HU216622B - Vizsgálati eljárás Herpes simplex proteázt gátló anyagok meghatározására - Google Patents

Vizsgálati eljárás Herpes simplex proteázt gátló anyagok meghatározására Download PDF

Info

Publication number
HU216622B
HU216622B HU9201723A HU9201723A HU216622B HU 216622 B HU216622 B HU 216622B HU 9201723 A HU9201723 A HU 9201723A HU 9201723 A HU9201723 A HU 9201723A HU 216622 B HU216622 B HU 216622B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
protease
icp35
hsv
plasmid
protein
Prior art date
Application number
HU9201723A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT65494A (en
HU9201723D0 (en
Inventor
Fenyong Liu
Bernard Roizman
Original Assignee
Arch Development Corp.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/832,855 external-priority patent/US5478727A/en
Application filed by Arch Development Corp. filed Critical Arch Development Corp.
Publication of HU9201723D0 publication Critical patent/HU9201723D0/hu
Publication of HUT65494A publication Critical patent/HUT65494A/hu
Publication of HU216622B publication Critical patent/HU216622B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1133—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against herpetoviridae, e.g. HSV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16641—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16643—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

A találmány tárgya: vizsgálati eljárás herpeszprőteáz inhibitőrazőnősítására. Herpeszprőteázként előnyösen rekőmbináns enzimetalkalmaznak. Ennek előállítása sőrán egy expressziós vektőrt hőznaklétre, amely előnyösen egy eűkarióta prőmőter által ellenőrzött génttartalmaz, és a vektőrt gazdasejtbe – előnyösen egy eűkariótagazdasejtbe – viszik át, majd a prőteázt izőlálják. Az inhibitőrazőnősítására a prőteázhőz egy fehérjeszűbsztrátőt adnak, aprőteőlítikűs hasítás körülményei között; a reakcióelegybe beadagőljákaz inhibitőrt, és meghatárőzzák, hőgy be övetkezett-e afehérjeszűbsztrát hasítása. ŕ

Description

A találmány tárgya: vizsgálati eljárás herpeszproteáz inhibitor azonosítására. Herpeszproteázként előnyösen rekombináns enzimet alkalmaznak. Ennek előállítása során egy expressziós vektort hoznak létre, amely előnyösen egy eukarióta promoter által ellenőrzött gént tartalmaz, és a vektort gazdasejtbe - előnyösen egy eukarióta gazdasejtbe - viszik át, majd a proteázt izolálják.
Az inhibitor azonosítására a proteázhoz egy fehérjeszubsztrátot adnak, a proteolitikus hasítás körülményei között; a reakcióelegybe beadagolják az inhibitort, és meghatározzák, hogy bekövetkezett-e a fehérjeszubsztrát hasítása.
A leírás terjedelme 54 oldal (ezen belül 26 lap ábra)
HU 216 622 B
HU 216 622 Β
A találmány tárgya eljárás herpeszvírus proteázok (HSV) működését gátolni képes anyagok azonosítására.
A vírusfertőzések súlyos egészségi problémát jelentenek.
A vírusfertőzések kezelése és megelőzése fontos orvosi cél. A fertőző vírus szerkezetének és működésének megértése fontos ahhoz, hogy átlássuk a vírusfertőzések kezelésére és megelőzésére szolgáló módszerek kidolgozásának lehetőségeit. A vírus egy kisméretű genetikai elem, amely egyes vagy kettős szálú DNS-t vagy RNS-t tartalmaz, és két elkülönült állapotban létezhet, azaz intracelluláris vagy extracelluláris. A vírusok obiigát intracelluláris paraziták, amelyek nem képesek önállóan szaporodni. A vírusok kisajátítják a gazdasejt bioszintetikus rendszerét, és azt saját szintézisükre használják. A virális DNS fehéijetermékei között található néhány speciális enzim vagy gátló faktor, amely a gazdasejt anyagcseréjét leállítja, ám a vírus által kódolt fehérjék többsége az új virionok létrehozásában vesz részt. A vírus úgy irányítja a fehérjeszintézist, hogy létrejöjjenek a replikálódásához és becsomagolásához szükséges komponensek, például a kapszid. Ezek a komponensek a vírus által meghatározott sorrendben állnak össze, és az új részecskéknek ki kell szabadulniuk a sejtből, hogy más sejteket megfertőzzenek.
Az intracelluláris virális replikáció (litikus ciklus) általános lépései a következők:
1. a vírus hozzátapad a gazdasejthez (adszorpció);
2. a vírus vagy nukleinsavja behatol a gazdasejtbe;
3. a virális nukleinsav replikálódik;
4. a virális fehérjék és más létfontosságú komponensek szintetizálódnak;
5. összeállnak a virális nukleinsav- és fehérjekomponensek; és
6. az érett virionrészecskék kiszabadulnak a gazdasejtből.
A litikus ciklus végső eredményeképpen új vírusrészecskék és elpusztult gazdasejtek keletkeznek, mivel a vírus elhasználta a gazdasejt létfontosságú erőit. Bizonyos típusú fertőzések esetében, ilyen például a herpeszvírus által okozott, lappangási periódus is jelentkezhet, amely során a vírus a gazdasejtben fennmarad.
A virális genetikai rendszer megismerése lehetőséget teremt a virális fertőzés és replikáció mechanizmusának tanulmányozására, s ez nem csupán elméleti jelentőségű, hanem a vírus által okozott betegségek felismerését, megelőzését és kezelését célozza. A vírusfertőzéssel szembeni rezisztencia megvalósulhat egyrészt a vírusreceptorok hiánya esetén, a vírus gazdasejthez történő tapadásának megelőzése révén, a gazdasejtbe behatolás után a virális nukleinsav destrukciója esetén, a létfontosságú virális proteinek szintézisének gátlása, vagy a keletkezett virális fehérjék lebontása révén a gazdasejtben.
Antivirális drogok kifejlesztése a természetes ellenálló képesség fokozása érdekében fontos kereskedelmi feladat, amelynek célja az emberekben előforduló sokféle vírusfertőzés pusztító hatásainak elhárítása. Sajnos azonban a ma elérhető ilyen kezelések a legtöbb fajta vírus esetén hatástalanok. Például az interferonok celluláris antivirális anyagok, kis molekulatömegű fehérjék, s a vírusok szaporodását gátolják. Azonban az interferonok inkább gazda-, s nem vírusspecifikusak, és a már megfertőzött sejtekre hatástalanok. Nagy koncentrációban toxikusak lehetnek.
Az antivirális drogok célpontjai lehetnek a csak vírusra jellemző enzimek. Például az AIDS-et okozó HIVfertőzés elleni küzdelemben a fő célpont a reverz transzkriptáz. Ezen enzim gátlása ugyanis a virális replikáció blokkját eredményezi. Sajnos azonban rezisztencia fejlődik ki az ilyen hatású gyógyszerek, például az AZT ellen, s ez a fő gátja a kezeléseknek. A mai piacon megtalálható anti-herpesz simplex vírus gyógyszerek a virális DNS-t szintetizáló enzimek ellen irányulnak (például aciklovir). Az ilyen gyógyszerek elleni rezisztencia kialakulása miatt nagy az érdeklődés újfajta víruscélpontok iránt.
A virális fehérjék szintézise különös érdeklődésre tart számot, mint az az állapot, amelyben a vírus megtámadható. Extracelluláris, vagyis fertőző állapotban a vírusok alapfelépítése egy fehérjékkel körbevett nukleinsavmag (nukleokapszid). Néhány vírus burokkal is rendelkezik, amely a nukleokapszid körül helyezkedik el, lipidből és fehérjéből áll.
A fehérjeköpeny elnevezése kapszid, amely a vírus fajtájától függően igen különböző fehérjékből állhat. Néhány vírus 3-10 fehérjét kódol, mások 200-nál is többet. A vírusrészecskék elnevezése virion, a feladata pedig a vírus nukleinsav-védelme a szintézis helyszínéről az új gazdasejtbe történő eljutás során. A gazdasejtbe kerülés után a virális intracelluláris állapot kezdődik, s lehetővé válik a vírus replikációja. Számos nem herpesz jellegű vírushasítási hely specifikus proteázokat kódol, amelyek a terápiás beavatkozás lehetséges célpontjai. Azonban a herpeszvírus esetében ilyen proteázt eddig még nem azonosítottak, bár ez egy különösen elteqedt fertőző ágens, amelyre a kezelési és megelőző módszerek már nagymértékben elégtelenek.
A herpeszcsalád
A herpeszvírus családjába tartozó állati vírusok nagy klinikai jelentőséggel bírnak, mivel sok betegség okozói. Az Epstein-Barr vírust rák okozásával hozták kapcsolatba, a citomegalovírus a legnagyobb fertőzésveszélyt jelenti AIDS-betegek számára; és a Varicella zoster vírus (VZV) a föld azon részein jelent nagy gondot, ahol a bárányhimlő és az övsömör komoly egészségi problémát okoznak. A szexuális úton terjedő herpesz simplex (HSV) fertőzés előfordulásának világméretű emelkedése az elmúlt évtizedben következett be, az újszülöttkori herpesz terjedésével kísérve. Aktív elfekélyesedett sebbel vagy aszimptómásan kiválasztó betegekkel történő kontaktus a fertőző ágens átadásával járhat. Átadás a vírus nyálkahártya-felületekkel és lehorzsolt bőrrel való érintkezése során történik, amely lehetővé teszi a vírus behatolását, és a vírusreplikáció megkezdését az epidermisz és a dermisz sejtjeiben. Klinikailag nyilvánvaló sérülések mellett látens fertőzések is fennmaradhatnak, különösen idegsejtekben. Különböző ingerek okozhatják a HSV-fertőzés reaktiválódását. Következésképpen ezt a fertőzést igen nehéz megsemmisí2
HU 216 622 Β teni. Ez a kór akadálytalanul terjed a gyógykezelési módok elégtelenségének következtében.
Herpesz simplex vírus (HSV)
A herpesz simplex vírusok 1 és 2 számú altípusai (HSV-1, HSV-2) az embert érintő leggyakoribb fertőző ágensek közé tartoznak (Corey és Spear, 1986; Whitley, 1990). Ezek a vírusok betegségek széles skáláját okozzák, amelyek jelenlétében kellemetlen fertőzésektől, például a herpesz simplex labiálistól kezdve komoly életveszélyes betegségekig, mint például az idősebb gyerekeket és felnőtteket érintő herpesz simplex encephalitis (HSE) vagy az újszülöttek elterjedt fertőzéséig teijednek. A herpeszfertőzés klinikai eredménye a korai diagnózis és az antivirális terápia azonnali megkezdésének függvénye. Mégis néhány sikeres terápiától eltekintve a dermális és epidermális fertőzések visszatérnek, és az újszülöttek HSV-fertőzése és az agy fertőzése a megbetegedések és halálozások nagy számával jár együtt. A mai gyakorlatnál korábbi diagnózis a terápiás sikert növelné. Emellett azonban tökéletesített kezelési módokra is óriási szükség van.
A fertőző sejtek számára külső segítséget adnak, leginkább különböző vegyszerek formájában. Például a herpeszvírus replikációjának kémiai gátlása történhet nukleozid analógokkal, mint például az 5-fluor-dezoxiuridin (FUDR), az 5-jód-dezoxiuridin, tiamin-arabinozid és hasonlók.
Kísérleti állati modellekben polispecifikus és monospecifikus anti-HSV ellenanyagok, HSV-stimulált limfociták és klónozott T-sejtek némi védelmet nyújtottak specifikus virális antigénekkel szemben (Corey és Spear, 1986). Azonban kielégítő kezelést nem találtak.
Proteázokat eddig nem azonosítottak herpeszvírusokban, de a herpeszvírusok családjáról rendelkezünk némi ismerettel. A herpeszvírusok kettős szálú DNS-vírusok, amelynek a gazdasejtmagjában replikálódnak. A herpesz virion több, mint 30 különböző fehérjéből áll, amelyek a gazdasejtben szerelődnek össze. A kapszid ezekből körülbelül 6-8-at használ fel. A herpeszvírusok előnyben részesítik a gerinces eredetű gazdasejteket.
A herpesz simplex vírus 1 (HSV-1) genomja nagy mennyiségben jelen lévő proteinkomplexet határoz meg, amely denaturáló gélekben több sávot ad a fehéijekomponensek különböző molekulatömege miatt. E fehérjék előzetes azonosítását már leírták. A herpesz simplex vírus 1 (HSV-1) kapszid fehérjéinek egy csoportjáról számol be Gibson és Roizman (1972, 1974). A virális kapszid fehérjék genetikailag és immunológiailag rokon családja, amit denaturáló gélben a migrációs sávok alapján azonosítottak, a fertőzöttsejt-fehérje 35 (ICP35) elnevezést kapta (Braun et al., 1983,1984). Legalább négy fő és több kisebb sávot találtak egydimenziós denaturáló poliakrilamid-géleken, és számos pontot kétdimenziós gélekben.
Braun et al. (1984) H745-tel szemléltetett monoklonális ellenanyag-panelt használva azt találta, hogy az ICP35 fehéijék poszttranszlációs módosulással legalább 6 fajtává (ICP35a, b, c, d, e, f) alakulnak, amelyek SDS poliakrilamid gélen különböző elektroforetikus mobilitást mutatnak. Bár a vírusfehéijék e csoportjának tagjai különböző molekulatömegűek, ugyanazon monoklonális ellenanyaggal mutathatók ki, és a HSV-1 genom egy régiójában kódoltak. Preston et al. (1983) az ICP35-tel feltehetőleg analóg fehérjék csoportjáról számolt be.
A HSV-1 genom nukleotidszekvenciáját meghatározták, és többnyire sikertelen próbálkozások történtek arra, hogy a különböző kapszid fehérjéket a genom szekvenciáihoz rendeljék. Például feltételezték, hogy az ICP35 fehérjék az UL26 elnevezésű nyitott leolvasási keretben kódoltak (McGeoch et al., 1988). A jelen találmányban kimutattuk, hogy ez a feltevés helytelen, vagy legalábbis hiányos. Az ICP35-öt kódoló régió közelítő térképezését kísérelte meg Braun et al. (1984) HSV-1xHSV-2 intertipikus rekombináns elemzés alapján. A szerzők feltételezték, hogy az ICP35 a timidin kinázt és a glikoprotein B-t meghatározó gének (Ul23 és Ul27) között elhelyezkedő szakasz által kódolt. Ez nem specifikus meghatározás, mivel ez a régió a mai ismereteink szerint négy gént foglal magába.
E találmány egy új virális célpont terápiás szempontból történő sikeres keresésének eredménye. A kutatás a HSV-1 ICP35 fehérjecsalád szubsztrátként való kiválasztásával kezdődött. Antivirális kemoterápiára alkalmas, különösen pedig herpeszvírus-fertőzéseknél használatos proteáz célpontazonosítása történt ily módon. A proteáz előállítási eljárásán kívül a proteáz inhibitor azonosításának módszerét, csakúgy, mint a proteáz gátlásán alapuló detektálási útmutatót ugyancsak leírjuk a találmány ismertetése kapcsán. Az, hogy hasonlóság található a HSV-1 és az emberi citomegalovírus herpeszproteáz génje között, jelzi, hogy a találmány széleskörűen használható az összes herpeszvírus, így a HSV, CMV, EBV és VZV esetében is.
A találmány lehetőséget nyújt vírusfertőzések megelőzésére szolgáló módszerek és vegyületek kifejlesztésére virális proteázok előállítása, azonosítása, tisztítása és működtetése révén. A találmányban leírt proteázok további definíció szerint szerinproteázok, amelyek mutatják a proteázok e csoportjának jellegzetességeit. A szerinproteázok olyan enzimek, amelyek peptidkötések hidrolízisét katalizálják, és az akciócentrumban jellegzetesen szerincsoport található (White, Handler és Smith, 1973). A szerinproteázokat ezenkívül még katalitikus csoportok hármas, triád elrendeződése jellemzi, ahol a csoportok az aminosavak lineáris sorrendjében távol vannak egymástól, azonban a helyesen felcsavart proteázban „proteolitikus hasadékof ’ alkotva közel kerülnek egymáshoz. Az egyes proteázok között a katalitikus triádokban különböző eltérések találhatók. Például a tripszin és a szubtilizin szerinproteázokban a katalitikus triád aminosavai az Asp, a His és a Ser. Azonban a tripszin típusú szerinproteázokban az aminosavak sorrendje His, Asp, Ser, míg a szubtilizin típusúakban Asp, His, Ser. Különbséget találhatunk még e kulcscsoportok relatív elhelyezkedésében is. E proteázok esetében ezenkívül még található több, evolúciósán konzerválódott jellemvonás, amelyek alapján szerinproteázként azonosíthatók és tovább osztályozhatók. A katalitikusán meghatározó Asp, His és Ser csoportok megléte azonban az a döntő ismérv, amelynek alapján a szerinproteázok azonosítása és osztályozása történik.
HU 216 622 Β
A találmányban leírt proteázok a vírus kapszid fejlődése szempontjából meghatározó jelentőségűnek tűnnek. Tehát a proteázműködés gátlása a vírus litikus ciklusának megszakításához vezet. Nyilvánvalóan az ilyen proteázok az antivirális terápia optimális célpontjai. Különösen a herpeszvírus elleni támadásban fontos ez a célpont, amelyre ezidáig proteázt még nem írtak le. A találmány szerinti eljárással előállított herpesz szerinproteázok gátlói alkalmazhatók herpeszfertőzések felismerése és kezelése során.
Egy szemléltető kiviteli mód során HSV-1-ből, a herpesz simplex vírus egy altípusából proteázt tisztítottunk. A proteáz látszólagos molekulatömege SDS poliakrilamid gélelektroforézissel (PAGE) meghatározva körülbelül 75 -85 kd, általában 80 kd körüli. A herpeszproteáz további jellemzője, hogy aminosav-szekvenciája körülbelül 450-635 aminosavból áll. Azonban ezek a határok rugalmasak. Például a 635 aminosav hosszú szekvencia karboxi végéről 329 aminosavat eltávolítva még mindig találunk mérhető szerinproteáz-aktivitást. A 635 aminosavas kiviteli mód esetén a proteázhasítási-hely a karboxivégződéstől 18-25 aminosavnyi távolságra helyezkedik el, inkább körülbelül 20 aminosavnyira a karboxivégtől. A proteázokat HSV-1-gyei vagy HSV-2-vel beoltott, vagy proteázt kódoló DNSszekvenciával transzfektált sejtekből nyertük, illetve tisztított formában in vitro vagy sejtmentes rendszerben szintetizálva, például nyúlretikulocita-lizátumot használva. A fehérjeszintézis után a fehérje a denaturáló gélen egy sávként vándorol, és könnyen detektálható 35S-nel jelölt metioninnal. Körülbelül 5 óra fehérjeszintézis után két sáv figyelhető meg. Mint azt a későbbi részekben kimutatjuk, a második sáv az első önhasítási terméke.
A proteáz jellemzői: (i) négy doménből áll, amelyek közül több nem feltétlenül szükséges a katalitikus aktivitáshoz és (ii) az aktív centrum a proteáz aminoterminális végéhez van közel. Aminosav-szubsztitúció, deléció, stop kodon vagy 20 aminosavas szakaszok inszerciója által létrehozott mutációk segítségével körvonalaztuk a gén amino és karboxil doménjeinél az I. és
IV. számú mellőzhető doméneket. AIII. számú esszenciális karboxi-proximális dómén legalább 20 aminosavval elválasztható a II. számú esszenciális doméntől, s a proteáz még működőképes marad.
Az amino-proximális dómén a legkonzervatívabb régió a Varicella zoster vírus és az emberi citomegalovírus UL26 homológok között. Az e doménban megvizsgált aszparaginsav, hisztidin és szerin aminosav kodonok közül csupán a 61. és 148. hisztidincsoport cserélhető ki a proteáz proteolitikus aktivitásának károsítása nélkül. Háromdimenziós kristályszerkezet-elemzés további bepillantást adhat az aktív centrumok szerkezetébe (Skalka, 1989).
Az itt jellemzett herpeszproteázt kódolni képes nukleinsavszakaszok és egy szemléltető kiviteli mód során a HSV-1 genombeli szekvenciák nagymértékű manipulációja lehetővé tette egyes virális mechanizmusok feltárását, fontos nukleinsavszakaszok és ezek expressziós termékeinek izolálását és tisztítását. Ilyen manipuláció például a nukleinsav-szekvencia kiválasztott szakaszainak beépítése plazmidokba megfelelő promoterekkel és nyomjelzőkkel együtt a célból, hogy meghatározzuk a genetikai szakaszok hatását és kölcsönhatását, expreszsziós termékeiket és az expressziót szabályozó mechanizmusokat.
A találmány megvalósítása során meghatároztuk a herpesz simplex vírus 1 ICP35 elnevezésű kapszidfehérje-családjának kódoló doménjét a nukleinsavszakaszban. Ez az újonnan meghatározott kódoló régió az UL26.5 elnevezést kapta. Egy, az ICP35 fehérjéket kódoló szekvenciákat szemléltető kiviteli mód során ezt a szakaszt a Hpa-I és Pst-I restrikciós endonukleáz hasítási helyekkel határoltuk el. A két hasítási hely a +832 és a +2761 térképpozícióban helyezkedik el. A térképpozíciót a HSV-1 genom UL26 nyitott leolvasási keretének átírási kezdőhelyétől számított távolságként definiáltuk. Ezt a pozíciót + 1-nek neveztük el. Az ICP35 fehéijéket kódoló gén tartalmazza még a +2104 helyzetű KpnI helytől downstream elhelyezkedő szekvenciákat, és a +2318 pozíciónál található poli A helyig folytatódik.
A találmány szerinti eljárásban szereplő nukleinsavszakaszok további jellemvonása, hogy átfedő nyitott leolvasási kereteket tartalmaznak a proteázra és az ICP35 fehérjékre (2. ábra). Az átfedő szakaszok ,,3’koterminálisok”. Az első szakasz, a hosszabbik, az első fehérjét kódolja. Az első fehérje körülbelül 75-85 kd molekulatömegű. A második nyitott leolvasási keret, a két átfedő ORF közül a kisebb, egy második fehérjét kódol, ami körülbelül 40-55 kd-os látszólagos molekulatömegű SDS poliakrilamid gélelektroforézis alapján, inkább 45 kd. Az első ORF proteolitikus egységet kódol, amely képes egy aminosav-szekvencia hasítására a szerinproteáz működésének megfelelően. A hasítás lehetséges szubsztrátja lehet maga az UL26 gén által kódolt proteázszekvencia vagy az ICP35 prekurzor fehérjék, amelyek előzetesen ICP35 c és d elnevezésűek voltak egy- és kétdimenziós gélekben történő vándorlásuk alapján. Húsz aminosav hosszú epitop inszerciója nem gátolja meg a hasítást.
A második fehérjét kódoló nukleinsavszakasz, legyen DNS vagy RNS, körülbelül 990 bázispárt tartalmaz egy HSV-1 példában. Némely alkalmazás során a kódolt szakasznak csak azon szekvenciákat kellett tartalmaznia, amelyek hasítás után az ICP35 e-t és f-et eredményezik. Más esetekben csak maga a hasítási hely kódolása szükséges, például a későbbiekben ismertetett inhibitorjelölt-próbánál. Egy szemléltető példa során a nukleinsavszakasz lényegében a leírás 1A ábrájának 5. sorában kijelölt szakaszokat vagy ezek egyenértékűen működőképes változatait tartalmazza.
Egyenértékűen működőképes változaton (funkcionális ekvivalens) olyan enzimeket és azokat kódoló nukleotidszekvenciákat értünk, ahol bizonyos szerkezeti változások történtek, de amelyek az ICP35 hasítására képes katalitikusán aktív proteázok vagy ilyeneket kódoló szakaszok. Általánosan ismert, hogy módosítások és/vagy változtatások történhetnek a fehérjék szerkezetében, s a molekula hasonló vagy más szempontból értékes jellegzetességeket mutat. Vagyis bizonyos aminosavak kicserélhetők egy fehérjeszerkezetben anélkül, hogy ész4
HU 216 622 Β revehető változás következne be például szubsztrátmolekulákkal vagy specifikus antitestekkel való kölcsönös kötési képességében. Mivel a fehérje kölcsönhatási képessége és természete az, amely az adott fehérje biológiai funkcionális aktivitását meghatározza, bizonyos aminosavszekvencia-szubsztitúciók végrehajthatók egy fehérje szekvenciájában (vagy természetesen az alapjául szolgáló nukleinsav-szekvenciában), és mindazonáltal azonos tulajdonságú fehérje lesz az eredmény. Tehát a feltalálók feltételezik, hogy a herpeszproteáz DNS- vagy fehéijeszekvenciákban különböző változások eszközölhetők biológiai használhatóságuk vagy aktivitásuk észrevehető változása nélkül.
Ilyen változtatások során az aminosavak hidropatikus indexét (pK) figyelembe vehetjük. A hidropatikus aminosavindex, vagyis a hidrofobicitás és töltési jellemzők jelentősége a fehéijék kölcsönhatási biológiai funkciójának meghatározásában általánosan elismert (Kyte et al., 1982). Például ismert, hogy bizonyos aminosavak kicseré lhetők más, hasonló hidropatikus indexű vagy jelű aminosavra (általában ± 1), és mégis azonos biológiai aktivitást mutatnak. Feltételezések szerint az aminosavak relatív hidrofil jellege szabja meg a keletkező fehérje másodlagos szerkezetét, amely viszont meghatározza a fehéqe kölcsönhatását a szubsztrátmolekulákkal. így például feltételezik, hogy a +4.5 hidropatikus indexű izoleucin felcserélhető a valinnal (+4.2) vagy a leucinnal (+3.8), s még mindig hasonló biológiai aktivitású fehérjét kapunk. Hasonlóan, a skála túlsó végén feltételezik, hogy a lizin (-3.9) felcserélhető az argininnel (-4.5) stb.
Aminosav-szubsztitúciók tehát általában az oldalláncok relatív hasonlóságán alapulnak, például méret, elektrofil sajátosságok, töltés stb. tekintetében. Példaszerű szubsztitúciók, amelyek az említett tulajdonságok közül többet figyelembe vesznek, jól ismertek a szakemberek számára, és ide tartozik például az alanin-, glicin- és szerin-, az arginin- és a lizin-, a valin-, leucinés az izoleucincsoport.
A találmányban leírt nukleinsav-szekvenciák hibridizációs próbaként is igen hasznosak, amely pedig számos alkalmazási lehetőséget kínál. Hibridizációs próbák használhatók például mutánsgén-klónok kiválasztásakor génkönyvtárakból, antiszensz molekulák előállításakor (például stabilizált antiszensz RNS-molekulák) vagy PCR primerként és próbaként, hogy csak egynéhányat említsünk a sok alkalmazási terület közül, amely hibridizációt is magába foglal a fehéijekódoló képesség mellett (vagy azon felül). Természetesen úgyszólván bármilyen hosszúságú hibridizációs próba előállítható, a kívánt alkalmazási terület és a hibridizáció körülményeinek függvényében. Például akár 10-14 nukleotid hosszúságú próbák is várhatóan stabil hibridet alkotnak a templát molekulával, egészen addig, amíg a hibridizáció körülményei megfelelnek a próba és a templát közötti szekvenciahomológia mértékének. Hasonlóképpen egészen egy gén, vagy akár összetett gének kódolására elegendő hosszúságú molekulák is használhatóak hibridizációs próbaként.
Mindenesetre előnyös hibridizációs próbaként vagy primerként használható nukleinsavmolekulák nagysága például 10-14-től 20, 30, 40 vagy 50, vagy hasonló számú nukleotidtól egészen 100, 200, 500, vagy akár 1000 vagy 2000 nukleotid hosszúságig terjedhet, a kívánt alkalmazási területtől és a hibridizáció körülményeitől függően.
így a találmány szerinti eljárásban megfelelő nukleinsavszakaszok hosszúsága az 1. ábrán ábrázoltnál lehet akár kisebb vagy nagyobb is, például megfelelhet egy körülbelül 14 nukleotid-bázispár hosszúságú régiónak, amely szigorú feltételek között képes az 1. ábrán látható nukleinsavszakaszhoz hibridizálni. Ilyen, ehhez hasonlóan rövid szakaszok használhatók például próbaként a proteáz kódoló szakasz jelenlétének kimutatására.
Nukleinsavszakasz lehet akár a proteáz vagy az ICP35 fehérjék mRNS-szekvenciája. Az utóbbi mRNS átírása a körülbelül +1000 pozíciótól (a + 1-nek elnevezett herpesz UL26 transzkripciós kezdőhelytől kijelölt távolság) a +2318 pozícióig tart. A transzláció az mRNS +1099 helyzetű metionin iniciációs kodonjánál kezdődik. Rövidebb vagy hosszabb szakaszok szintén számításba jöhetnek, a felhasználás mikéntjétől függően. Ezek az mRNS-szakaszok az ICP35 hasítási helyének szintéziséhez fontosak.
A herpeszgenomon belül különböző nukleinsavszakaszokat izoláltak és klónoztak. Herpeszproteázt kódoló nukleinsavszakaszt a herpeszgenomból az UL26 herpesz ORF térképelhelyezkedésnek megfelelő régióból kaphatunk. A proteázt kódoló szakaszon belül található egy rövidebb szakasz a timidin kináz és a glikoprotein gB gén között, ami a +832-től a +2138 pozícióig tart. Ez a kódoló szekvencia nemcsak az ICP35 herpeszkapszid-család fehérjéiként fejeződhet ki, de tartalmaz egy, az ICP35 kódoló szekvenciát szabályozó promoter szekvenciát.
Az ICP35 promotert izoláltuk, és rendkívül aktív promotemek bizonyult. Ezt az a megfigyelés bizonyítja, hogy az ICP35 kódoló egység a szubsztrátról sokkal több másolatot készít, összehasonlítva a hosszabb UL26 ORF proteáz termelésével. Ez a promoter szakasz 135 és 168 közötti bázispárt tartalmaz, s a térkép szerint az Ul26 első ORF-jének +832 és +1000 pozíciója között helyezkedik el. Ez a promoter régió képes az ICP35 fehérjék expresszióját elindítani. Más nukleinsav-szekvenciák expresszióját is képes nagyobb sebességre ösztönözni, például az Us5 és UL10 herpesz simplex génekét.
Az ICP35 fehéijék kódoló szekvenciáinak izolálása és manipulálása a találmány fontos eredménye, mivel ezek a fehérjék a herpeszvírus kapszidjának felépítésében vesznek részt. Az ICP35 fehérje prekurzor ICP35 c-t és d-t az Ul26 kódoló szekvencia által létrehozott herpeszproteáz kell, hogy hasítsa, és így átalakítsa a kapszid működőképes e és f elemeivé. Ez a proteáz képes a prekurzor fehérjék eredményes hasítására még akkor is, ha mind a proteázt, mind a prekurzort kódoló gének transz helyzetben vannak.
A találmányban leírt, kódoló szekvenciákat tartalmazó nukleinsavszakaszokat hordozhatja rekombináns expressziós vektor, amely képes a benne kódolt virális szerinproteázok expresszálására. Ilyen nukleinsavsza5
HU 216 622 Β kaszokra példa lehet a HSV-1 herpeszvírus esetében a leírás 1A ábrájának A-Z, AA-NN elnevezést viselő szakaszai. Ezek a nukleinsavszakaszok vagy funkcionálisan egyenértékű változataik tetszőlegesen kapcsolhatók kiválasztott promoter és/vagy kontrollelemekhez, csakúgy, mint más alkalmas elemekhez, például terminációs hely, poli A kapcsolóhely stb. (lásd például A-Z, AA-NN plazmidok). Ezek az elemek tartalmazhatnak promotert, mint például az <7.4, a herpesz ICP35 gének szabályozója, vagy gyakorlatilag bármely más promotert, amely a szelektív gazdasejtben képes expresszió működtetésére. Rekombináns expressziós vektorok hordozhatnak eukarióta vagy prokarióta promotert, a karboxiterminális aminosav 3’ pozícióján pedig poliadenilációs jelet. A promoter elhelyezkedhet a kódolt fehérje átírási egységén belül. A vektorok tartalmazhatnak még markereket, amelyeket az itt bemutatott vizsgálat is használt. Gazdasejtre példa a BHK sejtek, Verő, E. coli vagy más, a szakmabeliek által ismert, az átvitt vektorok expresszióját a találmányban leírt módon lehetővé tevő eukarióta vagy prokarióta sejtek.
A találmány leírása tárgyalja herpeszproteáz preparálási módszereit is. Egy lehetséges kiviteli mód a következő lépéseket tartalmazza:
(1) herpeszproteázt kódoló nukleinsavszakasz preparálása; és (2) a szakasz kifejeződésének lehetővé tétele fehérjetermelés céljából.
Egy szemléltető kiviteli mód során a proteáz preparálásának módszere magában foglalja gazdasejt használatát, amelybe a nukleinsavszakaszt transzferálunk. A gazdasejtet expresszió szempontjából megfelelő körülmények között tenyésztjük, és a fehérje így kifejeződik. A módszer tartalmazhat olyan lépést, amely során a fehérjét a szakmabeliek által jól ismert módszerekkel izoláljuk és tisztítjuk. A tisztítás kívánt mértéke a fehérje további felhasználásának függvénye. Vagylagosan, a nukleinsavszakasz sejtmentes rendszerben is kifejezhető, mint például nyúlretikulocita-lizátum vagy automata fehérjeszintetizálóban is létrehozható, mint az a referált irodalomjegyzékben olvasható.
A herpeszproteázt vagy az ICP35-öt kódoló nukleinsavszakaszt lehetséges herpesszel fertőzött sejtekből preparálni a virális genom DNS kinyerésével, s a vizsgált nukleinsavon belül felerősíteni a proteolitikus helyet tartalmazó nukleinsav-szekvencia-tartományt, és ilyen felerősített nukleinsavszakaszokat tartalmazó rekombináns kiónokat létrehozni. Ekkor kiválaszthatjuk a kívánt felerősített nukleinsavszakaszokat tartalmazó kiónokat, legalább a proteáz proteolitikus doménjét vagy az ICP35 fehérje hasítási helyét kódoló régió ellen irányított monoklonális ellenanyagok használatával, ilyen kiónok szkrinelésére. A szakmában járatosak által ismert más klónozási és szkrínelési technikák is megfelelőek (Sambrook et al., 1989).
A találmány tárgyalja a herpeszmolekula hasításának módszerét, melynek lépései során proteázzal kezelik a molekulát megfelelő körülmények között. Ezek azok a körülmények, amelyek között a szerinproteázok általában működnek.
Egy szemléltető példa herpeszproteáz detektálására szövetmintákban a következő lépéseket foglalja magában : proteáz elleni ellenanyag előállítása, az ellenanyag jelölése, a szövetminta érintkezésbe hozása ajelölt ellenanyaggal, és a jelölt ellenanyag-fehérje heterokonjugátum detektálása a szakmabeliek által jól ismert standard módszerekkel. A jelölés lehet fluoreszcens vagy radioaktívjelölés.
Nukleinsavszakaszok detektálásának egyik módszere biológiai mintákban nukleotidpróba előállítása, amely képes olyan nukleinsavszakaszhoz tartósan hibridizálni, mint az 1. ábra 5. vagy 6. soraiban szereplők, vagy mint a leírás más részeiben bemutatott, herpeszproteázt vagy ICP35 fehérjéket kódoló szakasz. A nukleotidpróba lehet jelölt is. A próbát ekkor a vizsgálni kívánt biológiai mintával inkubáljuk, a specifikus hibridek létrejöttéhez megfelelő szelektív körülmények között. A próbák és a biológiai minta nukleinsavai között létrejött specifikus hibridek többféle, a szakemberek által jól ismert módszerrel kimutathatók, például a próba radioaktív jelölésének detektálásával. Ilyen hibridek képződése az eredetileg keresett nukleinsavszakasz jelenlétét mutatja.
Az itt ismertetett targetproteázok létfontosságúak a virális életciklus során, proteázgátló hatékony mennyiségének bevitelével. Az inhibitor terápiás mennyiségét oly módon határozzák meg, hogy a herpeszvírus reprodukciója gátolt legyen, de a gazdasejtek ne pusztuljanak el. E módszer különösen alkalmas a herpesz simplex vírus 1. és 2. altípusai ellen, de általánosan alkalmazható a herpeszcsaládban, amelynek tagjai nagymértékű DNS-homológiát mutatnak. A HSV-1 UL26-hoz más szervezetekben, például a citomegalovírusban (UL80), a Varicella zoster vírusban (ORF33), az Epstein-Barr vírusban fellelhető nagymértékű szekvenciahomológiák következtében e stratégiák valószínűleg széleskörűen alkalmazhatók minden herpeszvírus esetén.
Ez a gátlás megvalósulhat akár a transzkripció, akár a transzláció vagy a fehérjeműködés szintjén. A transzkripció gátlása az mRNS-képződés gátlását kívánja meg a DNS-templáton. A transzláció gátlása az mRNStemplátról történő fehéijeszintézis gátlását teszi szükségessé. Vagylagosan, maga a proteáz működése is gátolható a proteáz szerkezetének, különösen proteolitikus doménjének roncsolása révén, s így a szubsztráthasítási hely megváltozik, vagy hamis szubsztrát adagolásával, amely inaktiválja a proteázt. Az inhibitor másik formája egy olyan nukleinsavszakasz, amely a herpeszproteázt kódoló szekvenciával képes hibridizálni, s olyan hibridet képez, amely megakadályozza az mRNS transzkripcióját, amelyről a proteáz transzlációja történne.
Több olyan gátló létezik, amely a találmány céljaira megfelelőnek mutatkozik. In vitro vizsgálat során a kimosztatin és a diizopropil-fluorofoszfát a proteáz 100%-os gátlását eredményezte. Fenil-metaszulfonilfluorid legalább 50%-os gátlást okoz, ez a csökkenés az idővel bekövetkező instabilitásának tudható be. Különböző proteáz inhibitorokkal elvégzett vizsgálat kimutatta, hogy az UL26 proteázt a szerinproteáz inhibitorok gátolták, viszont a cisztein, aszparaginsav vagy metallo6
HU 216 622 Β proteáz inhibitorok nem. Más feltételezett inhibitorok közé tartozik az antipain, aprotinin, leupeptin, (4-aminofenil)-metán-szulfonil-fluorid, és bármely más szerinproteáz inhibitor, amely pozitív eredményt ad az itt ismertetett gátlójelölt szkrínelő vizsgálata során. Egyes kiviteli módok során az itt közölt gátlók nemtoxikus származékait javasoljuk.
Annak érdekében, hogy további gátlókat határozzunk meg, a vizsgálni kívánt anyagokat szkríneltük vírus proteáz preparálás, gátlójelölt anyaggal kombinálás és a proteázt hasítani képes megfelelő szubsztrát kiválasztása révén. A vizsgálat során érintkezésbe hoztuk a szubsztrátot a proteázgátló jelölt eleggyel, és meghatároztuk, hogy a vizsgált anyag gátolta-e a proteáz működését. Egy szemléltető kiviteli mód során a vizsgált anyag tesztelésére használt vírusproteáz tisztított herpeszproteáz, amelyet nyúlretikulocita-lizátumban in vitro szintetizáltunk a leírásban ismertetett módszerrel.
A proteáz a vizsgálni kívánt gátlójelölt anyaggal laboratóriumi in vitro esszében vagy tesztorganizmusban vegyíthető. A proteáz által hasítható választott szubsztrát lehet maga a proteáz, vagy legalább a c és d ICP35 fehérje prekurzorok hasítási helyei. A szubsztrát proteázzal és a vizsgálandó gátlójelölt anyaggal való reagáltatása után meghatározható, hogy az anyag gátolta-e a proteáz működését abból, hogy a szubsztrát hasítása bekövetkezett-e. Ez példánkban abból látható, hogy SDS gélelektroforézissel történő meghatározás alapján az ICP35 c és d fehérjékből létrejött-e az e és f ICP35 alegység, amelyek csakis a c és d fehérjeproteáz általi hasítása révén keletkeznek. Ha a fehérjék hasítása nem történt meg, arra következtethetünk, hogy a vizsgált anyag valóban gátolja a vírusproteázt.
A gátlójelölt vizsgálat során használt vírus proteázt előállíthatjuk genetikai rekombináns technológia alkalmazásával, ahol például egy expressziós vektor tartalmazza legalább a proteáz proteolitikus egységét. Az expressziós vektort ekkor megfelelő gazdasejtbe juttatjuk olyan körülmények között, amely lehetővé teszi a kódoló szekvencia kifejeződését. Miután a szekvencia proteáz vagy proteázszegment formájában expreszszálódott, a proteáz kinyerhető a sejtből, és szükség esetén tovább tisztítható a szakmabeliek által jól ismert módszerekkel.
A herpeszproteáz előállításának alternatív módszere, hogy egy proteázt tartalmazó mintát használunk, például herpesz által fertőzött szövetdarabot vagy váladékot. A mintát homogenizáljuk és frakcionáljuk a proteázfrakció kinyerése céljából. A proteázfrakciót további izolálás és tisztítás alá vethetjük a felhasználás módjától függően a szakemberek által jól ismert módszerekkel.
A találmány tárgyalja szerinproteáz izolálásának módszerét, amely az itt leírtakhoz hasonlóan működik különböző herpeszvírusokban, más nem herpeszvírusban, vagy lényegében bármely szervezetben. A proteáz elválasztásához az itt bemutatott preotáznak legalább 1 hasítási helyét tartalmazó aminosav-szekvenciát kell előállítani. A kiválasztott vírusproteázt érintkezésbe hozzuk a hasítási hellyel, amely virális szerint proteázzal történő hasításra érzékeny aminosav-szekvenciát tartalmaz. Végül az ICP35 szubsztrát segítségével meghatározható, hogy bekövetkezett-e hasítás, hogy az ICP35 c és d átalakult-e e és f fehérjékké. Ezekkel a módszerekkel kimutattuk, hogy a HSV-2 proteáz képes ICP35 c és d-t e és f formákká hasítani.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott módszerek és készítmények lehetővé tették létfontosságú szerinproteázok azonosítását más fajokban. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott módszerek általánosan használhatóak, csupán a forrásgenom változik. Várható, hogy ezek a szerinproteázok konzervatív szakaszok által kódoltak és igen elterjedtek. Herpeszvírusok esetében a hat közül négy virális DNS-szekvencia (HSV-1, EBV, VZV, CMV) került leírásra, és került be szakemberek számára elérhető számítógépes adatbázisba. A szerinproteázok konzervatív jellegére, és rokon fajoknál, például a herpeszcsaládban korábban megfigyelt homológiákra alapozva aminosav-szekvencia és működésbeli homológiák valószínűsíthetők (Davison és munkatársai, 1986; McGeoch és munkatársai, 1988). Vagyis megjósolható, hogy a HSV-1 UL26 génje, az EBV BVRF2 génje, a CMV UL80 génje és a VZV 33. génje azonos, vagy hasonló szerepet játszanak a kapszid érési folyamatában, és proteázt kódolnak. Mivel a HSV-1 UL26 génje és e feltételezett proteázok között nagymértékű szekvenciahomológiát találtak, feltételezik, hogy e proteázok működése vagy hasítási mechanizmusa azonos a HSV-1 Ul26 termékével. így nem meglepő, hogy az e találmányban leírt herpesz simplex vírus (HSV-1 és HSV-2) elleni inhibitor felhasználható más herpeszvírusok (EBV, VZV, CMV és HSV-6) esetében is.
Más mikrobákban leírt kapszid-összeszerelődés arra utal, hogy a találmányban leírt szerinproteázok nem korlátozódnak csupán a herpeszcsaládra. A T4 bakteriofág és a lambda fág a kapszid-összeszerelődés leggyakoribb vizsgálati alanyai. E fágokban először a külső köpeny fehérje és belső váz (scaffolding) fehéije kölcsönhatása révén preformált kapszid jön létre. Ekkor a vázfehérjét egy, a fág által kódolt proteáz hasítja, és az a kapszidról leválik. Ugyanakkor a fág DNS bepakolódik a kapszidba, s érett fág keletkezik. A vázfehéije hasítása létfontosságú az érett kapszid kialakulása szempontjából. A közelmúltban krio-elektronmikroszkópiás vizsgálatok kimutatták a HSV és a lambda fág kapszid szerkezetének hasonlóságát. Meghatározták a humán CMV AD169 törzsének szekvenciáját, és a HSV UL26-tal analóg gént azonosítottak. ICP35 a feltételezések szerint váz- vagy összepakoló fehérjeként működik a HSV kapszid érése során. Az ICP35 hasítása a találmányban leírt proteázok által szükséges a kapszid éréséhez, és létfontosságú a vírus replikációjához. Az itt leírt proteázok működése analóg azokkal, amelyek fágok ICP35 fehérjéit hasítják a DNS-pakolás elindítása céljából. Vagyis az imént leírt proteáz inhibitor-jelölt vizsgálatok és kezelési módszerek a herpeszek családjánál jóval szélesebb körben alkalmazhatóak.
Dömén a fehérje egy része vagy régiója, definíció szerint aminosav-szekvencia egy polipeptiden vagy fehérjén belül. Ebben az esetben a dómén funkcionálisan a szekvenciában bekövetkező aminosav
HU 216 622 Β delécióknak vagy szubsztitúcióknak a fehérje működésére vagy szubsztitúciójára gyakorolt hatása alapján határozható meg.
Downstream egy nukleinsavmolekulában adott referenciaponttól 3’ irányban elhelyezkedő nukleinsavszekvenciát jelöl.
Az epitop antigén determináns aminosav-szekvencia. A nyitott leolvasási keret (ORF) aminosavakat kódoló tripletek sorozata, amely nem tartalmaz terminációs kodont. E típusú szekvenciák potenciálisan fehéijévé fordíthatóak.
Szubsztanciális tisztítás DNS-sel kapcsolatban izolált, egy szervezet genomjában megtalálható, természetes állapotukból kiszakított DNS-szakaszokat jelöl, és azokat úgy értelmezi, ahogyan genetikai manipulálás során előfordulnak, például rekombináns vektorba történő illesztéskor.
Transzkripciós egység az RNS polimeráz kezdő és terminációs helye közötti távolság.
Upstream egy nukleinsavmolekulában adott referenciaponttól 5’ irányban elhelyezkedő nukleinsavszekvenciát jelöl.
Virális proteáz olyan enzim, amely képes virális prekurzor fehérjéket specifikus helyen hasítani.
HSV herpesz simplex vírus
CMV citomegalovírus
ORF nyitott leolvasási keret
ICP fertőzöttsejt-eredetű polipeptid
DFP diizopropil-fluorofoszfát
TPCK L-1 -tozilamido-2-fenil-etil-klór-metil-
TLCK keton N-alfa-p-tozil-L-lizin-klór-metil-keton
PMSF fenil-metil-szulfonil-fluorid
EGTA etilénglikol-bisz(béta-amino-etil-éter),
tetraecetsav Ν,Ν,Ν’,Ν’
1A ábra A HSV-1 genom szekvenciaelrendeződése, az UL26 és UL26.5 nyitott leolvasási keret és transzkripciós termék elhelyezkedése, a találmány céljaira létrehozott tesztplazmidok szerkezete.
1B ábra Az UL26 nyitott leolvasási keret nukleotidés aminosav-szekvenciája. A +1 hely az UL26 nyitott leolvasási keret transzláció iniciációs helyének felel meg.
2. ábra A HSV-1 genom DNS, az UL26 és az
UL26.5 nyitott leolvasási keret (ORF) közötti összefüggés vázlatos ábrázolása, valamint e genetikai rendszer transzlációs és poszttranszlációs termékei.
3. ábra Az 1. DNS-próba (A) és a 2. DNS-próba (B) autoradiográfiás képei, látszatfertőzést és 12 órás fertőzést követően Vero-sejtek teljes citoplazmás RNS-éhez történő hibridizálás és S1 nukleázos emésztés után.
4. ábra Fényképfelvétel plazmidkonstrukciókkal transzfektált és vírussal felülfertőzött sejtek lizátumának fehérjéiről, poliakrilamid gélelektroforetikus elválasztás, nitrocellulózlapra történő elektromos átvitel, és
HSV-1 ICP35 ellen termelt H725 (HSV Ab) kecske monoklonális antitesttel való reagáltatás után.
5. ábra Fényképfelvétel plazmidkonstrukciókkal transzfektált és vírussal fertőzött sejtek lizátumának fehérjéiről, poliakrilamid gélelektroforetikus elválasztás, nitrocellulózlapra történő elektromos átvitel és H725 (HSV Ab) vagy CH28-2 (CMV Ab) monoklonális antitesttel való reagáltatás után.
6. ábra Fényképfelvétel plazmidkonstrukciókkal transzfektált HSV-1 vírussal felülfertőzött sejtek lizátumának fehérjéiről, poliakrilamid gélelektroforetikus elválasztás, nitrocellulózlapra történő elektromos átvitel és H725 (HSV Ab) vagy CH28-2 (CMV Ab) monoklonális antitesttel való reagáltatás után.
7. ábra Autoradiográfiás képek és fényképfelvétel plazmidkonstrukciókkal transzfektált és vírussal felülfertőzött sejtek lizátumának fehérjéiről, poliakrilamid gélelektroforetikus elválasztás, nitrocellulózlapra történő elektromos átvitel és H725 (HSV Ab) vagy CH28-2 (CMV Ab) monoklonális antitesttel való reagáltatás után.
8. ábra Nukleáz-kezelt nyúlretikulocita-lizátummal lefordított és 9,5%-os denaturáló poliakrilamid gélen elektroforetikusan elválasztott, 35S-metioninnal jelölt polipeptidek autoradiográfiás képe.
9. ábra Fényképfelvétel plazmidkonstrukciókkal transzfektált és HSV-1 vírussal felülfertőzött sejtekből 34 °C-on (34°), illetve 39 °Con (39°) kinyert, elektroforetikusan elválasztott polipeptidekről, poliakrilamid gélen történő elektroforetikus elválasztás, nitrocellulózlapra történő elektromos átvitel, HSV-1 ICP35 ellen termelt H725 (HSV Ab) kecske monoklonális antitesttel való reagáltatás, és peroxidázhoz kapcsolt kecske anti-egér IgG antitesttel való megfestés után.
10. ábra Fényképfelvétel plazmidkonstrukciókkal transzfektált és látszatfertőzött vagy HSV-l(F) vírussal felülfertőzött (HSV-1) sejtekből 34 °C-on (34°), 39 °C-on (39°), illetve 37 °C-on (37°) kinyert, elektroforetikusan elválasztott polipeptidekről, poliakrilamid gélen történő elektroforetikus elválasztás, nitrocellulózlapra történő elektromos átvitel, H725 (HSV Ab) vagy CH28-2 (CMV Ab) monoklonális antitesttel való reagáltatás, és peroxidázhoz kapcsolt kecske anti-egér IgG antitesttel való megfestés után.
11. ábra Fényképfelvétel plazmidokkal fertőzött és látszatfertőzött, HSV-1(F) (HSV-1) vagy HSV-2(G) (HSV-2) vírussal 34 °C-on, 39 °C-on, illetve 37 °C-on felülfertőzött sej8
HU 216 622 Β tekből kinyert, elektroforetikusan elválasztott polipeptidekről, poliakrilamid gélen történő elektroforetikus elválasztás, nitrocellulózlapra történő elektromos átvitel, H725 (HSV Ab) vagy CH28-2 (CMV Ab) monoklonális antitesttel való reagáltatás, és peroxidázhoz kapcsolt kecske anti-egér IgG antitesttel való megfestés után.
12. ábra Az UL26 nyitott leolvasási keret által kódolt és denaturáló poliakrilamid gélen elektroforetikusan elválasztott, 35S-metioninnal jelölt polipeptidek autoradiográfiás képe.
13. ábra Autoradiográfiás képek és fényképfelvétel
U vagy Y plazmidokban kódolt szekvenciákból in vitro szintetizált, illetve X vagy Z plazmiddal transzfektált, HSV-1(F) vagy HSV-l(G) vírussal felülfertőzött sejtek lizátumából származó polipeptidekről.
14. ábra Az UL26 nyitott leolvasási keret által kódolt, denaturáló gélen elektroforetikusan elválasztott, 35S-metionin-jelölt polipeptidek autoradiográfiás képe, mutatva a PMSF, mint proteázgátló hatását.
15. ábra Fényképfelvétel plazmidkonstrukciókkal fertőzött, HSV-l(F) vírussal 34 °C-on (34 °C) vagy 39 °C-on (39 °C) felülfertőzött sejtek lizátumából származó, poliakrilamid gélen elektroforetikusan elválasztott, nitrocellulózlapra elektromos úton átvitt, először HSV-1 ICP35 elleni H725 (HSV Ab) vagy CMV epitop elleni CH28-2 (CMV Ab) monoklonális antitesttel reagáltatott, majd peroxidázhoz kapcsolt kecske anti-egér IgG antitesttel megfestett polipeptidekről.
16. ábra Y plazmidban klónozott UL26 ORF-ről in vitro átírt szintetikus mRNS-ről nukleáz-kezelt nyúlretikulocita-lizátumban in vitro lefordított, majd elektroforetikusan elválasztott polipeptidek autoradiográfiás képei.
17. ábra A mutagenezis-vizsgálatok eredményének sematikus ábrázolása.
A találmány szerinti eljárásban a herpeszproteázokat kódoló nukleinsavszakaszok tartalmaznak még legalább egy, a virális replikáció során a kapszid produkcióban használt fehérjekódoló domént. A proteáz szubsztrátja egyrészt saját aminosav-szekvenciája és virális kapszidfehéqék prekurzorai (2. ábra). A proteáz gátlói megállítják a virális életciklust, és így eszközt kínálnak terápiás beavatkozásra. A találmány szemléltető kiviteli módja proteázforrásként HSV-1-t alkalmaz.
A HSV- 1-ben új herpeszproteázt azonosítottunk, és tisztítottunk, amely a „Pr” elnevezést kapta. A Pr proteáz működésének gátlása hatékony fegyver a vírus (produkció) közvetlen megtámadására. Mivel a proteáz létfontosságú a DNS virális kapszidba való bepakolásához, a proteáz gátlása megbontja a vírus replikáéiós ciklusát. A proteáz gátlói enyhítik a klinikai tüneteket, és csökkentik a továbbfertőzés esélyét.
A herpeszproteáz a HSV-genom egy szakaszának, az Ul26 nyitott leolvasási keretnek terméke. A proteáz egy szükséges, és egyszersmind az egyetlen virális fehérje, amely egyrészt saját magát képes hasítani, valamint az Ul26.5 nyitott leolvasási keret (ORF), a találmány keretében azonosított és tisztított régió termékét. Az Ul26 ORF terméke, a Pra elnevezésű fehéije egy ezidáig le nem írt proteáz, az első, herpeszvírusból tisztított proteáz. Sejtmentes rendszerben a Pra Prb-vé hasította magát, s ezzel bebizonyosodott, hogy a Pra transzlációs termék képes proteázként működni. Pra autokatalitikus hasításának Prb elnevezésű terméke (1. ábra) körülbelül 20 aminosawal rövidebb, mint Pra.
A találmányban leírt proteázt nemcsak az jellemzi, hogy a saját hasítását katalizálja, de meglepő módon második szubsztrátja, amely nagyobb mennyiségben van jelen, a proteázt kódoló gén belsejében elhelyezkedő szakasz kódolja. A proteáz és a második szubsztrát a karboxiterminálisnál közös aminosav-szekvenciával rendelkeznek. Meglepő és váratlan felismerés volt, hogy a második szubsztrátot kódoló szakasz az ICP35 elnevezésű virális kapszidfehérjéket kódolja, s az újonnan azonosított gén az Ul26.5 elnevezést kapta.
Az Ul26 gén expressziója proteáz formájában létfontosságú a virális érési folyamatban. Erre az állításra bizonyíték a Preston és munkatársai (1983) által leírt hőmérsékletszenzitív mutáció az UL26 nyitott leolvasási keretben, amely letális hatással van a kapszidérésre. Vagyis a proteáz működésének leállása gátolja a virális érést, s így terápiás stratégiát nyújt.
Három általános megközelítést alkalmaztunk a herpeszproteáz azonosítására és jellemzésére. Ezek: 1. sejtek transzfektálása plazmiddal, majd fertőzése herpeszvírussal; 2. sejtek transzfektálása két plazmiddal;
3. in vitro transzláció. A vizsgálatok alapján két, átfedő herpesz simplex vírus 1 (HSV-1) nukleinsav-szekvenciát azonosítottunk, amely két génből áll (önálló transzkripciós egységek). A nagyobbik, az UL26 elnevezésű szekvencia egy, SDS-PAGE-meghatározás szerint körülbelül 75-85 kd látszólagos molekulatömegű fehérjét kódol. Ez a fehérje szerinproteáz, amely képes önmagát, és az ICP35 fehéije prekurzorokat processzálni karboxiterminális proteolitikus hasítás révén. A rövidebb szekvencia elnevezése UL26.5, és SDS-PAGE-meghatározással körülbelül 35-50 kd látszólagos molekulatömegű fehérjét kódol. Mind a két gén klónozása megtörtént.
A kulcsszerepet játszó tesztszubsztrát, az ICP35 fehérjék kiválasztása volt az egyik oka annak, hogy a találmányban szereplő proteázokat sikeresen izoláltuk és tisztítottuk. A herpeszgenom jobb megértéséhez másik eredményes lépés volt nagyszámú plazmid konstrukciója a herpesz genetikai útjainak mechanizmusáról felvetett specifikus kérdések megválaszolására kidolgozott specifikus konstrukciós stratégiával. Néhány plazmidba markerszekvenciát inszertáltunk, ami lehetővé teszi a genetikai utak nyomon követését. A plazmidszerkezetek egy sorozatában a markerek deléciókat tartalmaztak, «4 promotert vagy egér monoklonális antitesttel reagálni képes citomegalovírus epitopot kódoló szakaszt hordoztak. E szerkezetek segítségével meglepő különbségeket mutattunk ki a herpeszgenom egy szakaszának genetikai működésében ahhoz viszonyítva, amit
HU 216 622 Β az Ul26 ORF szerkezetéről és működéséről eddig végzett munka jósolt.
Korábbi kutatások során McGeoch és munkatársai (1988) azt feltételezték, hogy az ICP35-t az UL26 keret kódolja. Az UL26 leolvasási keret nukleotidszekvenciájából jósolható tennék azonban az ICP35-nél meglehetősen nagyobbnak adódott. Úgy találták, hogy a herpesz kapszidfehérje produkciójáért egy hierarchikus genetikai rendszer felel. A találmány ismertetése során leírjuk, hogy az UL26 elnevezésű dómén két átfedő transzkripciós egységre oszlik, amelyek részben azonos aminosav-szekvenciájú fehérjéket eredményeznek. A korábban ICP35 elnevezésű fehérjét az UL26 nyitott leolvasási keretnek csupán egy része kódolja. A találmány céljai számára ez az egység az UL26.5 elnevezést kapta.
A találmányban leírt proteáz általánosan alkalmazható. Az ICP35 fehérjéket eredményező prekurzort hasító Pra proteáz szubsztrátjának homológjait megtalálták más herpeszvírusokban. Valószínű tehát, hogy a találmányban leírt módszerek a víruscsalád más tagjaiban és más fajokban is kimutatják a proteázt. Példaképpen, a közelmúltban leírták, hogy az ICP35 fehérje CMV megfelelője a karboxiterminálisnál hasítódik (Gibson és munkatársai, 1990; Schenk és munkatársai, 1991), bár e fajban CMV proteázt addig még nem azonosítottak. Vagyis a herpesz-hasított proteáz valószínűleg más herpeszvírusokban is befolyásolja a hasítást. Azóta citomegalovírusban is írtak le proteinázt. Eszerint a teljes hosszúságú proteáz 248. aminosavjánál bekövetkezett hasítás után egy aktív proteáz szabadul fel, de a találmány alapján valószínű, hogy egy ilyen hasítás terméke inaktív.
Az ICP35-tel homológ nyitott leolvasási keret megléte Varicella zoster vírus (VZV) genomban (Davidson és Scott, 1986; Davison és McGeoch, 1986) arra utal, hogy az ICP ekvivalens, és az annak megfelelő proteáz konzerválódott a különböző herpeszvírusokban. Mivel az ICP35 aminosav-szekvenciáját a Pr karboxiterminálisa teljes mértékben tartalmazza, és mivel az ICP35 nem rendelkezik mérhető proteolitikus aktivitással, a Pr által mutatott proteolitikus aktivitást várhatóan a fehérje aminoterminális doménje fejti ki. Érdekes megjegyezni, hogy a VZV genomban (Davison és Scott, 1986) az UL26-nak megfelelő nyitott leolvasási keret nagyobb aminosav-szekvencia-homológiát mutat az aminoterminális, mint a karboxiterminális részen.
A Herpesz simplex genom manipulációja
A virális proteáz jelentősége, mint terápiás célpont egyértelmű a virális replikációs mechanizmusok fényében. Például a herpesz simplex vírus genomja lineáris, kettős szálú DNS-molekula (körülbelül ΙΟΟχΙΟ6 molekulatömegű) elegendő nagyságú 73 különböző géntermék kódolásához. A genom szerkezete DNS-vírusok körében szokatlan a tekintetben, hogy két unikális nukleotidszakaszt „inverted repeat” szekvenciák szegélyeznek.
A virális genom 162 kapszómából álló szabályos ikozahedrális fehérjeburokba (kapszid) pakolódik be. A vírus külső burka módosult sejtmembrán eredetű lipidtartalmú membrán envelop. Sejtfehérjéket nem mutattak ki a virion envelopban. Az envelop lipid kettős rétegének glikoproteinjei közvetítik a vírus kapcsolódását a gazdasejt felületéhez, a vírus behatolását a sejtbe, a virális érést és a kijutást. A kapszid és a lipid kettős réteg között tegumentum helyezkedik el. A kapszid belsejében DNS-poliaminok és DNS-kötő fehérjék találhatók.
Klinikai tüneteket eredményez, ha a sejtek fertőzését replikáció, és a vírus szétterjedése követi. Miután a virális genom eljut a sejt magjához, a virális gének expressziója történik nagymértékben szabályozott módon. A virális fertőzés és replikáció vezethet sejthalálhoz is. A proteáz gátlása blokkolja a replikációt. Bizonyos sejtek, különösen érző neuronok in vivő fertőzése nem feltétlenül vezet a vírus replikálódásához és sejthalálhoz. Bekövetkezhet látens szakasz is.
A HSV-1 genom szekvenciaelrendeződése, az UL26 és az Ul26.5 nyitott leolvasási keretek és átirataik pozíciója, valamint a találmány céljaira létrehozott tesztplazmidok szerkezete az 1. ábrán látható:
1. sor - a HSV-1 genom szekvenciaelrendeződésének sematikus ábrázolása. UL és Us a hosszú (long) és a rövid (short) unikális szekvenciának felel meg, amelyet téglalapként ábrázolt terminális „inverted repeat” szekvenciák vesznek körül.
2. és 3. sor - genom térképpozíció, az UL26 I betűjelzésű hozzávetőleges transzkripció iniciációs helyétől (+1) számított nukleotidszámok és a HSV-1 EcoRI-PstI DNS-szakasz restrikciós endonukleáz helyei. A 3. sor mutatja még a transzláció terminációs kodont (T), s az egyedüli, mind UL26, mind UL26.5 RNS-eit kiszolgáló poli(A) farok (A) elhelyezkedését.
4. és 5. sor — a kitöltött téglalapok (vastag vonalak) az UL26 és UL26.5 nyitott leolvasási keretek kódoló doménjeit jelzik. A számok a transzkripció iniciációs helyek, a transzláció iniciációs és terminációs kodonok és a mindkét leolvasási keret számára szolgáló poli(A) jel pozícióját jelölik az UL26 +1 nukleotidjához képest.
A 6. sor restrikciósendonukleáz-térkép arányosan kicsinyítve A-tól a Z vonalig s AA-től NN-ig, melyek a jelentésben leírt vizsgálatok során használt plazmidszerkezetekbe beépített HSV-1-szekvenciák sematikus ábrázolásai. Az A-tól Z-ig és AA-tól NN-ig jelölt vonalakkal sematikusan ábrázolt plazmidok konstrukciója az 1. példában olvasható. A B, D, H, J, K, L, Μ, P, W, X, Z, AA-NN plazmidokban látható a4 promoter (üres téglalap) forrása egy megfelelő transzkripciós elrendezésben beillesztett BamHI Z DNS-szakasz (Post és munkatársai, 1981). A CMV epitóp ábrázolása kitöltött ovális. A C oligonukleotid komplementerével együtt kitöltött háromszögként jelölt, és az újonnan létrehozott PmlI hely jele P*. A restrikció endonukleáz helyek rövidítése a következő: B, BamHI; Ba, Ball; Bs, BstEII; E, EcoRI; H, Hpal; K, KpnI; Ms, MstlI; P, PmlI; Ps, PstI; S, Sáli; X, Xmal. Me az UL26.5 nyitott leolvasási keret metionin transzláció iniciációs kodonját jelöli.
Annak érdekében, hogy azonosítsuk az UL26 és Ul26.5 nyitott leolvasási keretek in vitro transzlációs termékét, valamint az ICP35 feldolgozatlan formáit, mind Ul26 és UL26.5 nyitott leolvasási kereteket a PGEM3Z-f(+) plazmidba klónoztuk, amely révén létrejött a T, illetve az U plazmid (1. ábra). Az UL26 és UL26.5
HU 216 622 Β mRNS-einek megfelelő RNS-ek átírása Sp6RNS polimerázzal történt, és a transzláció nukleázkezelt nyúlretikulocita-lizátumban zajlott. Az eredmények azt mutatták, hogy mind az UL26 és UL26.5 kettős sávot kialakító fehérjéket kódol, amelyek látszólagos molekulatömege 80 kd (Pra), illetve 45 kd (ICP35 d, c). Az UL26.5 két, in vitro szintetizált terméke együtt vándorol a HSV-l(F) fertőzött sejtekben in vitro szintetizált ICP35 c és d fehérjével. Később kimutatták, hogy az UL26.5 fel nem dolgozott formái, vagyis ICP35 c és d feldolgozható ICP e és f proteinekké.
Lehetőség nyílt az ICP35 c és d fehérjét ICP35 e és f proteinekké feldolgozáshoz szükséges virális DNSszekvenciák térképezésére és tisztítására. BHK sejteket plazmidok egy sorozatával transzfektáltuk, amelyek különböző hosszúságú HSV-1 DNS-szekvenciát hordoztak, mindegyik egy intakt ICP35 gént, majd felülfertőztük HSV-l(F) vírussal 39 °C-on. Az intakt UL26 gént (1. ábra) tartalmazó A plazmiddal fertőzött BHK sejtekben ICP35 c és d mellett ICP35 e és f keletkezett, míg a deléciós, UL26 promotert nem, csak az UL26 gén kódoló szekvenciáját hordozó C plazmiddal történő (1. ábra) fertőzés csak a feldolgozatlan ICP35 c és d fehérjét eredményezte. Ezen eredmények alapján feltételezhető, hogy az UL26 génterméke szükséges az ICP35 c és d átalakításához e és f formákká.
A vizsgálatok szerint az UL26 gén terméke transz helyzetben képes az ICP35 c és d hasítására e és f fehérjékké. Azért, hogy meghatározzuk, vajon UL26 transz vagy cisz helyzetben hat, BHK sejteket a feldolgozás szubsztrátjául szolgáló N plazmiddal és az UL26 nyitott leolvasási keretben deléciókat hordozó plazmidok sorozatával transzfektáltuk, majd HSV-l(F) vírussal fertőztük, és 39 °C-on inkubáltuk. Eredményként a következőket kaptuk:
(i) Az ICP35 c és d nem autokatalizálták saját feldolgozásukat e és f formává, mivel az N és E plazmiddal (1. ábra) kotranszfektált sejtek lizátumai nem tartalmaztak CMV monoklonális antitesttel reagálni képes e és f ICP35 formákat.
(ii) N és C vagy I plazmidokkal transzfektált BHK sejtekben ICP35 c és d nem került feldolgozásra. A C és I plazmidok deléciókat hordoznak a promoter szakaszban, illetve az UL26 nyitott leolvasási keret poliadenilációs helyénél (1. ábra).
(iii) Az N és A vagy B plazmiddal kotranszfektált BHK sejtekben az ICP35 c és d átalakult e és f formákká. Az A és B plazmid intakt UL26 promotert és nyitott leolvasási keretet, illetve a4 promoter által szabályozott Ul26 kódoló szekvenciát hordoznak. HSV-1 (F) vírusban az α-transzdukáló faktor 39 °C-on az ö.4 promotert magas szintre indukálja (Post és munkatársai, 1981; Batterson és Roizman, 1983). Az UL26 expresszió magas szintje magyarázhatja az ICP35 feldolgozott formáinak (e és f forma) megjelenését az N és B plazmiddal kotranszfektált sejtek lizátumában.
Az Ul26 által kódolt proteáz jelentőségét mutatják az eredmények, vagyis hogy képes az ICP35 c és d formát feldolgozni e és f proteinné. Kimutatták, hogy mind az UL26, mind az ICP35 c és d feldolgozása e és f formákká létfontosságú a kapszid létrejöttéhez, mivel e régióban (az UL26 ORF 5’ végén) bekövetkező mutáció letálisnak bizonyult (Preston és munkatársai, 1983).
Ha a proteáz felhasználásának lehetőségét vizsgáljuk a herpeszfertőzések elleni harc célpontjaként, még érdekesebb lehet, hogy úgy tűnik, a proteáz az egyetlen fehéije, amely az ICP35 c és d kapszidképződéshez elengedhetetlen e és f formába történő feldolgozását végzi. Ez mutatja, hogy a proteáz létfontosságú a kapszid létrejöttéhez. Annak meghatározására, hogy vajon az Ul26 az egyetlen olyan virális fehéije, amely a folyamathoz szükséges, továbbá kizárni annak lehetőségét, hogy a HSV-1 (F) genom által 39 °C-on kifejezett virális gének hozzájárulnak az ICP35 katalíziséhez, BHK sejteket kotranszfektáltunk állandó mennyiségű L plazmiddal és különböző mennyiségű B plazmiddal, azaz a szubsztrátot, illetve a processzáló enzimet kódoló génekkel. Az L plazmidban (1. ábra) az UL26 nyitott leolvasási keretet az <x4 promoter szabályozta, és az MstlI restrikciós endonukleáz helyen CMV epitopot inzertáltunk be, míg a B plazmid az intakt UL26 nyitott leolvasási keretet hordozta ugyanazon promoterrel. Mivel a4 transzfektált sejtekben állandóan expresszálódó (konstitutív) erős eukarióta promoter (Post és munkatársai, 1981; Kristie és Roizman, 1984), az UL26 és UL26.5 fehéijék expressziójához az L és B plazmiddal transzfektált sejtekben nem szükséges felülfertőzés HSV-1 (F) vírussal. Az eredmény a következő volt:
(i) Virális fertőzés hiányában ICP35 c és d volt az egyedüli expresszálódó termék az L plazmiddal fertőzött sejtekben. Az L plazmid által kifejezett, epitoppal megjelölt ICP35 teljes feldolgozása megtörtént HSV-l(F) vírussal felülfertőzött sejtekben permisszív hőmérsékleten. Ahogy az várható volt, B plazmid nem hozott létre semmilyen, az anti CMV ellenanyaggal reagálni képes terméket.
(ii) Az UL26-ot tartalmazó plazmid B jelenlétében az L plazmid által expresszált, epitoppal megjelölt ICP35 c és d feldolgozása megtörtént ICP35 e és f formákká. A B plazmid alacsony koncentrációja esetén az ICP35 e és f akkumulálódásának mértéke arányos volt a BHK sejtekbe L plazmiddal kotranszfektált UL26 plazmid DNSmennyiségével. A B plazmid legnagyobb mennyiségei esetén megfigyelt csökkenés az ICP35 e és f mennyiségében feltehetőleg a két plazmid közötti kompetícióra vagy nagy mennyiségű DNS toxicitására vezethető vissza.
E vizsgálatok eredményeiből arra következtettünk, hogy az UL26 terméke az egyetlen szükséges és elégséges faktor az ICP35 c és d feldolgozásához. A proteáz tehát létfontosságú a kapszidfejlődéshez, amely viszont a herpeszvírus replikációs életciklusához elengedhetetlen.
A gátló gátolhatja egy, már meglévő proteáz működését, vagy megzavarhatja vagy megakadályozhatja a proteáz termeléséért felelős nukleinsavszakaszok transzkripciójának vagy transzlációjának megindulását. A gátló lehet kémiai készítmény formájában, amely esetben sejtinkorporációra ható vegyülettel szükséges kombinálni.
Ha a gátló egy nukleinsavszakasz, a fertőzött sejtekbe való bevitele történhet a szakemberek által jól ismert módszerek bármelyikével. Ezek között az itt ismertetés11
HU 216 622 Β re kerülő módszerek között szerepel transzfektálás rekombináns vektorral, elektroporáció, valamint „génágyú” bevetése mechanikusan felgyorsított nukleinsavrészecskék bejuttatásához a fertőzött sejtbe.
1. példa
Plazmidok konstrukciója és azok viszonya a
HSV-genomhoz
Plazmidok sorozatát hoztuk létre, hogy azonosítsuk a HSV-genom nukleinsav-szekvenciájának specifikus polipeptidek termelését szabályozó szakaszait, e szakaszokat izoláljuk, és termékeiket tisztítsuk.
E módszereket a virális fertőzés folyamatában szerepet játszó nukleinsav-szekvenciák azonosítása és manipulálása céljából hoztuk létre. Néhány plazmidba specifikus helyen markereket inszertáltunk, hogy a hasítás termékeit nyomon követhessük, és hogy az egyes fertőzési folyamatok során használt nukleotidszekvenciákat meghatározzuk. Az 1. ábrán a CMV epitopot kitöltött ovális jelzi. A C oligonukleotid a komplementerével együtt kitöltött háromszögként jelenik meg. Az újonnan létrehozott PmlI hely jele P. A restrikciós endonukleáz helyek rövidítése a következő: B, BamHI; Ba, Ball; Bs, BstEII; E, EcoNI; H, Hpal; K, KpnI; Ms, MstlI; P, PmlI; Ps, PstI; S, Sáli; X, Xmal.
Együttesen, A-Z, AA-NN plazmidok által hordozott HSV-1-szekvenciák deléciókat tartalmaznak, amelyek az Ul26 nyitott leolvasási keret teljes doménjét felölelik. Néhány esetben, például a B és D plazmidszerkezetekben az cc4 gén promoterét BamHI Z fragment formájában helyeztük el, hogy nagyobb mértékű transzkripciót kényszerítsünk ki.
Az 1. ábrán látható, J-N elnevezésű plazmidkonstrukciók HSV DNS-szekvencia fragmentje egyetlen MstlI helyére CMV epitopot kódoló szekvenciát inszertáltunk. Egy plazmidkonstrukció kivételével mindegyikbe beleinszertáltuk a BamHI Z szakaszt, hogy a benne található a4 promoter fokozza a transzkripciót. A kivétel az N elnevezésű plazmid volt.
Az O és P plazmidokban a CMV epitopot az egyetlen Hpal helyre inszertáltuk, s csak a P plazmid tartalmazza az a4 promotert BamHI Z fragment formájában.
A következő plazmidokat hoztuk létre:
A (pRB4057), B (pRB4060), C (pRB4058), D (pRB4089), E (pRB4093), F (pRB4056), G (pRB4087), H (pRB4088), I (pRB4026), J (pRB4092), K (pRB4094), L (pRB4096), M (pRB4095), N (pRB4102), O (pRB4079), P (pRB4080), Q (pRB4140), R (pRB4184), S (pRB4185), T (pRB4103), U (pRB4090), V (pRB4186), W (pRB4188), X (pRB4213), Y (pRB4214), Z (pRB4215). PRB4026 egy pUC18, amelynek KpnI hasítási helyére HSV-1 szakaszt inszertáltunk. PRB4057 az UL26 nyitott leolvasási keret teljes kódoló szekvenciáját tartalmazza a transzláció iniciációs helytől számított -900 nukleotidtól 3’ irányban a poliadenilációs helytől körülbelül 650 nukleotidnyi távolságra downstream. PRB4060 készítése során a pRB4057 plazmidban az UL26 nyitott leolvasási keret transzláció kezdőhelyétől upstream 23 bázispárra elhelyezkedő virális DNS-szekvenciát kicseréltük a HSV-1 DNS BamHI Z fragmentjére. A BamHI Z fragmentum egyik végén az «4 gén 5’ átíródó nemkódoló szekvenciáinak részeit tartalmazza, a + 33 nukleotiddal és a gén upstream át nem íródó doménjeivel kezdődően. A BamHI Z szakaszt az a4 promoter mellé inszertáltuk megfelelő transzkripciós elrendezésben az UL26 nyitott leolvasási keret intakt és megcsonkított doménjeihez viszonyítva. PRB4056, pRB4058, pRB4087 és pRB4093 a pRB4057-ből, pRB4088 és pRB4089 pedig a pRB4060-ból származtatható oly módon, hogy bennük a Sambrook és munkatársai (1989) által leírt szubklónozási módszerekkel deléciókat hoztunk létre.
Két pár oligonukleotidot, azaz oligonukleotid A-t (5’-AAGGGACAGAAGCCCAACCTGCTAGACCGAC TGCGACACCGCAAAAACGGGTACCGACAC-3’) komplementerével, oligonukleotid B-t (5’-AAAGGG ACAGAAGCCCAACCTGCTAGACCGACTGCGAC ACCGCAAAAACGGGTACCGACACGA-3’) komplementerével, valamint oligonukleotid C-t (5’-TCGA CGTTGACACGGCCCGCGCCGCCGATTTCTTCGTC TCTCAGATGATGGGGGCCCGCCACGTGTGA-3’) szintetizáltunk Applied Biosystems DNA Synthetiser 380A (Foster City, Califomia) segítségével.
A és B oligonukleotidok és komplementereik a CH28-2 monoklonális antitest epitopját kódolják, és a 3’ végükön KpnI hasítási helyet hordoznak, hogy az oligonukleotid inszerció megfelelően ellenőrizhető legyen a plazmidokban. PRB4079 és pRB4080 létrehozása során a pRB4057, illetve a pRB4060 plazmidok egyetlen Hpal helyére az A oligonukleotid-szekvenciát inszertáltuk. PRB4092 létrehozása során a pRB4060 plazmidok egyetlen MstlI helyére a B oligonukleotid-szekvenciát inszertáltuk. PRB4094, pRB4095, pRB4096 és pRB4102 létrehozásakor gyakran használt szubklónozási módszerekkel (Sambrook és munkatársai, 1989) deléciókat hoztunk létre a pRB4092 plazmidon. E plazmidok valamennyi inszerciós helyét megszekvenáltuk annak eldöntésére, hogy a CMV epitop valóban az UL26 nyitott leolvasási kerettel azonos keretbe került.
Q plazmid (pRB4140) az A plazmidból származik oly módon, hogy annak egyetlen PmlI helyére A oligonukleotidot és komplementerét inszertáltuk. Ez a szekvencia (tudniillik plazmid Q) valódi UL26-szekvenciát kódol a PmlI helytől egészen a transzláció terminációs helyig, ám az UL26 nyitott leolvasási keret új PmlI helyének megfelelő orientációjú inszerciójával az Ul26 nyitott leolvasási keret karboxiterminális aminosava és stop kodonja között létrejött egy új PmlI hely. Ezen túl, az eredeti PmlI hely „GTG”-szekvenciája felcserélődött „GTC”-re. A C-szekvencia megfelelő orientációjú beinszertálásával az UL26 nyitott leolvasási keret egyetlen PmlI helyére az UL26 stop kodonja és karboxiterminális aminosava között új PmlI hely jött létre. Az eredeti, autentikus PmlI hely tönkretétele az UL26 aminosav-szekvenciájának megváltozása nélkül történt, mivel a „GTG” és a „GTC” kodonok ugyanazt az aminosavat kódolják. Vagyis a C oligonukleotid és komplementere Ul26 nyitott leolvasási keretbe történő inszerciójának nettó eredménye az lett, hogy UL26 két plusz aminosawal bővült eredeti karboxiterminális aminosava
HU 216 622 Β és stop kodonja között, amelyeket az újonnan létrehozott PmlI felismerő hely kódol. R plazmid (pRB4184) a Cszekvenciának az E plazmid (pRB4093) PmlI helyébe történő inszerciója révén jött létre, S plazmid (pRB4185) pedig az A oligonukleotid és komplementer R plazmid PmlI helyébe történő inszerciója által. T, U, V és W plazmidok (pRB4103, pRB4090, pRB4186, pRB4188) B és S plazmidok szubklónozásából származnak. X, Y és Z plazmidok (pRB4213, pRB4214, pRB4215) létrehozása az A staphylococcus fehérje IgG kötő doménjének 256 aminosav hosszúságú öt homológját kódoló szekvenciának vagy 129 aminosav hosszú és két ilyen domént kódoló szekvenciának in frame inszerciója révén történt az UL26 nyitott leolvasási keret CMV-szekvenciájának 3’ vége és a stop kodon között. A beinszertált szekvenciák a pRIT5 A protein gén fúziós vektor (Pharmacia, Piscataway, NJ) BclL-HincII, illetve HindlII-HincII szakaszai voltak. A T, U, V és Y plazmidok vektora PGEM3Zf(+) (Promega, Madison, WI) származék volt, és ezek a plazmidok felhasználhatók voltak in vitro transzlációs templátként T7 vagy Sp6 RNS polimerázok számára. Az Összes többi plazmid vektora pUC18 (New England Biolabs, MA) származék volt. Minden A és C oligonukleotid és komplement inszerciós helyet megszekvenáltunk, hogy meggyőződjünk arról, a CMV epitopot és a C oligonukleotid és komplementje által kódolt aminosav-szekvenciát in frame inszertáltuk az UL26 nyitott leolvasási keretbe.
Az AA, BB, CC, DD és MM konstrukciók létrehozása transzlációs stop kodon inszerciója révén történt a pRB4060 PmlI, MstlI, BssHII, Hpal, illetve az ICP35 transzláció iniciációs kodonját kódoló helyére. Az NN konstrukciót az ICP35 transzláció iniciációs helye és stop kodonja közötti szekvencia deléciójával hoztuk létre. A pGEM3zf(+)-ba klónozott BamHI Z-vel fuzionált Ul26 ORF, mint pRB4245 mutagenizáció révén létrehozta az II, JJ, KK, LL, HH és GG szerkezeteket a gyártó javaslatainak megfelelő alkalmazott Muta-Gene Kit (Bio-Rad) segítségével. Az e célra használt 40 bázis hosszúságú oligomert Applied Biosystems model 38OB DNS-szintetizáló készüléken szintetizáltuk. EE és FF plazmidok UL26 Xbal hasítása és GG, illetve HH szerkezetek újraligálása révén jöttek létre, amely során Ul26 első 10, illetve 33 aminosavja delécióra került. Az 1. ábrán használt jelek a következők voltak: üres négyzet: ct4 promoter forrásaként használt BamHI Z fragmentum, amit az UL26 és UL26.5 nyitott leolvasási keretekhez viszonyított megfelelő transzkripciós orientációba helyeztünk el; kitöltött ovális: az itt bemutatott 20 aminosavnyi CMV epitop; kitöltött téglalap: A fehérje IgG kötő doménjét kódoló DNS-szekvencia; P*: A fehérje IgG kötő doménjének inszerciója révén létrejött új PmlI hely. Az in vitro mutagenezis során létrehozott új transzláció iniciációs kodonok jele „ATG”. A kitöltött háromszögek inszertált stop kodont jelölnek. A restrikciós endonukleáz helyek rövidítése a következő: B, BamHI; Ba, Ball; Bs, BstEII; E, EcoNI; H, Hpal; K, KpnI; Ms, MstlI; P, PmlI; Ps, PstI; S, Sáli; X, XcmI. Me az UL26.5 nyitott leolvasási keretének metionin transzláció iniciációs kodonját jelzi.
2. példa
A plazmidok felhasználása virális komponensek izolálása és tisztítása során
Gazdasejteket az 1. ábrán látható plazmidkonstrukciókkal transzfektáltunk. Ezen túl proteázt in vitro nyúlretikulocita-lizátum+plazmidok rendszerben szintetizáltunk. Plazmidszerkezetekkel transzfektált és vírussal felülfertőzött sejtekből kinyert, poliakrilamid gélen elektroforetikusan elválasztott, nitrocellulóz membránra elektromos úton átvitt, peroxidáz-kapcsolt kecske anti-egér immunglobulin antitesttel reagáltatott polipeptidek fényképét használtuk a fertőzés mechanizmusaiért felelős nukleinsav-szekvenciák elemzésére. A polipeptidtisztítás kísérleti részletei az Anyag és módszer című fejezetben olvashatók.
Az MM és NN konstrukciókat annak megállapítására használtuk, vajon a proteázban valamely ICP35 kódoló szekvenciája szükséges-e az ICP35 hasításhoz.
3. példa
A transzkripciós egységek elemzése
Úgy találtuk, hogy az UL26 nukleotidszekvenciáit meglepően és váratlanul két transzkripcionális egység tartalmazza. Az UL26 átiratainak térképezésére két próbát szerkesztettünk. Az 1. próba, amelyet az UL26 RNS 5’ terminusának azonosítására hoztuk létre, BamHI helynél jelölt EcoNI-BamHI szakaszból állt, míg a 2. próba BstEII helynél jelölt Xcml-BstEÜ fragmentum volt.
Látszatfertőzött és 12 órás fertőzött Vero-sejtekből származó, SÍ nukleázzai emésztett teljes citoplazmás RNS-hez hibridizált 1. DNS-próba (A) és 2. DNS-próba (B) autoradiográfiás képét ábrázolja a 3. ábra. Az RNSpreparálás az Anyag és módszer fejezetben leírt módon történt. A 3. ábrán az 1. sorban (PS) látható SÍ emésztett 1. próbát a MOCK és HSV-1 jelű sorokban találhatóakkal azonos körülmények között hibridizáltuk, és emésztettük.
A 2. és 8. sor (MOCK) sejtekből kivont RNS-t ábrázolja 12 órás látszatfertőzést követően. A 3. és 9. sorok (HSV-1) HSV-l(F) vírussal fertőzött és 12 óráig fenntartott sejtekből kivont RNS-t mutatják.
A 4. és 7. sorok (P) az emésztetlen próbák (1. vagy 2. próba) helyzetét jelzik.
Az 5. és 7. sor (M) PGEM3Z DNS Mspl enzimes emésztéséből származó 5’ végjelölt fragmentumokat ábrázol.
A 3. ábra nyilat UL26 (A) és UL26.5 (B) RNS-ek védett 5’ végződését jelzi. T, a 2. próbán az UL26 RNS által védett HSV-1-szekvenciák helyzetét ábrázolja.
Az SÍ elemzések eredménye a 3. ábrán látható, vagyis, hogy az 1. próbához hibridizált citoplazmás RNS egy körülbelül 300 nukleotid hosszú szakasz (3. sor) számára nyújtott védelmet.
A BamHI helytől upstream a 300. nukleotid kapta a +1 elnevezést az UL26 génen. A hozzávetőleges transzkripció iniciációs helytől számított első metionin kodon a +180 pozícióban található.
A 2. próbához hibridizált citoplazmás RNS két, az SÍ emésztéstől megvédett szakaszt eredményezett (9. sor). Az első fragmentum az összes HSV-1 DNS-szek13
HU 216 622 Β véneiét tartalmazta (T sáv). A védett fragmentumok második sorozata különböző sávokból állt, amelyek hosszúsága 35-40 nukleotidnál kezdődött (2. sor, Ul26.5 sáv). Vagyis, e transzkript transzkripció iniciációs helye az Ul26 +1 nukleotidjához képest körülbelül a +1000. nukleotidnál helyezkedik el. Ennek az RNS-nek az első metionin kodonja a +1099 pozíciónál található downstream a transzkripció iniciációs helytől. A hosszabbik RNS az UL26 elnevezést kapta.
4. példa
Az ICP35 gén lokalizálása és izolálása
Az ICP35-öt meghatározó gén kódoló doménjeinek lokalizálása céljából az UL26 nyitott leolvasási kereten egy sorozat deléciós termék ICP35 expresszálási képességét megvizsgáltuk.
BHK sejteket Ο, N és P plazmidkonstrukciókkal (1. ábra) transzfektáltunk, majd HSV-2-vel fertőztünk (4. ábra). A 4. ábrán a gél felső szélénél látható betűk a sejteket transzfektáló plazmidszerkezeteket jelölik. A gondolatjel vagy a betű hiánya azt jelenti, hogy a sejteket fertőztük, de nem transzfektáltuk. A függőleges vonalak a lassan migráló sávokat jelzik. A legkisebb, ICP35-öt eredményező fragment az E plazmid volt (2. sáv). Mivel ez a plazmidkonstrukció endogén promotere segítségével fejeződött ki, az eredmények azt mutatják, hogy a Hpal-PstI fragmenten belül elhelyezkedő szekvenciák között találhatók mind a kódoló szekvenciák, mind az ICP35-öt kódoló gén promotere. Az E plazmid az UL26.5 RNS összes szekvenciáját, ezen felül még 168 nukleotidot hordoz.
5. példa
Nyitott leolvasási keretek izolálása és jellemzése
Az 5. ábrán plazmidkonstrukciókkal fertőzött és vírussal felülfertőzött sejtekből származó, poliakrilamid gélen elektroforetikusan elválasztott, elektromos úton nitrocellulózlapra átvitt, H725 (HSV Ab) vagy CH28-2 (CMV Ab) monoklonális antitesttel reagáltatott polipeptidek fényképe látható. A betűk a gél felső szélén a sejteket transzfektáló plazmidszerkezeteket azonosítják. A gondolatjel vagy a betű hiánya azt jelenti, hogy a sejteket fertőztük, de nem transzfektáltuk. A függőleges vonalak a lassan migráló sávokat jelzik.
Az 5. ábra mutatja, hogy a J, K vagy L elnevezésű plazmidszerkezetekkel fertőzött BHK sejtek egy fehérjecsaládot hoztak létre, amelynek tagjai mind az antiHSV-1 ICP35 (H725), mind az anti-CMV (CH28-2) monoklonális antitesttel reagáltak. Az L plazmid konstrukció transzfekciója következtében létrejött négy jellegzetes ICP35 sáv megléte arra utal, hogy az ICP35 iniciációs metionin kodonja az 1099 pozícióban helyezkedik el.
Ezen eredmények mutatják, hogy az ICP35-öt meghatározó UL26.5 kódoló szekvenciák az UL26 egy részét képezik, és vele azonos leolvasási keretben találhatók. Az előbbi részekben kimutattuk, hogy az ICP35 kifejezhető a Hpal-PstI fragmentumban található DNSszekvenciák transzaktivációja segítségével. Mivel az E plazmidkonstrukció transzaktiválható HSV-2-vel, az is belátható, hogy az UL26 kódoló szekvenciái magukban foglalják az ICP35-öt meghatározó gén kódoló szekvenciáit és promoter doménjét is.
6. példa
Az anti-CMV mAb (monoklonális antitest) felhasználása
Plazmidkonstrukciókkal transzfektált és HSV-1 vírussal felülfertőzött sejtekből származó, poliakrilamid gélen elektroforetikusan elválasztott, elektromos úton nitrocellulózlapra átvitt, H725 (HSV Ab) vagy CH28-2 (CMV Ab) monoklonális antitesttel reagáltatott polipeptidek fényképe látható. A 6. ábrán látható gél felső szélén a betűk a sejteket transzfektáló plazmidszerkezeteket azonosítják. A gondolatjel vagy a betű hiánya azt jelenti, hogy a sejteket fertőztük, de nem transzfektáltuk. A függőleges vonalak a lassan migráló sávokat jelzik. Az eredmények azt mutatják, hogy anti-CMV monoklonális antitest használata feleslegessé teszi a sejt felülfertőzését heterológ vírussal.
7. példa
Az Ul26 ORF termékének azonosítása, izolálása és jellemzése
A 7. ábra plazmidkonstrukciókkal fertőzött és vírussal felülfertőzött BHK sejtekből származó, poliakrilamid gélen elektroforetikusan elválasztott, nitrocellulózlapra elektromosan átvitt, H725 (HSV Ab) vagy CH28-2 (CMV Ab) monoklonális antitesttel reagáltatott polipeptidek fényképét és autoradiográfiás képét ábrázolja. A betűk a gél felső szélén a sejteket transzfektáló plazmidszerkezeteket jelölik. Függőleges vonal és nyíl azonosítja az UL26 termékét.
A 7. ábrán az 1., 2. és 3. oszlopokban az Anyag és módszer fejezetben leírt módon [35S]-metioninnal jelölt fehérjék autoradiográfiás képe látható. HSV-2 fertőzött sejt fehérjéi (ICP-k) számozása Morse és munkatársai (1978) szerint történt.
A 8., 9. és 10. oszlopok ugyanazon fehérjék lizátumait mutatják, mint a 4., 5. és 6. oszlopok, CH28-2, illetve H725 monoklonális antitesttel megfestve.
A 7. oszlop J plazmiddal (ahol az UL26-ot az a4 promoter szabályozza) transzfektált, HSV-l(F) vírussal fertőzött, és 39 °C-on fenntartott sejtek lizátumát mutatja. Ilyen körülmények között csak a és néhány β fehérje expresszálódik, de a HSV-l(F) ICP35 proteinje nem fejeződik ki. Az ICP35 a HSV-l(F) virális genomban nem expresszálódik. A plazmidkonstrukció által kódolt ICP35 kifejeződik, mivel a transzfektált gén β génként szabályozott.
Az előző részekben kimutattuk, hogy az ICP35-öt kódoló szekvenciák az UL26 ORF elnevezésű szekvenciának csak egy részét fedik le. A következőkben bemutatandó vizsgálatok célja az volt, hogy a teljes hoszszúságú UL26 nyitott leolvasási keret termékét azonosítsuk. BHK sejteket Ο, N vagy P plazmidszerkezetekkel (1. ábra) transzfektáltunk, majd HSV-2-vel fertőztünk. Az Ο, N vagy P plazmidokkal transzfektált sejtekből kinyert, elektroforetikusan elválasztott fehérjéket HSV-1 (H725) vagy CMV (CH28-2) monoklo14
HU 216 622 Β nális antitestekkel reagáltatok (7. ábra 4-6. és 8-10. oszlopai), majd autoradiografáltuk, hogy molekulatömeg-markereket nyerjünk (1-3. oszlop). Az eredmények szembeötlő sajátságai a következők:
(1) az UL26-tal in frame inszertált CMV epitopot hordozó O és P plazmidszerkezetek körülbelül 75- 85 000 látszólagos molekulatömegű fehérjéknek megfelelő elektroforetikus mobilitású két sávot eredményező fehérjéket határoztak meg (7. ábra 4. és 6. oszlop). A CMV monoklonális antitest nem reagált az O és P plazmidok által létrehozott ICP35 sávokkal (4. és 6. oszlop). A CMV epitopot a Hpal restrikciós endonukleáz helyre inszertáltuk (+832), vagyis az ICP35 transzláció iniciációs helye előtt a +1099 pozíciónál.
(2) Az összes plazmidszerkezet által létrehozott ICP35 reagált a HSV-1 ICP35 ellen termelt H725 monoklonális antitesttel. Az N és P plazmidszerkezetek által létrehozott ICP35 fehérjék elektroforetikus mobilitása közötti egyenlőtlenség betudható annak, hogy az N plazmidkonstrukcióba további 21 aminosavat kódoló oligonukleotidot inszertáltunk.
(3) A teljes UL26 ORF által meghatározott fehérjék ICP35 fehérjékhez viszonyított nagy mennyiségére következtethetünk abból a megfigyelésből, hogy bár mind a 75-78,000 kd molekulatömegű és az ICP35 fehérjék reagáltak ugyanazon monoklonális antitesttel, CH28-2vel, a nagyobb fehérje reaktivitása vagy mennyisége jóval kisebb az ICP35 esetében megfigyeltnél.
Egyértelmű bizonyíték arra, hogy a két fehérje közös aminosav-szekvenciákat tartalmaz, azon a megfigyelésen alapszik, hogy az UL26 fehérjék túltermelése esetén a J konstrukció olyan fehérjéket eredményezett, amely mind a nagyobb fehérjével és az ICP35-tel együtt vándorolt, és reakcióba lépett a CH28-2 monoklonális antitesttel (nyíl, 7. ábra, 7. oszlop).
8. példa
Az Ul26 és UL26.5 fehérjék jellemzése
Nukleázkezelt nyúlretikulocita-lizátumban lefordított, 9,5% denaturáló poliakrilamid gélen elektroforetikusan elválasztott, 35S-metioninnal jelölt polipeptidek autoradiográfiás képe a 8. ábrán látható.
Az 1. oszlopban Promega Biotec, WI gyártmányú készletből származó rozsnok mozaikvírus emplát transzlációs termékei láthatók, az átírás a gyártó leírása szerint történt. A 2. oszlop az U plazmid UL26 nyitott leolvasási keretének transzlációs termékeit ábrázolja. A 3. oszlop a T plazmid UL26.5 nyitott leolvasási keretének transzlációs termékeit mutatja. Az eredmények azt mutatják, hogy az UL26 és UL26.5 által meghatározott fehérjék mindegyike kettős sávot alkot, s látszólagos molekulatömegük 80,000 (Pra), illetve 45,000 (ICP35 d, c) kd.
9. példa
Az Ul26 génterméke szükséges az ICP35 c, d feldolgozásához e és f formákká transz pozícióban A 9. ábrán fényképfelvétel látható 34 °C-on (34°), illetve 39 °C-on (39°) plazmidszerkezetekkel fertőzött és HSV-1 vírussal felülfertőzött BHK sejtekből kinyert, poliakrilamid gélen elektroforetikusan elválasztott, nitrocellulózlapra elektromos úton átvitt polipeptidekből, HSV-1 ICP35 ellen termelt H725 monoklonális antitesttel (HSV Ab) való reagáltatás, és peroxidázhoz kapcsolt kecske anti-egér IgG antitesttel való megfestés után. A kísérleti részletek az Anyag és módszer fejezetben olvashatók. A betűk a gél felső szélén a sejteket transzfektáló plazmidszerkezeteket jelölik. A gondolatjel arra utal, hogy a sejteket fertőztük, de nem transzferáltuk. Az oldalt látható betűk a különböző ICP termékeket jelzik Braun és munkatársai (1984) elnevezése szerint.
Az e és f ICP sávok a c és d sáv fehérjéinek hasítási termékei. A c’, d’, e’ és f sávban vándorló fehérjék hordozzák a CMV epitopot, és így lassabb a mozgásuk, mint a c, d, e, illetve az f sáv eredeti fehérjéi.
Korábbi vizsgálatok arra utaltak, hogy az ICP c, d az ICP e, f prekurzorai (Braun és munkatársai, 1984; Preston és munkatársai, 1983). Hogy ezt a feltevést ellenőrizzük, BHK sejteket Uj 26.5 gént hordozó E plazmiddal (1. ábra) transzferáltunk, és HSV-l(F) vírussal felülfertőztünk 39 °C-on. Ez a vírus hőmérséretszenzitív, és 39 °Con nem expresszálja saját UL26 és UL26.5 nyitott leolvasási kereteit. Az eredmények (1. ábra) a következőket mutatják:
(1) A virális genomban rezidens ICP35 gén 34 °C-on kifejeződik (1. oszlop), viszont 39 °C-on nem (2. oszlop), amit bizonyít az ICP35 ellen termelt H725 monoklonális antitesttel reaktív ICP35 sávok megléte, illetve hiánya.
(2) 39 °C-on az E plazmid egyedüli nyitott leolvasási kerete csupán kétfajta ICP35 fehérjét, ICP35 c és d-t expresszált (4. oszlop), míg 34 °C-on fenntartott, eredményesen fertőzött sejtek lizátumaiban legalább ICP35 c, d, e és f detektálható volt (1. oszlop).
Ezen eredményekből arra következtettünk, hogy:
(a) ICP35 c és d az ICP35 fehérjék feldolgozatlan formái; és hogy (b) feldolgozhatok ICP35 e és f formákká; és hogy (c) a feldolgozáshoz szükséges egy tranzaktív faktor, mivel HSV-l(F) késői génexpresszió hiányában nem zajlik le a feldolgozás.
10. példa
Az Ul26 transz helyzetben képes feldolgozni
ICP35 c és d-t ICP35 e és f-fé, valamint UL26 alkalmas és az egyetlen szükséges virális fehérje az ICP35 c és d feldolgozásához ICP35 e és f formákká Hogy meghatározzuk, vajon UL26 transz vagy cisz helyzetben működik, BHK sejteket a feldolgozás szubsztrátjául szolgáló N plazmiddal, valamint az Ul26 nyitott leolvasási keretben deléciókat hordozó plazmidok sorozatával transzfektáltunk, HSV-l(F) vírussal fertőztünk, és 39 °C-on fenntartottuk. Az eredmények (10A ábra) a következőket mutatták:
(i) ICP35 c és d nem autokatalizálták saját feldolgozásukat ICP35 e és f formákká, mivel az N és E plazmidokkal (1. ábra) kotranszfektált sejtek lizátumaiban nem található CMV monoklonális antitesttel reagálni képes ICP35 e és f (8. oszlop).
HU 216 622 Β (ii) N, valamint C vagy I plazmiddal kotranszfektált BHK sejtekben (7. és 6. oszlop) ICP35 c és d feldolgozása nem történt meg. A C és I plazmid deléciókat hordoz az Ul26 nyitott leolvasási keret promoter régiójában, illetve poliadenilációs helyén (1. ábra).
(iii) N, valamint A vagy B plazmiddal kotranszfektált BHK sejtekben ICP35 c és d átalakult ICP35 e és f formákká. Az A és B plazmid intakt UL26 promotert és nyitott leolvasási keretet, illetve 0.4 promoter által irányított Ul26 kódoló szekvenciát hordoznak (5. és 4. oszlop). A HSV-l(F) α-transzdukáló faktora az a4 promotert magas szintre indukálja 39 °C-on. UL26 nagymértékű expressziója magyarázatot adhat az ICP35 feldolgozott formáinak (e és f formák) jelenlétére N és B plazmiddal kotranszfektált sejtek lizátumában (4. oszlop).
Az eredmények arra utaltak, hogy UL26 olyan fehérjét kódol, amely részt vesz ICP35 c és d feldolgozásában ICP35 e és f formákká.
Hogy meghatározzuk, vajon UL26 az egyetlen virális fehéije, amely szükséges a feldolgozáshoz, és kizárjuk annak lehetőségét, hogy 39 °C-on a HSV-l(F) gén által kifejezett virális gének hozzájárulnak az ICP35 katalíziséhez, BHK sejteket kotranszfektáltunk állandó mennyiségű L plazmiddal és különböző mennyiségű B plazmiddal, mint a feldolgozás szubsztrátját, illetve enzimét kódoló génnel. L plazmidban (1. ábra) az UL26.5 nyitott leolvasási keretet az 0.4 promoter szabályozza, és az MstI restrikciós endonukleáz helyen beinszertált CMV epitopot hordoz, míg B plazmid ugyanazon promoter által irányított intakt UL26 nyitott leolvasási keretet tartalmaz. Mivel 0.4 promoter erős eukarióta promoter, amely transzfektált sejtekben konstitutívan kifejeződik (Kristie és Roizman, 1991; Post és munkatársai, 1981), L és B plazmiddal transzfektált sejtekben az UL26.5 és Ul26 fehérjék expresszálásához nincs szükség felülfertőzésre HSV-l(F) vírussal. Az eredmények (10B ábra) a következők voltak:
(i) L plazmiddal transzfektált sejtekben vírusfertőzés hiányában ICP35 c és d volt az egyedüli expressziós termék (17. oszlop). Az L plazmid által kifejezett, epitopjelölt ICP35 teljes feldolgozása lezajlott HSV-l(F) vírussal felülfertőzött sejtekben permisszív hőmérsékleten (18. oszlop). Mint várható volt, B plazmid nem eredményezett anti-CMV antitesttel reagálni képes terméket (11. oszlop).
(ii) Ul26 gént hordozó B plazmid jelenlétében az L plazmid által expresszált, epitopjelölt ICP35 c és d átalakult ICP35 e és f formákká. Alacsony B plazmid koncentráció esetén az ICP35 e és f akkumuláció mértéke egyenesen arányos volt a BHK sejtekbe az L plazmiddal kotranszfektált UL26 plazmid DNS-mennyiségével (12-16. oszlop). A B plazmid legnagyobb koncentrációinak jelenlétében megfigyelt csökkenés ICP35 e és f mennyiségében utalhat kompetícióra a két plazmid között, vagy a nagy mennyiségű DNS toxikus hatására kialakult hozamcsökkenésre.
E vizsgálatok alapján arra következtethetünk, hogy az UL26 terméke az egyetlen virális faktor, amely alkalmas és szükséges az ICP35 c és d feldolgozásához ICP35 e és f formákká.
11. példa
A proteáz karboxiterminális hasítást eredményez
All. ábrán fényképfelvétel látható 34 °C-on (34°, 1. és 4. oszlop), 39 °C-on (39°, 2. és 5. oszlop), illetve 37 °C-on (37 °C, 3. és 6-14. oszlop) plazmidszerkezetekkel fertőzött, látszatfertőzött, HSV-l(F) vírussal (HSV-1), illetve HSV-2(G) vírussal (HSV-2) felülfertőzött BHK sejtekből kinyert, poliakrilamid gélen elektroforetikusan elválasztott, nitrocellulózlapra elektromos úton átvitt polipeptidekről, H725 (HSV Ab) vagy CH28-2 (CMV Ab) monoklonális antitesttel való reagáltatás, és peroxidázhoz kapcsolt kecske anti-egér IgG antitesttel való megfestés után. A betűk a gél felső szélén a sejteket transzfektáló plazmidszerkezeteket jelölik. A gondolatjel arra utal, hogy a sejteket fertőztük, de nem transzfektáltuk.
Ami a proteáz általi hasítás típusát illeti: az ICP35 c és d feldolgozása e és f formákká karboxiterminális proteolitikus hasítással jár.
Mivel denaturáló gélben az N plazmid által meghatározott ICP35 e és f együtt vándorol a HSV-1-fertőzött sejtekben termelődő ICP35 c és d-vel (10. ábra, A tábla, 1. és 5. oszlop), arra következtethetünk, hogy az ICP35 feldolgozás során lehasított szakasza körülbelül azonos méretű az N plazmidba beillesztett CMV aminosav-szekvenciával. Hogy megállapítsuk, vajon az ICP35 feldolgozás karboxiterminális hasítással jár-e, BHK sejteket J, R, S és W plazmidokkal transzfektáltunk, és HSV-2 vírussal felülfertőztünk. Az R plazmid hordozza a CMV epitopot (A-szekvencia) az UL26.5 PmlI helyére inszertálva, míg az S és W plazmidokban az inszerció a karboxiterminális aminosavnál történt. Elektroforetikusan elválasztott, anti-HSV-1 (H725) és antiCMV (CH28-2) monoklonális antitesttel elektromos úton átvitt polipeptidek vizsgálata a következőket fedte fel (11. ábra):
(1) J plazmiddal transzfektált sejtekben, ahol a CMV epitopot az MstlI helyen, az UL26 stop kodonjától upstream 122 aminosavnyi távolságra inszertáltuk, mind a prekurzor ICP35 c és d, mind a termékek ICP35 e és f keletkeztek, amelyek reagáltak a CMV antitesttel (8. oszlop). A csökkenés ICP35 c, d, e és f elektroforetikus mobilitásában a vad típusú fehérjéhez képest a CMV epitop ínszerciójából következő molekulatömeg-növekedésnek felel meg.
(2) A Q plazmiddal transzfektált sejtekben csupán ICP35 c és d szintetizálódott (3. és 5. oszlop). E plazmidban a CMV epitopot az UL26 PmlI helyére inszertáltuk, az Ul26.5 stop kodonjától upstream 21 aminosavnyi távolságra. Az ICP35 c és d formák azonosítása azon a megfigyelésen alapult, hogy ezek együtt vándorolnak a megfelelő, L plazmid által meghatározott formákkal, s ez transzfektált sejtekben csupán ICP35 c és d-t expresszál (10. ábra, B, 17. oszlop).
(3) A C-szekvencia inszerciója R plazmidba a PmlI restrikciós endonukleáz helyen megszüntette ezt a helyet, és létrehozott egy új PmlI hasítási helyet az UL26 karboxiterminális aminosava és stop kodonja között anélkül, hogy akár UL26, akár UL26.5 aminosav-szekvenciáját megváltoztatta volna. A H725 monoklonális antitesttel
HU 216 622 Β detektált ICP35 c, d, e és f együtt vándorolt az eredeti fehérjékkel (11. oszlop), s ez arra utal, hogy a C-szekvencia inszerciója nem volt hatással az ICP35 expressziójára és feldolgozására.
(4) S és W plazmidban a CMV epitopot az R plazmid új PmlI helyére inszertáltuk az UL26.5 karboxiterminálisánál. E plazmidokkal transzfektált sejtek felhalmoztak HSV-1 H725 monoklonális antitesttel reaktív ICP35 c, d, e és f formákat (10. és 14. oszlop), viszont csak az ICP35 c és d formák reagáltak a CMV CH28-2 monoklonális antitesttel (9. és 14. oszlop). Lényeges észrevétel, hogy az S plazmid ICP35 c és d formái együtt vándoroltak a J plazmid megfelelő formáival, vagyis 21 aminosawal hosszabbak voltak a vad típusnál, addig ICP35 e és f jelezve, hogy a beinszertált CMV epitopot kódoló aminosav-szekvencia eltávolítása zajlott le (9. és 10. oszlop). A W plazmid termékei hasonlóképpen viselkedtek (11. ábra). A W plazmid által meghatározott ICP35 e és f nagyobb mennyiségben volt jelen, mint az S vagy R plazmid esetében, valószínűleg azért, mivel W plazmidba a teljes UL26 nyitott leolvasási keretet beépítettük, és több fehérjetermék expresszálódott és vett részt az ICP35 feldolgozásában.
A prekurzor ICP35 fehérje hasítása körülbelül 20 aminosavnyira történik a karboxiterminális kodontól. E feltevésre bizonyíték, hogy (1) a CMV epitop inszerciója 21 aminosavnyira a terminálistól meggátolta a hasítást, míg az epitop inszerciója a karboxi-terminálisnál lehetővé tette a hasítást;
(2) 1CP35 e’ és f (CMV epitoppal) együtt vándorol ICP35 c és d-vel. Az együtt vándorlás a CMV-inszertált e és f formákat azonos pozícióba hozza, mint c és d az eredeti proteáz esetén.
Váratlan korreláció az ICP35 alegységek létrehozásának és az Ul26 proteáz autoprocesszálásának hasítási mechanizmusai között, hogy mindkettő karboxiterminális proteolitikus hasítással jár. Az előbbi fejezetekben kimutattuk, hogy Ul26 az egyedüli virális faktor, amely felelős az ICP35 karboxiterminális proteolitikus feldolgozásáért. A proteázt kódoló UL26 és az ICP35-öt kódoló Ul26.5 közös karboxiterminális aminosav-szekvenciával rendelkeznek. Annak eshetősége, hogy UL26 saját magát hasítja, abból a megfigyelésből adódott, hogy P plazmiddal (1. ábra) transzfektált, HSV-1(F) vírussal felülfertőzött BHK sejtekben akár 34 °C-on, akár 39 °C-on kettős Ul26 sáv expresszálódott (11. ábra, 4. és 5. oszlop), amely reagált a CH28-2 monoklonális antitesttel. Ez a megfigyelés sugallta annak lehetőségét, hogy az UL26 saját hasítását katalizálja, mivel HSV-l(F) 39 °C-on elsősorban ot géneket expresszál.
12. példa
A proteáz önmagát hasítja
A 12. ábrán az UL26 nyitott leolvasási keret által kódolt, denaturáló poliakrilamid gélen elektroforetikusan elválasztott, 35S-metionin-jelölt polipeptidek autoradiográfiás képe látható. Az U és V plazmidokban (1. ábra) jelen lévő UL26 nyitott leolvasási keretet in vitro átírtuk, és nukleázkezelt nyúlretikulocita-lizátumban lefordítottuk. Az ábrázolt oszlopok a transzlációs keverékben a transzláció kezdését követő 10,20, 90 és 360 perc eltelte utáni helyzetet mutatják. A 4-7. és a 12-15. oszlopokban látható minták esetében a transzláció elkezdése után 10 perccel cikloheximidet juttattunk a transzlációs keverékbe, hogy megakadályozzuk a további transzlációt. Az 1 -3. oszlopok esetében a transzláció elkezdése után 10 perccel a transzlációs keveréket 10-szeresére hígítottuk 100 pg/ml cikloheximidet tartalmazó PBS-sel (foszfátpufferolt sóoldat).
In vitro vizsgálatok során további bizonyítékot szereztünk arról, hogy az UL26 képes saját hasítását katalizálni. U vagy P plazmidról (1. ábra) T7 Sp6 RNS polimeráz segítségével in vitro átírt RNS-t nukleázkezelt nyúlretikulocita-lizátumban lefordítottunk [35S]-metionin jelenlétében. A transzláció elektroforetikusan szétválasztott termékeinek elemzése a következő (12. ábra):
(1) Az U plazmid transzlációs termékeinek inkubálása cikloheximid jelenlétében az UL26 fehérje hasítási termékének (Prb) fokozatos akkumulációját eredményezte. Az akkumulálódott hasítási termék mennyisége arányos volt az inkubáció időtartamával (16-19. oszlop).
(2) A V plazmid termékeinek transzlációja során ugyanazon eredményeket kaptuk. E kísérlet jelentősége abban rejlik, hogy az UL26 karboxiterminálisán a CMV epitop található. Mint várható volt, az UL26 plazmidból létrejött prekurzor formája lassabban vándorolt, mint az U plazmidból nyert eredeti fehérje. Azonban a V plazmidról szintetizált feldolgozott UL26 termék együtt vándorolt az U plazmid eredeti proteinjével, s ez mutatja, hogy az UL26 autoprocesszálása során karboxiterminális proteolitikus hasítás történik.
13. példa
ICP35 c, d és Pra hasítása szekvenciaspecifikus, és azonos helyen történik
A 13. ábrán U vagy Y plazmidok által kódolt szekvenciák alapján in vitro szintetizált vagy X vagy Z plazmiddal transzfektált és HSV-l(F) vagy HSV-l(G) vírussal felülfertőzött sejtek lizátumából származó polipeptidek autoradiográfiás képe (13. ábra, A) és fényképe (13. ábra, B) látható. Az in vitro szintetizált és a sejtlizátumból származó polipeptideket denaturáló 12%-os poliakrilamid gélen elektroforetikusan elválasztottuk, elektromos úton nitrocellulózlapra átvittük, és vagy csak torma peroxidázzal konjugált anti-egér IgG monoklonális antitesttel (anti-IgG), vagy ezen IgG antitesttel és H725 (HSV Ab) vagy CH28-2 (CMV Ab) monoklonális antitesttel reagáltattuk. A gondolatjel arra utal, hogy a sejteket fertőztük, de nem transzfektáltuk. Az A táblán látható fehérjéket 35S-metioninnal jelöltük. A sávok elnevezései a következők: A c, d, e és f betűk vessző nélkül az UL26.5 nyitott leolvasási keret eredeti ICP35 termékeit jelölik. Pra és Prb az UL26 nyitott leolvasási keret proteáztermékeinek transzlációs feldolgozott formái. A kettős és hármas vesszők jelzik, hogy a fehéije hordozza még a CMV epitopot és a Staphylococcus A fehérje két IgG, illetve öt IgG kötő doménjét kódoló szekvenciáját. PA” és PA’” az ICP35 c, d és Pra fehérjék hasítási termékei, amelyek
HU 216 622 Β
CMV epitop és IgG kötő dómén inszerciókat hordoznak.
ICP35 c, d és Pra hasítási szekvenciaspecifikus, és azonos helyen történik. Az itt bemutatott kísérletek eredménye arra utal, hogy az UL26 és UL26.5 termékeinek hasítása/feldolgozása a fehérjék karboxiterminálisától körülbelül 18- 25 aminosavnyi távolságra történt. Annak bizonyítására, hogy e fehérjék feldolgozása valóban az előre megjósolt helyen történik, szükséges volt a hasítási reakció mindkét termékét ugyanazon a gélen bemutatni. Hogy mindkét terméket láthatóvá tegyük, szükséges volt a kódoló szekvenciába a megjósolt karboxiterminálisnál beinszertálni mind a CMV monoklonális antitest epitopját, mind a Staphylococcus A fehérje IgG kötő doménjeit kódoló szekvenciákat. X és Z plazmidok konstrukciója során in frame beinszertáltunk 129, illetve 256 aminosavat kódoló szekvenciákat, amelyek két, illetve öt A fehérjekötő helyet határoznak meg az UL26 stop kodonja és a CMV epitop 3’ vége között (1. ábra).
Két kísérletet végeztünk el. Az elsőben U és Y plazmidok HSV-1 nyitott leolvasási kereteinek átírása és transzlációja történt 6 órán keresztül. Az in vitro transziáit fehérjéket ekkor denaturáló gélben elektroforetikusan elválasztottuk (13. ábra, A). A második kísérlet során BHK sejteket Z vagy X plazmíddal transzfektáltunk, majd felülfertőztünk HSV-2(G) vírussal. A sejtlizátumokat az in vitro transziáit fehérjék elválasztására használttal azonos gélen elektroforetikusan elválasztottuk, elektromos úton nitrocellulózlapra vittük át, és CMV, HSV ellen képzett antitesttel vagy anti-IgG antitesttel, amely képes kötődni az A fehérje IgG kötő doménjeihez (13. ábra, B). Az eredmény a következő volt:
(i) Az U plazmid in vitro átírt és transziáit HSV-1szekvenciák autokatalitikus feldolgozása, mint az várható volt, a Pra és Prb elnevezésű fehérjesávokat eredményezte. Az Y plazmid termékeinek hasonló autokatalitikus feldolgozása három sávot eredményezett. Az első sáv lassabban migrált, mint az eredeti Pra prekurzor sáv, mint várható volt a hozzáadott A fehérje 256 aminosavas és a CMV epitop 21 aminosavas szerkezete miatt. A második sáv együtt vándorolt a Prb sávval, tehát a transzlációs termék autokatalitikus hasításának eredménye. A harmadik sáv együtt vándorolt az alább leírt sávokkal, amelyek a CMV-vel és az anti-IgG antitesttel reakcióba léptek.
(ii) Az X plazmid várható transzlációs termékei ICP35 c, d és Pra voltak. Az is várható volt, hogy Z plazmid transzlációs termékei ehhez hasonlóak lesznek, kivéve, hogy a rövidebb A fehérjeszekvenciák inszerciója következtében ezek a fehéijék gyorsabban kell, hogy migráljanak, mint az X plazmid termékei. Valóban ez történt (lásd 3., 5. és 8. oszlop, illetve 4., 6. és 9. oszlop összehasonlítása). Az is megjósolható volt, hogy ha az ICP35 c és d hasítása valóban az eredeti fehérje karboxiterminálisától 20 aminosavnyira történik, akkor a hasítási reakció aminoterminális termékeinek együtt vándorolnak az eredeti ICP35-tel, és csak a HSV-1 monoklonális antitesttel reagálnak. Valóban így is történt, vagyis Z és X plazmidok által létrehozott ICP35 e és f (5. és 6. oszlop) együtt vándoroltak az eredeti ICP35 e és f formákkal (7. oszlop), és egyedül a HSV-1-specifikus monoklonális antitesttel voltak kimutathatóak. Viszont az is várható volt, hogy a hasítás karboxiterminális termékei méretüknek megfelelően vándorolnak, és mind az anti-IgG, mind a CMV antitesttel reakcióba lépnek. Mint az a 13. ábra B felén látható, az X plazmiddal transzfektált sejtek lizátumából származó, és az anti-IgG antitesttel reaktív sávok lassabban vándoroltak, mint a nekik megfelelő Z sávok. Azonban, mivel mindegyik karboxiterminális hasítási termék hordozza az A fehérje IgG kötő doménjeit, várható volt, hogy az immunglobulin specificitásától függetlenül mindegyik fehérjetermék reagál az IgG-vei (például 5. és 6. sáv).
Minthogy mindkét terméket detektáltuk, az eredmény mutatja, hogy ICP35 c, d és Pra, az UL26, illetve UL26.5 termékei hasítás révén transzlációs feldolgozásra kerültek. Mivel a két fehérje közös aminosav-szekvenciával rendelkezik az ICP35 c és d teljes hosszában, s mivel a két fehéije hasítási termékei együtt vándorolnak, a két fehérje hasítása azonos helyen történik. Végül, mindkét nyitott leolvasási keret transzlációs termékei in vitro kettős sávokká válnak szét. A kettős sávok különösen jól láthatóak az ICP35 esetében (c és d forma). Az ezidáig végzett kísérletek mindegyikében, beleértve all. ábrán láthatót is, a hasítás karboxiterminális terméke egyetlen sávot alkotott. Ez a megfigyelés egybevág azzal a feltételezéssel, hogy a kettős sávok létrejöttét okozó különbségek a fehérjékben inkább az amino-, mint a karboxiterminális közelében találhatók.
14. példa
A proteáz expressziós rendszere mint vizsgálati módszer
A 14. ábrán az UL26 nyitott leolvasási keret által kódolt, denaturáló gélen elektroforetikusan elválasztott, 35S-metionin-jelölt polipeptidek autoradiográfiás képe látható. Az U és Y plazmidok által hordozott UL26 nyitott leolvasási keretet (1. ábra) in vitro átírtuk, és nukleázkezelt nyúlretikulocita-lizátumban lefordítottuk. Az
1. oszlopban a transzlációs elegyből a transzláció megkezdése után 360 perccel vett minta látható. A 2-5. oszlopok a transzlációs elegyből a transzláció megkezdése után 10 (0) vagy 360 (360) perccel vett mintákat reprezentálnak. A 2-5. oszlopban látható minták esetében a transzláció megkezdése után 10 perccel a transzlációs elegy megfelelő mennyiségét 20-szorosára hígítottuk 100 pg/ml cikloheximidet és 0,4%-os SDS-t (nátriumdodecil-szulfát) (3. oszlop) vagy 500 pg/ml PMSF-t (fenil-metán-szulfonil-klorid) (4. oszlop) tartalmazó PBS-oldatban.
Amint az a 14. ábrán látható, a PMSF részlegesen gátolta a proteáz önhasítását. Az 5. oszlopban normális önhasítás látható. A 3. oszlopban az SDS 100%-os gátlást eredményezett. A 14. ábra magyarázata, hogy 1. SDS, a denaturáló detergens teljesen gátolja a proteázaktivitást (3. oszlop); 2. a proteáz képes önhasításra proteázgátló hiányában; és 3. a proteáz részleges gátlása következik be PMSF, egy szerinproteáz-gátló hatására.
HU 216 622 Β
15. példa
A proteázfehérje doménjeinek jellemzése
A proteázfehérje jellemzője, hogy (i) több olyan domént tartalmaz, amelyek nem szükségesek katalitikus aktivitásához, és (ii) az aktív hely a proteáz aminoterminálisához közel található.
E jellemzőket kimutató kísérlet terve két megfigyelésen alapult. Az első, hogy további aminosav-szekvenciák, köztük a Staphylococcus A fehérje IgG kötő doménjeinek beinszertálása nem gátolja meg a proteáz önhasítását, viszont könnyen detektálható reakcióterméket eredményez. A második, hogy humán citomegalovírus monoklonális antitest 20 aminosavas epitopját kódoló szekvencia in frame inszerciója UL26 és UL26.5 ORF-ek kódoló doménjébe kettős célt szolgál. Elsődlegesen az ORF-ek termékeinek specifikus azonosítására szolgál. Másodsorban a proteáz különböző doménjeinek szétválasztásakor a proteáz azon részeinek azonosítására szolgál, amelyek összefüggőek kell legyenek a katalitikus működéshez.
A. Az Ul26 fehérje funkcionális doménjeinek körvonalazása
Az Ul26 proteáz hárommutáns-sorozatát (I. táblázat) használtuk fel a proteáz domének felderítéséhez. Az első sorozatot az UL26 és UL26.5 nyitott leolvasási keretek térképezésére szerkesztettük, és három UL26 génből állt, amelybe különböző helyeken in frame inszertáltunk 20 aminosav hosszúságú, CMV epitopot kódoló DNSszekvenciákat.
A második sorozat 10 UL26 gén konstrukcióból állt, amelyek a gén különböző régióiban stop kodonokat vagy deléciókat hordoztak (I. táblázat).
A harmadik sorozat hat UL26 génből állt, amelyek a 7-215 aminosavrégióban a megjósolt aminosav-szekvenc iában szubsztitúciókat tartalmaztak. Amint azt a következő részben bemutatjuk, mindegyik plazmid Ul26 génje az Ci4 promoter segítségével expresszálódott. A proteáz szubsztrátja általában az L plazmidban (1. ábra) klónozott, in frame CMV epitop inszertet hordozó Ul26.5 gén volt. A kivétel, a P és J klón, amelyek a CMV epitopot az UL26 és az Ul26.5 kódoló szekvenciáiban (J plazmid), vagy csak az UL26 kódoló doménjében (P plazmid) hordozták.
Általában BHK sejteket az L plazmiddal és egy proteázt kódoló plazmiddal transzfektáltuk, és felülfertőztük HSV-l(F) vírussal 39 °C-on. A sejtlizátumokat denaturáló gélen elektroforetikusan elválasztottuk, nitrocellulózlapra átvittük, majd minden Ul26.5 termékkel reagáló H725 HSV monoklonális antitesttel és a csupán a CMV epitopot hordozó UL26.5 termékekkel reagáló CH28-2 CMV monoklonális antitesttel reagáltattuk (lásd 15. ábra). Mivel a HSV-l(F) a fő HSV-1 szabályozó fehérjét meghatározó «4 génekben hőmérsékletérzékeny léziót hordoz, nem expresszálja saját UL26 proteázát vagy szubsztrátját 39 °C-on. Azonban az a gén transzindukáló faktor (VP16) működőképes magasabb hőmérsékleten is (Post és munkatársai, 1981; Batterson és munkatársai, 1983), és transzaktiválja a proteázt (Ul26) és a szubsztrátot (UL26.5) meghatározó gén expresszióját. Az eredmény a következő volt:
(1) A virális genomban rezidens UL26.5 gén 34 °Con a HSV monoklonális antitesttel reagálni képes (1. és 14. oszlop), 39 °C-on reagálni nem képes (2. és 15. oszlop) fehérjesávokat eredményezett. Továbbá a proteolitikus hasítás termékeinek jelenléte (e és f sáv) arra utal, hogy 34 °C-on az UL26 által kódolt virális proteáz is szintetizálódott.
(2) A virális genomban kódolt UL26 proteáz nem fejeződött ki 39 °C-on (3. oszlop). Vagyis a proteázt kódoló plazmid hiányában az L plazmid által kódolt szubsztrát szintetizálódott (c és d sáv), de az e és f sávokat eredményező hasítás nem zajlott le, utalva arra, hogy a virális genomban kódolt proteáz nem permisszív hőmérsékleten nem expresszálódott.
(3) Csupán az L plazmidból származó prekurzor ICP35 c és d formák akkumulálódtak a H (4. oszlop), G (5. oszlop), CC (7. oszlop), D (9. oszlop), DD (11. oszlop), FF (13. oszlop), II (21. oszlop) és JJ (23. oszlop) plazmidok mutáns UL26génjeivel transzfektált sejtekben. Ezekben a sejtekben a géntermék proteáz működése inaktiválódott.
(4) Az L plazmid eredetű ICP35 mind prekurzor-, mind termékformája akkumulálódott az AA (6. oszlop), B (15. ábra, 8. oszlop), BB (10. oszlop), EE (12. oszlop), GG (20. oszlop), HH (19. oszlop), KK (22. oszlop), P (25. oszlop), MM (26. oszlop) és NN (27. oszlop) plazmidok mutáns UL26 génjeivel transzfektált sejtekben.
/. táblázat
Az Ul26 proteázt kódoló génen végrehajtott mutációk listája
Vad típusú génbe helyezett mutációk elnevezése
Inszcrciós mutánsok (20 aminosavnyi CMV epitop)
P Inszerció a 218. aminosav után
J Inszerció az 514. aminosav után
Q Inszerció a 615. aminosav után
Dclcciós mutánsok konstrukciója
D 1 -200. aminosavak deléciója
G 219-615. aminosavak deléciója
EE 1 -9. aminosavak deléciója
FF 1 -32. aminosavak deléciója
AA Stop kodon inszerciója a 615. aminosav után
BB Stop kodon inszerciója az 514. aminosav után
CC Stop kodon inszerciója a 287. aminosav után
DD Stop kodon inszerciója a 218. aminosav után
MM Stop kodon inszerciója a 306. aminosav után
NN 307-635. aminosavak deléciója
Aminosav-szubsztitúciók
GG Gly7AspArg helyett SerArgThr (új Xbal hely)*
HH Aspj|SetGly helyett LeuAspMet (új Xbal hely)*
HU 216 622 Β
I. táblázat (folytatás)
Aminosav-szubsztitúciók
II His61 helyett Val (új AatlI hely)*
JJ Hisl41t helyett Alá (új PstI hely)*
KK Ser2|5 helyett Alá (új Nhel hely)*
LL Asp34 helyett Alá (új Nhel hely)*
*A szubsztituált szekvenciák a következők voltak:
GG plazmid: CCGGGAGACCGATG helyett
CCGTCTAGAACCATG;
HH plazmid: TATGACAGCGGGGAC helyett
TATCTAGACATGGAC;
II plazmid: GACCAACCGC helyett GACGTCCGC;
JJ plazmid: GCGCACGTC helyett GCTGCAGTC;
KK plazmid: ACGCTTTCCAACC helyett ACGCTAGCCACC;
LL plazmid: GGGGACTCGGGG helyett GGGGCTAGCGGC.
(5) Amint azt fentebb megjegyeztük, a P plazmidba a 20 aminosavnyi epitopot 218 aminosav után inszertáltuk, vagyis az UL26.5 által kódolt szubsztrát fehérje kódoló doménjétől upstream. A P plazmid által kódolt proteáz saját magát (16., 17. oszlop) és ICP35-öt (25. oszlop) hasította. J plazmid a CMV inszertet az 514. aminosav után hordozta (1. ábra). A próbák során (18. oszlop) a magában a J plazmidban kódolt UL26 termékét hasította. Ebben az esszében az egyedüli detektált hasítási termék az e sáv volt. Mivel az epitopot az UL26.5 fehérjébe is beinszertáltuk, elképzelhető, hogy a beinszertált 20 aminosavas epitop meggátolta és csökkentette a hasítás hatékonyságát. A Q plazmid által kódolt proteáz (1. ábra és I. táblázat) más plazmidok UL26 génjeinek termékét hasította, viszont a saját doménjében kódolt gén termékét nem, mivel a 615. aminosav után beinszertált epitop meggátolta a hasítást.
A 17. összefoglaló ábra a mutagenezis vizsgálatok eredményeinek sematikus ábrázolása. A számok a McGeoch és munkatársai (1988) által leírt UL26ORF nukleotidszekvencia alapján megjósolt aminosavszámot jelzik. Az inszercióknál feltüntetett aminosavak közvetlenül az inszerció helye előtt találhatók. Az aminosavakat egybetűs kóddal jelöltük. Az üres jelek mutatják, hogy a proteáz működőképes volt. A kitöltött jelek arra utalnak, hogy a proteáz a mutagenezis által inaktiválódott. Az ábra alján húzódó vonal a proteáz doménjeit jelzi (I-IV. számok). A restrikciós endonukleáz helyek rövidítése a következő: B: BstEII, H: Hpal, M: MstlI, P: Pmll. Me az UL26.5 nyitott leolvasási keret metionin transzláció iniciációs kodonját jelöli.
B. Az Ul26proteáz doménjeinekjellemzése
A 15. ábrán bemutatott és a 16. ábrán összefoglalt eredmények arra utalnak, hogy az UL26 proteáz négy doménből áll, amelyek közül kettő nélkülözhető, kettő pedig nem. Az I. és IV. mellőzhető domének az 1. aminosavtól a 9.-en túl, de a 32.-en innen, illetve a karboxiterminálistól (635. aminosav) legalább a 307. és legfeljebb a 287. aminosavig tart. A III. számú dómén láthatólag legalább a 218. aminosavtól legfeljebb a 306. aminosavig terjed. Ez a dómén elmozdítható legalább aminosavval (CMV epitop inszerciója a 218. aminosav után) a proteáz aminoterminális részéhez viszonyítva. A II. számú dómén sem nélkülözhető, és láthatólag a 10. és 218. aminosav között helyezkedik el.
C. Az Ul26proteáz katalitikus doménje
Proteázgátlókkal végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy UL26 előreláthatólag a szerinproteázok kimotripszin vagy szubtilizin alcsaládjába tartozik (Kraut, 1977; Neurath, 1983). A két szerinproteáz-alcsalád közös jellemvonása, hogy aktív centrumukban hisztidin, aszparaginsav és szerin aminosavak találhatók.
Az ICP35, a proteáz szubsztrátja leírások szerint (Newcomb és munkatársai, 1991) szerepet játszik a HSV kapszid összepakolásában, mint váz (scaffolding) fehérje. Más herpeszvírusok replikációja során hasonló az események sorozata, és beszámoltak az ICP35 homológjairól is (Robson és Gibson, 1989). Különleges érdeklődés övezte azt a kérdést, hogy az UL26 ORF homológjai más herpeszvírusokban tartalmaznak-e konzervált hisztidin, aszparaginsav és szerin aminosavakat, amely triád az UL26 proteolitikus aktivitásában játszik szerepet.
Nukleotidszekvencia-összehasonlítások arra utalnak, hogy a Varicella zoster vírus 33. ORF-je és a humán citomegalovírus CMV UL80 ORF-je a HSV-1 UL26 ORF homológjait kódolják (McGeogh és munkatársai, 1988; Chee és munkatársai, 1990; Davison és Scott, 1986). A HSV Ul26, CMV UL80 és VZV 33 gén fehérjéinek aminosav-szekvencia-összehasonlítása kimutatta, hogy az Ul26 proteáz legkonzervatívabb régiója az aminoterminális rész. Az a következtetés, hogy a proteáz az Ul26 ORF aminoproximális doménjében helyezkedik el, összeegyeztethető a megfigyeléssel, mely szerint az ICP35, az Ul26.5 ORF terméke nem rendelkezik enzimaktivitással. Hogy feltérképezzük az UL26 aminoproximális doménjének konzervált aminosavait, a GG, II, JJ, KK és LL plazmidokban kódolt aminosav-szubsztitúciók segítségével megvizsgáltuk az Asp3|Ser32, Asp34, His6|, Hísi48 és Ser2|5 aminosavakat. Az eredményt azt mutatta, hogy az enzimaktivitás megszűnéséhez csak a 61. és 148. pozíciókban található konzervált hisztidin szubsztitúciója vezetett. Jobban körülhatárolt térképezési vizsgálatokat megelőzően elmondhatjuk, hogy a proteáz katalitikus doménje valószínűleg az UL26 proteáz
II. doménjében található.
D. Az UL26proteáz többi doménjének szerepe
Az I., II. és III. domének szerepe nem ismert. Mivel a szubsztrát, ICP35 aggregálódik, hogy a HSV kapszid vázát megalkossa, valószínűleg a proteáz is bekapcsolódik a vázépítés (scaffolding) folyamatába, és legalább a
III. dómén, de feltehetőleg az I. és IV. domének is komplexet kell, hogy alkossanak az ICP35-tel.
16. példa
Az UL26 gén szerinproteázt kódol
A leírásban ismertetett 20 aminosavnyi CMV epitopot és az A fehérje 256 aminosavnyi IgG kötő doménjét (Y plazmid, 1. ábra) beinszertáltuk az UL26 ORF terminális aminosavja és stop kodonja közé. Az Y plazmid kódoló doménjének Sp6 RNS polimeráz segítségével
HU 216 622 Β kapott átiratait nukleázkezelt nyúlretikulocita-lizátumban transzláltuk 10 percig [35S]-metionin jelenlétében. Ekkor cikloheximidet adtunk az elegyhez a további transzláció megállítására, és az Y plazmid transzlációs termékeit további 6 órán keresztül inkubáltuk proteázgátlók jelenlétében, hogy az önhasítást lehetővé tegyük. Az Y plazmidkonstrukcióban klónozott UL26 ORF-ről in vitro átirt szintetikus RNS-ekről in vitro nyúlretikulocita-lizátumban kifejezett polipeptidek elektroforetikus elválasztást követő autoradiográfiás képe a 16. ábrán látható. Az oszlopok a 10 perces szintézist követően elektroforézis céljából azonnal denaturált (15. és 28. oszlop), illetve további 6 óráig 100 pg/ml cikloheximiddel vagy kiegészítve más proteázgátlókkal (pm) inkubált (1-4., 16-27., 29-47. oszlopok) mintákat reprezentálnak. Mindegyik proteázgátlót dimetil-szulfoxidban (DMSO) oldottuk fel használat előtt.
Az eredmény (16. ábra) a következő volt:
(1) A 10 perces transzláció termékei egyetlen jelölt polipeptidsávot alkottak, amely a hasítatlan proteázt (Pra) tartalmazta (15. és 28. oszlop).
(2) Hatórás reakció után 100 pg/ml cikloheximid jelenlétében, de proteázgátlók nélkül a reakcióelegy három sávot eredményezett, amelyek az intakt transzlációs terméknek (Pra), a transzláció aminoterminális (Prb) és a karboxiterminális (PA) hasítási termékének felelnek meg (9., 10., 21., 22. és 33. oszlopok).
(3) A hasítási termékek, Pra és PA mennyisége csökkent a transzlációs elegyben cikloheximid és alacsony koncentrációjú szerinproteázgátlók, azaz diizopropil-fluorofoszfát (DFP, Sigma, St. Louis, MI), L-ltozilamido-2-fenil-etil-klór-metil-keton (TPCK, Sigma), Na-p-tozil-L-lizin-klór-metil-keton (TLCK), fenilmetil-szulfonil-fluorid (PMSF, Sigma) és kimosztatin (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) jelenlétében. A legmagasabb vizsgált koncentrációk esetén emésztési terméket nem detektáltunk (1., 29., 34., 39. és 44. oszlop).
(4) A transzlációs termék (Pra) hasítását nem befolyásolták a cisztein proteázgátlók, azaz a jódecetsav (Sigma) és a cisztatin (Boehringer Mannheim; 5-9., 22-27. oszlop), a metalloproteáz kelátor és inhibitor etilénglikol-bisz(P-amino-etil-éter), Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetraecetsav (EGTA) vagy az aszparaginsav proteázgátló pepsztatin (Boehringer Mannheim; 15-21. oszlop).
Ezen eredmények egybevágnak a feltevéssel, miszerint az Ul26 gén terméke szerinproteáz.
17. példa
Gátlójelölt anyagok detektálása
A találmány a további kiviteli módok során új herpeszvírus proteázgátló vegyületek, „gátlójelöltek” azonosításának módszerével foglalkozik. Feltételezhető, hogy ez a szkrínelési módszer hasznosnak fog bizonyulni általában a herpeszproteáz gátlását eredményező bármely vegyület azonosítására. További feltevés, hogy az e tekintetben hasznos vegyületek semmiképpen nem korlátozódnak fehérjeszerű vagy peptid jellegű vegyületekre. Valójában az is előfordulhat, hogy a szkrínelési próba használata során majd azonosítható leghasznosabb gyógyszerészeti vegyületek nempeptid természetűek lesznek, amelyeket az enzim felismert, és hozzájuk kötődik, majd szoros kötés vagy más kémiai kölcsönhatás révén az enzim aktiválódik.
A találmány szerinti vizsgálati eljárás, amely gátlójelöltek herpeszproteázgátló képességét határozza meg, általában a következő lépéseket foglalja magában:
(a) olyan herpeszproteázt tartalmazó készítmény előállítása vagy beszerzése, amely képes a saját aminosav-szekvenciáját, az ICP35 fehérjét vagy bármely, a proteáz hasítási helyén hordozó aminosav-szekvenciát hasítani, (b) a gátlójelölt keverése a proteáz készítménnyel, (c) a proteáz hasítási képességének meghatározása a gátlójelölt jelenlétében, és (d) a hasítás megtörténtének ellenőrzése.
Az itt ismertetett gátlójelölt szkrínelési próba fontos szempontja, hogy képesek legyünk a proteázkészítményt viszonylag tisztított formában elkészíteni, például az alább leírt módszerrel. Erre azért van szükség, mivel legalább viszonylagosan tiszta preparátum hiányában nem leszünk képesek specifikusan a proteázgátlást mérni, kiküszöbölni a kivonat egyéb anyagainak gátló hatását, amely befolyásolhatja a proteáz működését. Mindenesetre, a proteáz sikeres izolálása most először teszi lehetővé, hogy új vegyületeket azonosítsunk, amelyek használhatók e herpeszfehérje gátlására.
A gátlójelöltpróba egyszerűen előkészíthető és kivitelezhető, és több vonatkozásban kapcsolódik az imént tárgyalt, proteázaktivitást meghatározó próbához. Miután rendelkezésre áll viszonylag tisztított proteáz-preparátum, kívánatos volna, hogy csupán össze kelljen keverni a gátlójelölt anyagot a proteázkészítménnyel, lehetőleg olyan körülmények között, ahol a proteáz képes ellátni hasító funkcióját, ha gátló anyag nincs jelen. így például kívánatos lehet az elegyhez adni olyan ismert proteázszubsztrát adott mennyiségét, mint például az Ul26.5 kódoló szekvencia által meghatározott aminosav-szekvencia, vagy legalább a hasítási hely, ahol a proteáz hasítja ICP35 c és d-t e és f formákká. Ily módon mérhető a gátlójelölt azon képessége, hogy csökkenti vagy megváltoztatja a herpeszproteáz szubsztráthasítását a gátlójelölt jelenlétében.
Következésképpen, kívánatos lehet mérni, vagy más módon meghatározni a viszonylagosan tisztított proteáz aktivitását a vizsgált gátlójelölt hiányában a gátlójelölt jelenlétében mutatott aktivitáshoz viszonyítva, hogy megállapíthassuk a gátlójelölt anyag relatív gátlóképességét.
A találmány megvalósítása során a proteázt olyan hatékony koncentrációjú proteázgátlónak vetjük alá, mint a fent tárgyalt peptidilvegyületek családjának tagjai vagy a gátlójelölt-vizsgálat példája szerint azonosított gátlójelöltek. A találmány fontos felismerése, hogy feltételezésünk szerint a herpeszproteázgátlása révén képesek lehetünk herpeszfertőzések kezelésére. Ilyen gátlók használata a kapszid fehérjék termelődésének blokkolására a fertőzések kezelését vagy csillapítását eredményezi, és önmagában, vagy más herpeszterápiával kombinálva hasznosítható lehet.
HU 216 622 Β
1. Markerek (keresők)
Két monoklonális antitestet használtunk markerként (keresőként), az egyik az mind UL26, mind Ul26.5 nyitott leolvasási keretek által kódolt állandó epitoppal, a másik egy „mozgó epitoppal” reagálni képes. Az utóbbi nélkülözhetetlen eszköz volt a két nyitott leolvasási keret termékeinek azonosítása során, a fehérjék funkciójának meghatározásakor, valamint a hasítási helyek térképezésénél. A „mozgó epitop” nélkül az elemzés egyedül a gén különböző doménjeinek megfelelő oligopeptidjeik ellen képzett radioaktív keresők vagy monoklonális antitestek használatára hagyatkozna. A mozgó epitop bármely nyitott leolvasási keret termékéhez közvetlen antitestet kínál, és a találmány során használata jelentősen megkönnyítette az általa megjelölt géntermék funkciójának azonosítását.
Citomegalovírus monoklonális antitesttel reagálni képes epitop és Staphylococcus A fehérje IgG kötő dómén homológok kódoló szekvenciájának beépítése segítségével a két nyitott leolvasási keret kódoló doménjének 3’ végébe, azonosítottuk a proteázhasítás termékeit, a Prb elnevezésű hasított proteázt és ICP e és f formákat. E módszerrel azt is meghatároztuk, hogy az ICP35 fehéijék hasítási helye és a teljes proteáz szekvenciaelválasztási helye Pra és Prb termékekké mind a proteáz, mind az ICP prekurzor karboxiterminális végétől körülbelül 20 aminosavra helyezkedik el.
A herpeszgenom markerrel jelölt plazmidokkal történő vizsgálatára szemléletes példa S marker-inszertált plazmid (1. ábra) hatása, amelyet sejtek herpeszgenom egy részével történő transzfektálására használnak. Ebbe a plazmidba a CMV epitopot az ICP-szekvencia karboxiterminálisánál inszertáltuk. Az ily módon a herpeszgenom egy részével fertőzött sejteket összegyűjtöttük és elroncsoltuk, hogy a sejtekben lévő fehérje vizsgálható legyen. Ezeket a fehérjéket molekulatömegük alapján elektroforetikusan sávokká választottuk el. ICP35 immunológiailag azonosítható a HSV antitesttel. Az epitop ellen képzett antitest alkalmazásával és az antigén-antitest komplex képződést mutató jel detektálásával kerestük a CMV epitopot a sávok között. Az immunológiai elemzés eredménye azt mutatta, hogy a CMV epitopot a c és d sávokban detektáltuk, e és f sávokban viszont nem. Ez mutatta, hogy c és d karboxiterminálisának hasítása révén jött létre e és f.
2. Sejtmentes fehérjeszintézis
Másik fontos alkalmazott technika volt a sejtmentes fehéqeszintetizáló rendszer. UL26 és UL26.5 mRNS-einek megfelelő RNS-eket Sp6 RNS polimeráz segítségével átírtuk, és nukleázkezelt nyúlretikulocita-lizátumban, sejtmentes „ríboszómagépben” kifejeztük. A sejtmentes rendszerben in vitro kifejezett fehérjéket radioaktív jelöléssel jelöltük, gélelektroforézissel elválasztottuk, majd autoradiográfia segítségével határoztuk meg a jelölést tartalmazó sávokat. Ezt az általános metodikát két kísérleti rendszerben használtuk:
(i) U plazmid transzlációs termékeinek inkubálása cikloheximid jelenlétében, amely az UL26 fehérje hasítási termékének (Prb) fokozatos akkumulációját eredményezte. A felhalmozódott hasítási termék mennyisége arányos volt az inkubáció időtartamával (12. ábra, 12-15. oszlop).
(ii) Hasonló eredményt kaptunk a V plazmid transzlációs termékeinél (4-7. oszlop). E kísérlet jelentősége az Ul26 karboxiterminálisánál beinszertált CMV epitop jelenlétében rejlik. Mint várható volt, a V plazmid eredetű UL26 Pra transzlációs terméke lassabban vándorolt, mint az U plazmidból származó eredeti fehérje. Azonban a V plazmid eredetű UL26 feldolgozott alakja, Prb együtt vándorolt U plazmid eredeti fehérjéjével, jelezve, hogy az UL26 autoprocesszálása karboxiterminális proteolitikus hasítással jár.
3. HSV-l(F), a hőmérséklet-szenzitív mutáns
A HSV-genom elemzésének másik eszköze HSV-l(F) volt, egy hőmérséklet-szenzitív mutáns, amely 39 °C-on nem expresszálja saját UL26 és UL26.5 nyitott leolvasási keretét. HSV-l(F) nempermisszív hőmérsékleten inkább ct gén promotereket indukál (Post és munkatársai, 1981), és elsődlegesen a típusú géneket expresszál.
4. Proteázgátlás azonosítása és felhasználása
Ha a proteáz működése gátolt, nem képződik kapszid, és a vírus nem replikálódik. Ez a gátlás megtörténhet a transzkripció, transzláció vagy a fehérjeműködés szintjén. A transzkripció gátlása szükségessé teszi az mRNS-szintézis gátlását a DNS-templáton. A transzláció gátlása szükségessé teszi a fehéijeszintézis gátlását az mRNS-templáton. Ennek alternatívájaként a proteáz működése gátolható a proteáz szerkezetének, különösen a proteolitikus egységének elroncsolásával, a szubsztrát hasítási helyének megváltoztatásával, vagy a proteáz irreverzibilis gátlókhoz való kötésével.
Speciálisan tervezett peptidek, amelyek gátolják a proteáz működését, igen értékesek a herpeszfertőzések megelőzése és kezelése során. Ilyen blokkolók között lehetnek szubsztrát analógok, vagy szerinproteáz-gátlók, például oligopeptidek, vagy a proteáz által felismert hasítási hely aminosav-szekvenciáját hordozó származékok. Megfelelő proteázgátlók azonosításának módszere gátlójelöltek közül a 17. példában olvasható.
Proteázfehérje előállításának szemléltető kiviteli módja például a kívánt proteázfehérjét vagy polipeptidet kódolni képes nukleinsav-szekvenciát tartalmazó nukleinsavszakasz előállítása. Ez a szakasz kódolhatja a teljes proteázt vagy annak csak egy részét, például a proteáz proteolitikus doménjét. A szakasz lehet olyan rövid is, amely antitesttel már pozitív jelet képes kiváltani, s így jelzi a virális fertőzés meglétét. Az 1. ábrán bemutatott, a találmány céljaira létrehozott szekvenciákkal funkcionálisan egyenértékű szakaszokat szintén választhatunk, az előállítani kívánt polipeptidtől függően. A funkcionális egyenértékűséget meghatározhatjuk annak tesztelésével, hogy a szakasz képes-e hasítani az ICP35 prekurzort vagy a Pr proteázt, például az itt bemutatott, gátlójelöltek közül proteázgátlók kiválasztására szolgáló módszerekkel.
A kiválasztott nukleinsavszakaszt polipeptid expressziójának számára megfelelő környezetbe helyezzük. Ez lehet expressziót indukálni képes elegyet, például nyúlretikulocita-lizátumot tartalmazó edény. Ennek
HU 216 622 Β alternatívájaként a szakaszt gazdasejtbe juttathatjuk transzformáció, rekombináns expressziós vektor általi transzfekció, elektroporáció vagy „génágyú” segítségével. Gazdasejtet választhatunk BHK, Verő, Hela, E. coli és hasonló sejtek közül.
A rekombináns expressziós vektor tartalmazhat promotert. Ilyen promoterre példa az a.4 promoter, az UL26 natív promotere, és bármely más prokarióta vagy eukarióta promoter.
Másik kiviteli mód nukleinsavszakasz előállítására genom nukleinsav kinyerése herpesz sejtekből, a proteolitikus helykonzervált nukleinsav-szekvencia régiójának felerősítése a genomon belül, az említett felerősített nukleinsav-szekvenciákat tartalmazó rekombináns kiónok előállítása és a kívánt felerősített nukleinsavszekvenciákat tartalmazó kiónok kiválasztása.
Virális proteázt előállíthatunk proteáztartalmú minta kinyerésével, a minta homogenizálásával, s a homogenátum frakcionálásával a proteázfrakció kinyerésére. Proteázt tartalmazó minták lehetnek biológiai minták, például virálisan fertőzött szövetek.
5. Vírusok és sejtek
A találmányban használt HSV-l(F), HSV-2(G), a HSV-1, illetve HSV-2 törzsek prototípusainak jellemzői, és a timidin kináz deficiens újszülött hörcsög vese (BHK) sejtek fenntartása és szaporítása Arsenakis és munkatársai (1986), Ejercito és munkatársai (1968), valamint Roizman és Spear (1968) munkáiban olvasható, illetve ezek alapján történt.
6. Monoklonális antitestek
Az ICP35 és CMV B glikoprotein ellen képzett H725, illetve CH28-2 monoklonális antitestek jellemzését korábban már leírták (Braun és munkatársai, 1983, 1984; lásd még Zweig, 1980; Liu és Roizman, 1991). A H725 monoklonális antitest reagál a HSV-1 ICP35jével, a HSV-2 fehérjékkel viszont nem (Braun és munkatársai, 1983, 1984). CH28-2-t L. Pereira-tól kaptuk (Liu és Roizman, 1991a; Braun és munkatársai, 1984). Ehelyett bármely, ismert epitop elleni bármely, kereskedelemben kapható antitest használható. CH28-2 a humán citomegalovírus (CMV) B glikoproteinje ellen képzett monoklonális antitest. Az antitest epitopja térképezés után egy 20 aminosavnyi pepiidnek bizonyult, NKGQKPNLLDRLRHRKNGYRH-C aminosav-sorrenddel, amely a fehérje feltételezett nukleotidszekvenciájának megfelelően szintetizált, átfedő peptidsorozat reaktivitásának mérése alapján adódott.
7. In vitro transzkripció és transzláció pg, EcoRI vagy HindlII segítségével linearizált plazmid DNS-templátot állítottunk elő, és GppG cap analóg (New England Biolabs, MA) jelenlétében átírtuk Sp6 vagy T7 RNS polimerázzal, a Promega Biotec, Madison, WI leírása alapján. Az RNS 1 pg-nyi mennyiségeit 10 percig transztól tűk 50 pl, nukleázkezelt nyúlretikulocita-lizátumot (Promega Biotech, WI) és [35S]metionint (Dupont, NEN Research Product) tartalmazó reakcióelegyben, majd a transzlációt leállítottuk, vagy lízispuffer (0,05M Tris pH 7,0, 8,5% v/v szaharóz, 5% v/v β-merkapto-etanol, 2% v/v SDS) hozzáadásával, vagy 20-szoros felhígítással cikloheximidet (100 pg/ml végső koncentráció) és különböző koncentrációban proteázgátlót tartalmazó PBS-oldattal. 6 óra reakcióidő után cikioheximid jelenlétében az elegyet lízispufferben denaturáltuk, poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk, elektromos úton átvittük nitrocellulóz membránra az itt ismertetett módon (lásd még Liu és Roizman, 1991 és Braun, 1984), majd Kodak X-Omat filmen exponáltuk.
8. Plazmid DNS-sel transzfektált sejtek transzfekciója és jéliilfertőzése
A transzfekciót Kristie és Roizman (1984) leírása szerint végeztük, azzal az eltéréssel, hogy a sejteket általában 10 pg plazmid DNS-sel transzfektáltuk. BHK sejtek 6 lyukú Costar (Cambridge, Mass.) tenyésztőedény kultúrája körülbelül 106 sejtet tartalmazott lyukanként. A legtöbb kísérlet során a transzfektált sejteket a transzfekciót követő 18-20 óra elteltével sejtenként 10 pfu HSV-1(F) vagy HSV-2(G) vírussal fertőztük, mint az az Eredmények között olvasható. Két óra 10 °C-on történő expozíció után az oltóanyagot felcseréltük 10%-os fetális marhaszérummal kiegészített, Dulbecco által módosított Eagle-féle táptalajra, s a sejteket 34 °C-on, 37 °C-on vagy 39 °C-on inkubáltuk 20 órán keresztül. A vírusfertőzéssel nem járó kísérletek során a sejteket a transzfekció után 40-42 órával összegyűjtöttük. A fertőzés után 20 órával a sejteket 2 órán keresztül 35Smetioninnal (50 pCi/ml táptalaj) jelöltük (1% borjúszérummal kiegészített 199 metionin nélkül). Az összegyűjtött sejteket egyszer mostuk PBS-sel, 5 perces, körülbelül 4,000 rpm-es centrifugálással ülepítettük (SS34 Sorvall rotor, DuPont centrifuga), lízispufferben szuszpendáltuk, jégen 20 másodpercig szonikáltuk, s egy percig forraltuk a denaturáló gélen való elektroforézis előtt (lásd még Liu és Roizman, 1991a és b; Ejercito és munkatársai, 1968).
9. A fertőzött sejtfehérjék (ICP) elektroforetikus elválasztása és festése monoklonális antitesttel
A sejtlizátumból vagy in vitro transzlációból származó denaturált, szolubilizált polipeptideket Ν,Ν’-diallil-borkősav-diamiddal keresztülkötött, 9,5% vagy 12% (v/v) SDS-poliakrilamid gélen választottuk el, Gibson és Roizman (1972, 1974) és Braun és munkatársai (1984) szerint. A BHK sejtekből származó elválasztott polipeptideket elektromos úton nitrocellulóz membránra vittük át, és enzimkapcsolt immunvizsgálat során reagáltattuk, vagy csak torma peroxidázzal konjugált anti-egér IgG-vel (Amersham, Arlington Heights, IL), vagy ezen anti-egér IgG mellett HSV-1, ICP35 ellen képezett H725 vagy a CMV epitop ellen termelt CH28-2 monoklonális antitestekkel, Braun és munkatársai (1984) leírása szerint. A retikulocita lizátumból lefordított, elválasztott polipeptideket tartalmazó géleket megszárítottuk, és Kodak X-Omat filmen exponáltuk.
10. Citoplazmás RNS izolálása és Sí analízise
Látszatfertőzött vagy sejtenként 20 PFU HSV-l(F) vírussal fertőzött és 12 órán át inkubált Vero-sejtekből származó, citoplazmikus RNS-t Jenkins és Howett (1984) leírása alapján tisztítottuk. HSV-1 DNA-próbát (0,02 pmol) 5’ végén jelöltünk (gamma32P)ATP-vel (DuPont, NEN Research Products), 50 pg teljes cito23
HU 216 622 Β plazmikus RNS-sel hibridizáltuk, SÍ nukleázzal emésztettük, és 7%-os poliakrilamid gélen elválasztottuk 8M karbamid jelenlétében (Jenkins és Howett, 1984).
11. A találmány szerinti eljárásban szereplő fehérjék preparálást módszerei
Rekombináns vektorok hasznosak lehetnek mind a proteázt vagy ICP35-öt kódoló DNS előállításának vagy a kódolt fehérjék preparálásának módszere keretében. Feltehető, hogy ha a találmányban szereplő fehérjék előállítása rekombináns módszerrel történik, alkalmazható akár prokarióta, akár eukarióta expressziós rendszer.
Amennyiben eukarióta gazdában herpesz nukleinsavszakasz expresszióját tervezzük, kívánatos lehet olyan vektort, például plazmidot alkalmazni, amelyik eukarióta replikációs origót hordoz, mint például a pCMV-sorozat vektorai, többek között pCMV4. Ezenkívül, eukarióta rendszerben történő expresszió során kívánatos lehet a preotázt vagy az ICP kódoló szakaszt egy hatékony eukarióta promoter mellé és annak irányítása alá helyezni, mint amilyen például az SV40 vagy CMV promoter. Ahhoz, hogy egy kódoló szekvenciát akár eukarióta, akár prokarióta promoter irányítása alá helyezzünk, általában csak az szükséges, hogy a transzkripció iniciációs hely 5’ végét a választott promotertől downstream körülbelül 1 és 50 közötti nukleotidnyira helyezzük.
Továbbá, ha eukarióta expressziót alkalmazunk, kívánatos lehet egy megfelelő poliadenilációs hely (például 5’-AATAAA-3’) beépítése a kívánt peptidet vagy fehérjét hordozó transzkripciós egységbe. Általában a poli A farok a fehérje terminációs helyétől körülbelül 30-2000 nukleotidnyi távolságra helyezkedik el, a transzkripció terminációt megelőzően.
Hasznos eukarióta vektorok, amelyek a fenti kívánalmaknak megfelelnek, és amelyekbe a találmány herpesz génjei viszonylag könnyen beépíthetők, jól ismertek. Például, pCD és pCMV megfelelő vektorok, a leginkább alkalmazott a pCMV. A pCD és pCMS vektorokon kívül gyakori eukarióta expressziós vektor még pMSG és pSVL a Pharmacia LKB Technology, Piscataway, N. J. cégtől. Ezek az MMTV, illetve az SV40 késői promotereket használják. A herpeszfehéije teljes leolvasási keretét tartalmazó cDNS-t, mint amilyen az 1. ábrán látható, könnyen beinszertálható az előbb említett vektorok bármelyikébe a kódolt ICP35 prekurzor transzlációját elindító iniciációs kodontól (ATG) upstream (vagyis 5’ irányban) elhelyezkedő HindlII restrikciós helynél (AAGCTT).
Feltehetőleg lényegében bármely általánosan használt eukarióta gazdasejt alkalmas herpesz génexpreszszióra az itt leírtaknak megfelelően. A példákban szerepelnek eukarióta expresszióra általánosan használt vonalak, mint például az AtT-20, HepG2, VERŐ, HeLa, CHO, WI 38, BHK, COS-7 RIN és MDCK sejtvonalak. Az eukarióta expressziós kiviteli módok közül a BHK rendszer a legelőnyösebb.
Prokarióta expresszió egy olyan alternatíva, amely kívánt esetben alkalmazható. Bár nem kötelező, de prokarióta expresszió céljaira ajánlatos általában olyan transzkripciós egységet használni, amely csak a kívánt pepiidnek megfelelő leolvasási keretet tartalmazza, s például az 1. ábrán látható, hogy további processzálásra ne legyen szükség. Az alkalmazható jellegzetes prokarióta promoterek közé tartozik PL, T7 és a lac promoter, a leginkább előnyben részesített a T7 promoter. Kedvelt bakteriális expressziós vektorok a PKK233-2 és a PKK233-3 plazmidok, a Pharmacia LKB Technology cégtől. Ezek tac, illetve trc promotert használnak.
Természetesen még ha eukarióta kapcsolást és expressziót alkalmazunk is, ajánlatos prokarióta expreszsziós kezdőhelyet, valamint prokarióta rendszerben működőképes szelektív markereket használni, hogy lehetővé tegyük a szekvenciák „átkapcsolását” prokarióta konstrukcióról eukarióta expresszióra.
Bizonyos kiviteli módok esetében kívánatos lehet nemrekombináns szintetikus módszerekkel előállítani herpesz fehérjéket vagy peptideket, mint például kémiai peptidszintézis vagy sejtmentes riboszóma „gépezet” segítségével. Megfelelő peptidszintetizáló berendezések a kereskedelemben hozzáférhetőek (Applied Biosystems) és felhasználhatók.
A találmány némely kiviteli módja során feltételezhető, hogy az 1. ábrán látható szekvenciákat tartalmazó rövidebb és hosszabb DNS-szakaszok egyéb célokra is felhasználhatók, többek között rövid aktív peptidek előállítása során, vagy rövid DNS-szakasz hibridizációs próbaként, például klónbankok szkríneléséhez. Mindenesetre az 1. ábrán láthatónak megfelelő 14-20 nukleotidnyi hosszúságú szakaszok hasznosnak bizonyulhatnak ilyen vagy más példák szerint alkalmazva. DNS-szakaszok, amelyek hordoznak legalább 14 nukleotid hosszú, az 1. ábra nukleinsavszakaszaival megegyező vagy azzal komplementer fragmentumot, képesek lesznek preferenciális hibridek képzésére herpeszfajok DNS-eivel, különösen szigorú feltételek között, mint például 0,15M NaCl és 0,02M Na-citrát, pH 7,4 és 50 °C esetén.
Míg egy komplementer, vagy körülbelül 14 nukleotidnyi egyszerű szakasz biztosítja stabil hibrid képződését, bizonyos célokra hosszabb komplementer szakaszok hasznosabbnak bizonyulhatnak. Vagyis bizonyos esetekben hosszabb komplementer szakaszt hordozó DNS-fragmentumok lehetnek szükségesek, például 18, 22 vagy akár 25 bázis hosszúak.
A találmány szerinti módszer alkalmazható proteáz izolálására más fajokból, amely proteázok a HSV-1 proteáz enzimével antigenikusan keresztreaktívaknak bizonyulhatnak. Ez a módszer magában foglalja immunoadszorbens anyag készítését, amelyhez proteáz elleni antitestet kapcsolunk. A szakmabeliek számára számos immunoadszorbens anyag ismert, többek között például az Affi-Gel, Cn-Sepharose, protein A-speharose és számos más, jól ismert immunoadszorbens módszer. Az összes ilyen módszer hasznosnak bizonyulhat immun keresztreaktív molekulák izolálására (teljesebb körű listát lásd Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, John G. Hurrell, ed., CRC Press, 1982, megemlítve az irodalmi hivatkozásokban).
A találmány alkalmazása során herpeszproteáz vagy rokon proteázok klinikai detektálását biológiai mintákban lehetővé tévő kit is előállítható. Ilyen kit a proteázra
HU 216 622 Β vagy immunológiailag rokon proteázra specifikus poliklonális vagy monoklonális ellenanyagot tartalmazna, immundetekciós reagenssel kombinálva. Immundetekciós reagens definíció szerint bármely reagens, amely antitest/antigén komplexek létrejöttének detektálására vagy kvantifikálására szolgál. Jellemző immundetekciós reagensek közé tartoznak például radioaktív jelölésű vagy enzimjelölt antigének vagy antitestek. Jelölt antitestet felhasználó módszer például a RIA (radio-immunoesszé) és az ELISA (enzimkapcsolt immunoesszé). Mindamellett számos más technika ismert, amely felhasználható a találmánynak megfelelő immundetekciós kitekhez. Megfelelő technikákat bemutató szabványok például az US 4,446,232, 4,407,943, 4,399,299 és 454,233 számú szabadalmi leírásban találhatók.
Tehát egy tipikus, ELISA-technikán alapuló herpeszproteáz detekciós kit tartalmazhat anti-herpeszproteáz monoklonális antitestet vagy tisztított proteáz antigént (ha keringésben lévő antitestek detektálása a cél), és egy második „immundetekciós” antitestet, amely képes specifikus immunreakcióra a tisztított antigénnel vagy anti-proteáz antitesttel. A második antitest rendelkezhet színképző enzimaktivitással, például peroxidáz molekula hozzákapcsolása révén. Ha a második „immundetekciós” antitestet ily módon alkalmazzuk, először általában a tesztelni kívánt biológiai minta, például szérum, plazma, vizelet vagy szövetminta és az antitest között immunkomplex létrehozása történik. Az immunkomplex létrejötte után az immundetekciós ellenanyag hozzáadása következik, hogy kvantitatív reakcióba lépjen a proteázkötött antitesttel. A komplexképződés kalorimetrikus peroxidáz esszé segítségével kvantifikálható.
A fenti kettősantitest-módszer alternatívájaként használható enzim vagy radioligandum közvetlenül az antiproteáz antitesthez kötve, és a direkt jelölésű antitest közvetlenül kvantifikálható.
Az előbb ismertetett típusú kit és módszer jól ismert, és általánosan tekinthető úgy, hogy magában foglalja biológiai minta vételét a pácienstől, a biológiai minta érintkezésbe hozását antiherpeszproteáz monoklonális antitesttel az antigén/antitest komplex kialakulását elősegítő körülmények között, és a monoklonális antitest és a minta közötti specifikus immunológiai reakció létrejöttének kimutatását.
Semlegesítő antitestek szintén megemlíthetők, amelyek a proteázhoz vagy annak egy szakaszához való kötődés révén a proteáz proteolitikus képességét működésképtelenné teszik.
12. Gazdasejtkultúrák és vektorok
A találmányban bemutatott DNS-szekvenciák kezdeti klónozásához és a szükséges vektorok konstrukciójához a prokarióták általában előnyösebbek. Például az
E. coli K12 294 törzs (ATCC No. 314460) különösen hasznos. Más használható mikrobiális törzsek lehetnek E. coli törzsek, például E. coli B és E. coli X 1776 (ATTC No. 31537). Ezek a példák inkább illusztrációra, semmint megszorításra szolgálnak.
Prokarióták alkalmazhatók még expresszió céljaira. Az előbb felsorolt törzsek csakúgy, mint az E. coli W3110 (F-, lambda-, prototróf, ATCC No. 273325) bacilusfajok, például Bacillus subtilis vagy más Enterobacteriaceae-fajok, mint például Salmonella typhimurium, Serratia marcescens és különböző Pseudomonasfajok is használhatóak.
Általában gazdasejttel kompatíbilis fajokból származó replikon és szabályozó szekvenciákat tartalmazó plazmidvektorok használatosak az adott gazdával kapcsolatban. A vektor szokásosan hordozza a replikációs helyet, valamint markerszekvenciákat, amelyek a transzformáit sejtek fenotipikus szelekcióját teszik lehetővé. Például az E. coli transzformálására általában pBR322 plazmidot használnak, amely E. coli fajból származik. PBR 322 ampicillin- és tetarciklin-rezisztenciagéneket hordoz, és így egyszerű módszert kínál a transzformált sejtek azonosítására. A pBR plazmid vagy más mikrobiális plazmid vagy fág kell, hogy tartalmazzon, vagy különben bele kell építeni promotereket, amelyeket a mikrobiális szervezet képes felhasználni saját fehérjéinek expresszálására.
Rekombináns DNS-konstrukcióhoz legáltalánosabban használt promoterek közé tartozik a β-laktamáz (penicillináz) és a laktóz promoterrendszer, valamint a triptofán (trp) promoterrendszer. Bár ezek a leggyakrabban használtak, más mikrobiális promotereket felfedeztek és hasznosítottak, s nukleotidszekvenciájukról több részletet nyilvánosságra hoztak, a szakemberek számára lehetővé téve működőképes összekapcsolásukat plazmidvektorokkal.
A prokariótákon kívül eukarióta mikrobák, például élesztőkultúra is használható. Saccharomyces cerevisiae, vagyis a közönséges sütőélesztő a leggyakrabban használt az eukarióta mikroorganizmusok közül, bár számos más törzs is könnyen elérhető. Saccharomyces-ben történő expresszióhoz gyakran használják például az Yrp7 plazmidot. Ez a plazmid már hordozza a trp 1 gént, amely szelekciós markert kínál olyan mutáns élesztőtörzsek számára, amelyek nem képesek triptofán-tartalmú közegben növekedésre, például ATCC No. 44076 vagy PEP4-1. A trpl károsodása, ami jellemző az élesztő gazdasejt genomra, hatékony hátteret kínál a transzformáció detektálására triptofán hiányában történő növekedés esetén.
Elesztővektorokban megfelelő promoter szekvenciák a 3-foszfoglicerát-kináz vagy más glikolízis enzimek, például enoláz, glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz, hexokináz, piroszőlősav-dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glükóz-6-foszfát-izomeráz, 3-foszfoglicerinsav-mutáz, piroszőlősav-kináz, triózfoszfát-izomeráz, foszfoglükóz-izomeráz és glükokináz promoterei. Megfelelő expressziós plazmidok konstrukciója során az e génekhez társuló terminációs szekvenciákat szintén bejuttatják az expressziós vektorba az expresszálni kívánt szekvencia 3’ végére, hogy az mRNS-termináció poliadenilációja lehetővé váljon. Más promoterek, amelyek a növekedési körülmények által szabályozott transzkripció előnyével is rendelkeznek, például az alkohol-dehidrogénáz 2, izocitokróm C, sav-foszfatáz, a nitrogén anyagcserében részt vevő degradáló enzimek és az előbb említett glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz, valamint a maltóz és galaktóz hasznosításáért felelős enzimek promoter régiói. Bármely élesztő kompatíbilis promotert,
HU 216 622 Β replikációs kezdőhelyet és terminációs szekvenciát hordozó plazmidvektor megfelelő.
Mikroorganizmusokon kívül többsejtű szervezetekből származó sejtek kultúrája is használható gazdaként. Elvben bármely ilyen sejtkultúra működőképes, legyen az gerinces vagy gerinctelen eredetű. Azonban nagyobb érdeklődés tapasztalható gerinces sejtek iránt, s az utóbbi években gerinces sejtek kultúrában (szövetkultúrában) történő szaporítása rutineljárássá vált. Ilyen hasznos gazdasejt-vonalakra példa az AtT-20 VERŐ és HeLa sejtek, a kínai hörcsög ovárium (CHO) sejtvonalak, valamint a W138, BHK, COS-7 293 és MDCK sejtvonalak. Ilyen sejtekhez megfelelő vektorok általában hordoznak (ha szükséges) replikációs kezdőhelyet, promotert az expresszálni kívánt gén előtt, bármely kívánt riboszóma kötőhellyel együtt, RNS-hasítási helyeket, poliadenilációs helyet és transzkripció terminációs szekvenciákat.
Emlőssejtekben használható expressziós vektorok szabályozó funkcióit gyakran a virális eredetű szakasz kínálja. Például általánosan használt promoterek lehetnek polioma, adenovírus 2, cytomegalovírus és leggyakrabban simian vírus 40 (SV40) eredetűek. Az SV40 vírus korai és késői promoterei különösen hasznosak, mivel a vírusból könnyen kinyerhetők olyan szakasz formájában, amely hordozza az SV40 virális replikációs kezdőhelyet is. Rövidebb vagy hosszabb SV40 szakaszok szintén használhatóak, feltéve, ha ezek a HindlII helytől kezdődően a virális replikációs origóban található Bgl hely felé kiterjedő 250 bázispámyi szekvenciát is hordozzák. Továbbá az is lehetséges, s néha kívánatos, hogy a kívánt génszekvenciához eredetileg kapcsolódó promoter vagy szabályozó szekvenciát használjunk, feltéve, hogy e szabályozó szekvenciák kompatíbilisek a gazdasejt-rendszerekkel.
Replikációs origó létrejöhet a vektor konstrukciója során exogén eredetű, például SV40 vagy más virális (például Polyoma, Adeno, HSV, BPV, CMV) forrás beépítésével, vagy a gazdasejt kromoszomális replikációs mechanizmusa is szolgáltathatja. Ha a vektor beépül a gazdasejt kromoszómájába, ez utóbbi gyakran elégséges.
13. Nukleinsavhibridizálás szerinproteázt, ICP35 fehérjéket, vagy ezek biológiailag funkcionálisan egyenértékű változatait kódoló szekvenciák detektálására
A találmány által nyújtott nukleinsav-szekvencia-információ lehetővé teszi viszonylag rövid DNS- (vagy RNS-) szekvenciák preparálását, amelyek specifikusan hibridizálnak legalább a proteázok proteolitikus doménjét vagy az ICP35 fehérjék hasítási helyét kódolni képes génszekvenciákkal. E tekintetben megfelelő hosszúságú nukleinsavpróbákat hozunk létre az 1. ábrán látható szekvenciák figyelembe vételével. Ilyen nukleinsavpróbák specifikus hibridizálási képessége proteázhoz vagy ICP35 génszekvenciákhoz különös fontosságot kölcsönöz számos kiviteli mód során. A leglényegesebb, hogy a próbák felhasználhatók számos vizsgálat során adott mintában komplementer szekvenciák jelenlétének detektálására. Más felhasználás is elképzelhető, többek között a szekvenciainformáció felhasználása mutáns faj primer, vagy más genetikai konstrukció előállításához használt primer preparálásához.
A találmány előnyeinek bemutatásaképpen elmondható, hogy a hibridizációs esszék vagy vizsgálatok céljára előnyös nukleinsav-szekvencia hordozza az 1. ábrán bemutatott szekvenciának legalább 14 bázis nukleotidszakasszal komplementer szakaszait. A legalább 14 nukIeotidnyi méret biztosítja, hogy a szakasz elegendő hoszszúságú legyen stabil és szelektív duplex molekula létrehozásához. Ilyen szakaszok könnyen előállíthatok például kémiai módszerekkel történő közvetlen szintézis révén, nukleinsav-reprodukciós technológia segítségével, mint például az US 4,603,102 számú szabadalmi leírás PCR módszere, vagy a kiválasztott szekvenciák rekombináns vektorokba történő beépítésével rekombinánsok előállítására. 18-25, vagy akár 30-40 bázisnyi szakaszoktól kezdve egészen teljes gént vagy géneket kódolni képes nagyságú szakaszok mind a találmány alkalmazási területébe tartoznak.
Ennek megfelelően a találmány nukleotidszekvenciáinak fontos képessége, hogy szelektíven képesek duplex molekulát létrehozni a gén komplementer szakaszaival. A felhasználás módjától függően különböző hibridizációs körülményeket alkalmazhatunk, amellyel elérhetjük a próba különböző mértékű szelektivitását a célszekvencia iránt. Nagymértékű szelektivitást kívánó alkalmazás esetén viszonylag szigorú feltételeket teremthetünk a hibridek létrehozására, például viszonylag alacsony sókoncentráció és/vagy magas hőmérséklet választásával, mint például 0,02-0,15M NaCl és 50-70 °C. Ezek a körülmények különösen szelektívek, és kevés vagy semmilyen illeszkedési hibát (mismatch) nem tolerálnak a próba és a templát vagy cél nukleinsav között.
Természetesen néhány alkalmazás során, mint például az alapul szolgáló templáthoz hibridizált mutáns primer szál segítségével történő mutáns előállításhoz vagy rokon fajokból proteáz, illetve ICP35 kódoló szekvenciák, vagy funkcionálisan egyenértékű változataik izolálása során kevésbé szigorú feltételek szükségesek a heterodupíex kialakulásához. Ezekben az esetekben a használt körülmények lehetnek például 0,15-0,9M só, 20-55 °C hőmérséklet. A kereszthibridizáló molekulák ily módon könnyen azonosíthatók, mint a kontrollhibridizációhoz viszonyítva pozitívan hibridizáló jelek. Mindenesetre általánosan elfogadott, hogy a feltételek szigorúbbá tétele történhet formamid növekvő mennyiségének hozzáadásával, s ez a hibrid duplexet hasonló módon destabilizálja, mint az emelkedő hőmérséklet. Vagyis a hibridizáció körülményei könnyen manipulálhatók, és általában a kívánt eredmények függvényében a módszer kiválasztásán múlik.
Bizonyos esetekben előnyös a találmányban leírt nukleinsav-szekvenciákat más, alkalmas eszközökkel kombinálva használni, mint például jelöléssel a hibridizáció meghatározására. A szakmában a megfelelő indikátorok széles választéka ismert, többek között radioaktív, enzimatikus vagy más ligandumok, például az avidin/biotin, amely képes detektálható jelet adni. Diagnosztikai alkalmazás során előnyös enzimjelölést, pél26
HU 216 622 Β dául ureázt, alkalikus foszfatázt vagy peroxidázt alkalmazni radioaktív, vagy egyéb környezetet károsító reagens helyett. Enzimjelölés esetében ismertek kalorimetrikus indikátorszubsztrátok, amelyek használatakor szemmel vagy spektrofotometrikusan észlelhető eredményt kapunk komplementer nukleinsavtartalmú minták specifikus hibridizációja esetén.
Általánosságban elmondható, hogy az itt leírt hibridizációs próbák hasznosak lehetnek, egyrészt mint oldat hibridizációs reagensek, csakúgy, mint szilárd fázisú felhasználás esetén. Szilárd fázist alkalmazó vizsgálatok során a tesztelni kívánt DNS-t (vagy RNS-t) adszorbeáljuk, vagy más módon hozzáerősítjük a kiválasztott mátrixhoz vagy felülethez. Ezt a rögzített, egyszálú nukleinsavat ezután a választott próbákkal specifikus hibridizáció alá vetjük a kívánt körülmények között. A választott körülmények a kívánt egyéni jellegzetességen alapuló adott helyzettől függenek (például a G+C aránytól, a célnukleinsav típusától, a nukleinsavforrástól, a hibridizációs próba nagyságától stb.). A hibridizált felület mosása után, amely a nem specifikusan kötődött próbamolekulák eltávolítására szolgál, a specifikus hibridizáció detektálása, vagy a jelölés segítségével kvantifikálása történik.
Molekulák sejtextraktumban történő detektálásának egy módszere fluoreszcens próba használata. Fluoreszcens próbák jól ismertek a szakmabeliek számára. A módszerre példa fluoreszceinjelölt avidin (Vector Laboratories, Burlingame, Ca) kötése biotinjelölt fehérjéhez. A jel tovább erősíthető.
A találmány előbbi leírása az alkalmazott vagy javasolt kiviteli módok sorozatán keresztül történt, és összefoglalja a találmány gyakorlat számára hasznosítható előnyös módszereit. A szakértő bizonyára értékelni fogja, hogy az egyes példák alapján számos módosítás és változtatás eszközölhető anélkül, hogy a találmány szellemétől és terétől eltávolodnánk. Például a kodonredundancia következtében az alapul szolgáló DNS-szekvenciák megváltoztathatók a fehérjeszekvencia módosítása nélkül. Továbbá, a biológiai funkcionális egyenértékűség figyelembevételével a fehérje szerkezetét is megváltoztathatjuk, és mégis hasznos proteázt vagy antigénszakaszt kapunk. Az ehhez hasonló módosítások mindegyike az igénypontok által meghatározott oltalmi körbe tartozik.
A következő irodalomjegyzéket a hivatkozás révén a leírás részévé tesszük, mivel ezek kiegészítik, magyarázzák, hátterét képezik a találmánynak, vagy az általunk alkalmazott módszertant, technikákat és/vagy anyagokat (készítményeket) ismertetik.
Arsenakis, M., Hubenthal-Voss, J., Campadelli-Fiume, G., Pereira, L., and Roizman, B. (1986), Construction and properties of a cell line constitutively expressing the herpes simplex vírus glycoprotein B dependent on functional a4 protein synthesis. J. Virol., 60:674-682.
Batterson, W. and Roizman, B. (1983), Characterization of the herpes simplex virion-associated factor responsible fór the induction of a genes. 7. Kiró/., 46:371-377.
Braun, D. K.., Pereira, L., Norrild, B., and Roizman, B. (1983), Application of denatured, electrophoretically separated, and immobilized lysates of herpes simplex virus-infected cells fór the detection of monoc lónál antibodies and fór studies of the properties of viral proteins. J. Virol., 46:103-112.
Braun, D. K., Roizman, B., and Pereira, L. (1984), Characterization of post-transnational products of herpes simplex vírus gene 35 proteins binding to the surfaces of full capsids bút nőt empty capsids. J. Virol., 49:142-153.
Chee, M. S., Bankier, A. T., Beck, S. et al. (1990), Current Topics in Microbiology and Immunology. 154:127-169.
Corey, L. and Spear (1986), PG Infections with herpes simplex viruses. N. Engl. J. Med., 314:686-691.
Davison, A. I, and McGeoch, D. J. (1986), Evolutionary comparisons of the S segments in the genomes of herpes simplex vírus type 1 and varicella-zoster vírus. J. Gén. Virol., 67:597-611.
Davison, A. J. and McGeoch, D. J. (1986), J. Gén. Virol., 67:1759-1816.
Ejercito, P. M., Kieff, E. D., and Roizman, B. (1986), Characterization of herpes simplex vírus strains differing in their effect on social behavior of infected cells. J. Gén. Virol., 2:357-364.
Gibson, W., Marcy, A. I., Comolli, J. C., and Lee, J. (1990), Identification of precursor to cytomegalovirus capsid assembly protein and evidence that processing results in loss of its carboxylterminal end. J. Virol., 64:1241-1249.
Gibson, W., and Roizman, B. (1972), Proteins specified by herpes simplex vírus VIII. Charaterization and composition of multiple capsid forms ofsubtypes 1 and 2. J. Virol., 10:1044-1052.
Gibson, W., and Roizman, B. (1974), Protein specified by herpes simplex vírus. Staining and radiolabeling properties of B capsids and virion proteins in polyacrylamide gels. J. Virol., 13:155-165.
Jenkins et al. (1984), Characterization of the mRNAs mapping in the BplW N fragment of the herpes simplex vírus type 2 genome. J. Virol., 52:99-107.
Kraut, J. (1977), AnnualRév. Biochem., 46:331-358. Kristie, T. M., and Roizman, B. (1984), Separation of sequences defining basal expressing ffom those conferring a gene recognition within the regulatory domains of herpes simplex vírus 1 a genes.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:4065-4069.
Kyte, J., etal. (1982), J. Mól. Bioi., 157-105-132. Liu, F., and Roizman, B. (1991a), The promoter, transcriptional unit, and coding sequence of herpes simplex family 35 proteins are contained within and in frame with the UL26 open reading frame. J. Virol., 65:206-212.
Liu, F., and Roizman, B. (1991b), J. Virol., 65:5149-5156.
HU 216 622 Β
McGeoch, D. J., Dalrymple, M. A., Davison, A. J., Dolan, A., Frame, M. C., McNab, D., Perry, L. J., Scott, J. E., and Taylor, P. (1988), The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex vírus type 1. J. Gén. Virol., 69:1531-1574.
Morse, L. S., Pereira, L., Roizman, B. et al. (1978), Preparation of herpes simplex vírus of high titer. J. Virol., 2:83-84.
Neurath, H. (1983), Science, 224:350-357. Newcomb, W. W., and Brown, J. C. (1991), Structure of the herpes simplex vírus capsid effects of extraction with guanidine hydrochloride and partial reconstitution of extracted capsids. J. Virol., 65:613-620.
Newcomb, W. W., Brown, J. C., Booy, F. P., and Steven, A. C. (1989), Nucleocapsid mass and capsomere protein stoichiometry in equine herpes vírus 1: scanning transmission electron microscopic study. J. Virol., 63:3777-3783.
Post, L. E., Mackem, S., and Roizman, B. (1981), The regulation of a genes of herpes simplex vírus: expression of chimeric genes produced by fusion of thymidine kinase with a gene promoters.Ce//, 24:555-565.
Preston, V. G., Coates, J. A. V., and Rixon, F. J. (1983), Identification and characterization of a herpes simplex vírus gene product required fór encapsodation of vírus DNA. J. Virol., 45:1056-1064.
Preston, V. G. (1992), Processing of the herpes simplex vírus assembly protein ICP35 near its carboxy terminál end requires the products of the whole of the UL26 reading frame, Virology, 186:87-98.
Robson, L., and Gibson, W. (1989), Primate cytomegalovirus assembly protein: genome localization and nucleotide sequence. J. Virol., 63:669-676.
Roizman, B., and Spear, P. ZG. (1968), Preparation of herpes simplex vírus of high titer. J. Virol., 65:1525-1529.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Moniatis, T. (1989), Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratories.
Schenk, P. et al. (1991), The 45-kilodalton protein of cytomegalovirus (Colbum) B-capsids is an amino-terminal extension form of the assembly protein. J. Virol., 65 :1525-1529.
Skalka, A. M. (1989), Retroviral Proteases: First glimpses at the anatomy of a processing machine. Cell, 58:911-913.
Welch, A. R. et al. (1991), A herpes vírus maturational proteinase, assemblin: Identification of the gene, putative active site domain, and cleavage site. PNAS, 88:10792-10796.

Claims (11)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Vizsgálati eljárás Herpes simplex vírus (HSV) proteáz gátlására képes anyag azonosítására, azzal jellemezve, hogy (i) tisztított HSV proteázt állítunk elő, amelyet az Ul26 gén legalább II. és III. doménje kódol;
    (ii) a proteázhoz egy fehérjeszubsztrátot adunk, amely a proteáz hasítási helyét tartalmazza, a szubsztrát proteolitikus hasítását eredményező körülmények között;
    (iii) a proteázhoz feltételezett inhibitor anyagot adunk; és (iv) meghatározzuk, hogy a fehérjeszubsztrát hasítása bekövetkezett-e.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy II. és III. doménként a 2. számú szekvencia 10-306. maradékaival azonos aminosav-szekvenciát alkalmazunk.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan HSV proteázt alkalmazunk, amelyet a teljes Ul26 gén kódol.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy HSV proteázként egy rekombináns enzimet alkalmazunk.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szubsztrátként a HSV ICP35-öt alkalmazzuk.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (iv) meghatározási lépésben a szubsztrát fragmentumokat elektroforézissel mutatjuk ki.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy az ICP35e és ICP35f szubsztrát fragmentumot mutatjuk ki.
  8. 8. A 4. igénypont szerinti vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) előállítási lépésben (i’) előállítunk egy, az UL26 gént tartalmazó expreszsziós vektort, és (í”) az expressziós vektort a kódoló szekvencia kifejezését lehetővé tévő körülmények között egy megfelelő gazdasejtbe visszük be.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (i” ’) a proteázt kinyerjük a gazdasejtből.
  10. 10. A 8. igénypont szerinti vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy egy eukarióta promoter ellenőrzése alatt álló UL26 gént alkalmazunk.
  11. 11. A 8. igénypont szerinti vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként egy eukarióta gazdasejtet alkalmazunk.
HU9201723A 1991-05-24 1992-05-22 Vizsgálati eljárás Herpes simplex proteázt gátló anyagok meghatározására HU216622B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US70581491A 1991-05-24 1991-05-24
US07/832,855 US5478727A (en) 1991-05-24 1992-02-07 Methods and compositions for the preparation and use of a herpes protease

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9201723D0 HU9201723D0 (en) 1992-08-28
HUT65494A HUT65494A (en) 1994-06-28
HU216622B true HU216622B (hu) 1999-07-28

Family

ID=27107575

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9201723A HU216622B (hu) 1991-05-24 1992-05-22 Vizsgálati eljárás Herpes simplex proteázt gátló anyagok meghatározására

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0514830B1 (hu)
JP (1) JP3355202B2 (hu)
AT (1) ATE192494T1 (hu)
AU (1) AU666305B2 (hu)
CA (1) CA2069460C (hu)
DE (2) DE69230984T4 (hu)
ES (1) ES2145742T3 (hu)
FI (1) FI104427B (hu)
HU (1) HU216622B (hu)
IE (1) IE921656A1 (hu)
IL (1) IL101975A (hu)
NO (1) NO303645B1 (hu)
NZ (1) NZ242739A (hu)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5434074A (en) 1991-07-05 1995-07-18 Gibson; D. Wade Cytomegalovirus proteinase
US6406902B1 (en) 1991-07-05 2002-06-18 Johns Hopkins University Herpes virus proteinase and methods of assaying
US5376633A (en) * 1992-09-30 1994-12-27 Lezdey; John Method for deactivating viruses in blood component containers
CA2164601A1 (en) * 1993-06-08 1994-12-22 Kevin R. Steffy Herpes simplex virus type-2 protease
CN1133594A (zh) * 1993-08-20 1996-10-16 史密丝克莱恩比彻姆公司 单纯性疱疹病毒-2ul26基因，衣壳蛋白，免疫测定和蛋白酶抑制剂
US5506115A (en) * 1994-04-29 1996-04-09 G. D. Searle & Co. Reagent and method for determining activity of herpes protease
WO1995029897A1 (en) * 1994-04-29 1995-11-09 G.D. Searle & Co. METHOD OF USING (H+/K+) ATPase INHIBITORS AS ANTIVIRAL AGENTS
US5486470A (en) * 1994-07-21 1996-01-23 Merck & Co., Inc. Purified herpes simplex virus protease and methods of purification
US5618685A (en) * 1995-04-06 1997-04-08 Merck & Co., Inc. Activation of herpes simplex virus protease by kosmotropes
US5985872A (en) * 1995-05-24 1999-11-16 G.D. Searle & Co. 2-amino-benzoxazinones for the treatment of viral infections
EP0828823A4 (en) * 1995-06-01 1999-02-10 Merck & Co Inc HERPES SIMPLEX TYPE 1 VIRUS PROTEASE MUTANTS AND VECTORS THEREOF
US6083711A (en) * 1996-05-15 2000-07-04 Smithkline Beecham Corporation Proteases compositions capable of binding to said site, and methods of use thereof
US6756207B1 (en) 1997-02-27 2004-06-29 Cellomics, Inc. System for cell-based screening
DE69903337T2 (de) * 1998-10-30 2003-08-21 Cellomics Inc Ein screeningsystem auf zellbasis
AU780116B2 (en) 1999-12-23 2005-03-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of cellular proteases

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3800233A1 (de) * 1988-01-07 1989-07-20 Hans Prof Dr Dr Wolf Methoden fuer die gentechnologische produktion einer rekombinanten, enzymatisch aktiven hiv spezifischen protease und der vorlaeufermolekuele der gruppenspezifischen antigene (gag) und der polymerase (pol) und verwendung dieser produkte in ansaetzen zur testung von hiv-protease spezifischen inhibitoren

Also Published As

Publication number Publication date
JPH05336964A (ja) 1993-12-21
CA2069460C (en) 2002-12-31
EP0514830B1 (en) 2000-05-03
NO922029L (no) 1992-11-25
AU1711292A (en) 1992-11-26
DE69230984D1 (de) 2000-06-08
NO303645B1 (no) 1998-08-10
ES2145742T3 (es) 2000-07-16
AU666305B2 (en) 1996-02-08
EP0514830A3 (en) 1993-06-09
DE69230984T4 (de) 2001-04-05
HUT65494A (en) 1994-06-28
EP0514830A2 (en) 1992-11-25
FI922271A (fi) 1992-11-25
NZ242739A (en) 1994-12-22
DE69230984T2 (de) 2000-11-02
IE921656A1 (en) 1992-12-02
HU9201723D0 (en) 1992-08-28
JP3355202B2 (ja) 2002-12-09
ATE192494T1 (de) 2000-05-15
NO922029D0 (no) 1992-05-22
FI922271A0 (fi) 1992-05-19
IL101975A (en) 1998-08-16
CA2069460A1 (en) 1992-11-25
FI104427B (fi) 2000-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Brideau et al. The Us9 gene product of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus, is a phosphorylated, tail-anchored type II membrane protein
Nixdorf et al. Effects of truncation of the carboxy terminus of pseudorabies virus glycoprotein B on infectivity
Kemble et al. Open reading frame S/L of varicella-zoster virus encodes a cytoplasmic protein expressed in infected cells
HU216622B (hu) Vizsgálati eljárás Herpes simplex proteázt gátló anyagok meghatározására
US5478727A (en) Methods and compositions for the preparation and use of a herpes protease
IE83278B1 (en) Use of a herpes protease
Kaufer et al. The varicella-zoster virus ORFS/L (ORF0) gene is required for efficient viral replication and contains an element involved in DNA cleavage
Cranmer et al. Identification, analysis, and evolutionary relationships of the putative murine cytomegalovirus homologs of the human cytomegalovirus UL82 (pp71) and UL83 (pp65) matrix phosphoproteins
Visalli et al. The HSV-1 UL45 18 kDa gene product is a true late protein and a component of the virion
Person et al. Capsids are formed in a mutant virus blocked at the maturation site of the UL26 and UL26. 5 open reading frames of herpes simplex virus type 1 but are not formed in a null mutant of UL38 (VP19C)
Gredmark et al. A functional ubiquitin-specific protease embedded in the large tegument protein (ORF64) of murine gammaherpesvirus 68 is active during the course of infection
Heineman et al. Role of the varicella-zoster virus gB cytoplasmic domain in gB transport and viral egress
JP2005333990A (ja) ｇｐ３５０／２２０非スプライシング変異体
Ward et al. A novel herpes simplex virus 1 gene, UL43. 5, maps antisense to the UL43 gene and encodes a protein which colocalizes in nuclear structures with capsid proteins
Gong et al. A single point mutation of Ala-25 to Asp in the 14,000-Mr envelope protein of vaccinia virus induces a size change that leads to the small plaque size phenotype of the virus
Huang et al. Characterization and expression of the pseudorabies virus early gene UL54
US20130064844A1 (en) Non-splicing variants of gp350/220
Yao et al. Association of a major transcriptional regulatory protein, ICP4, of herpes simplex virus type 1 with the plasma membrane of virus-infected cells
Gompels et al. Infectivity determinants encoded in a conserved gene block of human herpesvirus-6
Horst et al. Residues required for host shutoff activity are located in the “bridge” of the Epstein-Barr virus protein BGLF5
Lu et al. Identification and Sequence Analysis of the Duck Plague Virus UL46 Gene
Welch Identification and characterization of a herpesvirus proteinase
Gredmark et al. The large tegument protein (ORF64) of the mouse r herpesvirus MHV-68 encodes a functional ubiquitin-specific protease, expressed and active in the course of infection

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees