JP2735537B2 - ヒト乳頭腫ウイルスｈｐｖ−３３由来の抗原性組換えペプチドおよびその発現用宿主細胞 - Google Patents
ヒト乳頭腫ウイルスｈｐｖ−３３由来の抗原性組換えペプチドおよびその発現用宿主細胞Info
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【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト乳頭腫ウイル
スＨＰＶ−33由来の抗原性組換えペプチドに関する。具
体的には、ＨＰＶ−33ゲノムに由来し、ヌクレオチド配
列決定されたＤＮＡ断片、特に、以下の方法によって、
このＤＮＡ断片によって改変した各種ベクターからなる
ＤＮＡ組換体を、その複製を可能にする適当な宿主細胞
に導入したとき発現して得られる組換えペプチドに関す
る。さらに、本発明は、そのような組換えペプチドを発
現させるための宿主細胞にも関する。 【０００２】なお、ＩＰ−２と命名された乳頭腫ウイル
ス（現在では、ＨＰＶ−33と命名）は、1985年11月29
日、第85.402362.9 号として出願された欧州特許出願中
に記載されているが、その内容は、本明細書に参考とし
て包含される。このウイルスのＤＡＮを含むプラスミド
の寄託は、第Ｉ-450号としてＣＮＣＭ（パリのパスツー
ル研究所付属の「微生物培養物の国立寄託所（Collecti
on nationale de Culture de Micro-Organismes)」）に
行った。 【０００３】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】乳頭
腫ウイルスは、パポーバウイルス科に属しており、共有
結合による閉環ＤＮＡ分子から成る約7,900 塩基対（b
p）を有する。ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）は、その
ＤＮＡ配列の相同性を基準に分類され(6) 、現在まで
に、約40の型が記録されている。ＨＰＶに関する生物学
的研究が著しく進み、それらが関与するヒトの疾病が、
分子生物学の様々な手法を応用して解明されている。性
器いぼの悪性転換から生じた腫瘍においてＨＰＶのＤＮ
Ａが検出されたことから、ヒトの癌にＨＰＶが関与して
いる可能性が考えられた(33)。さらに、子宮頚癌から２
種のＨＰＶゲノム、ＨＰＶ−16およびＨＰＶ−18がクロ
ーニングされたこと（3,11）により、社会経済的に極め
て重要なこの分野での研究が一層刺激された。これらの
ウイルスは、検査した悪性性器腫瘍の70％を越えるもの
に見いだされており、その他、ＨＰＶ−16に関連性のあ
るヌクレオチド配列が検出されたものも多い（3,16,33
）。このヌクレオチド配列の一つとして、最近、緊縮
性の低下した条件下でプローブとしてＨＰＶ−16を使用
して浸潤性子宮頸癌からクローニングされたＨＰＶ−33
を挙げることができる(1) 。 【０００４】本研究において、我々は、ＨＰＶ−33のＤ
ＮＡ配列を決定し、ＨＰＶ−16との関連を記載した。乳
頭腫ウイルスの中では、ＨＰＶ−33は特異な存在であっ
て、ＳＶ40のエンハンサーと極めて類似性の高い 78bp
の同方向反復(tandem repeat) 配列を有している（4,1
4）。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明は、図１Ａおよび
１Ｂに示されるヌクレオチド配列を有するヒト乳頭腫ウ
イルス（ＨＰＶ）−３のゲノムＤＮＡ、又はそのＨＰＶ
−33ウイルスを認識する抗体によって認識可能な免疫学
的性質を有するポリペプチドをコードするそのＤＮＡ、
を含有する挿入体を、前記ゲノムＤＮＡ又はその断片に
対し外来性のＤＮＡと融合して含む、宿主細胞中で複製
可能なＤＮＡ組換体で形質転換された宿主細胞を提供す
る。 【０００６】前記宿主細胞は、好ましくは細菌、特に大
腸菌である。また、前記ＤＮＡ組換体の具体例はベクタ
ーである。さらにまた、前記ＤＮＡ断片の例は、図１Ａ
および１Ｂに示される配列中、ヌクレオチド番号76〜55
6 ， 543〜864 ， 867〜2811，2728〜3808，3326〜357
5，3842〜4079，4198〜5611および5516〜7091の断片群
から選択されるものであるか、又はヌクレオチド番号 1
09〜556 ， 573〜864 ，879〜2811，2749〜3808，3326
〜3575，3842〜4079，4210〜5611および5594〜7091の断
片群から選択されるものであるか、又はヌクレオチド番
号1275〜1307の断片である。 【０００７】本発明はまた、ＨＰＶ−33ゲノムＤＮＡの
図１Ａおよび１Ｂに示されるヌクレオチド配列におい
て、それぞれ76〜556 ， 543〜864 ， 867〜2811，2728
〜3808，3326〜3575，3842〜4079，4198〜5611，5516〜
7091， 109〜556 ， 573〜864, 879〜2811，2749〜380
8，3326〜3575，3842〜4079，4210〜5611，5594〜709
1，1275〜1307および 229〜404 というヌクレオチド番
号で規定されるヌクレオチド末端間を占有する断片群か
ら選択されるＤＮＡ断片から推定されるアミノ酸配列を
有する、遺伝子工学的に作製されたペプチドを提供す
る。 【０００８】 【発明の実施の形態】本発明は、以降に開示するＨＰＶ
−33ゲノムのクローニング法に基づいて行われたもので
ある。この方法は、特定のＤＮＡ配列の同定を可能にす
るものである。更に、様々なハイブリダイゼーション・
プローブ、特に、ヒト組織中でＨＰＶ−33に関連した乳
頭腫ウイルスＤＮＡの検出に極めて有用な該プローブを
提供することができるＤＮＡ配列に基づいている。これ
らを用いて組織の陽性反応を検出することによって、宿
主における浸潤性子宮頸癌の発生の可能性を調べること
ができる。 【０００９】好ましい配列は、完全なタンパクをコード
するものであり、更に、表１に挙げる読み取り枠を夫々
有するヌクレオチド配列である。 【００１０】ＤＮＡヌクレオチド配列の解析条件は、以
下の「材料および方法」中に示す。この配列解析より得
られた結論は以下の検討の欄に記載する。 【００１１】材料および方法ＤＮＡ配列解析 ：本研究でヌクレオチド配列の決定を行
ったＨＰＶ−33の出発材料は、p15-5(1)であり、これ
は、ＢglIIで直線化したＨＰＶ−33ゲノムを pＢＲ322
誘導物へクローニングして構成されている。ランダムＤ
ＮＡ断片(400〜800bp)のライブラリーは、従来から記載
されている基本的な方法(28)に従って、ｐ15-5の超音波
処理および末端修復した後Ｍ13mp8 内で作製した。ＤＮ
Ａ塩基の配列決定は、ジデオキシチェーンターミネータ
ー法（19, 20）をBigginらが改良した方法(2) によって
実施した。殆どの配列は、この方法によって決定した
が、非コード領域の一部は欠落が認められたか、または
Ｍ13ライブラリー（＞300クローン）中では充分に表現
されていなかった。この領域のヌクレオチド配列は、Sm
ith の方法（24）を用いて、p15-5 から直接決定した。
すなわち、２つの「相補的」Ｍ13クローンから単離した
制限断片を使用し、制限酵素で直線化したのちエキソヌ
クレアーゼIII で処理(200単位/pmol ＤＮＡで22℃にて
１時間）してｐ15-5から調製した鋳型上でＤＮＡ合成を
開始させた。 【００１２】コンピューター解析：ＤＮＡヌクレオチド
配列を収集し、B.Caudron が修正したStadenのプログラ
ム（26, 27）を用いて解析した。ＤＮＡの塩基またはタ
ンパク質のアミノ酸の最適配列は、WilburおよびLipman
の開発した計算法（31）を用いて得られた。 【００１３】結果及び検討ＨＰＶ−33のゲノム構造 ：7909個のヌクレオチドから成
るＨＰＶ−33の完全配列は、Ｍ13ショットガン法または
ジデオキシ法により決定し、この結果を図１に示す。平
均で、各ヌクレオチド位を 6.5回の配列測定によって決
定した。その他の乳頭腫ウイルスのヌクレオチド配列に
於ける慣例に従って、番号付は、非コード領域における
ＨpqＩの認識配列に類似した部位から始めた。 【００１４】ナンセンスコドンの分布（図２）に関する
解析によれば、その他の配列決定済みのあらゆる乳頭腫
ウイルスでの場合と同様に、８つの主要な読み取り枠は
同一鎖上に位置していることが分かる。ＨＰＶ−33、お
よびＨＰＶ型1a，6bならびに16、ワタオウサギ乳頭腫ウ
イルス、および原型ウシ乳頭腫ウイルスのＢＰＶ−１、
（5,7,8,13,21,22）に幾つかの共通の性質として、初期
領域中の最大読み取り枠であるＥ1 とＥ2 及びＥ2 をコ
ードする区域中に含まれるＥ4 との間に重複が存在す
る。興味深いことに、ＨＰＶ−33の分子クローニングで
用いられるＢglII部位は、Ｅ1 とＥ2 の重複領域内に位
置している。ＢＰＶ−１以外の全ての乳頭腫ウイルスに
共通するもう１つの性質は、Ｌ1 リーディングフレーム
とＬ2 リーディングフレームとの間に重複が存在するこ
とである。Ｌ1 に続いて、892bp 非コード領域が存在
し、これには、ＢＰＶ−１(15,29）から類推して、複製
の起点および多数の転写調節因子が確実に含まれる。Ｈ
ＰＶ−33ゲノムの基本特性を表１に総括する。 【００１５】ＨＰＶ−16とのヌクレオチド配列比較：Ｈ
ＰＶ−16は、肛門生殖器の腫瘍から単離され、そのヌク
レオチド配列が完全に決定されている、ＨＰＶ−16以外
の唯一の発癌性乳頭腫ウイルスである(22)。ＨＰＶ−33
とＨＰＶ−16とでは、後者のＥ1 リーディングフレーム
が途中で切断されている以外、大概の性質は類似してい
る。Ｅ5 コード配列を除外して、ＨＰＶ−33中のコード
配列は、ＨＰＶ−16の各対応部分より若干短い。このた
めに、Ｌ1 とＥ6 （図２）間での非コード領域が76bpだ
け長くても、ゲノムのサイズが一定に保たれている。 【００１６】各読み取り枠を対にして比較する（表２）
と、Ｅ1 ，Ｅ2 ，Ｅ6 ，Ｅ7 ，Ｌ1およびＬ2 は、その
間の相同性が65〜75％であるが、Ｅ4 とＥ5 との相同性
はより発散している（約50％の相同性）。これらの知見
は、従来行われたヘテロ二重鎖解析の結果と一致する
(1)。乳頭腫ウイルスＥ1 遺伝子産物との比較研究(8)に
よれば、そのポリペプチドには、アミノ酸の可変性が極
めて高いＮ末端領域、および一次構造の保存性が非常に
よいＣ末端領域が含まれている。相同性を有する最長領
域である33個のヌクレオチド配列（1275〜1307位、図
１）が、上記ポリペプチドの可変領域をコードする領域
中のＥ1 リーディングフレームの5'末端近くに見いださ
れる。そのほか完全に同一な領域（19〜28ヌクレオチ
ド）の幾つかは、Ｅ1 ，Ｅ2 ，Ｌ2 及びＬ1 中の別の場
所に検出される。これらの配列は、ＨＰＶ−1aおよびＨ
ＰＶ−6bのような他のＨＰＶのゲノム中には認められな
いので、対応するオリゴヌクレオチドを産生し、これを
潜在性の発癌病巣からの生検材料をスクリーニングする
ための診断用ハイブリダイゼイションプローブとして使
用できる可能性がある。 【００１７】潜在的遺伝子産物：乳頭腫ウイルスの遺伝
子産物群は、純粋に構造的役割を果すと考えられている
もの（Ｌ1 およびＬ2 ）、およびウィルスの増殖と存続
に必要なものに分けられる。ＨＰＶ−33，16ならびに6b
の主要リーディングフレームのから生じると見られる産
物を比較した結果を表２に総括する。予想どおり、特に
ここに呈示したＥ1 ，Ｅ6 ，Ｅ7 ，Ｌ2 ならびにＬ1 タ
ンパクに関して、発癌性のＨＰＶ−33と16との間に著し
い同一性が認められる。保存性の置換が含まれていると
すれば、２つのＬ1 ポリペプチド間の相同性は、90％に
増大し、対応するキャプシドは抗原性からみて関連があ
るに違いないことが示唆される。これとは対照的に、良
性の性器いぼを形成するＨＰＶ−6bを含めた広範な解析
を実施すると、非常に低い相同性が検出された（表
２）。ＨＰＶ−16のタンパク群との比較を行った場合、
ＨＰＶ−33との比較より若干高い相同性の存在がＨＰＶ
−6bで明らかになり、進化上より近い関係が示唆され
た。 【００１８】非コード領域：ＨＰＶ−33の非コード領域
を検討すると、ユニークな特性、およびＨＰＶ−16の相
当物に対して極めて弱い類似性を有することが分かる。
後期転写産物に関する、Ｌ1 停止コドンと推定ポリアデ
ニル化シグナルを含むコドンとの距離は、長さ 223bp
（7097〜7320番、図１）に相当し、Ｔ＋Ｇ含量が以上に
高い（79％）。この領域内には、19bp同方向反復配列が
２コピー（ミスマッチの１コピーとともに）、およびモ
チーフ配列 TTGTRTR（ここで、ＲはＡまたはＧ）が７コ
ピー含まれる。後者は、ＨＰＶ−16の対応領域にも７回
見いだされるので、これは複製に関するタンパク群の認
識部位である可能性が示唆される。ＢＰＶ−１ゲノムで
は、この領域に初期の複製フォークが位置し（29）、さ
らに、エプシュタイン‐バール・ウイルスでは、複製の
起点に反復配列群（32）が存在することに着目しなけれ
ばならない。 【００１９】最近、検索した全ての乳頭腫ウイルスの非
コード領域のみに12bpのパリンドーム構造（ＡＣＣＧ…
…ＣＧＧＴ）の生じていることがDartmannらによって報
告された(9) 。３コピーがＨＰＶ−33ゲノム中に見いだ
され（図３）、これらは、ＨＰＶ−16の非コード領域中
と同一位を占めている。パリンドームの役割として、初
期プロモーターの調節部位の可能性が提唱されている
（4,9,15）。そして、これは、ＨＰＶ−33等のＨＰＶ群
の非コード領域が、プロモーターに特異的な活性因子Ｓ
p １に対する認識部位の集団配列を示すものではないと
いう我々の知見によって間接的に支持される（12）。こ
れは、もう１つのパポーバウイルス、ＳＶ40に於ける状
況（12, 14）と直接的な対照を示すものである。 【００２０】ＨＰＶ−33の最も顕著な特徴は、複製の推
定領域後200bp の位置に完全な78bp同方向反復配列が存
在することである（図３）。その他の乳頭腫ウイルスの
ゲノムにおいて、この種の大きさまたは順序の反復配列
を有するものは、未だ記載されていない。ＨＰＶ−33の
初期プロモーターは、該反復配列の下流約300 bpの位置
に存在していると推定され、その特徴的なプロモーター
因子を同定することができた（図３）ＨＰＶ−33におけ
る78bp同方向反復配列の大きさ、位置、および配列順序
から、それらがウイルス転写のエンハンサーとして機能
することが示唆される。72、73および68bpの同方向反復
配列は、ＳＶ40の初期プロモーター近傍（4,14）、モロ
ニーマウス肉腫ウイルスのＬＴＲ中（10）、およびＢＫ
ウイルスゲノム中（23）に位置しており、これらは、シ
ス活性様式でＰolII依存性プロモーターからの転写を促
進することが示された。ＳＶ40エンハンサーの突然変異
原性（14, 30）、および特徴的な転写アクチベーターの
ヌクレオチド配列を比較することから、エンハンサーの
共通ヌクレオレド配列が認められた。この構造は78bp反
復配列中に検出されなかったが、潜在的Ｚ‐ＤＮＡ形成
領域が見いだされた。Ｚ‐ＤＮＡは調節分子を真核細胞
のプロモーターに引きつけると考えられ、Ｚ‐ＤＮＡ抗
体の結合部位はＳＶ40エンハンサー中にあることが示さ
れた（18）。この抗体が結合する配列が、単一のミスマ
ッチを伴うものの、ＨＰＶ−33の推定エンハンサー中に
見いだされた（7520〜7527位、7599〜7606位、図１、図
３）。 【００２１】上記で提唱されたＨＰＶ−33エンハンサー
には、特徴のよく分ったエンハンサー、または他の乳頭
腫ウイルス調節領域との広範な相同性はない。しかし、
エンハンサー様因子がＢＰＶ−１の非コード領域に位置
すること、およびその因子は活性化のためにＥ2 産物を
要求することが最近示された（25）。これらの知見か
ら、78bp同方向反復配列がエンハンサー機能を有すると
いう我々の提唱が支持され、そして、ＨＰＶ−33ならび
にＨＰＶ−16のＥ2 タンパク間の比較的低い相同性（表
２）は、対応するエンハンサー／調節領域の特異性を反
映したものであるということが示される。 【００２２】本明細書中で言及した表１および表２は以
下の通りである。 【００２３】 【表１】 【００２４】 【表２】 【００２５】本発明は、特に、Ｅ6 ，Ｅ7 ，Ｅ1 ，Ｅ2
，Ｅ4 ，Ｅ5 ，Ｌ2 ，Ｌ1 の読み取り枠に対応するヌ
クレオチド配列群にも関する。 【００２６】また、本発明は、ハイブリダイゼイション
・プローブとしての上記ヌクレオチド配列、すなわち、
他の乳頭腫ウイルス群の検出にも有用なもの、つまり、
Ｌ1に対応する読み取り枠の一部もしくは全部を含むプ
ローブ、または、よりウイルスに特異的なプローブ、す
なわち、それに対応する読み取り枠の一部もしくは全部
を含むプローブの使用法にも関する。 【００２７】また、本発明は、乳頭腫ウイルスの亜群を
検出するプローブ、特に、重篤な疾病に関連し得るウイ
ルス、つまり、腫瘍関連ウイルスの検出用プローブにも
関する。該プローブの１例として、図１Ａ、図１Ｂにお
けるヌクレオチドの配列に従って、1275番と1307番との
間に位置するヌクレオチド配列を含むものを挙げること
ができる。 【００２８】言うまでもなく、本発明は、標識が適当な
ラベル、すなわち、放射活性、酵素または免疫蛍光ラベ
ルで行われた場合の上記すべてのＤＮＡヌクレオチド配
列にも関する。 【００２９】ウイルスゲノム由来であって、および抗体
が認識し得る化学基によって修飾されたヌクレオチドを
有するＤＮＡ群も本発明の一部を成している。周知のご
とく、この種のＤＮＡは、適切な修飾を行ったヌクレオ
チドの存在下、ニックトランスレーションによって産生
することができる。 【００３０】これらのＤＮＡは、検索すべき相補鎖を含
むＤＡＮ調製物にハイブリダイズさせるとき、上記の抗
体によって検出し得るという点で極めて価値が高いハイ
ブリダイゼーションプローブである。 【００３１】同様に、本発明は、診断法にも関する。以
下、適切な方法の実例を挙げる。 【００３２】数種のハイブリダイゼーション法を使用す
ることができる。例えば、スポットハイブリダイゼーシ
ョン法は、ＤＮＡの変性後、ＤＮＡのアリコートをフイ
ルム支持体（ニトロセルロース、またはジーンスクリー
ンプラス）上にスポットし、通常の条件下で該フイルム
をプローブとハイブリダイズさせ、そして、ハイブリダ
イゼーションの起きたフイルムを放射線写真用フイルム
に接触露出させることによって、放射活性のあるハイブ
リッドを検出する方法である。もう１つの可能性とし
て、制限酵素によるＤＮＡの処理から生じたＤＮＡ断片
群をアガロースゲル電気泳動で分離し、アルカリ変性さ
せた後、該断片群をフィルム（ニトロセルロース、また
はジーンスクリーンプラス）上に移し、そして、通常条
件下でプローブの様々な混合物とハイブリダイズさせる
複製培養ハイブリダイゼーション法がある。放射活性の
あるハイブリッドが形成したかは、ハイブリダイゼーシ
ョンの支持体フイルムを放射線写真用フイルム上に接触
露出させて検出する。 【００３３】例えば、本発明のプローブは、病巣から採
取した生検用細胞試料、またはカルノア（Carnoy）液
（エタノール、クロロホルム、酢酸＝６：３：１）で固
定してパラフィン中に包埋した生検用組織試料から成る
調製物中において、重要なウイルス群（または、そのＤ
ＮＡ群）の検出に用いることができる。 【００３４】上記ヌクレオチド配列は、ベクターに挿入
して修飾ベクターを作製し、これを適当な細胞の宿主に
導入した場合、転写を起こさせ、そして、適宜、該ＤＮ
Ａヌクレオチド配列を対応のタンパクに翻訳させて宿主
の細胞抽出物から該タンパクを単離することができる。
適当なベクター、特に、トランスフォーメーションを起
こす宿主に関連して適切なベクターを選択することは、
当該技術分野の技術者には周知の知識である。例えば、
ベクターは、プラスミドまたはファージであって、すで
に認められている、これらに対応する原核細胞（また
は、酵母）中で複製を起こす能力、およびそれらが有す
るＤＮＡヌクレオチド配列を発現させる能力に従って選
ばれる。 【００３５】さらに、本発明は、先に定義した読み取り
枠のどれか、またはそれらの一部に対応するＤＮＡヌク
レオチド配列からなる挿入体を含み、そして、真核細
胞、特に温血動物の細胞中での該挿入体の発現に適する
ような処理を行ったＤＮＡ組換体にも関する。これに適
したＤＮＡ組換体は、選択した細胞のポリメラーゼに認
識されるウイルスまたは真核細胞のプロモーターの調節
下に該挿入体を有し、そして、更に、その挿入体の下流
に適当なポリアデニル化部位を含む遺伝子構成物であ
る。 【００３６】一例として挙げるならば、本発明は、ＳＶ
40ウイルスのゲノムに由来するプロモーターの調節下で
上記読み取り枠のどれかを含むＤＮＡ組換体群にも関す
る。そのようなＤＮＡ組換体群、またはベクター群は、
高等真核細胞、特に哺乳動物の細胞（例えば、Vero細
胞）のトランスフォーメーションに使用することができ
る。さらに、本発明は、このように同定したＤＮＡヌク
レオチド配列の一部であって、類似のベクターに挿入し
た場合、対応するタンパク部分をコードし得るものにも
関する。なお、このタンパク部分は、上記の完全なヌク
レオチド配列によってコードされたタンパクに類似した
免疫的特性を有している。この類似した免疫的特性は、
関連する宿主から産生された、対応するポリペプチドの
能力によって認識し得る。この能力とは、先に上記の全
ＤＮＡヌクレオチド配列を含むベクターで前以てトラン
スフォームした細胞の産生するタンパク群に対して形成
した抗体によって認識されるものである。 【００３７】また当然のことながら、本発明は、上記の
ヌクレオチド配列を少なくとも部分的に合成して得られ
るものと関連のあるいかなるヌクレオチド配列にも関す
る。なお、これらのヌクレオチド配列は、遺伝コードの
制約内で変異し得るものであって、その程度は、修飾ヌ
クレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列
の実質的修飾を伴わないようなものとすることができ
る。 【００３８】前記の考察から明らかなように、本発明
は、前記の方法で得られる生成タンパクまたはポリペプ
チドそれ自体にも関する。これらのポリペプチドは、適
当な宿主中で産生させる際、例えば、細胞壁を破壊した
後の細胞から得られるか、またはその細胞の培地中に分
泌される場合はその培地から得られる。これは、使用す
る細胞のＤＮＡ組換体系に応じて異なる。さらに、得ら
れたポリペプチドは、通常の精製法によって精製するこ
とができる。本明細書において使用した「精製」とは、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った際、精製タンパク
が検出可能な単一バンドとなって現れる（例えば、ウェ
スタン法）程度の精製レベルをいう。 【００３９】例えば、大腸菌中で上記ＤＮＡ配列が発現
した結果として得られたウイルスのタンパク、特に構造
タンパクは、乳頭腫ウイルス感染の可能性がある患者の
組織試料中で検出し得る乳頭腫ウイルスに対する抗体の
in vitro検出法に使用することができる。 【００４０】特に重要なのは、遺伝子工学的に得られ
る、Ｌ1 およびＬ2 読み取り枠から誘導し得るペプチド
配列を有するタンパク群である。興味あるもう１つのペ
プチドは、Ｅ6 ＊（Ｅ6 スター）タンパクである。この
タンパクは、スプライングによる誘導で合成することが
でき、ＨＰＶ−33ヌクレオチド配列（詳細は、図１参
照）の 229番（ドナーサイト）と404 番（アクセプター
サイト）との間に位置するヌクレオチド配列によってコ
ードされている。これらの部位は、ＨＰＶ−33のＥ6 ＊
読み取り枠中の推定スプライシング部位を規定するもの
である。そのようなタンパクの産生条件に関する引例と
して、Schneider-GardickeおよびSchwartz,Embo. J.,
5, 2285-2292 の文献を挙げることができる。 【００４１】続いて、これらの精製ポリペプチドは、体
液、特に患者の血清または組織培養液中のウイルス由来
ポリペプチドの存在をin vitroで診断し得る関連抗体の
産生に用いることができる。前記の例と同様に、本発明
は、上記のポリペプチドの一部、特に同一抗体によって
認識されるもの、または、in vitro とは対照的に、完
全タンパクを認識する抗体の産生をin vivoで生起させ
るものにも関する。 【００４２】当然、本発明は、前記の開示で特に言及し
たＤＡＮ領域によってコードされる特定のペプチドにも
関する。そして、これらのペプチドは、極めて興味深く
重要であることが分っている。 【００４３】さらに、本発明は、上記の様々なペプチド
の発現を指示するヌクレオチド配列を含むＤＡＮ組換体
でトランスフォーメーションを起こし、そして、適切な
培地中で培養すればこれらのペプチドを効果的に産生し
得る宿主細胞にも関する。 【００４４】特に最後の例として、本発明は、標準的な
方法で前記のポリペプチドによって免疫したウサギ等の
動物、及び／またはいずれかの既存方法で前以て調製し
たハイブリドーマから得られる抗体自体にも関する。特
に興味深いのは、構造タンパクに対する抗体（ポリクロ
ーナルおよびモノクローナル抗体）である。これらの抗
体は、ウイルス感染の検出に有用である。ＨＰＶ−33の
Ｌ1 、Ｌ2 およびＥ6＊タンパクに特異的な抗体は特に
重要である。Ｌ2 に特異的な抗体は、ＨＰＶ−33と類似
Ｌ2 タンパクをコードする配列を共有する特異的なウイ
ルスの in vitro 検出の診断手段として用いることがで
きる。Ｌ1 に特異的な抗体は、ＨＰＶ−33が属するウイ
ルス群の検出に有用である。Ｅ6 ＊タンパクに特異的な
抗体は、前記のウイルス感染を引き起こすウイルス発癌
性の検出に有用である。 【００４５】なお、本発明は、非常に興味のある遺伝子
間配列、特に78bpヌクレオチド配列にも関する。この配
列は、真核細胞のベクター、特に、プロモーターの上流
域、および一定部位の下流（特定の遺伝子またはヌクレ
オチド配列の転写を重要な宿主中で開始するとき必要な
領域）に挿入し得る断片として極めて興味深い。 【００４６】本明細書中で引用した全ての文献は、参考
文献として本明細書に組み入れられている。特に、これ
らの文献は、本明細書で用いられる様々な発現の定義に
関して、適宜参考にすることができる。従って、これら
は本開示の一部を成す。 【００４７】 【表３】【００４８】 【表４】【００４９】 【表５】【００５０】 【表６】
スＨＰＶ−33由来の抗原性組換えペプチドに関する。具
体的には、ＨＰＶ−33ゲノムに由来し、ヌクレオチド配
列決定されたＤＮＡ断片、特に、以下の方法によって、
このＤＮＡ断片によって改変した各種ベクターからなる
ＤＮＡ組換体を、その複製を可能にする適当な宿主細胞
に導入したとき発現して得られる組換えペプチドに関す
る。さらに、本発明は、そのような組換えペプチドを発
現させるための宿主細胞にも関する。 【０００２】なお、ＩＰ−２と命名された乳頭腫ウイル
ス（現在では、ＨＰＶ−33と命名）は、1985年11月29
日、第85.402362.9 号として出願された欧州特許出願中
に記載されているが、その内容は、本明細書に参考とし
て包含される。このウイルスのＤＡＮを含むプラスミド
の寄託は、第Ｉ-450号としてＣＮＣＭ（パリのパスツー
ル研究所付属の「微生物培養物の国立寄託所（Collecti
on nationale de Culture de Micro-Organismes)」）に
行った。 【０００３】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】乳頭
腫ウイルスは、パポーバウイルス科に属しており、共有
結合による閉環ＤＮＡ分子から成る約7,900 塩基対（b
p）を有する。ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）は、その
ＤＮＡ配列の相同性を基準に分類され(6) 、現在まで
に、約40の型が記録されている。ＨＰＶに関する生物学
的研究が著しく進み、それらが関与するヒトの疾病が、
分子生物学の様々な手法を応用して解明されている。性
器いぼの悪性転換から生じた腫瘍においてＨＰＶのＤＮ
Ａが検出されたことから、ヒトの癌にＨＰＶが関与して
いる可能性が考えられた(33)。さらに、子宮頚癌から２
種のＨＰＶゲノム、ＨＰＶ−16およびＨＰＶ−18がクロ
ーニングされたこと（3,11）により、社会経済的に極め
て重要なこの分野での研究が一層刺激された。これらの
ウイルスは、検査した悪性性器腫瘍の70％を越えるもの
に見いだされており、その他、ＨＰＶ−16に関連性のあ
るヌクレオチド配列が検出されたものも多い（3,16,33
）。このヌクレオチド配列の一つとして、最近、緊縮
性の低下した条件下でプローブとしてＨＰＶ−16を使用
して浸潤性子宮頸癌からクローニングされたＨＰＶ−33
を挙げることができる(1) 。 【０００４】本研究において、我々は、ＨＰＶ−33のＤ
ＮＡ配列を決定し、ＨＰＶ−16との関連を記載した。乳
頭腫ウイルスの中では、ＨＰＶ−33は特異な存在であっ
て、ＳＶ40のエンハンサーと極めて類似性の高い 78bp
の同方向反復(tandem repeat) 配列を有している（4,1
4）。 【０００５】 【課題を解決するための手段】本発明は、図１Ａおよび
１Ｂに示されるヌクレオチド配列を有するヒト乳頭腫ウ
イルス（ＨＰＶ）−３のゲノムＤＮＡ、又はそのＨＰＶ
−33ウイルスを認識する抗体によって認識可能な免疫学
的性質を有するポリペプチドをコードするそのＤＮＡ、
を含有する挿入体を、前記ゲノムＤＮＡ又はその断片に
対し外来性のＤＮＡと融合して含む、宿主細胞中で複製
可能なＤＮＡ組換体で形質転換された宿主細胞を提供す
る。 【０００６】前記宿主細胞は、好ましくは細菌、特に大
腸菌である。また、前記ＤＮＡ組換体の具体例はベクタ
ーである。さらにまた、前記ＤＮＡ断片の例は、図１Ａ
および１Ｂに示される配列中、ヌクレオチド番号76〜55
6 ， 543〜864 ， 867〜2811，2728〜3808，3326〜357
5，3842〜4079，4198〜5611および5516〜7091の断片群
から選択されるものであるか、又はヌクレオチド番号 1
09〜556 ， 573〜864 ，879〜2811，2749〜3808，3326
〜3575，3842〜4079，4210〜5611および5594〜7091の断
片群から選択されるものであるか、又はヌクレオチド番
号1275〜1307の断片である。 【０００７】本発明はまた、ＨＰＶ−33ゲノムＤＮＡの
図１Ａおよび１Ｂに示されるヌクレオチド配列におい
て、それぞれ76〜556 ， 543〜864 ， 867〜2811，2728
〜3808，3326〜3575，3842〜4079，4198〜5611，5516〜
7091， 109〜556 ， 573〜864, 879〜2811，2749〜380
8，3326〜3575，3842〜4079，4210〜5611，5594〜709
1，1275〜1307および 229〜404 というヌクレオチド番
号で規定されるヌクレオチド末端間を占有する断片群か
ら選択されるＤＮＡ断片から推定されるアミノ酸配列を
有する、遺伝子工学的に作製されたペプチドを提供す
る。 【０００８】 【発明の実施の形態】本発明は、以降に開示するＨＰＶ
−33ゲノムのクローニング法に基づいて行われたもので
ある。この方法は、特定のＤＮＡ配列の同定を可能にす
るものである。更に、様々なハイブリダイゼーション・
プローブ、特に、ヒト組織中でＨＰＶ−33に関連した乳
頭腫ウイルスＤＮＡの検出に極めて有用な該プローブを
提供することができるＤＮＡ配列に基づいている。これ
らを用いて組織の陽性反応を検出することによって、宿
主における浸潤性子宮頸癌の発生の可能性を調べること
ができる。 【０００９】好ましい配列は、完全なタンパクをコード
するものであり、更に、表１に挙げる読み取り枠を夫々
有するヌクレオチド配列である。 【００１０】ＤＮＡヌクレオチド配列の解析条件は、以
下の「材料および方法」中に示す。この配列解析より得
られた結論は以下の検討の欄に記載する。 【００１１】材料および方法ＤＮＡ配列解析 ：本研究でヌクレオチド配列の決定を行
ったＨＰＶ−33の出発材料は、p15-5(1)であり、これ
は、ＢglIIで直線化したＨＰＶ−33ゲノムを pＢＲ322
誘導物へクローニングして構成されている。ランダムＤ
ＮＡ断片(400〜800bp)のライブラリーは、従来から記載
されている基本的な方法(28)に従って、ｐ15-5の超音波
処理および末端修復した後Ｍ13mp8 内で作製した。ＤＮ
Ａ塩基の配列決定は、ジデオキシチェーンターミネータ
ー法（19, 20）をBigginらが改良した方法(2) によって
実施した。殆どの配列は、この方法によって決定した
が、非コード領域の一部は欠落が認められたか、または
Ｍ13ライブラリー（＞300クローン）中では充分に表現
されていなかった。この領域のヌクレオチド配列は、Sm
ith の方法（24）を用いて、p15-5 から直接決定した。
すなわち、２つの「相補的」Ｍ13クローンから単離した
制限断片を使用し、制限酵素で直線化したのちエキソヌ
クレアーゼIII で処理(200単位/pmol ＤＮＡで22℃にて
１時間）してｐ15-5から調製した鋳型上でＤＮＡ合成を
開始させた。 【００１２】コンピューター解析：ＤＮＡヌクレオチド
配列を収集し、B.Caudron が修正したStadenのプログラ
ム（26, 27）を用いて解析した。ＤＮＡの塩基またはタ
ンパク質のアミノ酸の最適配列は、WilburおよびLipman
の開発した計算法（31）を用いて得られた。 【００１３】結果及び検討ＨＰＶ−33のゲノム構造 ：7909個のヌクレオチドから成
るＨＰＶ−33の完全配列は、Ｍ13ショットガン法または
ジデオキシ法により決定し、この結果を図１に示す。平
均で、各ヌクレオチド位を 6.5回の配列測定によって決
定した。その他の乳頭腫ウイルスのヌクレオチド配列に
於ける慣例に従って、番号付は、非コード領域における
ＨpqＩの認識配列に類似した部位から始めた。 【００１４】ナンセンスコドンの分布（図２）に関する
解析によれば、その他の配列決定済みのあらゆる乳頭腫
ウイルスでの場合と同様に、８つの主要な読み取り枠は
同一鎖上に位置していることが分かる。ＨＰＶ−33、お
よびＨＰＶ型1a，6bならびに16、ワタオウサギ乳頭腫ウ
イルス、および原型ウシ乳頭腫ウイルスのＢＰＶ−１、
（5,7,8,13,21,22）に幾つかの共通の性質として、初期
領域中の最大読み取り枠であるＥ1 とＥ2 及びＥ2 をコ
ードする区域中に含まれるＥ4 との間に重複が存在す
る。興味深いことに、ＨＰＶ−33の分子クローニングで
用いられるＢglII部位は、Ｅ1 とＥ2 の重複領域内に位
置している。ＢＰＶ−１以外の全ての乳頭腫ウイルスに
共通するもう１つの性質は、Ｌ1 リーディングフレーム
とＬ2 リーディングフレームとの間に重複が存在するこ
とである。Ｌ1 に続いて、892bp 非コード領域が存在
し、これには、ＢＰＶ−１(15,29）から類推して、複製
の起点および多数の転写調節因子が確実に含まれる。Ｈ
ＰＶ−33ゲノムの基本特性を表１に総括する。 【００１５】ＨＰＶ−16とのヌクレオチド配列比較：Ｈ
ＰＶ−16は、肛門生殖器の腫瘍から単離され、そのヌク
レオチド配列が完全に決定されている、ＨＰＶ−16以外
の唯一の発癌性乳頭腫ウイルスである(22)。ＨＰＶ−33
とＨＰＶ−16とでは、後者のＥ1 リーディングフレーム
が途中で切断されている以外、大概の性質は類似してい
る。Ｅ5 コード配列を除外して、ＨＰＶ−33中のコード
配列は、ＨＰＶ−16の各対応部分より若干短い。このた
めに、Ｌ1 とＥ6 （図２）間での非コード領域が76bpだ
け長くても、ゲノムのサイズが一定に保たれている。 【００１６】各読み取り枠を対にして比較する（表２）
と、Ｅ1 ，Ｅ2 ，Ｅ6 ，Ｅ7 ，Ｌ1およびＬ2 は、その
間の相同性が65〜75％であるが、Ｅ4 とＥ5 との相同性
はより発散している（約50％の相同性）。これらの知見
は、従来行われたヘテロ二重鎖解析の結果と一致する
(1)。乳頭腫ウイルスＥ1 遺伝子産物との比較研究(8)に
よれば、そのポリペプチドには、アミノ酸の可変性が極
めて高いＮ末端領域、および一次構造の保存性が非常に
よいＣ末端領域が含まれている。相同性を有する最長領
域である33個のヌクレオチド配列（1275〜1307位、図
１）が、上記ポリペプチドの可変領域をコードする領域
中のＥ1 リーディングフレームの5'末端近くに見いださ
れる。そのほか完全に同一な領域（19〜28ヌクレオチ
ド）の幾つかは、Ｅ1 ，Ｅ2 ，Ｌ2 及びＬ1 中の別の場
所に検出される。これらの配列は、ＨＰＶ−1aおよびＨ
ＰＶ−6bのような他のＨＰＶのゲノム中には認められな
いので、対応するオリゴヌクレオチドを産生し、これを
潜在性の発癌病巣からの生検材料をスクリーニングする
ための診断用ハイブリダイゼイションプローブとして使
用できる可能性がある。 【００１７】潜在的遺伝子産物：乳頭腫ウイルスの遺伝
子産物群は、純粋に構造的役割を果すと考えられている
もの（Ｌ1 およびＬ2 ）、およびウィルスの増殖と存続
に必要なものに分けられる。ＨＰＶ−33，16ならびに6b
の主要リーディングフレームのから生じると見られる産
物を比較した結果を表２に総括する。予想どおり、特に
ここに呈示したＥ1 ，Ｅ6 ，Ｅ7 ，Ｌ2 ならびにＬ1 タ
ンパクに関して、発癌性のＨＰＶ−33と16との間に著し
い同一性が認められる。保存性の置換が含まれていると
すれば、２つのＬ1 ポリペプチド間の相同性は、90％に
増大し、対応するキャプシドは抗原性からみて関連があ
るに違いないことが示唆される。これとは対照的に、良
性の性器いぼを形成するＨＰＶ−6bを含めた広範な解析
を実施すると、非常に低い相同性が検出された（表
２）。ＨＰＶ−16のタンパク群との比較を行った場合、
ＨＰＶ−33との比較より若干高い相同性の存在がＨＰＶ
−6bで明らかになり、進化上より近い関係が示唆され
た。 【００１８】非コード領域：ＨＰＶ−33の非コード領域
を検討すると、ユニークな特性、およびＨＰＶ−16の相
当物に対して極めて弱い類似性を有することが分かる。
後期転写産物に関する、Ｌ1 停止コドンと推定ポリアデ
ニル化シグナルを含むコドンとの距離は、長さ 223bp
（7097〜7320番、図１）に相当し、Ｔ＋Ｇ含量が以上に
高い（79％）。この領域内には、19bp同方向反復配列が
２コピー（ミスマッチの１コピーとともに）、およびモ
チーフ配列 TTGTRTR（ここで、ＲはＡまたはＧ）が７コ
ピー含まれる。後者は、ＨＰＶ−16の対応領域にも７回
見いだされるので、これは複製に関するタンパク群の認
識部位である可能性が示唆される。ＢＰＶ−１ゲノムで
は、この領域に初期の複製フォークが位置し（29）、さ
らに、エプシュタイン‐バール・ウイルスでは、複製の
起点に反復配列群（32）が存在することに着目しなけれ
ばならない。 【００１９】最近、検索した全ての乳頭腫ウイルスの非
コード領域のみに12bpのパリンドーム構造（ＡＣＣＧ…
…ＣＧＧＴ）の生じていることがDartmannらによって報
告された(9) 。３コピーがＨＰＶ−33ゲノム中に見いだ
され（図３）、これらは、ＨＰＶ−16の非コード領域中
と同一位を占めている。パリンドームの役割として、初
期プロモーターの調節部位の可能性が提唱されている
（4,9,15）。そして、これは、ＨＰＶ−33等のＨＰＶ群
の非コード領域が、プロモーターに特異的な活性因子Ｓ
p １に対する認識部位の集団配列を示すものではないと
いう我々の知見によって間接的に支持される（12）。こ
れは、もう１つのパポーバウイルス、ＳＶ40に於ける状
況（12, 14）と直接的な対照を示すものである。 【００２０】ＨＰＶ−33の最も顕著な特徴は、複製の推
定領域後200bp の位置に完全な78bp同方向反復配列が存
在することである（図３）。その他の乳頭腫ウイルスの
ゲノムにおいて、この種の大きさまたは順序の反復配列
を有するものは、未だ記載されていない。ＨＰＶ−33の
初期プロモーターは、該反復配列の下流約300 bpの位置
に存在していると推定され、その特徴的なプロモーター
因子を同定することができた（図３）ＨＰＶ−33におけ
る78bp同方向反復配列の大きさ、位置、および配列順序
から、それらがウイルス転写のエンハンサーとして機能
することが示唆される。72、73および68bpの同方向反復
配列は、ＳＶ40の初期プロモーター近傍（4,14）、モロ
ニーマウス肉腫ウイルスのＬＴＲ中（10）、およびＢＫ
ウイルスゲノム中（23）に位置しており、これらは、シ
ス活性様式でＰolII依存性プロモーターからの転写を促
進することが示された。ＳＶ40エンハンサーの突然変異
原性（14, 30）、および特徴的な転写アクチベーターの
ヌクレオチド配列を比較することから、エンハンサーの
共通ヌクレオレド配列が認められた。この構造は78bp反
復配列中に検出されなかったが、潜在的Ｚ‐ＤＮＡ形成
領域が見いだされた。Ｚ‐ＤＮＡは調節分子を真核細胞
のプロモーターに引きつけると考えられ、Ｚ‐ＤＮＡ抗
体の結合部位はＳＶ40エンハンサー中にあることが示さ
れた（18）。この抗体が結合する配列が、単一のミスマ
ッチを伴うものの、ＨＰＶ−33の推定エンハンサー中に
見いだされた（7520〜7527位、7599〜7606位、図１、図
３）。 【００２１】上記で提唱されたＨＰＶ−33エンハンサー
には、特徴のよく分ったエンハンサー、または他の乳頭
腫ウイルス調節領域との広範な相同性はない。しかし、
エンハンサー様因子がＢＰＶ−１の非コード領域に位置
すること、およびその因子は活性化のためにＥ2 産物を
要求することが最近示された（25）。これらの知見か
ら、78bp同方向反復配列がエンハンサー機能を有すると
いう我々の提唱が支持され、そして、ＨＰＶ−33ならび
にＨＰＶ−16のＥ2 タンパク間の比較的低い相同性（表
２）は、対応するエンハンサー／調節領域の特異性を反
映したものであるということが示される。 【００２２】本明細書中で言及した表１および表２は以
下の通りである。 【００２３】 【表１】 【００２４】 【表２】 【００２５】本発明は、特に、Ｅ6 ，Ｅ7 ，Ｅ1 ，Ｅ2
，Ｅ4 ，Ｅ5 ，Ｌ2 ，Ｌ1 の読み取り枠に対応するヌ
クレオチド配列群にも関する。 【００２６】また、本発明は、ハイブリダイゼイション
・プローブとしての上記ヌクレオチド配列、すなわち、
他の乳頭腫ウイルス群の検出にも有用なもの、つまり、
Ｌ1に対応する読み取り枠の一部もしくは全部を含むプ
ローブ、または、よりウイルスに特異的なプローブ、す
なわち、それに対応する読み取り枠の一部もしくは全部
を含むプローブの使用法にも関する。 【００２７】また、本発明は、乳頭腫ウイルスの亜群を
検出するプローブ、特に、重篤な疾病に関連し得るウイ
ルス、つまり、腫瘍関連ウイルスの検出用プローブにも
関する。該プローブの１例として、図１Ａ、図１Ｂにお
けるヌクレオチドの配列に従って、1275番と1307番との
間に位置するヌクレオチド配列を含むものを挙げること
ができる。 【００２８】言うまでもなく、本発明は、標識が適当な
ラベル、すなわち、放射活性、酵素または免疫蛍光ラベ
ルで行われた場合の上記すべてのＤＮＡヌクレオチド配
列にも関する。 【００２９】ウイルスゲノム由来であって、および抗体
が認識し得る化学基によって修飾されたヌクレオチドを
有するＤＮＡ群も本発明の一部を成している。周知のご
とく、この種のＤＮＡは、適切な修飾を行ったヌクレオ
チドの存在下、ニックトランスレーションによって産生
することができる。 【００３０】これらのＤＮＡは、検索すべき相補鎖を含
むＤＡＮ調製物にハイブリダイズさせるとき、上記の抗
体によって検出し得るという点で極めて価値が高いハイ
ブリダイゼーションプローブである。 【００３１】同様に、本発明は、診断法にも関する。以
下、適切な方法の実例を挙げる。 【００３２】数種のハイブリダイゼーション法を使用す
ることができる。例えば、スポットハイブリダイゼーシ
ョン法は、ＤＮＡの変性後、ＤＮＡのアリコートをフイ
ルム支持体（ニトロセルロース、またはジーンスクリー
ンプラス）上にスポットし、通常の条件下で該フイルム
をプローブとハイブリダイズさせ、そして、ハイブリダ
イゼーションの起きたフイルムを放射線写真用フイルム
に接触露出させることによって、放射活性のあるハイブ
リッドを検出する方法である。もう１つの可能性とし
て、制限酵素によるＤＮＡの処理から生じたＤＮＡ断片
群をアガロースゲル電気泳動で分離し、アルカリ変性さ
せた後、該断片群をフィルム（ニトロセルロース、また
はジーンスクリーンプラス）上に移し、そして、通常条
件下でプローブの様々な混合物とハイブリダイズさせる
複製培養ハイブリダイゼーション法がある。放射活性の
あるハイブリッドが形成したかは、ハイブリダイゼーシ
ョンの支持体フイルムを放射線写真用フイルム上に接触
露出させて検出する。 【００３３】例えば、本発明のプローブは、病巣から採
取した生検用細胞試料、またはカルノア（Carnoy）液
（エタノール、クロロホルム、酢酸＝６：３：１）で固
定してパラフィン中に包埋した生検用組織試料から成る
調製物中において、重要なウイルス群（または、そのＤ
ＮＡ群）の検出に用いることができる。 【００３４】上記ヌクレオチド配列は、ベクターに挿入
して修飾ベクターを作製し、これを適当な細胞の宿主に
導入した場合、転写を起こさせ、そして、適宜、該ＤＮ
Ａヌクレオチド配列を対応のタンパクに翻訳させて宿主
の細胞抽出物から該タンパクを単離することができる。
適当なベクター、特に、トランスフォーメーションを起
こす宿主に関連して適切なベクターを選択することは、
当該技術分野の技術者には周知の知識である。例えば、
ベクターは、プラスミドまたはファージであって、すで
に認められている、これらに対応する原核細胞（また
は、酵母）中で複製を起こす能力、およびそれらが有す
るＤＮＡヌクレオチド配列を発現させる能力に従って選
ばれる。 【００３５】さらに、本発明は、先に定義した読み取り
枠のどれか、またはそれらの一部に対応するＤＮＡヌク
レオチド配列からなる挿入体を含み、そして、真核細
胞、特に温血動物の細胞中での該挿入体の発現に適する
ような処理を行ったＤＮＡ組換体にも関する。これに適
したＤＮＡ組換体は、選択した細胞のポリメラーゼに認
識されるウイルスまたは真核細胞のプロモーターの調節
下に該挿入体を有し、そして、更に、その挿入体の下流
に適当なポリアデニル化部位を含む遺伝子構成物であ
る。 【００３６】一例として挙げるならば、本発明は、ＳＶ
40ウイルスのゲノムに由来するプロモーターの調節下で
上記読み取り枠のどれかを含むＤＮＡ組換体群にも関す
る。そのようなＤＮＡ組換体群、またはベクター群は、
高等真核細胞、特に哺乳動物の細胞（例えば、Vero細
胞）のトランスフォーメーションに使用することができ
る。さらに、本発明は、このように同定したＤＮＡヌク
レオチド配列の一部であって、類似のベクターに挿入し
た場合、対応するタンパク部分をコードし得るものにも
関する。なお、このタンパク部分は、上記の完全なヌク
レオチド配列によってコードされたタンパクに類似した
免疫的特性を有している。この類似した免疫的特性は、
関連する宿主から産生された、対応するポリペプチドの
能力によって認識し得る。この能力とは、先に上記の全
ＤＮＡヌクレオチド配列を含むベクターで前以てトラン
スフォームした細胞の産生するタンパク群に対して形成
した抗体によって認識されるものである。 【００３７】また当然のことながら、本発明は、上記の
ヌクレオチド配列を少なくとも部分的に合成して得られ
るものと関連のあるいかなるヌクレオチド配列にも関す
る。なお、これらのヌクレオチド配列は、遺伝コードの
制約内で変異し得るものであって、その程度は、修飾ヌ
クレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列
の実質的修飾を伴わないようなものとすることができ
る。 【００３８】前記の考察から明らかなように、本発明
は、前記の方法で得られる生成タンパクまたはポリペプ
チドそれ自体にも関する。これらのポリペプチドは、適
当な宿主中で産生させる際、例えば、細胞壁を破壊した
後の細胞から得られるか、またはその細胞の培地中に分
泌される場合はその培地から得られる。これは、使用す
る細胞のＤＮＡ組換体系に応じて異なる。さらに、得ら
れたポリペプチドは、通常の精製法によって精製するこ
とができる。本明細書において使用した「精製」とは、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った際、精製タンパク
が検出可能な単一バンドとなって現れる（例えば、ウェ
スタン法）程度の精製レベルをいう。 【００３９】例えば、大腸菌中で上記ＤＮＡ配列が発現
した結果として得られたウイルスのタンパク、特に構造
タンパクは、乳頭腫ウイルス感染の可能性がある患者の
組織試料中で検出し得る乳頭腫ウイルスに対する抗体の
in vitro検出法に使用することができる。 【００４０】特に重要なのは、遺伝子工学的に得られ
る、Ｌ1 およびＬ2 読み取り枠から誘導し得るペプチド
配列を有するタンパク群である。興味あるもう１つのペ
プチドは、Ｅ6 ＊（Ｅ6 スター）タンパクである。この
タンパクは、スプライングによる誘導で合成することが
でき、ＨＰＶ−33ヌクレオチド配列（詳細は、図１参
照）の 229番（ドナーサイト）と404 番（アクセプター
サイト）との間に位置するヌクレオチド配列によってコ
ードされている。これらの部位は、ＨＰＶ−33のＥ6 ＊
読み取り枠中の推定スプライシング部位を規定するもの
である。そのようなタンパクの産生条件に関する引例と
して、Schneider-GardickeおよびSchwartz,Embo. J.,
5, 2285-2292 の文献を挙げることができる。 【００４１】続いて、これらの精製ポリペプチドは、体
液、特に患者の血清または組織培養液中のウイルス由来
ポリペプチドの存在をin vitroで診断し得る関連抗体の
産生に用いることができる。前記の例と同様に、本発明
は、上記のポリペプチドの一部、特に同一抗体によって
認識されるもの、または、in vitro とは対照的に、完
全タンパクを認識する抗体の産生をin vivoで生起させ
るものにも関する。 【００４２】当然、本発明は、前記の開示で特に言及し
たＤＡＮ領域によってコードされる特定のペプチドにも
関する。そして、これらのペプチドは、極めて興味深く
重要であることが分っている。 【００４３】さらに、本発明は、上記の様々なペプチド
の発現を指示するヌクレオチド配列を含むＤＡＮ組換体
でトランスフォーメーションを起こし、そして、適切な
培地中で培養すればこれらのペプチドを効果的に産生し
得る宿主細胞にも関する。 【００４４】特に最後の例として、本発明は、標準的な
方法で前記のポリペプチドによって免疫したウサギ等の
動物、及び／またはいずれかの既存方法で前以て調製し
たハイブリドーマから得られる抗体自体にも関する。特
に興味深いのは、構造タンパクに対する抗体（ポリクロ
ーナルおよびモノクローナル抗体）である。これらの抗
体は、ウイルス感染の検出に有用である。ＨＰＶ−33の
Ｌ1 、Ｌ2 およびＥ6＊タンパクに特異的な抗体は特に
重要である。Ｌ2 に特異的な抗体は、ＨＰＶ−33と類似
Ｌ2 タンパクをコードする配列を共有する特異的なウイ
ルスの in vitro 検出の診断手段として用いることがで
きる。Ｌ1 に特異的な抗体は、ＨＰＶ−33が属するウイ
ルス群の検出に有用である。Ｅ6 ＊タンパクに特異的な
抗体は、前記のウイルス感染を引き起こすウイルス発癌
性の検出に有用である。 【００４５】なお、本発明は、非常に興味のある遺伝子
間配列、特に78bpヌクレオチド配列にも関する。この配
列は、真核細胞のベクター、特に、プロモーターの上流
域、および一定部位の下流（特定の遺伝子またはヌクレ
オチド配列の転写を重要な宿主中で開始するとき必要な
領域）に挿入し得る断片として極めて興味深い。 【００４６】本明細書中で引用した全ての文献は、参考
文献として本明細書に組み入れられている。特に、これ
らの文献は、本明細書で用いられる様々な発現の定義に
関して、適宜参考にすることができる。従って、これら
は本開示の一部を成す。 【００４７】 【表３】【００４８】 【表４】【００４９】 【表５】【００５０】 【表６】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ＨＰＶ−33のヌクレオチド配列。環状ゲノム
上の１位は、ＨＰＶ−６ｂの配列中で見いだされる「Ｈ
ｐａ様」配列に相当する。 【図１Ｂ】ＨＰＶ−33のヌクレオチド配列。環状ゲノム
上の１位は、ＨＰＶ−６ｂの配列中で見いだされる「Ｈ
ｐａ様」配列に相当する。 【図２】ＨＰＶ−33ゲノムにおいて、主要なリーディン
グフレーム（読み取り枠）の分布。各リーディングフレ
ームは、他のＨＰＶ配列との比較によって同定し、停止
コドンは縦線で示した。単一の制限酵素切断部位（Ｓ，
ＳmaＩ；Ｅ，ＥcoＲＶ；Ｂ2 ，ＢglII；Ｂ1 ，ＢglＩ）
の位置、および転写の初期ならびに後期に必要なポリア
デニル化シグナル（ＰＡ）と思われるものの位置にも記
号を付けた。これらの他に、 862、1215、1221、2666、
5837、および6239の位置に６つの潜在的ＰＡ部位（ＡＡ
ＴＡＡＡ）を検出した。 【図３】非コード領域の基本的特性。7500ないし 114位
の非コード領域の一部を示す。78bpの同方向の反復配列
の上に線を引き、ＳＶ40エンハンサーのＺ−ＤＮＡの形
成因子に類似している領域を示した。プロモーターであ
る可能性がある要素には星印を付し、12bpのパリンドロ
ームの３コピーは２列の点線で挟んで示す。
上の１位は、ＨＰＶ−６ｂの配列中で見いだされる「Ｈ
ｐａ様」配列に相当する。 【図１Ｂ】ＨＰＶ−33のヌクレオチド配列。環状ゲノム
上の１位は、ＨＰＶ−６ｂの配列中で見いだされる「Ｈ
ｐａ様」配列に相当する。 【図２】ＨＰＶ−33ゲノムにおいて、主要なリーディン
グフレーム（読み取り枠）の分布。各リーディングフレ
ームは、他のＨＰＶ配列との比較によって同定し、停止
コドンは縦線で示した。単一の制限酵素切断部位（Ｓ，
ＳmaＩ；Ｅ，ＥcoＲＶ；Ｂ2 ，ＢglII；Ｂ1 ，ＢglＩ）
の位置、および転写の初期ならびに後期に必要なポリア
デニル化シグナル（ＰＡ）と思われるものの位置にも記
号を付けた。これらの他に、 862、1215、1221、2666、
5837、および6239の位置に６つの潜在的ＰＡ部位（ＡＡ
ＴＡＡＡ）を検出した。 【図３】非コード領域の基本的特性。7500ないし 114位
の非コード領域の一部を示す。78bpの同方向の反復配列
の上に線を引き、ＳＶ40エンハンサーのＺ−ＤＮＡの形
成因子に類似している領域を示した。プロモーターであ
る可能性がある要素には星印を付し、12bpのパリンドロ
ームの３コピーは２列の点線で挟んで示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｑ 1/70 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ
Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．下記のヌクレオチド配列を有するヒト乳頭腫ウイル
ス（ＨＰＶ）−33のゲノムＤＮＡ、又はＨＰＶ−33ウイ
ルスを認識する抗体によって認識可能な免疫学的性質を
有するポリペプチドをコードするそのＤＮＡ断片、を含
有する挿入体を、前記ゲノム又はその断片に対し外来性
のＤＮＡと融合して含む、宿主細胞中で複製可能なＤＮ
Ａ組換体で形質転換された宿主細胞。 【化１】【化２】２．宿主細胞が細菌である、ことを特徴とする請求項１
に記載の宿主細胞。 ３．宿主細胞が大腸菌である、ことを特徴とする請求項
２に記載の宿主細胞。 ４．前記ＤＮＡ断片が、ＨＰＶ−33のゲノムＤＮＡ由来
であって、読み取り枠から構成されており、前記ヌクレ
オチド配列において、それぞれ76〜556 ，543 〜864 ，
867 〜2811，2728〜3808，3326〜3575，3842〜4079，41
98〜5611及び5516〜7091というヌクレオチド番号で規定
されるヌクレオチド末端間を占有する断片群から選ばれ
る、ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記
載の宿主細胞。 ５．前記ＤＮＡ断片が、ＨＰＶ−33のゲノムＤＮＡ由来
であって、タンパク質をコードし、前記ヌクレオチド配
列において、それぞれ 109〜556， 573〜864 ， 879〜2
811，2749〜3808，3326〜3575，3842〜4079，4210〜561
1及び5594〜7091というヌクレオチド番号で規定される
ヌクレオチド末端間を占有する断片群から選ばれる、こ
とを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の宿
主細胞。 ６．前記ＤＮＡ断片がクローニングされた断片である、
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の
宿主細胞。 ７．前記ＤＮＡ断片が、ＨＰＶ−33のゲノムＤＮＡ由来
であり、前記ヌクレオチド配列において、1275〜1307と
いうヌクレオチド番号で記載されるヌクレオチド末端間
を占有するものである、ことを特徴とする請求項１〜３
のいずれか一項に記載の宿主細胞。 ８．前記ＤＮＡ組換体がベクターであり、前記挿入体が
該ベクターと共に複製可能である、ことを特徴とする請
求項１〜７のいずれか一項に記載の宿主細胞。 ９．ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）−33ゲノムＤＮＡの
下記のヌクレオチド配列において、それぞれ76〜556 ，
543〜864 ， 867〜2811，2728〜3808，3326〜3575，38
42〜4079，4198〜5611，5516〜7091， 109〜556 ， 573
〜864 ， 879〜2811，2749〜3808，3326〜3575，3842〜
4079，4210〜5611，5594〜7091，1275〜1307及び 229〜
404 というヌクレオチド番号で規定されるヌクレオチド
末端間を占有する断片群から選択されるＤＮＡ断片から
推定されるアミノ酸配列を有する、遺伝子工学的に作製
されたペプチド。 【化３】【化４】
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