JPH09502864A

JPH09502864A - 診断上重要なウイルスカプシド抗原をコードするエプスタイン−バールウイルスｄｎａ配列、ポリメラーゼ連鎖反応により誘導された発現クローンおよび診断試験におけるこの組換え抗原の使用

Info

Publication number: JPH09502864A
Application number: JP7504952A
Authority: JP
Inventors: ヨアヒムヴォルフ，ハンス; ライシェル，ウード; モッツ，マンフレッド
Original assignee: ヨアヒムヴォルフ，ハンス
Priority date: 1993-07-23
Filing date: 1994-07-22
Publication date: 1997-03-25
Also published as: DE69330966T2; CN1117150C; ATE207120T1; WO1995003415A3; US5741656A; CN1129460A; CZ20996A3; EP0726315A1; EP0726315B1; WO1995003415A2; AU7495494A; ES2166757T3; DE69330966D1

Abstract

(57)【要約】本出願は、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）をコードする遺伝子の同定とこの遺伝子または他の遺伝子を有効に発現するプラスミドの迅速な構築方法を述べている。ＥＢＶ遺伝子は、ＥＢＶ関連疾病の診断と治療のための抗原として精製し使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】診断上重要なウイルスカプシド抗原をコードするエプスタイン−バールウイルスＤＮＡ配列、ポリメラーゼ連鎖反応により誘導された発現クローンおよび診断試験におけるこの組換え抗原の使用発明の属する技術分野本発明は、ＥＢＶ関連抗原をコードするＥＢＶゲノムのＤＮＡ配列に関するものであり、以下に述べる方法及び診断上そして薬学上の組成物ならびに少なくとも各ＤＮＡ配列の一部の検出と単離の方法に使用できる。さらに本発明は、それぞれ、このＥＢＶ関連抗原に対する抗体の迅速で単純で高感度かつ高度に特異的な測定のための方法と組成物またはキットに関するものである。これらの試験において、該ＥＢＶ抗原は、本質的に、患者血清中の特異抗体クラス検出を改良する。この検出は、例えば、感染前、初感染、慢性感染、回復期、新生物形成状態のようなドナーの感染状態に関する信頼できる結論を与える。背景技術エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）感染とその結果ＥＢＶは初期疾患として伝染性単核症を生じさせる。主として、小児や青年が感染する。平均成人人口の９０％以上は、終生保菌者としてＥＢＶの持続感染を受けている。ウイルスは、生涯口腔咽頭で産生され、経口伝播する。幼児感染は、ほとんど症状のない血清転化（seroconversion）に至ることが多い一方、成人感染は、高熱、白血球数の劇的な増加、咽頭炎、肝臓や脾臓の肥大を伴う重篤な病気の原因となることが多い。診断により、猩紅熱、トキソプラズマ症、ジフテリアや白血病を識別しなければならない。慢性感染ＥＢＶ感染は、急性初感染にみられるような慢性または慢性動揺性症状を示すことはまれである。毛状白板症免疫抑制(immunocompromised)患者ではＥＢＶは舌に重篤な病変を引き起こす可能性がある。免疫力の枯渇した個体におけるＥＢＶの再活性化細胞性免疫の低下は、ＥＢＶの再活性化を導く。その結果抗体価が上昇し、移植の拒絶反応のような多数の可能な原因による有害な効果が記述されている。伴性細胞分裂症候群ある遺伝子座が、男子のみ胎児性リンパ性網皮症に至る感染に関与している。バーキット(Burkitt's)リンパ腫とＥＢＶバーキットリンパ腫の発生は染色体上の再配列に関連している。腫瘍細胞にＥＢＶゲノムを含む場合がすべてではない。しかし、少なくとも高発生率の地域では、これらの新形成の９７％がＥＢＶ関連であり、ＥＢＶ感染の制御がバーキットリンパ腫発生の危険を減少させる可能性がある。ＥＢＶ関連「第２の疾病」の可能性としての鼻咽頭がんＥＢＶが１００％関与する他の疾病は、鼻咽頭がん（ＮＰＣ）である〔「鼻咽頭がんの生物学(“The Biology of Nasopharyngeal Carcinoma”)」，UICC tech nical report series，vol．71,シモンズとシャンムガラナム（M.J．Simons and K．Shanmugaratnam）（編集），International Union Against Cancer，Geneva ，p.1(1982)〕。ＮＰＣは鼻後方空間にあるローゼンミュレル窩（咽頭陥凹）で最も高頻度で発生する。頚部リンパ腺に最初の典型的な転移が発生して初めて入院する患者が多い。ＥＢＶ関連新形成の制御新形成を制御するに可能な３つの基本的な計画がある：１．早期発見と療法、２．病気開始を理想的には平均寿命を超えて遅らせること、そして３．予防。これらの目標は多くの新形成のような多因子疾病においてもまた達せられる可能性がある。それ自身では必ずしも病気を発生させることのできないような必須因子を１つ以上除くことにより、または、新形成状態の出現を促進する因子を減らすことにより病気の発生率は減少するだろう。ウイルス関連腫瘍の早期診断のために本発明の特異的ウイルス関連抗原または抗体または遺伝学的材料を手段として使用することにより必須因子の除去を促進するだろう。ＥＢＶ関連ＮＰＣの診断のためのＥＢＶ関連遺伝子産物の使用組成が明らかな組換え抗原が利用可能になる以前は、最も普通に用いられるウイルス特異的血清学検査は、免疫蛍光法に基づいており、免疫蛍光法または免疫酵素検定法において通常細胞に結合している抗原源として種々の性質を持ったそして／または前処理したＥＢＶゲノム陽性細胞を使用した。表Ｉは、疾病と抗体および診断に使用できるウィルス抗原をまとめたものである。現在使用されるＥＢＶ由来抗原は、その免疫応答の制限のためＥＢＶ感染者すべてに認識されるわけではない。さらに、いくつかのＥＢＶ関連抗原は他のヘルペスウイルスとタンパク質レベルで配列の相同性がある。このように、本発明の技術的な課題は、ＥＢＶ感染のより確実な診断を可能とするＥＢＶ関連タンパク質を提供することである。上述の技術的な課題はクレームにおいて特徴づけられる発明の態様を提供することにより達成される。従って、本発明は、主な遺伝学的な変異なしにＥＢＶをコードするプローブも提供する。発明の概要本発明によるＥＢＶ特異抗原の産生１．すべての発見の結論として、本発明の目的の１つは抗体クラスと抗原のウイルスカプシドクラスに特異的な抗体の検出法の感度を改良することであり、集団検査やよりよい標準化のできるシステムを改良することである。２．組換えＤＮＡ技術の応用は、ＥＢＶの抗原性を改善するのに重要なポリペプチドの同定を可能にした。その生産は適切な宿主細胞を組み換えＤＮＡ分子で形質転換し、適切な培養系で培養することにより可能となった。３．本発明によれば、ＰＣＲ法のための修飾したプライマーの選択を含む組換えＤＮＡ法を、遺伝子または２３ｋＤａＥＢＶタンパク質（ＢＬＬＦ２より読まれる）をコードする遺伝子の少なくとも一部の遺伝情報を、たとえば、細菌（例：大腸菌、サルモネラ、シュードモナスまたはバチルス属）、酵母（例：カンジダまたは酵母菌属）、昆虫細胞（例：夜蛾科(Spodoptera frugiper da SF251)）、哺乳動物細胞（例： Vero 細胞、CHO 細胞、またはリンパ芽球細胞株）などの適当な宿主細胞において発現させるために使用する。４．さらに、ＥＢＶ２３ｋＤａタンパク質をコードするゲノム領域を同定し、診断上の目的にとってのそれらの重要性を立証した。従って、これらのタンパク質、あるいはその抗原決定基の作成のための重要な情報も本発明において開示されている。ＤＮＡ配列は、天然、合成または半合成源を含むどんな材料源からのＤＮＡ配列とでもハイブリダイズし、それは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入そしてヌクレオチドストレッチの逆位などの突然変異によって、エプスタイン−バールウイルスのＢ９５−８タンパク質の読み枠ＢＬＲＦ２がコードする２３ｋＤａタンパク質に近似するタンパク質の少なくとも一部分をコードするＤＮＡ配列と関連している。ハイブリダイゼーションの条件は、ＤＮＡ分子のホモダイマーの融点以下である１５〜２７℃の範囲が好ましい。本発明は、組み換えＤＮＡ技術によるＥＢＶ特異抗原の作成と、ＥＢＶ関連疾病の診断と予防と治療法における抗原の使用に関するものである。従って、本発明の目的は新しいエプスタイン−バールウイルス抗原を免疫学的方法により同定することであり、その抗原は鼻咽頭がん（ＮＰＣ）、感染性単核症やバーキットリンパ腫（表Ｉの説明文参照）のようなエプスタイン −バールウイルス関連疾病に関与している。本発明のもう１つの目的は、ＥＢＶのゲノム領域の局在と同定であり、たとえばそれはＢ９５−８細胞〔American T ype Culture Collection，Rockville，MD USA（ATCC）CRL1612〕〔スカーレとストロミンガー(Skare，J.，and Strominger，J.L.)、エプスタイン−バールウイルスの形質転換性Ｂ９５−８株由来ＤＮＡのクローニングとＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ断片の遺伝子地図の作成（Cloning and mapping of BamHI endonucle ase fragments of the DNA from the transforming B95-8 strain of Epstein-B arr virus.）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77:3860（1980）〕からクローニングされているように、診断上の重要性や医学的目的のための重要性を有する上述の抗原をコードしている。このことは患者血清の免疫沈降と組み合わせた雑種選択法を使用することにより達成される（図１）。本発明のさらなる目的は、ＥＢＶのゲノム領域のサブクローニングであり、たとえば、有効な抗原ｐ２３の少なくとも一部をコードするＢ９５−８細胞からクローニングされたＥＢＶの現存ライブラリーからのサブクローニングである。このことをＰＣＲで行う。ＰＣＲは読み枠の末端に適当な制限酵素切断部位を必要とせずに、ゲノムＤＮＡ断片を増幅し、プライマー配列から合成された末端を含むような増幅遺伝子を適切なクローニング手段で、発現プラスミドに挿入した。同じクローニング法がＢ９５−８がコードする配列とは異なるであろう他のウイルス単離体から希望する遺伝子を増幅するためにも使用できることは明らかである。そのためには他のプライマーが必要となるかもしれず、そのようなプライマーの選択と作成は当業者の技術範囲にある。コードする領域に相補的な配列の５’に付加する配列（５’プライマー）やコードする領域に相補的な配列の３’に付加する配列のプライマーの選択は、広範なサブクローニングをする必要性なしに可能であり、付加したコントロールシグナルによる発現のために最も適したＰＣＲ産物から直接クローンを樹立できる。本発明のもう１つの目的は、適した宿主細胞にそれぞれの遺伝情報を発現させることによるタンパク質の生成である、宿主はたとえば、細菌（例：大腸菌、サルモネラ、シュードモナスまたはバチルス属）、酵母（例：カンジダまたは酵母菌属）、動物細胞とヒト細胞（例：Ｖｅｒｏ細胞；ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞；適切な制御配列の制御の下、ＥＢＶ遺伝子の遺伝情報と機能するｄｈｆｒ遺伝子を持つプラスミドを選択し適当な選択系と連結して；またはリンパ芽球細胞株）である。これらの宿主細胞により産出されたタンパク質は２３ｋＤａの関連抗原決定基（エピトープ）を含み、発現系によっては融合タンパク質または非融合タンパク質として合成される。細菌による融合タンパク質の産生のために、ＥＢＶＢ９５−８のｐ２３をコードするゲノム副断片の発現は既知のプラスミドｐＵＣ８に導入して行われ、例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト−ピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。それぞれの発現産物を免疫学的方法で同定した。自然に発生するタンパク質またはその一部のアミノ酸配列を本来含む非融合タンパク質産生のため、本発明の組み換えプラスミドを修飾できる。もし、発現ベクターの細菌のタンパク質をコードする領域とＥＢＶ関連タンパク質をコードする領域の間にオリゴヌクレオチドリンカーを挿入したら、そのリンカーに対応するアミノ酸配列が発現融合タンパク質の一部に生じるだろう。発現する形質転換細胞から融合タンパク質を単離後、導入されたアミノ酸リンカーのアミノ酸配列に特異的なプロテアーゼによるか、もしアミノ酸リンカーが酸による開裂に敏感なペプチド結合を含んでいたら例えば蟻酸のような酸処理により融合タンパク質を切断する。本発明のさらなる目的は、臨床診断や科学研究に有用な診断構成物（キット）を作成するために、２３ｋＤａＥＢＶ関連タンパク質またはその副領域またはもし適当なら、ＥＢＶ関連ＤＮＡ断片またはクローンを利用することである。これらの検査は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ（ラジオノムアッセイ）または間接赤血球凝集反応法のような確立された原理に基づくものである。さらに、ＥＢＶ関連タンパク質を例えば予防接種計画の監視、疫学上の問題の分析、患者の処置（医薬品の成分）、そして単核症やバーキットリンパ腫や鼻咽頭がんのようなＥＢＶ関連疾病の治療において予防法としてのワクチンの生産のために使用する。最後に、このタンパク質はＥＢＶ関連疾病の予防と治療に有効である。なぜなら、それは、ＮＰＣ、慢性伝染性単核症あるいはＥＢＶ関連バーキッドリンパ腫のような病気に罹患する患者において免疫応答を調節できるからである。図面の簡単な説明図１：ＥＢＶゲノムのＢａｍＨＩＤＮＡ断片で選択したＲＮＡハイブリッドからイン・ビトロで翻訳された産物のオートラジオグラフィー。免疫沈降のためＮＰＣ患者由来のＥＢＶ特異血清のプールを使用した。³⁵Ｓ標識免疫沈降タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、Ｘ線フィルムをゲルに露出させた。「プール」と命名した対照は、免疫沈降できるＥＢＶ特異タンパク質のすべてを含む。オートラジオグラフィーからＥＢＶ陽性血清中に２３ｋＤａに対する抗体が存在することがわかる。ホルボールエステルで誘導したＰ３ＨＲ１細胞由来のＲＮＡをＥＢＶＤＮＡのＢａｍＨＩ制限断片にハイブリダイズさせ、溶出させて、イン・ビトロで翻訳させたこともまた明らかである。既に報告されているように、ＥＢＶゲノム陰性ＢＪＡＢ細胞で前吸着したＥＢＶ反応血清のプールで翻訳生成物を免疫沈降させた〔セイブルとウォルフ(Seibl，R．and Wolf H.)、誘導Ｐ３ＨＲ１細胞と誘導Ｒａｊｉ細胞由来のハイブリッド選択したＲＮＡの翻訳によるエプスタイン−バールウイルスタンパク質のゲノム上の遺伝子座位決定(Mapping of Epstein-Barr virus proteins on the genome by tra nslation of hybrid-selected RNA from induced P3HR1 cells and induced Raj i cells.)、Virology 141：1-13（1985）〕。図２：ＥＢＶＢ９５−８ゲノム関連ｍＲＮＡの詳細な遺伝子地図。ＥＢＶＢ９５−８ゲノムのＢａｍＨＩ制限部位を図の下部に示し、それぞれの制限断片を大文字と小文字で示す。ハイブリッド選択により個々のＢａｍＨＩ制限断片に配置したタンパク質のｍＲＮＡは数字と線で示す。この詳細なマッピングによりＥＢＶ回復期の患者血清中に２３ｋＤａに対する抗体が存在することがわかる。図３：Ａ）ＢａｍＨＩ−Ｌ断片中の読み枠の局在。２３ｋＤａの大きさをもつＥＢＶ抗原をハイブリッド選択翻訳によりマッピングした。ＢＬＬＦＩはＥＢＶの主要膜抗原をコードし、ＢＬＬＦ２、ＢＬＲＦＩとＢＬＲＦ３は、計算上３１ｋＤａ、１１ｋＤａおよび１２ｋＤａの分子量をもつタンパク質をコードする。ＢＬＬＦ３もまたＢａｍＨＩ−Ｓ断片の近隣にマップするが、一方２３ｋＤａ抗原をコードする領域は、ＢａｍＨＩ−Ｌにしか発見されなかった。従って、２３ｋＤａ抗原をコードする最も可能性のある候補はＢＬＲＦ２がコードするタンパク質のようである。Ｂ）ＰＣＲで使用するヌクレオチド鎖とオリゴデオキシヌクレオチドプライマーによるＢＬＲＦ２の５’と３’末端の拡張プライマー１は２３ｋＤａタンパク質のＮ末端をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズする。相補的配列は第２コドンの後からスタート。翻訳開始近傍の領域をＢｓｐＨＩ部位に変化させＡＴＧ発現ベクターにクローニングした。これは、両方ともセリンをコードするＴＣＡからＡＧＣへの第２コドンの変化を含む。ＡＴＧ開始コドンから上流のオリゴンデオキシヌクレオチド配列は、ＢａｍＨＩ制限酵素部位といくつかの追加したヌクレオチド（ｎｔ）をコードし、制限酵素消化とクローニングを容易にする。プライマー２は、２３ｋＤａの翻訳終止部にハイブリダイズし、ベクターに挿入するために５’末端にＨｉｎｄIII部位を含む。両プライマーのハイブリダイズしない５’末端は、相補的鎖において第１回めのＰＣＲサイクル中は合成されないが、次のサイクル中で新しく生成したＰＣＲ産物が鋳型として使用される時合成される。図４：増幅ＤＮＡの生成とクローニング。１（Ｂ）で示したオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを８７００ＤＮＡ合成装置（Biosearch / MILLIGEN）の１ｍｏｌカラムで合成した。合成は非常に有効だったので、プライマーをカラムから切断後それ以上の精製なしにＰＣＲに使用した。それぞれ１００μｌの同じ組成を含む５つのＰＣＲ反応を並行して行った。その組成は製造業者の指示書に従って、０．２５％総プライマー収量、４ｎｇのＥＢＶのＢａｍＨＩ−Ｌ断片を含むプラスミド〔スカーレとストロミンガー（Skare，J．and Strominger，J.L.）エプスタイン−バールウイルスの形質転換性Ｂ９５−８株由来ＤＮＡのクローニングとＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ断片の遺伝子地図の作成(Cloning and mapping of BamHI endo nuclease fragments of the DNA from the transforming B95-8 strain of Epst ein-Barr virus.)、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77:3860（1980）〕、ヌクレオチド、緩衝液、Ｔａｑポリメラーゼであった。反応は、Ｅｒｉｃｏｍｐ温度循環器中、アニーリング温度５０℃２分間、鎖の伸長７２℃４分間、熱変性９４℃１分間で行った。５０サイクル行い、生成したＤＮＡを集め、エタノール沈澱させ乾燥させた。ＤＮＡを２００リットルのＨ₂Ｏに再懸濁し、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄ IIIで消化した。ＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動で精製し、単離してＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで直鎖状にしたｐＵＲ２８９と連結した。大腸菌ＪＭ１０９への形質転換後〔ヤニッシューペロン（Yanish-Perron）ら、改良Ｍ１３ファージクローニングベクターそしてＭ１３ｍｐ１８とｐＵＣ１９ベクターの宿主株ヌクレオチド配列(Improved M13 phage cloning vectors and host s trains nucleotide sequences of M13mp18 and pUC19 vectors.)、 Gene 33:103-119(1985)〕、制限酵素消化により、２３ｋＤａ抗原をコードする断片を持つコロニーのプラスミドをスクリーニングした。ＥＢＶ抗原の産生は、陽性クローンをＩＰＴＧ誘導させ、タンパク質のＰＡＧＥをし、クーマシーブルー（Coomassie blue）染色またはウエスタンブロットで可視化した（図５）。生成クローン、ｐＵＲ２３ｋからＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで消化し再び単離した２３ｋＤａをコードするセグメントをｐＤＳに挿入した（ｐＤ５２３ｋ）。第３段階で、ＢｓｐＨＩとＨｉｎｄIII切断によって断片を単離し、ＮｃｏＩとＨｉｎｄ IIIで直鎖状にしたｐＫＫ２３３−２と連結した（ｐＫＫ２３ｋ）。最後に、ｐＤＳ２３ｋ由来３７０ｂｐのＮｌａIV／ＨｉｎｄIII断片を得て、ＨｉｎｄI IとＨｉｎｄIIIで直鎖状にしたｐＵＣ８と連結した（ｐＵＣ８−Ｎ２３４）。ここに述べたすべての発現クローニング方法はベクター配列からＥＢＶ由来断片へフレームを合わせて翻訳する機能を与える。図５：大腸菌における２３ｋＤａ発現生成物の同定ＩＰＴＧ誘導クローン（１ｍＭＩＰＴＧ３７℃で３時間）のタンパク質をＳＤＳ−１７．５ＰＡＧＥで分析し、クーマシーブルー染色（左パネル）またはウエスタンブロット後、ＮＰＣ患者由来の高い抗体価の血清プールで免疫染色した。レーン１：ｐＵＲ２８９，β−Ｇａｌ発現；レーン２：ｐＵＲ２３ｋ；レーン３：ｐＤＳ２３ｋ；レーン４：ｐＫＫ２３ｋ；レーン５：ｐＵＣＮ２３ｋ。β −Ｇａｌ::レーン２の２３ｋＤａ融合タンパク質はレーン１のβ−Ｇａｌ（１１６ｋＤａ）よりも大きい。このことは増幅ＤＮＡ断片の読み過ごしを意味する。レーン３の２３ｋＤａの発現生成物は、約２４ｋＤａの大きさであり、大量に合成されている。しかし、レーン４のＡＴＧベクターからの真の２３ｋＤａ発現生成物は効率的には産生されていない。レーン５のｐＵＣＮ２３由来２３ｋＤａ抗原断片のＣ末端は安定のようであり、非常に効率的に産生されている。すべての抗原はＮＰＣ血清プールとかなり強力に反応する。このことはウイルス感染中のこのタンパク質の抗原性を示す。図６：エプスタイン−バールウイルスのＢＬＲＦ２の読み枠からの２３ｋＤａ抗原のＤＮＡとアミノ酸配列本発明を実施例により説明する。実施例１：２３ｋＤａタンパク質をコードする領域の増幅。ＥＢＶのＢａｍＨＩ−Ｌ断片上の２３ｋＤａタンパク質（ＢＬＲＦ２）をコードする可能性のある領域は１６２アミノ酸を含む。読み枠全長の直接のクローニングに利用できる５’末端と３’末端の適当な制限酵素部位はない。この理由のため、我々はコード領域の５’末端と３’末端に相補的な２つのオリゴデオキシヌクレオチドを合成し、ＰＣＲのプライマーとして使用した。それぞれのプライマーは増幅したＤＮＡのクローニング（図１）に使用できる制限部位を５’末端に付加した配列と、これらの制限酵素での切断を容易にする２〜３のヌクレオチドをさらに含む。ＰＣＲの後、増幅したＤＮＡセグメントをＢａｍＨＩとＨｉｎｄ IIIで切断し、アガロースゲル電気泳動で精製し、プラスミドベクターとのクローニングに使用した。ＥＢＶの分離物、Ｂ９５−８由来の全ＢａｍＨＩ−Ｌ断片を含むプラスミド〔スカーレ，J. とストロミンガー，J.L．(Skare，J.，and S trominger，J.L.)エプスタイン−バールウイルスの形質転換性Ｂ９５−８株由来ＤＮＡのクローニングとＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ断片の遺伝子地図の作成、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77:3860（1980）〕を鋳型として使用した。実施例２： β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質として大腸菌での２３ｋＤａＶＣＡの発現。大腸菌中では多くの組み換え抗原は非融合抗原として安定に発現しないので、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を作成することにより、第１の評価を行った。理論上、細菌の大きなタンパク質は不安定なタンパク質セグメントの分解を防止する。この理由からＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで消化した増幅ＤＮＡをβＧａｌ発現ベクターｐＵＲ２８９のｌａｃＺ遺伝子の３’にフレームを合わせてクローニングした〔リュターとミュラー−ヒル(R EMBO J.２（1983）1791-1794〕（図４）。このベクターを含む大腸菌クローンを β−Ｇａｌ::２３ｋＤａ融合タンパク質を発現させるために、ＩＰＴＧで誘導した。図５からβ−Ｇａｌ標準品よりも高分子量の生成物が合成されたことが明らかである。融合タンパク質はＥＢＶの高抗体価をもつ血清と特異的に反応する。このことは、正しい翻訳が行われ、ＰＣＲによる大きな誤りや終止コドンが導入されず、免疫原性のあるＥＢＶ抗原が生成することを示すものである。実施例３：タンパク質標準品としての２３ｋＤａＶＣＡの発現。ｐＵＲ２８９−２３ｋからＥＢＶをコードする領域をＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで単離し、本明細書のためにｐＤＳ３と再命名したｐＤＳ１２／ＰＢＳII−２にクローニングした〔ブジャード，H.ら(Bujard，H．et al.)イン・ビトロとイン・ビボでの分析のためのＴ５プロモーターに基づく転写翻訳系、Meth．Enzymol． 155:416 （1987）〕。ｐＤＳ３は２３ｋＤａをコードする領域において与えられるものと同じ翻訳フレームを供給する（図４）。ＩＰＴＧで誘導後、クーマシー染色したＰＡＧＥ中に２３ｋＤａの新しいタンパク質が出現する。それは、ウエスタンブロットでＥＢＶ血清と特異的に反応し、クーマシー染色したゲルから推定し得るように総大腸菌タンパク質の約１０％を占める（図５）。発現生成物はクローニング部位とオリゴデオキシヌクレオチド配列由来のいくつかのアミノ酸を含むため、このＢｓｐＨＩとＨｉｎｄIIIを単離しＡＴＧベクターｐＫＫ２３３−２のＮｃｏＩとＨｉｎｄIII部位へ挿入することによりタンパク質標準品の発現を達成した〔アマン，E.とブロシウス，J.(Amann，E．and Brosius，J.)大腸菌でのクローン遺伝子の高レベルの発現を制御する「ＡＴＧベクター」、Gene 40:183-190（1985）〕。しかしながら、このベクターからの２３ｋＤａ抗原の発現収量はｐＤＳベクターからよりもずっと低かった。おそらく、Ｎ末端配列を変えたことにより生じた大腸菌細胞中のこのタンパク質の非効果的な翻訳によるためであろう。２３ｋＤａ抗原のＣ末端部分をコードするより小さな断片からより高い発現が達成された。コードする領域からＮｌａIV／ＨｉｎｄIII断片を単離し、ｐＵＣ８のＨｉｎｄII／Ｈｉｎｄ III部位へ挿入し〔ヴィエィラ，B. とメッシング，B.(Vieira，B．a nd Messing，B.)汎用性の合成プライマーを用いた突然変異誘発の挿入と配列決定のためのｐＵＣプラスミド、Ｍ１３ｍｐ７誘導系、Gene 19(1982)259-268〕、ｐＵＣＮ２３ｋを作成した。再び、ＩＰＴＧ誘導後、非常に効率的な抗原生成が見られた。しかし、この抗原はタンパク質標準品のＮ末端を含んでいないため、これ以上の評価には用いなかった。実施例４：２３ｋＤａＶＣＡの反応性と特異性。種々の血清源たとえば、伝染性単核症患者、ＮＰＣ患者、そして健康保菌者などから得たＥＢＶ陽性血清と陰性血清を用いて組換え抗原の診断上の価値の最初の評価を行った。ｐＤＳ２３ｋ由来の２３ｋＤａ抗原を含む細菌の粗溶菌液と対照として外来抗原を持たない溶菌液をＰＡＧＥで泳動分離した。タンパク質をニトロセルロースフィルターに移し、それからフィルター片を血清と共にインキュベートした。免疫染色したウエスタンブロット片の結果を表IIに要約する。従来の免疫蛍光検査と比べて、健康保菌者やＮＰＣ患者由来のＶＣＡ陽性血清は２３ｋＤａ抗原に対して明らかに陽性であった。ＩＦ検査で反応した２つの血清だけは反応を示さなかった。ＩＦから決定した初感染者の３つの血清もまた反応を示さなかったし、ＥＢＶ陰性だと信じていた３つの血清はｐ２３ｋＤａ抗原に陽性であることがわかった。要約すると、ＩＦとウエスタンブロット活性の大体の相関が見られる。しかしながら、ＩＦ検査と比較してこの抗原の関連性と感度を試験するなお一層の検査が必要である。ＩＦ検査による血清の分類は：ＶＣＡ＋，ＥＢＮＡ＋＝健康保菌者；ＶＣＡ＋，ＥＢＮＡ＋臨床データ＝ＮＰＣ；ＶＣＡ＋，ＥＢＮＡ-,臨床データ＝初感染；ＶＣＡ-,ＥＢＮＡ-,＝ＥＢＶ陰性であった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年８月１４日【補正内容】請求の範囲１．図６に示すようなアミノ酸配列を有するＥＢＶ−関連抗原性タンパク質に相当することを特徴とする、ＥＢＶ−ゲノムのＤＮＡ配列。２．コードされるＥＢＶ関連抗原性タンパク質が２３ｋＤａの分子量を有することを特徴とする、請求項１記載のＤＮＡ配列。３．天然、合成または半合成起原などの如何なる起原由来のものかを問わず、請求項１または請求項２のいずれかに記載されたＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列であって、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入およびヌクレオチドストレッチの逆位などの突然変異によって請求項１または請求項２記載のＤＮＡ配列に関係付けられ、そして該２３ｋＤａＥＢＶタンパク質の抗原性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列。４．その構築が図４に示されている組換えプラスミドｐＵＲ２８９−２３ｋ、ｐＤＳ−２３ｋ、ｐＵＣ８−Ｎ２３中に挿入されることを特徴とする、請求項１または請求項２記載のＤＮＡ配列。５．その結果産生されるポリペプチドにおいて配列特異的プロテアーゼの切断部位として役立ちまたはギ酸のような酸で酸処理することにより切断可能なまたはその後の精製を容易にするようなオリゴペプチドをコードするオリゴデゾキシヌクレオチドをその５’末端に含むことを特徴とする、請求項１〜請求項４いずれか１項に記載のＤＮＡ配列。６．請求項１〜請求項５いずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、クローニング用の組換えＤＮＡ分子。７．発現制御配列に機能的に連結されている請求項１〜請求項５いずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、発現用の組換えＤＮＡ分子。８．発現制御配列が、大腸菌ラムダ−プロモーター系、大腸菌ｌａｃ−系、大腸菌β−ラクタマーゼ系、大腸菌ｔｒｐ−系、大腸菌リポプロテインプロモーター系、酵母発現制御配列または他の真核細胞発現制御系であることを特徴とする、請求項７記載の組換えＤＮＡ分子。９．請求項６〜請求項８のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子の少なくとも１つで形質転換されることを特徴とする、宿主。１０．大腸菌、その他の細菌、酵母、その他のカビ、動物細胞またはヒト細胞の株である、請求項９記載の宿主。１１．ＥＢＶ−関連疾病の診断および治療に適するＥＢＶ−関連抗原性決定基を有するタンパク質であって、請求項１〜請求項５いずれか１項に記載のＤＮＡ配列によってコードされることを特徴とするタンパク質。１２．請求項１１記載のタンパク質を含むことを特徴とする融合タンパク質。１３．請求項１１記載のタンパク質を含むことを特徴とする非融合タンパク質。１４．請求項１１〜請求項１３いずれか１項に記載のタンパク質を製造する方法であって、請求項９または請求項１０記載の宿主の培地中での適当な条件下での培養、培養中でのタンパク質の蓄積、およびそれからの回収を含む方法。１５．抗−ＥＢＶ−抗体の検出用の診断組成物であって、請求項１１〜請求項１３いずれか１項に記載のタンパク質を少なくとも１つ、試料中の該抗−ＥＢＶ− 抗体と結合するのに充分な量で含む診断組成物。１６．請求項１〜請求項５いずれか１項のＤＮＡ配列に適当なオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングさせそしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行わせるステップを含むクローニング可能なおよび／または発現可能なＤＮＡ配列を構築する方法であって、該プライマーがそれらの５’−末端および３’−末端にそれぞれクローニング制御配列および／または発現制御配列を表す付加的な非−相同的配列を含むことを特徴とする方法。１７．該発現制御配列が転写開始部位および／または翻訳開始部位および／または増強部位および転写停止シグナルおよび／または翻訳停止シグナルまたはコードされる転写物のプロセッシングに重要な配列を含むことを特徴とする、請求項１６記載の方法。１８．請求項１１〜請求項１３いずれか１項に記載のタンパク質を少なくとも１つ含むキット。１９．請求項１１〜請求項１３いずれか１項に記載のタンパク質の少なくとも１つと薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。２０．請求項１１〜請求項１３いずれか１項に記載のタンパク質を含むワクチン。２１．ＥＢＶ関連疾病の予防または治療用の医薬組成物の製造における、請求項１１〜請求項１３いずれか１項に記載のタンパク質の使用。２２．請求項１９記載の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含むＥＢＶ関連疾病の治療方法。２３．該ＥＢＶ関連疾病がＮＰＣ、慢性伝染性単核症、またはＥＢＶ関連バーキットリンパ腫、ホジキン病、鼻咽喉ガン、臓器移植と関連するＥＢＶ再活性化である、請求項２１記載の使用または請求項２２記載の方法。２４．付加的な増幅を行いまたは行わずに、請求項１〜請求項５いずれか１項に記載のＤＮＡ配列の全部または断片を使用してハイブリダイゼーションにより臨床試料中のＥＢＶＤＮＡを検出することを特徴とする、ＥＢＶ感染の特異的検出のための手順。２５．請求項１または請求項２記載のＤＮＡ配列のコード領域の５’−および３ ’−末端およびそれぞれその相補鎖にハイブリダイズするプライマー対。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｑ 1/68 9453−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者モッツ，マンフレッドドイツ連邦共和国ムーニックデー― 81379，シャハナーストラーセ７ (54)【発明の名称】診断上重要なウイルスカプシド抗原をコードするエプスタイン−バールウイルスＤＮＡ配列、ポリメラーゼ連鎖反応により誘導された発現クローンおよび診断試験におけるこの組換え抗原の使用

Claims

【特許請求の範囲】１．図６に示すようなアミノ酸配列を有するＥＢＶ−関連抗原性タンパク質の少なくとも一部に相当することを特徴とする、ＥＢＶ−ゲノムのＤＮＡ配列。２．コードされるＥＢＶ関連抗原性タンパク質が２３ｋＤａの分子量を有することを特徴とする、請求項１記載のＤＮＡ配列。３．天然、合成または半合成起原などの如何なる起原由来のものかを問わず、請求項１または請求項２のいずれかに記載されたＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列であって、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入およびヌクレオチドストレッチの逆位などの突然変異によって請求項１記載のＤＮＡ配列に関係付けられ、そして該２３ｋＤａＥＢＶタンパク質の抗原性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列。４．組換えプラスミドｐＵＲ２８９−２３ｋ中に挿入されるものであることを特徴とする請求項２記載のＤＮＡ配列。５．組換えプラスミドｐＤＳ−２３ｋおよびｐＵＣ８−Ｎ２３中に挿入されるものであることを特徴とする請求項２記載のＤＮＡ配列。６．組換えプラスミドｐＭＤIIIおよびｐＶＬ９４１中に挿入されているものであることを特徴とする請求項２記載のＤＮＡ配列。７．その結果産生されるポリペプチドにおいて配列特異的プロテアーゼの切断部位として役立ちまたはギ酸のような酸で酸処理することにより切断可能なまたはその後の精製を容易にするようなオリゴペプチドをコードするオリゴデゾキシヌクレオチドを５’末端に含むことを特徴とする、請求項１〜請求項６いずれか１項に記載のＤＮＡ配列。８．請求項１〜請求項７いずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、クローニング用の組換えＤＮＡ分子。９．発現制御配列に機能的に連結されている請求項１〜請求項７いずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、発現用の組換えＤＮＡ分子。１０．発現制御配列が、大腸菌ラムダ−プロモーター系、大腸菌ｌａｃ−系、大腸菌β−ラクタマーゼ系、大腸菌ｔｒｐ−系、大腸菌リポプロテインプロモーター系、酵母発現制御配列または他の真核細胞発現制御配列であることを特徴とする、請求項９記載の組換えＤＮＡ分子。１１．請求項８〜請求項１０のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子の少なくとも１つで形質転換されることを特徴とする、宿主。１２．大腸菌、その他の細菌、酵母、その他のカビ、動物細胞またはヒト細胞の株である、請求項１１記載の宿主。１３．ＥＢＶ−関連疾病の診断および治療に適するＥＢＶ−関連抗原性決定基を有するタンパク質であって、請求項１〜請求項７いずれか１項に記載のＤＮＡ配列によってコードされることを特徴とするタンパク質。１４．請求項１３記載のタンパク質を含むことを特徴とする融合タンパク質。１５．請求項１３記載のタンパク質を含むことを特徴とする非融合タンパク質。１６．請求項１３〜請求項１５いずれか１項に記載のタンパク質を製造する方法であって、請求項１１または請求項１２記載の宿主の培地中での適当な条件下での培養、培養中でのタンパク質の蓄積、およびそれからの回収を含む方法。１７．抗−ＥＢＶ−抗体の検出用の診断組成物であって、請求項１３〜請求項１５いずれか１項に記載のタンパク質を少なくとも１つ、試料中の該抗−ＥＢＶ−抗体と結合するのに充分な量で含む診断組成物。１８．請求項１〜請求項７いずれか１項のＤＮＡ配列に適当なオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングさせそしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行わせるステップを含むクローニング可能なおよび／または発現可能なＤＮＡ配列を構築する方法であって、該プライマーがそれらの５’−末端および３’−末端にそれぞれクローニング制御配列および／または発現制御配列を表す付加的な非− 相同的配列を含むことを特徴とする方法。１９．該発現制御配列が転写開始部位および／または翻訳開始部位および／または増強部位および転写停止シグナルおよび／または翻訳停止シグナルまたはコードされる転写物のプロセッシングに重要な配列を含むことを特徴とする、請求項１８記載の方法。２０．請求項１３〜請求項１５いずれか１項に記載のタンパク質を少なくとも１つ含むキット。２１．請求項１３〜請求項１５いずれか１項に記載のタンパク質の少なくとも１つと薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。２２．請求項１３〜請求項１５いずれか１項に記載のタンパク質を含むワクチン。２３．ＥＢＶ関連疾病の予防または治療用の医薬組成物の製造における、請求項１３〜請求項１５いずれか１項に記載のタンパク質の使用。２４．請求項２２記載の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含むＥＢＶ関連疾病の治療方法。２５．該ＥＢＶ関連疾病がＮＰＣ、慢性伝染性単核症、またはＥＢＶ関連バーキットリンパ腫、ホジキン病、鼻咽喉ガン、臓器移植と関連するＥＢＶ再活性化である、請求項２３記載の使用または請求項２４記載の方法。２６．付加的な増幅を行いまたは行わずに、請求項１〜請求項７いずれか１項に記載のＤＮＡ配列の全部または断片を使用してハイブリダイゼーションにより臨床試料中のＥＢＶＤＮＡを検出することを特徴とする、ＥＢＶ感染の特異的検出のための手順。