JPH10114677A - 乳頭腫ウイルス蛋白質に対する抗体を含む医薬組成物 - Google Patents
乳頭腫ウイルス蛋白質に対する抗体を含む医薬組成物Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 乳頭腫ウイルス感染の治療用医薬組成物を提
供する。 【解決手段】 過酷条件下で相互に５０％未満の交差ハ
イブリダイゼーションを示す１種又は複数種の乳頭腫ウ
イルスのＤＮＡ配列によってコードされるＥ６、Ｅ７及
び／又はＬ２蛋白質に特徴的な部位に対する少なくとも
一つの精製単離抗体を含有する抗体又は抗体混合物を、
許容できる医薬賦形剤と組合せて含む、所定の病気の状
態の発症の原因である乳頭腫ウイルス感染の治療用医薬
組成物。
供する。 【解決手段】 過酷条件下で相互に５０％未満の交差ハ
イブリダイゼーションを示す１種又は複数種の乳頭腫ウ
イルスのＤＮＡ配列によってコードされるＥ６、Ｅ７及
び／又はＬ２蛋白質に特徴的な部位に対する少なくとも
一つの精製単離抗体を含有する抗体又は抗体混合物を、
許容できる医薬賦形剤と組合せて含む、所定の病気の状
態の発症の原因である乳頭腫ウイルス感染の治療用医薬
組成物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は乳頭腫ウイルス蛋白
質に対する抗体を含む乳頭腫ウイルス感染の治療用医薬
組成物に係る。
質に対する抗体を含む乳頭腫ウイルス感染の治療用医薬
組成物に係る。
【０００２】「乳頭腫ウイルス」なる用語は、一般に比較
的良性の皮膚又は粘膜のいぼから、上皮内新形成及び皮
膚癌に変質し得る過形成までの各段階に存在する数種類
の形態のウイルス性感染の原因であると共通に認識され
ている多数のウイルスを包含する。乳頭腫ウイルス感染
のうち、より特定的にはいぼ状表皮異形成が特筆され、
これを以下の文中ではしばしばEVとして表す。
的良性の皮膚又は粘膜のいぼから、上皮内新形成及び皮
膚癌に変質し得る過形成までの各段階に存在する数種類
の形態のウイルス性感染の原因であると共通に認識され
ている多数のウイルスを包含する。乳頭腫ウイルス感染
のうち、より特定的にはいぼ状表皮異形成が特筆され、
これを以下の文中ではしばしばEVとして表す。
【０００３】所定数の型の乳頭腫ウイルスが文献中に既
に記載されている。本特許出願の範囲では、いぼ又は散
在斑性病変から単離され、多数の罹患患者で皮膚癌を早
発させ得る多数の型及び亜型の新規乳頭腫ウイルスにつ
いて記載する。
に記載されている。本特許出願の範囲では、いぼ又は散
在斑性病変から単離され、多数の罹患患者で皮膚癌を早
発させ得る多数の型及び亜型の新規乳頭腫ウイルスにつ
いて記載する。
【０００４】最近の研究の結果、各種の型のヒト乳頭腫
ウイルス(HPV)について多数の免疫因子及び主要な役割
が明らかになっており、乳頭腫ウイルス感染の病原性に
おける各種の遺伝的因子及び化学作用放射線の役割につ
いて文献中に既に記載されている。
ウイルス(HPV)について多数の免疫因子及び主要な役割
が明らかになっており、乳頭腫ウイルス感染の病原性に
おける各種の遺伝的因子及び化学作用放射線の役割につ
いて文献中に既に記載されている。
【０００５】本発明は、以下に規定するような本質的ゲ
ノム特徴を有する新規に単離された多数の乳頭腫ウイル
スの相対的挙動に関して為し得た研究に基づいている。
ノム特徴を有する新規に単離された多数の乳頭腫ウイル
スの相対的挙動に関して為し得た研究に基づいている。
【０００６】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】少数
のEVの例については既に研究されており、ゲノムの分子
クローニングにより既に6種類の型のHPVが特徴付けられ
ている(KREMSDORF, D. 他、1982, J.Virol. 43:436-447
及びKREMSDORF他、1983, J.Virol. 48:340-351)。これ
らのHPVは、異なる群に属するゲノム間に交差ハイブリ
ダイゼーションが形成されないかあるいは非常に弱い交
差ハイブリダイゼーションが形成されるかに従って3群
に分類されている。第１の群は、所定数のEV罹患患者及
び一般集団に観察される扁平いぼに関連するHPV3a及び1
0から成り、HPV3aのDNA配列に属するDNA配列はEV罹患患
者の癌に見出だされた。第２の群は、HPV5、8及び12を
含んでおり、HPV5及び8のゲノムはEV罹患患者の癌に検出
された。第３の群は、今日までの処ではただ一種類のウ
イルスHPV9から構成されている。免疫抑制した腎同種移
植片を移植されており、HPV5に感染していることが明白
であった者を除き、第２及び第３群のウイルスはEV罹患
患者にしか検出されておらず、これらの患者の大部分は
数種類のウイルスに感染していた。ここで留意すべき点
として、文献(追って示す参考文献1-5,8,9,13,14,16,18
-20)に実際に挙げられている14種類の型のHPVのうち4種
類の型は、稀な症例であるEVに特異的に関連付けられる
ことが分かった。
のEVの例については既に研究されており、ゲノムの分子
クローニングにより既に6種類の型のHPVが特徴付けられ
ている(KREMSDORF, D. 他、1982, J.Virol. 43:436-447
及びKREMSDORF他、1983, J.Virol. 48:340-351)。これ
らのHPVは、異なる群に属するゲノム間に交差ハイブリ
ダイゼーションが形成されないかあるいは非常に弱い交
差ハイブリダイゼーションが形成されるかに従って3群
に分類されている。第１の群は、所定数のEV罹患患者及
び一般集団に観察される扁平いぼに関連するHPV3a及び1
0から成り、HPV3aのDNA配列に属するDNA配列はEV罹患患
者の癌に見出だされた。第２の群は、HPV5、8及び12を
含んでおり、HPV5及び8のゲノムはEV罹患患者の癌に検出
された。第３の群は、今日までの処ではただ一種類のウ
イルスHPV9から構成されている。免疫抑制した腎同種移
植片を移植されており、HPV5に感染していることが明白
であった者を除き、第２及び第３群のウイルスはEV罹患
患者にしか検出されておらず、これらの患者の大部分は
数種類のウイルスに感染していた。ここで留意すべき点
として、文献(追って示す参考文献1-5,8,9,13,14,16,18
-20)に実際に挙げられている14種類の型のHPVのうち4種
類の型は、稀な症例であるEVに特異的に関連付けられる
ことが分かった。
【０００７】本発明に至る研究により、多数の新規型及
び亜型の乳頭腫ウイルスを単離することができたので、
より高度なインビトロ診断法が予想できる。より特定的
には本発明は、例えば病変部又は生検切片から得られた
乳頭腫の改良された同定方法を提供するものであり、よ
り正確な診断を実現することができ、従って、該当病変
に予想される進行に関して改良された予後診断を下すこ
とができる。
び亜型の乳頭腫ウイルスを単離することができたので、
より高度なインビトロ診断法が予想できる。より特定的
には本発明は、例えば病変部又は生検切片から得られた
乳頭腫の改良された同定方法を提供するものであり、よ
り正確な診断を実現することができ、従って、該当病変
に予想される進行に関して改良された予後診断を下すこ
とができる。
【０００８】一般に、乳頭腫ウイルスは非常に多くの種
類があるが、7000〜8000のオーダの塩基対の寸法を有し
ていることが注目される。一方、該ウイルスのゲノムは
ある程度の相同性を有し得る。以下の記載では、種々の
型及び亜型の乳頭腫ウイルス間の相同百分率を数的に表
現するが、この相同百分率は所謂非厳酷もしくは非過酷
条件下、又は厳酷もしくは過酷条件下で実施されたハイ
ブリダイゼーション試験の結果として得られた値であ
る。
類があるが、7000〜8000のオーダの塩基対の寸法を有し
ていることが注目される。一方、該ウイルスのゲノムは
ある程度の相同性を有し得る。以下の記載では、種々の
型及び亜型の乳頭腫ウイルス間の相同百分率を数的に表
現するが、この相同百分率は所謂非厳酷もしくは非過酷
条件下、又は厳酷もしくは過酷条件下で実施されたハイ
ブリダイゼーション試験の結果として得られた値であ
る。
【０００９】乳頭腫ウイルスのうち、過酷もしくは厳酷
条件下で測定された相同百分率により特徴付けられる数
種類の型の乳頭腫ウイルスについて考察しよう。このよ
うな条件下で50％未満の相同百分率を有するす乳頭腫ウ
イルスは、異なる型に属するといえよう。このため、異
なる型のウイルス間の相同百分率は過酷もしくは厳酷条
件下ではゼロとさえなることが銘記されよう。この過酷
もしくは厳酷条件で50％を越える相同百分率が観察され
るようなウイルスは、同一型に属すると見なされ、この
同一型のうちで異なる亜型を形成すると見なされる。
条件下で測定された相同百分率により特徴付けられる数
種類の型の乳頭腫ウイルスについて考察しよう。このよ
うな条件下で50％未満の相同百分率を有するす乳頭腫ウ
イルスは、異なる型に属するといえよう。このため、異
なる型のウイルス間の相同百分率は過酷もしくは厳酷条
件下ではゼロとさえなることが銘記されよう。この過酷
もしくは厳酷条件で50％を越える相同百分率が観察され
るようなウイルスは、同一型に属すると見なされ、この
同一型のうちで異なる亜型を形成すると見なされる。
【００１０】非過酷もしくは非厳酷条件のハイブリダイ
ゼーション試験では、HEILMAN C.A.他、1980, J. Viro
l., 36,395-407及びCROISSANT他、1982, C.R.Acad. Sc.
Paris, 294,581-586に記載されている条件下でウイル
スの2つの単離体から得られたDNA(ヘテロ二重鎖分子)を
相互に接触させる。
ゼーション試験では、HEILMAN C.A.他、1980, J. Viro
l., 36,395-407及びCROISSANT他、1982, C.R.Acad. Sc.
Paris, 294,581-586に記載されている条件下でウイル
スの2つの単離体から得られたDNA(ヘテロ二重鎖分子)を
相互に接触させる。
【００１１】過酷もしくは厳酷条件のハイブリダイゼー
ション試験では、KREMSDORF,D.他((1982), J. Virol. 4
3:436-447及び1983, J. Virol. 48:340-351)及びDAVIS
R.W.他、1971, Methods Enzymol., 21, 413-428により
記載されている条件下でウイルスの2つの単離体から得
られたDNA(ヘテロ二重鎖分子)を相互に接触させる。
ション試験では、KREMSDORF,D.他((1982), J. Virol. 4
3:436-447及び1983, J. Virol. 48:340-351)及びDAVIS
R.W.他、1971, Methods Enzymol., 21, 413-428により
記載されている条件下でウイルスの2つの単離体から得
られたDNA(ヘテロ二重鎖分子)を相互に接触させる。
【００１２】概して、同一型に属する乳頭腫ウイルスは
夫々の長さの全体の80〜100％にわたってほぼ等しいヌ
クレオチド配列を有するハイブリダイズ可能な配列を有
しており、これらの相同配列は異なる型の乳頭腫ウイル
スでは60％、即ち同一型の場合よりも少なくなることが
注目されよう。非過酷もしくは非厳酷条件下で相互にハ
イブリッド形成する異なる型の乳頭腫ウイルスの配列の
同一もしくは相同度は、同一型に属する乳頭腫ウイルス
の場合よりも明らかに小さい。
夫々の長さの全体の80〜100％にわたってほぼ等しいヌ
クレオチド配列を有するハイブリダイズ可能な配列を有
しており、これらの相同配列は異なる型の乳頭腫ウイル
スでは60％、即ち同一型の場合よりも少なくなることが
注目されよう。非過酷もしくは非厳酷条件下で相互にハ
イブリッド形成する異なる型の乳頭腫ウイルスの配列の
同一もしくは相同度は、同一型に属する乳頭腫ウイルス
の場合よりも明らかに小さい。
【００１３】本発明者らが研究を進めた結果、各種の型
の乳頭腫ウイルス間の遺伝子異質度は従来予想されてい
たよりも大きいこと、同時に各種の型は所定の特異度を
有する感染形又は感染変異体にしばしば関連しているこ
とがわかった。
の乳頭腫ウイルス間の遺伝子異質度は従来予想されてい
たよりも大きいこと、同時に各種の型は所定の特異度を
有する感染形又は感染変異体にしばしば関連しているこ
とがわかった。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、過酷条件下で
相互に５０％未満の交差ハイブリダイゼーションを示す
１種又は複数種の乳頭腫ウイルスのＤＮＡ配列によって
コードされるＥ６、Ｅ７及び／又はＬ２蛋白質に特徴的
な部位に対する少なくとも一つの精製単離抗体を含有す
る抗体又は抗体混合物を、許容できる医薬賦形剤と組合
せて含む、所定の病気の状態の発症の原因である乳頭腫
ウイルス感染の治療用医薬組成物を提供する。
相互に５０％未満の交差ハイブリダイゼーションを示す
１種又は複数種の乳頭腫ウイルスのＤＮＡ配列によって
コードされるＥ６、Ｅ７及び／又はＬ２蛋白質に特徴的
な部位に対する少なくとも一つの精製単離抗体を含有す
る抗体又は抗体混合物を、許容できる医薬賦形剤と組合
せて含む、所定の病気の状態の発症の原因である乳頭腫
ウイルス感染の治療用医薬組成物を提供する。
【００１５】本発明はまた、予め単離された各種の新規
乳頭腫ウイルスから単離され得るDNA及びこれらのDNAの
全部又は一部から構成され得るプローブに係るのみなら
ず、種々の種類の感染、即ち所定の乳頭腫ウイルスを発
見された患者の危険の程度を診断するためにより効果的
に使用され得る型の乳頭腫ウイルスの混合物即ち、「カ
クテル」にも係る。本明細書に記載されている乳頭腫ウ
イルスプローブの個数、場合によっては予め既に単離さ
れている乳頭腫ウイルスのゲノムDNAから単離されたプ
ローブ及び所定の混合物に含まれるその配合物を加えた
数は、より高度な診断を可能にし、特に、各種の型の乳
頭腫ウイルスに起因するか又はこれらの型の影響下で発
生し得る各種の種類の感染をより十分に識別でき、所定
のある種の感染では、これらの感染が憂慮すべき病気に
変質する危険度をより十分に予後診断することが可能で
ある。例えば本発明の目的は、いぼ状表皮異形成により
現わる感染の場合、これらの感染が皮膚癌に進行する危
険度をより十分に予想することが可能な手段を提供する
ことにある。
乳頭腫ウイルスから単離され得るDNA及びこれらのDNAの
全部又は一部から構成され得るプローブに係るのみなら
ず、種々の種類の感染、即ち所定の乳頭腫ウイルスを発
見された患者の危険の程度を診断するためにより効果的
に使用され得る型の乳頭腫ウイルスの混合物即ち、「カ
クテル」にも係る。本明細書に記載されている乳頭腫ウ
イルスプローブの個数、場合によっては予め既に単離さ
れている乳頭腫ウイルスのゲノムDNAから単離されたプ
ローブ及び所定の混合物に含まれるその配合物を加えた
数は、より高度な診断を可能にし、特に、各種の型の乳
頭腫ウイルスに起因するか又はこれらの型の影響下で発
生し得る各種の種類の感染をより十分に識別でき、所定
のある種の感染では、これらの感染が憂慮すべき病気に
変質する危険度をより十分に予後診断することが可能で
ある。例えば本発明の目的は、いぼ状表皮異形成により
現わる感染の場合、これらの感染が皮膚癌に進行する危
険度をより十分に予想することが可能な手段を提供する
ことにある。
【００１６】一般に、以下の説明を簡単にするために、
乳頭腫ウイルスの完全ゲノムは略称HPV-DNAで表す。
乳頭腫ウイルスの完全ゲノムは略称HPV-DNAで表す。
【００１７】同様に解り易くするために、以下の説明は
既知の乳頭腫HPV-DNAを含むHPV-DNAの物理的制限地図か
ら成る添付図面を参考にしている。
既知の乳頭腫HPV-DNAを含むHPV-DNAの物理的制限地図か
ら成る添付図面を参考にしている。
【００１８】物理的地図は、各種の制限エンドヌクレア
ーゼによる切断部位の位置を示している。地図の原点は
一般に単一の切断部位から構成されている。原点までの
距離は、ゲノムの長さの百分率で表してある。地図の1
単位はゲノムの長さの1％を表す。
ーゼによる切断部位の位置を示している。地図の原点は
一般に単一の切断部位から構成されている。原点までの
距離は、ゲノムの長さの百分率で表してある。地図の1
単位はゲノムの長さの1％を表す。
【００１９】本発明はまず第一に、より特定的には7000
〜8000塩基対の間の寸法を有しており、図面に示したよ
うな制限地図により特徴付けられるDNAの集合から選択
されたHPV-DNAの各々に係り、これらの図面はより特定
的には、乳頭腫ウイルスから得られ、指称HPV-2d、HPV-
10b、HPV-14a、HPV-14b、HPV-15HPV-17a、HPV-17b、HPV
-19、HPV-20、HPV-21、HPV-22、HPV-23、HPV-24、HPV-2
8、HPV-29、HPV-31及びHPV-32、HPV-IP2及びHPV-IP4に
相当するHPV-DNAに関するものである。
〜8000塩基対の間の寸法を有しており、図面に示したよ
うな制限地図により特徴付けられるDNAの集合から選択
されたHPV-DNAの各々に係り、これらの図面はより特定
的には、乳頭腫ウイルスから得られ、指称HPV-2d、HPV-
10b、HPV-14a、HPV-14b、HPV-15HPV-17a、HPV-17b、HPV
-19、HPV-20、HPV-21、HPV-22、HPV-23、HPV-24、HPV-2
8、HPV-29、HPV-31及びHPV-32、HPV-IP2及びHPV-IP4に
相当するHPV-DNAに関するものである。
【００２０】当然のことながら、本発明は上記に列挙し
たと同一型に属するとみなされ得るHPV-DNAに対する効
果にも及ぶ。
たと同一型に属するとみなされ得るHPV-DNAに対する効
果にも及ぶ。
【００２１】新規に特徴付けられたウイルスのHPV-DNA
に対応する物理的地図は、黒円で示してある。
に対応する物理的地図は、黒円で示してある。
【００２２】本発明はまた、上記HPV-DNAのフラグメン
ト又は特に過酷条件下でこれらのHPV-DNAとハイブリダ
イズ可能なフラグメントにも係る。更に本発明は、上記
HPV-DNAの各々の全部又は一部を含む組換え体DNA、より
特定的には夫々遺伝子E1、E6-E7、L1及びL2に対応する
フラグメントあるいは上記HPV-DNAの遺伝子間領域に対
応する配列を含むDNAに係る。更に本発明は、これらのH
PV-DNAから又は対応するフラグメントから構成され得る
プローブ及び該プローブをインビトロで使用する診断法
に係る。
ト又は特に過酷条件下でこれらのHPV-DNAとハイブリダ
イズ可能なフラグメントにも係る。更に本発明は、上記
HPV-DNAの各々の全部又は一部を含む組換え体DNA、より
特定的には夫々遺伝子E1、E6-E7、L1及びL2に対応する
フラグメントあるいは上記HPV-DNAの遺伝子間領域に対
応する配列を含むDNAに係る。更に本発明は、これらのH
PV-DNAから又は対応するフラグメントから構成され得る
プローブ及び該プローブをインビトロで使用する診断法
に係る。
【００２３】
【発明の実施の形態】ウイルスDNA調製物は、EVに罹患
した6人のヨーロッパ人患者とEVに罹患した２人の南米
人患者の良性病変の掻去物から選択的に抽出した（ＬＵ
ＴＺＮＥＲ，Ｍ．Ａ．他、1983, Lancet ii:422-424)。
HPVのDNAは、塩化セシウム勾配中で平衡遠心分離によ
り、及び／又は従来記載されている操作方法(前出のKRE
MSDORF, D.他の論文及びORTH, G.他、1980, Cold Sprin
g Harbor Conf. Cell Proliferation 7:259-282)に従っ
て臭化エチジウムの存在下でショ糖勾配中で沈降させる
ことにより精製した。DNA調製物を制限エンドヌクレア
ーゼで処理し、消化物をアガロースゲルで電気泳動によ
り分離した(前出のKREMSDORF他の論文)。患者の1人の尋
常性いぼにはHPV5、8及び12(前出のKREMSDORF他の論文)
及びHPV2(HEILMAN, C.A.他、1980,J.Virol 36:395-407
及びORTH,G．他、1980,Cold Spring Harbor Conf. Cell
Pro-liferation 7: 259-282)が検出されたが、これ以
外にDNA制限酵素による主要切断モデルを提供する菌株
として、従来特徴付けられている型とは異なる11個の菌
株が同定された。同定の年代順(COGGIN, J.R.他、Cance
r Res. 39:545-546)に従って新規HPV型に番号を付け、
亜型には番号と文字とを付した。11種の新規HPVのゲノ
ムを、大腸菌K12株C600でクローニングした(前出ののKR
EMSDORF,D.他の論文(1983))。エンドヌクレアーゼBamHI
により形成されたHPV24のDNAの2つのフラグメントを除
き、DNAを単位長さの分子として挿入した。DNAは、Ava
I、BamHI及びHind IIIの単一切断部位を使用することに
よりプラスミドpBR322(SUT-CLIFFE, J.G., 1978, Nucle
ic Acids Res. 5:2721-2728)に挿入するか、又はHPV5の
DNAのフラグメントHindIIIBを組み込んでおり、単一Sac
I部位を含む組換え体プラスミドに挿入した。より特定
的には、HPVのDNAとHPV5のDNAのフラグメントHindIIIB
を含む組換え体プラスミドpBR322とをただ一箇所でしか
切断しない酵素(SacI)で切断後、単位長さのDNA分子と
してHPV17b及び22を挿入した。HPV14aのDNAは、ゲノム
の長さの96.1及び3.9％の2つのフラグメントを形成する
酵素であるHindIIIでウイルスDNA調製物を不完全に消化
後、単位長さのDNA分子としてプラスミドpBR322に挿入
した。(ゲノムの長さの夫々83.1及び16.9％に対応する
寸法を有する)HPV24のフラグメントBamHIA及びBは、プ
ラスミドpBR322に別々に挿入した。
した6人のヨーロッパ人患者とEVに罹患した２人の南米
人患者の良性病変の掻去物から選択的に抽出した（ＬＵ
ＴＺＮＥＲ，Ｍ．Ａ．他、1983, Lancet ii:422-424)。
HPVのDNAは、塩化セシウム勾配中で平衡遠心分離によ
り、及び／又は従来記載されている操作方法(前出のKRE
MSDORF, D.他の論文及びORTH, G.他、1980, Cold Sprin
g Harbor Conf. Cell Proliferation 7:259-282)に従っ
て臭化エチジウムの存在下でショ糖勾配中で沈降させる
ことにより精製した。DNA調製物を制限エンドヌクレア
ーゼで処理し、消化物をアガロースゲルで電気泳動によ
り分離した(前出のKREMSDORF他の論文)。患者の1人の尋
常性いぼにはHPV5、8及び12(前出のKREMSDORF他の論文)
及びHPV2(HEILMAN, C.A.他、1980,J.Virol 36:395-407
及びORTH,G．他、1980,Cold Spring Harbor Conf. Cell
Pro-liferation 7: 259-282)が検出されたが、これ以
外にDNA制限酵素による主要切断モデルを提供する菌株
として、従来特徴付けられている型とは異なる11個の菌
株が同定された。同定の年代順(COGGIN, J.R.他、Cance
r Res. 39:545-546)に従って新規HPV型に番号を付け、
亜型には番号と文字とを付した。11種の新規HPVのゲノ
ムを、大腸菌K12株C600でクローニングした(前出ののKR
EMSDORF,D.他の論文(1983))。エンドヌクレアーゼBamHI
により形成されたHPV24のDNAの2つのフラグメントを除
き、DNAを単位長さの分子として挿入した。DNAは、Ava
I、BamHI及びHind IIIの単一切断部位を使用することに
よりプラスミドpBR322(SUT-CLIFFE, J.G., 1978, Nucle
ic Acids Res. 5:2721-2728)に挿入するか、又はHPV5の
DNAのフラグメントHindIIIBを組み込んでおり、単一Sac
I部位を含む組換え体プラスミドに挿入した。より特定
的には、HPVのDNAとHPV5のDNAのフラグメントHindIIIB
を含む組換え体プラスミドpBR322とをただ一箇所でしか
切断しない酵素(SacI)で切断後、単位長さのDNA分子と
してHPV17b及び22を挿入した。HPV14aのDNAは、ゲノム
の長さの96.1及び3.9％の2つのフラグメントを形成する
酵素であるHindIIIでウイルスDNA調製物を不完全に消化
後、単位長さのDNA分子としてプラスミドpBR322に挿入
した。(ゲノムの長さの夫々83.1及び16.9％に対応する
寸法を有する)HPV24のフラグメントBamHIA及びBは、プ
ラスミドpBR322に別々に挿入した。
【００２４】単離したクローン及び対応するHPVのソー
スを下記第Ｉ表に示す。
スを下記第Ｉ表に示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】組換え体プラスミドを認識するために、プ
ラスミドにウイルス配列を挿入するために使用したエン
ドヌクレアーゼを含む2種の制限エンドヌクレアーゼの
混合物で処理後、組換え体DNAと非クローン化HPVのDNAと
の消化物について電気泳動による移動度を比較した。単
離されたフラグメントの個数及び寸法を検討した処、い
ずれの場合もこれらの完全なウイルスゲノムが組み込ま
れていることがわかった。プラスミド配列からクローニ
ングされないもしくは切り出されないHPVのDNAをアガロ
ースゲルで電気泳動により分析した処、DNAの寸法は異
なっていることが観察された(データは示さず)。HPV14
b、19、20及び21のDNAは、HPV3a、5、8及び12の寸法(約
7700ヌクレオチド対)(前出のKREMSDORF,D.の論文)に類
似する寸法を有しており、HPV15、17a、17b、22及び23
のDNAの寸法はHPV9の寸法(約7200ヌクレオチド対)(前出
のKREMSDORF,D.,1982及びORTH, G., 1980の論文)とそれ
程は類似していなかった。
ラスミドにウイルス配列を挿入するために使用したエン
ドヌクレアーゼを含む2種の制限エンドヌクレアーゼの
混合物で処理後、組換え体DNAと非クローン化HPVのDNAと
の消化物について電気泳動による移動度を比較した。単
離されたフラグメントの個数及び寸法を検討した処、い
ずれの場合もこれらの完全なウイルスゲノムが組み込ま
れていることがわかった。プラスミド配列からクローニ
ングされないもしくは切り出されないHPVのDNAをアガロ
ースゲルで電気泳動により分析した処、DNAの寸法は異
なっていることが観察された(データは示さず)。HPV14
b、19、20及び21のDNAは、HPV3a、5、8及び12の寸法(約
7700ヌクレオチド対)(前出のKREMSDORF,D.の論文)に類
似する寸法を有しており、HPV15、17a、17b、22及び23
のDNAの寸法はHPV9の寸法(約7200ヌクレオチド対)(前出
のKREMSDORF,D.,1982及びORTH, G., 1980の論文)とそれ
程は類似していなかった。
【００２７】14種の制限エンドヌクレアーゼに対するク
ローン化ウイルスゲノムの反応性を分析し、物理的地図
(図１〜図10)を作成した。後述するモチーフに関する所
定の図面では、所定のHPV-DNAの制限地図を反復した。
従来記載されている方法(9)に従って22〜33の切断部位
を位置付けした。HPV14a及び14b(図4a及び図4b)並びにH
PV17a及び17b(図５)を除いて、これらの地図の間に明白
な相同性は検出されなかった。HPV14aのDNAの2つのBamH
I切断部位の一方がHPV14bのDNAの単一BamHＩ切断部位と
整合している場合、夫々HPV14a及び14b,15に位置付けさ
れた21〜31の部位は共通であることが判明した。同様
に、単一BamHＩ切断部位が相互に整合している場合、HP
V17aのDNAに配置された29の切断部位のうち21の部位はH
PV17bのDNAにも(26部位と共に)見出だされた。
ローン化ウイルスゲノムの反応性を分析し、物理的地図
(図１〜図10)を作成した。後述するモチーフに関する所
定の図面では、所定のHPV-DNAの制限地図を反復した。
従来記載されている方法(9)に従って22〜33の切断部位
を位置付けした。HPV14a及び14b(図4a及び図4b)並びにH
PV17a及び17b(図５)を除いて、これらの地図の間に明白
な相同性は検出されなかった。HPV14aのDNAの2つのBamH
I切断部位の一方がHPV14bのDNAの単一BamHＩ切断部位と
整合している場合、夫々HPV14a及び14b,15に位置付けさ
れた21〜31の部位は共通であることが判明した。同様
に、単一BamHＩ切断部位が相互に整合している場合、HP
V17aのDNAに配置された29の切断部位のうち21の部位はH
PV17bのDNAにも(26部位と共に)見出だされた。
【００２８】これらの地図と、EVに関連するHPV(HPV3a,
5,8,9,10及び12)(8,9,16,18,20)、皮膚いぼに関連するH
PV(HPV1,2,4及び7)、及び粘膜皮膚又は粘膜の病変に関
するHPV(HPV6b,11a,13及び16)(1,33,19)に関して従来作
成されている地図との間に、何ら明白な類似は見出ださ
れなかった。但しHPV14aの地図は、EVに罹患した1人の
日本人患者から単離されたHPVの地図に非常によく似て
いる(24)。この患者から単離した単離体はBamHI部位及
び付加的HindII部位がHPV14aと異なっており、部位Ava
Ｉ、BamHＩ、BglＩ、EcoRＩ、HindII及びHindIIIの位置
は2種のウイルス間で類似している。交差ハイブリダイ
ゼーション実験により、これらの2種のウイルスが非常
によく似ていることを確認した。
5,8,9,10及び12)(8,9,16,18,20)、皮膚いぼに関連するH
PV(HPV1,2,4及び7)、及び粘膜皮膚又は粘膜の病変に関
するHPV(HPV6b,11a,13及び16)(1,33,19)に関して従来作
成されている地図との間に、何ら明白な類似は見出ださ
れなかった。但しHPV14aの地図は、EVに罹患した1人の
日本人患者から単離されたHPVの地図に非常によく似て
いる(24)。この患者から単離した単離体はBamHI部位及
び付加的HindII部位がHPV14aと異なっており、部位Ava
Ｉ、BamHＩ、BglＩ、EcoRＩ、HindII及びHindIIIの位置
は2種のウイルス間で類似している。交差ハイブリダイ
ゼーション実験により、これらの2種のウイルスが非常
によく似ていることを確認した。
【００２９】所定の部位(矢印で示した部位)は位置付け
されていないことが認められる。位置付けによるゲノム
の長さの差が2％未満の切断部位は保存されていると見
なされる(*)。ニックを形成しない酵素はHPV14a及び23
のDNAではPvuＩ、SalＩ及びSmaＩ、HPV14bのDNAではPvu
Ｉ、SacＩ、SalＩ及びSmaＩ、HPV15、17a及び17bのDNA
ではBglＩ、PvulＩ、SalＩ及びSmaＩ、HPV19のDNAではB
glＩ、SacＩ、SalＩ及びSmaＩ、HPV20のDNAではEcoR
Ｉ、PvuＩ、SacＩ及びSmaＩ、HPV21のDNAではSacI及びS
maＩ、HPV22のDNAではBamHＩ、BglＩ、PvuI、PvuII及び
SalＩ、HPV24のDNAではBglＩ、EcoRＩ、PvuI、SacＩ、S
alＩ及びSmaＩであった。
されていないことが認められる。位置付けによるゲノム
の長さの差が2％未満の切断部位は保存されていると見
なされる(*)。ニックを形成しない酵素はHPV14a及び23
のDNAではPvuＩ、SalＩ及びSmaＩ、HPV14bのDNAではPvu
Ｉ、SacＩ、SalＩ及びSmaＩ、HPV15、17a及び17bのDNA
ではBglＩ、PvulＩ、SalＩ及びSmaＩ、HPV19のDNAではB
glＩ、SacＩ、SalＩ及びSmaＩ、HPV20のDNAではEcoR
Ｉ、PvuＩ、SacＩ及びSmaＩ、HPV21のDNAではSacI及びS
maＩ、HPV22のDNAではBamHＩ、BglＩ、PvuI、PvuII及び
SalＩ、HPV24のDNAではBglＩ、EcoRＩ、PvuI、SacＩ、S
alＩ及びSmaＩであった。
【００３０】新規に特徴付けられたHPVのDNAのDNA間相
互の配列の相同性の存在、更にこれらのDNAと、EVに関
連するHPV(HPV3a,5,8,9,10及び12)、皮膚いぼに関連す
るHPV(HPV1,2,4及び7)及び粘膜病変に関連するHPV(HPV6
b,11a,13及び16)のDNAとの間の配列の相同性の存在につ
いて検討した。濾紙固定によるハイブリダイゼーション
及び飽和液相DNA-DNAハイブリダイゼーション後、ヌク
レアーゼS1により消化させる実験を、上記過酷もしくは
厳酷条件下で実施した(8,9)。特に、HPVのDNAをニック
トランスレーションにより標識し、従来記載されている
ように(13)、アルカリショ糖勾配(5〜20％)中で沈降に
より断片化した。標識したHPVのDNA(4000cpm)を、従来
記載されているように(8,9)ウシ胸腺DNA(20μｇ)又は非
標識HPVのDNA(0.20μｇ)の存在下でNaCl 0.48M-EDTA 1m
M(pH6.8)中で68℃でインキュベートした。HPVのDNAのプ
ローブの特異活性は5.3×107〜2×108cpm/μgであっ
た。ヌクレアーゼS1耐性フラクションを測定することに
より、ハイブリダイゼーション率を決定した。数値は、
プローブの自発的自然再生を表す修正値(4〜15％)及び
相同ハイブリダイゼーションを表す100％に標準化した
値(75〜95％)を表している。略記NDは測定せずという意
味である。上記条件下におけるHPV-DNA間の交差ハイブ
リダイゼーションの相対的な大きさは、標識したHPV-DN
Aと非標識HPV DNAとの間のハイブリダイゼーション(％)
で表す。
互の配列の相同性の存在、更にこれらのDNAと、EVに関
連するHPV(HPV3a,5,8,9,10及び12)、皮膚いぼに関連す
るHPV(HPV1,2,4及び7)及び粘膜病変に関連するHPV(HPV6
b,11a,13及び16)のDNAとの間の配列の相同性の存在につ
いて検討した。濾紙固定によるハイブリダイゼーション
及び飽和液相DNA-DNAハイブリダイゼーション後、ヌク
レアーゼS1により消化させる実験を、上記過酷もしくは
厳酷条件下で実施した(8,9)。特に、HPVのDNAをニック
トランスレーションにより標識し、従来記載されている
ように(13)、アルカリショ糖勾配(5〜20％)中で沈降に
より断片化した。標識したHPVのDNA(4000cpm)を、従来
記載されているように(8,9)ウシ胸腺DNA(20μｇ)又は非
標識HPVのDNA(0.20μｇ)の存在下でNaCl 0.48M-EDTA 1m
M(pH6.8)中で68℃でインキュベートした。HPVのDNAのプ
ローブの特異活性は5.3×107〜2×108cpm/μgであっ
た。ヌクレアーゼS1耐性フラクションを測定することに
より、ハイブリダイゼーション率を決定した。数値は、
プローブの自発的自然再生を表す修正値(4〜15％)及び
相同ハイブリダイゼーションを表す100％に標準化した
値(75〜95％)を表している。略記NDは測定せずという意
味である。上記条件下におけるHPV-DNA間の交差ハイブ
リダイゼーションの相対的な大きさは、標識したHPV-DN
Aと非標識HPV DNAとの間のハイブリダイゼーション(％)
で表す。
【００３１】
【表２】
【００３２】HPV1,2,4,6b,7及び11aのゲノムと新規にク
ローニングされ32Pで標識したEVのHPVのDNAとの間、又
は非標識EVのHPVのDNAとHPV13,16及び18の特異的プロー
ブとの間には交差ハイブリダイゼーションが不在又はほ
ぼ不在であることが認められる。同様に、HPV14a,14b,1
5,17a,17b,19,20,21,22,23及び24のDNAとHPV1a及び11a
のDNAとの間には、飽和再結合による交差ハイブリダイ
ゼーションは全く又はほぼ認められなかった(第II表)。
新規にクローニングされたHPVのDNAは交差ハイブリダイ
ゼーションを全く又はほぼ示さず、あるいは相互間及び
EVに関連する他のHPV(HPV3a,5,8,9,10及び12)のゲノム
との間に50％未満の交差ハイブリダイゼーションを示し
た。但しHPV14a及び14bとHPV17a及び17bは強い交差ハイ
ブリダイゼーションを示した。以上の結果から、新規ウ
イルスは9種類の新規型(HPV14,15,17,19,20,21,22,23及
び24)と、型14(HPV14a及びb)及び17(HPV17a及びb)の2種
類の亜型に分類されることが確認される。
ローニングされ32Pで標識したEVのHPVのDNAとの間、又
は非標識EVのHPVのDNAとHPV13,16及び18の特異的プロー
ブとの間には交差ハイブリダイゼーションが不在又はほ
ぼ不在であることが認められる。同様に、HPV14a,14b,1
5,17a,17b,19,20,21,22,23及び24のDNAとHPV1a及び11a
のDNAとの間には、飽和再結合による交差ハイブリダイ
ゼーションは全く又はほぼ認められなかった(第II表)。
新規にクローニングされたHPVのDNAは交差ハイブリダイ
ゼーションを全く又はほぼ示さず、あるいは相互間及び
EVに関連する他のHPV(HPV3a,5,8,9,10及び12)のゲノム
との間に50％未満の交差ハイブリダイゼーションを示し
た。但しHPV14a及び14bとHPV17a及び17bは強い交差ハイ
ブリダイゼーションを示した。以上の結果から、新規ウ
イルスは9種類の新規型(HPV14,15,17,19,20,21,22,23及
び24)と、型14(HPV14a及びb)及び17(HPV17a及びb)の2種
類の亜型に分類されることが確認される。
【００３３】同様に、過酷な分子ハイブリダイゼーショ
ン条件下における配列の相同性(又は相同性の不在)に基
づいて各HPVを群に分類した。これらの群はA〜Hの文字
で示し、下記第III表にリストした。この表は、これら
のHPV(単離体又は単離体の組み合わせ)の保菌者で診断
された疾患、及び該保菌者に認識された腫瘍遺伝子の潜
在性を示している。
ン条件下における配列の相同性(又は相同性の不在)に基
づいて各HPVを群に分類した。これらの群はA〜Hの文字
で示し、下記第III表にリストした。この表は、これら
のHPV(単離体又は単離体の組み合わせ)の保菌者で診断
された疾患、及び該保菌者に認識された腫瘍遺伝子の潜
在性を示している。
【００３４】
【表３】
【００３５】HPV5,8,12,14,19,20,21,22及び23のDNAは
相互間の交差ハイブリダイゼーション率(群の相同性)が
5〜38％であり、HPV5,8及び12のDNAとの間のみに顕著な
交差ハイブリダイゼーション(4〜13％)を示す。従っ
て、これらのウイルスは従来規定されているEVのHPVの
群(9)の一部をなす。
相互間の交差ハイブリダイゼーション率(群の相同性)が
5〜38％であり、HPV5,8及び12のDNAとの間のみに顕著な
交差ハイブリダイゼーション(4〜13％)を示す。従っ
て、これらのウイルスは従来規定されているEVのHPVの
群(9)の一部をなす。
【００３６】同様に、相互間の交差ハイブリダイゼーシ
ョンが約20％でありHPV9のDNAとの間の交差ハイブリダ
イゼーションが約6％であるHPV9,15及び17のDNAは、同
様に既に記載されているEVのHPVの群(9)に属する。型13
及び31のHPVは、同一の群に属すると考えられる。最後
に、他のHPVのゲノムとの間に相同性をほとんど示さな
い型1,2,4,24及び32のHPVは、相互に異なる他の群及び
上記群の第１員を形成すると見なされる。
ョンが約20％でありHPV9のDNAとの間の交差ハイブリダ
イゼーションが約6％であるHPV9,15及び17のDNAは、同
様に既に記載されているEVのHPVの群(9)に属する。型13
及び31のHPVは、同一の群に属すると考えられる。最後
に、他のHPVのゲノムとの間に相同性をほとんど示さな
い型1,2,4,24及び32のHPVは、相互に異なる他の群及び
上記群の第１員を形成すると見なされる。
【００３７】本発明は更に、より特定的には上記HPV-DN
Aに由来するDNAフラグメント、及びより特定的には夫々
遺伝子E6-E7,E1,L1,L2及びそれらの遺伝子間領域に対応
するDNAフラグメントに係る。原点とみなされる部位(図
１〜図９)に対するこれらの各種のフラグメントの位置
及び相対長さを、下記の第IV表に示した。
Aに由来するDNAフラグメント、及びより特定的には夫々
遺伝子E6-E7,E1,L1,L2及びそれらの遺伝子間領域に対応
するDNAフラグメントに係る。原点とみなされる部位(図
１〜図９)に対するこれらの各種のフラグメントの位置
及び相対長さを、下記の第IV表に示した。
【００３８】
【表４】
【００３９】HPV1のゲノムにおける遺伝子の位置付けは
このゲノムのヌクレオチド配列から導いた(O.Danos, M.
Kaninka及びM. Yanivの特許)。過酷(Tm−29℃)又は非過
酷(Tm−40℃)条件で形成されたヘテロ二重鎖分子の電子
顕微鏡分析後、HPV3,5,8,9,10a,12,14,15,17及び24のゲ
ノムの物理的地図を、HPV1の物理的地図及び遺伝子地図
に対して整合させ、HPV31のゲノムの物理的地図を、HPV6
bの物理的地図及び遺伝子地図に対して整合させた(E.Sc
hwarz他、EMBO.J., 1983,2,2341-2348)。
このゲノムのヌクレオチド配列から導いた(O.Danos, M.
Kaninka及びM. Yanivの特許)。過酷(Tm−29℃)又は非過
酷(Tm−40℃)条件で形成されたヘテロ二重鎖分子の電子
顕微鏡分析後、HPV3,5,8,9,10a,12,14,15,17及び24のゲ
ノムの物理的地図を、HPV1の物理的地図及び遺伝子地図
に対して整合させ、HPV31のゲノムの物理的地図を、HPV6
bの物理的地図及び遺伝子地図に対して整合させた(E.Sc
hwarz他、EMBO.J., 1983,2,2341-2348)。
【００４０】第IV表に示した座標の値は、図１〜図９の
物理的地図における遺伝子E6及びE7,E1,L2及びL1の相同
ゲノムのセグメントの5'及び3'末端、及びHPV1aのゲノ
ムに対する遺伝子間領域、又はHPV31の場合にはHPV6bの
ゲノムに対する遺伝子間領域の位置を示している。
物理的地図における遺伝子E6及びE7,E1,L2及びL1の相同
ゲノムのセグメントの5'及び3'末端、及びHPV1aのゲノ
ムに対する遺伝子間領域、又はHPV31の場合にはHPV6bの
ゲノムに対する遺伝子間領域の位置を示している。
【００４１】非過酷ハイブリダイゼーション条件下で異
なる群に属する型のHPVのゲノム間、又は過酷ハイブリ
ダイゼーション条件下で同一群に属する型のHPVの大部
分のゲノム間に形成されたヘテロ二重鎖分子を電子顕微
鏡分析にした場合、(調節成分を含む)遺伝子間領域及び
隣接遺伝子E6及びE7(腫瘍中に発現される主要トランス
フォーメーション遺伝子に対応すると思われる)は、検
出可能な配列相同性を示さない。非過酷ハイブリダイゼ
ーション条件下で異なる群に属する型のHPVのゲノム
間、又は過酷ハイブリダイゼーション条件下で同一群に
属するHPVのゲノム間に形成されたヘテロ二重鎖を分析
した場合、遺伝子E1(主にウイルスDNAの複製に関与す
る)及び遺伝子L1(ビリオンの主要抗原決定基を有するウ
イルスキャプシドの主要タンパクをコードする)は、検
出可能な配列の相同性を示す。
なる群に属する型のHPVのゲノム間、又は過酷ハイブリ
ダイゼーション条件下で同一群に属する型のHPVの大部
分のゲノム間に形成されたヘテロ二重鎖分子を電子顕微
鏡分析にした場合、(調節成分を含む)遺伝子間領域及び
隣接遺伝子E6及びE7(腫瘍中に発現される主要トランス
フォーメーション遺伝子に対応すると思われる)は、検
出可能な配列相同性を示さない。非過酷ハイブリダイゼ
ーション条件下で異なる群に属する型のHPVのゲノム
間、又は過酷ハイブリダイゼーション条件下で同一群に
属するHPVのゲノム間に形成されたヘテロ二重鎖を分析
した場合、遺伝子E1(主にウイルスDNAの複製に関与す
る)及び遺伝子L1(ビリオンの主要抗原決定基を有するウ
イルスキャプシドの主要タンパクをコードする)は、検
出可能な配列の相同性を示す。
【００４２】領域E1及びL1を含む組換え体プラスミドか
ら作製されたプローブは、場合によっては過酷又は非過
酷条件下で実施される分子ハイブリダイゼーションの実
験により最大数のHPV型を検出することが理論的に可能
である。遺伝子間領域及び遺伝子E6及びE7を含む組換え
体プラスミドから作製されたプローブは、所定のHPV型
又は同種のHPV型を特異的に検出することが可能であ
る。
ら作製されたプローブは、場合によっては過酷又は非過
酷条件下で実施される分子ハイブリダイゼーションの実
験により最大数のHPV型を検出することが理論的に可能
である。遺伝子間領域及び遺伝子E6及びE7を含む組換え
体プラスミドから作製されたプローブは、所定のHPV型
又は同種のHPV型を特異的に検出することが可能であ
る。
【００４３】領域L2(ウイルスキャプシドの微量構成成
分をコードする)は、異なる型のHPV間で可変のヌクレオ
チド配列保存率を有する。
分をコードする)は、異なる型のHPV間で可変のヌクレオ
チド配列保存率を有する。
【００４４】以下、ウイルスHPV-IP2及びHPV-IP4を単離
した条件、次いでこれらのウイルスからHPV-DNAを得た
条件についてより明確に説明する。
した条件、次いでこれらのウイルスからHPV-DNAを得た
条件についてより明確に説明する。
【００４５】生殖器新形成及び癌に関連する新規型のHP
V(HPV IP2)の分子クローニング及び特徴付け 非過酷条件下でHPV16型の特異的放射性プローブを使用
するハイブリダイゼーションにより、子宮頸部の癌から
抽出したDNAには新規型のHPVが露呈された。過酷ハイブ
リダイゼーション条件でハイブリダイゼーションを実施
した場合には交差ハイブリダイゼーションは検出できな
かった。数種類の制限酵素に対するこのHPVのDNAの反応
性を調べた処、酵素BglIIはウイルスDNAを一箇所で切断
していることがわかった。腫瘍から抽出したDNAをエン
ドヌクレチーゼBglIIで消化後、8kb(乳頭腫ウイルスの
ゲノムの寸法)のDNA分子を含んでいるフラクションを、
ショ糖勾配中で遠心分離により精製した。8kbの分子をB
glII部位でプラスミドPL15.5から成るベクター(BglII及
びBamHIによる単一切断部位を含む)に挿入し、該ベクタ
ーはBamHI部位でλバクテリオファージL47,1のDNAに挿
入した。組換え体DNAのキャプシド形成及び宿主細菌(大
腸菌、菌株LA101)への感染後、非過酷条件下で放射性HP
V16のDNAで感染細菌培養物のレプリカハイブリダイゼー
ションを実施した処、組換え体ファージに対応する溶菌
プラークが検出された。ウイルス配列全体を含んでいる
数個の組換え体バクテリオファージが単離され、挿入酵
素BglIIによるファージDNAの切断は非過酷条件でHPV16
プローブとハイブリダイズする8kbのフラグメントを形
成し、酵素BglII及びPstＩの混合物による組換え体ファ
ージのDNAと元の腫瘍のDNAとの切断は、乳頭腫ウイルス
のゲノムの寸法に等しい総分子量を有する同一の5つの
フラグメントを形成する。新規HPVのDNAを組換え体バク
テリオファージのDNAから切出し、電気溶離により精製
し、プラスミドPL15.5内で再クローニングした。18個の
制限エンドヌクレアーゼに対するこのDNAの反応性に基
づいて、ウイルスDNAの制限地図を作成し、21個の切断
部位を位置付けすることができた(図９)。こうして作成
した地図は今日までに同定されているHPVのゲノムの地
図とは異なっている。新規HPVのDNAと従来同定されてい
るHPVのDNAとの間の配列の相同性を、過酷条件で実施し
たレプリカ分子ハイブリダイゼーション実験により分析
した。検出された相同性は常に5％未満であり、最大の
相同性はHPV16のゲノムで検出された。子宮頸部の癌か
ら特徴付けられた新規ウイルスは、従って新規型のHPV
を構成しており、これをHPVIP2と仮称する。
V(HPV IP2)の分子クローニング及び特徴付け 非過酷条件下でHPV16型の特異的放射性プローブを使用
するハイブリダイゼーションにより、子宮頸部の癌から
抽出したDNAには新規型のHPVが露呈された。過酷ハイブ
リダイゼーション条件でハイブリダイゼーションを実施
した場合には交差ハイブリダイゼーションは検出できな
かった。数種類の制限酵素に対するこのHPVのDNAの反応
性を調べた処、酵素BglIIはウイルスDNAを一箇所で切断
していることがわかった。腫瘍から抽出したDNAをエン
ドヌクレチーゼBglIIで消化後、8kb(乳頭腫ウイルスの
ゲノムの寸法)のDNA分子を含んでいるフラクションを、
ショ糖勾配中で遠心分離により精製した。8kbの分子をB
glII部位でプラスミドPL15.5から成るベクター(BglII及
びBamHIによる単一切断部位を含む)に挿入し、該ベクタ
ーはBamHI部位でλバクテリオファージL47,1のDNAに挿
入した。組換え体DNAのキャプシド形成及び宿主細菌(大
腸菌、菌株LA101)への感染後、非過酷条件下で放射性HP
V16のDNAで感染細菌培養物のレプリカハイブリダイゼー
ションを実施した処、組換え体ファージに対応する溶菌
プラークが検出された。ウイルス配列全体を含んでいる
数個の組換え体バクテリオファージが単離され、挿入酵
素BglIIによるファージDNAの切断は非過酷条件でHPV16
プローブとハイブリダイズする8kbのフラグメントを形
成し、酵素BglII及びPstＩの混合物による組換え体ファ
ージのDNAと元の腫瘍のDNAとの切断は、乳頭腫ウイルス
のゲノムの寸法に等しい総分子量を有する同一の5つの
フラグメントを形成する。新規HPVのDNAを組換え体バク
テリオファージのDNAから切出し、電気溶離により精製
し、プラスミドPL15.5内で再クローニングした。18個の
制限エンドヌクレアーゼに対するこのDNAの反応性に基
づいて、ウイルスDNAの制限地図を作成し、21個の切断
部位を位置付けすることができた(図９)。こうして作成
した地図は今日までに同定されているHPVのゲノムの地
図とは異なっている。新規HPVのDNAと従来同定されてい
るHPVのDNAとの間の配列の相同性を、過酷条件で実施し
たレプリカ分子ハイブリダイゼーション実験により分析
した。検出された相同性は常に5％未満であり、最大の
相同性はHPV16のゲノムで検出された。子宮頸部の癌か
ら特徴付けられた新規ウイルスは、従って新規型のHPV
を構成しており、これをHPVIP2と仮称する。
【００４６】種々の条件下でHPVIP2のDNAとHPV1のDNAと
の間に形成されたヘテロ二重鎖分子を電子顕微鏡で分析
した処、これらの2種のゲノムの物理的地図を整合させ
ることができ、HPVIP2のDNAがもっている異なる遺伝子
の理論的位置を決定することができた［第Ｖ表］。
の間に形成されたヘテロ二重鎖分子を電子顕微鏡で分析
した処、これらの2種のゲノムの物理的地図を整合させ
ることができ、HPVIP2のDNAがもっている異なる遺伝子
の理論的位置を決定することができた［第Ｖ表］。
【００４７】
【表５】
【００４８】精製されたHPVIP2のDNAから作製した放射
性プローブを使用することにより、これらのウイルスの
病原性を決定することができた。HPVIP2のDNAが認識さ
れたのは、14件の調査対象のうち外部生殖器官の退形成
丘疹の1例、51件の調査対象のうち2件の子宮頸部の侵入
性癌、及び28件の調査対象のうちの子宮頸部の上皮内新
形成の1例であった。従って、HPVIP2は頻度がHPV18より
もやや低く且つHPV16よりも著しく低い腫瘍形成潜在力
を有する生殖器向性HPV型である。生殖器新形成、特に
子宮頸部癌の発生の危険を孕むHPV型を診断又は早期発
見するためには、分子プローブの作製に使用されるHPV
のDNAのあらゆる混合物にHPVIP2を混入させる必要があ
る。
性プローブを使用することにより、これらのウイルスの
病原性を決定することができた。HPVIP2のDNAが認識さ
れたのは、14件の調査対象のうち外部生殖器官の退形成
丘疹の1例、51件の調査対象のうち2件の子宮頸部の侵入
性癌、及び28件の調査対象のうちの子宮頸部の上皮内新
形成の1例であった。従って、HPVIP2は頻度がHPV18より
もやや低く且つHPV16よりも著しく低い腫瘍形成潜在力
を有する生殖器向性HPV型である。生殖器新形成、特に
子宮頸部癌の発生の危険を孕むHPV型を診断又は早期発
見するためには、分子プローブの作製に使用されるHPV
のDNAのあらゆる混合物にHPVIP2を混入させる必要があ
る。
【００４９】皮膚の前癌性病変に関連する新規HPV型(HP
VIP4)の分子クローニング及び特徴付け 過酷条件下でHPV5,8及び14型の特異的放射性プローブを
用いて混合物で分子ハイブリダイゼーションを実施する
と、皮膚前癌性病変である紫外線角化症の生検から抽出
したDNAに新規型のHPVが露呈された。1,2,3,7,10,13,1
6,18,28,IP1(前出のHPV31),IP2及びIP3(前出のHPV32)型
の特異的プローブでハイブリダイゼーションを実施した
場合、交差ハイブリダイゼーションは何も見出だされな
かった。
VIP4)の分子クローニング及び特徴付け 過酷条件下でHPV5,8及び14型の特異的放射性プローブを
用いて混合物で分子ハイブリダイゼーションを実施する
と、皮膚前癌性病変である紫外線角化症の生検から抽出
したDNAに新規型のHPVが露呈された。1,2,3,7,10,13,1
6,18,28,IP1(前出のHPV31),IP2及びIP3(前出のHPV32)型
の特異的プローブでハイブリダイゼーションを実施した
場合、交差ハイブリダイゼーションは何も見出だされな
かった。
【００５０】数種類の制限酵素に対するこのHPVのDNAの
反応性を調べた処、酵素EcoRIはウイルスDNAを一箇所切
断することがわかった。生検から抽出されたDNAをエン
ドヌクレアーゼEcoRIにより消化後、8kb(乳頭腫ウイル
スのゲノムの寸法)のDNA分子を含むフラクションを、シ
ョ糖勾配中で遠心分離により精製した。8kbの分子をEco
RＩ部位でバクテリオファージλgt wes.λBのDNAに挿入
した。組換え体DNAのキャプシド形成及び宿主細菌(大腸
菌、菌株LA101)への感染後、非過酷条件下でHPV8及び14
のDNAの放射性混合物で感染細菌培養物のレプリカハイ
ブリダイゼーションを実施した処、組換え体ファージに
対応する溶菌プラークが検出された。ウイルス配列全体
を含む数種類の組換え体バクテリオファージが単離さ
れ、挿入酵素EcoRIによるファージDNAの切断は、非過酷
条件でHPV5,8及び14の特異的プローブとハイブリダイズ
する8kbのフラグメントを形成し、酵素EcoRＩ及びPstＩ
の混合物による組換え体ファージのDNAと元の病変部のD
NAとの切断は、乳頭腫ウイルスのゲノムの寸法に等しい
総分子量を有する同一の6個のフラグメントを形成す
る。新規HPVのDNAを組換え体バクテリオファージのDNA
から切り出し、電気溶出により精製し、プラスミドpSP6
5内で再クローニングした。15個の制限エンドヌクレア
ーゼに対するこのDNAの反応性に基づいて、ウイルスDNA
の制限地図を作成し、こうして23の切断部位を位置付け
することができた(図10)。こうして作成した地図は今日
までに同定されているHPVのゲノムの地図とは異なって
いる。過酷条件下で実施されたレプリカ分子ハイブリダ
イゼーション実験により、新規HPVのDNAと今日まで同定
されているHPVのDNAとの間の配列の相同性を分析した。
新規HPVのDNAといぼ状表皮異形成病変中に従来同定され
ている所定の型のHPV(HPV5,8,12,14,19,20,21及び25)の
DNAとの間には50％未満の相同性が検出されたが、その
他の型のHPVとの間には相同性は何も検出されなかっ
た。従って、紫外線角化症から特徴付けられる新規ウイ
ルスは、HPV-IP4と仮称される新規型のHPVを構成する。
反応性を調べた処、酵素EcoRIはウイルスDNAを一箇所切
断することがわかった。生検から抽出されたDNAをエン
ドヌクレアーゼEcoRIにより消化後、8kb(乳頭腫ウイル
スのゲノムの寸法)のDNA分子を含むフラクションを、シ
ョ糖勾配中で遠心分離により精製した。8kbの分子をEco
RＩ部位でバクテリオファージλgt wes.λBのDNAに挿入
した。組換え体DNAのキャプシド形成及び宿主細菌(大腸
菌、菌株LA101)への感染後、非過酷条件下でHPV8及び14
のDNAの放射性混合物で感染細菌培養物のレプリカハイ
ブリダイゼーションを実施した処、組換え体ファージに
対応する溶菌プラークが検出された。ウイルス配列全体
を含む数種類の組換え体バクテリオファージが単離さ
れ、挿入酵素EcoRIによるファージDNAの切断は、非過酷
条件でHPV5,8及び14の特異的プローブとハイブリダイズ
する8kbのフラグメントを形成し、酵素EcoRＩ及びPstＩ
の混合物による組換え体ファージのDNAと元の病変部のD
NAとの切断は、乳頭腫ウイルスのゲノムの寸法に等しい
総分子量を有する同一の6個のフラグメントを形成す
る。新規HPVのDNAを組換え体バクテリオファージのDNA
から切り出し、電気溶出により精製し、プラスミドpSP6
5内で再クローニングした。15個の制限エンドヌクレア
ーゼに対するこのDNAの反応性に基づいて、ウイルスDNA
の制限地図を作成し、こうして23の切断部位を位置付け
することができた(図10)。こうして作成した地図は今日
までに同定されているHPVのゲノムの地図とは異なって
いる。過酷条件下で実施されたレプリカ分子ハイブリダ
イゼーション実験により、新規HPVのDNAと今日まで同定
されているHPVのDNAとの間の配列の相同性を分析した。
新規HPVのDNAといぼ状表皮異形成病変中に従来同定され
ている所定の型のHPV(HPV5,8,12,14,19,20,21及び25)の
DNAとの間には50％未満の相同性が検出されたが、その
他の型のHPVとの間には相同性は何も検出されなかっ
た。従って、紫外線角化症から特徴付けられる新規ウイ
ルスは、HPV-IP4と仮称される新規型のHPVを構成する。
【００５１】精製したHPVIP4のDNAから作製された放射
性プローブを使用した処、調査したいぼ状表皮異形成に
罹患した17人の患者の42％、及び分析した紫外線角化症
生検のx/yにHPVIP4を露呈させることができた。HPVIP4
は、皮膚癌の頻発により特徴付けられる疾患であるいぼ
状表皮異形成に罹患した患者に頻度が高く、皮膚の有し
細胞癌の前駆体とみなされる紫外線角化症の病変のフラ
クションに関連付けられるので、腫瘍形成潜在力を有す
る皮膚向性HPV型であると判断できる。皮膚の前癌又は
癌の病変の発生の危険を孕むHPV型を診断又は早期発見
するためには、分子プローブの作製に使用されるHPVのD
NAの全混合物にHPVIP4型を混入することが必要である。
性プローブを使用した処、調査したいぼ状表皮異形成に
罹患した17人の患者の42％、及び分析した紫外線角化症
生検のx/yにHPVIP4を露呈させることができた。HPVIP4
は、皮膚癌の頻発により特徴付けられる疾患であるいぼ
状表皮異形成に罹患した患者に頻度が高く、皮膚の有し
細胞癌の前駆体とみなされる紫外線角化症の病変のフラ
クションに関連付けられるので、腫瘍形成潜在力を有す
る皮膚向性HPV型であると判断できる。皮膚の前癌又は
癌の病変の発生の危険を孕むHPV型を診断又は早期発見
するためには、分子プローブの作製に使用されるHPVのD
NAの全混合物にHPVIP4型を混入することが必要である。
【００５２】本発明はより特定的には、乳頭腫ウイルス
の感染の各種の形態の総合的診断を実施するため、特に
感染の可能な進行を予後診断するために組み合わせて使
用し得る各種のHPV-DNAの混合物即ち、カクテル(又はこ
れらのHPV-DNA又はこれらのDNA配列を含むプローブ)に
も係る。本発明の好適な混合物を下記第VI表に示した。
の感染の各種の形態の総合的診断を実施するため、特に
感染の可能な進行を予後診断するために組み合わせて使
用し得る各種のHPV-DNAの混合物即ち、カクテル(又はこ
れらのHPV-DNA又はこれらのDNA配列を含むプローブ)に
も係る。本発明の好適な混合物を下記第VI表に示した。
【００５３】
【表６】
【００５４】この表は、より特定的には表の左側に示し
た混合物を使用することにより診断され得る疾患の性質
も示している。図１〜図９の制限地図の区分は第VI表の
「構成」の欄に示した区分と一致していることが銘記され
よう。また、このために所定のプローブは各添付図面で
数回繰り返している。
た混合物を使用することにより診断され得る疾患の性質
も示している。図１〜図９の制限地図の区分は第VI表の
「構成」の欄に示した区分と一致していることが銘記され
よう。また、このために所定のプローブは各添付図面で
数回繰り返している。
【００５５】これらの混合物の各々は、本発明の新規プ
ローブの少なくとも1つを含むものと規定できる。換言
するなら、本発明の診断用組成物は、 1)少なくともHPV2dのDNA、 2)HPV10b,28及び29のDNAの少なくとも1種、 3)HPV17,24のDNAの少なくとも1種、 4)HPV14,15,17,19,20,21,22及び23のDNAの少なくとも1
種、 5)HPV15及び17のDNAの少なくとも1種、 6)HPV24のDNA、 7)HPV14,32のDNA、 8)HPV31のDNA、 9)HPV32のDNA を含むものと規定できる。尚、上記9群のDNAは相互に異
なる全状況で選択される。
ローブの少なくとも1つを含むものと規定できる。換言
するなら、本発明の診断用組成物は、 1)少なくともHPV2dのDNA、 2)HPV10b,28及び29のDNAの少なくとも1種、 3)HPV17,24のDNAの少なくとも1種、 4)HPV14,15,17,19,20,21,22及び23のDNAの少なくとも1
種、 5)HPV15及び17のDNAの少なくとも1種、 6)HPV24のDNA、 7)HPV14,32のDNA、 8)HPV31のDNA、 9)HPV32のDNA を含むものと規定できる。尚、上記9群のDNAは相互に異
なる全状況で選択される。
【００５６】種々のいぼ形態又は他の皮膚もしくは粘膜
病変部から単離され得るHPVは非常に多種に及ぶことを
考慮すると、他のHPV-DNAも同一型の疾患の発生に関与
し得ると認められるので、表に示した各型の疾患を診断
するためには、1種又は2種より多くのHPV-DNAを含む混
合物を使用することが好ましい。感染の性質及び可能な
進行の診断は、使用されるプローブの数が多いほど有効
である。更に、プローブの各混合物を使用してハイブリ
ダイゼーション試験を実施すると、患者が罹患している
病気の性質をより高い確率で鑑別する鑑別診断が可能に
なる。
病変部から単離され得るHPVは非常に多種に及ぶことを
考慮すると、他のHPV-DNAも同一型の疾患の発生に関与
し得ると認められるので、表に示した各型の疾患を診断
するためには、1種又は2種より多くのHPV-DNAを含む混
合物を使用することが好ましい。感染の性質及び可能な
進行の診断は、使用されるプローブの数が多いほど有効
である。更に、プローブの各混合物を使用してハイブリ
ダイゼーション試験を実施すると、患者が罹患している
病気の性質をより高い確率で鑑別する鑑別診断が可能に
なる。
【００５７】第VI表では、発明者の実験室で単離したHP
V-DNAから形成したプローブしか示していない。上記に
述べた理由により、他の実験室で得られたHPVに由来す
るDNAも同一型に感染した患者に繰り返して認められる
ので、各混合物にこれらのDNAを追加できることは言う
までもない。例えば混合物7には、上皮内新形成及び皮
膚癌に変質する危険を孕むいぼ状表皮異形成に認識され
る他の全HPV-DNAを追加することができる。第VI表中、
所定の混合物は診断すべき同一疾患の特徴を有するもの
として示されていることが認められよう。一方、各混合
物は癌化の危険の低い感染と癌化の危険の高い感染とを
識別する。例えば、混合物7で診断した患者からのウイ
ルス調製物のハイブリダイゼーションは、混合物3でハ
イブリダイゼーションを形成する場合よりも皮膚癌化の
危険が大きいことが立証されよう。
V-DNAから形成したプローブしか示していない。上記に
述べた理由により、他の実験室で得られたHPVに由来す
るDNAも同一型に感染した患者に繰り返して認められる
ので、各混合物にこれらのDNAを追加できることは言う
までもない。例えば混合物7には、上皮内新形成及び皮
膚癌に変質する危険を孕むいぼ状表皮異形成に認識され
る他の全HPV-DNAを追加することができる。第VI表中、
所定の混合物は診断すべき同一疾患の特徴を有するもの
として示されていることが認められよう。一方、各混合
物は癌化の危険の低い感染と癌化の危険の高い感染とを
識別する。例えば、混合物7で診断した患者からのウイ
ルス調製物のハイブリダイゼーションは、混合物3でハ
イブリダイゼーションを形成する場合よりも皮膚癌化の
危険が大きいことが立証されよう。
【００５８】同様に、混合物5により検出されるEVは混
合物6により検出されるEVより癌化の危険が大きいこと
がわかる。混合物4は、混合物5により検出されるよりも
危険度の高いEVを検出する。
合物6により検出されるEVより癌化の危険が大きいこと
がわかる。混合物4は、混合物5により検出されるよりも
危険度の高いEVを検出する。
【００５９】以下、乳頭腫ウイルスの各感染形態の総合
診断を実施するために、場合によっては感染の可能な進
行を予後診断するために組み合わせて使用され得る種々
のHPV-DNAから成る他の混合物即ち、カクテル(又はこれ
らのHPV-DNAを又は該DNAの配列を含むプローブ)につい
て更に説明する。
診断を実施するために、場合によっては感染の可能な進
行を予後診断するために組み合わせて使用され得る種々
のHPV-DNAから成る他の混合物即ち、カクテル(又はこれ
らのHPV-DNAを又は該DNAの配列を含むプローブ)につい
て更に説明する。
【００６０】本発明の好適な混合物は、上記第VI表に示
した。
した。
【００６１】この表は、より特定的には表の左側に示し
た混合物を使用することにより診断され得る疾患の性質
も示している。もう一度ことわっておくが、この表に示
される他のHPV-DNAの制限地図は図１〜図９に含まれて
いる。
た混合物を使用することにより診断され得る疾患の性質
も示している。もう一度ことわっておくが、この表に示
される他のHPV-DNAの制限地図は図１〜図９に含まれて
いる。
【００６２】HPV-IP2は生殖器新形成、特に子宮頸部癌
の発生の危険を検出するために使用可能なプローブを特
定的に表すとみなされ得ることに留意されたい。
の発生の危険を検出するために使用可能なプローブを特
定的に表すとみなされ得ることに留意されたい。
【００６３】従って、本発明はより特定的には表中「混
合物の指称」の欄に1〜10の番号を付けた少なくとも10群
を含む診断用箱又は「キット」にも係る。
合物の指称」の欄に1〜10の番号を付けた少なくとも10群
を含む診断用箱又は「キット」にも係る。
【００６４】以上の説明ではクローニングした完全なHP
V-DNAをプローブとして使用する場合について特に考察
した。もっとも、該DNAの代わりにこれらの各DNAのクロ
ーン化フラグメント、特に遺伝子E1又はL1及び遺伝子E6
-E7を使用してもよい。
V-DNAをプローブとして使用する場合について特に考察
した。もっとも、該DNAの代わりにこれらの各DNAのクロ
ーン化フラグメント、特に遺伝子E1又はL1及び遺伝子E6
-E7を使用してもよい。
【００６５】HPV-DNAをインビトロで検出する基本原理
は、当然過酷又は非過酷条件で操作されるハイブリダイ
ゼーションを使用するものである。例えば以下に述べる
ように操作すればよいが、記載されている診断試験は当
然本発明のプローブ又はプローブ混合物の使用条件を限
定するものと見なすことはできない。
は、当然過酷又は非過酷条件で操作されるハイブリダイ
ゼーションを使用するものである。例えば以下に述べる
ように操作すればよいが、記載されている診断試験は当
然本発明のプローブ又はプローブ混合物の使用条件を限
定するものと見なすことはできない。
【００６６】クローン化HPVのDNAの混合物から作製した
プローブを使用する試験の目的は、生検中、病変部の掻
去により得られた細胞中、又はCarnoy混合物(エタノー
ル、クロロホルム、酢酸6:3:1)により形成され且つパラ
フィンに含有される生検の切片中でHPVを露呈させ且つH
PV型を同定することである。試験は、既知の原則の方法
に従って採取物のDNAを予め抽出する必要があり、HPVの
DNAの混合物から作製した(32P又は35Sで標識した)放射
性プローブを使用して、過酷又は非過酷条件下で実施し
た分子ハイブリダイゼーション実験によりこのDNAの分
析を行う。各試験では、一般にプローブの数種類の混合
物を使用する必要がある。
プローブを使用する試験の目的は、生検中、病変部の掻
去により得られた細胞中、又はCarnoy混合物(エタノー
ル、クロロホルム、酢酸6:3:1)により形成され且つパラ
フィンに含有される生検の切片中でHPVを露呈させ且つH
PV型を同定することである。試験は、既知の原則の方法
に従って採取物のDNAを予め抽出する必要があり、HPVの
DNAの混合物から作製した(32P又は35Sで標識した)放射
性プローブを使用して、過酷又は非過酷条件下で実施し
た分子ハイブリダイゼーション実験によりこのDNAの分
析を行う。各試験では、一般にプローブの数種類の混合
物を使用する必要がある。
【００６７】数種類のハイブリダイゼーション法を使用
することができる。例えばブロットハイブリダイゼーシ
ョン法を使用することができる。この方法は、DNAの変
性後、膜(ニトロセルロース又はGenescreenplus)にアリ
コート量のDNAを付着させ、通常条件で各膜をプローブ
の混合物でハイブリダイゼーションし、膜をX線写真フ
ィルムと接触させることにより放射性ハイブリッドを検
出することから成る。レプリカハイブリダイゼーション
法を使用してもよい。この方法は、制限酵素によるDNA
の処理後に形成されたDNAのフラグメントをアガロース
ゲル電気泳動で分離し、アルカリ変性後、膜(ニトロセ
ルロース、Genescreenplus)にフラグメントを移し、こ
れらのフラグメントを通常条件でプローブの各混合物で
ハイブリダイゼーションすることから成る。放射性ハイ
ブリッドの形成は、膜をX線写真フィルムと接触後に検
出される。
することができる。例えばブロットハイブリダイゼーシ
ョン法を使用することができる。この方法は、DNAの変
性後、膜(ニトロセルロース又はGenescreenplus)にアリ
コート量のDNAを付着させ、通常条件で各膜をプローブ
の混合物でハイブリダイゼーションし、膜をX線写真フ
ィルムと接触させることにより放射性ハイブリッドを検
出することから成る。レプリカハイブリダイゼーション
法を使用してもよい。この方法は、制限酵素によるDNA
の処理後に形成されたDNAのフラグメントをアガロース
ゲル電気泳動で分離し、アルカリ変性後、膜(ニトロセ
ルロース、Genescreenplus)にフラグメントを移し、こ
れらのフラグメントを通常条件でプローブの各混合物で
ハイブリダイゼーションすることから成る。放射性ハイ
ブリッドの形成は、膜をX線写真フィルムと接触後に検
出される。
【００６８】放射性プローブは、「ニックトランスレー
ション」法により標識したHPVのDNAから構成されるか、
例えばSP6型のベクターに挿入されたウイルスDNAの転写
により作成されたRNAから構成される。放射性プローブ
を使用すると感度が大きいという利点があるが、相互に
標識された抗体又はそれ自体酵素、蛍光等のマーカーを
有する抗体により認識された抗体により認識され得る例
えばビオチニル化した非放射性プローブを使用する場合
はこのような利点は得られない。
ション」法により標識したHPVのDNAから構成されるか、
例えばSP6型のベクターに挿入されたウイルスDNAの転写
により作成されたRNAから構成される。放射性プローブ
を使用すると感度が大きいという利点があるが、相互に
標識された抗体又はそれ自体酵素、蛍光等のマーカーを
有する抗体により認識された抗体により認識され得る例
えばビオチニル化した非放射性プローブを使用する場合
はこのような利点は得られない。
【００６９】プローブの選択は、採取物の性質に依存す
る。例えばEVに罹患している疑いのある患者の場合、混
合物1,2,3,4,5,6及び7が使用される。混合物1及び2は、
EVと皮膚いぼとの間の鑑別診断が可能である。病気に関
連する3群のHPVの各々の最も高頻度で検出された群を含
むプローブ3、及びEVの癌に関連する型のHPVのDNAを含
むプローブ7は、EVの殆どの症例を診断することがで
き、特に、癌の発生の危険のあるHPV型に感染した患者
を認識することができる。混合物4,5及び6を使用する
と、同一患者に感染するHPV型を確定することができ
る。
る。例えばEVに罹患している疑いのある患者の場合、混
合物1,2,3,4,5,6及び7が使用される。混合物1及び2は、
EVと皮膚いぼとの間の鑑別診断が可能である。病気に関
連する3群のHPVの各々の最も高頻度で検出された群を含
むプローブ3、及びEVの癌に関連する型のHPVのDNAを含
むプローブ7は、EVの殆どの症例を診断することがで
き、特に、癌の発生の危険のあるHPV型に感染した患者
を認識することができる。混合物4,5及び6を使用する
と、同一患者に感染するHPV型を確定することができ
る。
【００７０】従って、更に本発明は上記に示したような
複数のプローブ、即ち −上記19種の型及び亜型のHPV-DNAの各々の典型、又は −プローブ混合物、好ましくは先に規定した各種の群又
はプローブ混合物を含む容器もしくは「キット」に係り、
これらの「キット」は、患者から得られたウイルス調製物
と各種の群又は混合物との間のハイブリダイゼーション
により「インビトロ」診断調査に使用される。
複数のプローブ、即ち −上記19種の型及び亜型のHPV-DNAの各々の典型、又は −プローブ混合物、好ましくは先に規定した各種の群又
はプローブ混合物を含む容器もしくは「キット」に係り、
これらの「キット」は、患者から得られたウイルス調製物
と各種の群又は混合物との間のハイブリダイゼーション
により「インビトロ」診断調査に使用される。
【００７１】当然のことながら既に示したように、本発
明は特定的に述べた適用例及び実施例に限定されず、あ
らゆる変形例を包含し、特に図面に示した制限地図のHP
V-DNAが対応するように請求の範囲の項で所定の数字と
共にDNA-HPVに付した参照符号は、これらの請求の範囲
が上述の規定に従って同一型に分類され得るこの特定の
HPV-DNAと共通の全HPV-DNA、更に同一亜型に属するHPV-
DNAに及ぶことを意味するものと見なされる。
明は特定的に述べた適用例及び実施例に限定されず、あ
らゆる変形例を包含し、特に図面に示した制限地図のHP
V-DNAが対応するように請求の範囲の項で所定の数字と
共にDNA-HPVに付した参照符号は、これらの請求の範囲
が上述の規定に従って同一型に分類され得るこの特定の
HPV-DNAと共通の全HPV-DNA、更に同一亜型に属するHPV-
DNAに及ぶことを意味するものと見なされる。
【００７２】より特定的には、図面に示したHPV-32から
誘導したDNAは、AvaI,BalI,BamHI,ClaI,EcoRI,HindIII,
NdeI,NruI,PvuI,PvuII,SacI,SalI,SmaI,TthIII,XmaIに
より切断されていないことも注目される。
誘導したDNAは、AvaI,BalI,BamHI,ClaI,EcoRI,HindIII,
NdeI,NruI,PvuI,PvuII,SacI,SalI,SmaI,TthIII,XmaIに
より切断されていないことも注目される。
【００７３】以下に示す組換え体DNAは、1984年11月30
日付けでC.N.C.M.(Collection Nationale des Cultures
de Micro-Organismes de l'INSTITUT PASTEUR de Pari
s)に下記の番号で寄託されている。
日付けでC.N.C.M.(Collection Nationale des Cultures
de Micro-Organismes de l'INSTITUT PASTEUR de Pari
s)に下記の番号で寄託されている。
【００７４】 pBR322/HPV2d………………No.I-379 pBR322/HPV10bA……………No.I-380 pBR322/HPV10bB……………No.I-381 pBR322/HPV14a…………… No.I-382 pBR322/HPV14b…………… No.I-383 pBR322/HPV15………………No.I-384 pBR322/HPV17a…………… No.I-385 pHPV5HindIIIB/HPV17b…… No.I-386 pBR322/HPV19………………No.I-387 pBR322/HPV20………………No.I-388 pBR322/HPV21………………No.I-389 pHV5 HindIIIB/HPV22…… No.I-390 pBR322/HPV23………………No.I-391 pBR322/HPV24a…………… No.I-392 pBR322/HPV24b…………… No.I-393 pBR322/HPV28………………No.I-394 pBR322/HPV29………………No.I-395 pBR322/HPV31………………No.I-396 pSP64/HPV32……………… No.I-397 pLI55/IP2………………… No.I-450 pSP65/IP4………………… No.I-449。
【００７５】本発明はより特定的には、上記に言及した
異なる乳頭腫ウイルスの遺伝子E6、E7及び特にL2の発現
生成物に係る。
異なる乳頭腫ウイルスの遺伝子E6、E7及び特にL2の発現
生成物に係る。
【００７６】これらの発現生成物は、所定の生物採取物
中の乳頭腫ウイルス又は該ウイルスの発現生成物を検出
するため、及び乳頭腫ウイルスが属する型又は亜型に従
って乳頭腫ウイルスを同定するためにそれ自体使用され
得る。これらの発現生成物が得られる条件については、
特に乳頭腫ウイルスHPVの配列L2の発現に関して以下の
記載中に説明するが、同様の方法を利用して他の型の乳
頭腫ウイルスに由来する遺伝子配列L2(又はE6,E7又はL
1)の発現を誘導してもよい。以下の説明は例外を除き、
配列又は遺伝子L2についてより特定的に述べているが、
場合によっては遺伝子L2の発現生成物に関する教示を他
の該当遺伝子の発現生成物に置き換えてもよい。配列L2
の発現生成物は、異なる型の乳頭腫ウイルスではなく対
応する乳頭腫ウイルスにより侵された生物採取物中で遺
伝子L2の発現生成物を認識し得る抗体をインビボで産生
させるために使用できるという点で特に有利であり、よ
り特定的には、該当する類の調製物が予め固定されてい
る場合に特に有利である。以下に述べる本発明の新規実
施例は、重度を推定し且つ採用すべき治療を選択するた
めに、調査された病変物中に存在している乳頭腫ウイル
スの型を決定することの可能な別個の手段を提供するも
のである。遺伝子L2の各種の型の発現生成物に対して産
生される抗体は、ハイブリダイゼーションプローブに関
して先に記載した混合物に対応する混合物に分類され得
る。
中の乳頭腫ウイルス又は該ウイルスの発現生成物を検出
するため、及び乳頭腫ウイルスが属する型又は亜型に従
って乳頭腫ウイルスを同定するためにそれ自体使用され
得る。これらの発現生成物が得られる条件については、
特に乳頭腫ウイルスHPVの配列L2の発現に関して以下の
記載中に説明するが、同様の方法を利用して他の型の乳
頭腫ウイルスに由来する遺伝子配列L2(又はE6,E7又はL
1)の発現を誘導してもよい。以下の説明は例外を除き、
配列又は遺伝子L2についてより特定的に述べているが、
場合によっては遺伝子L2の発現生成物に関する教示を他
の該当遺伝子の発現生成物に置き換えてもよい。配列L2
の発現生成物は、異なる型の乳頭腫ウイルスではなく対
応する乳頭腫ウイルスにより侵された生物採取物中で遺
伝子L2の発現生成物を認識し得る抗体をインビボで産生
させるために使用できるという点で特に有利であり、よ
り特定的には、該当する類の調製物が予め固定されてい
る場合に特に有利である。以下に述べる本発明の新規実
施例は、重度を推定し且つ採用すべき治療を選択するた
めに、調査された病変物中に存在している乳頭腫ウイル
スの型を決定することの可能な別個の手段を提供するも
のである。遺伝子L2の各種の型の発現生成物に対して産
生される抗体は、ハイブリダイゼーションプローブに関
して先に記載した混合物に対応する混合物に分類され得
る。
【００７７】従って本発明は、複数の異なる抗体を含ん
でおり且つ新規に単離された乳頭腫ウイルスの検出、場
合によっては同定又は分類の連続試験を実施することが
可能な容器もしくは「キット」も提供する。例えば、本発
明の容器もしくはキットは、抗体又は異なる抗体の混合
物から構成される複数の試薬、例えば以下のように分類
される乳頭腫ウイルスの遺伝子L2の発現生成物に対して
形成された抗体を夫々含む試薬から構成される。
でおり且つ新規に単離された乳頭腫ウイルスの検出、場
合によっては同定又は分類の連続試験を実施することが
可能な容器もしくは「キット」も提供する。例えば、本発
明の容器もしくはキットは、抗体又は異なる抗体の混合
物から構成される複数の試薬、例えば以下のように分類
される乳頭腫ウイルスの遺伝子L2の発現生成物に対して
形成された抗体を夫々含む試薬から構成される。
【００７８】1)少なくともHPV2d、 2)HPV10b,28及び29の少なくとも1種、 3)HPV17,24の少なくとも1種、 4)HPV14,15,17,19,20,21,22,23及びIP24の少なくとも1
種、 5)HPV15及び17の少なくとも1種、 6)HPV24、 7)HPV14,32及びIP4の少なくとも1種、 8)HPV31、 9)HPV32、 10)HPV16,18及びIP2の少なくとも1種。
種、 5)HPV15及び17の少なくとも1種、 6)HPV24、 7)HPV14,32及びIP4の少なくとも1種、 8)HPV31、 9)HPV32、 10)HPV16,18及びIP2の少なくとも1種。
【００７９】尚、以上10群の抗体は、10群の各々が該群
を構成している抗体のただ1種に限定される限り、相互
に異なるように選択される。
を構成している抗体のただ1種に限定される限り、相互
に異なるように選択される。
【００８０】遺伝子L2の発現生成物(又は遺伝子L2の発
現生成物の免疫特性を変化させない追加ポリペプチド、
特に安定化ポリペプチドと融合されたこれらの発現生成
物を含む組換え体タンパク)に対して形成された抗体
は、罹患した被験者の体内の乳頭腫ウイルスにより誘導
された病変部に由来する組織病理切片中でウイルスを直
接検出するために使用可能である。有利には、検出は例
えば前出のCARNOY溶媒もしくは混合物(L.LISONの著書"H
istochimie et cytochimie animales"にも記載されてい
る)を使用して、解離条件下で予め固定された調製物に
対して実施される。
現生成物の免疫特性を変化させない追加ポリペプチド、
特に安定化ポリペプチドと融合されたこれらの発現生成
物を含む組換え体タンパク)に対して形成された抗体
は、罹患した被験者の体内の乳頭腫ウイルスにより誘導
された病変部に由来する組織病理切片中でウイルスを直
接検出するために使用可能である。有利には、検出は例
えば前出のCARNOY溶媒もしくは混合物(L.LISONの著書"H
istochimie et cytochimie animales"にも記載されてい
る)を使用して、解離条件下で予め固定された調製物に
対して実施される。
【００８１】場合によっては固定された抗L2抗体は、こ
の抗体に対して形成された別の抗体により認識され得、
これらの別の抗体は好ましくは非放射性の適当なマーカ
ーを含んでいる。これらのマーカーは例えば酵素又は蛍
光性質を有する。
の抗体に対して形成された別の抗体により認識され得、
これらの別の抗体は好ましくは非放射性の適当なマーカ
ーを含んでいる。これらのマーカーは例えば酵素又は蛍
光性質を有する。
【００８２】本発明は当然のことながら、乳頭腫ウイル
スの遺伝子L2を発現させるポリペプチド自体にも係る。
これらの発現生成物は上記記載で既にL2タンパクと呼称
している。本発明は更に、このL2タンパクがL2タンパク
の免疫特性を本質的に変化させないような他のポリペプ
チド配列と融合されているポリペプチドにも係る。これ
らの他のポリペプチドフラグメントの存在は、殊に遺伝
子工学技術を使用する操作によりこれらのハイブリッド
ポリペプチドを得る場合、使用される該ハイブリッドポ
リペプチドの製造方法に特に起因し得る。有利には、本
発明はβ-ガラクトシダーゼから誘導された配列を含む
ハイブリッドポリペプチドに係る。このような生成物
は、特にラクトースオペロンの全部又は一部により修飾
され且つ、所定の型の乳頭腫ウイルスに由来する遺伝子
L2から誘導されたヌクレオチド配列をラクトースオペロ
ンのプロモータ(又は例えばλファージのような適当な
他の全プロモータ)の下流に挿入させた適当なベクター
(ファージ又はプラスミド)で大腸菌を形質転換すること
により得られる。有利には、ラクトースオペロンのβ-ガ
ラクトシダーゼの遺伝子の少なくとも一部を含むこの型
のプラスミド又はファージを使用する。
スの遺伝子L2を発現させるポリペプチド自体にも係る。
これらの発現生成物は上記記載で既にL2タンパクと呼称
している。本発明は更に、このL2タンパクがL2タンパク
の免疫特性を本質的に変化させないような他のポリペプ
チド配列と融合されているポリペプチドにも係る。これ
らの他のポリペプチドフラグメントの存在は、殊に遺伝
子工学技術を使用する操作によりこれらのハイブリッド
ポリペプチドを得る場合、使用される該ハイブリッドポ
リペプチドの製造方法に特に起因し得る。有利には、本
発明はβ-ガラクトシダーゼから誘導された配列を含む
ハイブリッドポリペプチドに係る。このような生成物
は、特にラクトースオペロンの全部又は一部により修飾
され且つ、所定の型の乳頭腫ウイルスに由来する遺伝子
L2から誘導されたヌクレオチド配列をラクトースオペロ
ンのプロモータ(又は例えばλファージのような適当な
他の全プロモータ)の下流に挿入させた適当なベクター
(ファージ又はプラスミド)で大腸菌を形質転換すること
により得られる。有利には、ラクトースオペロンのβ-ガ
ラクトシダーゼの遺伝子の少なくとも一部を含むこの型
のプラスミド又はファージを使用する。
【００８３】本発明は異なるポリペプチドの群にも係
り、該ポリペプチドは常に上述のL2タンパクの一部のみ
に夫々対応するが、これらの各群のポリペプチドは該当
する類のL2タンパクの特徴的抗原部位を常に含んでい
る。
り、該ポリペプチドは常に上述のL2タンパクの一部のみ
に夫々対応するが、これらの各群のポリペプチドは該当
する類のL2タンパクの特徴的抗原部位を常に含んでい
る。
【００８４】本発明のポリペプチドは、精製した場合、
該ポリペプチドに対応する抗体、特にこれらのポリペプ
チドにより感作された動物の血清から得られた抗体の精
製技術で使用することができる。特に、これらのポリペ
プチドはアフィニティカラムに固定することができる。
抗体の精製操作は、該ポリペプチドを含んでいるアフィ
ニティカラムに抗体を含んでいる血清を接触させること
から成る。これらのカラムに選択的に固定された抗体
は、次に適当なイオン強度を有する適当な緩衝液、例え
ば酢酸アンモニウムのような塩溶液を使用する抗原-抗
体複合体解離により回収され得る。また酸性溶液を使用
してもよい。
該ポリペプチドに対応する抗体、特にこれらのポリペプ
チドにより感作された動物の血清から得られた抗体の精
製技術で使用することができる。特に、これらのポリペ
プチドはアフィニティカラムに固定することができる。
抗体の精製操作は、該ポリペプチドを含んでいるアフィ
ニティカラムに抗体を含んでいる血清を接触させること
から成る。これらのカラムに選択的に固定された抗体
は、次に適当なイオン強度を有する適当な緩衝液、例え
ば酢酸アンモニウムのような塩溶液を使用する抗原-抗
体複合体解離により回収され得る。また酸性溶液を使用
してもよい。
【００８５】最後に、本発明はこれらの抗原(又は抗原
群)及び抗体(又は抗体群)を使用する組成物に係る。
群)及び抗体(又は抗体群)を使用する組成物に係る。
【００８６】特に、本発明は所与の型の疾患にしばしば
存在すると見なされる乳頭腫ウイルスの集合から誘導さ
れた抗体の1種又は好ましくは「カクテル」を含む群に係
る。該当患者からの組織又は細胞採取物のインビトロ診
断試験後に所与の疾患は臨床診断されている筈である
し、あるいはインビトロ診断の結果、感染乳頭腫ウイル
スは上記集合の乳頭腫ウイルスの1種に類似する型に属
することが判明している筈であるから、これらのカクテ
ル(適当な薬学的賦形剤と共にこれらの抗体又は抗体
群、即ち血清混合物又は精製抗体組成物を含む)はこの
場合、この疾患の治療にあたり、患者に特に非経口経路
で投与することにより使用できる。従って、これらの血
清は対応する型又は亜型の乳頭腫ウイルスにより誘導さ
れる感染を退行させ得る。
存在すると見なされる乳頭腫ウイルスの集合から誘導さ
れた抗体の1種又は好ましくは「カクテル」を含む群に係
る。該当患者からの組織又は細胞採取物のインビトロ診
断試験後に所与の疾患は臨床診断されている筈である
し、あるいはインビトロ診断の結果、感染乳頭腫ウイル
スは上記集合の乳頭腫ウイルスの1種に類似する型に属
することが判明している筈であるから、これらのカクテ
ル(適当な薬学的賦形剤と共にこれらの抗体又は抗体
群、即ち血清混合物又は精製抗体組成物を含む)はこの
場合、この疾患の治療にあたり、患者に特に非経口経路
で投与することにより使用できる。従って、これらの血
清は対応する型又は亜型の乳頭腫ウイルスにより誘導さ
れる感染を退行させ得る。
【００８７】最後に本発明は、選択された投与方法、特
に対応する疾患に罹患している危険の高い人を保護する
ために使用可能な非経口経路の投与方法に適合する薬学
的に許容可能な賦形剤と共に、1又は好ましくは数種のL
2タンパクを含む対応するワクチン組成物に係る。
に対応する疾患に罹患している危険の高い人を保護する
ために使用可能な非経口経路の投与方法に適合する薬学
的に許容可能な賦形剤と共に、1又は好ましくは数種のL
2タンパクを含む対応するワクチン組成物に係る。
【００８８】最後に、読者が明細書を十分に理解するの
に有益と思われる限りにおいて、従来技術の状態の説明
を必要の範囲内で補う参考文献の論文を参照されたい。
従って、これらの論文の内容は明細書の一部を形成する
ものとみなされるべきである。
に有益と思われる限りにおいて、従来技術の状態の説明
を必要の範囲内で補う参考文献の論文を参照されたい。
従って、これらの論文の内容は明細書の一部を形成する
ものとみなされるべきである。
【００８９】さて、所与の乳頭腫ウイルスの遺伝子L2の
読み取り相のフラグメントを利用するタンパクL2(又は
このタンパク質のフラグメント)を産生させるために好
適な方法を、まず読み取り相のこれらのフラグメントを
含むベクター構造に関して、次に大腸菌中のL2タンパク
又はこのポリペプチドの発現を誘導し得る条件に関して
説明しよう。また、タンパク又はこのポリペプチドの精
製方法、及びこれらのタンパク又はこのポリペプチドに
対する抗体を含む血清の製造における該精製方法の使用
例についても記載する。
読み取り相のフラグメントを利用するタンパクL2(又は
このタンパク質のフラグメント)を産生させるために好
適な方法を、まず読み取り相のこれらのフラグメントを
含むベクター構造に関して、次に大腸菌中のL2タンパク
又はこのポリペプチドの発現を誘導し得る条件に関して
説明しよう。また、タンパク又はこのポリペプチドの精
製方法、及びこれらのタンパク又はこのポリペプチドに
対する抗体を含む血清の製造における該精製方法の使用
例についても記載する。
【００９０】当業者にとっては自明のことであるが、L2
の読み取り相の使用されるフラグメントは、使用される
ベクターで常に同相で融合させるべきであり、場合によ
っては安定性を確保し且つこうして形成されるハイブリ
ッドタンパク質のその後の精製を容易にするタンパク質
のコード化遺伝子が使用される。
の読み取り相の使用されるフラグメントは、使用される
ベクターで常に同相で融合させるべきであり、場合によ
っては安定性を確保し且つこうして形成されるハイブリ
ッドタンパク質のその後の精製を容易にするタンパク質
のコード化遺伝子が使用される。
【００９１】製造順序は添付した図11に示してある。
【００９２】材料及び方法 1)DNAの処理 DNAの組換え、プラスミドとDNAフラグメントとの形成、
新しい末端の形成、酵素Bal31による消化及び細胞のト
ランスフェクションに関しては、Cold Spring Harbor L
aboratory, Cold Spring Harbor, NEW-YORK, U.S.A.の
著書"A Laboratory Manuel"の"Molecular cloning"の章
に記載されているManiatis, T.他(1982)の方法を援用し
た。
新しい末端の形成、酵素Bal31による消化及び細胞のト
ランスフェクションに関しては、Cold Spring Harbor L
aboratory, Cold Spring Harbor, NEW-YORK, U.S.A.の
著書"A Laboratory Manuel"の"Molecular cloning"の章
に記載されているManiatis, T.他(1982)の方法を援用し
た。
【００９３】2)細菌、プラスミド及びウイルス プラスミドDNAは、大腸菌(細胞C600)に含まれるpHPVI.a
(Danos他、1982及び1982年4月5日付仏国特許出願第82 0
5887号)、細胞RRI(queen, 1983)に含有されていたpCQV2
及び細胞MC 1000(Casadaban,1983)に含有されていたpMC
1403から得た。
(Danos他、1982及び1982年4月5日付仏国特許出願第82 0
5887号)、細胞RRI(queen, 1983)に含有されていたpCQV2
及び細胞MC 1000(Casadaban,1983)に含有されていたpMC
1403から得た。
【００９４】構成した遺伝子間プラスミド及びプラスミ
ドpHPL2を、大腸菌MM294の細胞に数回通し、プラスミド
pHPL2-β-ガラクトシダーゼはβ-ガラクトシダーゼを欠
失する細胞MC1000に通した。ラクトースを含むMc Conke
yの寒天培地(Silhavy他、1984,"Experiments with gene
fusions":Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spri
ng Harbor, NEW-YORK)で、菌株Lac+を赤いコロニーの形
態で検出した。
ドpHPL2を、大腸菌MM294の細胞に数回通し、プラスミド
pHPL2-β-ガラクトシダーゼはβ-ガラクトシダーゼを欠
失する細胞MC1000に通した。ラクトースを含むMc Conke
yの寒天培地(Silhavy他、1984,"Experiments with gene
fusions":Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spri
ng Harbor, NEW-YORK)で、菌株Lac+を赤いコロニーの形
態で検出した。
【００９５】次に、プロテアーゼを欠失する菌株lon-、
CAG1139(Grossman他、1983,Cell32,151-159)に、プラス
ミドpHPL2及びpHPL2-β-galをトランスフェクトした。
CAG1139(Grossman他、1983,Cell32,151-159)に、プラス
ミドpHPL2及びpHPL2-β-galをトランスフェクトした。
【００９６】3)細菌溶解質の生成及び該溶解質のドデシ
ル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル分析(SDS-PA
GE) 一晩培養後、pHPL2又はpHPL2-β-gal116を含む細胞CAG1
139をLB溶媒で5〜20倍に希釈した。次に光学密度OD600
が0.5〜0.9に達するまで細胞を30℃で培養した。
ル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル分析(SDS-PA
GE) 一晩培養後、pHPL2又はpHPL2-β-gal116を含む細胞CAG1
139をLB溶媒で5〜20倍に希釈した。次に光学密度OD600
が0.5〜0.9に達するまで細胞を30℃で培養した。
【００９７】次に、細胞を90分間で41℃にすることによ
りλ-PRプロモータを抑制解除した。培養物を再び遠心
分離し、沈降物を収集し、SDS2％、グリセロール26％、
2Mの2-メルカプトエタノール、及びブロモフェノールブ
ルー0.03％を含有する溶媒62mM Tris, pH6.8に懸濁させ
た。プラスミドを含んでいない細胞CAG1139の溶解質を
対照として使用した。
りλ-PRプロモータを抑制解除した。培養物を再び遠心
分離し、沈降物を収集し、SDS2％、グリセロール26％、
2Mの2-メルカプトエタノール、及びブロモフェノールブ
ルー0.03％を含有する溶媒62mM Tris, pH6.8に懸濁させ
た。プラスミドを含んでいない細胞CAG1139の溶解質を
対照として使用した。
【００９８】100℃で10分間処理後、Laemli(1970), Nat
ure, 227, 680-684の技術に従って、試料に対して10％
のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。既
知の分子量を有する予め着色したBRLタンパクに対して
同様に電気泳動を実施した。
ure, 227, 680-684の技術に従って、試料に対して10％
のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。既
知の分子量を有する予め着色したBRLタンパクに対して
同様に電気泳動を実施した。
【００９９】「アミドブラック」の呼称で知られている着
色剤で着色することにより、タンパク質のバンドを可視
化させ、ニトロセルロース膜に移して所謂「ウェスタン
ブロット」(ウェスタン転写)により分析した。
色剤で着色することにより、タンパク質のバンドを可視
化させ、ニトロセルロース膜に移して所謂「ウェスタン
ブロット」(ウェスタン転写)により分析した。
【０１００】4)分析 乳頭腫ウイルスのポリクローナル抗体(Orth他(1978),Vi
rology91, 243-255及び前出のRosetto他)と、Raifortの
ペルオキシダーゼに結合された抗ラット及び抗ウサギ免
疫グロブリンIgGとを使用することにより、Rosetto他(1
984)J.Gen. Virol. 65, 1319-1324に記載されているよ
うに、「ウエスタンブロット」による分析を実施した。
rology91, 243-255及び前出のRosetto他)と、Raifortの
ペルオキシダーゼに結合された抗ラット及び抗ウサギ免
疫グロブリンIgGとを使用することにより、Rosetto他(1
984)J.Gen. Virol. 65, 1319-1324に記載されているよ
うに、「ウエスタンブロット」による分析を実施した。
【０１０１】5)抗体の分析 精製されたHPVl.aのウイルス粒子又は異なる型の乳頭腫
ウイルスにより誘導された病変の切片を使用することに
より、従来記載されている免疫拡散、免疫蛍光及び免疫
ペルオキシダーゼ法(Orth他、1984及びRosetto他、198
4)を使用した。
ウイルスにより誘導された病変の切片を使用することに
より、従来記載されている免疫拡散、免疫蛍光及び免疫
ペルオキシダーゼ法(Orth他、1984及びRosetto他、198
4)を使用した。
【０１０２】6)融合タンパクL2-β-ガラクトシダーゼの
精製 pHPL2-β-ガラクトシダーゼ116を含有するCAG1139の培
養物をLB溶媒で200倍に希釈し、D.O.600が0.32に達する
まで培養した。次に培養物を急速に41℃にし、高温で90
分間培養した。
精製 pHPL2-β-ガラクトシダーゼ116を含有するCAG1139の培
養物をLB溶媒で200倍に希釈し、D.O.600が0.32に達する
まで培養した。次に培養物を急速に41℃にし、高温で90
分間培養した。
【０１０３】細胞沈降物を溶媒Tris20mM,pH7.5, MgCl21
0mMに再懸濁させ、超音波で細胞破壊処理した。
0mMに再懸濁させ、超音波で細胞破壊処理した。
【０１０４】Ullmann(1984). Gene29, 27-31により記載
されているように、調製物に可溶性の融合タンパクを、
p-アミノフェニル-β-D-チオガラクトシド(TPEG)-SEPHA
ROSEカラムでアフィニティクロマトグラフィにより精製
した。
されているように、調製物に可溶性の融合タンパクを、
p-アミノフェニル-β-D-チオガラクトシド(TPEG)-SEPHA
ROSEカラムでアフィニティクロマトグラフィにより精製
した。
【０１０５】上記のように精製した融合タンパクを使用
してHarley雌ラットに免疫感作した。動物には、完全フ
ロイントアジュバント(DIFCO)の存在下で2〜3週間の間
隔で異なる部位に約150ccのタンパク質を3回皮下注射し
た。3回目の注射から1週間後に血清を採取した。
してHarley雌ラットに免疫感作した。動物には、完全フ
ロイントアジュバント(DIFCO)の存在下で2〜3週間の間
隔で異なる部位に約150ccのタンパク質を3回皮下注射し
た。3回目の注射から1週間後に血清を採取した。
【０１０６】結果 大腸菌内でL2読み取り枠を発現することの可能なプラス
ミドの構造 構造は図１に示した。L2読み取り枠をクローニングして
大腸菌内で発現させた。プラスミドpHPVl.aは、Danos他
(EMBO J.l,p.231-236,1982)によりプラスミドpBR322のB
amHＩ部位でクローニングされたHPVl.aの完全なゲノム
を含んでいる。ウイルスゲノムの後期領域から読み取り
枠を単離するために、プラスミドpBR322内でプラスミド
pHPV 1.aのフラグメントHindIII-HpaIIをサブクローニ
ングした。得られたプラスミドをpHPL9とした。領域pBR
322における非本質的なフラグメントBamHI-pVuIIを除去
することにより、このプラスミドを短縮した。得られた
プラスミドpHPL9.3から、5'末端の318対を除く読み取り
枠の1526塩基対(p.b.)を含むフラグメントXhoII-XmnＩ
を単離した。
ミドの構造 構造は図１に示した。L2読み取り枠をクローニングして
大腸菌内で発現させた。プラスミドpHPVl.aは、Danos他
(EMBO J.l,p.231-236,1982)によりプラスミドpBR322のB
amHＩ部位でクローニングされたHPVl.aの完全なゲノム
を含んでいる。ウイルスゲノムの後期領域から読み取り
枠を単離するために、プラスミドpBR322内でプラスミド
pHPV 1.aのフラグメントHindIII-HpaIIをサブクローニ
ングした。得られたプラスミドをpHPL9とした。領域pBR
322における非本質的なフラグメントBamHI-pVuIIを除去
することにより、このプラスミドを短縮した。得られた
プラスミドpHPL9.3から、5'末端の318対を除く読み取り
枠の1526塩基対(p.b.)を含むフラグメントXhoII-XmnＩ
を単離した。
【０１０７】L2読み取り枠の終止コドンを保存した。
【０１０８】得られたL2フラグメントを次に、非本質的
なフラグメントBamHI-PvuIIの代わりにpCQV2発現ベクタ
ー(queen1983)に挿入した。こうして、L2読み取り枠
は、開始ATGコドン及びλファージのcro遺伝子の配列SD
(Shine及びDargarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71,
p.1342-1346,1974)に直接隣接しており、λPRプロモー
タの制御下にある。プロモータは温度に敏感な抑制剤CI
857により調節されるので、L2の発現生成物の産生を制
御することができる。こうしてL2読み取り枠のC末端部
の1206塩基対がλファージのcroの開始ATGコドンと同相
であるようなプラスミドpHPL2が得られた。解読相につ
いては、BamHＩ/BglIIの交差点における制限部位XhoII
の存在により立証した。
なフラグメントBamHI-PvuIIの代わりにpCQV2発現ベクタ
ー(queen1983)に挿入した。こうして、L2読み取り枠
は、開始ATGコドン及びλファージのcro遺伝子の配列SD
(Shine及びDargarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71,
p.1342-1346,1974)に直接隣接しており、λPRプロモー
タの制御下にある。プロモータは温度に敏感な抑制剤CI
857により調節されるので、L2の発現生成物の産生を制
御することができる。こうしてL2読み取り枠のC末端部
の1206塩基対がλファージのcroの開始ATGコドンと同相
であるようなプラスミドpHPL2が得られた。解読相につ
いては、BamHＩ/BglIIの交差点における制限部位XhoII
の存在により立証した。
【０１０９】大腸菌内で合成されたL2タンパクを安定化
させ、該タンパクを精製するのに好適な方法を提供する
目的で、大腸菌のβ-ガラクトシダーゼと融合したハイ
ブリッドタンパクと同様に該タンパクを発現させること
に決定した。
させ、該タンパクを精製するのに好適な方法を提供する
目的で、大腸菌のβ-ガラクトシダーゼと融合したハイ
ブリッドタンパクと同様に該タンパクを発現させること
に決定した。
【０１１０】このためには、BstEII部位でプラスミドpH
PL2を直線状にしてから酵素Bal31で消化させ、L2終始コ
ドンを除去した。
PL2を直線状にしてから酵素Bal31で消化させ、L2終始コ
ドンを除去した。
【０１１１】遺伝子L2と転写及び翻訳信号を供給する配
列とを含むこのDNAを、PstIによる消化によって短縮
し、フラグメントPstI-SmaIの代わりにプラスミドpMC14
03(Casadaban, Methods in enzymology 100,p.293-308,
1983)に挿入した。
列とを含むこのDNAを、PstIによる消化によって短縮
し、フラグメントPstI-SmaIの代わりにプラスミドpMC14
03(Casadaban, Methods in enzymology 100,p.293-308,
1983)に挿入した。
【０１１２】PMC1403は、プロモータを含まないlacオペ
ロンと、β-ガラクトシダーゼの遺伝子の読み取り相の
最初の22塩基対とを含んでいる。組換え体を細胞 MC100
0, lac-にトランスフェクトした。クローン中で高温で
β-ガラクトシダーゼを産生させると、L2とβ-ガラクト
シダーゼとが同相であるようなプラスミドpHPL2βgal
を、Mc.Condeyラクトース寒天培地(Silhavez他、Cold.S
pring Harbor Laboratory, N.Y.1984)で選択することが
できた。
ロンと、β-ガラクトシダーゼの遺伝子の読み取り相の
最初の22塩基対とを含んでいる。組換え体を細胞 MC100
0, lac-にトランスフェクトした。クローン中で高温で
β-ガラクトシダーゼを産生させると、L2とβ-ガラクト
シダーゼとが同相であるようなプラスミドpHPL2βgal
を、Mc.Condeyラクトース寒天培地(Silhavez他、Cold.S
pring Harbor Laboratory, N.Y.1984)で選択することが
できた。
【０１１３】このような方法に従って選択されたクロー
ンpHPL2、βgal116を後で調査した。
ンpHPL2、βgal116を後で調査した。
【０１１４】DNAの配列(その結果についてはここでは示
さない)を検討した処、L2読み取り枠の最後の2個のC末
端アミノ酸のみがBal31による消化の過程で失われてい
ること、及びL2読み取り枠により発現される生成物はプ
ロリンを介してβ-ガラクトシダーゼの9番目のアミノ酸
に結合されていることがわかった。
さない)を検討した処、L2読み取り枠の最後の2個のC末
端アミノ酸のみがBal31による消化の過程で失われてい
ること、及びL2読み取り枠により発現される生成物はプ
ロリンを介してβ-ガラクトシダーゼの9番目のアミノ酸
に結合されていることがわかった。
【０１１５】pHPL2及びpHPL2βgal116でトランスフェク
トした細胞によるHPVl.aと同種のタンパク質の産生 プラスミドpHPL2は、約51.2KdのL2タンパクをコード
し、及び約167Kdのハイブリッドタンパク質のpHPL-βga
lの容量を有している。
トした細胞によるHPVl.aと同種のタンパク質の産生 プラスミドpHPL2は、約51.2KdのL2タンパクをコード
し、及び約167Kdのハイブリッドタンパク質のpHPL-βga
lの容量を有している。
【０１１６】これらのプラスミドによるタンパク質の産
生を検討するために、まずプロテアーゼを欠失する大腸
菌CAG1139lon-の菌株にこれらのプラスミドをトランス
フェクトした。次に細胞を30℃、次に41℃で培養し、λ
PRプロモータの制御下でタンパク質の産生を誘導した。
得られた細菌溶解質に対して、SDS-ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を実施した。
生を検討するために、まずプロテアーゼを欠失する大腸
菌CAG1139lon-の菌株にこれらのプラスミドをトランス
フェクトした。次に細胞を30℃、次に41℃で培養し、λ
PRプロモータの制御下でタンパク質の産生を誘導した。
得られた細菌溶解質に対して、SDS-ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を実施した。
【０１１７】抗ウイルスHPVl.a抗体を使用して所謂「ウ
ェスタンブロット」法に従って分析した処、ウイルスHPV
l.aと同種のタンパク質が認識された。30℃にした培養
物の分析結果は、プラスミドを含むか又は含まない細胞
については同様であったが、41℃にした細胞の場合、ト
ランスフェクトした細胞中にタンパク質の特異的バンド
が示され、組換え体pHPL2-βgal116でトランスフェクト
した細胞から単離されたタンパク質のうち、融合タンパ
クL2β-ガラクトシダーゼ(L2-βgal)に対応する約136Kd
の期待分子量を有する主要なバンドと、恐らくタンパク
分解の結果であると考えられる約58Kdの分子量の数個の
小さいバンドとが単離された。
ェスタンブロット」法に従って分析した処、ウイルスHPV
l.aと同種のタンパク質が認識された。30℃にした培養
物の分析結果は、プラスミドを含むか又は含まない細胞
については同様であったが、41℃にした細胞の場合、ト
ランスフェクトした細胞中にタンパク質の特異的バンド
が示され、組換え体pHPL2-βgal116でトランスフェクト
した細胞から単離されたタンパク質のうち、融合タンパ
クL2β-ガラクトシダーゼ(L2-βgal)に対応する約136Kd
の期待分子量を有する主要なバンドと、恐らくタンパク
分解の結果であると考えられる約58Kdの分子量の数個の
小さいバンドとが単離された。
【０１１８】構造pHPL2については、約72Kdのタンパク
質のバンドが見出だされた。この分子量は51.2Kdの予想
分子量よりも大きい。この差の意味については解明の余
地がある。
質のバンドが見出だされた。この分子量は51.2Kdの予想
分子量よりも大きい。この差の意味については解明の余
地がある。
【０１１９】次に、大腸菌中で産生されたタンパク質の
抗原性を検討するために、熱誘導培養株の細菌溶解質の
生成物L2-βgalをTREG-SEPHAROSEカラム(Ullman, Gene
29,p.27-31,1984)でアフィニティクロマトグラフィによ
り精製した。カラムから溶離されたタンパク質をSDS-ポ
リアクリルアミドゲルで分析した。「アミドブラック」で
着色した処、3個の主要なタンパク質のバンド、即ちL2-
βgalハイブリッドタンパクに対応すると思われる高分
子量バンドと、精製したβ-ガラクトシダーゼと共に移
動する第２のバンドと、約60Kdの分子量を有する第３の
バンドとが認められた。
抗原性を検討するために、熱誘導培養株の細菌溶解質の
生成物L2-βgalをTREG-SEPHAROSEカラム(Ullman, Gene
29,p.27-31,1984)でアフィニティクロマトグラフィによ
り精製した。カラムから溶離されたタンパク質をSDS-ポ
リアクリルアミドゲルで分析した。「アミドブラック」で
着色した処、3個の主要なタンパク質のバンド、即ちL2-
βgalハイブリッドタンパクに対応すると思われる高分
子量バンドと、精製したβ-ガラクトシダーゼと共に移
動する第２のバンドと、約60Kdの分子量を有する第３の
バンドとが認められた。
【０１２０】分子量の小さいこのタンパク質は汚染物に
対応し得る。HPVl.a型の特異抗体を使用する「ウェスタ
ンブロット」法による分析の結果、発現生成物L2-βgal
に対応する高分子量の主要なバンドと、数個の二次的な
バンドとが認められた（図3b）。
対応し得る。HPVl.a型の特異抗体を使用する「ウェスタ
ンブロット」法による分析の結果、発現生成物L2-βgal
に対応する高分子量の主要なバンドと、数個の二次的な
バンドとが認められた（図3b）。
【０１２１】生成物L2-βgalの免疫性 融合タンパクの免疫性を試験するために、2匹のラット
に溶離物を注射した。3回目の注射後に血清を収集し
た。得られた血清を、夫々プラスミドpHPL2-βgal116又
はプラスミドpHPL2を含む熱誘導培養株の細菌溶解質中
で「ウェスタンブロット」分析により、融合タンパクL2-
βgal又は生成物L2と同様に移動するバンドと反応させ
た。
に溶離物を注射した。3回目の注射後に血清を収集し
た。得られた血清を、夫々プラスミドpHPL2-βgal116又
はプラスミドpHPL2を含む熱誘導培養株の細菌溶解質中
で「ウェスタンブロット」分析により、融合タンパクL2-
βgal又は生成物L2と同様に移動するバンドと反応させ
た。
【０１２２】2種類の型の細胞溶解質で、血清は対照溶
解質CAG1139にも見出だされるタンパク質(約60及び55K
d)を認識した。これらのタンパク質の少なくとも一種
は、融合タンパクL2-βgal及びβガラクトシダーゼと同
時に生成されたタンパク質に対応するように思われる。
解質CAG1139にも見出だされるタンパク質(約60及び55K
d)を認識した。これらのタンパク質の少なくとも一種
は、融合タンパクL2-βgal及びβガラクトシダーゼと同
時に生成されたタンパク質に対応するように思われる。
【０１２３】血清は、解離されたウイルス調製物HPVl.a
(デタージェント処理)及びHPVl.aにより誘導されたいぼ
の抽出物中で、約80Kdのタンパク質を認識した。
(デタージェント処理)及びHPVl.aにより誘導されたいぼ
の抽出物中で、約80Kdのタンパク質を認識した。
【０１２４】免疫拡散試験において、得られたラット血
清は抗原として使用された未処理のウイルス粒子HPVl.a
を沈降させず、従って、免疫トランスファー法で血清に
より認識されるウイルス抗原はビリオンの表面では得ら
れないこと、及び血清は沈降しないことが更に判明し
た。
清は抗原として使用された未処理のウイルス粒子HPVl.a
を沈降させず、従って、免疫トランスファー法で血清に
より認識されるウイルス抗原はビリオンの表面では得ら
れないこと、及び血清は沈降しないことが更に判明し
た。
【０１２５】ビリオン及びウイルスポリペプチドの天然
高次構造を保存するために知られている凍結いぼ切片HP
Vl.aでは、L2の発現生成物から得た血清は反応しなかっ
た。この結果から、抗体は配座抗原に向けられていない
ことがわかる。
高次構造を保存するために知られている凍結いぼ切片HP
Vl.aでは、L2の発現生成物から得た血清は反応しなかっ
た。この結果から、抗体は配座抗原に向けられていない
ことがわかる。
【０１２６】血清は、BOUIN溶媒に固定されたHPVl.aに
感染したいぼ切片とはほとんど反応しなかった(希釈度1
/50)。この結果から、ウイルスに感染しており且つBOUI
N溶媒に固定された切片でより強い抗原-抗体反応を生じ
る群の抗原に対して該当型の抗原の特異的特徴が確認さ
れる。
感染したいぼ切片とはほとんど反応しなかった(希釈度1
/50)。この結果から、ウイルスに感染しており且つBOUI
N溶媒に固定された切片でより強い抗原-抗体反応を生じ
る群の抗原に対して該当型の抗原の特異的特徴が確認さ
れる。
【０１２７】一方、CARNOY溶媒により切片を観察した
処、抗原型及び抗原群のどちらも正の反応が認められ
た。特に、切片が試験で使用された抗体の起源である抗
原を提供したと同一型のウイルスを含んでいた場合、ラ
ットの血清は非常に強い抗原-抗体反応(1/1000の希釈
度)をもたらすことが確認された。これに対して、被調
査血清を別の型に属するウイルスを含む切片と接触させ
た場合、交差免疫反応は何も認められなかった。
処、抗原型及び抗原群のどちらも正の反応が認められ
た。特に、切片が試験で使用された抗体の起源である抗
原を提供したと同一型のウイルスを含んでいた場合、ラ
ットの血清は非常に強い抗原-抗体反応(1/1000の希釈
度)をもたらすことが確認された。これに対して、被調
査血清を別の型に属するウイルスを含む切片と接触させ
た場合、交差免疫反応は何も認められなかった。
【０１２８】銘記すべき点として、抗原に予想される型
は、2種の異なる乳頭腫ウイルスのゲノムの相互ハイブ
リダイゼーション能力に関して上述したような型と常に
一致している必要はない。
は、2種の異なる乳頭腫ウイルスのゲノムの相互ハイブ
リダイゼーション能力に関して上述したような型と常に
一致している必要はない。
【０１２９】乳頭腫ウイルスに存在する抗原として特に
2種類、即ち、 −完全ビリオンの注入後に得られる抗体を使用すること
により、各種の乳頭腫ウイルス間の交差抗原反応の不在
により特徴付けられる型の抗原、及び −本質的にビリオン中に遮蔽されており、解離されたウ
イルス粒子の注入後に抗体により露呈される類の抗原、
に区別される。
2種類、即ち、 −完全ビリオンの注入後に得られる抗体を使用すること
により、各種の乳頭腫ウイルス間の交差抗原反応の不在
により特徴付けられる型の抗原、及び −本質的にビリオン中に遮蔽されており、解離されたウ
イルス粒子の注入後に抗体により露呈される類の抗原、
に区別される。
【０１３０】抗原-抗体反応試験で異なる型に属する乳
頭腫ウイルスは、好ましくは夫々の相同領域を欠くL2コ
ード配列が夫々の抗体で抗原-抗体交差反応を生じさせ
ないポリペプチドをコードするような乳頭腫ウイルスで
ある。
頭腫ウイルスは、好ましくは夫々の相同領域を欠くL2コ
ード配列が夫々の抗体で抗原-抗体交差反応を生じさせ
ないポリペプチドをコードするような乳頭腫ウイルスで
ある。
【０１３１】好適な型の抗原は、特に該当するL2領域の
長さの1/4にわたってN末端領域を欠く遺伝子L2の読み取
り枠によりコードされた抗原である。
長さの1/4にわたってN末端領域を欠く遺伝子L2の読み取
り枠によりコードされた抗原である。
【０１３２】最後に本発明は、異なる型に属するウイル
ス中で、交差反応を生じないL2領域によりコードされた
ポリペプチドの型を求めるために実施される試験にも係
る。これらのポリペプチドは、Carnoy溶媒に固定された
組織又は細胞切片に含まれるウイルスと効果的に反応す
る抗体を含むが、Bouin溶媒により固定されている同一切
片とは不十分にしか反応しないかあるいは全く反応しな
いようなポリペプチドとして規定され得る。
ス中で、交差反応を生じないL2領域によりコードされた
ポリペプチドの型を求めるために実施される試験にも係
る。これらのポリペプチドは、Carnoy溶媒に固定された
組織又は細胞切片に含まれるウイルスと効果的に反応す
る抗体を含むが、Bouin溶媒により固定されている同一切
片とは不十分にしか反応しないかあるいは全く反応しな
いようなポリペプチドとして規定され得る。
【０１３３】本発明は更に、既知の乳頭腫ウイルスに対
して新規乳頭腫ウイルスを分類する方法にも係る。
して新規乳頭腫ウイルスを分類する方法にも係る。
【０１３４】更に、本発明は場合によっては患者の体内
に存在している感染ウイルスの型の同定を含む診断方法
にも係り、該方法は、異なる型に属するウイルスに対し
て予め得られた抗原を、試験すべき患者からの生物採取
物、特に血清と反応させることから成る。
に存在している感染ウイルスの型の同定を含む診断方法
にも係り、該方法は、異なる型に属するウイルスに対し
て予め得られた抗原を、試験すべき患者からの生物採取
物、特に血清と反応させることから成る。
【０１３５】血清採取物とこの同一型に属する乳頭腫ウ
イルスからの抗原との間に抗原-抗体反応が観察される
なら、感染ウイルスは所定の型に属するものと見なされ
る。この診断試験は、例えばELISA法を使用することに
より実施され得る。
イルスからの抗原との間に抗原-抗体反応が観察される
なら、感染ウイルスは所定の型に属するものと見なされ
る。この診断試験は、例えばELISA法を使用することに
より実施され得る。
【０１３６】より特定的には、本発明は組織又は流体の
ようなヒト生物試料、例えば血清中の感染乳頭腫ウイル
スが所与の型の乳頭腫ウイルスに属するか否かを検出す
る方法に係る。この方法は、この生物試料を、この型に
属するウイルスのゲノムの領域L2の少なくとも一部を含
むDNAの発現生成物に対して予め形成された抗体と接触
させることを特徴とし、この接触は免疫反応を可能にす
る条件下及び時間内で実施される。抗原-抗体複合体の
形成が検出されると、上記発現生成物の起源である型と
同一又は同種の型を有する乳頭腫ウイルスの存在が証明
される。
ようなヒト生物試料、例えば血清中の感染乳頭腫ウイル
スが所与の型の乳頭腫ウイルスに属するか否かを検出す
る方法に係る。この方法は、この生物試料を、この型に
属するウイルスのゲノムの領域L2の少なくとも一部を含
むDNAの発現生成物に対して予め形成された抗体と接触
させることを特徴とし、この接触は免疫反応を可能にす
る条件下及び時間内で実施される。抗原-抗体複合体の
形成が検出されると、上記発現生成物の起源である型と
同一又は同種の型を有する乳頭腫ウイルスの存在が証明
される。
【０１３７】好ましくは、L2領域又は対応部分を含むDN
Aを、細菌例えば大腸菌のようなコンピテント細胞宿主
内でクローニングした。
Aを、細菌例えば大腸菌のようなコンピテント細胞宿主
内でクローニングした。
【０１３８】有利には、使用されるL2領域部分は型の非
特徴的N末端領域を欠失している遺伝子L2の読み取り枠
に対応する。好ましくは、このN末端領域はこの読み取
り枠の4分の1に対応する。
特徴的N末端領域を欠失している遺伝子L2の読み取り枠
に対応する。好ましくは、このN末端領域はこの読み取
り枠の4分の1に対応する。
【０１３９】より特定的には、本発明は上記L2領域部分
(又はL2領域全体)を含むDNAが選択されたコンピテント
細胞宿主内で通常発現可能なタンパク質をコードする核
酸から形成されたハイブリッドDNAであり、上記L2領域
が特にインビトロ再結合により予め取り込まれているよ
うなこの型の検出方法に係る。
(又はL2領域全体)を含むDNAが選択されたコンピテント
細胞宿主内で通常発現可能なタンパク質をコードする核
酸から形成されたハイブリッドDNAであり、上記L2領域
が特にインビトロ再結合により予め取り込まれているよ
うなこの型の検出方法に係る。
【０１４０】例えば細胞宿主内で通常発現可能なタンパ
ク質は、この細胞宿主が大腸菌であるとき、β-ガラク
トシダーゼの全部又は一部に対応する。
ク質は、この細胞宿主が大腸菌であるとき、β-ガラク
トシダーゼの全部又は一部に対応する。
【０１４１】本発明の検出方法は、好ましくはCarnoy溶
媒中あるいは血清に直接固定されたあらゆる組織切片に
適用可能である。
媒中あるいは血清に直接固定されたあらゆる組織切片に
適用可能である。
【０１４２】本発明の方法は生物試料を、同一型又は同
種の型の数個のウイルス、特にDNAプローブに対して上
述の方法で再編成されたウイルスに由来するL2領域の発
現生成物、又は夫々の対応する部分に対して予め形成さ
れた抗体の「カクテル」と、上記条件で接触させることも
含む。
種の型の数個のウイルス、特にDNAプローブに対して上
述の方法で再編成されたウイルスに由来するL2領域の発
現生成物、又は夫々の対応する部分に対して予め形成さ
れた抗体の「カクテル」と、上記条件で接触させることも
含む。
【０１４３】これらの抗体の「カクテル」を使用すると、
DNAプローブに関して使用したと同様の条件下で、検出
された乳頭腫ウイルスの所与の種類への帰属と、患者が
罹患しているか又は潜在的に危険のある病気とを相関さ
せることができる。
DNAプローブに関して使用したと同様の条件下で、検出
された乳頭腫ウイルスの所与の種類への帰属と、患者が
罹患しているか又は潜在的に危険のある病気とを相関さ
せることができる。
【０１４４】最後に本発明は、上記ハイブリッドポリペ
プチド及び対応する抗体の各々の製造方法にも係る。
プチド及び対応する抗体の各々の製造方法にも係る。
【０１４５】この方法は、 −該当する乳頭腫ウイルスのゲノムのL2領域又は適当な
ベクター内の対応する領域部分の、特にインビトロの取
り込み、 −こうして修飾されたベクターで受容可能な細胞宿主、
即ち上記L2領域又は対応する部分を発現し得る宿主の形
質転換、及び −L2領域又は対応部分の発現の結果として形成されるポ
リペプチドの回収、及び好ましくは分離、から成り、こ
のポリペプチドは上記条件下で乳頭腫ウイルスのタンパ
ク質を検出することの可能な抗体をインビボで産生させ
ることが可能である。
ベクター内の対応する領域部分の、特にインビトロの取
り込み、 −こうして修飾されたベクターで受容可能な細胞宿主、
即ち上記L2領域又は対応する部分を発現し得る宿主の形
質転換、及び −L2領域又は対応部分の発現の結果として形成されるポ
リペプチドの回収、及び好ましくは分離、から成り、こ
のポリペプチドは上記条件下で乳頭腫ウイルスのタンパ
ク質を検出することの可能な抗体をインビボで産生させ
ることが可能である。
【０１４６】本発明は更に、動物、例えばウサギを上記
ポリペプチドで感作し、形成された抗体を回収すること
を特徴とする抗体の産生方法にも係る。
ポリペプチドで感作し、形成された抗体を回収すること
を特徴とする抗体の産生方法にも係る。
【０１４７】最後に本発明は、各乳頭腫ウイルスが属す
ることが確認され得る各型に従って該乳頭腫ウイルスか
ら得られるハイブリッドペプチド又は抗体の再編成を包
含することもある。
ることが確認され得る各型に従って該乳頭腫ウイルスか
ら得られるハイブリッドペプチド又は抗体の再編成を包
含することもある。
【０１４８】本明細書中で引用した参考文献は以下のと
おりである。
おりである。
【０１４９】(1) Derst, M.他、1983, Proc.Natl.Aca
d.Sci. U.S.A., 80, 3812-3845. (2) Coggin,J.R., Jr.他、1979, Cancer Res., 39, 54
5-546. (3) Gissmann, L.他、1982, J.Virol. 44, 393-400. (4) Green,M.他、1982, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 7
9, 4437-4441. (5) Heilman, C.A.他、1980, Virol. 36, 359-407. (6) Jablonska, S.他、1972, Cancer Res., 32, 583-5
89. (7) Jablonska, S.他、1982, Springer Semin. Immuno
-pathol. 5, 33-62. (8) Kremsdorf, D.他、1982, J. Virol. 43, 436-447. (9) Kremsdorf, D.他、1983, J. Virol. 48, 340-351. (10) Lutzner, M.A.他、1978, Bull. Cancer, 65, 169
-182. (11) Lutzner, M.A.他、1983, Lancet ii, 422-424. (12) Miggozi, M.他、1965, Bull.Soc.Franc.Derm.Syp
h. 72, 747-748. (13) Orth, G.他、1980, Cold Spring Harbor Conf.Ce
ll Proliferation, 7, 259-282. (14) Orth, G.他、1981, J. Invest. Dermatol. 76, 9
7-102. (15) Orth, G.他、1979, Cancer Res. 39, 1074-1082. (16) Ostrow, R.S.他、1982, Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A. 79, 1634-1638. (17) Ostrow, R.S. 他、1983, Ann.Acad.Dermatol.8,
398-404. (18) Pfister, H.他、1983, Cancer Res. 43, 1436-14
41. (19) Pfister, H. 他、1983, J.Virol. 47, 363-366. (20) Pfister, H.他、1981, Int. J. Cancer, 27, 645
-650. (21) Rueda, L.A.他、1976, Med. Cut. I.L.A. 2, 113
-136. (22) Ruiter, M.他、J. Invest.Dermatol., 47, 247-2
52. (23) Sutcliffe, J.G., 1978, Nucleic Acids Res. 5,
2721-2728. (24) Tsumori, T.他、1983, J. Gen.Virol. 64, 967-9
69.
d.Sci. U.S.A., 80, 3812-3845. (2) Coggin,J.R., Jr.他、1979, Cancer Res., 39, 54
5-546. (3) Gissmann, L.他、1982, J.Virol. 44, 393-400. (4) Green,M.他、1982, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 7
9, 4437-4441. (5) Heilman, C.A.他、1980, Virol. 36, 359-407. (6) Jablonska, S.他、1972, Cancer Res., 32, 583-5
89. (7) Jablonska, S.他、1982, Springer Semin. Immuno
-pathol. 5, 33-62. (8) Kremsdorf, D.他、1982, J. Virol. 43, 436-447. (9) Kremsdorf, D.他、1983, J. Virol. 48, 340-351. (10) Lutzner, M.A.他、1978, Bull. Cancer, 65, 169
-182. (11) Lutzner, M.A.他、1983, Lancet ii, 422-424. (12) Miggozi, M.他、1965, Bull.Soc.Franc.Derm.Syp
h. 72, 747-748. (13) Orth, G.他、1980, Cold Spring Harbor Conf.Ce
ll Proliferation, 7, 259-282. (14) Orth, G.他、1981, J. Invest. Dermatol. 76, 9
7-102. (15) Orth, G.他、1979, Cancer Res. 39, 1074-1082. (16) Ostrow, R.S.他、1982, Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A. 79, 1634-1638. (17) Ostrow, R.S. 他、1983, Ann.Acad.Dermatol.8,
398-404. (18) Pfister, H.他、1983, Cancer Res. 43, 1436-14
41. (19) Pfister, H. 他、1983, J.Virol. 47, 363-366. (20) Pfister, H.他、1981, Int. J. Cancer, 27, 645
-650. (21) Rueda, L.A.他、1976, Med. Cut. I.L.A. 2, 113
-136. (22) Ruiter, M.他、J. Invest.Dermatol., 47, 247-2
52. (23) Sutcliffe, J.G., 1978, Nucleic Acids Res. 5,
2721-2728. (24) Tsumori, T.他、1983, J. Gen.Virol. 64, 967-9
69.
【図１】ＨＰＶ１ａ、ＨＰＶ２ｄ及びＨＰＶ４ａの各Ｄ
ＮＡの制限地図を示す。
ＮＡの制限地図を示す。
【図２】ＨＰＶ３ａ、ＨＰＶ１０ａ、ＨＰＶ１０ｂ、Ｈ
ＰＶ２８及びＨＰＶ２９の各ＤＮＡの制限地図を示す。
ＰＶ２８及びＨＰＶ２９の各ＤＮＡの制限地図を示す。
【図３】ＨＰＶ５ａ、ＨＰＶ１７ａ及びＨＰＶ２４の各
ＤＮＡの制限地図を示す。
ＤＮＡの制限地図を示す。
【図４ａ】ＨＰＶ５ａ、ＨＰＶ８、ＨＰＶ１２、ＨＰＶ
１４ａ及びＨＰＶ１４ｂの各ＤＮＡの制限地図を示す。
１４ａ及びＨＰＶ１４ｂの各ＤＮＡの制限地図を示す。
【図４ｂ】ＨＰＶ１９、ＨＰＶ２０、ＨＰＶ２１、ＨＰ
Ｖ２２及びＨＰＶ２３の各ＤＮＡの制限地図を示す。
Ｖ２２及びＨＰＶ２３の各ＤＮＡの制限地図を示す。
【図５】ＨＰＶ９、ＨＰＶ１５、ＨＰＶ７ａ及びＨＰＶ
７ｂの各ＤＮＡの制限地図を示す。
７ｂの各ＤＮＡの制限地図を示す。
【図６】ＨＰＶ２４ＤＮＡの制限地図を示す。
【図７】ＨＰＶ５ａ、ＨＰＶ８、ＨＰＶ１４ｂ及びＨＰ
Ｖ３２の各ＤＮＡの制限地図を示す。
Ｖ３２の各ＤＮＡの制限地図を示す。
【図８】ＨＰＶ１３及びＨＰＶ３１の各ＤＮＡの制限地
図を示す。
図を示す。
【図９】ＨＰＶ ＩＰ２ ＤＮＡの制限地図を示す。
【図１０】ＨＰＶ ＩＰ４ ＤＮＡの制限地図を示す。
【図１１】プラスミドｐＨＰＬ２βｇａｌの構築を示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 キヤロル・アン・コムリ フランス国、75015・パリ、リユ・コプロ、 ６ (72)発明者 オデール・クロワツサン フランス国、75013・パリ、リユ・アー・ ランソン、19 (72)発明者 フランソワーズ・ブレブユール フランス国、75016・パリ、リユ・モリト ール、36
Claims (11)
- 【請求項１】 過酷条件下で相互に５０％未満の交差ハ
イブリダイゼーションを示す１種又は複数種の乳頭腫ウ
イルスのＤＮＡ配列によってコードされるＥ６、Ｅ７及
び／又はＬ２蛋白質に特徴的な部位に対する少なくとも
一つの精製単離抗体を含有する抗体又は抗体混合物を、
許容できる医薬賦形剤と組合せて含む、所定の病気の状
態の発症の原因である乳頭腫ウイルス感染の治療用医薬
組成物。 - 【請求項２】 上記乳頭腫ウイルスが乳頭腫ウイルス１
又は４である請求項１に記載の医薬組成物。 - 【請求項３】 上記乳頭腫ウイルスが乳頭腫ウイルス１
０ｂ、２８又は２９であり、上記の抗体又は抗体混合物
が粘膜、皮膚、中間又は偏平いぼ、上皮内新形成及び皮
膚癌を治療できる請求項１に記載の医薬組成物。 - 【請求項４】 上記乳頭腫ウイルスが乳頭腫ウイルス３
又は１０ａを更に含む請求項３に記載の医薬組成物。 - 【請求項５】 上記乳頭腫ウイルスが乳頭腫ウイルス２
４であり、上記の抗体又は抗体混合物がいぼ状表皮異形
成を治療できる請求項１に記載の医薬組成物。 - 【請求項６】 上記乳頭腫ウイルスが乳頭腫ウイルス１
５及び１７であり、上記の抗体混合物がいぼ状表皮異形
成を治療できる請求項１に記載の医薬組成物。 - 【請求項７】 上記乳頭腫ウイルスが乳頭腫ウイルス１
４ｂ又は３２であり、上記の抗体又は抗体混合物がいぼ
状表皮異形成、上皮内新形成又は皮膚癌を治療できる請
求項１に記載の医薬組成物。 - 【請求項８】 上記乳頭腫ウイルスが乳頭腫ウイルス５
又は８を更に含む請求項７に記載の医薬組成物。 - 【請求項９】 上記乳頭腫ウイルスが乳頭腫ウイルス３
１であり、上記の抗体又は抗体混合物が口腔上皮過形成
又は口腔上皮内新形成を治療できる請求項１に記載の医
薬組成物。 - 【請求項１０】 上記乳頭腫ウイルスが乳頭腫ウイルス
１３を更に含む請求項９に記載の医薬組成物。 - 【請求項１１】 上記乳頭腫ウイルスが乳頭腫ウイルス
３２であり、上記混合物が上皮内新形成及び皮膚癌を診
断できる請求項１に記載の医薬組成物。
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| JP10112334A Expired - Lifetime JP3067734B2 (ja) | 1985-08-26 | 1998-04-22 | 新規に単離された乳頭腫ウイルスの分類方法 |
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|---|---|---|---|
| JP61504468A Expired - Lifetime JP2755574B2 (ja) | 1985-08-26 | 1986-08-22 | 乳頭腫ウイルスの特徴を示すポリペプチドを含む組成物 |
| JP8109988A Expired - Lifetime JP2818745B2 (ja) | 1985-08-26 | 1996-04-30 | 新規に単離された乳頭腫ウイルスの分類方法 |
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| DE3625257A1 (de) * | 1986-07-23 | 1988-02-04 | Behringwerke Ag | Expressionsprodukte der menschlichen papillomviren typ 16 und 18, fuer diese proteine spezifische antikoerper und diese antikoerper bzw. entsprechende dna enthaltende diagnostika |
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| FR2631341B1 (fr) * | 1988-05-13 | 1991-04-26 | Pasteur Institut | Sondes a papillomavirus hpv49, hpv50, hpv54, hpv55 et produits genetiquement et immunologiquement lies a ce papillomavirus hpv49, hpv50, hpv54, hpv55 et procede de diagnostic in vitro d'infections a papillomavirus et d'immunisation in vivo contre ces papillomavirus |
| SE8803870D0 (sv) * | 1988-10-28 | 1988-10-28 | Medscand Ab | Method for detection of human papillomavirus (hpv) for diagnostic purposes |
| FR2641081A1 (ja) * | 1988-12-23 | 1990-06-29 | Medgenix Group | |
| FR2656627B1 (fr) * | 1989-12-28 | 1992-04-17 | Pasteur Institut | Sonde a papillomavirus (hvpv63), notamment pour le diagnostic in vitro d'infections a papillomavirus, pouvant s'accompagner de neoplasies genitales, et produits genetiquement et immunologiquement lies a ce papillomavirus. |
| SE9001705D0 (sv) * | 1990-05-11 | 1990-05-11 | Medscand Ab | Saett foer diagnostik av virusbaerande tumoerer genom immunoassay |
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