CN116621971A - Hpv18亚型的纳米抗体及其应用 - Google Patents

Hpv18亚型的纳米抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本公开提供了针对人乳头瘤病毒(HPV)18亚型的纳米抗体或其活性片段，以及编码该纳米抗体或其活性片段的核酸分子，含该纳米抗体或其活性片段的蛋白偶联物、药物组合物。本公开还提供了该纳米抗体或其活性片段在诊断与HPV18亚型相关疾病，或治疗或预防与HPV18亚型相关疾病的药物中的应用。

Description

HPV18亚型的纳米抗体及其应用
技术领域
本公开属于生物技术领域，特别涉及针对HPV18亚型的纳米抗体及其应用。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，以下简称HPV)是一种无包膜DNA病毒，属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属。HPV感染人体的表皮与粘膜组织，目前已鉴别的HPV约有170余种。根据与肿瘤发生的危险性高低，HPV分为低危险性亚型和高危险性亚型。低危型的HPV亚型常常引起外生殖道的湿疣等良性病变，也包括宫颈上皮内低度病变。高危型的HPV亚型与宫颈癌以及宫颈上皮高度内瘤样变的发生密切相关。HPV18即是人乳头瘤病毒18亚型，属于高危型HPV亚型。HPV18与HPV16亚型是诱发女性宫颈癌的罪魁祸首。与其他亚型的HPV相比，HPV18引发的宫颈癌是最严重的，患者死亡风险甚至高于HPV16亚型。宫颈癌作为目前唯一病因明确的癌症，宫颈癌是唯一可以通过早期筛查、早期发现、彻底防治的癌症。因此，HPV18筛查仍是目前预防宫颈癌的关键之一。
在研究HPV18过程中，抗体是一个非常重要的研究工具，对于患者诊断、病毒分析与研究等都具有重大的价值和意义。不同于传统技术依赖于鼠、兔、猴、羊等经典的模式动物，本发明的技术方案是依靠羊驼的免疫系统产生的抗体，被成为“纳米抗体”。纳米抗体是从骆驼、鲨鱼等动物体内免疫球蛋白分离出的微小抗体片段，它具有与完整抗体相同的抗原结合能力和结构稳定性，是现有可结合目标抗原的最小的单位，相对分子质量仅为15kD。相比于传统的鼠、兔等动物仅能识别抗原表面平展的多肽，羊驼等动物体内的免疫系统能够识别抗原表面复杂的空间结构，能够产生高度特异性、高亲和力的纳米抗体。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本发明提供了一种针对人乳头瘤病毒(HPV)18亚型的纳米抗体或其活性片段，以及该纳米抗体或其活性片段在治疗或诊断与HPV18亚型相关疾病中的应用。
根据本公开的一个方面，提供了一种针对人乳头瘤病毒(HPV)18亚型的纳米抗体或其活性片段。在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段包括至少一个重链可变区，所述重链可变区包括：具有如SEQ ID NO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66、71、76、81、86或91所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67、72、77、82、87或92所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:3、8、13、18、23、28、33、38、43、48、53、58、63、68、73、78、83、88或93所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段能够特异性结合HPV18亚型的L1蛋白。
在一些实施方式中，所述纳米抗体的活性片段是所述纳米抗体能够与HPV18亚型，特别是能够与HPV18亚型的L1蛋白特异性结合的片段。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以包括：具有如SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:93所示的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述纳米抗体或其活性片段的至少一个重链可变区可以具有如SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的氨基酸序列。
根据本公开的另一方面，提供了一种编码本公开的纳米抗体或其活性片段的核酸分子。
在一些实施方式中，所述核酸分子可以具有如SEQ ID NO:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95所示的核苷酸序列，或与其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.8％序列同一性的核苷酸序列。
根据本公开的又一方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括本公开的上述核酸分子。
根据本公开的又一方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本公开的上述表达载体。在一些实施方式中，所述宿主细胞可以表达本公开的纳米抗体或其活性片段。在一些实施方式中，所述宿主细胞可以为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或原核细胞。在具体的实施方式中，所述宿主细胞可以为大肠杆菌(E.coli)。
根据本公开的又一方面，提供了一种人源化的抗体或其活性片段，其由本公开的纳米抗体或其活性片段获得。
根据本公开的又一方面，提供了一种蛋白偶联物，所述蛋白偶联物包括本公开的纳米抗体或其活性片段，以及配体。在一些实施方式中，所述配体选自放射性同位素、荧光基团和/或递送载体。
根据本公开的又一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本公开的纳米抗体或其活性片段，以及药学上可接受的载剂。
根据本公开的又一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包括本公开的纳米抗体或其活性片段。
根据本公开的又一方面，提供了本公开的纳米抗体或其活性片段在诊断或治疗与HPV，特别是HPV18亚型相关疾病中的应用。
根据本公开的又一方面，提供了本公开的纳米抗体或其活性片段在诊断与HPV，特别是HPV18亚型相关疾病中的试剂盒中的应用。
根据本公开的又一方面，提供了本公开的纳米抗体或其活性片段在治疗或预防与HPV，特别是HPV18亚型相关的疾病中的药物的应用。
在一些实施方式中，所述与HPV相关的疾病可以包括宫颈癌、肛门肛管癌、扁桃体癌、口腔癌、喉癌、鼻腔内癌、食道癌、鲍温病(Bowen disease)、基底细胞癌、帕哲氏病(Paget’s disease)、鳞状细胞癌、扁平疣等。
附图说明
图1示出了纳米抗体的氨基酸序列。
图2示出了纳米抗体与抗原的结合亲和力的检测结果。图2A至2S分别示出了纳米抗体1A1、1B4、1B11、1E10、1D5、1F3、3D11、2A4、2A5、2A7、2H3、2F5、3C1、2G11、3B8、3G6、4B4、4F5和4G7的亲和力检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。
人乳头瘤病毒(HPV)属于乳多空病毒科乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。目前已分离出130多种，不同的型别引起不同的临床表现，根据侵犯的组织部位不同可分为不同亚型。在本公开的一些实施方式中，使用了HPV18亚型，其属于粘膜高危型，与宫颈癌、肛门肛管癌、扁桃体癌、口腔癌、喉癌、鼻腔内癌、食道癌等疾病相关。
本文所用的术语“病毒样颗粒”或“VLP”是指含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒核酸，不能自主复制，在形态上与真正病毒粒子相同或相似。在本公开的一些实施方式中，使用的VLP具有与HPV18相同的表面结构，同时没有HPV18的病毒核酸，不能自主复制。使用VLP做为抗原进行动物免疫将更有利于获得识别HPV18天然状态的抗体。
HPV的L1蛋白(major capsid protein)在HPV感染及其生活周期的各个阶段，特别是在病毒感染早期和诱发保护性体液免疫方面发挥重要作用。L1蛋白散布在HPV病毒衣壳表面。已知L1蛋白的线性表位和构象表位均是诱发机体保护性免疫反应的主要抗原表位。
本文所用的术语“kd”值是指解离常数(dissociation constant，kd)是一种特定类型的平衡常数，用于衡量一较大物体与另一较小组分分开(解离)的倾向，是缔合常数的倒数，单位为mol/L(M)或nmol/L(nM)。kd值越小说明两个物质的结合能力越强。
本文所用的术语“纳米抗体”或“Nanobody”可以互换使用，是指在骆驼科动物外周血液中存在的天然缺失轻链的抗体。纳米抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性，以及与抗原的结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa，因此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。相比于传统的鼠、兔等动物仅能识别抗原表面平展的多肽，骆驼科动物体内的免疫系统能够识别抗原表面复杂的空间结构，能够产生高度特异性、高亲和力的纳米抗体。
相对于参照氨基酸序列具有“百分比(％)序列同一性”指在比对序列和(根据需要)引入缺口以获得最大百分比序列同一性后，候选序列中与参照氨基酸序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，但不考虑任何保守取代为序列同一性的一部分。为了确定氨基酸序列同一性百分比，可以以本领域范围内的各种方式进行比对，例如使用BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较序列全长上实现最大比对所需的任何算法。
本文所用的术语“药学上可接受的载剂”指药物制剂中除了活性成分之外的对受试者无毒性的成分。药学上可接受的载体包括，但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本文所使用的术语“治疗”指减轻和/或改善障碍和/或与其相关的疾病或症状，以及预防障碍症状的恶化。期望的治疗效果包括，但不限于防止疾病发生或复发，症状的缓解，疾病的任何直接或间接的病理结果的减少、防止转移、减缓疾病发展速度、改善或缓解症状、缓解或改善预后。但应当理解，治疗疾病或症状并不要求完全地消除该疾病或与其相关的症状。
本文所用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是一种受体蛋白，它赋予免疫细胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。常规的CAR分子是由抗体的抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区和胞内的免疫受体酪氨酸活化基序构成。
下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本领域技术人员应理解，对于实施例中描述的一些实验步骤可以参考本领域的常规操作进行。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
实施例
实施例1.抗原的制备以及羊驼的免疫注射
本实施例本发明是使用HPV18 VLP L1(采购于Creative Biostructure公司，货号CBS-V644)做为抗原，进行羊驼免疫注射。简单来讲，实验步骤如下：
(1)累计对羊驼进行4次免疫，将抗原经皮下注射至动物体内。将第一次免疫计为第一天，后续的免疫分别于第10天、第19天、第28天；
(2)第28天，于第四次免疫注射前，采集约200mL羊驼静脉外周血液；
(3)第42天，即第四次免疫之后14天，采集约200mL羊驼静脉外周血液。
相比于传统鼠、兔等动物抗体的免疫技术方案，本技术优势在于采集大量的羊驼静脉外周血液，有利于后续筛选得到高度多样性的纳米抗体。
实施例2.构建羊驼的纳米抗体文库
以实施例1中采集的两个批次的羊驼静脉外周血液为原料，构建高度多样性的纳米抗体文库。通过以下步骤，对这两个批次的羊驼静脉外周血液进行处理：
(1)使用密度梯度离心法，从羊驼静脉外周血液中分离得到淋巴细胞；
(2)提取淋巴细胞的总mRNA，并反转录为cDNA；
(3)使用适当的DNA引物，以上述cDNA为模板，经聚合酶链式反应(PCR)扩增得到羊驼免疫球蛋白IgG2和IgG3的VHH片段，即纳米抗体的DNA片段；
(4)将VHH的DNA片段连接至噬菌体表面展示筛选载体，构成VHH-pIII融合蛋白表达载体质粒库。其中，pIII是存在于噬菌体表面鞭毛上的蛋白质；
(5)将步骤(4)中得到的连接有VHH的DNA片段的筛选载体经电转化方法，转化至TG1感受态细菌，适当培养后收集全部菌落，即为羊驼的纳米抗体文库。
相比于传统的从鼠、兔等动物血清或淋巴细胞中分离得到抗体的方法，本实施例能够长期保存持有羊驼的全部纳米抗体片段(纳米抗体文库)，能够持续地进行纳米抗体的筛选与开发。
实施例3.噬菌体表面展示筛选特异性纳米抗体
以实施例2得到的纳米抗体文库为来源，经噬菌体表面展示筛选得到抗原特异性的纳米抗体。具体步骤如下：
(1)取适量冻存的纳米抗体文库，接种至细菌培养基，经适当培养后加入适量的辅助噬菌体，继续于适量条件下培养。
(2)以PEG-NaC法提取细菌培养上清中扩增的噬菌体。
(3)将噬菌体与抗原适当孵育，HPV18 VLP抗原预先固定于免疫试管(Maxisorp免疫试管，ThermoFisher Scientific)。
(4)淘洗，弃去噬菌体，用PBS缓冲液润洗抗原数次，淘洗、除去与抗原非特异性结合的噬菌体，保留与抗原特异性结合的噬菌体。
(5)洗脱，采用酸性甘氨酸溶液处理与抗原特异性结合的噬菌体，使噬菌体与抗原解离并保留。至此，得到了表达有特异性纳米抗体的噬菌体。
(6)将得到的噬菌体再次侵染培养至大肠杆菌(E.coli)，但不再加入辅助噬菌体。待噬菌体侵染完全后，特异性的纳米抗体即以DNA质粒的形式存在于大肠杆菌中。收集全部的大肠杆菌，即成为抗原特异性的纳米抗体文库。此文库为原料，可以返回步骤(1)再进行下一轮的噬菌体表面展示筛选。
(7)转变为单克隆纳米抗体菌落。取少量步骤(5)得到的噬菌体，稀释后再次侵染培养至大肠杆菌，但不再加入辅助噬菌体。待噬菌体侵染完全后，将这些大肠杆菌均匀涂布于细菌培养皿，经培养得到含有纳米抗体DNA质粒的单克隆菌落。
实施例4.阳性单克隆纳米抗体的鉴定
对实施例3的步骤(7)得到的单克隆菌落，进行阳性单克隆纳米抗体的鉴定。具体步骤如下：
(1)挑取单克隆菌落于微孔板中进行培养；
(2)加入IPTG，诱导含有纳米抗体的融合蛋白质VHH-pIII的表达；
(3)收集含有纳米抗体的细菌培养上清，与抗原HPV18 VLP孵育，抗原预先固定于96微孔板(Maxisorp透明微孔板，ThermoFisher Scientific)；
(4)利用酶联免疫吸附检测(ELISA)，检测各单克隆纳米抗体是否与HPV18 VLP抗原结合；
(5)筛选出能够与抗原结合的单克隆纳米抗体的单克隆菌落。
通过上述方法，筛选得到19株能够特异性识别并结合HPV18 L1的单克隆菌落。
实施例5.小批量单克隆纳米抗体的重组表达与纯化
将编码实施例4筛选得到的19株能够特异性识别并结合抗原的单克隆菌落进行扩大培养，提取DNA质粒，并进行DNA测序获得纳米抗体核酸序列，翻译后即可得到纳米抗体的氨基酸序列。这19株单克隆菌落获得的纳米抗体序列如图1以及表1～19所示。
表1.抗体1A1的氨基酸序列和核酸序列
表2.抗体1B4的氨基酸序列和核酸序列
表3.抗体1B11的氨基酸序列和核酸序列
表4.抗体1E10的氨基酸序列和核酸序列
表5.抗体1D5的氨基酸序列和核酸序列
表6.抗体1F3的氨基酸序列和核酸序列
表7.抗体3D11的氨基酸序列和核酸序列
表8.抗体2A4的氨基酸序列和核酸序列
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表9.抗体2A5的氨基酸序列和核酸序列
表10.抗体2A7的氨基酸序列和核酸序列
表11.抗体2H3的氨基酸序列和核酸序列
表12.抗体2F5的氨基酸序列和核酸序列
表13.抗体3C1的氨基酸序列和核酸序列
表14.抗体2G11的氨基酸序列和核酸序列
表15.抗体3B8的氨基酸序列和核酸序列
表16.抗体3G6的氨基酸序列和核酸序列
表17.抗体4B4的氨基酸序列和核酸序列
表18.抗体4F5的氨基酸序列和核酸序列
表19.抗体4G7的氨基酸序列和核酸序列
另外，将提取的DNA质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，小批量表达、纯化单克隆纳米抗体。然后，利用ELISA方法，孵育不同浓度的纳米抗体，根据纳米抗体与HPV18的结合能力测量纳米抗体与抗原的亲和力大小。检测结果示于图2A～S中。
从图2A～图2S的结果可以看出，筛选到的19种纳米抗体与HPV18结合的Kd值均在100nM以下。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种针对人乳头瘤病毒(HPV)18亚型的纳米抗体或其活性片段。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体或其活性片段，其特征在于，所述纳米抗体或其活性片段包括至少一个重链可变区，所述重链可变区包括：
具有如SEQ ID NO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66、71、76、81、86或91所示的氨基酸序列的CDR1；
具有如SEQ ID NO:2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67、72、77、82、87或92所示的氨基酸序列的CDR2；和，
具有如SEQ ID NO:3、8、13、18、23、28、33、38、43、48、53、58、63、68、73、78、83、88或93所示的氨基酸序列的CDR3。
3.根据权利要求1所述的纳米抗体或其活性片段，其特征在于，所述纳米抗体或其活性片段特异性结合HPV18亚型的L1蛋白。
4.根据权利要求1所述的纳米抗体或其活性片段，其特征在于，所述纳米抗体或其活性片段包括至少一个重链可变区，所述重链可变区包括：
具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的CDR3；
具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的CDR3；
具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的CDR3；
具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的CDR3；
具有如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的CDR3；
具有如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的CDR3；
具有如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的CDR3；
具有如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列的CDR3；
具有如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的CDR3；
具有如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的CDR3；
具有如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列的CDR3；
具有如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列的CDR3；
具有如SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列的CDR3；
具有如SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列的CDR3；
具有如SEQ ID NO:71所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列的CDR3；
具有如SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列的CDR3；
具有如SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列的CDR3；
具有如SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列的CDR3；或
具有如SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列的CDR1；具有如SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列的CDR2；和，具有如SEQ ID NO:93所示的氨基酸序列的CDR3。
5.根据权利要求1所述的纳米抗体或其活性片段，其特征在于，所述纳米抗体或其活性片段包括至少一个重链可变区，所述重链可变区具有如SEQ ID NO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69、74、79、84、89或94所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69、74、79、84、89或94所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1至5中任一项所述的纳米抗体或其活性片段。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求6所述的核酸分子。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求7所述的表达载体。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或原核细胞，优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。
10.一种蛋白偶联物，其特征在于，所述蛋白偶联物包括如权利要求1至5中任一项所述的纳米抗体或其活性片段，以及配体，优选地，所述配体选自放射性同位素、荧光基团和/或递送载体。
11.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1至5中任一项所述的纳米抗体或其活性片段，以及药学上可接受的载剂。
12.如权利要求1至5中任一项所述的纳米抗体或其活性片段在制备诊断与HPV18亚型相关疾病的试剂盒中的应用，或者在制备治疗或预防与HPV18亚型相关疾病的药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述疾病包括宫颈癌、肛门肛管癌、扁桃体癌、口腔癌、喉癌、鼻腔内癌、食道癌、鲍温病、基底细胞癌、帕哲氏病、鳞状细胞癌和扁平疣。
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