JPH09502864A - 診断上重要なウイルスカプシド抗原をコードするエプスタイン−バールウイルスdna配列、ポリメラーゼ連鎖反応により誘導された発現クローンおよび診断試験におけるこの組換え抗原の使用 - Google Patents

診断上重要なウイルスカプシド抗原をコードするエプスタイン−バールウイルスdna配列、ポリメラーゼ連鎖反応により誘導された発現クローンおよび診断試験におけるこの組換え抗原の使用

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JPH09502864A JP7504952A JP50495294A JPH09502864A JP H09502864 A JPH09502864 A JP H09502864A JP 7504952 A JP7504952 A JP 7504952A JP 50495294 A JP50495294 A JP 50495294A JP H09502864 A JPH09502864 A JP H09502864A
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Abstract

(57)【要約】 本出願は、エプスタイン−バールウイルス(EBV)をコードする遺伝子の同定とこの遺伝子または他の遺伝子を有効に発現するプラスミドの迅速な構築方法を述べている。EBV遺伝子は、EBV関連疾病の診断と治療のための抗原として精製し使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】診断上重要なウイルスカプシド抗原をコードするエプスタイン−バールウイルス DNA配列、ポリメラーゼ連鎖反応により誘導された発現クローンおよび診断試 験におけるこの組換え抗原の使用 発明の属する技術分野 本発明は、EBV関連抗原をコードするEBVゲノムのDNA配列に関するも のであり、以下に述べる方法及び診断上そして薬学上の組成物ならびに少なくと も各DNA配列の一部の検出と単離の方法に使用できる。さらに本発明は、それ ぞれ、このEBV関連抗原に対する抗体の迅速で単純で高感度かつ高度に特異的 な測定のための方法と組成物またはキットに関するものである。これらの試験に おいて、該EBV抗原は、本質的に、患者血清中の特異抗体クラス検出を改良す る。この検出は、例えば、感染前、初感染、慢性感染、回復期、新生物形成状態 のようなドナーの感染状態に関する信頼できる結論を与える。背景技術 エプスタイン−バールウイルス(EBV)感染とその結果 EBVは初期疾患として伝染性単核症を生じさせる。主として、小児や青年が 感染する。平均成人人口の90%以上は、終生保菌者としてEBVの持続感染を 受けている。ウイルスは、生涯口腔咽頭で産生され、経口伝播する。幼児感染は 、ほとんど症状のない血清転化(seroconversion)に至るこ とが多い一方、成人感染は、高熱、白血球数の劇的な増加、咽頭炎、肝臓や脾臓 の肥大を伴う重篤な病気の原因となることが多い。診断により、猩紅熱、トキソ プラズマ症、ジフテリアや白血病を識別しなければならない。慢性感染 EBV感染は、急性初感染にみられるような慢性または慢性動揺性症状を示す ことはまれである。毛状白板症 免疫抑制(immunocompromised)患者ではEBVは舌に重篤な病変を引き起こす 可能性がある。免疫力の枯渇した個体におけるEBVの再活性化 細胞性免疫の低下は、EBVの再活性化を導く。その結果抗体価が上昇し、移 植の拒絶反応のような多数の可能な原因による有害な効果が記述されている。伴性細胞分裂症候群 ある遺伝子座が、男子のみ胎児性リンパ性網皮症に至る感染に関与している。バーキット(Burkitt's)リンパ腫とEBV バーキットリンパ腫の発生は染色体上の再配列に関連している。腫瘍細胞にE BVゲノムを含む場合がすべてではない 。しかし、少なくとも高発生率の地域では、これらの新形成の97%がEBV関 連であり、EBV感染の制御がバーキットリンパ腫発生の危険を減少させる可能 性がある。EBV関連「第2の疾病」の可能性としての鼻咽頭がん EBVが100%関与する他の疾病は、鼻咽頭がん(NPC)である〔「鼻咽 頭がんの生物学(“The Biology of Nasopharyngeal Carcinoma”)」,UICC tech nical report series,vol.71,シモンズとシャンムガラナム(M.J.Simons and K.Shanmugaratnam)(編集),International Union Against Cancer,Geneva ,p.1(1982)〕。NPCは鼻後方空間にあるローゼンミュレル窩(咽頭陥凹)で 最も高頻度で発生する。頚部リンパ腺に最初の典型的な転移が発生して初めて入 院する患者が多い。EBV関連新形成の制御 新形成を制御するに可能な3つの基本的な計画がある: 1. 早期発見と療法、 2. 病気開始を理想的には平均寿命を超えて遅らせること、そして 3. 予防。 これらの目標は多くの新形成のような多因子疾病においてもまた達せられる可 能性がある。それ自身では必ずしも病気を発生させることのできないような必須 因子を1つ以上除くことにより、または、新形成状態の出現を促進する因子を減 らすことにより病気の発生率は減少するだろう。ウイルス関連腫瘍の早期診断の ために本発明の特異的ウイルス関連抗原または抗体または遺伝学的材料を手段と して使用することにより必須因子の除去を促進するだろう。EBV関連NPCの診断のためのEBV関連遺伝子産物の使用 組成が明らかな組換え抗原が利用可能になる以前は、最も普通に用いられるウ イルス特異的血清学検査は、免疫蛍光法に基づいており、免疫蛍光法または免疫 酵素検定法において通常細胞に結合している抗原源として種々の性質を持ったそ して/または前処理したEBVゲノム陽性細胞を使用した。表Iは、疾病と抗体 および診断に使用できるウィルス抗原をまとめたものである。 現在使用されるEBV由来抗原は、その免疫応答の制限のためEBV感染者す べてに認識されるわけではない。さらに、いくつかのEBV関連抗原は他のヘル ペスウイルスとタンパク質レベルで配列の相同性がある。このように、本発明の 技術的な課題は、EBV感染のより確実な診断を可能とするEBV関連タンパク 質を提供することである。上述の技術的な課題はクレームにおいて特徴づけられ る発明の態様を提供することにより達成される。従って、本発明は、主な遺伝学 的な変異なしにEBVをコードするプローブも提供する。発明の概要 本発明によるEBV特異抗原の産生 1. すべての発見の結論として、本発明の目的の1つは抗体クラスと抗原の ウイルスカプシドクラスに特異的な抗体の検出法の感度を改良することであり、 集団検査やよりよい標準化のできるシステムを改良することである。 2. 組換えDNA技術の応用は、EBVの抗原性を改善するのに重要なポリ ペプチドの同定を可能にした。その生産は適切な宿主細胞を組み換えDNA分子 で形質転換し、適切 な培養系で培養することにより可能となった。 3. 本発明によれば、PCR法のための修飾したプライマーの選択を含む組 換えDNA法を、遺伝子または23kDa EBVタンパク質(BLLF2より 読まれる)をコードする遺伝子の少なくとも一部の遺伝情報を、たとえば、細菌 (例:大腸菌、サルモネラ、シュードモナス または バチルス属)、酵母(例 : カンジダまたは酵母菌属)、昆虫細胞(例: 夜蛾科(Spodoptera frugiper da SF251))、哺乳動物細胞(例: Vero 細胞、CHO 細胞、または リンパ芽球 細胞株)などの適当な宿主細胞において発現させるために使用する。 4. さらに、EBV 23kDaタンパク質をコードするゲノム領域を同定 し、診断上の目的にとってのそれらの重要性を立証した。従って、これらのタン パク質、あるいはその抗原決定基の作成のための重要な情報も本発明において開 示されている。 DNA配列は、天然、合成または半合成源を含むどんな材料源からのDNA配 列とでもハイブリダイズし、それは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌ クレオチド挿入そしてヌクレオチドストレッチの逆位などの突然変異によって、 エプスタイン−バールウイルスのB95−8タンパク質の読み枠BLRF2がコ ードする23kDaタンパク質に近似す るタンパク質の少なくとも一部分をコードするDNA配列と関連している。ハイ ブリダイゼーションの条件は、DNA分子のホモダイマーの融点以下である15 〜27℃の範囲が好ましい。本発明は、組み換えDNA技術によるEBV特異抗 原の作成と、EBV関連疾病の診断と予防と治療法における抗原の使用に関する ものである。従って、本発明の目的は新しいエプスタイン−バールウイルス抗原 を免疫学的方法により同定することであり、その抗原は鼻咽頭がん(NPC)、 感染性単核症やバーキットリンパ腫(表Iの説明文参照)のようなエプスタイン −バールウイルス関連疾病に関与している。本発明のもう1つの目的は、EBV のゲノム領域の局在と同定であり、たとえばそれはB95−8細胞〔American T ype Culture Collection,Rockville,MD USA(ATCC)CRL1612〕〔スカーレとス トロミンガー(Skare,J.,and Strominger,J.L.)、エプスタイン−バールウイ ルスの形質転換性B95−8株由来DNAのクローニングとBamHIエンドヌ クレアーゼ断片の遺伝子地図の作成(Cloning and mapping of BamHI endonucle ase fragments of the DNA from the transforming B95-8 strain of Epstein-B arr virus.)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:3860(1980)〕からクローニン グされているように、診断上の重要性や医学的目的のための重要性を有する上述 の抗原をコードしている。このことは患者血清の免疫沈降と組み合わせた雑種選 択法を使用することにより達成される(図1)。本発明のさらなる目的は、EB Vのゲノム領域のサブクローニングであり、たとえば、有効 な抗原p23の少なくとも一部をコードするB95−8細胞からクローニングさ れたEBVの現存ライブラリーからのサブクローニングである。このことをPC Rで行う。PCRは読み枠の末端に適当な制限酵素切断部位を必要とせずに、ゲ ノムDNA断片を増幅し、プライマー配列から合成された末端を含むような増幅 遺伝子を適切なクローニング手段で、発現プラスミドに挿入した。同じクローニ ング法がB95−8がコードする配列とは異なるであろう他のウイルス単離体か ら希望する遺伝子を増幅するためにも使用できることは明らかである。そのため には他のプライマーが必要となるかもしれず、そのようなプライマーの選択と作 成は当業者の技術範囲にある。コードする領域に相補的な配列の5’に付加する 配列(5’プライマー)やコードする領域に相補的な配列の3’に付加する配列 のプライマーの選択は、広範なサブクローニングをする必要性なしに可能であり 、付加したコントロールシグナルによる発現のために最も適したPCR産物から 直接クローンを樹立できる。本発明のもう1つの目的は、適した宿主細胞にそれ ぞれの遺伝情報を発現させることによるタンパク質の生成である、宿主はたとえ ば、細菌(例:大腸菌、サルモネラ、シュードモナスまたはバチルス属)、酵母 (例:カンジダまたは酵母菌属)、動物細胞とヒト細胞(例:Vero細胞;C HO−dhfr−細胞;適切な制御配列の制御の下、EBV遺伝子の遺伝情報と 機能するdhfr遺伝子を持つプラスミドを選択し適当な選択系と連結して;ま たはリンパ芽球細胞株)である。これらの宿主細胞により産 出されたタンパク質は23kDaの関連抗原決定基(エピトープ)を含み、発現 系によっては融合タンパク質または非融合タンパク質として合成される。細菌に よる融合タンパク質の産生のために、EBV B95−8のp23をコードする ゲノム副断片の発現は既知のプラスミドpUC8に導入して行われ、例えば、イ ソプロピル−β−D−チオガラクト−ピラノシド(IPTG)で誘導した。それ ぞれの発現産物を免疫学的方法で同定した。自然に発生するタンパク質またはそ の一部のアミノ酸配列を本来含む非融合タンパク質産生のため、本発明の組み換 えプラスミドを修飾できる。もし、発現ベクターの細菌のタンパク質をコードす る領域とEBV関連タンパク質をコードする領域の間にオリゴヌクレオチドリン カーを挿入したら、そのリンカーに対応するアミノ酸配列が発現融合タンパク質 の一部に生じるだろう。発現する形質転換細胞から融合タンパク質を単離後、導 入されたアミノ酸リンカーのアミノ酸配列に特異的なプロテアーゼによるか、も しアミノ酸リンカーが酸による開裂に敏感なペプチド結合を含んでいたら例えば 蟻酸のような酸処理により融合タンパク質を切断する。 本発明のさらなる目的は、臨床診断や科学研究に有用な診断構成物(キット) を作成するために、23kDa EBV関連タンパク質またはその副領域または もし適当なら、EBV関連DNA断片またはクローンを利用することである。こ れらの検査は、ELISA、RIA(ラジオノムアッセイ) または間接赤血球凝集反応法のような確立された原理に基づくものである。さら に、EBV関連タンパク質を例えば予防接種計画の監視、疫学上の問題の分析、 患者の処置(医薬品の成分)、そして単核症やバーキットリンパ腫や鼻咽頭がん のようなEBV関連疾病の治療において予防法としてのワクチンの生産のために 使用する。最後に、このタンパク質はEBV関連疾病の予防と治療に有効である 。なぜなら、それは、NPC、慢性伝染性単核症あるいはEBV関連バーキッド リンパ腫のような病気に罹患する患者において免疫応答を調節できるからである 。図面の簡単な説明 図1: EBVゲノムのBamHI DNA断片で選択したRNAハイブリッド からイン・ビトロで翻訳された産物のオートラジオグラフィー。 免疫沈降のため NPC患者由来のEBV特異血清のプールを使用した。35S標識免疫沈降タンパ ク質をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、X線フィルムをゲル に露出させた。「プール」と命名した対照は、免疫沈降できるEBV特異タンパ ク質のすべてを含む。オートラジオグラフィーからEBV陽性血清中に23kD aに対する抗体が存在することがわかる。ホルボールエステルで誘導したP3H R1細胞由来のRNAをEBV DNAのBamHI制限断片にハイブリダイズ させ、溶出させて、イン・ビトロで翻訳させたこともまた明らかである。既に報 告されているように、EBVゲノム陰性BJAB細胞で前吸着したEBV反応血 清のプールで翻訳生成物を免疫沈降させた〔セイブルとウォルフ(Seibl,R.and Wolf H.)、誘導P3HR1細胞と誘導Raji細胞由来のハイブリッド選択し たRNAの翻訳によるエプスタイン−バールウイルスタンパク質のゲノム上の遺 伝子座位決定(Mapping of Epstein-Barr virus proteins on the genome by tra nslation of hybrid-selected RNA from induced P3HR1 cells and induced Raj i cells.)、Virology 141:1-13(1985)〕。図2: EBV B95−8ゲノム関連mRNAの詳細な遺伝子地図。 EBV B95−8ゲノムのBamHI制限部位を図の下部に示し、それぞれの制限断片 を大文字と小文字で示す。ハイブリッド選択により個々のBamHI制限断片に 配置したタンパク質のmRNAは数字と線で示す。この詳細なマッピングにより EBV回復期の患者血清中に23kDaに対する抗体が存在することがわかる。図3: A) BamHI−L断片中の読み枠の局在。 23kDaの大きさをも つEBV抗原をハイブリッド選択翻訳によりマッピングした。BLLFIはEB Vの主要膜抗原をコードし、BLLF2、BLRFIとBLRF3は、計算上3 1kDa、11kDaおよび12kDaの分子量をもつタンパク質をコードする 。BLLF3もまたBamHI−S断片の近隣にマップするが、一方23kDa 抗原をコードする領 域は、BamHI−Lにしか発見されなかった。従って、23kDa抗原をコー ドする最も可能性のある候補はBLRF2がコードするタンパク質のようである 。 B) PCRで使用するヌクレオチド鎖とオリゴデオキシヌクレオチドプライ マーによるBLRF2の5’と3’末端の拡張 プライマー1は23kDaタンパク質のN末端をコードするDNA配列とハイブ リダイズする。相補的配列は第2コドンの後からスタート。翻訳開始近傍の領域 をBspHI部位に変化させATG発現ベクターにクローニングした。これは、 両方ともセリンをコードするTCAからAGCへの第2コドンの変化を含む。A TG開始コドンから上流のオリゴンデオキシヌクレオチド配列は、BamHI制 限酵素部位といくつかの追加したヌクレオチド(nt)をコードし、制限酵素消 化とクローニングを容易にする。プライマー2は、23kDaの翻訳終止部にハ イブリダイズし、ベクターに挿入するために5’末端にHindIII部位を含む 。両プライマーのハイブリダイズしない5’末端は、相補的鎖において第1回め のPCRサイクル中は合成されないが、次のサイクル中で新しく生成したPCR 産物が鋳型として使用される時合成される。図4: 増幅DNAの生成とクローニング。 1(B)で示したオリゴデオキシヌ クレオチドプライマーを8700DNA合成装置(Biosearch / MILLIGEN)の1 molカラムで合成 した。合成は非常に有効だったので、プライマーをカラムから切断後それ以上の 精製なしにPCRに使用した。それぞれ100μlの同じ組成を含む5つのPC R反応を並行して行った。その組成は製造業者の指示書に従って、0.25%総 プライマー収量、4ngのEBVのBamHI−L断片を含むプラスミド〔スカ ーレとストロミンガー(Skare,J.and Strominger,J.L.)エプスタイン−バー ルウイルスの形質転換性B95−8株由来DNAのクローニングとBamHIエ ンドヌクレアーゼ断片の遺伝子地図の作成(Cloning and mapping of BamHI endo nuclease fragments of the DNA from the transforming B95-8 strain of Epst ein-Barr virus.)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:3860(1980)〕、ヌクレオ チド、緩衝液、Taqポリメラーゼであった。反応は、Ericomp温度循環 器中、アニーリング温度50℃2分間、鎖の伸長72℃4分間、熱変性94℃1 分間で行った。50サイクル行い、生成したDNAを集め、エタノール沈澱させ 乾燥させた。DNAを200リットルのH2Oに再懸濁し、BamHIとHin IIIで消化した。DNA断片を1.5%アガロースゲル電気泳動で精製し、単 離してBamHIとHindIIIで直鎖状にしたpUR289と連結した。大腸 菌JM109への形質転換後〔ヤニッシューペロン(Yanish-Perron)ら、改良 M13ファージクローニングベクターそしてM13mp18とpUC19ベクタ ーの宿主株ヌクレオチド配列(Improved M13 phage cloning vectors and host s trains nucleotide sequences of M13mp18 and pUC19 vectors.)、 Gene 33:103-119(1985)〕、制限酵素消化により、23kDa抗原をコードする 断片を持つコロニーのプラスミドをスクリーニングした。EBV抗原の産生は、 陽性クローンをIPTG誘導させ、タンパク質のPAGEをし、クーマシーブル ー(Coomassie blue)染色またはウエスタンブロットで可視化した(図5)。生 成クローン、pUR23kからBamHIとHindIIIで消化し再び単離した 23kDaをコードするセグメントをpDSに挿入した(pD523k)。第3 段階で、BspHIとHindIII切断によって断片を単離し、NcoIとHi nd IIIで直鎖状にしたpKK233−2と連結した(pKK23k)。最後に 、pDS23k由来370bpのNlaIV/HindIII断片を得て、HindI IとHindIIIで直鎖状にしたpUC8と連結した(pUC8−N234)。こ こに述べたすべての発現クローニング方法はベクター配列からEBV由来断片へ フレームを合わせて翻訳する機能を与える。図5:大腸菌における23kDa発現生成物の同定 IPTG誘導クローン(1mM IPTG 37℃で3時間)のタンパク質を SDS−17.5PAGEで分析し、クーマシーブルー染色(左パネル)または ウエスタンブロット後、NPC患者由来の高い抗体価の血清プールで免疫染色し た。レーン1:pUR289,β−Gal発現;レーン2:pUR23k;レー ン3:pDS23k;レーン4:pKK23k;レーン5:pUCN23k。β −Gal::レーン2 の23kDa融合タンパク質はレーン1のβ−Gal(116kDa)よりも大 きい。このことは増幅DNA断片の読み過ごしを意味する。レーン3の23kD aの発現生成物は、約24kDaの大きさであり、大量に合成されている。しか し、レーン4のATGベクターからの真の23kDa発現生成物は効率的には産 生されていない。レーン5のpUCN23由来23kDa抗原断片のC末端は安 定のようであり、非常に効率的に産生されている。すべての抗原はNPC血清プ ールとかなり強力に反応する。このことはウイルス感染中のこのタンパク質の抗 原性を示す。図6: エプスタイン−バールウイルスのBLRF2の読み枠からの23kDa 抗原のDNAとアミノ酸配列 本発明を実施例により説明する。実施例1: 23kDaタンパク質をコードする領域の増幅。 EBVのBamHI−L断片上の23kDaタンパク質(BLRF2)をコード する可能性のある領域は162アミノ酸を含む。読み枠全長の直接のクローニン グに利用できる5’末端と3’末端の適当な制限酵素部位はない。この理由のた め、我々はコード領域の5’末端と3’末端に相補的な2つのオリゴデオキシヌ クレオチドを合成し、PCRのプライマーとして使用した。それぞれのプライマ ーは増幅したDNAのクローニング(図1)に使用できる制限部位を5’末端に 付加した配列と、これらの制限酵素での切断を容易にする2〜3のヌクレオチド をさらに含む。PCRの後、増幅したDNAセグメントをBamHIとHind IIIで切断し、アガロースゲル電気泳動で精製し、プラスミドベクターとのクロ ーニングに使用した。EBVの分離物、B95−8由来の全BamHI−L断片 を含むプラスミド〔スカーレ,J. とストロミンガー,J.L.(Skare,J.,and S trominger,J.L.)エプスタイン−バールウイルスの形質転換性B95−8株由来 DNAのクローニングとBamHIエンドヌクレアーゼ断片の遺伝子地図の作成 、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:3860(1980)〕を鋳型として使用した。実施例2: β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質として大腸菌での23kDa VCAの発現。 大腸菌中では多くの組み換え抗原は非融合抗原として安定に発 現しないので、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を作成することにより、第 1の評価を行った。理論上、細菌の大きなタンパク質は不安定なタンパク質セグ メントの分解を防止する。この理由からBamHIとHindIIIで消化した増 幅DNAをβGal発現ベクターpUR289のlacZ遺伝子の3’にフレー ムを合わせてクローニングした〔リュターとミュラー−ヒル(R EMBO J.2(1983)1791-1794〕(図4)。このベクターを含む大腸菌クローンを β−Gal::23kDa融合タンパク質を発現させるために、IPTGで誘導し た。図5からβ−G al標準品よりも高分子量の生成物が合成されたことが明らかである。融合タン パク質はEBVの高抗体価をもつ血清と特異的に反応する。このことは、正しい 翻訳が行われ、PCRによる大きな誤りや終止コドンが導入されず、免疫原性の あるEBV抗原が生成することを示すものである。実施例3: タンパク質標準品としての23kDa VCAの発現。 pUR28 9−23kからEBVをコードする領域をBamHIとHindIIIで単離し、 本明細書のためにpDS3と再命名したpDS12/PBSII−2にクローニン グした〔ブジャード,H.ら(Bujard,H.et al.)イン・ビトロとイン・ビボでの 分析のためのT5プロモーターに基づく転写翻訳系、Meth.Enzymol. 155:416 (1987)〕。pDS3は23kDaをコードする領域において与えられるものと 同じ翻訳フレームを供給する(図4)。IPTGで誘導後、クーマシー染色した PAGE中に23kDaの新しいタンパク質が出現する。それは、ウエスタン ブロットでEBV血清と特異的に反応し、クーマシー染色したゲルから推定し得 るように総大腸菌タンパク質の約10%を占める(図5)。発現生成物はクロー ニング部位とオリゴデオキシヌクレオチド配列由来のいくつかのアミノ酸を含む ため、このBspHIとHindIIIを単離しATGベクターpKK233−2 のNcoIとHindIII部位へ挿入することによりタンパク質標準品の発現を 達成した〔アマン,E.とブロシウス,J.(Amann,E.and Brosius,J.)大腸菌で のクローン遺伝子の高レ ベルの発現を制御する「ATGベクター」、Gene 40:183-190(1985)〕。しか しながら、このベクターからの23kDa抗原の発現収量はpDSベクターから よりもずっと低かった。おそらく、N末端配列を変えたことにより生じた大腸菌 細胞中のこのタンパク質の非効果的な翻訳によるためであろう。23kDa抗原 のC末端部分をコードするより小さな断片からより高い発現が達成された。コー ドする領域からNlaIV/HindIII断片を単離し、pUC8のHindII/Hind III部位へ挿入し〔ヴィエィラ,B. と メッシング,B.(Vieira,B.a nd Messing,B.)汎用性の合成プライマーを用いた突然変異誘発の挿入と配列決 定のためのpUCプラスミド、M13mp7誘導系、Gene 19(1982)259-268〕、 pUCN23kを作成した。再び、IPTG誘導後、非常に効率的な抗原生成が 見られた。しかし、この抗原はタンパク質標準品のN末端を含んでいないため、 これ以上の評価には用いなかった。実施例4: 23kDa VCAの反応性と特異性。 種々の血清源たとえば、伝 染性単核症患者、NPC患者、そして健康保菌者などから得たEBV陽性血清と 陰性血清を用いて組換え抗原の診断上の価値の最初の評価を行った。pDS23 k由来の23kDa抗原を含む細菌の粗溶菌液と対照として外来抗原を持たない 溶菌液をPAGEで泳動分離した。タンパク質をニトロセルロースフィルターに 移し、それからフィルター片を血清と共にインキュベートした。免疫染色したウ エスタンブロット片の結果を表IIに要約する。従来の免疫蛍光検査と比べて、健 康保菌者やNPC患者由来のVCA陽性血清は23kDa抗原に対して明らかに 陽性であった。IF検査で反応した2つの血清だけは反応を示さなかった。IF から決定した初感染者の3つの血清もまた反応を示さなかったし、EBV陰性だ と信じていた3つの血清はp23kDa抗原に陽性であることがわかった。要約 すると、IFとウエスタンブロット活性の大体の相関が見られる。しかしながら 、IF検査と比較してこの抗原の関連性と感度を試験するなお一層の検査が必要 である。 IF検査による血清の分類は:VCA+,EBNA+ =健康保菌者;VCA+ ,EBNA+臨床データ=NPC;VCA+,EBNA-,臨床データ=初感染; VCA-,EBNA-,=EBV陰性であった。
【手続補正書】特許法第184条の8 【提出日】1995年8月14日 【補正内容】 請求の範囲 1.図6に示すようなアミノ酸配列を有するEBV−関連抗原性タンパク質に相 当することを特徴とする、EBV−ゲノムのDNA配列。 2.コードされるEBV関連抗原性タンパク質が23kDaの分子量を有するこ とを特徴とする、請求項1記載のDNA配列。 3.天然、合成または半合成起原などの如何なる起原由来のものかを問わず、請 求項1または請求項2のいずれかに記載されたDNA配列にハイブリダイズする DNA配列であって、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入 およびヌクレオチドストレッチの逆位などの突然変異によって請求項1または請 求項2記載のDNA配列に関係付けられ、そして該23kDaEBVタンパク質 の抗原性を有するタンパク質をコードするDNA配列。 4.その構築が図4に示されている組換えプラスミドpUR289−23k、p DS−23k、pUC8−N23中に挿入されることを特徴とする、請求項1ま たは請求項2記載のDNA配列。 5.その結果産生されるポリペプチドにおいて配列特異的プ ロテアーゼの切断部位として役立ちまたはギ酸のような酸で酸処理することによ り切断可能なまたはその後の精製を容易にするようなオリゴペプチドをコードす るオリゴデゾキシヌクレオチドをその5’末端に含むことを特徴とする、請求項 1〜請求項4いずれか1項に記載のDNA配列。 6.請求項1〜請求項5いずれか1項に記載のDNA配列を含むことを特徴とす る、クローニング用の組換えDNA分子。 7.発現制御配列に機能的に連結されている請求項1〜請求項5いずれか1項に 記載のDNA配列を含むことを特徴とする、発現用の組換えDNA分子。 8.発現制御配列が、大腸菌ラムダ−プロモーター系、大腸菌lac−系、大腸 菌β−ラクタマーゼ系、大腸菌trp−系、大腸菌リポプロテインプロモーター 系、酵母発現制御配列または他の真核細胞発現制御系であることを特徴とする、 請求項7記載の組換えDNA分子。 9.請求項6〜請求項8のいずれか1項に記載の組換えDNA分子の少なくとも 1つで形質転換されることを特徴とする、宿主。 10.大腸菌、その他の細菌、酵母、その他のカビ、動物細 胞またはヒト細胞の株である、請求項9記載の宿主。 11.EBV−関連疾病の診断および治療に適するEBV−関連抗原性決定基を 有するタンパク質であって、請求項1〜請求項5いずれか1項に記載のDNA配 列によってコードされることを特徴とするタンパク質。 12.請求項11記載のタンパク質を含むことを特徴とする融合タンパク質。 13.請求項11記載のタンパク質を含むことを特徴とする非融合タンパク質。 14.請求項11〜請求項13いずれか1項に記載のタンパク質を製造する方法 であって、請求項9または請求項10記載の宿主の培地中での適当な条件下での 培養、培養中でのタンパク質の蓄積、およびそれからの回収を含む方法。 15.抗−EBV−抗体の検出用の診断組成物であって、請求項11〜請求項1 3いずれか1項に記載のタンパク質を少なくとも1つ、試料中の該抗−EBV− 抗体と結合するのに充分な量で含む診断組成物。 16.請求項1〜請求項5いずれか1項のDNA配列に適当なオリゴヌクレオチ ドプライマーをアニーリングさせそして ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行わせるステップを含むクローニング可能な および/または発現可能なDNA配列を構築する方法であって、該プライマーが それらの5’−末端および3’−末端にそれぞれクローニング制御配列および/ または発現制御配列を表す付加的な非−相同的配列を含むことを特徴とする方法 。 17.該発現制御配列が転写開始部位および/または翻訳開始部位および/また は増強部位および転写停止シグナルおよび/または翻訳停止シグナルまたはコー ドされる転写物のプロセッシングに重要な配列を含むことを特徴とする、請求項 16記載の方法。 18.請求項11〜請求項13いずれか1項に記載のタンパク質を少なくとも1 つ含むキット。 19.請求項11〜請求項13いずれか1項に記載のタンパク質の少なくとも1 つと薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。 20.請求項11〜請求項13いずれか1項に記載のタンパク質を含むワクチン 。 21.EBV関連疾病の予防または治療用の医薬組成物の製造における、請求項 11〜請求項13いずれか1項に記載の タンパク質の使用。 22.請求項19記載の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含 むEBV関連疾病の治療方法。 23.該EBV関連疾病がNPC、慢性伝染性単核症、またはEBV関連バーキ ットリンパ腫、ホジキン病、鼻咽喉ガン、臓器移植と関連するEBV再活性化で ある、請求項21記載の使用または請求項22記載の方法。 24.付加的な増幅を行いまたは行わずに、請求項1〜請求項5いずれか1項に 記載のDNA配列の全部または断片を使用してハイブリダイゼーションにより臨 床試料中のEBVDNAを検出することを特徴とする、EBV感染の特異的検出 のための手順。 25.請求項1または請求項2記載のDNA配列のコード領域の5’−および3 ’−末端およびそれぞれその相補鎖にハイブリダイズするプライマー対。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI C12P 21/02 9637−4B C12P 21/02 C C12Q 1/68 9453−4B C12Q 1/68 A //(C12N 15/09 ZNA C12R 1:92) (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (72)発明者 モッツ,マンフレッド ドイツ連邦共和国 ムーニック デー― 81379,シャハナーストラーセ 7 (54)【発明の名称】 診断上重要なウイルスカプシド抗原をコードするエプスタイン−バールウイルスDNA配列、ポ リメラーゼ連鎖反応により誘導された発現クローンおよび診断試験におけるこの組換え抗原の使 用

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.図6に示すようなアミノ酸配列を有するEBV−関連抗原性タンパク質の少 なくとも一部に相当することを特徴とする、EBV−ゲノムのDNA配列。 2.コードされるEBV関連抗原性タンパク質が23kDaの分子量を有するこ とを特徴とする、請求項1記載のDNA配列。 3.天然、合成または半合成起原などの如何なる起原由来のものかを問わず、請 求項1または請求項2のいずれかに記載されたDNA配列にハイブリダイズする DNA配列であって、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入 およびヌクレオチドストレッチの逆位などの突然変異によって請求項1記載のD NA配列に関係付けられ、そして該23kDaEBVタンパク質の抗原性を有す るタンパク質をコードするDNA配列。 4.組換えプラスミドpUR289−23k中に挿入されるものであることを特 徴とする請求項2記載のDNA配列。 5.組換えプラスミドpDS−23kおよびpUC8−N23中に挿入されるも のであることを特徴とする請求項2記載のDNA配列。 6.組換えプラスミドpMDIIIおよびpVL941中に挿入されているもので あることを特徴とする請求項2記載のDNA配列。 7.その結果産生されるポリペプチドにおいて配列特異的プロテアーゼの切断部 位として役立ちまたはギ酸のような酸で酸処理することにより切断可能なまたは その後の精製を容易にするようなオリゴペプチドをコードするオリゴデゾキシヌ クレオチドを5’末端に含むことを特徴とする、請求項1〜請求項6いずれか1 項に記載のDNA配列。 8.請求項1〜請求項7いずれか1項に記載のDNA配列を含むことを特徴とす る、クローニング用の組換えDNA分子。 9.発現制御配列に機能的に連結されている請求項1〜請求項7いずれか1項に 記載のDNA配列を含むことを特徴とする、発現用の組換えDNA分子。 10.発現制御配列が、大腸菌ラムダ−プロモーター系、大腸菌lac−系、大 腸菌β−ラクタマーゼ系、大腸菌trp−系、大腸菌リポプロテインプロモータ ー系、酵母発現制御配列または他の真核細胞発現制御配列であることを特徴とす る、請求項9記載の組換えDNA分子。 11.請求項8〜請求項10のいずれか1項に記載の組換えDNA分子の少なく とも1つで形質転換されることを特徴とする、宿主。 12.大腸菌、その他の細菌、酵母、その他のカビ、動物細胞またはヒト細胞の 株である、請求項11記載の宿主。 13.EBV−関連疾病の診断および治療に適するEBV−関連抗原性決定基を 有するタンパク質であって、請求項1〜請求項7いずれか1項に記載のDNA配 列によってコードされることを特徴とするタンパク質。 14.請求項13記載のタンパク質を含むことを特徴とする融合タンパク質。 15.請求項13記載のタンパク質を含むことを特徴とする非融合タンパク質。 16.請求項13〜請求項15いずれか1項に記載のタンパク質を製造する方法 であって、請求項11または請求項12記載の宿主の培地中での適当な条件下で の培養、培養中でのタンパク質の蓄積、およびそれからの回収を含む方法。 17.抗−EBV−抗体の検出用の診断組成物であって、請 求項13〜請求項15いずれか1項に記載のタンパク質を少なくとも1つ、試料 中の該抗−EBV−抗体と結合するのに充分な量で含む診断組成物。 18.請求項1〜請求項7いずれか1項のDNA配列に適当なオリゴヌクレオチ ドプライマーをアニーリングさせそしてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行わ せるステップを含むクローニング可能なおよび/または発現可能なDNA配列を 構築する方法であって、該プライマーがそれらの5’−末端および3’−末端に それぞれクローニング制御配列および/または発現制御配列を表す付加的な非− 相同的配列を含むことを特徴とする方法。 19.該発現制御配列が転写開始部位および/または翻訳開始部位および/また は増強部位および転写停止シグナルおよび/または翻訳停止シグナルまたはコー ドされる転写物のプロセッシングに重要な配列を含むことを特徴とする、請求項 18記載の方法。 20.請求項13〜請求項15いずれか1項に記載のタンパク質を少なくとも1 つ含むキット。 21.請求項13〜請求項15いずれか1項に記載のタンパク質の少なくとも1 つと薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。 22.請求項13〜請求項15いずれか1項に記載のタンパク質を含むワクチン 。 23.EBV関連疾病の予防または治療用の医薬組成物の製造における、請求項 13〜請求項15いずれか1項に記載のタンパク質の使用。 24.請求項22記載の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含 むEBV関連疾病の治療方法。 25.該EBV関連疾病がNPC、慢性伝染性単核症、またはEBV関連バーキ ットリンパ腫、ホジキン病、鼻咽喉ガン、臓器移植と関連するEBV再活性化で ある、請求項23記載の使用または請求項24記載の方法。 26.付加的な増幅を行いまたは行わずに、請求項1〜請求項7いずれか1項に 記載のDNA配列の全部または断片を使用してハイブリダイゼーションにより臨 床試料中のEBV DNAを検出することを特徴とする、EBV感染の特異的検 出のための手順。
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