すべての他の反応はＣＲＢプロトコールに従い
行った。
【００２１】例 ７ ポリエチレンピンをＥＬＩＳＡアッセイ法で前記ポリク
ローナルウサギ血清と共にインキュベートし、結合抗体
をプロテインＡペルオキシダーゼを用いて検出した。非
特異的結合で生じるバックグラウンドは第一抗体なしに
プロテインＡインキュベーションで定量した。反応性ペ
プチドは血清反応性エピトープとしてファージスクリー
ニングにより確認された領域に位置する。すべてのアッ
セイはポリエチレンピンに共有結合されたペプチドで行
われ、また、そのピン上にそれらが最初に合成されてい
た。マイクロタイタープレートのウェルに導入されうる
ような配置で固定された９６ピンを有するラックを用い
た。ＥＬＩＳＡのためのインキュベーションを行い、一
方でピンをウェルに浸漬した。ピンをメタノール及びＰ
ＢＳで洗浄し、次いでＰＢＳ中０．２５％ゼラチン、
０．１％ツイーン２０により３７℃で２時間かけてブロ
ックし、しかる後０．１２５％ゼラチン及び０．０５％
ツイーン２０で１：２００〜１：４０００希釈された血
清と共に３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／
０．１％ツイーン２０によるもう１回の洗浄ステップ
後、ピンをプロテインＡ‐ペルオキシダーゼ１：４００
０と共に３７℃で１時間インキュベートし、しかる後も
う１回洗浄ステップ及びテトラメチルベンジジン（ＴＭ
Ｂ）で１５分間染色を行った。染色ステップは染色溶液
からピンを引上げて０．２モルＨ２ＳＯ４溶液１００μ
ｌを加えることにより停止させた。次いで吸着量を自動
ＥＬＩＳＡ読取機で測定した。ＥＬＩＳＡ法の後に抗体
‐酵素複合体を除去するため、ピンをＰＢＳ／１％ＳＤ
Ｓ／０．１％β‐メルカプトエタノール中６０℃で１時
間超音波（水浴、３０Ｗ、４８KHz)下でインキュベート
し、最後にメタノールで洗浄した。この操作の効率は一
次血清を含むことなしにプロテインＡ／ペルオキシダー
ゼを用いてＥＬＩＳＡにより試験した。同じペプチドは
下記ＥＬＩＳＡで４０回以上調べた。
ローナルウサギ血清と共にインキュベートし、結合抗体
をプロテインＡペルオキシダーゼを用いて検出した。非
特異的結合で生じるバックグラウンドは第一抗体なしに
プロテインＡインキュベーションで定量した。反応性ペ
プチドは血清反応性エピトープとしてファージスクリー
ニングにより確認された領域に位置する。すべてのアッ
セイはポリエチレンピンに共有結合されたペプチドで行
われ、また、そのピン上にそれらが最初に合成されてい
た。マイクロタイタープレートのウェルに導入されうる
ような配置で固定された９６ピンを有するラックを用い
た。ＥＬＩＳＡのためのインキュベーションを行い、一
方でピンをウェルに浸漬した。ピンをメタノール及びＰ
ＢＳで洗浄し、次いでＰＢＳ中０．２５％ゼラチン、
０．１％ツイーン２０により３７℃で２時間かけてブロ
ックし、しかる後０．１２５％ゼラチン及び０．０５％
ツイーン２０で１：２００〜１：４０００希釈された血
清と共に３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／
０．１％ツイーン２０によるもう１回の洗浄ステップ
後、ピンをプロテインＡ‐ペルオキシダーゼ１：４００
０と共に３７℃で１時間インキュベートし、しかる後も
う１回洗浄ステップ及びテトラメチルベンジジン（ＴＭ
Ｂ）で１５分間染色を行った。染色ステップは染色溶液
からピンを引上げて０．２モルＨ２ＳＯ４溶液１００μ
ｌを加えることにより停止させた。次いで吸着量を自動
ＥＬＩＳＡ読取機で測定した。ＥＬＩＳＡ法の後に抗体
‐酵素複合体を除去するため、ピンをＰＢＳ／１％ＳＤ
Ｓ／０．１％β‐メルカプトエタノール中６０℃で１時
間超音波（水浴、３０Ｗ、４８KHz)下でインキュベート
し、最後にメタノールで洗浄した。この操作の効率は一
次血清を含むことなしにプロテインＡ／ペルオキシダー
ゼを用いてＥＬＩＳＡにより試験した。同じペプチドは
下記ＥＬＩＳＡで４０回以上調べた。
【００２２】
【表１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ルッツ、ギースマン ドイツ連邦共和国ウィースロッホ、イム、 ピロルウェーク、１ (72)発明者 マーチン、ミュラー ドイツ連邦共和国ハイデルベルク、フザー レンシュトラーセ、14
Claims (4)
- 【請求項１】下記アミノ酸配列のうち１つで表されるヒ
トパピローマウイルス１８のＥ６タンパク質における血
清反応性エピトープである抗原決定部位からなるペプチ
ド。 【化１】 - 【請求項２】下記のアミノ酸配列で表される血清反応性
エピトープの２種以上からなるペプチドであって、少な
くとも一つの血清反応性エピトープが請求項１に記載さ
れたエピトープであるペプチド。 【化２】 - 【請求項３】ヒトパピローマウイルス１８のタンパク質
Ｅ１、Ｅ６又はＥ７に対する特異的抗体を同定するため
の診断用組成物であって、請求項１および２に記載され
たペプチドから選択されるペプチドの１種またはそれ以
上を含むことを特徴とする組成物。 - 【請求項４】患者血清中のヒトパピローマウイルス１８
タンパク質を同定するための診断用組成物であって、請
求項１に記載されたペプチドに特異的な及び／又は請求
項２に記載されたペプチドに特異的なポリクローナル又
はモノクローナル抗体を含むことを特徴とする組成物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4015044A DE4015044A1 (de) | 1990-05-10 | 1990-05-10 | Seroreaktive epitope auf proteinen des menschlichen papillomavirus (hpv) 18 |
| DE4015044.5 | 1990-05-10 |
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Cited By (1)
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| AUPN015794A0 (en) | 1994-12-20 | 1995-01-19 | Csl Limited | Variants of human papilloma virus antigens |
| GB9503570D0 (en) * | 1995-02-23 | 1995-04-12 | Kodak Ltd | Process and apparatus for the development of photographic materials |
| AU4727296A (en) * | 1995-02-24 | 1996-09-11 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation |
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| AUPN443995A0 (en) * | 1995-07-27 | 1995-08-17 | Csl Limited | Papillomavirus polyprotein |
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| JP3618497B2 (ja) * | 1996-12-27 | 2005-02-09 | 富士通株式会社 | タンパク質の抗原決定基予測方法及びシステム |
| GB9717953D0 (en) | 1997-08-22 | 1997-10-29 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| CA2384987A1 (en) * | 1999-09-16 | 2001-03-22 | Zycos Inc. | Nucleic acids encoding polyepitope polypeptides |
| US20050100928A1 (en) * | 1999-09-16 | 2005-05-12 | Zycos Inc., A Delaware Corporation | Nucleic acids encoding polyepitope polypeptides |
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| EP1576967B1 (en) * | 2004-03-18 | 2007-09-12 | Institut Pasteur | Recombinant protein, carrying human papillomavirus epitopes inserted in an adenylate cyclase protein or fragment thereof, therapeutic uses thereof |
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| CN105753980B (zh) * | 2016-03-29 | 2019-04-02 | 上海市普陀区中心医院 | 一种hpv18 e6单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4777239A (en) * | 1986-07-10 | 1988-10-11 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Diagnostic peptides of human papilloma virus |
| DE3625257A1 (de) * | 1986-07-23 | 1988-02-04 | Behringwerke Ag | Expressionsprodukte der menschlichen papillomviren typ 16 und 18, fuer diese proteine spezifische antikoerper und diese antikoerper bzw. entsprechende dna enthaltende diagnostika |
-
1990
- 1990-05-10 DE DE4015044A patent/DE4015044A1/de not_active Withdrawn
-
1991
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