JP2755574B2 - 乳頭腫ウイルスの特徴を示すポリペプチドを含む組成物 - Google Patents
乳頭腫ウイルスの特徴を示すポリペプチドを含む組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は乳頭腫ウイルスの特徴を示すポリペプチドを
含む乳頭腫ウイルス感染の検出又は治療用組成物に係
る。 「乳頭腫ウイルス」なる用語は、一般に比較的良性の
皮膚又は粘膜のいぼから、上皮内新形成及び皮膚癌に変
質し得る過形成までの各段階に存在する数種類の形態の
ウイルス性感染の原因であると共通に認識されている多
数のウイルスを包含する。乳頭腫ウイルス感染のうち、
より特定的にはいぼ状表皮異形成が特筆され、これを以
下の文中ではしばしばEVとして表す。 所定数の型の乳頭腫ウイルスが文献中に既に記載され
ている。本特許出願の範囲では、いぼ又は散在斑性病変
から単離され、多数の罹患患者で皮膚癌を早発させ得る
多数の型及び亜型の新規乳頭腫ウイルスについて記載す
る。 最近の研究の結果、各腫の型のヒド乳頭腫ウイルス
（HPV）について多数の免疫因子及び主要な機能が明ら
かになっており、これらの因子は、乳頭腫ウイルス感染
病原体における各種の遺伝的因子及び放射線の機能とし
て文献中に既に記載されているものに加えられる。 本発明は、以下に規定するような本質的ゲノム特徴を
有する新規に単離された多数の乳頭腫ウイルスの相対的
挙動に関して為し得た研究に基づいている。 少数のEVの例については既に研究されており、ゲノム
の分子クローニングより既に６種類の型のHPVが特徴付
けられている（KREMSDORF,D.他、1982,J.Virol.43:436
−447及びKREMSDORF他、1983,J.Virol.48:340−351）。
これらのHPVは、異なる群に属するゲノム間に交差ハイ
ブリダイゼーションが形成されないかあるいは非常に弱
い交差ハイブリダイゼーションが形成されるかに従って
３群に分類されている。第１の群は、所定数のEV罹患患
者及び一般集団に観察されている扁平いぼに関連するHP
V3a及び10から成り、HPV3aのDNA配列に属するDNA配列EV
罹患患者の癌に見出だされた。第２の群は、HPV5、８及
び12を含んでおり、HPV5及び８のゲノムはEV罹患患者の
癌に検出された。第３の群は、今日までの処ではただ一
種類のウイルスHPV9から構成されている。免疫抑制した
腎同種移植片を移植されており、HPV5に感染しているこ
とが明白であった者を除き、第２及び第３群のウイルス
はEV罹患患者にしか検出されておらず、これらの患者の
大部分は数種類のウイルスに感染していた。ここで留意
すべき点として、文献（追って示す参考文献１−5,8,9,
13,14,16,18−20）に実際に挙げられている14種類の型
のHPVのうち４種類の型は、稀な病例であるEVに特異的
に関連付けられることが分かった。 本発明に至る研究により、多数の新規型及び亜型の乳
頭腫ウイルスを単離することができたので、より高度な
インビトロ診断法が予想できる。より特定的には本発明
は、例えば病変部又は生検切片から得られた乳頭腫の改
良された同定方法を提供するものであり、より正確な診
断を実現することができ、従って、該当病変に予想され
る進行に関して改良された予後診断を下すことができ
る。 一般に、乳頭腫ウイルスは非常に多くの種類がある
が、7000〜8000のオーダの塩基対の寸法を有しているこ
とが注目される。一方、該ウイルスのゲノムはある程度
の相同性を有し得る。以下の記載では、種々の型及び亜
型の乳頭腫ウイルス間の相同百分率を数的に表現する
が、この相同百分率は所謂非厳酷もしくは非過酷条件
下、又は厳酷もしくは過酷条件下で実施されたハイブリ
ダイゼーション試験の結果として得られた値である。 乳頭腫ウイルスのうち、過酷もしくは厳酷条件下で測
定された相同百分率により特徴付けられる数種類の型の
乳頭腫ウイルスについて考察しよう。このような条件下
で50％未満の相同百分率を有するす乳頭腫ウイルスは、
異なる型に属するといえよう。このため、異なる型のウ
イルス間の相同百分率は過酷もしくは厳酷条件下ではゼ
ロとさえなることが銘記されよう。この過酷もしくは厳
酷条件で50％を越える相同百分率が観察されるようなウ
イルスは、同一型に属すると見なされ、この同一型のう
ちで異なる亜型を形成すると見なされる。 非過酷もしくは非厳酷条件のハイブリダイゼーション
試験では、HEILMAN C.A.他、1980,J.Virol.,36,395−40
7及びCROISSANT他、1982、C.R.Acad.Sc.Paris,294,581
−586に記載されている条件下でウイルスの２つの単離
体から得られたDNA（ヘテロニ重鎖分子）を相互に接触
させる。 過酷もしくは厳酷条件のハイブリダイゼーション試験
では、KREMSDORF,D.他（（1982）,J.Virol.43:436−447
及び1983,J.Virol.48:340−351）及びDAVIS R.W.他、19
71,Methods Enzymol.,21,413−428により記載されてい
る条件下でウイルスの２つの単離体しから得られたDNA
（ヘテロ二重鎖分子）を相互に接触させる。 概して、同一型に属する乳頭腫ウイルスは夫々の長さ
の全体の80〜100％にわたってほぼ等しいヌクレオチド
配列を有するハイブリダイズ可能な配列を有しており、
これらの相同配列は異なる型の乳頭腫ウイルスでは60
％、即ち同一型の場合よりも少なくなることが注目され
よう。非過酷もしくは非厳酷条件下で相互にハイブリッ
ド形成する異なる型の乳頭腫ウイルスの配列の同一もし
くは相同度は、同一型に属する乳頭腫ウイルスの場合よ
りも明らかに小さい。 発明者らが研究を進めた結果、各種の型の乳頭腫ウイ
ルス間の遺伝子異質度は従来予想されていたよりも大き
いこと、同時に各種の型は所定の特異度を有する感染形
又は感染変異体にしばしば関連していることがわかっ
た。 従って本発明は、予め単離された各種の新規乳頭腫ウ
イルスから単離され得るDNA及びこれらのDNAの全部又は
一部から構成され得るプローブに係るのみならず、種々
の種類の感染、即ち所定の乳頭腫ウイルスを発見された
患者の危険の程度を診断するためにより効果的に使用さ
れ得る型の乳頭腫ウイルスの混合物即ち、「カクテル」
にも係る。本明細書に記載されている乳頭腫ウイルスプ
ローブの個数、場合によっては予め既に単離されている
乳頭腫ウイルスのゲノムDNAから単離されたプローブ及
び所定の混合物に含まれるその配合物を加えた数は、よ
り高度な診断を可能にし、特に、各種の型の乳頭腫ウイ
ルスに起因するか又はこれらの型の影響下で発生し得る
各種の種類の感染をより十分に識別でき、所定のある種
の感染では、これらの感染が憂慮すべき病気に変質する
危険度をより十分に予後診断することが可能である。例
えば本発明の目的は、いぼ状表皮異形成により現わる感
染の場合、これらの感染が皮膚癌に進行する危険度をよ
り十分に予想することが可能な手段を提供することにあ
る。 一般に、以下の説明を簡単にするために、乳頭腫ウイ
ルスの完ゲノムは略称HPV−DNAで表す。 同様に解り易くするために、以下の説明は既知の乳頭
腫HPV−DNAを含むHPV−DNAの物理的制限地図から成る添
付図面を参考にしている。 物理的地図は、各種の制限エンドヌクレアーゼによる
切断部位の位置を示している。地図の原点は一般に単一
の切断部位から構成されている。原点までの距離は、ゲ
ノムの長さの百分率で表してある。地図の１単位はゲノ
ムの長さの１％を表す。 本発明はまず第一に、より特定的には7000〜8000塩基
対の間の寸法を有しており、図面に示したような制限地
図により特徴付けられるDNAの集合から選択されたHPV−
DNAの各々に係り、これらの図面はより特定的には、乳
頭腫ウイルスから得られ、指称HPV−2d、HPV−10b、HPV
−14a、HPV−14b、HPV−15、HPV−17a、HPV−17b、HPV
−19、HPV−20、HPV−21、HPV−22、HPV−23、HPV−2
4、HPV−28、HPV−29、HPV−31及びHPV−32、HPV−IP2
及びHPV−IP4に相当するHPV−DNAに関するものである。 当然のことながら、本発明は上記に列挙したと同一型
に属するとみなされ得るHPV−DNAに対する効果にも及
ぶ。 新規に特徴付けられたウイルスのHPV−DNAに対応する
物理的地図は、黒円で示してある。 本発明はまた、上記HPV−DNAのフラグメント又は特に
過酷条件下でこれらのHPV−DNAとハイブリダイズ可能な
フラグメントにも係る。更に本発明は、上記HPV−DNAの
各々の全部又は一部を含む組換えDNA、より特定的には
夫々遺伝子E1、E6−E7、L1及びL2に対応するフラグメン
トあるいは上記HPV−DNAの遺伝子間領域に対応する配列
を含むDNAに係る。更に本発明は、これらのHPV−DNAか
ら又は対応するフラグメントから構成され得るプローブ
及び該プローブをインビトロで使用する診断法に係る。 ウイルスDNA調製物は、EVに罹患した６人のヨーロッ
パ人患者とEVに罹患した２人の南米人患者の良性病変の
掻去物から選択的に抽出した（LUTZNER,M.A.他、1983,L
ancet ii:422−424）。HPVのDNAは、塩化セシウム勾配
中で平衡遠心分離により、及び／又は従来記載されてい
る操作方法（前出のKREMSDORF,D.他の論文及びORTH,G.
他、1980,Cold Spring Harbor Conf.Cell Proliferatio
n７:259−282）に従って臭化エチジウムの存在下でショ
糖勾配中で沈降させることにより精製した。DNA調製物
を制限エンドヌクレアーゼで処理し、消化物をアガロー
スゲルで電気泳動により分離した（前出のKREMSDORF他
の論文）。患者の１人の尋常性いぼにはHPV5、８及び12
（前出のKREMSDORF他の論文）及びHPV2（HEILMAN,C.A.
他、1980,J.Virol36:395−407及びORTH,G.他、1980,Col
d Spring Harbor Conf.Cell Pro−liferation７:259−2
82）が検出されたが、これ以外にDNA制限酵素による主
要切断モデルを提供する菌株として、従来特徴付けられ
ている型とは異なる11個の菌株が同定された。同定の年
代順（COGGIN,J.R.他、Cancer Res.39:545−546）に従
って新規HPV型に番号を付け、亜型には番号と文字とを
付した。11種の新規HPVのゲノムを、大腸菌K12株C600で
クローニングした（前出ののKREMSDORF,D.他の論文（19
83））。エンドヌクレアーゼBamH Iによる形成されたHP
V24のDNAの２つのフラグメントを除き、DNAを単位長さ
の分子として挿入した。DNAは、Ava I、BamH I及びHind
IIIの単一切断部位を使用することによりプラスミドpB
R322（SUT−CLIFFE,J.G.,1978,Nucleic Acids Res.５:2
721−2728）に挿入するか、又はHPV5のDNAのフラグメン
トHind III Bを組み込んでおり、単一Sac I部位を含む
組換え体プラスミドに挿入した。より特定的には、HPV
のDNAとHPV5のDNAのフラグメントHind III Bを含む組換
え体プラスミドpBR322とをただ一箇所でしか切断しない
酵素（Sac I）で切断後、単位長さのDNA分子としてHPV1
7b及び22を挿入した。HPV14aのDNAは、ゲノムの長さの9
6.1及び3.9％の２つのフラグメントを形成する酵素であ
るHind IIIでウイルスDNA調製物を不完全に消化後、単
位流さのDNA分子としてプラスミドpBR322に挿入した。
（ゲノムの長さの夫々83.1及び16.9％に対応する寸法を
有する）HPV24のフラグメントBamH I A及びＢは、プラ
スミドpBR322に別々に挿入した。 単離したクローン及び対応するHPVのソースを下記第
Ｉ表に示す。 組換え体プラスミドを認識するために、プラスミドに
ウイルス配列を挿入するために使用したエンドヌクレア
ーゼを含む２種の制限エンドヌクレアーゼの混合物で処
理後、組換え体DNAと非クローン化HPVのDNAとの消化物
について電気泳動による移動度を比較した。単離された
フラグメントの個数及び寸法を検討した処、いずれの場
合もこれらの完全なウイルスゲノムが組み込まれている
ことがわかった。プラスミド配列からクローニングされ
ないもしくは切り出されないHPVのDNAをアガロースゲル
で電気泳動により分析した処、DNAの寸法は異なってい
ることが観察された（データは示さず）。HPV14b、19、
20及び21のDNAは、HPV3a、５、８及び12の寸法（約7700
ヌクレオチド対）（前出のKREMSDORF,D.の論文）に類似
する寸法を有しており、HPV15、17a、17b、22及び23のD
NAの寸法はHPV9の寸法（約7200ヌクレオチド対）（前出
のKREMSDORF,D.,1982及びORTH,G.,1980の論文）とそれ
程は類似していなかった。 14種の制限エンドヌクレアーゼに対するクローン化ウ
イルスゲノムの反応性を分析し、物理的地図（第１図〜
第10図）を作成した。後述するモチーフに関する所定の
図面では、所定のHPV−DNAの制限地図を反復した。従来
記載されている方法（９）に従って22〜23の切断部位を
位置付けした。HPV14a及び14b（第4a図及び4b図）並び
にHPV17a及び17b（第５図）を除いて、これらの地図の
間に明白な相同性は検出されなかった。HPV14aのDNAの
２つのBamH I切断部位の一方がHPV14bのDNAの単一BamH
I切断部位の整合している場合、夫々HPV14a及び14b,15
に位置付けされた21〜31の部位は共通であることが判明
した。同様に、単一BamH I切断部位が相互に整合してい
る場合、HPV17aのDNAに配置された29の切断部位のうち2
1の部位はHPV17bのDNAにも（26部位と共に）見出だされ
た。 これらの地図と、EVに関連するHPV（HPV3a,5,8,9,10
及び12）（8,9,16,18,20）、皮膚いぼに関連するHPV（H
PV1,2,4及び７）、及び粘膜皮膚又は粘膜の病変に関す
るHPV（HPV6b,11a,13及び16）（1,33,19）に関して従来
作成されている地図との間に、何ら明白な類似は見出だ
されなかった。但しHPV14aの地図は、EVに罹患した１人
の日本人患者から単離されたHPVの地図に非常によく似
ている（24）。この患者から単離した単離体はBamH I部
位及び付加的Hind II部位がHPV14aと異なっており、部
位Ava I、BamH I、Bgl I、EcoR I、Hind II及びHind II
Iの位置は２種のウイルス間で類似している。交差ハイ
ブリダイゼーション実験により、これらの２種のウイル
スが非常によく似ていることを確認した。 所定の部位（矢印で示した部位）は位置付けされてい
ないことが認められる。位置付けによるゲノムの長さの
差が２％未満の切断部位は保存されていると見なされる
（＊）。ニックを形成しない酵素はHPV14a及び23のDNA
ではPvu I、Sal I及びSma I、HPV14bのDNAではPvu I、S
ac I、Sal I及びSma I、HPV15、17a及び17bのDNAではBg
l I、Pvul I、Sal I及びSma I、HPV19のDNAではBgl I、
Sac I、Sal I及びSma I、HPV20のDNAではEcor I、Pvu
I、Sac I及びSma I、HPV21のDNAではSac I及びSma I、H
PV22のDNAではBamH I、Bgl I、Pvu I、Pvu II及びSal
I、HPV24のDNAではBgl I、EcoR I、Pvu I、Sac I、Sal
I及びSma Iであった。 新規に特徴付けられたHPVのDNAのDNA間相互の配列の
相同性の存在、更にこれらのDNAと、EVに関連するHPV
（HPV3a,5,8,9,10及び12）、皮膚いぼに関連するHPV（H
PV1,2,4及び７）及び粘膜病変に関連するHPV（HPV6b,11
a,13及び16）のDNAとの間の配列の相同性の存在につい
て検討した。紙固定によるハイブリダイゼーション及
び飽和液相DNA−DNAハイブリダイゼーション後、ヌクレ
アーゼS1により消化させる実験を、上記過酷もしくは厳
酷条件下で実施した（8,9）。特に、HPVのDNAをニック
トランスレーションにより標識し、従来記載されている
ように（13）、アルカリショ糖勾配（５〜20％）中で沈
降により断片化した。標識したHPVのDNA（4000cpm）
を、従来記載されているように（8,9）ウシ胸腺DNA（20
μｇ）又は非標識HPVのDNA（0.20μｇ）の存在下でNaCl
0.48M−EDTA 1mM（pH6.8）中で68℃でインキュベートし
た。HPVのDNAのプローブの特異活性は5.3×107〜２×10
8cpm/μｇであった。ヌクレアーゼS1耐性フラクション
を測定することにより、ハイブリダイゼーション率を決
定した。数値は、プローブの自発的自然再生を表す修正
値（４〜15％）及び相同ハイブリダイゼーションを表す
100％に標準化した値（75〜95％）を表している。略記N
Dは測定せずという意味である。上記条件下におけるHPV
−DNA間の交差ハイブリダイゼーションの相対的な大き
さは、標識したHPV−DNAと非標識HPV DNAとの間のハイ
ブリダイゼーション（％）で表す。 HPV1,2,4,6b,7及び11aのゲノムと新規にクローニング
され32Pで標識したEVのHPVのDNAとの間、又は非標識EV
のHPVのDNAとHPV13,16及び18の特異的プローブとの間に
は交差ハイブリダイゼーションが不在又はほぼ不在であ
ることが認められる。同様に、HPV14a,14b,15,17a,17b,
19,20,21,22,23及び24のDNAとHPV1a及び11aのDNAとの間
には、飽和再結合による交差ハイブリダイゼーションは
全く又はほぼ認められなかった（第II表）。新規にクロ
ーニングされたHPVのDNAは交差ハイブリダイゼーション
を全く又はほぼ示さず、あるいは相互間及びEVに関連す
る他のHPV（HPV3a,5,8,9,10及び12）のゲノムとの間に5
0％未満の交差ハイブリダイゼーションを示した。但しH
PV14a及び14bとHPV17a及び17bは強い交差ハイブリダイ
ゼーションを示した。以上の結果から、新規ウイルスは
９種類の新規型（HPV14,15,17,19,20,21,22,23及び24）
と、型14（HPV14a及びｂ）及び17（HPV17a及びｂ）の２
種類の亜型に分類されることが確認される。 同様に、過酷な分子ハイブリダイゼーション条件下に
おける配列の相同性（又は相同性の不在）に基づいて各
HPVを群に分類した。これらの群はＡ〜Ｈの文字で示
し、下記第III表にリストした。この表は、これらのHPV
（単離体又は単離体の組み合わせ）の保菌者で診断され
た疾患、及び該保菌者に認識された腫瘍遺伝子の潜在力
を示している。 HPV5,8,12,14,19,20,21,22及び23のDNAは相互間の交
差ハイブリダイゼーション率（群の相同性）が５〜38％
であり、HPV5,8及び12のDNAとの間のみに顕著な交差ハ
イブリダイゼーション（４〜13％）を示す。従って、こ
れらのウイルスは従来規定されているEVのHPVの群
（９）の一部をなす。 同様に、相互間の交差ハイブリダイゼーションが約20
％でありHPV9のDNAとの間の交差ハイブリダイゼーショ
ンが約６％であるHPV9,15及び17のDNAは、同様に既に記
載されているEVのHPVの群（９）に属する。型13及び31
のHPVは、同一の群に属すると考えられる。最後に、他
のHPVのゲノムとの間に相同性をほとんど示さない型1,
2,4,24及び32のHPVは、相互に異なる他の群及び上記群
の第１員を形成すると見なされる。 本発明は更に、より特定的には上記HPV−DNAに由来す
るDNAフラグメント、及びより特定的には夫々遺伝子E6
−E7,E1,L1,L2及びそれらの遺伝子間領域に対応するDNA
フラグメントに係る。原点とみなされる部位（第１図〜
第９図）に対するこれらの各種のフラグメントの位置及
び相対長さを、下記の第IV表に示した。 HPV1のゲノムにおける遺伝子の位置付けはこのゲノム
のヌクレオチド配列から導いた（O.Danos,M.Kaninka及
びM.Yanivの特許）。過酷（Tm−29℃）又は非過酷（Tm
−40℃）条件で形成されたヘテロ二重鎖分子の電子顕微
鏡分析後、HPV3,5,8,9,10a,12,14,15,17及び24のゲノム
の物理的地図を、HPV1の物理的地図及び遺伝子地図に対
して整合させ、HPV31のゲノムの物理的地図を、HPV6bの
物理的地図及び遺伝子地図に対して整合させた（E.Schw
arz他、EMBO.J.,1983,2,2341−2348）。 第IV表に示した座標の値は、第１図〜第９図の物理的
地図における遺伝子E6及びE7,E1,L2及びL1の相同ゲノム
のセグメントの５′及び３′末端、及びHPV1aのゲノム
に対する遺伝子間領域、又はHPV31の場合にはHPV6bのゲ
ノムに対する遺伝子間領域の位置を示している。 非過酷ハイブリダイゼーション条件下で異なる群に属
する型のHPVのゲノム間、又は過酷ハイブリダイゼーシ
ョン条件下で同一群に属する型のHPVの大部分のゲノム
間に形成されたヘテロ二重鎖分子を電子顕微鏡分析にし
た場合、（調節成分を含む）遺伝子間領域及び隣接遺伝
子E6及びE7（腫瘍中に発現される主要トランスフォーメ
ーション遺伝子に対応すると思われる）は、検出可能な
配列相同性を示さない。非過酷ハイブリダイゼーション
条件下で異なる群に属する型のHPVのゲノム間、又は過
酷ハイブリダイゼーション条件下で同一群に属するHPV
のゲノム間に形成されたヘテロ二重鎖を分析した場合、
遺伝子E1（主にウイルスDNAの複製に関与する）及び遺
伝子L1（ビリオンの主要抗原決定基を有するウイルスキ
ャプシドの主要タンパクをコードする）は、検出可能な
配列の相同性を示す。 領域E1及びL1を含む組換え体プラスミドから作製され
たプローブは、場合によっては過酷又は非過酷条件下で
実施される分子ハイブリダイゼーションの実験により最
大数のHPV型を検出することが理論的に可能である。遺
伝子間領域及び遺伝子E6及びE7を含む組換え体プラスミ
ドから作製されたプローブは、所定のHPV型又は同種のH
PV型を特異的に検出することが可能である。 領域L2（ウイルスキャプシドの微量構成成分をコード
する）は、異なる型のHPV間で可変のヌクレオチド配列
保存率を有する。 以下、ウイルスHPV−IP2及びHPV−IP4を単離した条
件、次いでこれらのウイルスからHPV−DNAを得た条件に
ついてより明確に説明する。 生殖器新形成及び癌に関連する新規型のHPV（HPV IP2）
の分子クローニング及び特徴付け 非過酷条件下でHPV16型の特異的放射性プローブを使
用するハイブリダイゼーションにより、子宮頸部の癌か
ら抽出したDNAには新規型のHPVが露呈された。過酷ハイ
ブリダイゼーション条件でハイブリダイゼーションを実
施した場合には交差ハイブリダイゼーションは検出でき
なかった。数種類の制限酵素に対するこのHPVのDNAの反
応性を調べた処、酵素Bgl IIはウイルスDNAを一箇所で
切断していることがわかった。腫瘍から抽出したDNAを
エンドヌクレチーゼBgl IIで消化後、8kb（乳頭腫ウイ
ルスのゲノムの寸法）のDNA分子を含んでいるフラクシ
ョンを、ショ糖勾配中で遠心分離により精製した。8kb
の分子をBgl II部位でプラスミドPL15.5から成るベクタ
ー（Bgl II及びBamH Iによる単一切断部位を含む）に挿
入し、該ベクターはBamH I部位でλバクテリオファージ
L47,1のDNAに挿入した。組換え体のDNAのキャプシド形
成及び宿主細菌（大腸菌、菌株LA101）への感染後、非
過酷条件下で放射性HPV16のDNAで感染細菌培養物のレプ
リカハイブリダイゼーションを実施した処、組換え体フ
ァージに対応する溶菌プラークが検出された。ウイルス
配列全体を含んでいる数個の組換え体がバクテリオファ
ージが単離され、挿入酵素Bgl IIによるファージDNAの
切断は非過酷条件でHPV16プローブとハイブリダイズす
る8kbのフラグメントを形成し、酵素Bgl II及びPst Iの
混合物による組換え体ファージのDNAと元の腫瘍のDNAと
の切断は、乳頭腫ウイルスのゲノムの寸法に等しい総分
子量を有する同一の５つのフラグメントを形成する。新
規HPVのDNAを組換え体バクテリオファージのDNAか切出
し、電気溶離により精製し、プラスミドPL15.5内で再ク
ローニングした。18個の制限エンドヌクレアーゼに対す
るこのDNAの反応性に基づいて、ウイルスDNAの制限地図
を作成し、21個の切断部位を位置付けすることができた
（第９図）。こうして作成した地図は今日までに同定さ
れているHPVのゲヌムの地図とは異なっている。新規HPV
のDNAと従来同定されているHPVのDNAとの間の配列を相
同性を、過酷条件で実施したレプリカ分子ハイブリダイ
ゼーション実験により分析した。検出された相同性は常
に５％未満であり、最大の相同性はHPV16のゲノムで検
出された。子宮頸部の癌から特徴付けられた新規ウイル
スは、従って新規型のHPVを構成しており、これをHPVIP
2と仮称する。 種々の条件下でHPVIP2のDNAとHPV1のDNAとの間に形成
されたヘテロ二重鎖分子を電子顕微鏡で分析した処、こ
れらの２種のゲノムの物理的地図を整合させることがで
き、HPVIP2のDNAがもっている異なる遺伝子の理論的位
置を決定することができた。 このゲノムの地図における主要遺伝子及びHPV−IP2の
遺伝子間領域の推定位置付け 末端座標 5′ 3′ E6−E7 62 71.5 E1 71 95 E2 95.5 11.5 L2 11 30.5 L1 31.5 52 遺伝子間領域 52 63.5 精製されたHPVIP2のDNAから作製した放射性ブローブ
を使用することにより、これらのウイルスの病原性を決
定することができた。HPVIP2のDNAが認識されたのは、1
4件の調査対象のうち外部生殖器官の退形成丘疹の１
例、51件の調査対象のうち２件の子宮頸部の進入性癌、
及び28件の調査対象のうちの子宮頸部の上皮内新形成の
１例であった。従って、HPVIP2は頻度がHPV18よりもや
や低く且つHPV16よりも著しく低い腫瘍形成潜在力を有
する生殖器向性HPV型である。生殖器新形成、特に子宮
頸部癌の発生の危険を孕むHPV型の診断又は早期発見す
るためには、分子プローブの作製に使用されるHPVのDNA
のあらゆる混合物にHPIVIP2を混入させる必要がある。 皮膚の前癌性病変に関連する新規HPV型（HPVIP4）の分
子クローニング及び特徴付け 過酷条件下でHPV5,8及び14型の特異的放射性プローブ
を用いて混合物で分子ハイブリダイゼーションを実施す
ると、皮膚前癌性病変である紫外線角化症の生検から抽
出したDNAに新規型のHPVが露呈された。1,2,3,7,10,13,
16,18,28,IP1（前出のHPV31）,IP2及びIP3（前出のHPV3
2）型の特異的プローブでハイブリダイゼーションを実
施した場合、交差ハイブリダイゼーションは何も見出だ
されなかった。 数種類の制限酵素に対するこのHPVのDNAの反応生を調
べた処、酵素EcoR IはウイルスDNAを一箇所切断するこ
とがわかった。生検から抽出されたDNAをエンドヌクレ
アーゼEcoR Iにより消化後、8kb（乳頭腫ウイルスのゲ
ノムの寸法）のDNA分子を含むフラクションを、ショ糖
勾配中で遠心分離により精製した。8kbの分子をEcoR I
部位でバクテリオファージλgt wes.λＢのDNAに挿入し
た。組換え体DNAのキャプシド形成及び宿主細菌（大腸
菌、菌株LA101）への感染後、非過酷条件下でHPV8及び1
4のDNAの放射性混合物で感染細菌培養物のレプリカハイ
ブリダイゼーションを実施した処、組換え体ファージに
対応する溶菌プラークが検出された。ウイルス配列全体
を含む数種類の組換え体バクテリオファージが単離さ
れ、挿入酵素EcoR IによるファージDNAの切断は、非過
酷条件でHPV5,8及び14の特異的プローブとハイブリダイ
ズする8kbのフラグメントを形成し、酵素EcoR I及びPst
Iの混合物による組換え体ファージのDNAと元の病変部
のDNAとの切断は、乳頭腫ウイルスのゲノムの寸法に等
しい総分子量を有する同一の６個のフラグメントを形成
する。新規HPVのDNAを組換え体バクテリオファージのDN
Aから切り出し、電気溶出により精製し、プラスミドpSP
65内で再クローニングした。15個の制限エンドヌクレア
ーゼに対するこのDNAの反応性に基づいて、ウイルスDNA
の制限地図を作製し、こうして23の切断部位を位置付け
することができた（第10図）。こうして作成した地図は
今日までに同定されているHPVのゲノムの地図とは異な
っている。過酷条件下で実施されたレプリカ分子ハイブ
リダイゼーション実験により、新規HPVのDNAと今日まで
同定されているHPVのDNAの間の配列の相同性を分析し
た。新規HPVのDNAといぼ状表皮異形成病変中に従来同定
されている所定の型のHPV（HPV5,8,12,14,19,20,21及2
5）のDNAとの間には50％未満の相同性が検出されたが、
その他の型のHPVとの間には相同性は何も検出されなか
った。従って、紫外線角化症から特徴付けられる新規ウ
イルスは、HPV−IP4と仮称される新規型のHPVを構成す
る。 精製したHPVIP4のDNAから作製された放射性プローブ
を使用した処、調査したいぼ状表皮異形成に罹患した17
人の患者の42％、及び分析した紫外線角化症生検のx/y
にHPVIP4を露呈させることができた。HPVIP4は、皮膚癌
の頻発により特徴付けられる疾患であるいぼ状表皮異形
成に罹患した患者に頻度が高く、皮膚の有し細胞癌の前
駆体とみなされる紫外線角化症の病変のフラクションに
関連付けられるので、腫瘍形成潜在力を有する皮膚向性
HPV型であると判断できる。皮膚の前癌又は癌の病変の
発生の危険を孕むHPV型を診断又は早期発見するために
は、分子プローブの作製に使用されるHPVのDNAの全混合
物にHPVIP4型を混入することが必要である。 本発明はより特定的には、乳頭腫ウイルスの感染の各
種の形態の総合的診断を実施するため、特に感染の可能
な進行を予後診断するために組み合わせて使用し得る各
種のHVP−DNAの混合物即ち、カクテル（又はこれらのHP
V−DNA又はこれらのDNA配列を含むプローブ）にも係
る。本発明の好適な混合物を下記第Ｖ表に示した。 この表は、より特定的には表の左側に示した混合物を
使用することにより診断され得る疾患の性質も示してい
る。第１図〜第９図の制限地図の区分は第Ｖ表の「構
成」の欄に示した区分と一致していることが銘記されよ
う。また、このために所定のプローブは各添付図面で数
回繰り返している。 これらの混合物の各々は、本発明の新規プローブの少
なくとも１つを含むものと規定できる。換言するなら、
本発明の診断用組成物は、 １）少なくともHPV2dのDNA、 ２）HPV10b,28及び29のDNAの少なくとも１種、 ３）HPV17,24のDNAの少なくとも１種、 ４）HPV14,15,17,19,20,21,22及び23のDNAの少なくとも
１種、 ５）HPV15及び17のDNAの少なくとも１種、 ６）HPV24のDNA、 ７）HPV14,32のDNA、 ８）HPV31のDNA、 ９）HPV32のDNA を含むものと規定できる。尚、上記９群のDNAは相互に
異なる全状況で選択される。 種々のいぼ形態又は他の皮膚もしくは粘膜病変部から
単離され得るHPVは非常に多種に及ぶことを考慮する
と、他のHPV−DNAも同一型の疾患の発生に関与し得ると
認められるので、表に示した各型の疾患を診断するため
には、１種又は２種より多くのHPV−DNAを含む混合物を
使用することが好ましい。感染の性質及び可能な進行の
診断は、使用されるプローブの数が多いほど有効であ
る。更に、プローブの各混合物を使用してハイブリダイ
ゼーション試験を実施すると、患者が罹患している病気
の性質をより高い確率で鑑別する鑑別診断が可能にな
る。 第Ｖ表では、発明者の実験室で単離したHPV−DNAから
形成したプローブしか示していない。上記に述べた理由
により、他の実験室で得られたHPVに由来するDNAも同一
型に感染した患者に繰り返して認められるので、各混合
物にこれらのDNAを追加できることは言うまでもない。
例えば混合物７には、上皮内新形成及び皮膚癌に変質す
る危険を孕むいぼ状表皮異形成に認識される他の全HPV
−DNAを追加することができる。第Ｖ表中、所定の混合
物は診断すべき同一疾患の特徴を有するものとして示さ
れていることが認められよう。一方、各混合物は癌化の
危険の低い感染と癌化の危険の高い感染とを識別する。
例えば、混合物７で診断した患者からウイルス調製物の
ハイブリダイゼーションは、混合物３でハイブリダイゼ
ーションを形成する場合よりも皮膚癌化の危険が大きい
ことが立証されよう。 同様に、混合物５により検出されるEVは混合物６によ
り検出されるEVより癌化の危険が大きいことがわかる。
混合物４は、混合物５により検出されるよりも危険度の
高いEVを検出する。 以下、乳頭腫ウイルスの各感染形態の総合診断を実施
するために、場合によっては感染の可能な進行を予後診
断するために組み合わせて使用され得る種々のHPV−DNA
から成る他の混合物即ち、カクテル（又はこれらのHPV
−DNAを又は該DNAの配列を含むプローブ）について更に
説明する。 本発明の好適な混合物は、上記第Ｖ表に示した。 この表は、より特定的には表の左側に示した混合物を
使用することにより診断され得る疾患の性質も示してい
る。もう一度ことわっておくが、この表に示される他の
HPV−DNAの制限地図は第１図〜第９図に含まれている。 HPV−IP2の生殖器新形成、特に子宮頸部癌の発生の危
険を検出するために使用可能なプローブを特定的に表す
とみなされ得ることに留意されたい。 従って、本発明はより特定的には表中「混合物の指
称」の欄に１〜10の番号を付けた少なくとも10群を含む
診断用箱又は「キット」にも係る。 以上の説明ではクローニングした完全なHPV−DNAをプ
ローブとして使用する場合について特に考察した。もっ
とも、該DNAの代わりにこれらの各DNAのクローン化フラ
グメント、特に遺伝子E1又はL1及び遺伝子E6−E7を使用
してもよい。 HPV−DNAをインビトロで検出する基本原理は、当然過
酷又は非過酷条件で操作されるハイブリダイゼーション
を使用するものである。例えば以下に述べるように操作
すればよいが、記載されている診断試験は当然本発明の
プローブ又はプローブ混合物の使用条件を限定するもの
と見なすことはできない。 クローン化HPVのDNAの混合物から作製したプローブを
使用する試験の目的は、生検中、病変部の掻去により得
られた細胞中、又はCarnoy混合物（エタノール、クロロ
ホルム、酢酸6:3:1）により形成され且つパラフィンに
含有される生検の切片中でHPVを露呈させ且つHPV型を同
定することである。試験は、既知の原則の方法に従って
採取物のDNAを予め抽出する必要があり、HPVのDNAの混
合物から作製した（32P又は35Sで標識した）放射性プロ
ーブを使用して、過酷又は非過酷条件下で実施した分子
ハイブリダイゼーション実験によりこのDNAの分析を行
う。各試験では、一般にプローブの数種類の混合物を使
用する必要がある。 数種類のハイブリダイゼーション法を使用することが
できる。例えばブロットハイブリダイゼーション法を使
用することができる。この方法は、DNAの変性後、膜
（ニトロセルロース又はGenescreenplus）にアリコート
量のDNAを堆積させ、通常条件で各膜をプローブの混合
物でハイブリダイゼーションし、膜をＸ線写真フィルム
と接触させることにより放射性ハイブリッドを検出する
ことから成る。レプリカハイブリダイゼーション法を使
用してもよい。この方法は、制限酵素によるDNAの処理
後に形成されたDNAのフラグメントをアガロースゲル電
気泳動で分離し、アルカリ変性後、膜（ニトロセルロー
ス、Genescreenplus）にフラグメントを移し、これらの
フラグメントを通常条件でプローブの各混合物でハイブ
リダイゼーションすることから成る。放射性ハイブリッ
ドの形成は、膜にＸ腺写真フィルムと接触後に検出され
る。 放射性プローブは、「ニックトランスレーション」法
により標識したHPVのDNAから構成されるか、例えばSP6
型のベクターに挿入されたウイルスDNAの転写により作
成されたRNAから構成される。放射性プローブを使用す
ると感度が大きいという利点があるが、相互に標識され
た抗体又はそれ自体酵素、蛍光等のマーカーを有する抗
体により認識された抗体により認識され得る例えばビオ
チニル化した非放射性プローブを使用する場合はこのよ
うな利点は得られない。 プローブの選択は、採取物の性質に依存する。例えば
EVに罹患している疑いのある患者の場合、混合物1,2,3,
4,5,6及び７が使用される。混合物１及び２は、EVと皮
膚いぼとの間の鑑別診断が可能である。病気に関連する
３群のHPVの各々の最も高頻度で検出された群を含むプ
ローブ３、及びEVの癌に関連する型のHPVのDNAを含むプ
ローブ７は、EVの殆どの症例を診断することができ、特
に、癌の発生の危険のあるHPV型に感染した患者を認識
することができる。混合物4,5及び６を使用すると、同
一患者に感染するHPV型を確定することができる。 従って、更に本発明は上記に示したような複数のプロ
ーブ、即ち −上記19種の型及び亜型のHPV−DNAの各々の典型、又は −プローブ混合物、好ましくは先に規定した各種の群又
はプローブ混合物を含む容器もしくは「キット」に係
り、これらの「キット」は、患者から得られたウイルス
調製物と各種の群又は混合物との間のハイブリダイゼー
ションにより「インビトロ」診断調査に使用される。 当然のことながら既に示したように、本発明は特定的
に述べた適用例及び実施例に限定されず、あらゆる変形
例を包含し、特に図面に示した制限地図のHPV−DNAが対
応するように請求の範囲の項で所定の数字と共にDNA−H
PVに付した参照符号は、これらの請求の範囲が上述の規
定に従って同一型に分類され得るこの特定のHPV−DNAと
共通の全HPV−DNA、更に同一亜型に属するHPV−DNAに及
ぶことを意味するものと見なされる。 より特定的には、図面に示したHPV−32から誘導したD
NAは、Ava I,Bal I,BamH I,Cla I,EcoR I,Hind III,Nde
I,Nru I,Pvu I,Pvu II,Sac I,Sal I,Sma I,Tth III,Xm
a Iにより切断されていないことも注目される。 以下に示す組換え体DNAは、1984年11月30日付けでC.
N.C.M.（Collection Nationale des Cultures de Micro
−Orga−nismes de l′INSTITUT PASTEUR de Paris）に
下記の番号で寄託されている。 pBR322/HPV2d ……No.I−379 pBR322/HPV10bA ……No.I−380 pBR322/HPV10bB ……No.I−381 pBR322/HPV14a ……No.I−382 pBR322/HPV14b ……No.I−383 pBR322/HPV15 ……No.I−384 pBR322/HPV17a ……No.I−385 pHPV5Hind III B/HPV17b ……No.I−386 pBR322/HPV19 ……No.I−387 pBR322/HPV20 ……No.I−388 pBR322/HPV21 ……No.I−389 pHV5 Hind III B/HPV22 ……No.I−390 pBR322/HPV23 ……No.I−391 pBR322/HPV24a ……No.I−392 pBR322/HPV24b ……No.I−393 pBR322/HPV28 ……No.I−394 pBR322/HPV29 ……No.I−395 pBR322/HPV31 ……No.I−396 pSP64/HPV32 ……No.I−397 pLI55/IP2 ……No.I−450 pSP65/IP4 ……No.I−449。 本発明はより特定的には、上記に言及した異なる乳頭
腫ウイルスの遺伝子E6、E7及び特にL2の発現生成物に係
る。 これらの発現生成物は、所定の生物採取物中の乳頭腫
ウイルス又は該ウイルスの発現生成物を検出するため、
及び乳頭腫ウイルスが属する型又は亜型に従って乳頭腫
ウイルスを同定するためにそれ自体使用され得る。これ
らの発現生成物が得られる条件については、特に乳頭腫
ウイルスHPVの配列L2の発現に関して以下の記載中に説
明するが、同様の方法を利用して他の型の乳頭腫ウイル
スに由来する遺伝子配列L2（又はE6,E7又はL1）の発現
を誘導してもよい。以下の説明は例外を除き、配列又は
遺伝子L2についてより特定的に述べているが、場合によ
っては遺伝子L2の発現生成物に関する教示を他の該当遺
伝子の発現生成物に置き換えてもよい。配列L2の発現生
成物は、異なる型の乳頭腫ウイルスではなく対応する乳
頭腫ウイルスにより侵された生物採取物中で遺伝子L2の
発現生成物を認識し得る抗体をインビボで産生させるた
めに使用できるという点で特に有利であり、より特定的
には、該当する類の調製物が予め固定されている場合に
特に有利である。以下に述べる本発明の新規実施例は、
重度を推定し且つ採用すべき治療を選択するために、調
査された病変物中に存在している乳頭腫ウイルスの型を
決定することの可能な別個の手段を提供するものであ
る。遺伝子L2の各種の型の発現生成物に対して産生され
る抗体は、ハイブリダイゼーションプローブに関して先
に記載した混合物に対応する混合物に分類され得る。 従って本発明は、複数の異なる抗体を含んでおり且つ
新規に単離された乳頭腫ウイルスの検出、場合によって
は同定又は分類の連続試験を実施することが可能な容器
もしくは「キット」も提供する。例えば、本発明の容器
もしくはキットは、抗体又は異なる抗体の混合物から構
成される複数の試薬、例えば以下のように分類される乳
頭腫ウイルスの遺伝子L2の発現生成物に対して形成され
た抗体を夫々含む試薬から構成される。 １）少なくともHPV2d、 ２）HPV10b,28及び29の少なくとも１種、 ３）HPV17,24の少なくとも１種、 ４）HPV14,15,17,19,20,21,22,23及びIP24の少なくとも
１種、 ５）HPV15及び17の少なくとも１種、 ６）HPV24、 ７）HPV14,32及びIP4の少なくとも１種、 ８）HPV31、 ９）HPV32、 10）HPV16,18及びIP2の少なくとも１種。 尚、以上10群の抗体は、10群の各々が該群を構成して
いる抗体のただ１種に限定される限り、相互に異なるよ
うに選択される。 遺伝子L2の発現生成物（又は遺伝子L2の発現生成物の
免疫特性を変化させない追加ポリペプチド、特に安定化
ポリペプチドと融合されたこれらの発現生成物を含む組
換え体タンパク）に対して形成された抗体は、罹患した
被験者の体内の乳頭腫ウイルスにより誘導された病変部
に由来する組織病理切片中でウイルスを直接検出するた
めに使用可能である。有利には、検出は例えば前出のCA
RNOY溶媒もしくは混合物（L.LISONの著書“Histochimie
et cytochimie animales"にも記載されている）を使用
して、解離条件下で予め固定された調製物に対して実施
される。 場合によっては固定された抗L2抗体は、この抗体に対
して形成された別の抗体により認識され得、これらの別
の抗体は好ましくは非放射性の適当なマーカーを含んで
いる。これらのマーカーは例えば酵素又は蛍光性質を有
する。 本発明は当然のことながら、乳頭腫ウイルスの遺伝子
L2を発現させるポリペプチド自体にも係る。これらの発
現生成物は上記記載で既にL2タンパクと呼称している。
本発明は更に、このL2タンパクがL2タンパクの免疫特性
を本質的に変化させないような他のポリペプチド配列と
融合されているポリペプチドにも係る。これらの他のポ
リペプチドフラグメントの存在は、殊に遺伝子工学技術
を使用する操作によりこれらのハイブリッドポリペプチ
ドを得る場合、使用される該ハイブリッドポリペプチド
の製造方法に特に起因し得る。有利には、本発明はβ−
ガラクトシダーゼから誘導された配列を含むハイブリッ
ドポリペプチドに係る。このような生成物は、特にラク
トースオペロンの全部又は一部により修飾され且つ、所
定の型の乳頭腫ウイルスに由来する遺伝子L2から誘導さ
れたヌクレオチド配列をラクトースオペロンのプロモー
タ（又は例えばλファージのような適当な他の全プロモ
ータ）の下流に挿入させた適当なベクター（ファージ又
はプラスミド）で大腸菌を形質転換することにより得ら
れる。有利には、ラクトースオペロンのβ−ガラクトシ
ダーゼの遺伝子の少なくとも一部を含むこの型のプラス
ミド又はファージを使用する。 本発明は異なるポリペプチドの群にも係り、該ポリペ
プチドは常に上述のL2タンパクの一部のみに夫々対応す
るが、これらの各群のポリペプチドは該当する類のL2タ
ンパクの特徴的抗原部位を常に含んでいる。 本発明のポリペプチドは、精製した場合、該ポリペプ
チドに対応する抗体、特にこれらのポリペプチドにより
感作された動物の血清から得られた抗体の精製技術で使
用することができる。特に、これらのポリペプチドはア
フィニティカラムに固定することができる。抗体の精製
操作は、該ポリペプチドを含んでいるアフィニティカラ
ムに抗体を含んでいる血清を接触させることから成る。
これらのカラムに選択的に固定された抗体は、次に適当
なイオン強度を有する適当な緩衝液、例えば酢酸アンモ
ニウムのような塩溶液を使用する抗原−抗体複合体解離
により回収され得る。また酸性溶液を使用してもよい。 最後に、本発明はこれらの抗原（又は抗原群）及び抗
体（又は抗体群）を使用する組成物に係る。 特に、本発明は所与の型の疾患にしばしば存在すると
見なされる乳頭腫ウイルスの集合から誘導された抗体の
１種又は好ましくは「カクテル」を含む群に係る。該当
患者からの組織又は細胞採取物のインビトロ診断試験後
に所与の疾患は臨床診断されている筈であるし、あるい
はインビトロ診断の結果、感染乳頭腫ウイルスは上記集
合の乳頭腫ウイルスの１種に類似する型に属することが
判明している筈であるから、これらのカクテル（適当な
薬学的賦形剤と共にこれらの抗体又は抗体群、血清混合
物又は精製抗体組成物を含む）はこの場合、この疾患の
治療にあたり、患者に特に非経口経路で投与することに
より使用できる。従って、これらの血清は対応する型又
は亜型の乳頭腫ウイルスにより誘導される感染を退行さ
せ得る。 最後に本発明は、選択された投与方法、特に対応する
疾患に罹患している危険の高い人を保護するために使用
可能な非経口経路の投与方法に適合する薬学的に許容可
能な賦形剤と共に、１又は好ましくは数腫のL2タンパク
を含む対応するワクチン組成物に係る。 最後に、読者が明細書を十分に理解するのに有益と思
われる限りにおいて、従来技術の状態の説明を必要の範
囲内で補う参考文献の論文を参照されたい。従って、こ
れらの論文の内容は明細書の一部を形成するものとみな
されるべきである。 さて、所与の乳頭腫ウイルスの遺伝子L2の読み取り相
のフラグメントを利用するタンパクL2（又はこのタンパ
ク質のフラグメント）を産生させるために好適な方法
を、まず読み取り相のこれらのフラグメントを含むベク
ター構造に関して、次に大腸菌中のL2タンパク又はこの
ポリペプチドの発現を誘導し得る条件に関して説明しよ
う。また、タンパク又はこのポリペプチドの精製方法、
及びこれらのタンパク又はこのポリペプチドに対する抗
体を含む血清の製造における該精製方法の使用例につい
ても記載する。 当業者にとっては自明のことであるが、L2の読み取り
相の使用されるフラグメントは、使用されるベクターで
常に同相で融合させるべきであり、場合によっては安定
性を確保し且つこうして形成されるハイブリッドタンパ
ク質のその後の精製を容易にするタンパク質のコード化
遺伝子が使用される。 製造順序は添付した第11図に示してある。 材料及び方法 １）DNAの処理 DNAの組換え、プラスミドとDNAフラグメントとの形
成、新しい末端の形成、酵素Bal31による消化及び細胞
のトランスフェクションに関しては、Cold Spring Harb
or Labo−ratory,Cold Spring Harbor,NEW−YORK,U.S.
A.の著書“A Laboratory Manuel"の“Molecular clonin
g"の章に記載されているManiatis,T.他（1982）の方法
を適用した。 ２）細菌、プラスミド及びウイルス プラスミドDNAは、大腸菌（細胞C600）に含まれるpHP
VI.a（Danos他、1982及び1982年４月５日付仏国特許出
願第82 058 87号）、細胞RRI（queen,1983）に含有され
ていたpCQV2及び細胞MC1000（Casadaban,1983）に含有
されていたpMC1403から得た。 構成した遺伝子間プラスミド及びプラスミドpHPL2
を、大腸菌MM294の細胞に数回通し、プラスミドpHPL2−
β−ガラクトシダーゼはβ−ガラクトシダーゼを欠失す
る細胞MC1000に通した。ラクトースを含むMc Conkeyの
寒天培地（Silhavy他、1984,“Experiments with gene
fusions":Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring
Harbor,NEW−YORK）で、菌株Lac+を赤いコロニーの形
態で検出した。 次に、プロテアーゼを欠失する菌株lon-、CAG1139（G
ro−ssman他、1983,Cell32,151−159）に、プラスミドp
HPL2及びpHPL2−β−galをトランスフェクトした。 ３）殺菌溶解質の生成及び該溶解質のドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル分析（SDS−PAGE） 一晩培養後、pHPL2又はpHPL2−β−gal116を含む細胞
CAG1139をLB溶媒で５〜20倍に希釈した。次に光学密度O
D600が0.5〜0.9に達するまで細胞を30℃で培養した。 次に、細胞を90分間で41℃にすることによりλ−PRプ
ロモータを抑制解除した。培養物を再び遠心分離し、沈
降物を収集し、SDS2％、グリセロール26％、2Mの２−メ
ルカプトエタノール、及びブロモフェノールブルー0.03
％を含有する溶媒62mM Tris,pH6.8に懸濁させた。プラ
スミドを含んでいない細胞CAG1139の溶解質を対照とし
て使用した。 100℃で10分間処理後、Laemli（1970）,Nature,227,6
80−684の技術に従って、試料に対して10％のSDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を実施した。既知の分子量
を有する予め着色したBRLタンパクに対して同様に電気
泳動を実施した。 「アミドブラック」の呼称で知られている着色剤で着
色することにより、タンパク質のバンドを可視化させ、
ニトロセルロース膜に移して所謂「ウェスタンブロッ
ト」（ウェスタン転写）により分析した。 ４）分析 乳頭腫ウイルスのポリクローナル抗体（Orth他（197
8）,Virology91,243−255及び前出のRosetto他）と、Ra
ifortのペルオキシダーゼに結合された抗ラット及び抗
ウサギ免疫グロブリンIgGとを使用することにより、Ros
etto他（1984）J.Gen.Virol.65,1319−1324に記載され
ているように、「ウエスタンブロット」による分析を実
施した。 ５）抗体の分析 精製されたHPVl.aのウイルス粒子又は異なる型の乳頭
腫ウイルスにより誘導された病変の切片を使用すること
により、従来記載されている免疫拡散、免疫蛍光及び免
疫ペルオキシダーゼ法（Orth法、1984及びRosetto他、1
984）を使用した。 ６）融合タンパクL2−β−ガラクトシダーゼの精製 pHPL2−β−ガラクトシダーゼ116を含有するCAG1139
の培養物をLB溶媒で200倍に希釈し、D.O.600が0.32に達
するまで培養した。次に培養物を急速に41℃にし、高温
で90分間培養した。 細胞沈降物を溶媒Tris20mM,pH7.5,MgCl210mMに再懸濁
させ、超音波で細胞破壊処理した。 Ullmann（1984）.Gene29,27−31により記載されてい
るように、調製物に可溶性の融合タンパクを、ｐ−アミ
ノフェニル−β−Ｄ−チオガラクトシド（TPEG）−SEPH
AROSEカラムでアフィニティクロマトグラフィにより精
製した。 上記のように精製した融合タンパクを使用してHarley
雌ラットに免疫感作した。動物には、完全フロイントア
ジュバント（DIFCO）の存在下で２〜３週間の間隔で異
なる部位に約150μｇのタンパク質を３回皮下注射し
た。３回目の注射から１週間後に血清を採取した。 結果 大腸菌内にL2読み取り枠を発現することの可能なプラス
ミドの構造 構造は第１図に示した。L2読み取り枠をクローニング
して大腸菌内で発現させた。プラスミドpHPV1.aは、Dan
os他（EMBO J.l,p,231−236,1982）によりプラスミドpB
R322のBamH I部位でクローニングされたHPVl.aの完全な
ゲノムを含んでいる。ウイルスゲノムの後期領域から読
み取り枠を単離するために、プラスミドpBR322内でプラ
スミドpHPV1.aのフラグメントHind III−Hpa IIをサブ
クローニングした。得られたプラスミドをpHPL9とし
た。領域pBR322における非本質的なフラグメントBamH I
−pVu IIを除去することにより、このプラスミドを短縮
した。得られたプラスミドpHPL9.3から、５′末端の318
対を除く読み取り枠の1526塩基対（p.b.）を含むフラグ
メントXho II−Xmn Iを単離した。 L2読み取り枠の終止コドンを保存した。 得られたL2フラグメントを次に、非本質的なフラグメ
ントBamH I−Pvu IIの代わりにpCQV2発現ベクター（que
en1983）に挿入した。こうして、L2読み取り枠は、開始
ATGコドン及びλファージのcro遺伝子の配列SD（Shine
及びDargarno,Proc,Natl.Acad.Sci.USA71,p.1342−134
6,1974）に直接隣接しており、λPRプロモータの制御下
にある。プロモータは温度に敏感な抑制剤CI857により
調節されるので、L2の発現生成物の産生を制御すること
ができる。こうしてL2読み取り枠のＣ末端部の1206塩基
対がλファージのcroの開始ATGコドンと同相であるよう
なプラスミドpHPL2が得られた。解読相については、Bam
H I/Bgl IIの交差点における制限部位Xho IIの存在によ
り立証した。 大腸菌内で合成されたL2タンパクを安定化させ、該タ
ンパクを精製するのに好適な方法を提供する目的で、大
腸菌のβ−ガラクトシダーゼと融合したハイブリッドタ
ンパクと同様に該タンパクを発現させることに決定し
た。 このためには、BstE II部位でプラスミドpHPL2を直線
状にしてから酵素Bal31で消化させ、L2終始コドンを除
去した。 遺伝子L2と転写及び翻訳信号を供給する配列とを含む
このDNAを、Pst Iによる消化によって短縮し、フラグメ
ントPst I−Sma Iの代わりにプラスミドpMC1403（Casad
aban,Methods in enzymology 100,p.293−308,1983）に
挿入した。 PMC1403は、プロモータの含まないlacオペロンと、β
−ガラクトシダーゼの遺伝子の読み取り相の最初の22塩
基対とを含んでいる。組換え体を細胞MC1000,lac-にト
ランスフェクトした。クローン中で高温でβ−ガラクト
シダーゼを産生させると、L2とβ−ガラクトシダーゼと
が同相であるようなプラスミドpHPL2βgalを、Mc.Conde
yラクトース寒天培地（Silhavez他、Cold.Spring Harbo
r Laboratory,N.Y.1984）で選択することができた。 このような方法に従って選択されたクローンpHPL2,β
gal116を後で調査した。 DNAの配列（その結果についてはここでは示さない）
を検討した処、L2読み取り枠の最後の２個のＣ末端アミ
ノ酸のみがBal31による消化の過程で失われているこ
と、及びL2読み取り枠により発現される生成物はプロリ
ンを介してβ−ガラクトシダーゼの９番目のアミノ酸に
結合されていることがわかった。 pHPL2及びpHPL2βgal116でトランスフェクトした細胞に
よるHPVl.aと同種のタンパク質の産生 プラスミドpHPL2は、約51.2KdのL2タンパクをコード
し、及び約167Kdのハイブリッドタンパク質のpHPL−βg
alの容量を有している。 これらのプラスミドによるタンパク質の産生を検討す
るために、まずプロテアーゼを欠失する大腸菌CAG1139l
on-の菌株にこれらのプラスミドをトランスフェクトし
た。次に細胞を30℃、次に41℃で培養し、λPRプロモー
タの制御下でタンパク質の産生を誘導した。得られた細
菌溶解質に対して、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を実施した。 抗ウイルスHPVl.a抗体を使用して所謂「ウェスタンブ
ロット」法に従って分析した処、ウイルスHPVl.aと同種
のタンパク質が認識された。30℃にした培養物の分析結
果は、プラスミドを含むか又は含まない細胞については
同様であったが、41℃にした細胞の場合、トランスフェ
クトした細胞中にタンパク質の特異的バンドが示され、
組換え体pHPL2−βgal116でトランスフェクトした細胞
から単離されたタンパク質のうち、融合タンパクL2β−
ガラクトシダーゼ（L2−βgal）に対応する約136Kdの期
待分子量を有する主要なバンドと、恐らくタンパク分解
の結果であると考えられる約58Kdの分子量の数個の小さ
いバンドとが単離された。 構造pHPL2については、約72Kdのタンパク質のバンド
が見出された。この分子量は51.2Kdの予想分子量よりも
大きい。この差の意味については解明の余地がある。 次に、大腸菌中で産生されたタンパク質の抗原性を検
討するために、熱誘導培養株の細菌溶解質の生成物L2−
βgalをTREG−SEPHAROSEカラム（Ullman,Gene29,p.27−
31,1984）でアフィニティクロマトグラフィにより精製
した。カラムから溶離されたタンパク質をSDS−ポリア
クリルアミドゲルで分析した。「アミドブラック」で着
色した処、３個の主要なタンパク質のバンド、即ちL2−
βgalハイブリッドタンパクに対応すると思われる高分
子量バンドと、精製したβ−ガラクトシダーゼと共に移
動する第２のバンドと、約60Kdの分子量を有する第３の
バンドとが認められた。 分子量の小さいこのタンパク質は汚染物に対応し得
る。HPVl.a型の特異抗体を使用する「ウェスタンブロッ
ト」法による分析の結果、発現生成物L2−βgalに対応
する高分子量の主要なバンドと、数個の二次的なバンド
とが認められた（第3b図）。 生成物L2−βgalの免疫性 融合タンパクの免疫性を試験するために、２匹のラッ
トに溶離物を注射した。３回目の注射後に血清を収集し
た。得られた血清を、夫々プラスミドpHPL2−βgal116
又はプラスミドpHPL2を含む熱誘導培養株の細菌溶解質
中で「ウェスタンブロット」分析により、融合タンパク
L2−βgal又は生成物L2と同様に移動するバンドと反応
させた。 ２種類の型の細胞溶解質で、血清は対照溶解質CAG113
9にも見出されるタンパク質（約60及び55Kd）を認識し
た。これらのタンパク質の少なくとも一種は、融合タン
パクL2−βgal及びβガラクトシダーゼと同時に生成さ
れたタンパク質に対応するように思われる。 血清は、解離されたウイルス調製物HPVl.a（デタージ
ュント処理）及びHPVl.aにより誘導されたいぼの抽出物
中で、約80Kdのタンパク質を認識した。 免疫拡散試験において、得られたラット血清は抗原と
して使用された未処理のウイルス粒子HPVl.aを沈降させ
ず、従って、免疫トランスファー法で血清により認識さ
れるウイルス抗原はビリオンの表面では得られないこ
と、及び血清は沈降しないことが更に判明した。 ビリオン及びウイルスポリペプチドの天然高次構造を
保存するために知られている凍結いぼ切片HPVl.aでは、
L2の発現生成物から得た血清は反応しなかった。この結
果から、抗体は配座抗原に向けられていないことがわか
る。 血清は、BOUIN溶媒に固定されたHPVl.aに感染したい
ぼ切片とはほとんど反応しなかった（希釈度1/50）。こ
の結果から、ウイルスに感染しており且つBOUIN溶媒に
固定された切片でより強い抗原−抗体反応を生じる群の
抗原に対して該当型の抗原の特異的特徴が確認される。 一方、CARNOY溶媒により切片を観察した処、抗原型及
び抗原群のどちらも正の反応が認められた。特に、切片
が試験で使用された抗体の起源である抗原を提供したと
同一型のウイルスを含んでいた場合、ラットの血清は非
常に強い抗原−抗体反応（1/1000の希釈度）をもたらす
ことが確認された。これに対して、被調査血清を別の型
に属するウイルスを含む切片と接触させた場合、交差免
疫反応は何も認められなかった。 銘記すべき点として、抗原に予想される型は、２種の
異なる乳頭腫ウイルスのゲノムの相互ハイブリダイゼー
ション能力に関して上述したような型と常に一致してい
る必要はない。 乳頭腫ウイルスに存在する抗原として特に２種類、即
ち、 −完全ビリオンの注入後に得られる抗体を使用すること
により、各種の乳頭腫ウイルス間の交差抗原反応の不在
により特徴付けられる型の抗原、及び −本質的にビリオン中に遮蔽されており、解離されたウ
イルス粒子の注入後に抗体により露呈される類の抗原、 に区別される。 抗原−抗体反応試験で異なる型に属する乳頭腫ウイル
スは、好ましくは夫々の相同領域を欠くL2コード配列が
夫々の抗体で抗原−抗体交差反応を生じさせないポリペ
プチドをコードするような乳頭腫ウイルスである。 好適な型の抗原は、特に該当するL2領域の長さの1/4
にわたってＮ末端領域を欠く遺伝子L2の読み取り枠によ
りコードされた抗原である。 最後に本発明は、異なる型に属するウイルス中で、交
差反応を生じないL2領域によりコードされたポリペプチ
ドの型を求めるために実施される試験にも係る。これら
のポリペプチドは、Carnoy溶媒に固定された組織又は細
胞切片に含まれるウイルスと効果的に反応する抗体を含
むが、Bouin溶媒により固定されている同一切片とは不
十分にしか反応しないかあるいは全く反応しないような
ポリペプチドとして規定され得る。 本発明は更に、既知の乳頭腫ウイルスに対して新規乳
頭腫ウイルスを分類する方法にも係る。この方法は、明
細書の一部をも構成する請求の範囲第８項に規定されて
いる。 更に、本発明は場合によっては患者の体内に存在して
いる感染ウイルスの型の同定を含む診断方法にも係り、
該方法は、異なる型に属するウイルスに対して予め得ら
れた抗原を、試験すべき患者からの生物採取物、特に血
清と反応させることから成る。 血清採取物とこの同一型に属する乳頭腫ウイルスから
の抗原との間に抗原−抗体反応が観察されるなら、感染
ウイルスは所定の型に属するものと見なされる。この診
断試験は、例えばELISA法を使用することにより実施さ
れ得る。 より特定的には、本発明は組織又は流体のようなヒト
生物試料、例えば血清中の感染乳頭腫ウイルスが所与の
型の乳頭腫ウイルスに属するか否かを検出する方法に係
る。この方法は、この生物試料を、この型に属するウイ
ルスのゲノムの領域L2の少なくとも一部を含むDNAの発
現生成物に対して予め形成された抗体と接触させること
を特徴とし、この接触は免疫反応を可能にする条件下及
び時間内で実施される。抗原−抗体複合体の形成が検出
されると、上記発現生成物の起源である型と同一又は同
種の型を有する乳頭腫ウイルスの存在が証明される。 好ましくは、L2領域又は対応部分を含むDNAを、殺菌
例えば大腸菌のようなコンピテント細胞宿主内でクロー
ニングした。 有利には、使用されるL2領域部分は型の非特徴的Ｎ末
端領域を欠失している遺伝子L2の読み取り枠に対応す
る。好ましくは、このＮ末端領域はこの読み取り枠の４
分の１に対応する。 より特定的には、本発明は上記L2領域部分（又はL2領
域全体）を含むDNAが選択されたコンピテント細胞宿主
内で通常発現可能なタンパク質をコードする核酸から形
成されたハイブリッドDNAであり、上記L2領域が特にイ
ンビトロ再結合により予め取り込まれているようなこの
型の検出方法に係る。 例えば細胞宿主内で通常発現可能なタンパク質は、こ
の細胞宿主が大腸菌であるとき、β−ガラクトシダーゼ
の全部又は一部に対応する。 本発明の検出方法は、好ましくCarnoy溶媒中あるいは
血清に直接固定されたあらゆる組織切片に適用可能であ
る。 本発明の方法は生物試料を、同一型又は同種の型の数
個のウイルス、DNAプローブに対して上述の方法で再編
成されたウイルスに由来するL2領域の発現生成物、又は
夫々の対応する部分に対して予め形成された抗体の「カ
クテル」と、上記条件で接触させることも含む。 これらの抗体の「カクテル」を使用すると、DNAプロ
ーブに関して使用したと同様の条件下で、検出された乳
頭腫ウイルスの所与の種類への帰属と、患者が罹患して
いるか又は潜在的に危険のある病気とを相関させること
ができる。 最後に本発明は、上記ハイブリッドポリペプチド及び
対応する抗体の各々の製造方法にも係る。 この方法は、 −該当する乳頭腫ウイルスのゲノムのL2領域又は適当な
ベクター内の対応する領域部分の、特にインビトロの取
り込み、 −こうして修飾されたベクターで受容可能な細胞宿主、
即ち上記L2領域又は対応する部分を発現し得る宿主の形
質転換、及び −L2領域又は対応部分の発現の結果として形成されるポ
リペプチドの回収、及び好ましくは分離、 から成り、このポリペプチドは上記条件下で乳頭腫ウイ
ルスのタンパク質を検出することの可能な抗体をインビ
ボで産生させることが可能である。 本発明は更に、動物、例えばウサギを上記ポリペプチ
ドで感作し、形成された抗体を回収することを特徴とす
る抗体の産生方法にも係る。 最後に本発明は、各乳頭腫ウイルスが属することが確
認され得る各型に従って該乳頭腫ウイルスから得られる
ハイブリッドペプチド又は抗体の再編成を包含すること
もある。 参考文献 （１） Derst,M.他、1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.,80,3812−3845. （２） Coggin,J.R.,Jr.他、1979,Cancer Res.,39,545
−546. （３） Gissmann,L.他、1982,J.Virol.44,393−400. （４） Green,M.他、1982,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.,79,4437−4441. （５） Heilman,C.A.他、1980,Virol.36,359−407. （６） Jablonska,S.他、1972,Cancer Res.,32,583−5
89. （７） Jablonska,S.他、1982,Springer Semin.Immuno
−pathol.５,33−62. （８） Kremsdorf,D.他、1982,J.Virol.43,436−447. （９） Kremsdorf,D.他、1983,J.Virol.48,340−351. （10） Lutzner,M.A.他、1978,Bull.Cancer,65,169−1
82. （11） Lutzner,M.A.他、1983,Lancet ii,422−424. （12） Miggozi,M.他、1965,Bull.Soc.Franc.Derm.Syp
h.72,747−748. （13） Orth,G,他、1980,Cold Spring Harbor Conf.Ce
ll Proliferation,７,259−282. （14） Orth,G,他、1981,J.Invest.Dermatol.76,97−1
02. （15） Orth,G,他、1979,Cancer Res.39,1074−1082. （16） Ostrow,R.S.他、1982,Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.79,1634−1638. （17） Ostrow,R.S.他、1983,Ann.Acad.Dermatol.８,3
98−404. （18） Pfister,H.他、1983,Cancer Res.43,1436−144
1. （19） Pfister,H.他、1983,J.Virol.47,363−366. （20） Pfister,H.他、1981,Int.J.Cancer,27,645−65
0. （21） Rueda,L.A.他、1976,Med.Cut.I.L.A.２,113−1
36. （22） Ruiter,M.他、J.Invest.Dermatol.,47,247−25
2. （23） Sutcliffe,J.G.,1978,Nucleic Acids Res.５,2
721−2728. （24） Tsumori,T.他、1983,J.Gen.Virol.64,967−96
9.
含む乳頭腫ウイルス感染の検出又は治療用組成物に係
る。 「乳頭腫ウイルス」なる用語は、一般に比較的良性の
皮膚又は粘膜のいぼから、上皮内新形成及び皮膚癌に変
質し得る過形成までの各段階に存在する数種類の形態の
ウイルス性感染の原因であると共通に認識されている多
数のウイルスを包含する。乳頭腫ウイルス感染のうち、
より特定的にはいぼ状表皮異形成が特筆され、これを以
下の文中ではしばしばEVとして表す。 所定数の型の乳頭腫ウイルスが文献中に既に記載され
ている。本特許出願の範囲では、いぼ又は散在斑性病変
から単離され、多数の罹患患者で皮膚癌を早発させ得る
多数の型及び亜型の新規乳頭腫ウイルスについて記載す
る。 最近の研究の結果、各腫の型のヒド乳頭腫ウイルス
（HPV）について多数の免疫因子及び主要な機能が明ら
かになっており、これらの因子は、乳頭腫ウイルス感染
病原体における各種の遺伝的因子及び放射線の機能とし
て文献中に既に記載されているものに加えられる。 本発明は、以下に規定するような本質的ゲノム特徴を
有する新規に単離された多数の乳頭腫ウイルスの相対的
挙動に関して為し得た研究に基づいている。 少数のEVの例については既に研究されており、ゲノム
の分子クローニングより既に６種類の型のHPVが特徴付
けられている（KREMSDORF,D.他、1982,J.Virol.43:436
−447及びKREMSDORF他、1983,J.Virol.48:340−351）。
これらのHPVは、異なる群に属するゲノム間に交差ハイ
ブリダイゼーションが形成されないかあるいは非常に弱
い交差ハイブリダイゼーションが形成されるかに従って
３群に分類されている。第１の群は、所定数のEV罹患患
者及び一般集団に観察されている扁平いぼに関連するHP
V3a及び10から成り、HPV3aのDNA配列に属するDNA配列EV
罹患患者の癌に見出だされた。第２の群は、HPV5、８及
び12を含んでおり、HPV5及び８のゲノムはEV罹患患者の
癌に検出された。第３の群は、今日までの処ではただ一
種類のウイルスHPV9から構成されている。免疫抑制した
腎同種移植片を移植されており、HPV5に感染しているこ
とが明白であった者を除き、第２及び第３群のウイルス
はEV罹患患者にしか検出されておらず、これらの患者の
大部分は数種類のウイルスに感染していた。ここで留意
すべき点として、文献（追って示す参考文献１−5,8,9,
13,14,16,18−20）に実際に挙げられている14種類の型
のHPVのうち４種類の型は、稀な病例であるEVに特異的
に関連付けられることが分かった。 本発明に至る研究により、多数の新規型及び亜型の乳
頭腫ウイルスを単離することができたので、より高度な
インビトロ診断法が予想できる。より特定的には本発明
は、例えば病変部又は生検切片から得られた乳頭腫の改
良された同定方法を提供するものであり、より正確な診
断を実現することができ、従って、該当病変に予想され
る進行に関して改良された予後診断を下すことができ
る。 一般に、乳頭腫ウイルスは非常に多くの種類がある
が、7000〜8000のオーダの塩基対の寸法を有しているこ
とが注目される。一方、該ウイルスのゲノムはある程度
の相同性を有し得る。以下の記載では、種々の型及び亜
型の乳頭腫ウイルス間の相同百分率を数的に表現する
が、この相同百分率は所謂非厳酷もしくは非過酷条件
下、又は厳酷もしくは過酷条件下で実施されたハイブリ
ダイゼーション試験の結果として得られた値である。 乳頭腫ウイルスのうち、過酷もしくは厳酷条件下で測
定された相同百分率により特徴付けられる数種類の型の
乳頭腫ウイルスについて考察しよう。このような条件下
で50％未満の相同百分率を有するす乳頭腫ウイルスは、
異なる型に属するといえよう。このため、異なる型のウ
イルス間の相同百分率は過酷もしくは厳酷条件下ではゼ
ロとさえなることが銘記されよう。この過酷もしくは厳
酷条件で50％を越える相同百分率が観察されるようなウ
イルスは、同一型に属すると見なされ、この同一型のう
ちで異なる亜型を形成すると見なされる。 非過酷もしくは非厳酷条件のハイブリダイゼーション
試験では、HEILMAN C.A.他、1980,J.Virol.,36,395−40
7及びCROISSANT他、1982、C.R.Acad.Sc.Paris,294,581
−586に記載されている条件下でウイルスの２つの単離
体から得られたDNA（ヘテロニ重鎖分子）を相互に接触
させる。 過酷もしくは厳酷条件のハイブリダイゼーション試験
では、KREMSDORF,D.他（（1982）,J.Virol.43:436−447
及び1983,J.Virol.48:340−351）及びDAVIS R.W.他、19
71,Methods Enzymol.,21,413−428により記載されてい
る条件下でウイルスの２つの単離体しから得られたDNA
（ヘテロ二重鎖分子）を相互に接触させる。 概して、同一型に属する乳頭腫ウイルスは夫々の長さ
の全体の80〜100％にわたってほぼ等しいヌクレオチド
配列を有するハイブリダイズ可能な配列を有しており、
これらの相同配列は異なる型の乳頭腫ウイルスでは60
％、即ち同一型の場合よりも少なくなることが注目され
よう。非過酷もしくは非厳酷条件下で相互にハイブリッ
ド形成する異なる型の乳頭腫ウイルスの配列の同一もし
くは相同度は、同一型に属する乳頭腫ウイルスの場合よ
りも明らかに小さい。 発明者らが研究を進めた結果、各種の型の乳頭腫ウイ
ルス間の遺伝子異質度は従来予想されていたよりも大き
いこと、同時に各種の型は所定の特異度を有する感染形
又は感染変異体にしばしば関連していることがわかっ
た。 従って本発明は、予め単離された各種の新規乳頭腫ウ
イルスから単離され得るDNA及びこれらのDNAの全部又は
一部から構成され得るプローブに係るのみならず、種々
の種類の感染、即ち所定の乳頭腫ウイルスを発見された
患者の危険の程度を診断するためにより効果的に使用さ
れ得る型の乳頭腫ウイルスの混合物即ち、「カクテル」
にも係る。本明細書に記載されている乳頭腫ウイルスプ
ローブの個数、場合によっては予め既に単離されている
乳頭腫ウイルスのゲノムDNAから単離されたプローブ及
び所定の混合物に含まれるその配合物を加えた数は、よ
り高度な診断を可能にし、特に、各種の型の乳頭腫ウイ
ルスに起因するか又はこれらの型の影響下で発生し得る
各種の種類の感染をより十分に識別でき、所定のある種
の感染では、これらの感染が憂慮すべき病気に変質する
危険度をより十分に予後診断することが可能である。例
えば本発明の目的は、いぼ状表皮異形成により現わる感
染の場合、これらの感染が皮膚癌に進行する危険度をよ
り十分に予想することが可能な手段を提供することにあ
る。 一般に、以下の説明を簡単にするために、乳頭腫ウイ
ルスの完ゲノムは略称HPV−DNAで表す。 同様に解り易くするために、以下の説明は既知の乳頭
腫HPV−DNAを含むHPV−DNAの物理的制限地図から成る添
付図面を参考にしている。 物理的地図は、各種の制限エンドヌクレアーゼによる
切断部位の位置を示している。地図の原点は一般に単一
の切断部位から構成されている。原点までの距離は、ゲ
ノムの長さの百分率で表してある。地図の１単位はゲノ
ムの長さの１％を表す。 本発明はまず第一に、より特定的には7000〜8000塩基
対の間の寸法を有しており、図面に示したような制限地
図により特徴付けられるDNAの集合から選択されたHPV−
DNAの各々に係り、これらの図面はより特定的には、乳
頭腫ウイルスから得られ、指称HPV−2d、HPV−10b、HPV
−14a、HPV−14b、HPV−15、HPV−17a、HPV−17b、HPV
−19、HPV−20、HPV−21、HPV−22、HPV−23、HPV−2
4、HPV−28、HPV−29、HPV−31及びHPV−32、HPV−IP2
及びHPV−IP4に相当するHPV−DNAに関するものである。 当然のことながら、本発明は上記に列挙したと同一型
に属するとみなされ得るHPV−DNAに対する効果にも及
ぶ。 新規に特徴付けられたウイルスのHPV−DNAに対応する
物理的地図は、黒円で示してある。 本発明はまた、上記HPV−DNAのフラグメント又は特に
過酷条件下でこれらのHPV−DNAとハイブリダイズ可能な
フラグメントにも係る。更に本発明は、上記HPV−DNAの
各々の全部又は一部を含む組換えDNA、より特定的には
夫々遺伝子E1、E6−E7、L1及びL2に対応するフラグメン
トあるいは上記HPV−DNAの遺伝子間領域に対応する配列
を含むDNAに係る。更に本発明は、これらのHPV−DNAか
ら又は対応するフラグメントから構成され得るプローブ
及び該プローブをインビトロで使用する診断法に係る。 ウイルスDNA調製物は、EVに罹患した６人のヨーロッ
パ人患者とEVに罹患した２人の南米人患者の良性病変の
掻去物から選択的に抽出した（LUTZNER,M.A.他、1983,L
ancet ii:422−424）。HPVのDNAは、塩化セシウム勾配
中で平衡遠心分離により、及び／又は従来記載されてい
る操作方法（前出のKREMSDORF,D.他の論文及びORTH,G.
他、1980,Cold Spring Harbor Conf.Cell Proliferatio
n７:259−282）に従って臭化エチジウムの存在下でショ
糖勾配中で沈降させることにより精製した。DNA調製物
を制限エンドヌクレアーゼで処理し、消化物をアガロー
スゲルで電気泳動により分離した（前出のKREMSDORF他
の論文）。患者の１人の尋常性いぼにはHPV5、８及び12
（前出のKREMSDORF他の論文）及びHPV2（HEILMAN,C.A.
他、1980,J.Virol36:395−407及びORTH,G.他、1980,Col
d Spring Harbor Conf.Cell Pro−liferation７:259−2
82）が検出されたが、これ以外にDNA制限酵素による主
要切断モデルを提供する菌株として、従来特徴付けられ
ている型とは異なる11個の菌株が同定された。同定の年
代順（COGGIN,J.R.他、Cancer Res.39:545−546）に従
って新規HPV型に番号を付け、亜型には番号と文字とを
付した。11種の新規HPVのゲノムを、大腸菌K12株C600で
クローニングした（前出ののKREMSDORF,D.他の論文（19
83））。エンドヌクレアーゼBamH Iによる形成されたHP
V24のDNAの２つのフラグメントを除き、DNAを単位長さ
の分子として挿入した。DNAは、Ava I、BamH I及びHind
IIIの単一切断部位を使用することによりプラスミドpB
R322（SUT−CLIFFE,J.G.,1978,Nucleic Acids Res.５:2
721−2728）に挿入するか、又はHPV5のDNAのフラグメン
トHind III Bを組み込んでおり、単一Sac I部位を含む
組換え体プラスミドに挿入した。より特定的には、HPV
のDNAとHPV5のDNAのフラグメントHind III Bを含む組換
え体プラスミドpBR322とをただ一箇所でしか切断しない
酵素（Sac I）で切断後、単位長さのDNA分子としてHPV1
7b及び22を挿入した。HPV14aのDNAは、ゲノムの長さの9
6.1及び3.9％の２つのフラグメントを形成する酵素であ
るHind IIIでウイルスDNA調製物を不完全に消化後、単
位流さのDNA分子としてプラスミドpBR322に挿入した。
（ゲノムの長さの夫々83.1及び16.9％に対応する寸法を
有する）HPV24のフラグメントBamH I A及びＢは、プラ
スミドpBR322に別々に挿入した。 単離したクローン及び対応するHPVのソースを下記第
Ｉ表に示す。 組換え体プラスミドを認識するために、プラスミドに
ウイルス配列を挿入するために使用したエンドヌクレア
ーゼを含む２種の制限エンドヌクレアーゼの混合物で処
理後、組換え体DNAと非クローン化HPVのDNAとの消化物
について電気泳動による移動度を比較した。単離された
フラグメントの個数及び寸法を検討した処、いずれの場
合もこれらの完全なウイルスゲノムが組み込まれている
ことがわかった。プラスミド配列からクローニングされ
ないもしくは切り出されないHPVのDNAをアガロースゲル
で電気泳動により分析した処、DNAの寸法は異なってい
ることが観察された（データは示さず）。HPV14b、19、
20及び21のDNAは、HPV3a、５、８及び12の寸法（約7700
ヌクレオチド対）（前出のKREMSDORF,D.の論文）に類似
する寸法を有しており、HPV15、17a、17b、22及び23のD
NAの寸法はHPV9の寸法（約7200ヌクレオチド対）（前出
のKREMSDORF,D.,1982及びORTH,G.,1980の論文）とそれ
程は類似していなかった。 14種の制限エンドヌクレアーゼに対するクローン化ウ
イルスゲノムの反応性を分析し、物理的地図（第１図〜
第10図）を作成した。後述するモチーフに関する所定の
図面では、所定のHPV−DNAの制限地図を反復した。従来
記載されている方法（９）に従って22〜23の切断部位を
位置付けした。HPV14a及び14b（第4a図及び4b図）並び
にHPV17a及び17b（第５図）を除いて、これらの地図の
間に明白な相同性は検出されなかった。HPV14aのDNAの
２つのBamH I切断部位の一方がHPV14bのDNAの単一BamH
I切断部位の整合している場合、夫々HPV14a及び14b,15
に位置付けされた21〜31の部位は共通であることが判明
した。同様に、単一BamH I切断部位が相互に整合してい
る場合、HPV17aのDNAに配置された29の切断部位のうち2
1の部位はHPV17bのDNAにも（26部位と共に）見出だされ
た。 これらの地図と、EVに関連するHPV（HPV3a,5,8,9,10
及び12）（8,9,16,18,20）、皮膚いぼに関連するHPV（H
PV1,2,4及び７）、及び粘膜皮膚又は粘膜の病変に関す
るHPV（HPV6b,11a,13及び16）（1,33,19）に関して従来
作成されている地図との間に、何ら明白な類似は見出だ
されなかった。但しHPV14aの地図は、EVに罹患した１人
の日本人患者から単離されたHPVの地図に非常によく似
ている（24）。この患者から単離した単離体はBamH I部
位及び付加的Hind II部位がHPV14aと異なっており、部
位Ava I、BamH I、Bgl I、EcoR I、Hind II及びHind II
Iの位置は２種のウイルス間で類似している。交差ハイ
ブリダイゼーション実験により、これらの２種のウイル
スが非常によく似ていることを確認した。 所定の部位（矢印で示した部位）は位置付けされてい
ないことが認められる。位置付けによるゲノムの長さの
差が２％未満の切断部位は保存されていると見なされる
（＊）。ニックを形成しない酵素はHPV14a及び23のDNA
ではPvu I、Sal I及びSma I、HPV14bのDNAではPvu I、S
ac I、Sal I及びSma I、HPV15、17a及び17bのDNAではBg
l I、Pvul I、Sal I及びSma I、HPV19のDNAではBgl I、
Sac I、Sal I及びSma I、HPV20のDNAではEcor I、Pvu
I、Sac I及びSma I、HPV21のDNAではSac I及びSma I、H
PV22のDNAではBamH I、Bgl I、Pvu I、Pvu II及びSal
I、HPV24のDNAではBgl I、EcoR I、Pvu I、Sac I、Sal
I及びSma Iであった。 新規に特徴付けられたHPVのDNAのDNA間相互の配列の
相同性の存在、更にこれらのDNAと、EVに関連するHPV
（HPV3a,5,8,9,10及び12）、皮膚いぼに関連するHPV（H
PV1,2,4及び７）及び粘膜病変に関連するHPV（HPV6b,11
a,13及び16）のDNAとの間の配列の相同性の存在につい
て検討した。紙固定によるハイブリダイゼーション及
び飽和液相DNA−DNAハイブリダイゼーション後、ヌクレ
アーゼS1により消化させる実験を、上記過酷もしくは厳
酷条件下で実施した（8,9）。特に、HPVのDNAをニック
トランスレーションにより標識し、従来記載されている
ように（13）、アルカリショ糖勾配（５〜20％）中で沈
降により断片化した。標識したHPVのDNA（4000cpm）
を、従来記載されているように（8,9）ウシ胸腺DNA（20
μｇ）又は非標識HPVのDNA（0.20μｇ）の存在下でNaCl
0.48M−EDTA 1mM（pH6.8）中で68℃でインキュベートし
た。HPVのDNAのプローブの特異活性は5.3×107〜２×10
8cpm/μｇであった。ヌクレアーゼS1耐性フラクション
を測定することにより、ハイブリダイゼーション率を決
定した。数値は、プローブの自発的自然再生を表す修正
値（４〜15％）及び相同ハイブリダイゼーションを表す
100％に標準化した値（75〜95％）を表している。略記N
Dは測定せずという意味である。上記条件下におけるHPV
−DNA間の交差ハイブリダイゼーションの相対的な大き
さは、標識したHPV−DNAと非標識HPV DNAとの間のハイ
ブリダイゼーション（％）で表す。 HPV1,2,4,6b,7及び11aのゲノムと新規にクローニング
され32Pで標識したEVのHPVのDNAとの間、又は非標識EV
のHPVのDNAとHPV13,16及び18の特異的プローブとの間に
は交差ハイブリダイゼーションが不在又はほぼ不在であ
ることが認められる。同様に、HPV14a,14b,15,17a,17b,
19,20,21,22,23及び24のDNAとHPV1a及び11aのDNAとの間
には、飽和再結合による交差ハイブリダイゼーションは
全く又はほぼ認められなかった（第II表）。新規にクロ
ーニングされたHPVのDNAは交差ハイブリダイゼーション
を全く又はほぼ示さず、あるいは相互間及びEVに関連す
る他のHPV（HPV3a,5,8,9,10及び12）のゲノムとの間に5
0％未満の交差ハイブリダイゼーションを示した。但しH
PV14a及び14bとHPV17a及び17bは強い交差ハイブリダイ
ゼーションを示した。以上の結果から、新規ウイルスは
９種類の新規型（HPV14,15,17,19,20,21,22,23及び24）
と、型14（HPV14a及びｂ）及び17（HPV17a及びｂ）の２
種類の亜型に分類されることが確認される。 同様に、過酷な分子ハイブリダイゼーション条件下に
おける配列の相同性（又は相同性の不在）に基づいて各
HPVを群に分類した。これらの群はＡ〜Ｈの文字で示
し、下記第III表にリストした。この表は、これらのHPV
（単離体又は単離体の組み合わせ）の保菌者で診断され
た疾患、及び該保菌者に認識された腫瘍遺伝子の潜在力
を示している。 HPV5,8,12,14,19,20,21,22及び23のDNAは相互間の交
差ハイブリダイゼーション率（群の相同性）が５〜38％
であり、HPV5,8及び12のDNAとの間のみに顕著な交差ハ
イブリダイゼーション（４〜13％）を示す。従って、こ
れらのウイルスは従来規定されているEVのHPVの群
（９）の一部をなす。 同様に、相互間の交差ハイブリダイゼーションが約20
％でありHPV9のDNAとの間の交差ハイブリダイゼーショ
ンが約６％であるHPV9,15及び17のDNAは、同様に既に記
載されているEVのHPVの群（９）に属する。型13及び31
のHPVは、同一の群に属すると考えられる。最後に、他
のHPVのゲノムとの間に相同性をほとんど示さない型1,
2,4,24及び32のHPVは、相互に異なる他の群及び上記群
の第１員を形成すると見なされる。 本発明は更に、より特定的には上記HPV−DNAに由来す
るDNAフラグメント、及びより特定的には夫々遺伝子E6
−E7,E1,L1,L2及びそれらの遺伝子間領域に対応するDNA
フラグメントに係る。原点とみなされる部位（第１図〜
第９図）に対するこれらの各種のフラグメントの位置及
び相対長さを、下記の第IV表に示した。 HPV1のゲノムにおける遺伝子の位置付けはこのゲノム
のヌクレオチド配列から導いた（O.Danos,M.Kaninka及
びM.Yanivの特許）。過酷（Tm−29℃）又は非過酷（Tm
−40℃）条件で形成されたヘテロ二重鎖分子の電子顕微
鏡分析後、HPV3,5,8,9,10a,12,14,15,17及び24のゲノム
の物理的地図を、HPV1の物理的地図及び遺伝子地図に対
して整合させ、HPV31のゲノムの物理的地図を、HPV6bの
物理的地図及び遺伝子地図に対して整合させた（E.Schw
arz他、EMBO.J.,1983,2,2341−2348）。 第IV表に示した座標の値は、第１図〜第９図の物理的
地図における遺伝子E6及びE7,E1,L2及びL1の相同ゲノム
のセグメントの５′及び３′末端、及びHPV1aのゲノム
に対する遺伝子間領域、又はHPV31の場合にはHPV6bのゲ
ノムに対する遺伝子間領域の位置を示している。 非過酷ハイブリダイゼーション条件下で異なる群に属
する型のHPVのゲノム間、又は過酷ハイブリダイゼーシ
ョン条件下で同一群に属する型のHPVの大部分のゲノム
間に形成されたヘテロ二重鎖分子を電子顕微鏡分析にし
た場合、（調節成分を含む）遺伝子間領域及び隣接遺伝
子E6及びE7（腫瘍中に発現される主要トランスフォーメ
ーション遺伝子に対応すると思われる）は、検出可能な
配列相同性を示さない。非過酷ハイブリダイゼーション
条件下で異なる群に属する型のHPVのゲノム間、又は過
酷ハイブリダイゼーション条件下で同一群に属するHPV
のゲノム間に形成されたヘテロ二重鎖を分析した場合、
遺伝子E1（主にウイルスDNAの複製に関与する）及び遺
伝子L1（ビリオンの主要抗原決定基を有するウイルスキ
ャプシドの主要タンパクをコードする）は、検出可能な
配列の相同性を示す。 領域E1及びL1を含む組換え体プラスミドから作製され
たプローブは、場合によっては過酷又は非過酷条件下で
実施される分子ハイブリダイゼーションの実験により最
大数のHPV型を検出することが理論的に可能である。遺
伝子間領域及び遺伝子E6及びE7を含む組換え体プラスミ
ドから作製されたプローブは、所定のHPV型又は同種のH
PV型を特異的に検出することが可能である。 領域L2（ウイルスキャプシドの微量構成成分をコード
する）は、異なる型のHPV間で可変のヌクレオチド配列
保存率を有する。 以下、ウイルスHPV−IP2及びHPV−IP4を単離した条
件、次いでこれらのウイルスからHPV−DNAを得た条件に
ついてより明確に説明する。 生殖器新形成及び癌に関連する新規型のHPV（HPV IP2）
の分子クローニング及び特徴付け 非過酷条件下でHPV16型の特異的放射性プローブを使
用するハイブリダイゼーションにより、子宮頸部の癌か
ら抽出したDNAには新規型のHPVが露呈された。過酷ハイ
ブリダイゼーション条件でハイブリダイゼーションを実
施した場合には交差ハイブリダイゼーションは検出でき
なかった。数種類の制限酵素に対するこのHPVのDNAの反
応性を調べた処、酵素Bgl IIはウイルスDNAを一箇所で
切断していることがわかった。腫瘍から抽出したDNAを
エンドヌクレチーゼBgl IIで消化後、8kb（乳頭腫ウイ
ルスのゲノムの寸法）のDNA分子を含んでいるフラクシ
ョンを、ショ糖勾配中で遠心分離により精製した。8kb
の分子をBgl II部位でプラスミドPL15.5から成るベクタ
ー（Bgl II及びBamH Iによる単一切断部位を含む）に挿
入し、該ベクターはBamH I部位でλバクテリオファージ
L47,1のDNAに挿入した。組換え体のDNAのキャプシド形
成及び宿主細菌（大腸菌、菌株LA101）への感染後、非
過酷条件下で放射性HPV16のDNAで感染細菌培養物のレプ
リカハイブリダイゼーションを実施した処、組換え体フ
ァージに対応する溶菌プラークが検出された。ウイルス
配列全体を含んでいる数個の組換え体がバクテリオファ
ージが単離され、挿入酵素Bgl IIによるファージDNAの
切断は非過酷条件でHPV16プローブとハイブリダイズす
る8kbのフラグメントを形成し、酵素Bgl II及びPst Iの
混合物による組換え体ファージのDNAと元の腫瘍のDNAと
の切断は、乳頭腫ウイルスのゲノムの寸法に等しい総分
子量を有する同一の５つのフラグメントを形成する。新
規HPVのDNAを組換え体バクテリオファージのDNAか切出
し、電気溶離により精製し、プラスミドPL15.5内で再ク
ローニングした。18個の制限エンドヌクレアーゼに対す
るこのDNAの反応性に基づいて、ウイルスDNAの制限地図
を作成し、21個の切断部位を位置付けすることができた
（第９図）。こうして作成した地図は今日までに同定さ
れているHPVのゲヌムの地図とは異なっている。新規HPV
のDNAと従来同定されているHPVのDNAとの間の配列を相
同性を、過酷条件で実施したレプリカ分子ハイブリダイ
ゼーション実験により分析した。検出された相同性は常
に５％未満であり、最大の相同性はHPV16のゲノムで検
出された。子宮頸部の癌から特徴付けられた新規ウイル
スは、従って新規型のHPVを構成しており、これをHPVIP
2と仮称する。 種々の条件下でHPVIP2のDNAとHPV1のDNAとの間に形成
されたヘテロ二重鎖分子を電子顕微鏡で分析した処、こ
れらの２種のゲノムの物理的地図を整合させることがで
き、HPVIP2のDNAがもっている異なる遺伝子の理論的位
置を決定することができた。 このゲノムの地図における主要遺伝子及びHPV−IP2の
遺伝子間領域の推定位置付け 末端座標 5′ 3′ E6−E7 62 71.5 E1 71 95 E2 95.5 11.5 L2 11 30.5 L1 31.5 52 遺伝子間領域 52 63.5 精製されたHPVIP2のDNAから作製した放射性ブローブ
を使用することにより、これらのウイルスの病原性を決
定することができた。HPVIP2のDNAが認識されたのは、1
4件の調査対象のうち外部生殖器官の退形成丘疹の１
例、51件の調査対象のうち２件の子宮頸部の進入性癌、
及び28件の調査対象のうちの子宮頸部の上皮内新形成の
１例であった。従って、HPVIP2は頻度がHPV18よりもや
や低く且つHPV16よりも著しく低い腫瘍形成潜在力を有
する生殖器向性HPV型である。生殖器新形成、特に子宮
頸部癌の発生の危険を孕むHPV型の診断又は早期発見す
るためには、分子プローブの作製に使用されるHPVのDNA
のあらゆる混合物にHPIVIP2を混入させる必要がある。 皮膚の前癌性病変に関連する新規HPV型（HPVIP4）の分
子クローニング及び特徴付け 過酷条件下でHPV5,8及び14型の特異的放射性プローブ
を用いて混合物で分子ハイブリダイゼーションを実施す
ると、皮膚前癌性病変である紫外線角化症の生検から抽
出したDNAに新規型のHPVが露呈された。1,2,3,7,10,13,
16,18,28,IP1（前出のHPV31）,IP2及びIP3（前出のHPV3
2）型の特異的プローブでハイブリダイゼーションを実
施した場合、交差ハイブリダイゼーションは何も見出だ
されなかった。 数種類の制限酵素に対するこのHPVのDNAの反応生を調
べた処、酵素EcoR IはウイルスDNAを一箇所切断するこ
とがわかった。生検から抽出されたDNAをエンドヌクレ
アーゼEcoR Iにより消化後、8kb（乳頭腫ウイルスのゲ
ノムの寸法）のDNA分子を含むフラクションを、ショ糖
勾配中で遠心分離により精製した。8kbの分子をEcoR I
部位でバクテリオファージλgt wes.λＢのDNAに挿入し
た。組換え体DNAのキャプシド形成及び宿主細菌（大腸
菌、菌株LA101）への感染後、非過酷条件下でHPV8及び1
4のDNAの放射性混合物で感染細菌培養物のレプリカハイ
ブリダイゼーションを実施した処、組換え体ファージに
対応する溶菌プラークが検出された。ウイルス配列全体
を含む数種類の組換え体バクテリオファージが単離さ
れ、挿入酵素EcoR IによるファージDNAの切断は、非過
酷条件でHPV5,8及び14の特異的プローブとハイブリダイ
ズする8kbのフラグメントを形成し、酵素EcoR I及びPst
Iの混合物による組換え体ファージのDNAと元の病変部
のDNAとの切断は、乳頭腫ウイルスのゲノムの寸法に等
しい総分子量を有する同一の６個のフラグメントを形成
する。新規HPVのDNAを組換え体バクテリオファージのDN
Aから切り出し、電気溶出により精製し、プラスミドpSP
65内で再クローニングした。15個の制限エンドヌクレア
ーゼに対するこのDNAの反応性に基づいて、ウイルスDNA
の制限地図を作製し、こうして23の切断部位を位置付け
することができた（第10図）。こうして作成した地図は
今日までに同定されているHPVのゲノムの地図とは異な
っている。過酷条件下で実施されたレプリカ分子ハイブ
リダイゼーション実験により、新規HPVのDNAと今日まで
同定されているHPVのDNAの間の配列の相同性を分析し
た。新規HPVのDNAといぼ状表皮異形成病変中に従来同定
されている所定の型のHPV（HPV5,8,12,14,19,20,21及2
5）のDNAとの間には50％未満の相同性が検出されたが、
その他の型のHPVとの間には相同性は何も検出されなか
った。従って、紫外線角化症から特徴付けられる新規ウ
イルスは、HPV−IP4と仮称される新規型のHPVを構成す
る。 精製したHPVIP4のDNAから作製された放射性プローブ
を使用した処、調査したいぼ状表皮異形成に罹患した17
人の患者の42％、及び分析した紫外線角化症生検のx/y
にHPVIP4を露呈させることができた。HPVIP4は、皮膚癌
の頻発により特徴付けられる疾患であるいぼ状表皮異形
成に罹患した患者に頻度が高く、皮膚の有し細胞癌の前
駆体とみなされる紫外線角化症の病変のフラクションに
関連付けられるので、腫瘍形成潜在力を有する皮膚向性
HPV型であると判断できる。皮膚の前癌又は癌の病変の
発生の危険を孕むHPV型を診断又は早期発見するために
は、分子プローブの作製に使用されるHPVのDNAの全混合
物にHPVIP4型を混入することが必要である。 本発明はより特定的には、乳頭腫ウイルスの感染の各
種の形態の総合的診断を実施するため、特に感染の可能
な進行を予後診断するために組み合わせて使用し得る各
種のHVP−DNAの混合物即ち、カクテル（又はこれらのHP
V−DNA又はこれらのDNA配列を含むプローブ）にも係
る。本発明の好適な混合物を下記第Ｖ表に示した。 この表は、より特定的には表の左側に示した混合物を
使用することにより診断され得る疾患の性質も示してい
る。第１図〜第９図の制限地図の区分は第Ｖ表の「構
成」の欄に示した区分と一致していることが銘記されよ
う。また、このために所定のプローブは各添付図面で数
回繰り返している。 これらの混合物の各々は、本発明の新規プローブの少
なくとも１つを含むものと規定できる。換言するなら、
本発明の診断用組成物は、 １）少なくともHPV2dのDNA、 ２）HPV10b,28及び29のDNAの少なくとも１種、 ３）HPV17,24のDNAの少なくとも１種、 ４）HPV14,15,17,19,20,21,22及び23のDNAの少なくとも
１種、 ５）HPV15及び17のDNAの少なくとも１種、 ６）HPV24のDNA、 ７）HPV14,32のDNA、 ８）HPV31のDNA、 ９）HPV32のDNA を含むものと規定できる。尚、上記９群のDNAは相互に
異なる全状況で選択される。 種々のいぼ形態又は他の皮膚もしくは粘膜病変部から
単離され得るHPVは非常に多種に及ぶことを考慮する
と、他のHPV−DNAも同一型の疾患の発生に関与し得ると
認められるので、表に示した各型の疾患を診断するため
には、１種又は２種より多くのHPV−DNAを含む混合物を
使用することが好ましい。感染の性質及び可能な進行の
診断は、使用されるプローブの数が多いほど有効であ
る。更に、プローブの各混合物を使用してハイブリダイ
ゼーション試験を実施すると、患者が罹患している病気
の性質をより高い確率で鑑別する鑑別診断が可能にな
る。 第Ｖ表では、発明者の実験室で単離したHPV−DNAから
形成したプローブしか示していない。上記に述べた理由
により、他の実験室で得られたHPVに由来するDNAも同一
型に感染した患者に繰り返して認められるので、各混合
物にこれらのDNAを追加できることは言うまでもない。
例えば混合物７には、上皮内新形成及び皮膚癌に変質す
る危険を孕むいぼ状表皮異形成に認識される他の全HPV
−DNAを追加することができる。第Ｖ表中、所定の混合
物は診断すべき同一疾患の特徴を有するものとして示さ
れていることが認められよう。一方、各混合物は癌化の
危険の低い感染と癌化の危険の高い感染とを識別する。
例えば、混合物７で診断した患者からウイルス調製物の
ハイブリダイゼーションは、混合物３でハイブリダイゼ
ーションを形成する場合よりも皮膚癌化の危険が大きい
ことが立証されよう。 同様に、混合物５により検出されるEVは混合物６によ
り検出されるEVより癌化の危険が大きいことがわかる。
混合物４は、混合物５により検出されるよりも危険度の
高いEVを検出する。 以下、乳頭腫ウイルスの各感染形態の総合診断を実施
するために、場合によっては感染の可能な進行を予後診
断するために組み合わせて使用され得る種々のHPV−DNA
から成る他の混合物即ち、カクテル（又はこれらのHPV
−DNAを又は該DNAの配列を含むプローブ）について更に
説明する。 本発明の好適な混合物は、上記第Ｖ表に示した。 この表は、より特定的には表の左側に示した混合物を
使用することにより診断され得る疾患の性質も示してい
る。もう一度ことわっておくが、この表に示される他の
HPV−DNAの制限地図は第１図〜第９図に含まれている。 HPV−IP2の生殖器新形成、特に子宮頸部癌の発生の危
険を検出するために使用可能なプローブを特定的に表す
とみなされ得ることに留意されたい。 従って、本発明はより特定的には表中「混合物の指
称」の欄に１〜10の番号を付けた少なくとも10群を含む
診断用箱又は「キット」にも係る。 以上の説明ではクローニングした完全なHPV−DNAをプ
ローブとして使用する場合について特に考察した。もっ
とも、該DNAの代わりにこれらの各DNAのクローン化フラ
グメント、特に遺伝子E1又はL1及び遺伝子E6−E7を使用
してもよい。 HPV−DNAをインビトロで検出する基本原理は、当然過
酷又は非過酷条件で操作されるハイブリダイゼーション
を使用するものである。例えば以下に述べるように操作
すればよいが、記載されている診断試験は当然本発明の
プローブ又はプローブ混合物の使用条件を限定するもの
と見なすことはできない。 クローン化HPVのDNAの混合物から作製したプローブを
使用する試験の目的は、生検中、病変部の掻去により得
られた細胞中、又はCarnoy混合物（エタノール、クロロ
ホルム、酢酸6:3:1）により形成され且つパラフィンに
含有される生検の切片中でHPVを露呈させ且つHPV型を同
定することである。試験は、既知の原則の方法に従って
採取物のDNAを予め抽出する必要があり、HPVのDNAの混
合物から作製した（32P又は35Sで標識した）放射性プロ
ーブを使用して、過酷又は非過酷条件下で実施した分子
ハイブリダイゼーション実験によりこのDNAの分析を行
う。各試験では、一般にプローブの数種類の混合物を使
用する必要がある。 数種類のハイブリダイゼーション法を使用することが
できる。例えばブロットハイブリダイゼーション法を使
用することができる。この方法は、DNAの変性後、膜
（ニトロセルロース又はGenescreenplus）にアリコート
量のDNAを堆積させ、通常条件で各膜をプローブの混合
物でハイブリダイゼーションし、膜をＸ線写真フィルム
と接触させることにより放射性ハイブリッドを検出する
ことから成る。レプリカハイブリダイゼーション法を使
用してもよい。この方法は、制限酵素によるDNAの処理
後に形成されたDNAのフラグメントをアガロースゲル電
気泳動で分離し、アルカリ変性後、膜（ニトロセルロー
ス、Genescreenplus）にフラグメントを移し、これらの
フラグメントを通常条件でプローブの各混合物でハイブ
リダイゼーションすることから成る。放射性ハイブリッ
ドの形成は、膜にＸ腺写真フィルムと接触後に検出され
る。 放射性プローブは、「ニックトランスレーション」法
により標識したHPVのDNAから構成されるか、例えばSP6
型のベクターに挿入されたウイルスDNAの転写により作
成されたRNAから構成される。放射性プローブを使用す
ると感度が大きいという利点があるが、相互に標識され
た抗体又はそれ自体酵素、蛍光等のマーカーを有する抗
体により認識された抗体により認識され得る例えばビオ
チニル化した非放射性プローブを使用する場合はこのよ
うな利点は得られない。 プローブの選択は、採取物の性質に依存する。例えば
EVに罹患している疑いのある患者の場合、混合物1,2,3,
4,5,6及び７が使用される。混合物１及び２は、EVと皮
膚いぼとの間の鑑別診断が可能である。病気に関連する
３群のHPVの各々の最も高頻度で検出された群を含むプ
ローブ３、及びEVの癌に関連する型のHPVのDNAを含むプ
ローブ７は、EVの殆どの症例を診断することができ、特
に、癌の発生の危険のあるHPV型に感染した患者を認識
することができる。混合物4,5及び６を使用すると、同
一患者に感染するHPV型を確定することができる。 従って、更に本発明は上記に示したような複数のプロ
ーブ、即ち −上記19種の型及び亜型のHPV−DNAの各々の典型、又は −プローブ混合物、好ましくは先に規定した各種の群又
はプローブ混合物を含む容器もしくは「キット」に係
り、これらの「キット」は、患者から得られたウイルス
調製物と各種の群又は混合物との間のハイブリダイゼー
ションにより「インビトロ」診断調査に使用される。 当然のことながら既に示したように、本発明は特定的
に述べた適用例及び実施例に限定されず、あらゆる変形
例を包含し、特に図面に示した制限地図のHPV−DNAが対
応するように請求の範囲の項で所定の数字と共にDNA−H
PVに付した参照符号は、これらの請求の範囲が上述の規
定に従って同一型に分類され得るこの特定のHPV−DNAと
共通の全HPV−DNA、更に同一亜型に属するHPV−DNAに及
ぶことを意味するものと見なされる。 より特定的には、図面に示したHPV−32から誘導したD
NAは、Ava I,Bal I,BamH I,Cla I,EcoR I,Hind III,Nde
I,Nru I,Pvu I,Pvu II,Sac I,Sal I,Sma I,Tth III,Xm
a Iにより切断されていないことも注目される。 以下に示す組換え体DNAは、1984年11月30日付けでC.
N.C.M.（Collection Nationale des Cultures de Micro
−Orga−nismes de l′INSTITUT PASTEUR de Paris）に
下記の番号で寄託されている。 pBR322/HPV2d ……No.I−379 pBR322/HPV10bA ……No.I−380 pBR322/HPV10bB ……No.I−381 pBR322/HPV14a ……No.I−382 pBR322/HPV14b ……No.I−383 pBR322/HPV15 ……No.I−384 pBR322/HPV17a ……No.I−385 pHPV5Hind III B/HPV17b ……No.I−386 pBR322/HPV19 ……No.I−387 pBR322/HPV20 ……No.I−388 pBR322/HPV21 ……No.I−389 pHV5 Hind III B/HPV22 ……No.I−390 pBR322/HPV23 ……No.I−391 pBR322/HPV24a ……No.I−392 pBR322/HPV24b ……No.I−393 pBR322/HPV28 ……No.I−394 pBR322/HPV29 ……No.I−395 pBR322/HPV31 ……No.I−396 pSP64/HPV32 ……No.I−397 pLI55/IP2 ……No.I−450 pSP65/IP4 ……No.I−449。 本発明はより特定的には、上記に言及した異なる乳頭
腫ウイルスの遺伝子E6、E7及び特にL2の発現生成物に係
る。 これらの発現生成物は、所定の生物採取物中の乳頭腫
ウイルス又は該ウイルスの発現生成物を検出するため、
及び乳頭腫ウイルスが属する型又は亜型に従って乳頭腫
ウイルスを同定するためにそれ自体使用され得る。これ
らの発現生成物が得られる条件については、特に乳頭腫
ウイルスHPVの配列L2の発現に関して以下の記載中に説
明するが、同様の方法を利用して他の型の乳頭腫ウイル
スに由来する遺伝子配列L2（又はE6,E7又はL1）の発現
を誘導してもよい。以下の説明は例外を除き、配列又は
遺伝子L2についてより特定的に述べているが、場合によ
っては遺伝子L2の発現生成物に関する教示を他の該当遺
伝子の発現生成物に置き換えてもよい。配列L2の発現生
成物は、異なる型の乳頭腫ウイルスではなく対応する乳
頭腫ウイルスにより侵された生物採取物中で遺伝子L2の
発現生成物を認識し得る抗体をインビボで産生させるた
めに使用できるという点で特に有利であり、より特定的
には、該当する類の調製物が予め固定されている場合に
特に有利である。以下に述べる本発明の新規実施例は、
重度を推定し且つ採用すべき治療を選択するために、調
査された病変物中に存在している乳頭腫ウイルスの型を
決定することの可能な別個の手段を提供するものであ
る。遺伝子L2の各種の型の発現生成物に対して産生され
る抗体は、ハイブリダイゼーションプローブに関して先
に記載した混合物に対応する混合物に分類され得る。 従って本発明は、複数の異なる抗体を含んでおり且つ
新規に単離された乳頭腫ウイルスの検出、場合によって
は同定又は分類の連続試験を実施することが可能な容器
もしくは「キット」も提供する。例えば、本発明の容器
もしくはキットは、抗体又は異なる抗体の混合物から構
成される複数の試薬、例えば以下のように分類される乳
頭腫ウイルスの遺伝子L2の発現生成物に対して形成され
た抗体を夫々含む試薬から構成される。 １）少なくともHPV2d、 ２）HPV10b,28及び29の少なくとも１種、 ３）HPV17,24の少なくとも１種、 ４）HPV14,15,17,19,20,21,22,23及びIP24の少なくとも
１種、 ５）HPV15及び17の少なくとも１種、 ６）HPV24、 ７）HPV14,32及びIP4の少なくとも１種、 ８）HPV31、 ９）HPV32、 10）HPV16,18及びIP2の少なくとも１種。 尚、以上10群の抗体は、10群の各々が該群を構成して
いる抗体のただ１種に限定される限り、相互に異なるよ
うに選択される。 遺伝子L2の発現生成物（又は遺伝子L2の発現生成物の
免疫特性を変化させない追加ポリペプチド、特に安定化
ポリペプチドと融合されたこれらの発現生成物を含む組
換え体タンパク）に対して形成された抗体は、罹患した
被験者の体内の乳頭腫ウイルスにより誘導された病変部
に由来する組織病理切片中でウイルスを直接検出するた
めに使用可能である。有利には、検出は例えば前出のCA
RNOY溶媒もしくは混合物（L.LISONの著書“Histochimie
et cytochimie animales"にも記載されている）を使用
して、解離条件下で予め固定された調製物に対して実施
される。 場合によっては固定された抗L2抗体は、この抗体に対
して形成された別の抗体により認識され得、これらの別
の抗体は好ましくは非放射性の適当なマーカーを含んで
いる。これらのマーカーは例えば酵素又は蛍光性質を有
する。 本発明は当然のことながら、乳頭腫ウイルスの遺伝子
L2を発現させるポリペプチド自体にも係る。これらの発
現生成物は上記記載で既にL2タンパクと呼称している。
本発明は更に、このL2タンパクがL2タンパクの免疫特性
を本質的に変化させないような他のポリペプチド配列と
融合されているポリペプチドにも係る。これらの他のポ
リペプチドフラグメントの存在は、殊に遺伝子工学技術
を使用する操作によりこれらのハイブリッドポリペプチ
ドを得る場合、使用される該ハイブリッドポリペプチド
の製造方法に特に起因し得る。有利には、本発明はβ−
ガラクトシダーゼから誘導された配列を含むハイブリッ
ドポリペプチドに係る。このような生成物は、特にラク
トースオペロンの全部又は一部により修飾され且つ、所
定の型の乳頭腫ウイルスに由来する遺伝子L2から誘導さ
れたヌクレオチド配列をラクトースオペロンのプロモー
タ（又は例えばλファージのような適当な他の全プロモ
ータ）の下流に挿入させた適当なベクター（ファージ又
はプラスミド）で大腸菌を形質転換することにより得ら
れる。有利には、ラクトースオペロンのβ−ガラクトシ
ダーゼの遺伝子の少なくとも一部を含むこの型のプラス
ミド又はファージを使用する。 本発明は異なるポリペプチドの群にも係り、該ポリペ
プチドは常に上述のL2タンパクの一部のみに夫々対応す
るが、これらの各群のポリペプチドは該当する類のL2タ
ンパクの特徴的抗原部位を常に含んでいる。 本発明のポリペプチドは、精製した場合、該ポリペプ
チドに対応する抗体、特にこれらのポリペプチドにより
感作された動物の血清から得られた抗体の精製技術で使
用することができる。特に、これらのポリペプチドはア
フィニティカラムに固定することができる。抗体の精製
操作は、該ポリペプチドを含んでいるアフィニティカラ
ムに抗体を含んでいる血清を接触させることから成る。
これらのカラムに選択的に固定された抗体は、次に適当
なイオン強度を有する適当な緩衝液、例えば酢酸アンモ
ニウムのような塩溶液を使用する抗原−抗体複合体解離
により回収され得る。また酸性溶液を使用してもよい。 最後に、本発明はこれらの抗原（又は抗原群）及び抗
体（又は抗体群）を使用する組成物に係る。 特に、本発明は所与の型の疾患にしばしば存在すると
見なされる乳頭腫ウイルスの集合から誘導された抗体の
１種又は好ましくは「カクテル」を含む群に係る。該当
患者からの組織又は細胞採取物のインビトロ診断試験後
に所与の疾患は臨床診断されている筈であるし、あるい
はインビトロ診断の結果、感染乳頭腫ウイルスは上記集
合の乳頭腫ウイルスの１種に類似する型に属することが
判明している筈であるから、これらのカクテル（適当な
薬学的賦形剤と共にこれらの抗体又は抗体群、血清混合
物又は精製抗体組成物を含む）はこの場合、この疾患の
治療にあたり、患者に特に非経口経路で投与することに
より使用できる。従って、これらの血清は対応する型又
は亜型の乳頭腫ウイルスにより誘導される感染を退行さ
せ得る。 最後に本発明は、選択された投与方法、特に対応する
疾患に罹患している危険の高い人を保護するために使用
可能な非経口経路の投与方法に適合する薬学的に許容可
能な賦形剤と共に、１又は好ましくは数腫のL2タンパク
を含む対応するワクチン組成物に係る。 最後に、読者が明細書を十分に理解するのに有益と思
われる限りにおいて、従来技術の状態の説明を必要の範
囲内で補う参考文献の論文を参照されたい。従って、こ
れらの論文の内容は明細書の一部を形成するものとみな
されるべきである。 さて、所与の乳頭腫ウイルスの遺伝子L2の読み取り相
のフラグメントを利用するタンパクL2（又はこのタンパ
ク質のフラグメント）を産生させるために好適な方法
を、まず読み取り相のこれらのフラグメントを含むベク
ター構造に関して、次に大腸菌中のL2タンパク又はこの
ポリペプチドの発現を誘導し得る条件に関して説明しよ
う。また、タンパク又はこのポリペプチドの精製方法、
及びこれらのタンパク又はこのポリペプチドに対する抗
体を含む血清の製造における該精製方法の使用例につい
ても記載する。 当業者にとっては自明のことであるが、L2の読み取り
相の使用されるフラグメントは、使用されるベクターで
常に同相で融合させるべきであり、場合によっては安定
性を確保し且つこうして形成されるハイブリッドタンパ
ク質のその後の精製を容易にするタンパク質のコード化
遺伝子が使用される。 製造順序は添付した第11図に示してある。 材料及び方法 １）DNAの処理 DNAの組換え、プラスミドとDNAフラグメントとの形
成、新しい末端の形成、酵素Bal31による消化及び細胞
のトランスフェクションに関しては、Cold Spring Harb
or Labo−ratory,Cold Spring Harbor,NEW−YORK,U.S.
A.の著書“A Laboratory Manuel"の“Molecular clonin
g"の章に記載されているManiatis,T.他（1982）の方法
を適用した。 ２）細菌、プラスミド及びウイルス プラスミドDNAは、大腸菌（細胞C600）に含まれるpHP
VI.a（Danos他、1982及び1982年４月５日付仏国特許出
願第82 058 87号）、細胞RRI（queen,1983）に含有され
ていたpCQV2及び細胞MC1000（Casadaban,1983）に含有
されていたpMC1403から得た。 構成した遺伝子間プラスミド及びプラスミドpHPL2
を、大腸菌MM294の細胞に数回通し、プラスミドpHPL2−
β−ガラクトシダーゼはβ−ガラクトシダーゼを欠失す
る細胞MC1000に通した。ラクトースを含むMc Conkeyの
寒天培地（Silhavy他、1984,“Experiments with gene
fusions":Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring
Harbor,NEW−YORK）で、菌株Lac+を赤いコロニーの形
態で検出した。 次に、プロテアーゼを欠失する菌株lon-、CAG1139（G
ro−ssman他、1983,Cell32,151−159）に、プラスミドp
HPL2及びpHPL2−β−galをトランスフェクトした。 ３）殺菌溶解質の生成及び該溶解質のドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル分析（SDS−PAGE） 一晩培養後、pHPL2又はpHPL2−β−gal116を含む細胞
CAG1139をLB溶媒で５〜20倍に希釈した。次に光学密度O
D600が0.5〜0.9に達するまで細胞を30℃で培養した。 次に、細胞を90分間で41℃にすることによりλ−PRプ
ロモータを抑制解除した。培養物を再び遠心分離し、沈
降物を収集し、SDS2％、グリセロール26％、2Mの２−メ
ルカプトエタノール、及びブロモフェノールブルー0.03
％を含有する溶媒62mM Tris,pH6.8に懸濁させた。プラ
スミドを含んでいない細胞CAG1139の溶解質を対照とし
て使用した。 100℃で10分間処理後、Laemli（1970）,Nature,227,6
80−684の技術に従って、試料に対して10％のSDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を実施した。既知の分子量
を有する予め着色したBRLタンパクに対して同様に電気
泳動を実施した。 「アミドブラック」の呼称で知られている着色剤で着
色することにより、タンパク質のバンドを可視化させ、
ニトロセルロース膜に移して所謂「ウェスタンブロッ
ト」（ウェスタン転写）により分析した。 ４）分析 乳頭腫ウイルスのポリクローナル抗体（Orth他（197
8）,Virology91,243−255及び前出のRosetto他）と、Ra
ifortのペルオキシダーゼに結合された抗ラット及び抗
ウサギ免疫グロブリンIgGとを使用することにより、Ros
etto他（1984）J.Gen.Virol.65,1319−1324に記載され
ているように、「ウエスタンブロット」による分析を実
施した。 ５）抗体の分析 精製されたHPVl.aのウイルス粒子又は異なる型の乳頭
腫ウイルスにより誘導された病変の切片を使用すること
により、従来記載されている免疫拡散、免疫蛍光及び免
疫ペルオキシダーゼ法（Orth法、1984及びRosetto他、1
984）を使用した。 ６）融合タンパクL2−β−ガラクトシダーゼの精製 pHPL2−β−ガラクトシダーゼ116を含有するCAG1139
の培養物をLB溶媒で200倍に希釈し、D.O.600が0.32に達
するまで培養した。次に培養物を急速に41℃にし、高温
で90分間培養した。 細胞沈降物を溶媒Tris20mM,pH7.5,MgCl210mMに再懸濁
させ、超音波で細胞破壊処理した。 Ullmann（1984）.Gene29,27−31により記載されてい
るように、調製物に可溶性の融合タンパクを、ｐ−アミ
ノフェニル−β−Ｄ−チオガラクトシド（TPEG）−SEPH
AROSEカラムでアフィニティクロマトグラフィにより精
製した。 上記のように精製した融合タンパクを使用してHarley
雌ラットに免疫感作した。動物には、完全フロイントア
ジュバント（DIFCO）の存在下で２〜３週間の間隔で異
なる部位に約150μｇのタンパク質を３回皮下注射し
た。３回目の注射から１週間後に血清を採取した。 結果 大腸菌内にL2読み取り枠を発現することの可能なプラス
ミドの構造 構造は第１図に示した。L2読み取り枠をクローニング
して大腸菌内で発現させた。プラスミドpHPV1.aは、Dan
os他（EMBO J.l,p,231−236,1982）によりプラスミドpB
R322のBamH I部位でクローニングされたHPVl.aの完全な
ゲノムを含んでいる。ウイルスゲノムの後期領域から読
み取り枠を単離するために、プラスミドpBR322内でプラ
スミドpHPV1.aのフラグメントHind III−Hpa IIをサブ
クローニングした。得られたプラスミドをpHPL9とし
た。領域pBR322における非本質的なフラグメントBamH I
−pVu IIを除去することにより、このプラスミドを短縮
した。得られたプラスミドpHPL9.3から、５′末端の318
対を除く読み取り枠の1526塩基対（p.b.）を含むフラグ
メントXho II−Xmn Iを単離した。 L2読み取り枠の終止コドンを保存した。 得られたL2フラグメントを次に、非本質的なフラグメ
ントBamH I−Pvu IIの代わりにpCQV2発現ベクター（que
en1983）に挿入した。こうして、L2読み取り枠は、開始
ATGコドン及びλファージのcro遺伝子の配列SD（Shine
及びDargarno,Proc,Natl.Acad.Sci.USA71,p.1342−134
6,1974）に直接隣接しており、λPRプロモータの制御下
にある。プロモータは温度に敏感な抑制剤CI857により
調節されるので、L2の発現生成物の産生を制御すること
ができる。こうしてL2読み取り枠のＣ末端部の1206塩基
対がλファージのcroの開始ATGコドンと同相であるよう
なプラスミドpHPL2が得られた。解読相については、Bam
H I/Bgl IIの交差点における制限部位Xho IIの存在によ
り立証した。 大腸菌内で合成されたL2タンパクを安定化させ、該タ
ンパクを精製するのに好適な方法を提供する目的で、大
腸菌のβ−ガラクトシダーゼと融合したハイブリッドタ
ンパクと同様に該タンパクを発現させることに決定し
た。 このためには、BstE II部位でプラスミドpHPL2を直線
状にしてから酵素Bal31で消化させ、L2終始コドンを除
去した。 遺伝子L2と転写及び翻訳信号を供給する配列とを含む
このDNAを、Pst Iによる消化によって短縮し、フラグメ
ントPst I−Sma Iの代わりにプラスミドpMC1403（Casad
aban,Methods in enzymology 100,p.293−308,1983）に
挿入した。 PMC1403は、プロモータの含まないlacオペロンと、β
−ガラクトシダーゼの遺伝子の読み取り相の最初の22塩
基対とを含んでいる。組換え体を細胞MC1000,lac-にト
ランスフェクトした。クローン中で高温でβ−ガラクト
シダーゼを産生させると、L2とβ−ガラクトシダーゼと
が同相であるようなプラスミドpHPL2βgalを、Mc.Conde
yラクトース寒天培地（Silhavez他、Cold.Spring Harbo
r Laboratory,N.Y.1984）で選択することができた。 このような方法に従って選択されたクローンpHPL2,β
gal116を後で調査した。 DNAの配列（その結果についてはここでは示さない）
を検討した処、L2読み取り枠の最後の２個のＣ末端アミ
ノ酸のみがBal31による消化の過程で失われているこ
と、及びL2読み取り枠により発現される生成物はプロリ
ンを介してβ−ガラクトシダーゼの９番目のアミノ酸に
結合されていることがわかった。 pHPL2及びpHPL2βgal116でトランスフェクトした細胞に
よるHPVl.aと同種のタンパク質の産生 プラスミドpHPL2は、約51.2KdのL2タンパクをコード
し、及び約167Kdのハイブリッドタンパク質のpHPL−βg
alの容量を有している。 これらのプラスミドによるタンパク質の産生を検討す
るために、まずプロテアーゼを欠失する大腸菌CAG1139l
on-の菌株にこれらのプラスミドをトランスフェクトし
た。次に細胞を30℃、次に41℃で培養し、λPRプロモー
タの制御下でタンパク質の産生を誘導した。得られた細
菌溶解質に対して、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を実施した。 抗ウイルスHPVl.a抗体を使用して所謂「ウェスタンブ
ロット」法に従って分析した処、ウイルスHPVl.aと同種
のタンパク質が認識された。30℃にした培養物の分析結
果は、プラスミドを含むか又は含まない細胞については
同様であったが、41℃にした細胞の場合、トランスフェ
クトした細胞中にタンパク質の特異的バンドが示され、
組換え体pHPL2−βgal116でトランスフェクトした細胞
から単離されたタンパク質のうち、融合タンパクL2β−
ガラクトシダーゼ（L2−βgal）に対応する約136Kdの期
待分子量を有する主要なバンドと、恐らくタンパク分解
の結果であると考えられる約58Kdの分子量の数個の小さ
いバンドとが単離された。 構造pHPL2については、約72Kdのタンパク質のバンド
が見出された。この分子量は51.2Kdの予想分子量よりも
大きい。この差の意味については解明の余地がある。 次に、大腸菌中で産生されたタンパク質の抗原性を検
討するために、熱誘導培養株の細菌溶解質の生成物L2−
βgalをTREG−SEPHAROSEカラム（Ullman,Gene29,p.27−
31,1984）でアフィニティクロマトグラフィにより精製
した。カラムから溶離されたタンパク質をSDS−ポリア
クリルアミドゲルで分析した。「アミドブラック」で着
色した処、３個の主要なタンパク質のバンド、即ちL2−
βgalハイブリッドタンパクに対応すると思われる高分
子量バンドと、精製したβ−ガラクトシダーゼと共に移
動する第２のバンドと、約60Kdの分子量を有する第３の
バンドとが認められた。 分子量の小さいこのタンパク質は汚染物に対応し得
る。HPVl.a型の特異抗体を使用する「ウェスタンブロッ
ト」法による分析の結果、発現生成物L2−βgalに対応
する高分子量の主要なバンドと、数個の二次的なバンド
とが認められた（第3b図）。 生成物L2−βgalの免疫性 融合タンパクの免疫性を試験するために、２匹のラッ
トに溶離物を注射した。３回目の注射後に血清を収集し
た。得られた血清を、夫々プラスミドpHPL2−βgal116
又はプラスミドpHPL2を含む熱誘導培養株の細菌溶解質
中で「ウェスタンブロット」分析により、融合タンパク
L2−βgal又は生成物L2と同様に移動するバンドと反応
させた。 ２種類の型の細胞溶解質で、血清は対照溶解質CAG113
9にも見出されるタンパク質（約60及び55Kd）を認識し
た。これらのタンパク質の少なくとも一種は、融合タン
パクL2−βgal及びβガラクトシダーゼと同時に生成さ
れたタンパク質に対応するように思われる。 血清は、解離されたウイルス調製物HPVl.a（デタージ
ュント処理）及びHPVl.aにより誘導されたいぼの抽出物
中で、約80Kdのタンパク質を認識した。 免疫拡散試験において、得られたラット血清は抗原と
して使用された未処理のウイルス粒子HPVl.aを沈降させ
ず、従って、免疫トランスファー法で血清により認識さ
れるウイルス抗原はビリオンの表面では得られないこ
と、及び血清は沈降しないことが更に判明した。 ビリオン及びウイルスポリペプチドの天然高次構造を
保存するために知られている凍結いぼ切片HPVl.aでは、
L2の発現生成物から得た血清は反応しなかった。この結
果から、抗体は配座抗原に向けられていないことがわか
る。 血清は、BOUIN溶媒に固定されたHPVl.aに感染したい
ぼ切片とはほとんど反応しなかった（希釈度1/50）。こ
の結果から、ウイルスに感染しており且つBOUIN溶媒に
固定された切片でより強い抗原−抗体反応を生じる群の
抗原に対して該当型の抗原の特異的特徴が確認される。 一方、CARNOY溶媒により切片を観察した処、抗原型及
び抗原群のどちらも正の反応が認められた。特に、切片
が試験で使用された抗体の起源である抗原を提供したと
同一型のウイルスを含んでいた場合、ラットの血清は非
常に強い抗原−抗体反応（1/1000の希釈度）をもたらす
ことが確認された。これに対して、被調査血清を別の型
に属するウイルスを含む切片と接触させた場合、交差免
疫反応は何も認められなかった。 銘記すべき点として、抗原に予想される型は、２種の
異なる乳頭腫ウイルスのゲノムの相互ハイブリダイゼー
ション能力に関して上述したような型と常に一致してい
る必要はない。 乳頭腫ウイルスに存在する抗原として特に２種類、即
ち、 −完全ビリオンの注入後に得られる抗体を使用すること
により、各種の乳頭腫ウイルス間の交差抗原反応の不在
により特徴付けられる型の抗原、及び −本質的にビリオン中に遮蔽されており、解離されたウ
イルス粒子の注入後に抗体により露呈される類の抗原、 に区別される。 抗原−抗体反応試験で異なる型に属する乳頭腫ウイル
スは、好ましくは夫々の相同領域を欠くL2コード配列が
夫々の抗体で抗原−抗体交差反応を生じさせないポリペ
プチドをコードするような乳頭腫ウイルスである。 好適な型の抗原は、特に該当するL2領域の長さの1/4
にわたってＮ末端領域を欠く遺伝子L2の読み取り枠によ
りコードされた抗原である。 最後に本発明は、異なる型に属するウイルス中で、交
差反応を生じないL2領域によりコードされたポリペプチ
ドの型を求めるために実施される試験にも係る。これら
のポリペプチドは、Carnoy溶媒に固定された組織又は細
胞切片に含まれるウイルスと効果的に反応する抗体を含
むが、Bouin溶媒により固定されている同一切片とは不
十分にしか反応しないかあるいは全く反応しないような
ポリペプチドとして規定され得る。 本発明は更に、既知の乳頭腫ウイルスに対して新規乳
頭腫ウイルスを分類する方法にも係る。この方法は、明
細書の一部をも構成する請求の範囲第８項に規定されて
いる。 更に、本発明は場合によっては患者の体内に存在して
いる感染ウイルスの型の同定を含む診断方法にも係り、
該方法は、異なる型に属するウイルスに対して予め得ら
れた抗原を、試験すべき患者からの生物採取物、特に血
清と反応させることから成る。 血清採取物とこの同一型に属する乳頭腫ウイルスから
の抗原との間に抗原−抗体反応が観察されるなら、感染
ウイルスは所定の型に属するものと見なされる。この診
断試験は、例えばELISA法を使用することにより実施さ
れ得る。 より特定的には、本発明は組織又は流体のようなヒト
生物試料、例えば血清中の感染乳頭腫ウイルスが所与の
型の乳頭腫ウイルスに属するか否かを検出する方法に係
る。この方法は、この生物試料を、この型に属するウイ
ルスのゲノムの領域L2の少なくとも一部を含むDNAの発
現生成物に対して予め形成された抗体と接触させること
を特徴とし、この接触は免疫反応を可能にする条件下及
び時間内で実施される。抗原−抗体複合体の形成が検出
されると、上記発現生成物の起源である型と同一又は同
種の型を有する乳頭腫ウイルスの存在が証明される。 好ましくは、L2領域又は対応部分を含むDNAを、殺菌
例えば大腸菌のようなコンピテント細胞宿主内でクロー
ニングした。 有利には、使用されるL2領域部分は型の非特徴的Ｎ末
端領域を欠失している遺伝子L2の読み取り枠に対応す
る。好ましくは、このＮ末端領域はこの読み取り枠の４
分の１に対応する。 より特定的には、本発明は上記L2領域部分（又はL2領
域全体）を含むDNAが選択されたコンピテント細胞宿主
内で通常発現可能なタンパク質をコードする核酸から形
成されたハイブリッドDNAであり、上記L2領域が特にイ
ンビトロ再結合により予め取り込まれているようなこの
型の検出方法に係る。 例えば細胞宿主内で通常発現可能なタンパク質は、こ
の細胞宿主が大腸菌であるとき、β−ガラクトシダーゼ
の全部又は一部に対応する。 本発明の検出方法は、好ましくCarnoy溶媒中あるいは
血清に直接固定されたあらゆる組織切片に適用可能であ
る。 本発明の方法は生物試料を、同一型又は同種の型の数
個のウイルス、DNAプローブに対して上述の方法で再編
成されたウイルスに由来するL2領域の発現生成物、又は
夫々の対応する部分に対して予め形成された抗体の「カ
クテル」と、上記条件で接触させることも含む。 これらの抗体の「カクテル」を使用すると、DNAプロ
ーブに関して使用したと同様の条件下で、検出された乳
頭腫ウイルスの所与の種類への帰属と、患者が罹患して
いるか又は潜在的に危険のある病気とを相関させること
ができる。 最後に本発明は、上記ハイブリッドポリペプチド及び
対応する抗体の各々の製造方法にも係る。 この方法は、 −該当する乳頭腫ウイルスのゲノムのL2領域又は適当な
ベクター内の対応する領域部分の、特にインビトロの取
り込み、 −こうして修飾されたベクターで受容可能な細胞宿主、
即ち上記L2領域又は対応する部分を発現し得る宿主の形
質転換、及び −L2領域又は対応部分の発現の結果として形成されるポ
リペプチドの回収、及び好ましくは分離、 から成り、このポリペプチドは上記条件下で乳頭腫ウイ
ルスのタンパク質を検出することの可能な抗体をインビ
ボで産生させることが可能である。 本発明は更に、動物、例えばウサギを上記ポリペプチ
ドで感作し、形成された抗体を回収することを特徴とす
る抗体の産生方法にも係る。 最後に本発明は、各乳頭腫ウイルスが属することが確
認され得る各型に従って該乳頭腫ウイルスから得られる
ハイブリッドペプチド又は抗体の再編成を包含すること
もある。 参考文献 （１） Derst,M.他、1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
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2. （23） Sutcliffe,J.G.,1978,Nucleic Acids Res.５,2
721−2728. （24） Tsumori,T.他、1983,J.Gen.Virol.64,967−96
9.
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｐ 21/00
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 クロワッサン，オデール
フランス国、75013・パリ、リユ・ア
ー・ランソン、19
(72)発明者 ブレブュール，フランソワーズ
フランス国、75015・パリ、リユ・モリ
トール、36
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．以下の群の乳頭腫ウイルス 群（１）ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）2d 群（２）HPV10b,HPV28,HPV29 群（３）HPV17,HPV24 群（４）HPV14,HPV15,HPV17,HPV19,HPV20,HPV21,HPV22,
HPV23,HPVIP4 群（５）HPV15,HPV17 群（６）HPV24 群（７）HPV14,HPV32,HPVIP4 群（８）HPV31 群（９）HPV32 群（10）HPV16,HPV18,HPVIP2、 に含まれる少なくとも１つの群の乳頭腫ウイルス由来の
E6、E7又はL2遺伝子の全体もしくは一部断片の発現産物
であるポリペプチドの少なくとも一つを含む組成物で、
但し、組成物が対応する各群の唯一の乳頭腫ウイルスか
らのポリペプチドに限定される限り、上記群のポリペプ
チドは互いに異なるものとする、乳頭腫ウイルス感染を
検出又は治療するための組成物。 ２．薬剤的に許容され得る賦形剤を更に含む請求の範囲
第１項に記載の組成物。 ３．ワクチンとして使用するためのものである請求の範
囲第１項又は第２項に記載の組成物。 ４．免疫原として使用するためのものである請求の範囲
第１項又は第２項に記載の組成物。
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