FI104427B - Menetelmä herpesviruksen proteaasin inhibointiin kykenevän aineen tunnistamiseksi - Google Patents

Menetelmä herpesviruksen proteaasin inhibointiin kykenevän aineen tunnistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI104427B
FI104427B FI922271A FI922271A FI104427B FI 104427 B FI104427 B FI 104427B FI 922271 A FI922271 A FI 922271A FI 922271 A FI922271 A FI 922271A FI 104427 B FI104427 B FI 104427B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
protease
icp35
proteins
hsv
virus
Prior art date
Application number
FI922271A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI922271A (fi
FI922271A0 (fi
Inventor
Fenyong Liu
Bernard Roizman
Original Assignee
Arch Dev Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/832,855 external-priority patent/US5478727A/en
Application filed by Arch Dev Corp filed Critical Arch Dev Corp
Publication of FI922271A0 publication Critical patent/FI922271A0/fi
Publication of FI922271A publication Critical patent/FI922271A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI104427B publication Critical patent/FI104427B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1133—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against herpetoviridae, e.g. HSV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/085—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus, Epstein-Barr virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16641—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16643—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

, 104427
Menetelmä herpesviruksen proteaasin inhibointiin kykenevän aineen tunnistamiseksi
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää herpesvi-5 ruksen proteaasin inhibointiin kykenevän aineen tunnistamiseksi.
' Virusinfektiot aiheuttavat suuria terveysongelmia
Virusinfektioiden hoito ja ehkäisy on tärkeä lääketieteellinen päämäärä. Jotta ymmärrettäisiin tilanne alal-10 la, joka kehittää menetelmiä virusinfektioiden hoitamiseksi ja ehkäisemiseksi, on tärkeää ymmärtää infektoivan viruksen rakenne ja toiminta. Virus on pieni geneettinen elementti, joka sisältää joko yksijuosteisen tai kaksi- f juosteisen DNA:n tai RNA:n ja voi vaihdella kahden erilai-15 sen tilan välillä: solun sisäisen ja solun ulkoisen. Virus on pakollinen solun sisäinen parasiitti, joka ei kykene jakaantumaan itsenäisesti. Itse asiassa virus ottaa haltuunsa isäntäsolun biosynteettisen koneiston ja käyttää ^ sitä viruksen syntetisoimiseen. Jotkin viruksen DNA:n pro-20 teiinituotteet ovat spesifisiä entsyymejä tai inhiboivia ! tekijöitä, jotka pysäyttävät isäntäsolun metabolian, mutta / fc useimpia viruksen koodittamia proteiineja käytetään uusien : : viruspartikkeleiden rakentamiseen. Virus ohjaa proteiini- Γ
synteesiä niin, että se tuottaa sen replikoitumiseen ja ’ 25 esim. kapsidin pakkaukseen tarpeelliset komponentit. Nämä I
komponentit täytyy koota järjestyksessä viruksesta riip- :
puen ja uusien partikkeleiden täytyy päästä ulos solusta, I
jos ne aikovat infektoida muita soluja.
. Solun sisäisen virusreplikaation (lyyttinen sykli) 30 yleiset vaiheet ovat: 1. viruksen kiinnittyminen isäntäsoluun (absorp- : tio) ; 2. viruksen tai sen nukleiinihapon sisäänmeno isän- 1 täsoluun; 35 3. viruksen nukleiinihapon replikoituminen; ^ 104427 2 4. virusproteiinien ja muiden elintärkeiden komponenttien tuotto; 5. viruksen nukleiinihapon ja proteiinikomponent-tien kokoaminen; ja 5 6. kypsien viruspartikkelien vapautuminen isäntäso- lusta.
Lyyttisen syklin lopputuloksena ovat uudet virus-partikkelit ja kuolleet isäntäsolut, koska virus on anastanut itselleen isännän elinvoiman. Tietyissä infektiotyy-10 peissä, kuten siinä, jonka aiheuttaa herpesvirus, voi olla latenttiaika, jolloin virus pesii isäntäsolussa.
Viruksen geneettisten systeemien paljastaminen avaa ; oven tutkimuksille, joissa tutkitaan virusinfektion ja replikaation mekanismia, joilla tutkimuksilla ei ole pel-15 kästään akateemista arvoa vaan joita käytetään virusten aiheuttamien tautien tunnistamiseen, ehkäisyyn ja hoitoon. Isännän vastustuskyky virusinfektiota vastaan voi aiheutua viruksen reseptorikohdan poissaolosta, joka estää viruksen kiinnittymisen isäntäsoluun; viruksen nukleiinihappojen 20 tuhoutumisesta sen jälkeen, kun ne on injektoitu isäntä-soluun, esimerkiksi isäntäsolun entsyymien aiheuttamalla viruksen nukleiinihappojen katkaisulla; elintärkeiden vi-: rusproteiinien synteesien inhibitiosta; tai virusproteii- I :'< nien tuhoutumisesta sen jälkeen kun ne ovat muodostuneet ,’ : 25 isäntäsolussa.
Virusten vastaisten lääkkeiden kehittäminen luonnollisen vastustuskyvyn avuksi on tärkeä kaupallinen tavoite, jonka päämäärä on vastustaa monien virusinfektoiden tuhoisia vaikutuksia ihmisellä. Valitettavasti tänä päi-30 vänä mahdolliset hoidot ovat riittämättömiä useimpien virustyyppien osalta. Esimerkiksi interferonit ovat solussa olevia virusten vastaisia aineita, matalan molekyylipainon omaavia proteiineja, jotka estävät viruksen jakaantumisen. Interferoneilla on kuitenkin tapana olla isäntäspesifisiä, 35 eivät virusspesifisiä, eikä niillä ole mitään vaikutusta i Ί 3 104427 jo infektoituneisiin isäntäsoluihin. Ne voivat myös olla toksisia korkeissa konsentraatioissa.
Virusten vastaisten lääkkeiden kohteena voivat olla entsyymit, jotka ovat erittäin spesifisiä virukselle. Esi-5 merkiksi pääasiallinen kohde HIV-infektioihin, jotka aiheuttavat AIDS:in, vaikuttamiseksi on käänteistranskrip-* taasientsyymi. Tämän entsyymin inhiboiminen estää viruk- j sen replikaation. Valitettavasti näitä lääkkeitä, esim.
AZT:tä, vastaan kehittyy vastustuskyky ja se on sellaisen 10 hoidon pääasiallinen rajoittava tekijä. Tällä hetkellä markkinoilla olevat herpes simplex -viruksen vastaiset lääkkeet on ohjattu sellaisia entsyymejä vastaan, jotka syntetisoivat viruksen DNA:ta (esim. asyklovir). Koska näitä lääkkeitä vastaan syntyy vastustuskykyä, uusien koh-15 teiden löytämiseen on olemassa melkoinen mielenkiinto.
Virusproteiinien tuotto on erikoisen mielenkiintoinen vaiheena, jossa virukseen voidaan vaikuttaa. Solun ulkoisessa tai infektoivassa vaiheessa virusten perusrakenne sisältää nukleiinihappoytimen, jota ympäröi proteii-20 nit (nukleokapsidi). Joillain viruksilla on myös vaippa, joka sijaitsee nukleokapsidin ulkopuolella ja sisältää lipidejä ja proteiinia. Proteiinikuorta kutsutaan kapsi-diksi. Kapsidin voi muodostaa monenlaiset erilaiset pro- ; teiinit viruksesta riippuen. Jotkin virukset koodittavat 3 :’ .j 25 - 10 proteiinia, toiset useampaa kuin 200. Viruspartikke- :’· : leita kutsutaan virioneiksi; niiden tehtävä on suojata " viruksen nukleiinihappoa silloin, kun se siirretään solusta, jossa se on replikoitunut, uuteen isäntäsoluun. Isän-Λ täsoluihin siirron jälkeen alkaa viruksen solun sisäinen 30 vaihe ja viruksen replikaatio tulee mahdolliseksi. Monet muut kuin herpesvirukset tuntuvat ekspressoivan proteaa- : ψ .........- ....... __ se ja, joilla on sellainen katkaisukohtaspesifisyys, jota mahdollisesti voidaan käyttää terapeuttisiin tarkoituk- _ siin. Mitään sellaista proteaasia ei ole kuitenkaan aiem- l 35 min tunnistettu herpesviruksella, joka on erikoisen laa- a 104427 4 jalle levinnyt infektoija, jolle hoito- ja ehkäisymenetelmät ovat suurimmaksi osaksi riittämättömiä.
Herpesryhmä
Herpesvirusten ryhmä sisältää suuren kliinisen mie-5 lenkiinnon kohteena olevia eläinviruksia, koska ne aiheuttavat monia tauteja. Epstein-Barr-viruksen on osoitettu ottavan osaa syövän aloitukseen; sytomegalovirus on suurin infektiouhka AIDS-potilaille ja Varicella-Zoster-virus on suurena huolenaiheena tietyissä osissa maapalloa, joissa 10 vesirokko ja vyöruusu ovat vakavia terveysongelmia. Viimeisen vuosikymmenen aikana on tapahtunut maailmanlaajuinen kohoaminen sukupuoliteitse leviävien herpes simplex (HSV) -virusinfektioiden määrässä, johon on liittynyt ko- hoaminen vastasyntyneiden herpesvirusinfektioissa. Kontak- 15 ti aktiivisia haavaisia vaurioita omaavien tai oireettomasti erittävien potilaiden kanssa voi johtaa infektoivan aineen siirtymiseen. Siirtyminen tapahtuu altistettaessa limakalvojen pinnat ja hiertynyt iho virukselle, joka sallii viruksen sisääntulon ja viruksen replikaation alkami-20 sen orvaskeden ja ihon soluissa. Kliinisesti selvien vaurioiden lisäksi voi olla olemassa latentteja infektioita, erikoisesti hermosoluissa. Erilaiset stimulaatiot voivat aiheuttaa HSV-infektion uudelleenaktivoitumisen. Sen mukaisesti tämä on vaikea infektio hävitettäväksi. Tämä vit-: 25 saus on suurelta osin levinnyt pidäkkeettömästi johtuen riittämättömistä hoitomodaliteeteista.
Herpes simplex -virus (HSV)
Herpes simplex -viruksen alatyypit 1 ja 2 (HSV-1, HSV-2) ovat herpesviruksia, jotka kuuluvat yleisimpien 30 ihmistä infektoivien aineiden joukkoon (Corey ja Spear, 1986; Whitley, 1990). Nämä virukset voivat aiheuttaa laajan kirjon erilaisia tauteja, jotka ulottuvat suhteellisen merkityksettömistä ja kiusallisista infektioista, kuten uusiutuva herpes simplex -viruksen aiheuttama yskänrokko, 35 vakaviin ja hengenvaarallisiin tauteihin, kuten vanhempien , 104427
D
lasten ja aikuisten herpes simplex -viruksen aiheuttama aivokalvontulehdus (HSE) tai vastasyntyneiden hajapesäk-keiset infektiot. Herpesinfektioiden kliininen tulos riippuu aikaisesta diagnoosista ja viruksen vastaisen terapian 5 pikaisesta aloituksesta. Kuitenkin, huolimatta joistain onnistuneista terapioista, ihon ja orvaskeden vauriot uu- j siutuvat ja vastasyntyneiden HSV-infektioihin ja aivoin- ! fektioihin liittyy korkea sairaalloisuus ja kuolleisuus.
Aikaisempi diagnostisointi kuin on mahdollista tällä het-10 kellä parantaisi hoidon onnistumista. Lisäksi kehittyneempiä hoitoja tarvitaan epätoivoisesti.
Infektoiduille soluille on annettu ulkopuolista apua erikoisesti kemikaalien muodossa. Esimerkiksi herpesviruksen replikaation kemiallinen inhibitio saadaan aikaan 15 erilaisilla nukleosidianalogeilla, kuten 5-fluorideoksi- uridiinilla (FUDR), 5-jodideoksiuridiinilla, tymiiniara- binosidilla ja niiden kaltaisilla.
Jonkin verran suojaa on saatu koe-eläinmalleissa polyspesifisillä tai monospesifisillä anti-HSV-vasta-ai-20 neilla, HSV-esikäsitellyillä lymfosyyteillä ja kloonatuilla T-soluilla, jotka on tehty spesifisiä virusantigeeneja 1 vastaan (Corey ja Spear, 1986). Kuitenkaan mitään tyydyttävää hoitoa ei ole löydetty.
Herpesviruksilla ei ole tunnistettu proteaaseja, : 25 mutta on olemassa jonkin verran tietoa herpesvirusryhmän ^ biologiasta. Herpesvirukset ovat kaksijuosteista DNA:ta 7 sisältäviä viruksia, jotka replikoituvat isäntäsolun tu- : massa. Herpesvirioni koostuu useammasta kuin 30 erilaises- ~ ta proteiinista, jotka kootaan isäntäsolun sisällä. Noin “ 30 6-8 käytetään kapsidissa. Herpesvirusten mieluisia isän- : täsoluja ovat selkärankaisten solut.
Herpes simplex -virus l:n (HSV-1) genomi koodittaa " runsasta kapsidiproteiinikompleksia, joka denaturoivissa ΐ
geeleissä muodostaa useita rintamia johtuen komponentti- T
35 proteiinien erilaisista molekyylipainoista. Näiden pro- | * 104427 teiinien joitain alustavia tunnistuksia on julkaistu. Herpes simplex -virus l:n (HSV-1) kapsidiproteiinien ryhmän julkaisi Gibson ja Roizman (1972, 1974). Geneettisesti ja immunologisesti toisilleen sukua olevien viruskapsidipro-5 teiinien ryhmä, joka tunnistetaan niiden denaturoivissa geeleissä kulkemien rintamien perusteella, on nimetty infektoidun solun proteiineiksi 35 (ICP35) (Braun et ai., 1983, 1984) . Ainakin neljä pääasiallista ja useita vähäisempiä rintamia yksisuuntaisissa denaturoivissa polyakryy-10 liamidigeeleissä ja useita täpliä kaksisuuntaisissa gee-! leissä on julkaistu.
Braun et ai. (1984) julkaisi käyttäen monoklonaa-listen vasta-aineiden ryhmää, joista esimerkkinä on käytetty vasta-ainetta H745, että ICP35-proteiinit prosessoi-15 daan translaation jälkeen ainakin 6 lajiksi (ICP35a, b, c, d, e, f), jotka eroavat elektroforeettiselta liikkuvuudeltaan SDS-polyakryyliamidigeeleissä. Erilaisesta molekyyli-painosta huolimatta tämän viruspolypeptidien ryhmän tunnistavat samat monoklonaaliset vasta-aineet ja niitä koo-20 dittaa HSV-1-viruksen genomissa oleva alue. Tyhjät kapsi-dit eivät sisällä näitä polypeptidejä. Ryhmän proteiineja, jotka mahdollisesti ovat analogisia ICP35-ryhmälle, julkaisi Preston et ai. (1983).
HSV-1-viruksen genomi on sekvenssoitu ja on tehty : 25 yrityksiä, yleensä epäonnistuneita, korreloida eri kapsi- diproteiineja genomin sekvensseihin. On ehdotettu esimerkiksi, että ICP35-proteiinit kooditetaan avoimesta luku-kehyksestä, joka on nimeltään UL26 (McGeoch et ai., 1988) . Esillä olevassa keksinnössä osoitetaan, että tämä ennustus 30 oli väärä tai ainakin epätäydellinen. ICP35-ryhmää koodattavan alueen raakakartoitusta yrittivät Braun et ai.
(1984) analysoiden välityypin HSV-1 x HSV-2 -rekombinant-i teja. Nämä julkaisijat ehdottivat, että ICP35-ryhmää koo- dittaa alue, joka sijaitsee sellaisten geenien välissä, 35 jotka koodittavat tymidiinikinaasia (UL23) ja glykoproteii- 1 11 104427 ni B:tä (Ul27) . Tämä ei ole kovin spesifinen ennuste, koska se kattaa alueen, jonka nyt tiedetään sisältävän neljä geeniä.
Esillä oleva keksintö syntyi onnistuneesta tera-5 piaan tarkoitetun uuden viruskohteen etsimisestä. Tutkimus alkoi valitsemalla HSV-1-viruksen ICP35-proteiiniryhmä substraatiksi. Proteaasikohde viruksen vastaista kemote-
S
rapiaa varten, erikoisesti sovellettuna herpesvirusinfek- ! tioihin, tunnistettiin tällä tavalla. Menetelmät pro-10 teaasi-inhibiittorien tunnistamiseksi ovat esillä olevan keksinnön kohteena. HSV-1-viruksen herpesviruksen prote-aasigeenin ja ihmisen sytomegaloviruksen proteaasigeenin samankaltaisuuden havaitseminen osoittaa, että esillä oleva keksintö on laajasti sovellettavissa kaikkiin herpesvi-15 ruksiin sisältäen HSV:n, CMV:n, EBV:n ja VZV:n.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti proteaasit voidaan edelleen määrittää seriiniproteaaseiksi, joilla on tämän proteaasiluokan odotetut ominaisuudet. Seriiniprote-aasi on entsyymi, joka katalysoi peptidisidosten hydrolyy-20 siä ja tyypillisesti aktiivisessa kohdassa on seriini (White, Handler ja Smith, 1973). Seriiniproteaaseilla on : myös tyypillisesti kolme katalyyttistä ryhmää, jotka jo- : tenkin erotetaan toisistaan aminohappojen lineaarisessa rakenteessa, mutta tuodaan yhteen "proteolyyttiseksi hal-: 25 keamaksi" oikein laskostuneessa proteaasissa. Vaihtelevia eroja tässä katalyyttisessä kolmikossa on havaittu prote- i aasista toiseen. Esimerkiksi trypsiini- ja subti- l
lisiiniseriiniproteaaseissa Asp, His ja Ser ovat katalyyt- L
tisen kolmikon aminohapot. Trypsiinin kaltaisissa se- = 30 riiniproteaaseissa ne ovat kuitenkin järjestyneet ryhmäksi
His, Asp, Ser, kun taas subtilisiinin kaltaisissa prote- i; aaseissa ne ovat järjestyneet ryhmäksi Asp, His, Ser. Näiden avainryhmien suhteellisessa tilankäytössä on myös ero- : ja. Lisäksi näillä proteaaseilla on myös muita evolutio-35 naalisesti säilyneitä ominaisuuksia, jotka sallivat niiden ΐ 104427 tunnistuksen seriiniproteaaseiksi ja sen jälkeisen luokituksen. Katalyyttisesti tärkeiden Asp-, His- ja Ser-ryhmien läsnäolo on kuitenkin tärkein kriteeri seriinipro-teaasien jäsenyyteen ja luokitukseen.
5 Proteaasit tuntuvat olevan elintärkeitä viruksen kapsidin muodostukselle. Sen mukaisesti proteaasitoiminnan inhiboiminen johtaa viruksen lyyttisen syklin keskeytymiseen. Sellaiset proteaasit ovat ilmiselvästi optimaalisia kohteita viruksen vastaiselle terapialle. Kohde on erikoi-10 sen käyttökelpoinen herpesvirusta vastaan, jolle mitään proteaaseja ei ole tähän mennessä julkaistu. Esillä olevassa julkaisussa kuvataan herpesviruksen seriiniprote-aasien tunnistusta, puhdistusta ja manipulaatiota ja pro-teaasi-inhibiittorien käyttöä herpesinfektioiden tunnis-. 15 tukseen ja hoitoon.
Kuvaavassa suoritustavassa proteaasi on puhdistettu HSV-1-viruksesta, joka on herpes simplex -viruksen alatyyppi. Tämän proteaasin havaittava molekyylipaino SDS-polyakryyliamidi-PAGE-geelielektroforeesilla määritettynä « 20 on noin 75 - 85 kd, yleisemmin noin 80 kd. Herpesviruksen proteaasin karakterisoidaan edelleen sisältävän noin 450 -635 aminohapon pituisen aminohapposekvenssin. Nämä rajat . ovat kuitenkin joustavia. Esimerkiksi 635 aminohapon pi- = tuisesta sekvenssistä voidaan poistaa ainakin 329 amino- 25 happoa sen karboksyylipäästä ja yhä säilyttää sen seriini-proteaasiaktiivisuus. 635 aminohapon suoritustavassa proteaasin katkaisukohta sijaitsee kohdassa, joka on noin 18 - 25 aminohappoa karboksyylipäästä, suositeltavasti noin 20 aminohapon päässä karboksyylipäästä. Proteaasit 30 saadaan joko soluista, joihin on injektoitu HSV-1 ja 2- virukset, soluista, jotka on transfektoitu proteaasia koo-dittavalla DNA-sekvenssillä tai puhdistetussa muodossa a syntetisoituna ia vitro tai soluvapaissa systeemeissä käyttäen esimerkiksi kanin retikulosyyttilysaattia. Pro-35 teiinin synteesin jälkeen proteiini kulkee yksittäisenä =1 9 104427 rintamana denaturoivassa geelissä ja tunnistetaan helposti 35S-leimatulla metioniinilla. Noin viiden tunnin proteiinisynteesin jälkeen tuloksena on kaksi rintamaa. Kuten seuraavissa osissa on esitetty, toinen rintama on ensim-5 mäisen rintaman itsekatkaisutuote.
Tämän proteaasin ominaisuudet sisältävät: (i) se sisältää neljä domeenia, joista useita ei tarvita sen katalyyttiseen aktiivisuuteen, ja (ii) aktiivinen kohta on lähellä proteaasin aminopäätä. Mutaatiot, jotka aiheut-io tavat aminohapposubstituutioita, -deleetioita, lopetus- kodonin tai 20 aminohappojakson insertioita proteaasiin, 1 ovat rajanneet poistettavissa olevat domeenit I ja IV geenin amino- ja karboksyylidomeeneissa. Elintärkeä karbok-syylipään lähellä oleva domeeni III voidaan erottaa elin-15 tärkeästä aminopään lähellä olevasta domeenista II ainakin 20 aminohapolla ja proteaasi pysyy toimivana.
Aminopään lähellä oleva domeeni on konservoitunein alue Varizella zoster -viruksen ja ihmisen sytomegalovi- L
ruksen UL26 homologien joukossa. Konservoituneiden aspara-20 giinihappo-, histidiini- tai seriiniaminohappokodonien ; joukossa, jotka on testattu tässä domeenissa, ainoastaan :
histidiiniryhmiä 61 ja 148 ei voida korvata, ilman että häiritään proteaasin proteolyyttistä aktiivisuutta. Kolmiulotteiset kiderakenneanalyysit voivat tuoda lisävaloa T
25 aktiivisten kohtien rakenteeseen (Skalka, 1989). 1
Kuvataan myös nukleiinihapposekvenssejä, jotka ky- = kenevät koodittamaan tässä kuvattuja herpesviruksen prote-aaseja. Kuvaavassa suoritustavassa laajat HSV-1-viruksen f genomin nukleiinihapposekvenssien manipulaatiot ovat pal-30 jastaneet virusmekanismien salat ja sallineet käyttökel-’·' poisten nukleiinihappoalueiden ja niiden ekspressiotuot-
* Z
teiden eristyksen ja puhdistuksen. Esimerkit sellaisista manipulaatiosta sisältävät valikoitujen nukleiinihapposek- “ venssialueiden liittämisen sopivien promoottoreiden ja 35 merkkiaineiden kanssa plasmideihin geneettisten alueiden " 104427 toimintojen ja interaktioiden, niiden ekspressiotuotteiden ja niiden ekspressiosäätelymekanismien määrittämiseksi.
Esitetään myös sellainen nukleiinihappoalueen do-meeni, joka koodittaa herpes simplex -virus l:n kapsidi- * 5 proteiinien ryhmää, joka ryhmä tunnetaan nimellä ICP35.
Tämä äskettäin määritelty koodittava alue on nimeltään UL26.5. ICP35-proteiinien koodattavan alueen kuvaavassa suoritustavassa alue on rajattu restriktioendonukleaasien Hpal- ja Pstl-katkaisukohdilla. Nämä kaksi katkaisukohtaa 10 sijaitsevat karttakohdilla +832 ja +2 761. Nämä karttakoh-dat määritetään etäisyyksiksi HSV-1-viruksen genomin avoimen lukukehyksen UL26 transkription aloituskohdasta. Tämä kohta on +1. ICP35-proteiineja koodittava geeni sisältää myös ne sekvenssit, jotka ovat alavirtaan Kpnl-kohdasta, 15 joka on karttakohdassa +2 104 ja jatkuu aina poly A -kohtaan kohdassa +2 138.
Nukleiinihappoalueet kuvataan edelleen niin, että niillä on päällekkäin menevät avoimet lukukehykset prote-aasille ja ICP35-proteiineille (kuvio 2). Nämä päällekkäin 20 menevät alueet sijaitsevat 3'-päässä. Ensimmäinen alue, pidempi kahdesta, koodittaa ensimmäistä proteiinia. Tämän ensimmäisen proteiinin molekyylipaino on noin 75 - 85 kd.
Toinen avoin lukukehys, pienempi kahdesta päällekkäin menevästä avoimesta lukukehyssekvenssistä, koodittaa toista : 25 proteiinia, jonka havaittava molekyylipaino on noin 40 - 55 kd SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla määritettynä, suositeltavasti 45 kd. Ensimmäisen proteiinin määritellään koodittavan proteolyyttistä moduulia, joka kykenee katkaisemaan aminohapposekvenssin seriiniproteaasille tyy-30 pillisellä tavalla. Substraatti, joka kyetään katkaisemaan, voi olla joko itse proteaasin sekvenssi, jota koodittaa UL26-geeni, tai ICP35-esiasteproteiinit, joita aiemmin on nimitetty ICD35 c- ja d-proteiineiksi perustuen ; niiden liikkuvuuteen yksi- ja kaksisuuntaisissa geeleissä.
.104427 20 aminohapon pituisen epitoopin insertio ei estä katkaisua.
Nukleiinihappoalue, joko DNA tai RNA, joka koodit-taa toista proteiinia, sisältää noin 990 emäsparia HSV-1-5 sovellutuksessa. Tietyissä sovellutuksissa koodittavan alueen tarvitsee sisältää ainoastaan sekvenssit, jotka katkaisussa muodostavat ICP35 e- ja f-proteiinit. Toisissa sovellutuksissa halutaan koodittaa ainoastaan katkaisukoh-taa per se. kuten keksinnön mukaisessa inhibiittorikandi-10 daattitestissä. Esimerkkinä olevassa suoritustavassa nukleiinihappoalue sisältää ne alueet tai niiden toiminnalliset ekvivalentit, jotka on kuvattu esillä olevan patenttihakemuksen kuvion IA rivillä 5.
Tässä käytettynä toiminnallisten ekvivalenttien 15 tarkoitetaan viittaavan niihin entsyymeihin ja niitä koo-dittaviin nukleiinihapposekvensseihin, joihin on tehty tiettyjä rakenteellisia muutoksia, mutta jotka kuitenkin ovat tai koodittavat katalyyttisesti aktiivisia proteaase-ja, jotka kykenevät katkaisemaan ICP35-proteiineja. Alalla 20 tunnetaan yleisesti, että proteiinirakenteisiin voidaan tehdä modifikaatioita ja/tai muutoksia ja silti saada molekyyli, jolla on samanlaiset tai muutoin toivottavat ominaisuudet. Näin ollen tiettyjä aminohappoja voidaan subs- Γ tituoida toisilla aminohapoilla proteiinirakenteessa, il-: 25 man että tapahtuu merkittävää interaktiivisen sitoutumis- " kapasiteetin häviämistä esimerkiksi substraattimolekyylei-hin tai spesifisiin vasta-aineisiin. Koska proteiinin in- ; teraktiivinen kapasiteetti ja luonne määrittää proteiinin · biologisen toiminta-aktiivisuuden, tiettyjä aminohapposek-30 venssisubstituutioita voidaan tehdä proteiinisekvenssiin ;
(tai tietysti sitä koodittavaan DNA-sekvenssiin) ja silti I
saada proteiini, jolla on samanlaiset ominaisuudet. Sen vuoksi keksijät ovat ajatelleet, että erilaisia muutoksia voidaan tehdä herpesviruksen proteaasin DNA- tai proteii- ” 35 nisekvensseihin, ilman että tapahtuu merkittäviä häviämi- : 12 104427 siä niiden biologisessa käytettävyydessä tai aktiivisuudessa .
Tehtäessä sellaisia muutoksia aminohappojen hydro-paattisuusindeksi voidaan ottaa huomioon. Hydropaattisen *r 5 aminohappoindeksin, se on hydrofobisuus- ja varausominai-suudet, tärkeys proteiinin interaktiivisen biologisen toiminnan aikaansaamisessa on yleisesti ymmärretty alalla (Kyte et ai., 1982). Tiedetään esimerkiksi, että tietyt aminohapot voidaan substituoida toisilla aminohapoilla, 10 joilla on verrannollinen hydropaattisuusindeksi tai pisteytys, esimerkiksi yleensä ±1, ja silti säilyttää samanlainen biologinen aktiivisuus. Aminohapon suhteellisen hydropaattisuusominaisuuden uskotaan määrittävän tuloksena j syntyvän proteiinin sekundaarirakenteen, joka puolestaan 15 määrittää proteiinin interaktion substraattimolekyylien kanssa. Näin ollen on esimerkiksi ehdotettu, että isoleu-siini, jonka hydropaattisuusindeksi on +4,5, voidaan substituoida valiinilla (+4,2) tai leusiinilla (+3,8), ja silti saada aikaan proteiini, jolla on samanlainen biologinen 20 aktiivisuus. Vaihtoehtoisesti skaalan toisessa päässä on ehdotettu, että lysiini (-3,9) voidaan substituoida argi-niinilla (-4,5) ja niin edelleen.
Aminohapposubstituutiot perustuvat näin ollen yleensä sivuketjusubstituenttien suhteelliseen samankal-' 25 taisuuteen, esimerkiksi kokoon, elektrofiiliseen ominai suuteen, varaukseen ja niiden kaltaisiin. Esimerkkinä olevat substituutiot, jotka ottavat huomioon edellä esitetyt eri ominaisuudet, on hyvin tunnettu alan asiantuntijoiden keskuudessa ja sisältävät esimerkiksi: alaniinin, glysii-30 nin ja seriinin; arginiinin ja lysiinin; glutamiinihapon ja asparagiinihapon; seriinin ja treoniinin; ja valiinin, * * leusiinin ja isoleusiinin.
Tässä kuvatut nukleiinihapposekvenssit ovat myös käyttökelpoisia hybridisaatiokoettimina, joilla puolestaan 35 on useita sovellutuksia. Hybridisaatiokoettimia voidaan 13 104427 käyttää esimerkiksi mutanttigeenikloonien valitsemisessa kirjastoista, antisense-molekyylien valmistuksessa (esim. stabiloidut antisense-RNA-molekyylit), PCR-alukkeina ja -koettimina, tässä mainittuna ainoastaan muutama niistä 5 monista sovellutuksista, jotka sisältävät hybridisaation proteiinia koodittavaan kapasiteettiin sovellettuna (tai 1 lisättynä). Käyttökelpoiset hybridisaatiokoettimet voidaan tietysti valmistaa minkä pituisina tahansa riippuen aio- ; tusta sovellutuksesta ja hybridisaatio-olosuhteista. Esi-10 merkiksi niinkin pienten koettimien kuin 10 - 14 nukleotidin pituisten voidaan kuitenkin odottaa muodostavan stabiilin hybridin templaattimolekyylin kanssa niin kauan, kun hybridisaatio-olosuhteet ovat sopivia sekvenssihomolo-giatason suhteen koettimen ja templaatin välillä. Samalla 15 tavalla molekyylit, jotka vaihtelevat pituudeltaan jopa sellaiseen, joka kykenee koodittamaan geeniä tai jopa useita geenejä, voidaan käyttää hybridisaatiokoettimina. :
Kaikissa tapauksissa suositeltavissa suoritusta- 1 voissa hybridisaatiokoettimina tai alukkeina käytettävät 20 nukleiinihappomolekyylit voivat vaihdella kooltaan esim.
10 - 14 nukleotidista 20 nukleotidiin, 30, 40 tai 50 tai suunnilleen sellaisesta nukleotidista aina 100, 200, 500 L
tai jopa 1 000 tai 2 000 nukleotidiin riippuen aiotusta Γ sovellutuksesta ja hybridisaatio-olosuhteista.
:- 25 Näin ollen nukleiinihappoalueet voivat sisältää sekvenssin, joka on joko pienempi tai suurempi kuin ne, “ jotka on kuvattu kuviossa 1, se voi olla esimerkiksi noin 14 nukleotidin pituinen alue, joka kykenee hybridisoitu-maan kuvion 1 nukleiinihappoalueille tiukoissa olosuhteis- 1
30 sa. Pieniä fragmentteja, kuten tämä on, voidaan käyttää I
·' koettimina tunnistettaessa proteaasia koodittavan alueen Γ läsnäolo.
Nukleiinihappoalue voi olla myös mRNA-sekvenssi proteaasille tai ICP35-proteiineille. Jälkimmäisen mRNA Γ 35 transkriptoidaan nukleotidikohdasta, joka on suunnilleen 14 104427 +1 000 (merkittynä etäisyytenä herpesviruksen UL26:n transkription aloituskohdasta, jota merkitään +1) - +2 138.
mRNA transloidaan metioniinin aloituskodonista, joka sijaitsee kohdassa +1 099. Pienempiä ja suurempia alueita on f 5 myös ajateltu riippuen käytöstä, johon alue on tarkoitettu. Nämä mRNA-alueet ovat käyttökelpoisia syntetisoitaessa ICP35-proteiinin katkaisukohta.
Herpesviruksen genomin eri nukleiinihappoalueet on eristetty ja kloonattu. Nukleiinihappoalue, joka koodittaa 10 herpesviruksen proteaasia, voidaan saada herpesviruksen genomista alueelta, joka vastaa herpesviruksen avoimen lukukehyksen UL26 karttakohtia. Pienempi alue proteaasia koodittavan alueen sisällä on tymidiinikinaasigeenin ja glykoproteiini gB -geenin välissä ja sisältää DNA-sekvens-. 15 sin kohdasta +832 kohtaan +2 138. Tämä koodittava sekvens si ei ainoastaan ekspressoi herpesviruksen ICP35-kapsidi-proteiinien ryhmää, vaan sisältää myös promoottorisekvens-sin, joka säätelee ICP35-proteiinia koodittavaa sekvenssiä .
- 20 ICP35-promoottori on eristetty ja sen on osoitettu olevan erittäin aktiivinen promoottori, jonka todistaa . havainto, että ICP35-proteiinia koodittava yksikkö tuottaa kohonneen määrän substraattikopioita verrattuna proteaasin tuottoon pidemmästä UL26:n avoimesta lukukehyksestä. Se si-:- ‘ 25 sältää 135 - 168 emäsparia ja sijaitsee karttakohdilla j +832 ja +1 000 UL26:n ensimmäisessä avoimessa lukukehyk- : sessä. Tämä promoottorialue kykenee aloittamaan ICP35-pro- teiinien ekspression. Se on myös käyttökelpoinen ohjaamaan muiden nukleiinihapposekvenssien, esimerkiksi herpes simp-30 lex -geenien Us5 ja UL10, ekspressiota kohonneella nopeu-della.
• * 8 ICP35-proteiineja koodittavan sekvenssin eristys ja manipulointi on tärkeä saavutus, koska näitä proteiineja käytetään herpesviruksen kapsidin rakennuksessa. Tullak-35 seen kapsidin toimiviksi jäseniksi ICP35-proteiinin esias- j 15 104427 teiden ICP35 c ja d täytyy katketa koodittavan sekvenssin Ul26 tuottaman herpesviruksen proteaasin toimesta muodostaen e- ja f-proteiinit. Tämä proteaasi kykenee tehokkaasti katkaisemaan esiasteproteiinit jopa silloin, kun molemmat 5 geenit, jotka koodittavat proteaasia ja esiastetta, ovat trans-asemassa.
Esillä olevat julkaisussa kuvatut koodittavat sekvenssit sisältävät nukleiinihappoalueet voivat olla rekom- i binanttiekspressiovektorissa, joka kykenee ekspressoimaan 10 sen koodittamia viruksen seriiniproteaaseja. Esimerkit sellaisista nukleiinihappoalueista ovat ne, jotka on esitetty herpesvirukselle HSV-1 kuviossa IA, jotka ovat esillä olevassa patenttihakemuksessa nimeltään A - Z, AA - NN.
Nämä nukleiinihappoalueet tai niiden toiminnalliset ekvi-15 valentit voivat olla toiminnallisesti liitettyjä vaihto- ' ehtoisesti valittuihin promoottori- ja/tai kontrolliele-mentteihin kuin myös muihin elementteihin, kuten termi-naatiokohtaan, poly A -lisäyskohtaan ja muihin sopiviin ^ elementteihin (katso esim. plasmidit A - Z, AA - NN) . Nämä 20 komponentit voivat sisältää sellaiset promoottorit, jotka kykenevät kontrolloimaan herpes <*4:ää, ICP35-geenejä, tai Γ käytännössä minkä tahansa muun promoottorin, joka kykenee muodostamaan ekspression valitussa isäntäsolussa. Rekom- r binanttiekspressiovektorit voivat sisältää promoottorina : 25 joko eukaryoottisen tai prokaryoottisen promoottorin ja voivat sisältää polyadenylaatiosignaalin karboksipään aminohapon 3'-puolella. Promoottori voi olla kooditettavan : proteiinin transkriptioyksikön sisällä. Vektorit voivat myös sisältää merkkigeenit, joita on käytetty tähän men- : 30 nessä esitetyissä analyyseissä. Esimerkit isäntäsoluista ovat BHK-, Vero-, E. coli- tai muu eukaryoottinen tai pro- : karyoottinen solu, jotka alan asiantuntijat tuntevat, jotka solut sallivat tässä kuvattujen vektorien ekspression. = v 16 104427
Lisäksi kuvataan menetelmiä herpesviruksen prote-aasien valmistamiseksi. Sellaisten menetelmien suoritustapa sisältää vaiheet, joissa: (1) valmistetaan nukleiinihappoalue, joka koodittaa 9 5 herpesviruksen proteaasia; ja (2) annetaan alueen ekspressoitua proteiinin tuottamiseksi.
Kuvaava suoritustapa menetelmästä proteaasin valmistamiseksi sisältää sellaisen isäntäsolun käytön, johon 10 nukleiinihappoalue on siirretty. Isäntäsolua viljellään olosuhteissa, jotka sopivat ekspressiolle ja näin proteiinia ekspressoidaan. Menetelmä sisältää myös vaiheen, jossa proteiini eristetään ja puhdistetaan alan asiantuntijoiden hyvin tuntemilla menetelmillä. Tarvittava puhdistusaste 15 riippuu sovellutuksesta, johon proteiinia aiotaan käyttää.
Vaihtoehtoisesti nukleiinihappoaluetta voidaan ekspres-soida soluvapaassa systeemissä, kuten kanin retikulosyyt-tilysaatissa, tai syntetisoida automaattisella proteiini-syntetisaattorilla, kuten tässä on esitetty.
20 Nukleiinihappoalue, joka koodittaa herpesviruksen proteaasia tai ICP35-proteiineja, voidaan valmistaa ottamalla talteen viruksen genominen DNA soluista, jotka on infektoitu herpesviruksella, amplifioimalla tutkittavassa nukleiinihapossa oleva proteolyyttisen kohdan sisältävä : 25 nukleiinihapposekvenssi ja valmistamalla rekombinanttik- loonit, jotka sisältävät sellaiset amplifioidut nukleii-: nihapposekvenssit. Sitten kloonit voidaan valita niin, että ne sisältävät halutut amplifioidut nukleiinihappo-alueet, käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka 30 on suunnattu ainakin sellaista aluetta vastaan, joka koodittaa proteaasin proteolyyttistä domeenia tai ICP35-pro-teiinin katkaisukohtaa, sellaisten kloonien seulontaan.
Muut kloonaus- ja kloonien seulontamenetelmät, jotka alan = asiantuntijat hyvin tuntevat, ovat myös sopivia (Sambrook 35 et ai., 1989).
104427
Menetelmä herpesviruksen molekyylin katkaisemiseksi sisältää vaiheet, joissa käsitellään molekyyliä proteaa-silla olosuhteissa, jotka ovat katkaisulle tehokkaita.
Sellaiset olosuhteet ovat niitä, joissa seriiniproteaasit 5 yleensä toimivat.
Esimerkkinä olevassa suoritustavassa menetelmät herpesviruksen proteaasin havaitsemiseksi kudosnäytteessä sisältävät vaiheet, joissa valmistetaan vasta-aineet pro-teaasia vastaan, leimataan nämä vasta-aineet, saatetaan 10 kudosnäytteet kosketukseen leimatun vasta-aineen kanssa ja tunnistetaan leimatun vasta-aineen ja proteiinin välinen heterokonjugaatti alan asiantuntijoiden hyvin tuntemilla standardimenetelmillä. Nämä leimat voivat olla fluoresoivia leimoja tai radioaktiivisia leimoja.
15 Yksi menetelmä nukleiinihappoalueiden tunnistami seksi biologisissa näytteissä on valmistaa nukleotidikoe-tin, joka kykenee hybridisoitumaan oleellisesti sellaiseen : nukleiinihappoalueeseen, kuten on kuvattu kuvion 1 rivillä 1 5 tai 6, tai kuten on esitetty tämän patenttijulkaisun ~ 20 muissa osissa, jotka koodittavat herpesviruksen proteaasia tai ICP35-proteiineja. Nukleotidikoetin voi olla leimattu.
Sitten koetinta inkuboidaan testattavan biologisen näytteen kanssa selektiivisissä olosuhteissa, jotka ovat sopi- i.
via spesifisten hybridien muodostukselle. Koettimien ja : 25 biologisen näytteen sisältämien nukleiinihappojen välille ” muodostuneet spesifiset hybridit tunnistetaan sitten alan asiantuntijoiden hyvin tuntemilla eri menetelmillä, esi- r merkiksi tunnistamalla koettimen radioaktiivinen leima.
Sellaisten hybridien muodostuminen on osoitus alunperin :
30 etsityn nukleiinihappoalueen läsnäolosta. I
Tässä esitettyjä kohdeproteaaseja, jotka ovat elintärkeitä viruksen elinkierrolle voidaan käyttää virusin- ΐ fektioiden hoidossa. Esimerkki hoitomenetelmästä sisältää proteaasi-inhibiittorin tehokkaan määrän valmistuksen. ;
35 Määrä riippuu hoitotavasta. Hoitotapa voi olla ulkoisesti I
18 104427 käytettävät rasvat, voiteet tai suihkeet, jotka annetaan suoraan iholle, tai laskimon sisäinen injektio systeemisiin infektioihin. Inhibiittorin ajatellaan olevan yhdistetty farmakologisesti hyväksyttävän kantajan kanssa, joka * 5 on sopiva käytettäväksi ihmiselle riippuen antoreitistä.
Lopuksi määritetään inhibiittorin sellainen terapeuttinen määrä, että herpesvirus itse inhiboidaan lisääntymästä, mutta isäntäsolut eivät tuhoudu. Tässä esitetty hoitomenetelmä on erikoisen sopiva herpes simplex -viruksen 10 alatyyppien 1 tai 2 hoitamiseksi, mutta on yleisesti sovellettavissa herpes-ryhmään, joiden jäsenillä on vahvat DNA-homologiat keskenään. Johtuen muiden organismien, esim. sytomegaloviruksen (UL80), Varicella-Zoster-viruksen (ORF33), Epstein-Barr-viruksen, vahvoista sekvenssihomolo-15 gioista HSV-1-viruksen UL26:een, nämä hoitostrategiat ovat todennäköisesti laajasti sovellettavissa kaikkiin herpesviruksiin.
Inhibitio voi tapahtua joko transkriptio-, translaatio- tai proteiinin toimintatasolla. Transkription häi-20 rintä voi vaatia mRNA:n muodostuksen häirinnän DNA-temp-laatilla. Translaation häirintä voi vaatia proteiinien synteesin häirinnän mRNA-templaatilla. Vaihtoehtoisesti proteaasin itsensä toiminta voidaan lopettaa joko tuhoamalla proteaasin rakenne, erikoisesti sen proteolyyttinen : 25 domeeni, vaihtamalla sen substraatin katkaisukohta tai tarjoamalla väärä substraatti, joka inaktivoi proteaasin.
Toinen inhibiittorimuoto sisältää nukleiinihappoalueen, joka kykenee hybridisoitumaan herpesviruksen proteaasia koodittavan sekvenssin kanssa, mutta muodostaa sellaisen ψ 30 hybridin, joka inhiboi mRNA:n transkription, josta pro-teaasi transloitaisiin.
' f
On olemassa useita inhibiittoreita, jotka tuntuvat olevan sopivia näihin tarkoituksiin. On havaittu, että ky-mostatiini ja di-isopropyylifluorifosfaatti aiheuttavat 35 100-%:isen proteaasi-inhibition in vitro -kokeessa. Fenyy- 19 . 104427 limetaanisulfonyylifluoridi aiheuttaa ainakin 50-%:isen inhibition, tämä alentuminen johtuu inhibiittorin epästa-biilisuudesta ajan suhteen. Eri proteaasi-inhibiittoreilla tehtyjen kokeiden tulokset osoittivat, että UL2 6-proteaasi 5 inhiboitui seriiniproteaasi-inhibiittoreilla, mutta ei kysteiini-, asparagiinihappo- tai metalliproteaasi-inhi-' biittoreilla. Muut ajatellut inhibiittorit sisältävät an- tipaiinin, aprotiniinin, leupeptiinin, (4-aminofenyyli)me- \ taanisulfonyylifluoridin ja mitkä tahansa muut seriinipro-10 teaasi-inhibiittorit, jotka ovat keksinnön mukaisessa kan- didaattiseulontatestissä positiivisia. Tietyissä suoritustavoissa on ajateltu tässä kuvattujen inhibiittorien myrkyttömiä johdannaisia.
Vielä muiden inhibiittorien määrittämiseksi tutkit-15 tavat kandidaattiaineet seulotaan valmistamalla keksinnön mukaisesti viruksen proteaasi, yhdistämällä proteaasi in-hibiittorikandidaattiaineen kanssa ja valitsemalla sellainen substraatti, jonka proteaasi kykenee katkaisemaan.
Testi suoritetaan saattamalla substraatti kosketukseen 20 proteaasi-kandidaattiaine-yhdistelmän kanssa ja määrittä mällä, inhiboiko kandidaattiaine proteaasin toimintaa substraatilla. Tarkemmin sanottuna keksintö koskee menetelmää herpesviruksen proteaasin inhibointiin kykenevän aineen tunnistamiseksi, jolle menetelmälle on tun-25 nusomaista, että se sisältää vaiheet, joissa: (a) valmistetaan puhdistettu HSV-proteaasi, jota koodittaa vähintään UL26-geenin domeenit II ja III, ^ (b) proteaasi saatetaan kosketukseen proteaasin : pilkkomiskohdan sisältävän proteiinisubstraatin kanssa 30 olosuhteissa, joissa substraatin proteolyyttista pilkko mista voi tapahtua, • ' _ • =· (c) yhdistetään proteaasi inhibiittorikandidaatti-aineen kanssa ja (d) määritetään, onko proteiinisubstraatti pilkkou- 3 5 tunut.
104427
Kuvaavassa suoritustavassa viruksen proteaasi, jota käytetään testattaessa kandidaattlainetta, on puhdistettu herpesviruksen proteaasi, joka on syntetisoitu in vitro kanin retikulosyyttilysaatissa menetelmillä, jotka on ku-5 vattu esillä olevassa patenttijulkaisussa.
Proteaasi yhdistetään inhibiittorikandidaattiaineen kanssa joko in vitro -testissä laboratoriossa tai koeorga-nismissa. Valittu substraatti, jonka proteaasi kykenee katkaisemaan, voi olla proteaasi itse tai ainakin ICP35-10 proteiinin esiasteiden c ja d katkaisukohta. Kun substraatti on saatettu kosketukseen proteaasin ja inhibiittorikandidaattiaineen kanssa, voidaan määrittää, inhiboiko aine proteaasin toimintaa substraatilla määrittämällä, onko substraatin katkaisu tapahtunut. Yhdessä suoritus-15 tavassa tämä voidaan määrittää katsomalla SDS-geelielek-troforeesilla, ovatko ICP35-proteiinit c ja d tuottaneet ICP35-alayksiköt e ja f, jotka muodostuvat ainoastaan proteaasin aiheuttamalla c- ja d-proteiinien katkaisulla. Jos proteiinit eivät ole katkenneet, johtopäätös on, että kan-20 didaattiaine todellakin inhiboi viruksen proteaasia. Tätä inhibiittoria voidaan sitten käyttää terapeuttisiin kokeisiin.
Viruksen proteaasi, jota käytettiin inhibiittori-kandidaattiainekokeessa, voidaan valmistaa soveltaen yh-: 25 distelmä-DNA-menetelmiä, jossa esimerkiksi ekspressiovek- tori sisältää ainakin proteaasin proteolyyttisen osan. ΐ Ekspressiovektori siirretään sitten sopivaan isäntäsoluun sellaisissa olosuhteissa, jotka sallivat koodittavan sekvenssin ekspressoitumisen. Kun sekvenssi on ekspressoitu 30 proteaasiksi tai proteaasin osa-alueeksi, proteaasi voidaan kerätä solusta ja puhdistaa edelleen alan asiantun-~1 · 9 tijoiden hyvin tuntemilla menetelmillä, jos tarvitaan.
Vaihtoehtoinen menetelmä herpesviruksen proteaasin valmistamiseksi on hankkia näyte, joka sisältää proteaa-35 siä, esimerkiksi herpesviruksen infektoima kudospala tai 104427 erite. Sitten näyte homogenisoidaan ja fraktioidaan pro-teaasifraktion saamiseksi. Proteaasifraktio voidaan edelleen eristää ja puhdistaa alan asiantuntijoiden hyvin tuntemilla menetelmillä riippuen tietystä sovellutuksesta.
5 Kuvataan myös menetelmää sellaisen seriiniproteaa- sin valitsemiseksi, joka toimii samoin kuin ne, jotka on kuvattu tässä eri herpesviruslajeilla, muilla kuin herpesviruksilla tai todellakin millä tahansa organismilla. Pro-teaasin valitsemiseksi valmistetaan aminohapposekvenssi, 10 j oka sisältää ainakin esillä olevassa patenttihakemuksessa kuvatun proteaasin katkaisukohdan. Sitten viruksen kandi-daattiproteaasi saatetaan kosketukseen sellaisen katkaisukohdan kanssa, joka sisältää aminohapposekvenssin, r joka on herkkä katkeamaan viruksen seriiniproteaasilla.
15 Lopuksi määritetään, onko katkaisu tapahtunut käyttäen ICP35-substraattia ja määrittämällä, onko ICP35-proteiinit c ja d muuttuneet proteiineiksi e ja f. Näillä menetelmillä on osoitettu, että HSV-2-viruksen proteaasi kykenee katkaisemaan ICP35-proteiinit c ja d proteiineiksi e ja f.
20 Edellä kuvatut menetelmät ja koostumukset ovat mah dollistaneet elintärkeiden seriiniproteaasien tunnistamisen muissa lajeissa. Esillä olevan keksinnön mukaiset me- Γ netelmät ovat yleisesti sovellettavissa, ainoastaan geno-min lähde muuttuu. On odotettavissa, että näitä seriinip-25 roteaaseja koodittavat konservoituneet alueet ja että ne ovat laajalle levinneitä. Herpesviruksilla kuuden viruksen ~
DNA:n sekvenssistä neljä (HSV-1, EBV, VZV, CMV) on julkaistu ja ne on talletettu tietokonetallenteiksi, jotka I
ovat alan asiantuntijoiden saatavissa. On odotettavissa : 30 homologioita aminohapposekvenssien ja toimintojen välillä perustuen seriiniproteaasien konservoituneeseen luontee-seen ja homologioihin, jotka on havaittu aiemmin sukulaislajien, esim. herpesryhmän, joukossa (Davison et ai., 1986; McGeoch et ai., 1988). Näin ollen voidaan ennustaa, 35 että HSV-1-viruksen UL26:11a, EBV-viruksen BVRF2:11a, CMV- ^ • = 22 104427 viruksen UL80:lla ja VZV-viruksen geenillä 33 on sama tai samantapainen rooli kapsidin kypsymisessä ja että ne koodattavat proteaasia. Koska näiden oletettujen proteaasien ja HSV-1-viruksen UL26:n välillä havaittiin vahva sekvens-5 sihomologia, uskotaan, että näiden proteaasien toiminta tai katkaisumekanismi on sama kuin HSV-1-viruksen UL26:lla.
Näin ollen ei ole yllättävää, että kuvattua herpes simplex -virusta (HSV-1 ja HSV-2) vastaan olevaa inhibiittoria voidaan soveltaa muiden herpesvirusten (EBV, VZV, CMV ja 10 ihmisen herpesvirus 6) hoitamiseen.
Osoituksena siitä, että seriiniproteaasit eivät rajoitu herpesryhmään, ovat julkaisut kapsidien kokoamisesta muissa mikrobeissa. Bakteriofagit T4 ja lambda ovat yleisimmin tutkittuja kapsidin kokoamisen suhteen. Näissä 15 faageissa esimuodostettu kapsidi ensin kootaan ulkokuori-proteiinin ja sisäpuolisen laskostusproteiinin välisellä interaktiolla. Sitten laskostusproteiini katkaistaan faa-gin koodittamalla proteaasilla ja poistetaan kapsidista.
Samalla faagin DNA pakataan kapsidiin muodostaen kypsä 20 kapsidi. Laskostusproteiinin katkaisu on elintärkeä kypsän kapsidin muodostukselle. Äskettäin jäädytyselektronimik-roskopiatutkimukset paljastivat kapsidirakenteen samankaltaisuuden HSV-viruksen ja lambda-faagin välillä. Ihmisen CMV-kannan AD169-sekvenssi on määritetty ja on tunnistettu 25 HSV-viruksen UL26 : lie analoginen geeni . ICP35-proteiinin on ehdotettu toimivan laskostus- tai kokoamisproteiinina HSV-viruksen kapsidin kypsymisprosessissa. ICP35-proteiinin katkaisu tässä kuvatuilla proteaaseilla vaaditaan kapsidin kypsymiseen ja on elintärkeä viruksen replikaatiolle. Täs-30 sä kuvatut proteaasit toimivat faagiproteaaseja vastaaval la tavalla katkaisten ICP35-proteiinin aloittaen DNA-.n ' r pakkaamisen. Sen vuoksi keksinnön mukaiset proteaasin in-hibiittorikandidaattikokeet ja kuvatut hoitomenetelmät ovat sovellettavissa laajemmalti kuin ainoastaan herpes-3 5 ryhmään.
"a 104427
e J
"Domeeni" viittaa proteiinin osaan tai alueeseen, joka on määritelty aminohapposekvenssiksi polypeptidissä tai proteiinissa, esillä olevassa tapauksessa domeeni määritellään toiminnallisesti sekvenssin aminohappodeleetioi- ‘ 5 den tai substituutioiden vaikutuksen suhteen proteiinin toimintaan tai substituutioon.
' "Alavirtaan" viittaa nukleiinihapposekvensseihin, jotka löytyvät annetun viitekohdan 31-puolelta nukleiini-happomolekyylistä.
10 "Epitooppi" on aminohapposekvenssi, joka on anti geeninen determinantti.
"Avoin lukukehys" (ORF) sisältää sarjan aminohappoja koodittavia triplettejä ilman lopetuskodoneja. Tämäntyyppiset sekvenssit voidaan hyvin translatoida proteii-15 niksi.
"Oleellisesti puhdistettu" DNA:hän viitatessa viittaa DNA-alueisiin, jotka eristetään vapaiksi niiden sellaisesta luonnollisesta ympäristöstä, jossa ne voivat olla organismin genomissa, ja sen on tarkoitettu sisältävän 20 alueet sellaisina kuin ne ovat geneettisen manipuloinnin jälkeen, esim. insertoituna rekombinanttivektoriin.
"Transkriptioyksikkö" on RNA polymeraasin aloitus-ja lopetuskohtien välimatka.
"Ylävirtaan" viittaa nukleiinihapposekvensseihin, : 25 jotka löytyvät annetun viitekohdan 5'-puolelta nukleiini- happomolekyylistä.
"Viruksen proteaasi" on entsyymi, joka kykenee katkaisemaan viruksen esiasteproteiineja spesifisestä kohdasta.
30 HSV herpes simplex -virus * · CMV sytomegalovirus ORF avoin lukukehys ICP infektoidun solun polypeptidi 35 DFP di-isopropyylifluorifosfaatti « “ 104427 TPCK L-l-tosyyliamido-2-fenyylietyylikloorimetyyliketoni TLCK Ν-α-ρ-tosyyli-L-lysiinikloorimetyyliketoni PMSF fenyyliraetyylisulfonyylifluoridi EGTA etyleeniglykoli-bis-(S-aminoetyylieetteri)-N, N, Ν' 5 Ν'-tetraetikkahappo
Kuvio IA. HSV-l-viruksen genomin sekvenssijärjes-tely, avoimien lukukehysten UL26 ja UL26.5 kohdat ja niiden transkriptit ja esillä olevassa keksinnössä käytettyjen 10 koeplasmidien rakenteet.
Kuvio IB. Avoimen lukukehyksen UL26 nukleotidi- ja aminohapposekvenssi. Kohta +1 vastaa avoimen lukukehyksen ; UL26 translaation aloituskohtaa.
1 Kuvio 2. Kaavamainen esitys HSV-l-viruksen genomi- 15 sen DNA:n, avoimien lukukehysten (ORF) UL26 ja UL26.5 ja tämän geneettisen systeemin translationaalisten ja post-translattonaalisten tuotteiden välisistä suhteista.
Kuvio 3. Autoradiografiakuvio DNA-koettimesta 1 (A) ja koettimesta 2 (B), jotka on hybridisoitu valeinfektoi-20 tujen ja 12 tuntia infektoitujen Vero-solujen sytoplasman kokonais-RNA:hän ja katkaistu Sl-nukleaasilla.
Kuvio 4. Valokuva polypeptideistä sellaisista solu-lysaateista, jotka on transfektoitu plasmidirakenteilla ja superinfektoitu viruksella, erotettu elektroforeettisesti : 25 polyakryyliamidigeeleissä, siirretty sähköisesti nitrosel- luloosamembraanille ja annettu reagoida vuohen monoklo-naalisen vasta-aineen H725 (HSV-vasta-aine), joka on valmistettu HSV-l-viruksen ICP35 vastaan, kanssa.
Kuvio 5. Valokuva polypeptideistä sellaisista solu-30 lysaateista, jotka on transfektoitu plasmidirakenteilla ja superinfektoitu viruksella, erotettu elektroforeettisesti polyakryyliamidigeeleissä, siirretty sähköisesti nitrosel-luloosamembraanille ja annettu reagoida monoklonaalisen vasta-aineen H725 (HSV-vasta-aine) tai CH28-2 (CMV-vasta-35 aine) kanssa.
25 1 0 4 4 2 7
Kuvio 6. Valokuva polypeptideistä sellaisista solu-lysaateista, jotka on transfektoitu plasmidirakenteilla ja superinfektoitu HSV-l-viruksella, erotettu elektroforeet-tisesti polyakryyliamidigeeleissä, siirretty sähköisesti 5 nitroselluloosamembraanille ja annettu reagoida monoklo-
naalisen vasta-aineen H725 (HSV-vasta-aine) tai CH28-2 ' (CMV-vasta-aine) kanssa. I
Kuvio 7. Autoradiografiset kuvat ja valokuva polypeptideistä sellaisista solulysaateista, jotka on trans-10 fektoitu plasmidirakenteilla ja superinfektoitu viruksel la, erotettu elektroforeettisesti polyakryyliamidigeeleissä, siirretty sähköisesti nitroselluloosamembraanille ja annettu reagoida monoklonaalisen vasta-aineen H725 (HSV-vasta-aine) tai CH28-2 (CMV-vasta-aine) kanssa.
15 Kuvio 8. Autoradiografinen kuva 35S-metioniinilla leimatuista polypeptideistä, jotka on transloitu nukleaa-silla käsitellyssä kanin retikulosyyttilysaatissa ja erotettu elektroforeettisesti 9,5 % denaturoivassa polyak-ryyliamidigeelissä.
20 Kuvio 9. Valokuva elektroforeettisesti erotetuista polypeptideistä sellaisista soluista, jotka on transfektoitu plasmidirakenteilla ja superinfektoitu HSV-l-viruksella (F) joko 34 °C:ssa (34 °C) tai 39 °C:ssa (39 °C), erotettu elektroforeettisesti polyakryyliamidigeeleissä, 2 ; 25 siirretty sähköisesti nitroselluloosamembraanille ja an nettu reagoida HSV-1-viruksen ICP35-proteiinia vastaan olevan monoklonaalisen vasta-aineen H725 (HSV-vasta-aine) kanssa ja värjätty vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-aineella, " joka on liitetty peroksidaasiin.
30 Kuvio 10. Valokuva elektroforeettisesti erotetuista polypeptideistä sellaisista soluista, jotka on transfek-toitu plasmideilla ja joko valemfektoitu tai superinfektoitu HSV-l-viruksella (F) (HSV-1) joko 34 °C:ssa, 39 °C:ssa tai 37 °C:ssa, erotettu elektroforeettisesti " 35 polyakryyliamidigeeleissä, siirretty sähköisesti nitrosel- " 26 104427 luloosamembraanille ja annettu reagoida monoklonaalisen vasta-aineen H725 (HSV-vasta-aine) tai CH28-2 (CMV-vasta-aine) kanssa ja värjätty vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-ai-neella, joka on liitetty peroksidaasiin.
c 5 Kuvio 11. Valokuva polypeptideistä sellaisista so luista, jotka on transfektoitu plasmideilla ja joko va-leinfektoitu tai superinfektoitu HSV-l-viruksella (F) (HSV-1) tai HSV-2-viruksella (G) (HSV-2) joko 34 °C:ssa, 39 °C:ssa tai 37 °C:ssa, erotettu elektroforeettisesti 10 polyakryyliamidigeeleissä, siirretty sähköisesti nitrosel-luloosamembraanille ja annettu reagoida monoklonaalisen vasta-aineen H725 (HSV-vasta-aine) tai CH28-2 (CMV-vasta-aine) kanssa ja värjätty vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-ai-neella, joka on liitetty peroksidaasiin.
15 Kuvio 12. Autoradiografinen kuva 35S-metioniinilla leimatuista polypeptideistä, jotka on koodattu avoimesta lukukehyksestä UL26 ja elektroforeettisesti erotettu denaturoivassa polyakryyliamidigeelissä.
Kuvio 13. Autoradiografiset kuvat ja valokuva po-20 lypeptideistä, jotka on syntetisoitu joko in vitro sekvensseistä, jotka ovat plasmideissa U tai Y, tai soluly-saateissa, jotka on transfektoitu plasmideilla X tai Z ja a superinfektoitu HSV-l-viruksella (F) tai HSV-2-viruksella (G) .
: 25 Kuvio 14. Autoradiografinen kuva 35S-metioniinilla leimatuista polypeptideistä, jotka on koodattu avoimesta lukukehyksestä UL26 ja elektroforeettisesti erotettu denaturoivassa polyakryyliamidigeelissä, jossa osoitetaan PMSF:n toiminta proteaasi-inhibiittorina.
30 Kuvio 15. Valokuva elektroforeettisesti erotetuista polypeptideistä sellaisista soluista, jotka on transfek-toitu plasmidirakenteilla ja superinfektoitu HSV-l-viruk-" sella (F) joko 34 °C:ssa (34 °C) tai 39 °C:ssa (39 °C), erotettu elektroforeettisesti polyakryyliamidigeeleissä, 35 siirretty sähköisesti nitroselluloosamembraanille ja an- 27 104427 nettu ensin reagoida HSV-1-viruksen ICP35-proteiinia vastaan olevan monoklonaalisen vasta-aineen H725 (HSV-vasta-aine) tai CMV:n epitooppia vastaan olevan monoklonaalisen vasta-aineen CH28-8 (CMV-vasta-aine) kanssa ja värjätty 5 vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-aineella, joka on liitetty peroksidaasiin.
' Kuvio 16. Autoradiografiset kuvat elektroforeetti- sesti erotetuista polypeptideistä, jotka on transloitu in vitro nukleaasilla käsitellyssä kanin retikulosyyttilysaa-10 tissa synteettisistä RNA:sta, jotka on transkriptoitu in vitro avoimesta lukukehyksestä UL26, joka on kloonattu plasmidirakenteeseen Y.
Kuvio 17. Kaavamainen esitys mutageneesitutkimusten tuloksista.
15 Julkaisussa kuvataan herpesviruksen proteaaseja ja sellaisia proteaaseja koodittavia nukleiinihappoalueita. Proteaasia koodattavat alueet sisältävät myös ainakin yhden koodittavan domeenin proteiineille, joita käytetään kapsidin tuotossa viruksen replikaation aikana. Proteaasin 20 substraatit sisältävät sen oman ja viruksen kapsidiprote-iinien esiasteiden aminohapposekvenssit (kuvio 2). Prote-aasi-inhibiittorit keskeyttävät viruksen elinkierron tarjoten näin keinot terapeuttiseen väliintuloon. Kuvaava sovellutus käyttää HSV-l-virusta proteaasin lähteenä.
: 25 Uusi herpesviruksen proteaasi on tunnistettu HSV-1- viruksessa, puhdistettu ja nimetty "Pr":ksi. Ase suoraan hyökkäykseen viruksen tuottoa vastaan muodostetaan inhiboimalla Pr-proteaasin toiminta. Koska proteaasi on elintärkeä DNA:n pakkaukselle viruksen kapsidiin, proteaasin 30 inhibitio tuhoaa viruksen replikaatiosyklin. Hoito prote-aasi-inhibiittoreilla lievittää kliinisiä vaikutuksia ja alentaa siirtymisriskiä.
Herpesviruksen proteaasi on HSV-genomin avoimen lukukehyksen UL26 alueen tuote. Proteaasi on sekä tarpeel-35 linen että ainoa viruksen proteiini, joka on riittävä ai- „ 104427 28 heuttamaan oman katkaisunsa ja avoimen lukukehyksen UL26.5 (ORF) alueen tuotteen katkaisun, joka tuote on tunnistettu ja puhdistettu esillä olevassa julkaisussa. Avoimen luku-kehyksen Ul26 tuote, proteiini, joka on nimeltään Pra, on 5 aiemmin kuvaamaton herpesviruksen proteaasi, ensimmäinen proteaasi, joka on puhdistettu herpesviruksesta. Soluva-paissa systeemeissä Pra katkaisee itsensä Prb-proteiiniksi muodostaen todisteen sille, että translaatiotuote Pra voi toimia proteaasina (kuvio 1). Prb, nimi, joka on annettu 10 Pra-proteiinin autokatalyyttiselle katkaisutuotteelle, on noin 20 aminohappoa pienempi kuin Pra.
Kuvatun proteaasin ominaisuudet eivät rajoitu ainoastaan siihen, että se katalysoi omaa katkeamistaan, vaan yllättävästi toista runsaampana esiintyvää substraattia, 15 jolla se toimii, koodittaa sekvenssi, joka sisältyy kokonaisuudessaan proteaasia koodittavaan geeniin. Proteaasil-la ja toisella substraatilla on samanlaiset aminohapposek-venssit karboksipäissään. Yllättävä ja odottamaton havainto oli, että toista substraattia koodittava alue koodittaa 20 viruksen kapsidiproteiineja, jotka ovat nimeltään ICP35-proteiineja, ja muodostaa uuden tunnistetun geenin, joka on nimeltään UL26.5.
UL26-geenin ekspressio proteaasin muodossa on elintärkeää viruksen kypsymiselle. Todiste tästä on se, että : 25 lämpöherkällä mutaatiolla, jonka ovat kuvanneet Preston et ai. (1983), avoimessa lukukehyksessä UL26 on letaali vaikutus kapsidin kypsymiseen. Sen vuoksi proteaasin toiminnan tuhoaminen häiritsee viruksen kypsymistä antaen mahdollisuuden terapeuttiselle strategialle.
30 Keksijät käyttivät kolmea yleistä lähestymistapaa herpesviruksen proteaasin tunnistamiseksi ja karakterisoi-miseksi. Nämä sisältävät: 1) solujen transfektoimisen tes-tiplasmideilla ja sitten niiden infektoimisen herpesviruksella; 2) solujen transfektoimisen kahdella plasmidilla; 35 ja 3) in vitro translaation. Näiden tutkimusten perusteel- • 29 104427 la keksijät tunnistivat kaksi päällekkäin menevää herpes simplex -virus l:n (HSV-1) nukleiinihapposekvenssiä, jotka sisältävät kaksi geeniä (riippumattomia transkriptioyk-sikköjä). Suurempi sekvensseistä on nimetty UL26:ksi ja se 5 koodittaa proteiinia, jonka havaittava molekyylipaino on noin 75 - 85 kd SDS-PAGE:lla määritettynä. Tämä proteiini * on seriiniproteaasi, joka kykenee prosessoimaan itseään ja ICP35-proteiinin esiasteita karboksipään proteolyyttisellä katkaisulla. Pienempi sekvenssi on nimeltään UL26.5 ja se 10 koodittaa proteiinia, jonka havaittava molekyylipaino on noin 35 - 50 kd SDS-PAGE:lla määritettynä. Molemmat geenit on kloonattu.
Yksi syistä, että tässä kuvatut proteaasit on onnistuneesti eristetty ja puhdistettu, on avainasemassa 15 olevan substraatin, ICP35-proteiinien, valinta. Herpesviruksen genomin paremmaksi ymmärtämiseksi toinen tuottovai-he oli valmistaa suuri määrä sellaisia spesifisellä raken-tamisstrategialla suunniteltuja plasmideja, jotka vastaavat spesifisiin kysymyksiin herpesviruksen geneettisten 20 reittien mekanismeista. Joihinkin plasmideihin insertoi-tiin merkkisekvenssi geneettisten toimintareittien jäljittämiseksi. Merkkisekvenssit ryhmässä plasmidirakenteita sisälsivät a4-promoottorin tai hiiren monoklonaalisen vasta-aineen kanssa reagoimaan kykenevää sytomegaloviruksen : 25 epitooppia koodittavan sekvenssin deleetiot tai insertiot.
Nämä rakenteet paljastivat dramaattisia ja yllättäviä eroja herpesviruksen genomin alueen geneettisessä toiminnassa verrattuna niihin, jotka oli ennustettu aiemmassa työssä liittyen avoimen lukukehyksen UL26 rakenteeseen ja toimin- * 30 taan.
Aiemmassa työssä McGeoch et ai. (1988) ennusti, m että avoin lukukehys UL26 koodittaa ICP35-proteiinia. Tässä avoimessa lukukehyksessä olevien nukleotidisekvenssien perusteella ennustetun UL26-tuotteen koko paljastui kuitenkin 35 olevan paljon suurempi kuin ICP35. Hierarkkinen geneetti- 30 104427 nen monimuotoisuus paljastui olevan vastuussa herpesviruksen kapsidiproteiinin tuotosta. Se, mitä on esitetty esillä olevassa julkaisussa, on UL26-nimisen domeenin jako kahteen päällekkäin menevään transkriptioyksikköön muodostaen 5 proteiinit, joilla on osittain sama aminohapposekvenssi. Se, mikä on aiemmin nimetty ICP35-proteiiniksi, paljastui olevan kooditettu ainoastaan osasta avointa lukukehystä Ul26. Esillä olevan julkaisun tarkoituksia varten se yksikkö on nimetty UL26.5:ksi.
10 Esillä olevassa julkaisussa kuvatulla proteaasilla on yleistä käyttökelpoisuutta. Pra-proteaasin, joka katkaisee esiasteet muodostaen ICP35-proteiinit, substraatin homologeja on tunnistettu muissa herpesviruksissa. Sen vuoksi on todennäköistä, että tässä kuvatut menetelmät 15 paljastavat proteaasin muissa virusruhmän jäsenissä ja muissa lajeissa. Yhtenä esimerkkinä on julkaistu äskettäin, että CMV-viruksen ekvivalentti ICP35-proteiinille katkaistaan karboksipäästä (Gibson et ai., 1990, Schenk et ai., 1991), vaikka CMV-viruksen proteaasia ei ole vielä 20 tunnistettu siinä lajissa. Herpesviruksen proteaasi sen vuoksi todennäköisesti aiheuttaa katkaisun muissa herpesviruksissa. Aivan äskettäin ilmestyi julkaisu sytomegalo-viruksen proteinaasista. Aktiivisen proteaasin sanottiin vapautuvan täyspitkän proteaasin katkaisun jälkeen amino-: 25 haposta 248, mutta esillä oleva julkaisu antaa ehdottaa, että sellaisen katkaisun lopputuote olisi inaktiivinen.
ICP35-proteiinin avoimen lukukehyksen homologin läsnäolo Varizella-Zoster-viruksen (VZV) genomissa (Davison ja Scott, 1986; Davison ja McGeoch, 1986) antaa eh-30 dottaa, että ICP35-ekvivalentti ja vastaava proteaasi ovat *; konservoituneita eri herpesviruksissa. Koska ICP35-prote- iinin aminohapposekvenssi sisältyy kokonaisuudessaan Pr-proteaasin karboksipäähän ja koska ICP35 ei osoita havaittavaa proteolyyttistä aktiivisuutta odotetaan, että Pr-35 proteaasin sisältämä proteolyyttinen aktiivisuus ilmentyy • 3l 104427 proteiinin aminopään domeenissa. On mielenkiintoista havaita, että VZV-genomissa (Davison ja Scott, 1986) UL26:tta vastaavalla avoimella lukukehyksellä on suurempi homologia aminopään aminohapposekvenssiin kuin karboksipään vastaa-5 vaan.
Herpes simplex -viruksen (HSV) genomin manipulointi * Viruksen proteaasin tärkeys terapeuttisena kohteena on selvää ajateltaessa viruksen replikaatiomekanismeja.
Herpes simplex -viruksella on esimerkiksi genomi, joka 10 sisältää lineaarisen, kaksijuosteisen DNA-molekyylin (mo- lekyylipaino noin 100 x 10e) , joka on tarpeeksi iso koodit-tamaan 73 erilaista geenituotetta. Genomin rakenne on epätavallinen DNA virusten joukossa siinä mielessä, että kahdella yksittäisellä nukleotidisekvenssillä on molemmissa 15 päissään invertoituneet toistosekvenssit.
Viruksen genomi on pakattu säännöllisen ikosahed-raalisen proteiinikuoren (kapsidin) sisälle, joka koostuu 162 kapsomeerista. Viruksen ulkopuolella on lipidivaippa, joka sisältää membraanikuoren, joka on peräisin modifioi-20 dusta solumembraanista. Solun proteiineja ei ole havaittu virionin vaipassa. Glykoproteiinit vaipan lipidikaksois-kerroksessa välittävät viruksen kiinnittymistä isäntäsolun pintaan ja viruksen pääsyä solun sisälle ja viruksen kypsymistä ja lähtöä solusta. Kapsidin ja lipidikaksoisker- ' : 25 roksen välillä on olemassa kuori. Kapsidin sisällä ovat DNA-polyamiinit ja DNA:hän sitoutuvat proteiinit.
Kun solujen infektion jälkeen tapahtuu viruksen replikaatio ja leviäminen, seurauksena on kliinisiä ongelmia. Kun viruksen genomi saavuttaa solun tuman, viruksen geenien ekspressio tapahtuu erittäin säädellyllä tavalla.
5 Virusinfektiosta ja replikaatiosta voi seurauksena olla ♦ t ..... - solun kuolema. Proteaasin inhibitio estää replikaation. In vivo -infektiot tietyissä soluissa, erikoisesti aistineu-roneissa, eivät välttämättä johda viruksen replikaatioon [ 32 104427 ja solun kuolemaan. Seurauksena voi olla latentti infektio .
HSV-l-genomin sekvenssijärjestely, avointen luku-kehysten Ul26 ja Ul26.5 ja niiden transkriptien ja esillä 5 olevan keksinnön mukaisia näkökohtia varten rakennettujen koeplasmidien rakenteet on esitetty kuviossa 1:
Rivi 1 - kaavamainen esitys HSV-l-genomin sekvenssi järjestelystä. UL ja Us viittaavat pitkään ja lyhyeen yksittäiseen sekvenssiin, joiden molemmissa päissä on suo-10 rakulmioilla kuvatut invertoidut toistoalueet.
Rivit 2 ja 3 - genomikartan kohdat, nukleotidinume-rot ovat suhteessa UL26:n transkription aloituskohtaan, joka on merkitty kirjaimella I kohdassa +1, ja HSV-l-vi-ruksen EcoRI-PstI DNA-fragmentin restriktioendonukleaasi-15 kohtiin. Rivi 3 esittää myös translaation lopetuskodonin (T) ja yksittäisen poly (A) -signaalin (A) kohdan,' jotka toimivat sekä UL26 että UL26.5 RNArlla.
Rivit 4 ja 5 - täytetyt neliöt (paksut viivat) edustavat avointen lukukehysten, UL26 ja UL26.5 koodittavia 20 domeeneja. Numerot viittaavat transkription aloituskohdan, translaation aloituskodonin ja lopetuskodonin ja poly (A) -signaalin kohtiin molemmissa avoimissa lukukehyksissä suhteessa UL26:n nukleotidiin +1.
Rivi 6 on restriktioendonukleaasikartta, joka on '•m 25 piirretty mittakaavaan viitaten riveihin A - Z ja AA - NN, jotka ovat kaavamaisia esityksiä HSV-1-viruksen sekvensseistä, joita on käytetty tässä julkaisussa kuvattujen tutkimusten plasmidirakenteissa. Plasmidien, jotka on esitetty kaavamaisesti riveillä A - Z ja AA - NN, rakentami-30 nen on kuvattu esimerkissä 1. a4-promoottorin (avoin ne- « ; liö), joka on kuvattu plasmideissa B, D, H, J, K, L, M, P, W, X, Z ja AA - NN, lähde oli BamHI Z DNA-fragmentti (Post et ai., 1981), joka insertoitiin sopivaan transkriptio-- naaliseen orientaatioon. CMV-epitooppi on esitetty täytet- 35 tynä soikiona. Oligonukleotidi C komplementtinsa kanssa on * "3 33 104427 ; esitetty täytettynä neliönä ja muodostettu uusi Pmll-kohta on merkitty merkillä P*. Restriktioendonukleaasikohdat lyhennettiin seuraavasti: B, BamHI; Ba, Ball; Bs, BstEII; E, EcoNI; H, Hpal; K, Kpnl; Ms, Mstll; P, Pmll; Ps, PstI; 5 S, Sali; X, Xmal. Me edustaa avoimen lukukehyksen UL26.5 translaation metioniinin aloituskodonia.
' Jotta Ul26 ja Ul26.5 voitiin transloida in vitro i
ICP35-proteiinin prosessoimattomiksi muodoiksi, avoimet lukukehykset Ul26 ja UL26.5 molemmat kloonattiin plasmidiin 10 pGEM3Zf(+) saaden plasmidit T ja U, vastaavassa järjestyksessä (kuvio 1) . Ul26:tta ja UL26.5:ttä vastaavien mRNA:den RNA:t transkriptoitiin SP6 RNA -polymeraasilla ja trans-loitiin nukleaasilla käsitellyissä kanin retikulosyytti-lysaateissa. Tulokset osoittivat, että UL26 ja UL26.5 spe-15 sifioivat proteiineja, joista kukin muodostaa kaksoisrin-tamat, joiden havaittavat molekyylipainot ovat 80 kd (Pra) ja 45 kd (ICP35 d, c) , vastaavassa järjestyksessä. UL26.5:n I
in vitro syntetisoiman kahden proteiinilajin (ICP35) ha- :
valttiin kulkevan yhdessä ICP35 c- ja d-proteiinien kans- I
20 sa, jotka syntetisoitiin in vitro HSV-l-viruksella (F) infektoiduissa soluissa. Lisäksi havaittiin, että UL26.5:n ^
prosessoimattomat muodot, se on ICP35 c ja d, voidaan pro- T
sessoida ICP35 e- ja f-proteiineiksi.
Oli mahdollista kartoittaa (paikallistaa) ja puh-: 25 distaa ne DNA-sekvenssit viruksen genomissa, joita tarvi- taan ICP35 c- ja d-proteiinien prosessoimiseksi ICP35 e- " ja f-proteiineiksi. BHK-solut transfektoitiin sarjalla plasmideja, jotka sisälsivät eripituisia HSV-l-genomin r sekvenssejä, kunkin sisältäessä koskemattoman ICP35-gee- z 30 nin, ja superinfektoitiin HSV-l-viruksella (F) 39 °C:ssa.
Plasmidilla A, joka sisältää koskemattoman UL26-geenin (ku-* ♦ _ vio 1), transfektoidut BHK-solut muodostivat ICP35 e- ja f-proteiinit ICP35 c- ja d-proteiinien lisäksi, kun taas | solut, jotka transfektoitiin plasmidilla C, josta UL26-gee- “ 35 nin promoottorialue oli poistettu ja jossa oli ainoastaan « 34 . 104427
Ul26:n koodittava sekvenssi jäljellä (kuvio 1), muodosti ainoastaan prosessoimattomia ICP35 c- ja d-proteiineja. Nämä tulokset antoivat ehdottaa, että UL26:n geenituotetta tarvittiin ICP35 c- ja d-proteiinien prosessoimiseen e- ja 5 f-proteiineiksi.
UL26-geenin tuotteen havaittiin kykenevän katkaisemaan ICP35 c- ja d-proteiinit e- ja f-proteiineiksi, kun se oli läsnä trans-asemassa. Sen määrittämiseksi, toimiiko UL26 trans- vai cis-asemassa, BHK-solut transfektoitiin 10 plasmidilla N, jota käytettiin prosessointisubstraattina, ja sarjalla plasmideja, jotka sisälsivät deleetioita avoimessa lukukehyksessä UL26, ja sitten infektoitiin HSV-1-viruksella (F) ja ylläpidettiin 39 °C:ssa. Tulokset osoittivat seuraavaa: 15 (i) ICP35 c- ja d-proteiinit eivät autokatalysoi- neet omaa prosessointiaan ICP35 e- ja f-proteiineiksi, koska solulysaatit, jotka oli transfektoitu yhdessä plas-midien N ja E kanssa (kuvio 1), eivät sisältäneet ICP35 e-ja f-muotoja, jotka olisivat reagoineet monoklonaalisen 20 CMV-vasta-aineen kanssa.
(ii) ICP35 c- ja d-proteiineja ei prosessoitu BHK-soluissa, jotka oli transfektoitu yhdessä plasmidien N ja C tai I kanssa. Plasmidit C ja I sisältävät deleetiot avoimen lukukehyksen UL26 promoottorialueella ja polyadeny- . 25 laatiokohdassa, vastaavassa järjestyksessä (kuvio 1) .
(iii) ICP35 c- ja d-proteiinit prosessoitiin e- ja f-proteiineiksi BHK-soluissa, jotka oli transfektoitu yhdessä plasmideilla N ja A tai B. Plasmidit A ja B sisältävät koskemattoman UL26-promoottorin ja avoimen lukukehyk- 30 sen ja UL26:n koodattavan sekvenssin, jota säädellään a4-• promoottorilla, vastaavassa järjestyksessä. HSV-l-viruk- sessa (F) oleva transdusoiva α-faktori indusoi cc4-promoottorin korkealle tasolle (Post et ai., 1981; Battreson ja Roizman, 1983) 39 °C:ssa. UL26:n korkean tason ekspressio 35 voi selittää prosessoitujen ICP35-muotojen (muodot e ja f) Ί 35 104427 läsnäolon solulysaateissa, jotka oli transfektoitu yhdessä plasmidien N ja B kanssa.
UL26:n koodittaman proteaasin tärkeyden osoittavat tulokset, jotka osoittavat sen kykenevän ICP35 c- ja 5 d-proteiinien prosessoimiseen e- ja f-proteiineiksi. On osoitettu, että UL26 ja ICP35 c- ja d-proteiinien proses-* sointi e- ja f-proteiineiksi ovat molemmat elintärkeitä kapsidin tuotolle, koska mutaation tällä alueella (avoimen j lukukehyksen UL26 5'-päässä) julkaistiin olevan letaali ! 10 (Preston et ai., 1983).
Jopa vielä jännittävämpi siltä näkökannalta, että proteaasia käytettäisiin kohteena herpesvirusinfektioita vastaan hyökätessä on se, että proteaasi tuntuu olevan ainoa proteiini, joka tarvitaan prosessoitaessa ICP35 c-15 ja d-proteiinit e- ja f-proteiineiksi, joita tarvitaan kapsidin tuotossa. Se osoittaa, että proteaasi on elintärkeä kapsidin muodostukselle. Sen määrittämiseksi, onko UL26 ainoa viruksen proteiini, joka tarvitaan tähän prosessoin- : tiin ja sen mahdollisuuden poistamiseksi, että viruksen : 20 geenit, joita HSV-l-genomi (F) ekspressoi 39 °C:ssa, vaikuttaisivat ICP35-proteiinien katalyysiin, BHK-solut transfektoitiin yhdessä vakiomäärän kanssa plasmidia L ja eri määrillä plasmidia B, joissa oli substraattia ja pro- r sessointientsyymiä koodittavat geenit, vastaavassa järjes- ^ 25 tyksessä. Plasmidissa L (kuvio 1) avointa lukukehystä UL26 säädeltiin <x4-promoottorilla ja CMV-epitooppi insertoitiin Mstll-restriktioendonukleaasikohtaan, kun taas plasmidi B sisälsi koskemattoman avoimen lukukehyksen UL26, jota sää-, teli sama promoottori. Koska a4 on vahva eukaryoottinen 30 promoottori, jota konstitutiivisesti ekspressoidaan trans- ^ • 1..
fektoiduissa soluissa (Post et ai., 1981; Kristie ja Roiz- man, 1984), UL26.5- ja UL26-proteiinien ekspressio soluis- ~ sa, jotka oli transfektoitu plasmideilla L ja B, ei vaati- “ nut superinfektiota HSV-l-viruksella (F). Tulokset olivat 35 seuraavat: 104427 (i) Virusinfektion poissa ollessa ICP35 c- ja d-proteiinit olivat ainoat kaksi lajia, jotka ekspressoi-tuivat soluissa, jotka oli transfektoitu plasmidilla L. Plasmidin L ekspressoima epitooppisesti merkitty ICP35 5 prosessoitiin täysin soluissa, jotka oli superinfektoitu HSV-l-viruksella (F) sallivassa lämpötilassa. Kuten oli odotettavissa, plasmidi B ei tuottanut sellaisia tuotteita, jotka olisivat reagoineet anti-CMV-vasta-aineen kanssa.
10 (ii) Plasmidin B, joka sisältää UL26:n, läsnä olles sa plasmidin L ekspressoimat epitooppisesti merkityt ICP35 c- ja d-proteiinit prosessoitiin ICP35 e- ja f-proteiin-eiksi. Matalilla plasmidin B konsentraatioilla ICP35 e- ja ϊ f-proteiinien akkumulaation määrä oli suoraan verrannol- 15 linen sen UL26 plasmidi-DNA:n määrään, joka transfektoitiin yhdessä plasmidin L kanssa BHK-soluihin. Kaikkien korkeimpien plasmidin B määrien yhteydessä havaittu ICP35 e- ja f-proteiinien määrien lasku voi heijastaa kilpailua näiden kahden plasmidin välillä tai alentunutta saantoa johtuen 20 korkeiden DNA määrien aiheuttamasta toksisuudesta.
Näiden kokeiden tuloksista pääteltiin, että UL26:n tuote on ainoa viruksen tekijä, joka on sekä kykenevä että riittävä prosessoimaan ICP35 c- ja d-proteiinit ICP35 e-ja f-proteiineiksi. Proteaasi on sen vuoksi elintärkeä 25 kapsidin kehitykselle, joka puolestaan on elintärkeä herpesviruksen replikaatioelinsyklille.
Sellaisten lääkeaineiden aktiiviset aineet sisältävät proteaasi-inhibiittorin. Inhibiittori voi toimia kumoamalla jo käytettävissä olevan proteaasin proteolyyt-30 tisen aktiivisuuden tai tuhoamalla tai estämällä sellais-’ ten nukleiinihappoalueiden translaation tai transkription aloituksen, jotka ovat vastuussa proteaasin tuotosta. Inhibiittori voi olla kemiallisen koostumuksen muodossa, 3 jolloin se täytyy yhdistää koostumuksen kanssa, joka vai- 35 kuttaa sisäänottoon soluun.
Ί 37 104427
Jos inhibiittori on nukleiinihappoalueen muodossa, se voidaan viedä sisään infektoituihin soluihin millä tahansa eri menetelmällä, jotka alan asiantuntijat hyvin tuntevat. Ne menetelmät on kuvattu tässä ja sisältävät 5 rekombinanttivektorin transfektion, elektroporaation tai "geenitykin" käytön, jolla mekaanisesti kiihdytetyt nuk-* leiinihappopartikkelit pakotetaan infektoituihin soluihin.
Esimerkki 1 i
Plasmidien rakentaminen ja niiden suhde HSV-geno-10 miin
Rakennettiin sarja sellaisia plasmideja, jotka sisälsivät nukleiinihappoalueita, joita voitiin manipuloida HSV-genomissa olevan nukleiinihapposekvenssin sellaisten alueiden tunnistamiseksi, jotka säätelevät spesifisten 15 polypeptidien tuottoa, ja niiden alueiden eristämiseksi ja r niiden tuotteiden puhdistamiseksi.
Nämä näppärät työkalut valmistettiin virusinfektioihin osaa ottavien nukleiinihapposekvenssien tunnistamiseksi ja manipuloimiseksi. Joihinkin plasmideihin sisäl-20 lytettiin merkkigeenit spesifisiin kohtiin niin, että kat-kaisutuotteet voitiin jäljittää ja määritellä eri infek-tioprosesseissa käytettävät nukleotidisekvenssit. CMV-epi-tooppi on esitetty täytettynä soikiona kuviossa 1. Oligo- : nukleotidi C komplementtinsa kanssa on esitetty täytettynä ~ .· 25 neliönä. Muodostettu uusi Pmll-kohta on merkitty merkillä P . Restriktioendonukleaasikohtien lyhenteet ovat seuraa-vat: B, BamHI; Ba, Ball; Bs, BstEII; E, EcoNI; H, Hpal; K, ~
Kpnl; Ms, Mstll; P, Pmll; Ps, PstI; S, Sali; X, Xmal. "
Yhteenvetona, HSV-1-sekvenssit plasmideissa A - Z,
30 AA - NN sisältävät deleetiot, jotka ulottuvat läpi avoimen I
v lukukehyksen UL26 koko domeenin. Joissain tapauksissa, f
esim. plasmidirakenteissa B ja D, a4-geenin promoottori I
asetettiin rinnalle BamHI Z -fragmenttina korkeamman tran-skriptiotason aikaansaamiseksi,_______ 38 104427
Plasmidirakenteet, jotka on merkitty nimillä J - N kuviossa 1, sisältävät HSV-DNA:ssa sekvenssin, joka koo-dittaa CMV-epitooppia, joka on insertoitu ainoaan MstIlkoiltaan näissä fragmenteissa. Kaikkiin muihin paitsi yh-5 teen plasmidirakenteeseen oli myös insertoitu BamHI Z -fragmentti suurentamaan transkriptiota tässä fragmentissa olevan a4-promoottorin avulla. Poikkeus oli plasmidira-kenne N.
Plasmideissa O ja P CMV-epitooppi insertoitiin ai-10 noaan Hpal-kohtaan ja ainoastaan plasmidi P sisältää oc4-promoottorin BamHI Z -fragmentin muodossa.
Rakennettiin seuraavat plasmidit: A (pRB4057), B (pRB4060), C (pRB4058), D (pRB4089), E (pRB4093), F
(pRB4056), G (pRB4087), H (pRB4088), I (pRB4026), J
15 (pRB4092), K (pRB4094), L (pRB4096), M (pRB4095), N
(pRB4102), O (pRB4079), P (pRB4080), Q (pRB4140), R
(pRB4184), S (pRB4185), T (pRB4103), U (pRB4090), V
(pRB4186), W (pRB4188), X (pRB4213), Y (pRB4214) ja Z (pRB4215). Plasmidi pRB4026 rakennettiin insertoimalla 20 HSV-l-fragmentti plasmidin pUC18 Kpnl-kohtaan. Plasmidi pRB4057 sisältää avoimen lukukehyksen UL26 koko koodittavan sekvenssin ulottuen 3'-päässä nukleotidista -900 suhteessa geenin translaation aloituskohtaan noin 650 nukleotidia alavirtaan sen polyadenylaatiokohdasta. Plasmidi pRB4060 25 rakennettiin korvaamalla plasmidissa pRB4057 olevan avoimen lukukehyksen UL26 translaation aloituskohdasta 23 emäs-paria ylävirtaan oleva viruksen sekvenssi HSV-l-DNA:n BamHI Z -fragmentilla. BamHI Z -fragmentti sisältää yhdessä päässä osia «4-geenin 5'-pään transkriptoiduista ei-30 koodittavista sekvensseistä, jotka alkavat nukleotidista i v +33, ja tämän geenin ylävirralla olevista ei-transkrip toiduista domeeneista. BamHI Z -fragmentti insertoitiin sellaiseen orientaatioon, joka asetti a4-promoottorin sopivaan transkriptionaaliseen orientaatioon suhteessa kos-35 kemattomiin ja lyhennettyihin avoimen lukukehyksen UL26 do- 39 104427 meeneihin. Plasmidit pRB4056, pRB4058, pRB4087 ja pRB4093 saatiin plasmidista pRB4057 ja plasmidit pRB4088 ja pRB4089 saatiin plasmidista pRB4060 tekemällä deleetioita jatkokloonausmenetelmällä, jonka ovat kuvanneet Sambrook 5 et ai. (1989).
Kaksi oligonukleotidiparia, se on oligonukleotidi A ' (5’-AAGGGACAGAAGCCCAACCTGCTAGACCGACTGCGACACCGCAAAAACGGG T- ! ACCGACAC-31) komplementtinsa kanssa, oligonukleotidi B (5'-AAAGGGACAGAAGCCCAACCTGCTAGACCGACTGCGACACCGCAAAAACGGG 10 TACCGACACGA-3') komplementtinsa kanssa ja oligonukleotidi C (51-TCGACGTTGACACGGCCCGCGCCGCCGATTTCTTCGTCTCTCAGATGATG GGGGCCCGCCACGTGTGA-31) syntetisoitiin Applied Biosystems DNA Synthesizer 380A -laitteella (Foster City, CA). Oligo-nukleotidit A ja B ja niiden komplementit koodittavat mo-15 noklonaalisen vasta-aineen CH28-2-epitooppia ja sisältävät
Kpnl-kohdan 31-päässä oligonukleotidin helpoksi insertoi-miseksi plasmideihin. Plasmidit pRB4079 ja pRB4080 saatiin insertoimalla oligonukleotidin A sekvenssi plasmidin pRB4057 ja pRB4060 ainoaan Hpal-kohtaan, vastaavassa jär-20 jestyksessä. Plasmidi pRB4092 saatiin insertoimalla oli gonukleotidin B sekvenssi plasmidin pRB4060 ainoaan MstIlkoiltaan. Plasmidit pRB4094, pRB4095, pRB4096 ja pRB4102 " saatiin plasmidista pRB4092 muodostamalla deleetiot tavanomaisten jatkokloonausmenetelmien (Sambrook et ai., 1989) .· 25 avulla. Kaikki näiden plasmidien insertiokohdat sekvens- soitiin sen varmistamiseksi, että CMV-epitooppi oli in- : sertoitunut samaan lukukehykseen voimen lukukehyksen UL26 ^ kanssa.
, Plasmidi Q (pRB4140) saatiin insertoimalla oligo- 30 nukleotidi A komplementtinsa kanssa plasmidin A ainoaan
Pmll-kohtaan. Sekvenssi koodittaa autenttista UL26 sekvens- 1 • - siä Pmll-kohdasta translaation lopetuskohtaan, mutta uuden avoimen lukukehyksen UL26 Pmll-kohdan lisäys sopivaan = orientaatioon johti uuden Pmll-kohdan muodostumiseen avoi- τ 35 men lukukehyksen UL26 karboksipään aminohapon ja lopetusko- 40 104427 donin välille. Lisäksi sekvenssi "GTG" autenttisessa Pmll-kohdassa muutettiin sekvenssiksi "GTC". Insertoimalla sekvenssi C avoimen lukuraamin UL26 ainoaan Pmll-kohtaan sopivaan orientaatioon johti uuden Pmll-kohdan muodostumi-5 seen UL26:n karboksipään aminohapon ja lopetuskodonin välille. Alkuperäinen autenttinen Pmll-kohta tuhottiin muuttamatta UL26:n aminohapposekvenssiä, koska kodonit "GTG" ja "GTC" koodattavat samaa aminohappoa. Sen vuoksi oligo-nukleotidin C ja sen komplementin kokonaisvaikutus avoi-10 meen lukuraamiin UL26 oli se, että UL26:een tuli kaksi ylimääräistä aminohappoa sen autenttisen karboksipään aminohapon ja sen lopetuskodonin väliin, joita uusia aminohappoja kooditti uusi muodostettu Pmll-tunnistussekvenssi. Plasmidi R (pRB4148) saatiin insertoimalla sekvenssi C 15 plasmidin E (pRB4093) Pmll-kohtaan ja plasmidi S (pRB4185) saatiin insertoimalla oligonukleotidi A komplementtinsa kanssa plasmidin R Pmll-kohtaan. Plasmidit T, U, V ja W (pRB4103, pRB4090, pRB4186 ja pRB4188) saatiin plasmideis-ta B ja S jatkokloonaamalla. Plasmidit X, Y ja Z (pRB4213, 20 pRB4214 ja pRB4215) rakennettiin insertoimalla avoimen lukukehyksen UL26 kanssa samaan lukukehykseen CMV-sekvenssin 3'-pään ja lopetuskodonin väliin joko sekvenssi, joka koodittaa 256 aminohappoa, jotka muodostavat stafylokokin proteiini A.-n IgG:tä sitovien domeenien viittä homologia, 25 tai sekvenssi, joka koodittaa 129 aminohappoa muodostaen kaksi sellaista domeenia. Nämä sekvenssit olivat proteiini A -geenin fuusiovektorin pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) BclI-HincII-fragmentti ja Hindlll-HincII-fragmentti, vastaavassa järjestyksessä. Vektori plasmideille T, U, V ja Y 30 saatiin plasmidista pGEM3Zf(+) (Promega, Madison, WI) ja ! näitä plasmideja voitiin käyttää templaatteina in vitro transkriptiossa T7 tai SP6-polymeraaseilla. Vektorit kaikille muille plasmideille saatiin plasmidista pUC18 (New England Biolabs, MA) . Kaikki plasmideissa olevat oligo-35 nukleotidisekvenssien A ja C insertiokohdat komplementtei- 41 104427 neen sekvenssoitiin sen varmistamiseksi, että CMV-epitoop-pi ja oligonukleotidin C koodittama aminohapposekvenssi komplementteineen olivat insertoituneet avoimen lukukehyksen Ul26 kanssa samaan lukukehykseen.
5 Rakenteet AA, BB, CC, DD ja MM valmistettiin inser- toimalla translaation lopetuskodoni plasmidiin pRB4060 ' Pmll-, Mstll-, BssHII- ja Hpal-kohtiin ja kohtaan, joka koodittaa ICP35-proteiinin translaation aloituskodonia, vastaavassa järjestyksessä. Rakenne NN rakennettiin dele-10 toimalla ICP35-proteiinin translaation aloituskohdan ja lopetuskodonin välinen sekvenssi. Plasmidiin pGEM3Zf(+) kloonattu BamHI Z -fragmenttiin liitetty avoin lukukehys Ul26 , joka muodosti plasmidin pRB4245, mutagenisoitiin saaden plasmidit II, JJ, KK, LL, HH ja GG, käyttäen apuna 15 Muta-Gene Kit -käyttöpakkausta (Bio-Rad) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tähän tarkoitukseen käytetyt 40-meeri-set oligonukleotidit syntetisoitiin Applied Biosystems 380B DNA -syntetisaattorilla. Plasmidit EE ja FF valmistettiin katkaisemalla rakenteet GG ja HH Xbal-entsyymillä ~ 20 ja ligoimalla uudelleen kiinni niin, että deletoitiin :
Ul26:n 10 ja 33 ensimmäistä aminohappoa, vastaavassa jär- :
jestyksessä. Kuviossa 1 käytetyt symbolit ovat seuraavat: I
Avoin nelikulmio: BamHI Z -fragmentti, jota käytettiin a4-promoottorin lähteenä ja joka insertoitiin sopivaan trans- r 25 kriptionaaliseen orientaatioon suhteessa avoimiin lukuke- r hyksiin 11,,26 ja UL26.5; täytetty soikio: 20 aminohapon pi- Ξ tuinen CMV-epitooppi, joka on kuvattu tässä; täytetty suo- r
rakulmio: DNA-sekvenssi, joka koodittaa proteiini A:n L
IgG:ia sitovaa domeenia; P*: uusi Pmll-kohta, joka muodos-30 tettiin yhdessä proteiini A:n IgGria sitovan domeenin in- sertion kanssa. Uudet translaation aloituskodonit, jotka s Φ _ muodostettiin in vitro -mutageneesillä. on merkitty merkillä "ATG". Täytetyt kolmiot edustavat insertoitua lope-tuskodonia. Restriktioendonukleaasikohdat on lyhennetty " 35 seuraavasti: B, BamHI; Ba, Ball; Bs, BatEII; E, EcoNI; H, 42 1 0 4 4 2 7
HpaI/ K, Kpnl; Ms, Mstll; P, Pmll; Ps, PstI; S, Sali; X, Xcml. Me edustaa avoimen lukukehyksen UL26.5 translaation metioniinin aloituskodonia.
Restriktioendonukleaasikartta on piirretty mitta-5 kaavaan kuvion 1 rivillä 9 viitaten riveihin A - Z, jotka ovat kaavamaisia esityksiä HSV-l-sekvensseistä, jotka sisältyvät tässä kuvatuissa tutkimuksissa käytettyihin plas-midirakenteisiin.
Esimerkki 2 10 Plasmidien käyttö viruskomponenttien eristämiseksi ja puhdistamiseksi
Isäntäsolut transfektoitiin kuvion 1 plasmidiraken-teilla. Lisäksi proteaasi syntetisoitiin in vitro kanin retikulosyyttilysaattisysteemissä plasmidien kanssa. Va-15 lokuvia polypeptideistä, jotka saatiin soluista, jotka oli transfektoitu plasmidirakenteilla ja superinfektoitu viruksella, jotka valokuvat otettiin sen jälkeen, kun poly-peptidit oli erotettu elektroforeettisesti polyakryyli-amidigeeleissä, siirretty sähköisesti nitroselluloosamem-^ 20 braanille ja annettu reagoida vuohen peroksidaasiin liite tyn anti-hiiri-immunoglobuliinivasta-aineen kanssa, käytettiin analysoitaessa niitä nukleiinihapposekvenssejä, ^ jotka ovat vastuussa infektiomekanismeista. Polypeptidi- puhdistusten yksityiskohtaiset koejärjestelyt on kuvattu 1 .· 25 materiaalit ja menetelmät -osassa.
Rakenteita MM ja NN käytettiin määritettäessä, ovatko mitkään ICP35-proteiinia koodittavat sekvenssit proteaasissa elintärkeitä ICP35-proteiinin katkeamiselle.
Esimerkki 3 30 Transkriptyöyksikköjen analyysi • UL26 :n nukleotidisekvenssien havaittiin yllättävästi ja odottamattomasti olevan kahdessa transkriptioyksikössä. - Valmistettiin kaksi koetinta UL26:n transkriptien kartoit tamiseksi. Koetin 1, joka suunniteltiin tunnistamaan UL26 35 mRNAtn 5'-pää, sisälsi BamHI-kohtaan leimatun EcoNI-BamHI- l 4 Ί 43 1 0 4 4 2 7 fragmentin, kun taas koetin 2 sisälsi BstEII-kohtaan leimatun XcmI-BstEII-fragmentin.
DNA-koettimen 1 (A) ja koettimen 2 (B), jotka hyb-ridisoituivat valeinfektoitujen ja 12 tuntia infektoitujen 5 Vero-solujen sytoplasmiseen kokonais-RNA:hän ja jotka di-gestoitiin Sl-nukleaasilla, autoradiografiset kuvat on ' esitetty kuviossa 3. RNA:t valmistettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät -osassa. Kuvion 3 kaistassa 1 (PS) Sl-nukleaasilla digestoitu koetin 1 on samoissa hyb-10 ridisaatio- ja digestio-olosuhteissa kuin ne, jotka on esitetty kaistoissa MOCK ja HSV-1.
Kaistat 2 ja 8 (MOCK) esittävät RNA:n, joka on eristetty soluista 12 tuntia valeinfektion jälkeen. Kaistat 3 ja 9 (HSV-1) esittävät RNA:n, joka on eristetty so-15 luista, jotka on infektoitu HSV-l-viruksella (F) ja ylläpidetty 12 tuntia.
Kaistat 4 ja 7 (P) osoittavat digeroimattomien koettimien (koetin 1 tai 2) kohdat.
Kaistat 5 ja 7 (M) edustavat 5'-päähän leimattuja 20 fragmentteja, jotka on saatu digestoimalla plasmidin ’ pGEM3Z DNA MspI-entsyymillä.
Nuolet kuviossa 3 edustavat suojattuja UL26:n (A) ja [ UL26.5:n (B) RNA:den 5'-päitä. T on niiden HSV-l-sek- venssien kohta koettimessa 2, jotka on suojattu UL26 25 RNA:11a.
Kuviossa 3 kuvattujen Sl-analyysitulosten mukaan koettimeen hybridisoitunut sytoplasminen RNA suojaa noin i 300 nukleotidin pituisen fragmentin (kaista 3).
Nukleotidi 300 ylävirtaan BamHI-kohdasta merkittiin 30 UL26:n kohdaksi +1. Ensimmäinen metioniinikodoni tämän ar- I
I, vioidun transkription aloituskohdan jälkeen on kohdassa ^ +180. ...........-........
Koettimeen 2 hybridisoitunut sytoplasminen RNA muodosti kaksi Sl-digestiolta suojattua fragmenttiryhmää Ξ 35 (kaista 9) . Ensimmäinen fragmentti sisälsi kaikki HSV-1- „ 104427 44 viruksen DNA-sekvenssit (rintama T) . Toinen suojattujen fragmenttien ryhmä muodosti useita rintamia, jotka olivat pituudeltaan 35 - 40 nukleotidia (kaista 2, rintama Ul26.5). Näin ollen tämän transkriptin transkription aloi-5 tuskohta oli nukleotidikohdassa noin +1 000 suhteessa
Ul26:n nukleotidiin +1. Ensimmäinen metioniinikodoni tämän RNA:n transkription aloituskohdasta alavirtaan on kohdassa +1 099. Pidemmälle RNA:lie annettiin nimi UL26.
Esimerkki 4 10 ICP35 geenin sijainti ja eristys ICP35-proteiinia spesifioivan geenin koodittavan domeenin sijainnin määrittämiseksi testattiin ryhmä avoimen lukukehyksen UL26 deleetioita niiden kyvyn suhteen eks-; pressoida ICP35-proteiinia.
15 BHK-solut transfektoitiin plasmidirakenteilla 0, N
ja P (kuvio 1) ja sitten infektoitiin HSV-2-viruksella (kuvio 4). Kuviossa 4 esitetyn geelin yllä olevat kirjaimet esittävät plasmidirakenteet, joilla solut transfektoitiin. Viiva tai kirjaimen poissaolo osoittaa, että solut 20 infektoitiin, mutta ei transfektoitu. Pystysuorat sarak- s keet esittävät hitaasti kulkevat rintamat. Lyhin fragmentti, joka muodosti ICP35-proteiinia, oli plasmidi E (kaista 2) . Koska tätä plasmidirakennetta ekspressoitiin sen sisäisestä promoottorista, tulokset osoittavat, että ; 25 Hpal-Pstl-fragmentin sisältämät sekvenssit sisältävät sekä koodittavan sekvenssin että promoottorin geenille, joka koodittaa ICP35-proteiinia. Plasmidi E sisältää kaikki Ul26.5 RNA:n sekvenssit ja lisäksi 168 nukleotidia.
Esimerkki 5 30 Avoimen lukukehyksen eristys ja karakterisointi
Kuvion 5 valokuva polypeptideistä, jotka uutettiin soluista, jotka oli transfektoitu plasmidirakenteilla ja s superinfektoitu viruksella, otettiin sen jälkeen, kun po- ^ lypeptidit oli elektroforeettisesti erotettu polyakryyli- 35 amidigeeleissä, siirretty sähköisesti nitroselluloosamem- i 45 104427 braaneille ja annettu reagoida monoklonaalisen vasta-aineen H725 (HSV-vasta-aine) tai CN28-2 (CMV-vasta-aine) kanssa. Geelin yllä olevat kirjaimet osoittavat plasmidi-rakenteet, joilla solut transfektoitiin. Viiva tai kirjai-5 men poissaolo osoittaa, että solut infektoitiin, mutta ei transfektoitu. Pystysuorat sarakkeet esittävät hitaasti ' kulkevat rintamat.
Kuvio 5 osoittaa, että BHK-solut, jotka transfektoitiin rakenteilla J, K tai L, muodostivat ryhmän prote-10 iineja, jotka reagoivat sekä monoklonaalisten anti-HSV-1 ICP35 (H725) että anti-CMV (CH28-2) -vasta-aineiden kanssa. Plasmidirakenteen L transfektiotuotteiden muodostamat neljä ominaista ICP35-rintamaa osoittavat, että ICP35-proteiinin metioniinialoituskodoni on kohdassa 15 1 099.
Nämä tulokset osoittavat, että UL26.5 koodittavat sekvenssit, jotka spesifioivat ICP35-proteiinia, ovat osa ul26:tta ja sen kanssa samassa lukukehyksessä. Aiemmassa : osassa osoitettiin, että ICP35-proteiinia voidaan ekspres-20 soida transaktivoimalla DNA-sekvenssit, jotka sisältyvät Γ
Hpal-Pstl-fragmenttiin. Koska plasmidirakenne E voidaan transaktivoida HSV-2-viruksella voidaan myös päätellä, 1 että UL26:n koodittavat sekvenssit sisältävät sekä koodittavat sekvenssit että promoottoridomeenin ICP35-proteiinia ^ • 25 spesifioivalle geenille.
Esimerkki 6
Anti-CMV-vasta-aineen käyttö
Valokuva polypeptideistä, jotka saatiin soluista, jotka oli transfektoitu plasmidirakenteilla ja superinfek-30 toitu HSV-l-viruksella, otettiin sen jälkeen, kun polypep- I
.· tidit oli erotettu elektroforeettisesti SDS-polyakryyli- * r amidigeeleissä, siirretty sähköisesti nitroselluloosamem-braaneille ja annettu reagoida monoklonaalisen vasta-aineen H725 (HSV-vasta-aine) tai CH28-2 (CMV-vasta-aine) 35 kanssa. Kuvion 6 geelin yllä olevat kirjaimet osoittavat 46 104427 plasmidirakenteet; joilla solut transfektoitiin. Viiva tai kirjaimen poissaolo osoittaa, että solut infektoitiin, mutta ei transfektoitu. Pystysuorat sarakkeet esittävät hitaasti kulkevat rintamat. Nämä tulokset osoittavat, että 5 monoklonaalisen anti-CMV-vasta-aineen käyttö poistaa tarpeen superinfektoida solu heterologisella viruksella. Esimerkki 7
Avoimen lukukehyksen UL26 tuotteen tunnistus, eristys ja karakterisointi 10 Kuvio 7 esittää autoradiografisiä kuvia ja valoku van polypeptideistä BHK-soluista, jotka transfektoitiin plasmidirakenteilla ja superinfektoitiin viruksella, jotka kuvat otettiin sen jälkeen, kun solut oli elektroforeet-tisesti erotettu polyakryyliamidigeeleissä, siirretty säh-15 köisesti nitroselluloosamembraaneille ja annettu reagoida monoklonaalisen vasta-aineen H725 (HSV-vasta-aine) tai CN28-2 (CMV-vasta-aine) kanssa. Geelin yllä olevat kirjaimet osoittavat plasmidirakenteet, joilla solut transfektoitiin. Pystysuora sarake ja nuoli osoittavat UL26-pro-: 20 teiinituotteen.
Kuvion 7 kaistat 1, 2 ja 3 ovat autoradiografiset kuvat proteiineista, jotka oli leimattu 35S-metioniinilla, kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät -osassa. HSV- 2-viruksen infektoiman solun proteiinit (ICP:t) numeroi-" 25 tiin Morse et ai. (1978) esityksen mukaisesti.
Kaistat 8, 9 ja 10 esittävät samojen solujen, jotka on esitetty kaistoissa 4, 5 ja 6, lysaatit, jotka on värjätty vasta-aineella H725 mieluummin kuin monoklonaalisel-la vasta-aineella CH28-2.
30 Kaista 7 esittää solulysaatit, jotka on transfek- , .· toitu plasmidirakenteella J, jossa UL26:tta säätelee a4- promoottori, infektoitu HSV-l-viruksella (F) ja ylläpidetty 39 °C:ssa. Näissä olosuhteissa ekspressoidaan ainoastaan muutamia a-ja β-proteiineja, mutta HSV-1-viruksen (F) 35 ICP35-proteiineja ei ekspressoida. HSV-1-viruksen (F) vi- i -4· 47 104427 rusgenomin ICP35-proteiinia ei ekspressoida. Plasmidira-kenteen koodittamaa ICP35-proteiinia ekspressoidaan, koska transfektoitua geeniä säädellään kuin β-geeniä.
Aiemmissa osissa osoitettiin, että ICP35-proteiinia 5 koodittavat sekvenssit menevät päällekkäin ainoastaan osittain sellaisen sekvenssin kanssa, jota merkitään avoimena lukukehyksenä UL26. Seuraavissa osissa esitettyjen tutkimusten tarkoituksena oli tunnistaa täyspitkän avoimen lukukehyksen UL26 tuote. BHK-solut transfektoitiin plasmi-10 dirakenteilla O, N tai P (kuvio l) ja sitten infektoitiin HSV-2-viruksella. Plasmideilla O, N ja P transfektoitujen solujen elektroforeettisesti erotettujen proteiinien annettiin reagoida joko HSV-l-virusta (H725) tai CMV-virusta (CH28-2) vastaan olevien monoklonaalisten vasta-aineiden 15 kanssa (kuvio 7, kaistat 4 - 6 ja 8 - 10) ja sitten auto-radiografoitiin molekyylipainomerkkien aikaansaamiseksi (kaistat 1 - 3) . Tulosten silmäänpistävät ominaisuudet ovat seuraavat:
(1) Plasmidirakenteet O ja P, jotka sisältävät CMV-20 epitoopin insertoituna samaan lukukehykseen UL26:n kanssa, spesifioivat proteiineja, jotka muodostivat kaksi rintamaa, joiden elektroforeettiset liikkuvuudet olivat suunnilleen samat kuin proteiinien, joiden molekyylipainot olivat 75 000 - 78 000 (kuvio 7, kaistat 4 ja 6) . Mono-; 25 klonaalinen CMV-vasta-aine ei reagoinut plasmidien O ja P
tuottamien ICP35 rintamien kanssa (kaistat 4 ja 6) . CMV-epitooppi insertoitiin Hpal-restriktioendonukleaasikohtaan - (+832), se tarkoittaa, ennen kohdassa +1 099 olevaa ICP35-proteiinin translaation aloituskohtaa.
30 (2) Kaikki plasmidirakenteet muodostivat ICP35-pro- teiinia, joka reagoi HSV-1-viruksen ICP35-proteiinia vas-taan olevan monoklonaalisen vasta-aineen H725 kanssa. Erot plasmidirakenteiden N ja P muodostamien ICP35-proteiinien r elektroforeettisessa liikkuvuudessa heijastavat sellaisen 48 104427 oligonukleotidin insertiota plasmidirakenteeseen N, joka oligonukleotidi koodittaa 21 ylimääräistä aminohappoa.
(3) Koko avoimen lukukehyksen UL26 spesifioimien proteiinien runsaus verrattuna ICP35-proteiinin runsauteen 5 voidaan päätellä siitä havainnosta, että samalla kun mo-lekyylipainoltaan 75 000 - 78 000 olevat proteiinit ja ICP35-proteiinit reagoivat saman monoklonaalisen vasta-aineen CH28-2 kanssa, suuremman proteiinin reaktiivisuus tai määrä on huomattavasti pienempi kuin ICP35-proteiinin 10 vastaava.
Voimakas todiste, että näillä kahdella proteiinilla on samoja aminohapposekvenssejä perustuu siihen havaintoon, että rakenne J sellaisissa olosuhteissa, joissa tuotetaan ylimäärin UL26-proteiineja, tuottaa proteiineja, 15 jotka kulkevat yhdessä sekä suuremman proteiinin että ICP35-proteiinin kanssa ja reagoivat monoklonaalisen vas ta-aineen CH28-2 kanssa (nuoli, kuvio 7, kaista 7).
Esimerkki 8
Ut26 ja Ul26.5 proteiinien karakterisointi 20 Kuviossa 8 on esitetty autoradiografinen kuva 35S- metioniinilla leimatuista polypeptideistä, jotka on trans-loitu nukleaasilla käsitellyssä kanin retikuloryyttilysaa-tissa ja erotettu elektroforeettisesti 9,5 % denaturoivassa polyakryyliamidigeelissä.
• 25 Kaistassa 1 on translaatiotuotteet kattaramosaiik- kiviruksen templaateista, jotka ovat mukana käyttöpakkauk-sessa, joka hankittiin Promega Biotec'lta, WI, valmistajan ohjeiden mukaisesti transkriptoituina. Kaista 2 esittää translaatiotuotteet plasmidin U avoimesta lukukehyksestä 30 Ul26. Kaista 3 esittää translaatiotuotteen plasmidin T .· avoimesta lukukehyksestä UL26.5. Nämä tulokset osoittivat, että 11^26 ja UL26.5 spesifioivat proteiineja, joista kukin muodostaa kaksoisrintamat, joiden molekyylipainot ovat 80 000 kd (Pra) ja 45 000 (ICP35 d ja c) , vastaavassa jär- 35 jestyksessä.
n 3 "n 49 104427
Esimerkki 9 UL26:n geenituotetta tarvitaan prosessoimaan ICP35 c- ja d-proteiinit e ja £ -proteiineiksi trans-ase-massa 5 Kuviossa 9 on esitetty valokuva elektroforeettises- ti erotetuista polypeptideistä, jotka on saatu BHK-soluis-ta, jotka on transfektoitu plasmidirakenteilla ja super-infektoitu HSV-l-viruksella (F) joko 34 °C:ssa (34 °C) tai 39 °C:ssa (39 °C) , erotettu elektroforeettisesti polyak-10 ryyliamidigeeleissä, siirretty sähköisesti nitroselluloo-samembraanille ja annettu reagoida HSV-1-viruksen ICP35-proteiinia vastaan olevan monoklonaalisen vasta-aineen H725 (HSV-vasta-aine) kanssa ja värjätty peroksidaasiin liitetyn vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-aineen kanssa. Yksi-15 tyiskohtaiset koejärjestelyt on esitetty materiaalit ja menetelmät -osassa. Geelin yllä olevat kirjaimet osoittavat plasmidirakenteet, joilla solut transfektoitiin. Viiva osoittaa, että solut infektoitiin, mutta ei transfektoitu.
Sivussa olevat kirjaimet merkittiin ICP-proteiinin eri 20 lajien erottamiseksi Braun et ai. (1984) mukaan.
ICP35-rintamat e ja f ovat rintamien c ja d proteiinien katkaisutuotteita. Rintamissa c', d', e' ja f' kulkevat proteiinit sisältävät CMV-epitoopin ja sen vuoksi kulkevat hitaammin kuin autenttiset proteiinit rintamissa ; 25 c,d,ejaf, vastaavassa järjestyksessä.
Aiemmat kokeet antoivat ehdottaa, että ICP35 c- ja d-proteiinit olivat ICP35 e- ja f-proteiinien esiasteita "
(Braun et ai., 1984; Preston et ai., 1983). Tämän hypotee- T
sin testaamiseksi BHK-solut transfektoitiin plasmidilla E, ~ 30 joka sisältää UL26.5 geenin (kuvio 1) ja superinfektoitiin ~ HSV-l-viruksella (F) 39 °C:ssa. Tämä virus on lämpöherkkä ” ja 39 °C:ssa ei ekspressoi omia avoimia lukukehyksiä UL26 ~
ja Ul26.5. Tulokset (kuvio 10) osoittavat seuraavaa: I
(1) Viruksen genomissa olevaa ICP35-geeniä ekspres- ~ 35 soitiin 34 °C:ssa (kaista 1), mutta ei 39 °C:ssa (kaista so 104427 2), josta todistuksena oli ICP35-proteiinia vastaan olevan monoklonaalisen vasta-aineen H725 kanssa reagoivien ICP35-rintamien läsnäolo ja poissaolo, vastaavassa järjestyksessä.
5 (2) ICP35 c- ja d-proteiinit olivat ainoat kaksi ICP35-proteiinia, jotka ekspressoituivat plasmidin E yhdestä lukukehyksestä 39 °C:ssa (kaista 4), kun taas ainakin ICP35 c-, d-, e- ja f-proteiinit voitiin tunnistaa tuottavasti infektoitujen solujen, joita ylläpidettiin 10 34 °C:ssa (kaista 1), lysaateissa.
Nämä tulokset johtivat päätelmään, että: (a) ICP35 c- ja d-proteiinit ovat ICP35-proteiinien prosessoimattornia muotoja; että (b) ne voidaan prosessoida ICP35 e- ja f-proteii- 15 neiksi, ja että (c) prosessointi vaatii trans-asemassa toimivan tekijän, koska prosessointia ei tapahtunut HSV-l-viruksen (F) myöhäisen geeniekspression poissaollessa.
Esimerkki 10 20 Ul26 voi toimia trans-asemassa prosessoiden ICP35 c-ja d-proteiinit ICP35 e- ja f-proteiineiksi ja Ut26 on kykenevä ja ainoa viruksen proteiini, joka tarvitaan ICP35 c- ja d-proteiinien prosessomiseksi ICP35 e- ja f-proteiineiksi • 25 Sen määrittämiseksi, toimiiko UL26 trans- vai cis- asemassa, BHK-solut transfektoitiin plasmidilla N, jota käytettiin prosessointisubstraattina, ja sarjalla plasmi-deja, jotka sisälsivät deleetioita avoimessa lukukehyksessä Ul26, infektoitiin HSV-l-viruksella (F) ja ylläpidettiin 30 39 eC:ssa. Tulokset (kuvio 10A) osoittivat seuraavaa: (i) ICP35 c- ja d-proteiinit eivät autokatalysoi-neet prosessointiaan ICP35 e- ja f-proteiineiksi, koska = solujen lysaatit, jotka oli transfektoitu yhdessä plasmi- dien N ja E (kuvio 1) kanssa, eivät sisältäneet ICP35 e- 104427
DX
ja f-proteiineja, jotka olivat reaktiivisia monoklonaali-sen CMV-vasta-aineen kanssa (kaista 8).
(ii) ICP35 c- ja d-proteiineja ei prosessoitu BHK-soluissa, jotka oli transfektoitu yhdessä plasmidien N ja 5 C tai I (kaistat 7 ja 6) kanssa. Plasmidit C ja I sisältävät deleetiot avoimen lukukehyksen UL26 promoottorialu-' eella ja polyadenylaatiokohdassa, vastaavassa järjestyk sessä (kuvio 1).
(iii) ICP35 c- ja d-proteiinit prosessoitiin ICP35 10 e- ja f-proteiineiksi BHK-soluissa, jotka oli transfektoitu yhdessä plasmidien N ja A tai B kanssa. Plasmidit A ja B sisältävät koskemattoman UL26-promoottorin ja avoimen lukukehyksen ja UL26 koodittavaa sekvenssiä säätelee cc4-promoottori, vastaavassa järjestyksessä (kaistat 5 ja 4).
15 HSV-1-viruksessa (F) oleva transdusoiva a-faktori indusoi a4-promoottorin korkealle tasolle 3 9 °C:ssa. UL26:n korkean tason ekspressio voi selittää ICP35-proteiinin prosessoitujen muotojen (muodot e ja f) läsnäolon sellaisten solujen lysaateissa, jotka on transfektoitu yhdessä plasmidien 20 N ja B kanssa (kaista 4).
Tulokset osoittavat, että UL26 koodittaa proteiinia, ~ joka ottaa osaa ICP35 c- ja d-proteiinien prosessoimiseen ICP35 e- ja f-proteiineiksi.
Sen määrittämiseksi, onko UL26 ainoa viruksen pro-; 25 teiini, joka tarvitaan tähän prosessointiin ja sen mah dollisuuden poissulkemiseksi, että viruksen geenit, jotka ekspressoituvat HSV-1-genomista (F) 39 °C:ssa, ottavat osaa lCP35-proteiinin katalyysiin, BHK-solut transfektoi-tiin yhdessä vakiomäärän kanssa plasmidia L ja erilaisten 30 määrien kanssa plasmidia B käyttäen näitä geeneinä, jotka tuottivat prosessointisubstraatin ja -entsyymin, vastaavassa järjestyksessä. Plasmidissa L (kuvio 1) avointa lukukehystä UL26.5 säädeltiin a4-promoottorilla ja CMV-epi-tooppi insertoitiin Mstll-restriktioendonukleaasikohtaan, 35 kun taas plasmidi B sisälsi koskemattoman avoimen lukuke- 52 104427 hyksen ^26, jota säädeltiin samalla promoottorilla. Koska <x4-promoottori on vahva eukaryoottinen promoottori, jota ekspressoidaan konstitutiivisesti transfektoiduissa soluissa (Kristie & Roizman, 1991; Post et ai., 1981), UL26.5-5 ja Ul26-proteiinien ekspressio soluissa, jotka oli trans-fektoitu plasmideilla L ja B, ei tarvinnut superinfektioi-ta HSV-l-viruksella (F). Tulokset (kuvio 10B) olivat seu-raavat: (i) Virusinfektion poissa ollessa ICP35 c- ja 10 d-proteiinit olivat ainoat kaksi lajia, joita plasmidilla L transfektoidut solut ekspressoivat (kaista 17). Epitoop-pisesti merkitty ICP35, jota ekspressoi plasmidi L, prosessoitiin täydellisesti soluissa, jotka superinfektoitiin HSV-l-viruksella (F) sallivassa lämpötilassa (kaista 18).
15 Kuten oli odotettua, plasmidi B ei tuottanut tuotteita, jotka olisivat reagoineet anti-CMV-vasta-aineen kanssa (kaista 11).
(ii) UL26:n sisältävän plasmidin B läsnä ollessa plasmidin L ekspressoimat epitooppisesti merkityt ICP35 c- 20 ja d-proteiinit prosessoitiin ICP35 e- ja f-proteiineiksi. Alhaisilla plasmidin B konsentraatioilla ICP35 e- ja " f-proteiinien akkumulaatioaste oli suoraan verrannollinen plasmidin L kanssa BHK-soluihin yhdessä transfektoidun Ul26-plasmidin DNA:n määrän kanssa (kaistat 12 ja 16) . Pie-V 25 nentyminen ICP35 e- ja f-proteiinien määrissä, joka havaittiin silloin, kun läsnä oli korkeimmat määrät plasmi-dia B, voi heijastaa näiden kahden plasmidin välistä kilpailua tai alentunutta saantoa, joka johtuu korkeiden DNA-määrien myrkyllisyydestä.
30 Näiden tutkimusten päätelmä on se, että UL26:n tuote on ainoa viruksen tekijä, joka on sekä kykenevä että riit-tävä prosessoimaan ICP35 c- ja d-proteiinit ICP35 e- ja = f-proteiineiksi.
i 53 104427
Esimerkki 11
Proteaasi vaikuttaa karboksipään katkaisuun
Kuviossa 11 on esitetty valokuva polypeptideistä, jotka ovat peräisin soluista, jotka on transfektoitu plas- r 5 mideilla ja joko valeinfektoitu tai superinfektoitu HSV-1-viruksella (F) (HSV-1) tai HSV-2-viruksella (G) (HSV-2) joko 34 °C:ssa (34 °C, kaistat 1 ja 4), 39 °C:ssa (39 °C, kaistat 2 ja 5) tai 37 °C:ssa (37 °C, kaistat 3 ja 6 - 14), jotka polypeptidit on erotettu elektroforeettisesti 10 denaturoivissa polyakryyliamidigeeleissä, siirretty säh köisesti nitroselluloosamembraanille, annettu reagoida monoklonaalisen vasta-aineen H725 (HSV-vasta-aine) tai CH28-2 (CMV-vasta-aine) kanssa ja värjätty peroksidaasiin [ liitetyn vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-aineen kanssa. Geelin 15 yllä olevat kirjaimet osoittavat plasmidirakenteet, joilla ‘ solut transfektoitiin. Viiva osoittaa, että solut infek-toitiin, mutta ei transfektoitu.
Toinen näkökanta on proteaasin katkaisutyyppi.
ICP35 c- ja d-proteiinien prosenssointi e- ja f-prote-20 iineiksi sisältää karboksipään proteolyyttisen katkaisun.
Plasmidin N spesifloimien ICP35 e- ja f-proteii-nien, jotka kulkivat denaturoivissa geeleissä yhtä aikaa HSV-1-infektoiduissa soluissa tuotettujen ICP35 c- ja d-proteiinien kanssa (kuvio 10, paneeli A, kaistat 1 ja r ’ 25 5), voidaan päätellä, että se osa ICP35-proteiinista, joka katkaistiin prosessoinnin aikana, on suurin piirtein samankokoinen kuin plasmidiin N insertoidun CMV:n aminohapposekvenssin koko. Sen määrittämiseksi, sisältääkö ICP35- ‘ . proteiinin prosessointi karboksipään proteolyyttisen kat- ^ 30 kaisun, BHK-solut transfektoitiin plasmideilla J, R, S ja .· W ja superinfektoitiin HSV-2-viruksella. Plasmidi R sisäl si CMV-epitoopin (sekvenssi A) insertoituna UL26.5:den Pmll-kohtaan, kun taas plasmideissa S ja W insertti oli karboksipään aminohapossa. Elektroforeettisesti erotettu- : 35 jen, sähköisesti siirrettyjen polypeptidien analyysit mo- ” 54 104427 noklonaalisilla anti-HSV-1 (H725) ja anti-CMV (CH28-2) -vasta-aineilla paljastivat seuraavaa (kuvio 11): (1) Solut, jotka transfektoitiin plasmidilla J, jossa CMV-epitooppi oli insertoitu Mstll-kohtaan 122 ami- 5 nohappoa ylävirtaan UL26:n lopetuskodonista, tekivät sekä esiastemuotoja ICP35 c ja d kuin myös tuotteita ICP35 e ja f, jotka reagoivat CMV-vasta-aineen kanssa (kaista 8) . Alentuminen ICP35 c-, d-, e- ja f-proteiinien elektrofo-reettisessa liikkuvuudessa suhteessa villityypin proteii-10 neihin vastaa kohoamista molekyylipainossa johtuen CMV-epitoopin insertiosta.
(2) Ainoastaan ICP35 c- ja d-proteiineja tehtiin soluissa, jotka oli transfektoitu plasmidilla Q (kaistat 3 ja 6) , Tässä plasmidissa CMV-epitooppi oli insertoitu 15 Ul26:n Pmll-kohtaan, joka on 21 aminohappoa ylävirtaan UL26.5:n lopetuskodonista. ICP35 c- ja d-muotojen tunnistus perustui siihen havaintoon, että ne kulkivat yhdessä vastaavien muotojen kanssa, joita spesifioi plasmidi L, joka ekspressoi ainoastaan ICP35 c- ja d-proteiineja transfek-20 toiduissa soluissa (kuvio 10, paneeli B, kaista 17).
(3) Sekvenssin C insertio plasmidin R Pmll-restrik-tioendonukleaasikohtaan tuhosi tämän kohdan ja muodosti uuden Pmll-katkaisukohdan UL26:n karboksipään aminohapon ja lopetuskodonin väliin muuttamatta UL26:n tai UL26.5:n ; 25 aminohapposekvenssejä. Monoklonaalisella H725 vasta-ai neella tunnistetut ICP35 c-, d-, e- ja f-proteiinit kulkivat yhdessä autenttisten proteiinien (kaista 11) kanssa osoittaen, että sekvenssin C insertiolla ei ollut mitään vaikutusta ICP35-proteiinin ekspressioon ja prosessoin-30 tiin.
(4) Plasmideissa S ja W CMV-epitooppi oli inser- toitu plasmidin R uuteen Pmll-kohtaan UL26.5:den karboksi-päässä. Solut, jotka oli transfektoitu näillä plasmideil-la, akkumuloivat ICP35 c-, d-, e- ja f-proteiineja, jotka 35 olivat reaktiivisia monoklonaalisen HSV-1 H725 -vasta-ai- · « 104427 55 neen kanssa (kaistat 10, 14), mutta ainoastaan ICP35 c- ja d-muodot reagoivat monoklonaalisen CMV CH28-2 -vasta-aineen kanssa (kaistat 9, 14). Merkittävä havainto on, että kun plasmidin S ICP35 c- ja d-muodot kulkivat vastaavien 5 plasmidin J-muotojen kanssa yhtä aikaa, se on, ne olivat 21 aminohappoa pidempiä kuin villityyppi, ICP35 e- ja ’ f-muodot osoittaen, että insertoitu CMV-epitooppia koodit- tava aminohapposekvenssi oli poistettu (kaistat 9 ja 10).
Plasmidin W spesifioimat tuotteet käyttäytyivät samalla 10 tavalla (kuvio 11). Plasmidin W spesifioimat ICP35 e- ja f-proteiinit olivat runsaampia kuin ne, joita spesifioivat plasmidit S ja R mahdollisesti, koska plasmidissa W koko avoin lukukehys UL26 oli uudelleenjärjestetty ja enemmän proteiinituotetta ekspressoitui ja oli käytettävissä 15 ICP35-proteiinin prosessoimiseksi.
ICP35-proteiinin esiasteproteiinin katkaisu tapahtuu noin 20 aminohapon päässä karboksipään kodonista. Todisteet tälle päätelmälle olivat ne, että: : (1) CMV-epitoopin insertoiminen 21 aminohapon pää-20 hän päästä häiritsi katkaisua, kun taas epitoopin insertio karboksipäähän antoi katkaisun tapahtua; (2) ICP35 e’- ja f'-proteiinien (CMV-epitoopin kanssa) ja ICP35 c- ja d-proteiinien kulku yhdessä. Yhteiskulku si- " joittaa CMV-insertion sisältämät e- ja f-muodot suunnil-25 leen samaan geelikohtaan kuin c- ja d-muodot autenttisessa : proteaasissa.
Odottamaton samankaltaisuus katkaisumekanismeissa, joita käytetään tuottamaan ICP35-alayksiköt ja autoproses-soitaessa UL26 proteaasi oli se, että molempiin ottaa osaa 30 karboksipään proteolyyttinen katkaisu. Aiemmissa osissa . osoitettiin, että UL26 on ainoa viruksen tekijä, joka on Ξ * *. Γ vastuussa ICP35-proteiinin karboksipään proteolyyttisestä prosessoinnista. Proteaasia koodittava UL26 ja ICP35-proteiinia koodittava UL26.5 jakavat myös saman karboksipään f 35 aminohapposekvenssin. Mahdollisuus, että UL26 katkaisee Γ 56 104427 itsensä, tuli siitä havainnosta, että plasmidilla P (kuvio 1) transfektoidut ja HSV-l-viruksella (F) joko 34 °C:ssa tai 39 °C:ssa superinfektoidut BHK-solut ekspressoivat UL26:n kaksoisrintaman (kuvio 11, kaistat 4 ja 5), joka 5 reagoi monoklonaalisen CH28-2-vasta-aineen kanssa. Tämä havainto ehdotti sellaisen mahdollisuuden olemassaolon, että Ul26 voi katalysoida oman katkaisunsa, koska HSV-1-virus (F) ekspressoi pääasiassa a-geenejä 39 °C:ssa.
Esimerkki 12 10 Proteaasi katkaisee itsensä
Kuviossa 12 on esitetty autoradiografinen kuva 35S-metioniinilla leimatuista polypeptideistä, joita avoin lukukehys UL26 koodittaa, jotka on erotettu elektroforeet-tisesti denaturoivassa polyakryyliamidigeelissä. Plasmi-’ 15 deissa U ja V (kuvio 1) oleva avoin lukukehys UL26 trans- kriptoitiin in vitro ja transloitiin nukleaasilla käsitel-: lyssä kanin retikulosyyttilysaatissa. Esitetyt kaistat edustavat aikapisteitä, jolloin translaatioseoksesta poistettiin näytteet 10, 20, 90 ja 360 minuutin kohdalla 20 translaation aloituksen jälkeen. Näytteissä, jotka on esitetty kaistoissa 4 - 7 ja 12 - 15, translaatioseokseen lisättiin sykloheksimidiä 10 minuuttia translaation aloituksen jälkeen lisätranslaation inhiboimiseksi. Kaistojen 1-3 tapauksissa translaatioseosta laimennettiin 10 mi-25 nuuttia translaation aloituksen jälkeen 10-kertaisesti fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi sykloheksimidiä (100 μg/ml).
Lisätodiste siitä, että UL26 voi katalysoida omaa
katkaisuaan, tuli in vitro -kokeista. Plasmideista U tai V
30 (kuvio 1} in vitro T7- tai SP6 RNA -polymeraasilla trans-
kriptoitu RNA transloitiin nukleaasilla käsitellyssä kanin • T
retikulosyyttilysaatissa 35S-metioniinin läsnä ollessa. Translaatioreaktioiden elektroforeettisesti erotettujen tuotteiden analyysit olivat seuraavat (kuvio 12): 57 104427 (1) Plasmidin U translaatiotuotteiden inkubointi sykloheksimidin läsnä ollessa johti asteittaiseen UL26 proteiinin katkaisutuotteen (Prb) akkumuloitumiseen. Ak-kumuloituneen katkaisutuotteen määrä oli verrannollinen 5 inkubaatioaikaan (kaistat 16 - 19) .
(2) Samanlaiset tulokset saatiin plasmidin V trans- ’ laatiotuotteilla. Tämän kokeen merkittävyys juontaa juu rensa CMV-epitoopin läsnäolosta UL26:n karboksipäässä. Kuten odotettua, plasmidista V tehty UL26:n esiastemuoto 10 kulki hitaammin kuin autenttinen proteiini, joka oli peräisin plasmidista U. Kuitenkin plasmidin V syntetisoima UL26:n prosessoitu muoto kulki yhdessä plasmidin U tuottaman autenttisen proteiinin vastaavan kanssa osoittaen, että Ul26 autoprosenssointiin sisältyy karboksipään pro-15 teolyyttinen katkaisu.
Esimerkki 13 ICP35 c- ja d- ja Pra-proteiinien katkaisu on sekvenssispesifistä ja tapahtuu samalla kohdalla
Kuviossa 13 on esitetty autoradiografiset kuvat 20 (kuvio 13, paneeli A) ja valokuva polypeptideistä (kuvio 13, paneeli B), jotka on syntetisoitu in vitro joko sek- ^ vensseistä, joita koodittavat plasmidit U tai Y tai jotka sisältyvät sellaisten solujen lysaatteihin, jotka solut on transfektoitu plasmideilla X tai Z ja superinfektoitu HSV-. 25 1-viruksella (F) tai HSV-2-viruksella (G) . Xq vitro syn tetisoidut polypeptidit ja ne, jotka sisältyivät soluly-saatteihin, erotettiin elektroforeettisesti samassa denaturoivassa 12-%:isessa polyakryyliamidigeelissä, siirrettiin sähköisesti nitroselluloosamembraanille ja annettiin 9 30 reagoida ainoastaan piparjuuriperoksidaasiin liitetyn mo-noklonaalisen anti-hiiri-IgG-vasta-aineen (anti-IgG) kans- e' · sa tai yhdessä tämän anti-IgG-vasta-aineen ja monoklonaa-lisen H725 (HSV-vasta-aine) tai CH28-2 (CMV-vasta-aine) -vasta-aineen kanssa. Viiva osoittaa, että solut infektoi-35 tiin, mutta ei transfektoitu. Paneelissa A esitetyt poly- 58 104427 peptidit leimattiin 35S-metioniinilla. Rintamien nimitys oli seuraava: Kirjaimet c, d, e ja f ilman heittomerkkiä osoittavat avoimen lukukehyksen UL26.5 autenttiset ICP35-tuotteet. Pra ja Prb ovat avoimen lukukehyksen UL26 prote-5 aasituotteiden translaatioprosessointimuotoja. Kaksois- ja kolmoisheittomerkit osoittavat, että proteiini sisältää myös CMV-epitoopin ja sekvenssin, joka koodittaa stafylokokin proteiini A:n kahta ja viittä IgG:n sitomisdomeenia, vastaavassa järjestyksessä. PA" ja PA"' ovat ICP35 c- ja 10 d- ja Pra-proteiinien, jotka sisältävät CMV-epitoopin ja IgG:n sitomisdomeenin insertit, katkaisussa syntyneitä 1 karboksipään tuotteita.
ICP35 c- ja d- ja Pra-proteiinien katkaisu on sek-venssispesifistä ja ne tapahtuvat samalla kohdalla. Tässä 15 esitettyjen kokeiden tulokset antavat ehdottaa, että UL26:n ja UL26.5:n tuotteiden katkaisu/prosessointi tapahtuu kohdalla, joka on noin 18 - 25 aminohappoa proteiinien kar-boksipäästä. Sen osoittamiseksi, että näiden proteiinien prosessointi tapahtuu ennustetussa kohdassa, oli tarpeel-20 lista osoittaa katkaisureaktion molemmat tuotteet samassa i geelissä. Jotta molemmat tuotteet saatiin näkyviin, oli
tarpeellista insertoida ennustetun karboksipään koodattavaan sekvenssiin sekä monoklonaalisen CMV-vasta-aineen epitooppi että sekvenssit, jotka koodittavat stafylokokin Ϊ ' 25 proteiini A:n IgG:n sitomisdomeeneja. Plasmidit X ja Z
rakennettiin insertoimalla sekvenssit, jotka koodittavat 129 ja 256 aminohappoa, jotka sisältävät proteiini A:n kaksi ja viisi IgG:n sitomisdomeenia, vastaavassa järjestyksessä, lukukehykseen CMV-epitoopin 3'-pään ja UL26:n lo- , 3 0 petuskodonin väliin (kuvio 1) .
Tehtiin kaksi koetta. Ensimmäisessä HSV-1-viruksen plasmideissa U ja Y olevia avoimia lukukehyksiä transkrip-toitiin ja transloitiin kuusi tuntia. In vitro transloidut s proteiinit erotettiin sitten elektroforeettisesti denatu- 35 roivassa geelissä (kuvio 13, paneeli A). Toisessa kokeessa i ! 59 104427 BHK-solut transfektoitiin plasmideilla Z tai X ja sitten superinfektoitiin HSV-2-viruksella (G). Solulysaatit erotettiin elektroforeettisesti samassa geelissä kuin in vitro transloidut proteiinit, siirrettiin sähköisesti nitro-5 selluloosamembraanille ja annettiin reagoida CMV, HSV tai anti-IgG, joka sitoutuu proteiini A:n IgG:n sitomisdomee-* neihin, vasta-aineiden kanssa (kuvio 13, paneeli B) . Tu lokset olivat seuraavat: (i) Plasmidissa U olevien jji vitro transkriptoitu-10 jen ja transloitujen HSV-l-sekvenssien autokatalyyttinen prosessointi antoi odotetut proteiinirintamat, joita merkittiin nimillä Pra ja Prb. Samanlainen plasmidin Z tuotteiden autokatalyyttinen prosessointi antoi kolme rintamaa. Ensimmäinen rintama kulki hitaammin kuin autenttinen 15 Pra-esiasterintama, kuten voitiin odottaakin lisänä olevien proteiini A:n 256 aminohapon ja CMV-epitoopin 21 aminohapon läsnäolon vuoksi. Toinen rintama kulki yhdessä Prb-rintaman kanssa ja on sen vuoksi translaatiotuotteen autokatalyyttisen katkaisun tuote. Kolmas rintama kulki Γ 20 yhdessä alla kuvattujen rintamien kanssa ja reagoi CMV- vasta-aineen kuin myös anti-IgG-vasta-aineen kanssa. r
(ii) Plasmidin X odotetut translaatiotuotteet olivat ICP35 c ja d ja Pra. Voitiin odottaa, että plasmidin Z I
translaatiotuotteet olisivat samanlaisia paitsi, johtuen 25 pienemmistä proteiini A -sekvenssien inserteistä, nämä 1 proteiinit kulkisivat vastaavasti nopeammin kuin plasmidin X tuotteet. Näin todella tapahtui (vertaa kaistoja 3, 5 ja 2 8 kaistoihin 4, 6 ja 9). Voitiin myös ennustaa, että jos ICP35 c- ja d-proteiinien katkaisu tapahtuu odotetusti 20 30 aminohappoa autenttisen proteiinin karboksipäästä, kat- r .. kaisureaktion aminopään tuotteet kulkisivat yhdessä au- r tenttisen ICP35-proteiinin kanssa ja reagoisivat ainoas- : taan monoklonaalisen HSV-l-vasta-aineen kanssa. Näin todella tapahtui, koska plasmidien Z ja X tuottamat ICP35 e- ~ 35 ja f-proteiinit (kaistat 5 ja 6) kulkivat yhdessä autent- = 60 104427 tisten ICP35 e- ja f-proteiinien kanssa (kaista 7) ja olivat tunnistettavissa ainoastaan spesifisellä monoklonaali-sella HSV-l-vasta-aineella. Päinvastaisesti oli odotettavissa, että katkaisureaktion karboksipään tuotteet kulki-5 sivat niiden koon mukaisesti ja reagoisivat sekä anti-IgG-että CMV-vasta-aineiden kanssa. Kuten kuvion 7 paneelissa B on esitetty, plasmidilla X transfektoitujen solulysaat-tien anti-IgG-vasta-aineen kanssa reaktiiviset rintamat kulkivat hitaammin kuin vastaavat plasmidin Z rintamat.
10 Kuitenkin johtuen siitä, että kaikki karboksipään katkai-sutuotteet sisälsivät proteiini A:n IgG:n sitomisdomeenit, kaikkien proteiinituotteiden voitiin odottaa reagoivan IgG:n kanssa riippumatta immunoglobuliinin spesifisyydestä (esim. rintamat 5 ja 6) .
15 Koska molemmat tuotteet olivat havaittavissa, tu lokset osoittavat, että ICP35 c- ja d- ja Pra-proteiinit, jotka ovat UL26.5:n ja UL26:n tuotteita, vastaavassa järjestyksessä, prosessoidaan molemmat translationaalisesti katkaisulla. Koska molemmilla proteiineilla on yhteisiä 20 aminohapposekvenssejä koko ICP35 c- ja d-proteiinien pituudelta ja koska näiden kahden proteiinin katkaisutuot-teet kulkevat yhdessä, nämä kaksi proteiinia katkaistaan samoista kohdista. Lopuksi, avointen lukukehysten in vitro -translaatiotuotteet eroavat kaksoisrintamaksi. Kaksois-25 rintamat ovat erikoisen huomattavat ICP35-proteiinin tapauksessa (muodot c ja d) . Kaikissa tähän mennessä tehdyissä kokeissa, sisältäen kuviossa 11 esitetyt kokeet, katkaistun karboksipään tuote muodosti yhden rintaman.
Tämä havainto on johdonmukainen sen hypoteesin kanssa, , 30 että erot proteiineissa, jotka muodostavat kaksoisrin- taman, ovat proteiinien aminopäässä mieluummin kuin kar-• * boksipäässä.
61 104427
Esimerkki 14
Proteaasin ekspressiosysteemi testinä
Kuviossa 14 on esitetty autoradiografinen kuva avoimen lukukehyksen UL26 koodittamista 35S-leimatuista po- w \ 5 lypeptideistä, jotka on elektroforeettisesti erotettu denaturoivassa geelissä. Plasmideissa U ja Y oleva avoin lu-* kukehys UL26 (kuvio 1) transkriptoitiin in vitro ja trans- j
loitiin nukleaasilla käsitellyissä kanin retikulosyytti- I
lysaateissa. Esitetty kaista 1 edustaa osaa, joka on pois- :
10 tettu translaatioseoksesta aikapisteessä 360 minuuttia translaation aloituksesta. Esitetyt kaistat 2-5 edustavat osia, jotka on poistettu translaatioseoksesta joko I
aikapisteissä 10 minuuttia (0) tai 360 minuuttia (360) translaation aloituksesta. Kaistoissa 2-5 esitetyissä 15 näytteissä sama määrä translaatioseosta, jota käytettiin 10 minuutin aikapisteessä translaation jälkeen, laimennettiin 20-kertaisesti fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen, joka sisälsi sykloheksimidiä (100 μg/ml) ja joko natriumdodekyylisulfaattia (SDS) (0,4 %) (kaista 3) tai 20 fenyylimetaanisulfonyylifluoridia (PMSF) (500 μg/ml) (kai sta 4) .
Kuten kuviossa 14 on esitetty, PMSF kykeni inhiboi- ' maan osittain proteaasin oman katkaisun. Kaistassa 5 on esitetty normaalisti tapahtuva oma katkaisu. Kaistassa 3 ^ ; ' 25 on 100-%:inen inhibitio SDS:n avulla. Päätelmät kuviosta = 14 ovat ne, että 1) denaturoiva detergentti SDS inhiboi täydellisesti proteaasiaktiivisuuden (kaista 3) ; 2) pro-teaasi voi katkaista itsensä proteaasi-inhibiittorin pois- - sa ollessa; ja 3) seriiniproteaasi-inhibiittori PMSF ai- 2 30 heuttaa osittaisen proteaasin inhibition.
a m 62 1 0 4 4 2 7
Esimerkki 15
Proteaasiproteiinin domeenien karakterisointi
Proteaasiproteiinin ominaisuudet sisältävät: (i) se sisältää useita domeeneja, joita ei tarvita sen katalyyt-5 tiseen aktiivisuuteen ja (ii) aktiivinen kohta on lähellä proteaasin aminopäätä.
Koejärjestelyt, joita käytettiin noiden ominaisuuksien tutkimiseen, perustuivat kahteen havaintoon. Ensiksi ylimääräisten aminohapposekvenssien, jotka sisältävät sta-10 fylokokin proteiini A:n IgG:n sitomisdomeenit, insertio proteaasin karboksipäähän ei häiritse proteaasin omaa katkaisua, mutta tuottaa helposti tunnistettavan reaktiotuotteen. Toiseksi sekvenssin, joka koodittaa ihmisen sytome-galoviruksen monoklonaalisen vasta-aineen 20 aminohapon 15 pituista epitooppia, insertio lukukehykseen avoimien luku-j kehyksien UL26 ja UL26.5 koodittavien domeenien kanssa pal velee kahta tarkoitusta. Ensiksikin se toimii näiden avointen lukukehysten tuotteiden spesifisessä tunnistuksessa. Toiseksi, erottamalla proteaasin eri domeenit toi-20 sistaan, se toimii proteaasin sellaisten alueiden tunnistuksessa, joiden täytyy olla jatkuvia sen katalyyttistä toimintaa varten.
A. UL26-proteiinin toiminnallisten domeenien kuvaaminen 25 Proteaasidomeenien tutkimukseen käytettiin kolmea UL26-proteaasin mutanttisarjaa (taulukko I). Sarja 1 valmistettiin avointen lukukehysten UL26 ja UL26.5 kartoittamiseksi ja se sisälsi kolme UL26-geeniä, joihin insertoi-tiin lukukehykseen eri kohtiin DNA-sekvenssit, jotka koo-30 dittivat 20 aminohapon pituista CMV-epitooppia.
Toinen sarja sisälsi kymmenen UL26-geenirakennetta, joissa oli joko lopetuskodonit tai deleetiot, jotka ulottuivat geenin eri alueille (taulukko I).
Sarja 3 sisälsi kuusi UL26-geeniä, jotka sisälsivät 35 substituutiot ennustetuissa aminohapposekvensseissä alkaen 63 104427 aminohappoalueelta 7 - 215. Kuten seuraavissa osissa on kuvattu, UL26-geeniä kussakin näissä plasmideissa ekspres-soitiin «4-promoottorista. Proteaasin kohde oli tavallisesti Ul26.5-geeni, joka oli kloonattu plasmidiin L (kuvio 5 1) ja joka sisälsi CMV-epitoopin inserttinä lukukehykses sä. Poikkeukset, kloonit P ja J, sisälsivät UL26-geenin, ' joka sisälsi CMV-epitoopin joko molempien geenien UL26 ja
Ul26.5 koodittavassa sekvenssissä (plasmidi J) tai ainoastaan Ul26:n koodattavassa domeenissa (plasmidi P).
10 Tyypillisesti BHK-solut transfektoitiin plasmidilla L ja yhdellä plasmideista, joka kooditti proteaasia, ja superinfektoitiin HSV-l-viruksella (F) 39 °C:ssa. Soluly-saatit erotettiin elektroforeettisesti denaturoivissa geeleissä, siirrettiin sähköisesti nitroseluuloosamembraanil-15 le ja annettiin reagoida monoklonaalisen HSV-vasta-aineen : kanssa, joka reagoi kaikkien UL26.5:n tuotteiden kanssa, ja monoklonaalisen CMV-vasta-aineen CH28-2 kanssa, joka reagoi ainoastaan sellaisten Ul26.5 tuotteiden kanssa, jotka sisältävät CMV-epitoopin (katso kuvio 15) . Koska 20 HSV-1 (F) sisältää lämpöherkän mutaation o4-geeneissä, ” jotka spesifioivat pääasiallista HSV-1-viruksen säätely-proteiinia, se ei ekspressoi omaa UL26-proteaasiaan tai ~ substraattia 39 °C:ssa. α-geenin transindusoiva faktori (VP16) on kuitenkin toiminnallinen korkeammissa lämpöti-25 loissa (Post et ai., 1981; Batterson et ai., 1983) ja
transaktivoi niiden geenien ekspression, jotka spesifioi- I
vat sekä proteaasia (11^26) että substraattia (UL26.5). Tulokset olivat seuraavat (kuvio 15): (1) Virusgenomissa oleva UL26.5-geeni muodosti pro- Ϊ: 30 teiinirintamat, jotka reagoivat monoklonaalisen HSV-vas- ta-aineen kanssa 34 °C:ssa (kaistat 1 ja 14), mutta ei " a · 39 °C:ssa (kaistat 2 ja 15). Lisäksi proteolyyttisten kat-kaisutuotteiden (rintamat e ja f) läsnäolo osoittaa, että Ul26:n koodittamaa viruksen proteaasia tehtiin myös 35 34 °C:Ssa.
64 104427 (2) Virusgenomin koodittamaa UL26-proteaasia ei ekspressoitu 39 °C:ssa (kaista 3) . Näin ollen plasmidin koodittaman proteaasin poissa ollessa plasmidin L koodit-tamaa substraattia tehtiin (rintamat c ja d), mutta ei 5 katkaistu rintamiksi e ja f, joka osoittaa, että virusgenomin koodittamia proteaaseja ei ekspressoitu ei-sallivas-sa lämpötilassa.
(3) Ainoastaan plasmidista L peräisin olevat ICP35-esiastemuodot c ja d akkumuloituivat soluissa, jotka 10 transfektoitiin plasmideissa H (kaista 4), G (kaista 5) , CC (kaista 7), D (kaista 9), DD (kaista 11), FF (3 kaista 13) , II (kaista 21) ja JJ (kaista 23) olevilla mutatoi-duilla UL26-geeneillä. Näissä plasmideissa geenituotteen proteaasiaktiivisuus inaktivoitiin.
15 (4) Plasmidista L peräisin olevat ICP35-esiaste- ja tuotemuodot akkumuloituivat soluihin, jotka transfektoitiin plasmideissa AA (kaista 6) , B (kuvio 15, kaista 8) , BB (kaista 10) , EE (kaista 12) , GG (kaista 20) , HH (3 kaista 19), KK (kaista 22), P (kaista 25), MM (kaista 26) 20 ja NN (kaista 27) olevilla mutatoiduilla UL26-geeneillä.
(5) Kuten yllä on huomautettu, plasmidissa P 20 aminohapon pituinen epitooppi oli insertoitu aminohapon 218 jälkeen, se on, ylävirtaan UL26.5:n koodittamaa subst-raattiproteiinia koodittavasta domeenista. Plasmidin P 25 koodittama proteaasi katkaisi itsensä (kaistat 16 ja 17) ja ICP35-proteiinin (kaista 15). Plasmidi J sisältää CMV-insertin aminohapon 514 jälkeen (kuvio 1). Kokeissa (kaista 18) se katkaisi plasmidin J itsensä koodittaman UL26:n tuotteen. Tässä kokeessa havaittu ainoa katkaisutuote oli 30 rintama e. Koska epitooppi oli insertoitu myös UL26.5-pro-teiiniin, on mahdollista, että insertoitu 20 aminohapon I r pituinen epitooppi häiritsi ja pienensi katkaisun tehoa. Plasmidin Q (kuvio 1 ja taulukko I) koodittaa proteaasia, joka katkaisi muiden plasmidien spesifioiman UL26-geenien 35 tuotteen, mutta ei sen omassa domeenissa kooditetun geenin 65 104427 tuotetta, koska aminohapon 615 jälkeen insertoitu epitoop-pi häiritsi katkaisua.
Taulukko I
5 Luettelo mutaatioista geenissä, joka koodittaa UL26-prote-aasia. Merkityt mutaatiot tehty villityypin geeniin.
* Insertiomutantit (20 aminohapon pituinen CMV-epitooppi) P Insertio aminohapon 218 jälkeen.
J Insertio aminohapon 514 jälkeen.
10 Q Insertio aminohapon 615 jälkeen.
Deleetiomutanttien rakenteet D Aminohappojen 1-220 deleetio.
G Aminohappojen 219 - 615 deleetio.
EE Aminohappojen 1-9 deleetio.
15 FF Aminohappojen 1-32 deleetio.
AA Lopetuskodonin insertio aminohapon 615 jälkeen.
BB Lopetuskodonin insertio aminohapon 514 jälkeen.
CC Lopetuskodonin insertio aminohapon 287 jälkeen.
DD Lopetuskodonin insertio aminohapon 218 jälkeen. " 20 MM Lopetuskodonin insertio aminohapon 306 jälkeen. r NN Aminohappojen 307 - 635 deleetio.
Aminohapposubstituutiot GG Gly7AspArg-peptidi SerArgThr-peptidillä (uusi Xbal-koh- | ta) *.
; ' 25 HH Asp31SerGly-peptidi LeuAspMet-peptidillä (uusi Xbal-koh- ta) .
II Aminohappo His61 aminohapolla Vai (uusi Aatll-kohta).
JJ Aminohappo His14B aminohapolla Ala (uusi Pstl-kohta) .
KK Aminohappo Ser215 aminohapolla Ala (uusi Nhel-kohta) .
30 LL Aminohappo Asp34 aminohapolla Ala (uusi Nhel-kohta).
, *, *Substituoidut sekvenssit olivat seuraavat: plasmidi GG: : sekvenssi CCGGGAGACCGATG sekvenssillä CCGTCTAGAACCATG; plasmidi HH: sekvenssi TäTGACAGCGGGGAC sekvenssillä TATC-35 TAGACATGGAC; plasmidi II: sekvenssi GACCACCGC sekvenssillä GACGTCCGC; plasmidi JJ: sekvenssi GCGCACGTC sekvenssillä GCTGCAGTC; plasmidi KK: sekvenssi ACGCTTTCCACC sekvenssil- Ξ lä ACGCTAGCCACC; plasmidi LL: sekvenssi GGGGACTCGGGG sek- s venssillä GGGGCTAGCGGC.
66 104427
Kuvio 16 on yhteenveto kaavakuvan muodossa mutage-neesitutkimusten tuloksista. Numerot viittaavat aminohap-ponumeroihin, jotka on ennustettu avoimen lukukehyksen UL26 nukleotidisekvenssin perusteella, jonka ovat julkaisseet 5 McGeoch et ai. (1988). Insertiota varten esitetyt aminohapot ovat juuri insertiokohdan edessä. Aminohapot merkitään yhden kirjaimen koodilla. Avoimet symbolit osoittavat, että proteaasi oli toiminnallinen. Suljetut symbolit osoittavat, että proteaasi inaktivoitui mutageneesissä.
10 Kuvan alaosassa oleva rivi osoittaa proteaasin domeenit (numerot I - IV) . Restriktioendonukleaasikohdat lyhennettiin seuraavasti: B, BstEII; H, Hpal; M, Mstll; P, Pmll. Me edustaa avoimen lukukehyksen UL26.5 translaation metio-niinin aloituskodonia.
15 B. UL2 6-proteaasin domeenien ominaisuudet
Kuviossa 15 esitetyt tulokset ja yhteenveto kuviossa 16 osoittavat, että UL26-proteaasi koostuu neljästä do-meenista, joista kaksi on välttämättömiä ja kaksi ei. Ei-välttämättömät domeenit I ja IV ulottuvat aminohaposta 1 20 aminohappoon 9, mutta ei aminohappoon 32, ja karboksi-päästä (aminohappo 635) ainakin aminohappoon 307, mutta ei aminohappoon 287, vastaavassa järjestyksessä. Domeeni numero III tuntuu ulottuvan ainakin aminohaposta 218 korkeintaan aminohappoon 306. Tämä domeeni voidaan siirtää ; 25 ainakin 20 aminohapolla (CMV-epitoopin insertio aminohapon 218 jälkeen) proteaasin aminopään osan suhteen. Domeeni numero II on välttämätön ja sijaitsee ilmeisesti aminohappojen 10 ja 218 välissä.
C. UL26-proteaasin katalyyttinen domeeni 1 30 Tutkimukset proteaasi-inhibiittorien kanssa antavat olettaa, että 1^26 :n voidaan ennustaa kuuluvan seriinipro-teaasien joko kymotrypsiini- tai subtilisiiniryhmiin (Kraut, 1977; Neurath, 1983). Yhteinen ominaisuus näillä kahdella seriiniproteaasiryhmällä on aktiiviset kohdat, 67 104427 jotka sisältävät histidiini-, asparagiinihappo- ja serii-niaminohapot.
Proteaasin substraatin ICP35-proteiinin on julkaistu ottavan osaa laskostajaproteiinina HSV-kapsidin kokoa- ·' 5 miseen (Newcomb et ai., 1991). Muiden herpesvirusten rep-likaatiotapahtumasarja on samanlainen ja ICP35-proteiinil-’ le homologisia proteiineja on julkaistu (Robson ja Gibson, 1989) . Erikoisen mielenkiintoinen oli kysymys, sisälsikö muiden herpesvirusten avoimen lukukehyksen UL26 homologit 10 konservoituneet histidiini-, asparagiinihappo- ja serii-niaminohapot, joka kolmen aminohapon ryhmä ottaa osaa UL2 6-proteaasin proteolyyttiseen aktiivisuuteen.
Nukleotidisekvenssivertailut osoittavat, että Vari-zella Zoster -viruksen avoin lukukehys 33 ja ihmisen syto-15 megaloviruksen avoin lukukehys UL80 koodittavat HSV-1-viruksen avoimen lukukehyksen UL26 homologeja (McGeoch et ai., 1988; Chee et ai., 1990; Davison ja Scott, 1986). ’
Aminohapposekvenssivertailut HSV-viruksen UL26:n, CMV-vi-ruksen UL80:n ja VZV-viruksen geenin 33 proteiinien välillä 20 osoittivat, että aminopää on UL26-proteaasin konservoi-tunein domeeni. Johtopäätös, että proteaasi sijoittuu avoimen lukukehyksen UL26 aminopään domeeniin on johdonmukainen sen havainnon kanssa, että avoimen lukukehyksen Ul26.5 tuote ICP35 ei sisällä entsymaattista aktiivisuutta.
25 Konservoituneiden aminohappojen tutkimiseksi UL26 aminopään domeenissa tehtiin plasmidien GG, II, JJ, KK ja LL koodit-tamiin aminohappoihin substituutiot Asp31Ser32, Asp34, His61,
His343 ja Ser215. Tulokset osoittivat, että ainoat aminohapot, joiden substituutiot hävittivät entsymaattisen aktii- ^ 30 visuuden, olivat konservoituneet histidiinit kohdilla 61 1 ja 148. Ennen tarkempien kartoitustutkimusten suorittamis- 2 4 · - ta voidaan olettaa, että proteaasin katalyyttinen domeeni sijaitsee todennäköisimmin UL26-proteaasin domeenissa II.
68 104427 D. UL26-proteaasin muiden domeenien tehtävä
Domeenien I, II ja III tehtäviä ei tunneta. Koska substraatti ICP35 aggregoituu muodostaessaan HSV-kapsidien laskostumisen on todennäköistä, että proteaasi ottaa myös 5 osaa laskostumiseen ja että ainakin domeenia III ja mahdollisesti myös domeeneja I ja IV tarvitaan kompleksoitu-miseen ICP35-proteiinin kanssa.
Esimerkki 16 UL26-geeni koodittaa seriiniproteaasia 10 Tässä kuvattu 20 aminohapon pituinen CMV-epitooppi ja 256 aminohapon pituinen proteiini A:n IgG:n sitomisdo-meeni (plasmidi Y, kuvio 1) insertoitiin avoimen lukukehyksen Ul26 päässä olevan aminohapon ja lopetuskodonin väliin. SP6 RNA -polymeraasilla valmistetut plasmidin Y koo-15 dittavan domeenin transkriptit transloitiin nukleaasilla käsitellyssä kanin retikulosyyttilysaatissa 35S-metionii-nin läsnä ollessa 10 minuuttia. Lisättiin sykloheksimidiä lisätranslaation lopettamiseksi ja plasmidin T translaa-tiotuotetta inkuboitiin lisää 6 tuntia itsekatkaisun sal-20 limiseksi proteaasi-inhibiittorien läsnä ollessa. Reaktio-tuotteet erotettiin sitten elektroforeettisesti denaturoivissa polyakryyliamidigeeleissä. Kuviossa 17 on esitetty autoradiografiset kuvat elektroforeettisesti erotetuista polypeptideistä, jotka on transloitu in vitro nukleaasilla ; 25 käsitellyssä kanin retikulosyyttilysaatissa synteettisesti in vitro transkriptoiduista RNA:sta, jotka valmistettiin plasmidirakenteessa Y olevasta avoimesta lukukehyksestä Ul26. Esitetyt kaistat edustavat osia näytteistä, jotka on denaturoitu elektroforeesia varten heti 10 minuutin syn- _ 30 teesin jälkeen (kaistat 15 ja 28) tai sen jälkeen, kun oli annettu reagoida 6 tuntia sykloheksimidin (100 μg/ml) kanssa yksinään tai esitettyjen proteaasi-inhibiittoreiden = (μΜ) kanssa (kaistat 1-4, 16 - 27 ja 29 - 47). Kaikki proteaasi-inhibiittorit liuotettiin dimetyylisulfoksidiin 35 (DMSO) ennen käyttöä.
69 104427
Tulokset olivat seuraavat (kuvio 17): (1) 10 minuutin translaatiotuotteet muodostivat yhden leimatun polypeptidirintaman, joka sisälsi katkai-sematonta proteaasia (Pra) (kaistat 15 ja 28).
(2) Kun oli annettu reagoida 6 tuntia sykloheks-imidin (100 μ9/πι1) läsnä ollessa, mutta proteaasi-inhi- ’ biittorien poissa ollessa, translaatioseos muodosti kolme i rintamaa, jotka vastasivat koskematonta translaatiotuotet-5 ta (Pra) ja translaatiotuotteiden katkaisutuotteiden ami-nopään (Prb) ja karboksipään (PA) osia (kaistat 9, 10, 21, 22 ja 33).
(3) Katkaisutuotteiden Prb ja PA määrät alenivat sellaisissa translaatioseoksissa, joiden annettiin rea- 10 goida sykloheksimidin läsnä ollessa ja alemmissa seriini-proteaasi-inhibiittoreiden di-isopropyylifluorifosfaatin (DFP, Sigma, St. Louis, MI), L-l-tosyyliamido-2-fenyyli-etyylikloorimetyyliketonin (TPCK, Sigma), N-a-p-tosyyli-L-lysiinikloorimetyyliketonin (TLCK, Sigma), fenyylimetyy-15 lisulfonyylifluoridin (PMSF, Sigma) ja kymostatiinin (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) konsentraatioissa. Korkeimmissa testatuissa konsentraatioissa ei digestio-tuotteita havaittu (kaistat 1, 29, 34, 39 ja 44).
(4) Translaatiotuotteen (Pra) katkaisuun eivät vai- 20 kuttaneet kysteiiniproteaasi-inhibiittorit, jodietikkahap- ,· po (Sigma) ja kystatiini (Boehringer Mannheim; kaistat 5 - 9, 22 - 27), etyleeniglykoli-bis-(β-aminoetyylieetteri), N, N, Ν', N'-tetraetikkahappo (EGTA), metalliproteaasin l kelaattori ja inhibiittori (kaistat 12 - 14) tai aspara- 1 , 25 giinihappoproteaasi-inhibiittori pepstatiini (Boehringer '
Mannheim; kaistat 15 - 21).
·: Nämä tulokset ovat johdonmukaisia sen hypoteesin kanssa, että UL26:n geenituote on seriiniproteaasi.
m 70 104427
Esimerkki 17
Inhibiittorikandidaattiaineen tunnistus
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää uusien herpesviruksen proteaasi-inhibiittoriyhdisteiden tunnistami-5 seksi, joita voidaan nimittää "kandidaattiaineiksi". On tarkoitettu, että tämä seulontamenetelmä osoittautuu käyttökelpoiseksi yleisesti minkä tahansa yhdisteiden tunnistamisessa, jotka yhdisteet toimivat herpesviruksen prote-aasia inhiboiden. Lisäksi on tarkoitettu, että tässä suh-10 teessä käyttökelpoiset yhdisteet eivät millään tavoin ole rajattuja proteiini- tai peptidiyhdisteisiin. Todellisuu-! dessa voi olla niin, että käyttökelpoisimmat farmakologi set yhdisteet, jotka tunnistetaan seulontamenetelmää käyttäen, ovat ei-peptidiaineita luonteeltaan ja jotka entsyy-15 mi esimerkiksi tunnistaa ja sitoo ja jotka toimivat inak-i tivoiden entsyymin tiukalla sitoutumisella tai muulla ke miallisella interaktiolla.
Näin ollen näissä suoritustavoissa esillä oleva = keksintö koskee menetelmää, jolla määritetään kandidaat- 20 tiaineen kyky inhiboida herpesviruksen proteaasi, menetelmän sisältäessä vaiheet, joissa: (a) valmistetaan puhdistettu HSV-proteaasi, jota koodittaa vähintään UL26-geenin domeenit II ja III, (b) proteaasi saatetaan kosketukseen proteaasin 25 pilkkomiskohdan sisältävän proteiinisubstraatin kanssa olosuhteissa, joissa substraatin proteolyyttista pilkkomista voi tapahtua, (c) yhdistetään proteaasi inhibiittorikandidaattiaineen kanssa ja , 30 (d) määritetään, onko proteiinisubstraatti pilkkou tunut .
« ' Tässä olevan kandidaattiaineen seulontatestin tärkeä näkökohta on kyky valmistaa suhteellisen puhtaassa muodossa oleva proteaasikoostumus esimerkiksi tavalla, 35 josta on tässä keskusteltu. Tämä on kandidaattiaineen seu- 71 104427 lontatestin tärkeä näkökohta siksi, että ilman ainakin suhteellisen puhdasta valmistetta ei kyetä testaamaan spesifisesti proteaasin inhibitiota johtuen muiden uutoksessa läsnä olevien aineiden inhibitorisista vaikutuksista, jot-5 ka voivat vaikuttaa proteaasiin. Kaikissa tapauksissa proteaasin onnistunut eristys antaa mahdollisuuden nyt ensi * kerran tunnistaa uusia yhdisteitä, joita voidaan käyttää herpesvirukseen liittyneiden proteiinien inhiboimiseksi. !
Kandidaattiseulontatesti on melko yksinkertainen 10 laittaa pystyyn ja suorittaa ja se on monella tavalla samanlainen yllä keskustellun proteaasiaktiivisuuden määri-tystestin kanssa. Kun on saatu aikaan suhteellisen puhdas proteaasivalmiste, tässä testissä yksinkertaisesti sekoitetaan kandidaattiaine proteaasivalmisteen kanssa suosi-15 teltavasti olosuhteissa, jotka sallivat proteaasin kat- kaisutoiminnan tapahtumisen, mutta myös inhibitorisen ai- " neen sisällyttämisen. Näin ollen seokseen esimerkiksi tyypillisesti lisätään määrä tunnettua proteaasisubstraattia, kuten Ul26.5 koodittavan sekvenssin koodittamaa aminohap-20 posekvenssiä tai ainakin katkaisukohtaa, josta proteaasi “ katkaisee ICP35 c- ja d-proteiinit e- ja f-proteiineiksi. *
Tällä tavalla voidaan mitata kandidaattiaineen kyky alentaa tai muuttaa herpesviruksen proteaasisubstraatin kat- I
kaisua suhteessa läsnä olevaan kandidaattlaineeseen. Γ I 25 Sen mukaisesti voidaan haluta mitata tai muuten määrittää suhteellisen puhtaan proteaasin aktiivisuus tes- 1
tattavan kandidaattiaineen poissa ollessa suhteessa aktii- I
visuuteen kandidaattiaineen läsnä ollessa niin, että pystytään määrittämään kandidaattiaineen suhteellinen inhi- I
30 bitorinen kyky.
Proteaasi voidaan sitten inhiboida menetelmällä, joka sisältää vaiheen, jossa proteaasi altistetaan tehok- I
kaalle määrälle proteaasi-inhibiittoria, kuten sellaisel- I
le, joka kuuluu yllä keskusteltujen peptidiyhdisteiden ~~ 35 ryhmään, tai sellaiselle kandidaattlaineelle, joka on tun- _ 72 104427 nistettu kandidaattiaineseulontatestin suoritustapojen mukaisesti. Tämä on tietysti tärkeä siksi, että uskotaan, että inhiboimalla herpesviruksen proteaasi kyetään hoitamaan herpesvirusinfektoiden eri puolia. Uskotaan, että 5 sellaisten inhibiittorien käyttö niin, että estetään pro-teaasin toiminta kapsidiproteiinien tuottamisessa, toimii hoidettaessa tai lievitettäessä infektiota ja ne voivat olla käyttökelpoisia itsessään tai yhdessä muiden herpes-virushoitojen kanssa.
10 1. Merkit (merkkiaineet)
Kahta monoklonaalista vasta-ainetta käytettiin merkkeinä (merkkiaineina), toista paikallaan pysyvää epi-tooppia vastaan, jota koodittavat molemmat avoimet luku-kehykset Ul26 ja Ul26.5, ja toista, joka on reaktiivinen 15 "liikkuvaa epitooppia" vastaan. Jälkimmäinen oli korvaamaton työkalu tunnistettaessa kahden avoimen lukukehyksen tuotteet, määritettäessä proteiinien toiminnat ja kartoitettaessa katkaisukohta. Ilman "liikkuvaa epitooppia" analyysit olisivat riippuneet ainoastaan radioaktiivisista 3 20 merkkiaineista ja monoklonaalisista vasta-aineista sellaisia oligonukleotideja vastaan, jotka vastaavat geenien eri domeeneja. Liikkuva epitooppi antaa välittömän vasta-aineen minkä tahansa avoimen lukukehyksen tuotteelle ja, kun sitä käytetään esillä olevan keksinnön mukaisessa yhtey-25 dessä, helpottaa huomattavasti sen geenin tuotteen toiminnan tunnistusta, johon geeniin se on insertoitu.
Insertoimalla sellaista epitooppia koodittava sekvenssi, joka epitooppi reagoi monoklonaalisen sytomegalo-virusvasta-aineen kanssa ja stafylokokin proteiini A:n 30 IgG:n sitomisdomeenin homologien kanssa, kahden avoimen lukukehyksen koodittavien domeenien 3'-päihin, tunnistettiin proteaasin katkaisutuotteet, katkaistu proteaasi Prb ja ICP35 e- ja f-proteiinit. Tällä menetelmällä määritettiin myös, että katkaisukohta ICP35-proteiineille ja kat-35 kaisukohta kokoproteaasisekvenssin erottamiseksi Pra- ja 73 104427
Prb-proteiineiksi on noin 20 aminohapon päässä sekä prote-aasin että ICP35-esiasteen karboksipäästä.
Esimerkkinä herpesviruksen genomin tutkimuksesta käyttäen plasmideja merkkeinä on yhden merkki-insertoidun 9 5 plasmidin S (kuvio 1), jota käytettiin solujen transfek-toimiseksi osalla herpesviruksen genomia, vaikutus kuvaa-' va. Tässä plasmidissa CMV-epitooppi insertoitiin ICP35- sekvenssin karboksipäähän. Sitten solut, jotka transfek-toitiin osalla herpesviruksen genomia tällä tavalla, kelo rättiin ja hajotettiin niin, että solujen sisällä olevat proteiinit voitiin analysoida. Sitten nämä proteiinit erotettiin elektroforeettisesti molekyylipainon mukaan rintamiksi. ICP35 on immunologisesti tunnistettavissa HSV-vasta-aineen avulla. CMV-epitooppia etsittiin rintamien 15 joukosta käyttäen epitooppia vastaan olevaa vasta-ainetta ja tunnistamalla signaali, joka osoitti antigeeni-vasta-aine-kompleksin muodostumisen. Tämän immunologisen analyysin tulokset osoittivat, että CMV-epitooppi tunnistettiin rintamissa c ja d, mutta ei rintamissa e ja f. Tämä osoit-20 ti, että c- ja d-proteiinien katkaisu karboksipäässä oli tapahtunut muodostaen e- ja f-proteiinit.
2. Soluvapaa proteiinisynteesi
Toinen käyttökelpoinen menetelmä oli soluvapaa pro-teiinisynteesisysteemi. UL26:den ja UL26.5:den mRNA:ta vas-' 25 taavat RNA:t transkriptoitiin SP6 RNA -polymeraasilla ja transloitiin nukleaasilla käsitellyissä kanin retikulo-syyttilysaateissa, joka on soluvapaa "ribosomitehdas". Soluvapaissa systeemeissä ia vitro -transloidut proteiinit leimattiin radioaktiivisilla leimoilla ja altistettiin r 30 autoradiografiälle leimaa sisältävien rintamien paikallis- „ tamiseksi. Kaksi koejärjestelyä suoritettiin tällä ylei- 1 * i sellä menetelmällä: (i) Plasmidin U translaatiotuotteita inkuboitiin sykloheksimidin läsnä ollessa, joka johti UL26-proteiinin ~ 35 katkaisutuotteen (Prb) asteittaiseen akkumuloitumiseen.
. 104427
Akkumuloituneen katkaisutuotteen määrä oli verrannollinen inkubaatioaikaan (kuvio 12, kaistat 12 - 15).
(ii) Samanlaiset tulokset saatiin plasmidin V translaatiotuotteilla (kaistat 4 - 7) . Tämän kokeen mer-5 kitys juontaa juurensa UL26:n karboksipäässä olevan CMV-epitoopin läsnäolosta. Kuten odotettua, plasmidin V tuottama UL26:n translaatiotuote Pra kulki hitaammin kuin autenttinen plasmidista U peräisin oleva proteiini. Plasmi-dista V syntetisoitu UL26:n prosessoitu muoto Prb kulki 10 kuitenkin yhdessä plasmidista U peräisin olevan autenttisen proteiinin kanssa osoittaen, että UL26:n autoproses-sointi pitää sisällään karboksipään proteolyyttisen katkaisun.
3. Lämpöherkkä mutantti HSV-1 (F) 15 Toinen työkalu, jota käytettiin HSV-genomin analyy seissä, oli lämpöherkkä mutantti HSV-1 (F), joka 39 °C:ssa ei ekspressoi omia avoimia lukukehyksiä UL26 ja UL26.5.
Mieluumminkin, ei-sallivissa olosuhteissa, HSV-1 (F) in-i dusoi α-geenin promoottorit (Post et ai., 1981) ja eks-20 pressoi pääasiallisesti α-tyypin geenejä.
4. Proteaasi-inhibition tunnistus ja käyttö
Jos proteaasin toiminta inhiboidaan, kapsidia ei voida tuottaa ja virus ei replikoidu. Tämä inhibitio voi tapahtua joko transkription, translaation tai proteiini-: · 25 toiminnan tasolla. Transkription häirintä tekisi tarpeel liseksi mRNA:n muodostuksen häirinnän DNA-templaatilla. Translaation häirintä tekisi tarpeelliseksi proteiinisynteesin häirinnän mRNA-templaatilla. Vaihtoehtoisesti itse proteaasin toiminta voidaan keskeyttää joko tuhoamalla , 30 proteaasin rakenne, erikoisesti sen proteolyyttinen osa, muuttamalla sen substraatin katkaisukohtaa tai sitomalla proteaasi irreversiibeleihin inhibiittoreihin.
Spesifisesti suunnitellut peptidit, jotka blokee-raavat proteaasin toiminnan, ovat erittäin arvokkaita es-35 tettäessä ja hoidettaessa herpesvirusinfektioita. Nämä 104427 blokeeraajat sisältävät mitkä tahansa substraattianalogit tai seriiniproteaasi-inhibiittorit, esim. oligopeptidit tai niiden johdannaiset, jotka sisältävät proteaasin tunnistaman katkaisukohdan aminohapposekvenssin. Esimerkissä 5 17 on kuvattu menetelmät sopivien proteaasi-inhibiittorien tunnistamiseksi kandidaattlaineiden joukosta.
' Tässä kuvataan myös helpot menetelmät virusproteaa- sin tuottamiseksi, jota voidaan käyttää inhibiittorien tunnistuksessa, kehittää hoitomodaliteetit, kehittää vas-10 ta-aineet virusinfektion tunnistamiseksi ja kehittää proteaasin inaktiiviset mutantit.
Esimerkki suoritustavasta proteaasiproteiinin valmistamiseksi on valmistaa nukleiinihappoalue, joka sisältää sellaisen nukleiinihapposekvenssin, joka kykenee koo-15 dittamaan haluttua proteaasiproteiinia tai polypeptidiä.
Tämä alue voi olla se, joka koodittaa koko proteaasia tai jotain sen osaa, esimerkiksi proteaasin proteolyyttistä domeenia. Alue voi olla niinkin pieni, joka kykenee aiheuttamaan positiivisen signaalin vasta-aineella tällä ta-20 valla tunnistaen virusinfektion läsnäolon. Alueet, jotka ovat toiminnallisesti samanlaisia kuin kuviossa 1 esitetyt, jotka valmistettiin esillä olevassa keksinnössä, voidaan myös valita riippuen halutusta tuotettavasta polypep-tidistä. Toiminnallinen samankaltaisuus voidaan määrittää 25 testaamalla, voiko alue katkaista joko ICP35-esiasteen tai Pr-proteaasin, esimerkiksi käyttäen menetelmiä, jotka on esitetty tässä patenttijulkaisussa tunnistettaessa prote-aasi-inhibiittorit kandidaattiaineiden joukosta.
Valittu nukleiinihappoalue siirretään ympäristöön, [ 30 joka on sopiva alueen ekspressoitumiseksi polypeptidiksi. ^ Tämä ympäristö voi olla astia, joka sisältää seoksen, joka 4 · · - ....... .....
kykenee indusoimaan ekspression, esim. kanin retikulosyyt- : tilysaatti. Vaihtoehtoisesti, alue voidaan siirtää isäntä-soluun transformaatiolla, transfektiolla rekombinanttieks- : 35 pressiovektorin avulla, elektroporaatiolla tai "geenity- 76 104427 kiliä". Isäntäsolu voidaan valita BHK-, Vero-, HeLa-, E. coli- ja niiden kaltaisten solujen joukosta.
Rekombinanttiekspressiovektori voi sisältää promoottorin. Promoottorit ovat a4-promoottori, joka on 5 Ul26.5:n luonnollinen promoottori, ja mitkä tahansa muut prokaryoottiset tai eukaryoottiset promoottorit.
Toisessa suoritustavassa nukleiinihappoalue voidaan valmistaa ottamalla genomista nukleiinihappoa herpes-soluista, amplif ioimalla genomisessa nukleiinihapossa olevaa 10 proteolyyttisen kohdan sisältävää nukleiinihapposekvens-sialuetta, valmistamalla rekombinanttikloonit, jotka sisältävät mainitut amplifioidut nukleiinihapposekvenssit ja valitsemalla kloonit, jotka sisältävät halutun amplifioi-' dun nukleiinihapposekvenssin.
15 Viruksen proteaasi voidaan valmistaa myös ottamalla näyte, joka sisältää proteaasia, homogenisoimalla näyte ja fraktioimalla homogenaatti proteaasifraktion saamiseksi. Näytteet, jotka sisältävät proteaasia, sisältävät biologiset näytteet, esimerkiksi viruksen infektoimat kudokset.
20 5. Herpesvirusinfektoiden hoito
Ajatellut hoitomodaliteetit sisältävät ulkoisesti käytettävät ja systeemiset lääkkeet. Ihon ja orvaskeden vaurioita varten on ajateltu rasvoja, voiteita tai suihkeita, jotka sisältävät proteaasi-inhibiittoria. Vaihtoeh-: 25 toisesti, systeemistä hoitoa laskimon sisäisellä injek tiolla tai nielemällä on ajateltu estämään viruksen repli-kaation vakava leviäminen, joka johtuu isäntäsoluissa olevien latenttien viruksien uudelleen aktivoitumisesta.
6. Virus ja solut _ 30 Tässä keksinnössä käytettyjen HSV-1- ja HSV-2-kan- tojen vastaavien prototyyppien HSV-i (F) ja HSV-2 (G) ominaisuudet ja ylläpito ja kasvatus tymidiinikinaasinega-tiivisissa hamsterin poikasen munuaissoluissa (BHK) on kuvattu aiemmin ja kuvaus on liitetty tähän liitteeksi 77 104427 (Arsenakis et ai., 1986; Ejercito et ai., 1968; Roizman ja Spear, 1968).
7. Monoklonaaliset vasta-aineet
Monoklonaaliset vasta-aineet H725 ja CH28-2, jotka ·» 5 on valmistettu ICP35-proteiinia ja CMV-viruksen glykopro-teiini B -proteiinia vastaan, vastaavassa järjestyksessä, ' on kuvattu aiemmin (Braun et ai., 1983, 1984; katso myös
Zweig, 1980, Liu ja Roizman, 1991). Monoklonaalinen vasta-aine H725 reagoi HSV-1-viruksen ICP35-proteiinin kanssa, 10 mutta ei HSV-2-proteiinien kanssa (Braun et ai., 1983, 1984). CH28-2 saatiin L. Pereira'lta (Liu ja Roizman, 1991 a, Braun et ai., 1984). Mitä tahansa kaupallisesti saatavia vasta-aineita, jotka on valmistettu mille tahansa epi-toopeille, voidaan käyttää substituutteina. CH28-2 on mo-15 noklonaalinen vasta-aine, joka on suunnattu ihmisen syto-megaloviruksen (CMV) glykoproteiini B -proteiinia vastaan.
Tämän vasta-aineen epitooppi on kartoitettu 20 aminohapon pituiseen peptidiin N-KGQKPNLLDRLRHRKNGYRH-C testaamalla reaktiivisuus ryhmästä päällekkäin meneviä peptidejä, jot-20 ka on syntetisoitu proteiinin ennustetun nukleotidisek-venssin mukaisesti.
8. In vitro transkriptio ja translaatio
Valmistettiin 5 μg EcoRI- tai Hindlll-entsyymeillä linearisoituja DNA-templaatteja ja transkriptoitiin cap-: 25 analogin GppG (New England Biolabs, MA) läsnä ollessa SP6- tai T7 RNA -polymeraasilla Promega Biotec, Madison, WI, suositusten mukaisesti. Yhtä mikrogrammaa RNA:ta transloi- : tiin 10 minuuttia 50 μΐ reaktioseoksissa, jotka sisälsivät nukleaasilla käsiteltyä kanin retikulosyyttilysaattia 30 (Promega Biotech, Madison, WI) ja 35S-metioniinia (Dupont, ~ NEN Research Product) , ja sitten translaatio lopetettiin Γ *
joko lisäämällä hajotuspuskuria (0,05 M Tris, pH 7,0, I
8,5 % vol/vol sakkaroosia, 5 % vol/vol S-merkaptoetanolia ^ ja 2 % vol/vol natriumdodekyylisulfaattia) tai laimenta- \
35 maila 20-kertaisesti fosfaatilla puskuroituun suolaliuok- I
78 104427 seen, joka sisälsi sykloheksimidiä (lopullinen konsentraa-tio 100 μg/ml) ja eri proteiini-inhibiittorikonsentraa-tioita. Kuuden tunnin reaktion jälkeen sykloheksimidin läsnä ollessa seokset denaturoitiin keskeytyspuskurissa, 5 altistettiin elektroforeesille polyakryyliamidigeeleissä, siirrettiin sähköisesti nitroselluloosamerabraaneille, kuten tässä on kuvattu (katso myös Liu ja Roizman, 1991 ja Braun, 1984) ja valotettiin Kodak X-Omat -filmeille.
9. Plasmidi-DNA:11a transfektoitujen solujen trans-10 faktiot ja superinfektiot
Transfektiot suoritettiin, kuten ovat kuvanneet Kristie ja Roizman (1984), paitsi että solut transfektoi-tiin yleensä 10 ^tg plasmidi-DNA: ta. Kuusikuoppaisissa Costar (Cambridge, Mass.) -maljaviljelmissä BHK-soluja oli 15 noin 10® solua per kuoppa. Useimmissa kokeissa transfektoi-dut solut altistettiin 18 - 20 tuntia transfektion jälkeen 10 pfu:lie HSV-l-virusta (F) tai HSV-2-virusta (G) per solu, kuten tulososassa on mainittu. Kun soluja oli altistettu kaksi tuntia 10 °C:ssa viruksille, ymppi korvattiin 20 Dulbecco'n modifioidulla Eagle'n alustalla, johon oli lisätty 10 % naudan sikiön seerumia ja soluja inkuboitiin 34 °C:ssa, 37 °C:ssa tai 39 °C:ssa 20 tuntia. Kokeissa, joissa ei käytetty virusinfektiota, solut kerättiin 40 -42 tuntia transfektion jälkeen. 20 tuntia infektion jäl-: 25 keen soluja leimattiin 2 tunnin ajan 50 //Ci:11a 35S-metio- niinia 1 ml:ssa alustaa (ilman metioniinia, johon oli lisätty 1 % vasikan seerumia). Kerätyt solut pestiin kerran fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella, pelletoitiin sentrifugaatiolla noin 4 000 kierroksella minuutissa 5 30 minuutin ajan SS34 Sorvali -roottorissa ajettuna DuPont-sentrifugissa, suspendoitiin hajotuspuskuriin, sonikoitiin 20 sekuntia jäissä ja keitettiin 1 minuutti ennen erotusta elektroforeettisesti denaturoivissa geeleissä (katso myös Liu ja Roizman, 1991 a ja b; Ejercito et ai., 1968).
79 104427 10. In£ektoitujen solujen proteiinien erotus elek-troforeettisesti ja värjäys monoklonaalisella vasta-aineella
Denaturoidut liuotetut solulysaattien polypeptidit 5 tai in vitro -translaatiot erotettiin 9,5 % tai 12 % (voi/ voi) SDS-polyakryyliamidigeeleissä, jotka ristisidottiin * N,N'-diallyylitartaaridiamidilla, kuten ovat kuvanneet
Gibson ja Roizman (1972, 1974) ja Braun et ai. (1984).
Erotetut polypeptidit BHK-soluista siirrettiin sähköisesti 10 nitroselluloosamembraaneille ja annettiin reagoida entsyy-mivälitteisessä immuunitestissä ainoastaan piparjuuriper-oksidaasiin liitetyn anti-hiiri-IgG:n (Amersham, Arlington Heights, IL) kanssa tai tämän anti-hiiri-IgG:n kanssa yhdessä HSV-1-viruksen ICP35-proteiinia vastaan olevan mo-15 noklonaalisen vasta-aineen H725 tai CMV-epitooppia vastaan olevan monoklonaalisen vasta-aineen CH28-2 kanssa, kuten aiemmin on kuvattu (Braun et ai., 1984). Geelit, jotka sisälsivät retikulosyyttilysaatista transloidut erotetut polypeptidit, kuivattiin ja valotettiin Kodak X-Omat -fil-20 mille.
11. Sytoplasmisen RNA: n eristys ja Sl-analyysi
Sytoplasminen RNA puhdistettiin, kuten ovat aiemmin kuvanneet Jenkins ja Howett (1984), Vero-soluista, jotka oli joko valeinfektoitu tai infektoitu 20 pfu:lla HSV-1-: ’ 25 virusta (F) per solu ja ylläpidetty 12 tuntia. HSV-1-vi ruksen DNA-koetin (0,02 pmoolia) oli leimattu 5’-päähän r32P-ATP:lla (Dupont, NEN Research Products), hybridisoi-tiin 50 ptg:n kanssa sytoplasman kokonais-RNA:ta, digestoi-tiin Sl-nukleaasilla ja erotettiin 7-%:isissä polyakryy-30 liamidigeeleissä 8 M urean läsnä ollessa (Jenkins ja
Howett, 1984). : * z 12. Menetelmät proteiinien valmistamiseksi
Rekombinanttivektorit ovat käyttökelpoinen keino : sekä valmistettaessa proteaasia tai ICP35-proteiineja koo-35 dittavaa DNA:ta itseään tai valmistettaessa kooditettavia : 104427 proteiineja. On ajateltu, että valmistettaessa näitä proteiineja yhdistelmä-DNA-menetelmillä voidaan käyttää joko prokaryoottisia tai eukaryoottisia ekspressiosysteemeitä.
Kun aiotaan ekspressoida herpesviruksen nukleiini-5 happoalueita eukaryoottisessa isännässä, voi olla toivottavaa käyttää vektoria, kuten plasmidia, joka sisältää eukaryoottisen replikaatio-origon, joista plasmideista esimerkkejä ovat pCMV-sarjan vektorit, kuten pCMV4. Lisäksi eukaryoottisissa systeemeissä ekspressointia varten voi 10 olla toivottavaa sijoittaa proteaasia tai ICP35-proteii-neja koodittava sekvenssi tehokkaan eukaryoottisen promoottorin, kuten SV40- tai CMV-promoottorin, viereen tai sen säätelyn alaisuuteen. Sijoitettaessa koodittava sekvenssi promoottorin säätelyn alaisuuteen, oli se sitten 15 eukaryoottinen tai prokaryoottinen promoottori, kaikki mitä tavallisesti tarvitsee tehdä, on sijoittaa proteiinin transkriptionaalisen lukukehyksen transkription aloitus-\ kohdan 51-pää noin 1 - noin 50 nukleotidin välille alavir taan valitusta promoottorista.
20 Lisäksi, kun aiotaan ekspressoida eukaryoottisessa solussa, voi olla toivottavaa sisällyttää transkriptioyk-sikköön, joka sisältää halutun peptidin tai proteiinin, sopiva polyadenylaatiokohta (esim. 51-AATAAA-31). Poly A -kohta sijoitetaan tyypillisesti noin 30 - noin 2 000 nuk-: 25 leotidia "alavirtaan" proteiinin terminaatiokohdasta koh taan, joka sijaitsee ennen transkription loppumista.
Käyttökelpoiset eukaryoottivektorit, jotka sisältävät kaikki edellä mainitut ja joihin kuvatut herpesviruksen geenit voidaan helposti insertoida, ovat hyvin tun-30 nettuja. Sopivat vektorit sisältävät esimerkiksi pCD- ja pCMV-vektorit suositeltavimman systeemin ollessa pCMV. pCD-i ja pCMV-vektorien lisäksi muut suositeltavat eukaryoot- tiekspressiovektorit sisältävät pMSG- ja pSVL-vektorit, ' joita myy Pharmacia LKB Technology, Piscataway, NJ. Näissä " 35 on MMTV- ja SV40-viruksien myöhäinen promoottori, vastaa- 81 104427 vassa järjestyksessä. cDNA, joka sisältää herpesviruksen proteiinin koko lukukehyksen, kuten on esitetty kuviossa 1, voidaan helposti insertoida yhteen edellä mainituista vektoreista Hindlll-restriktiokohdan (AAGCTT) avulla "ylä-5 virtaan" (se on 5'-puolelle) aloituskodonista (ATG), joka aloittaa kooditettavan ICP35-esiasteen translaation.
’ On ajateltu, että käytännöllisesti katsoen mitä tahansa yleisesti käytettyä eukaryoottista isäntäsolua ; voidaan käyttää herpesviruksen geenin ekspressiossa tässä 10 kuvatun mukaisesti. Esimerkit sisältävät linjat, joita tyypillisesti käytetään eukaryoottiekspressioissa, kuten AtT-20-, HepG2-, VERO-, HeLa-, CHO-, WI38-, BHK-, C0S-7-, RIN- ja MDCK-solulinjat. Eukaryoottiekspressioissa käytettäväksi suositeltava linja on BHK-systeemi.
15 Prokaryoottiekspressio on vaihtoehto, jota voidaan
käyttää, kun halutaan. Vaikka ei tarvitakaan silloin, kun aiotaan käyttää prokaryoottiekspressiota, voi olla yleensä toivottavaa käyttää transkriptioyksikköä, joka sisältää lukukehyksen, joka vastaa ainoastaan peptidiä itseään, ku-20 ten on kuvattu kuviossa 1, niin että lisäprosessointia ei tarvita. Tyypillisesti prokaryoottiset promoottorit, joita voidaan käyttää, sisältävät PL-, T7- ja lac-promoottorit T7-promoottorin ollessa yleensä suositeltava. Muut suositeltavat bakteeriekspressiovektorit sisältävät plasmidit : 25 PKK233-2 ja PKK233-3, jotka on saatavissa Pharmacia LKB
Technology'sta. Nämä käyttävät tae- ja tre-promoottoreita, vastaavassa järjestyksessä.
Tietysti jopa silloin, kun käytetään eukaryoottista systeemiä ja ekspressiota, voi olla kuitenkin toivottavaa 30 sisällyttää prokaryoottinen ekspression aloituskohta kuin myös prokaryoottisten systeemien kanssa toimivat selek- !.
M' m tiomarkkerit niin, että sallitaan sekvenssien "sukkuloin- : ti" prokaryoottirakenteesta ekspressoitavaksi eukaryootis- 7 sa. i m ea 104427
Tietyissä suoritustavoissa voi olla toivottavaa yksinkertaisesti valmistaa herpesviruksen proteiinit tai peptidit muilla kuin yhdistelmä-DNA-menetelmillä, kuten peptidien kemiallisella synteesillä tai soluvapaassa "ri-5 bosomitehtaassa". Sopivia peptidisyntetisaattoreita on kaupallisesti saatavissa (Applied Biosystems) ja niitä voidaan käyttää.
Tietyissä suoritustavoissa on ajateltu, että sekä lyhyemmillä että pidemmillä DNA-fragmenteilla, joissa on 10 kuvion 1 mukaisia sekvenssejä, on lisäkäyttöjä sisältäen käytöt lyhyiden aktiivisten peptidien valmistuksessa tai jopa lyhyinä DNA-fragmenttihybridisaatiokoettimina esimerkiksi kloonipankkeja seulottaessa. Joka tapauksessa fragmenteilla, jotka vastaavat kuvion 1 sekvenssin niinkin 15 lyhyitä jaksoja kuin suunnilleen 14 - 20 nukleotidia, on lisäkäyttöjä näissä tai muissa suoritustavoissa. Sisältä-essään ainakin noin 14 nukleotidin pituisen jakson, joka on yhteinen kuvion 1 mukaisten nukleiinihappoalueiden tai niiden komplementtien kanssa, DNA-alueella on kyky muodos-20 taa hybridi erityisesti herpeslajin DNA:n kanssa erikoisesti tiukoissa olosuhteissa, kuten 50 °C:ssa puskurissa, joka on 0,15 M NaCl ja 0,02 M natriumsitraatti, pH 7,4. Samalla, kun suunnilleen noin 14 nukleotidin pituinen yhteinen tai komplementaarinen jakso varmistaa kyvyn muodos-:* ' 25 taa stabiili hybridi, pidemmät komplementaariset jaksot voivat osoittautua toivottavammiksi tietyissä käytöissä. Näin ollen tiettyihin käyttöihin voidaan haluta DNA-aluei-ta, joissa on pidemmät komplementaariset jaksot, esimerkiksi suunnilleen 18, 22 tai jopa 25 emäksen pituiset.
30 13. Vasta-aineet tässä kuvattuja proteiineja vas taan
Vasta-aineita herpesviruksen proteaasia ja siitä peräisin olevia muotoja vastaan voidaan valmistaa joko yh-distelmä-DNA- tai muilla menetelmillä. On ajateltu esimer-35 kiksi, että vasta-aineilla, jotka on valmistettu kuvion 1 104427 mukaista herpesviruksen proteaasia tai muiden kuin ihmislajien, kuten naudan tai sian, proteaasia vastaan, on tiettyjä etuja verrattuna vasta-aineisiin, jotka on valmistettu ihmislajia vastaan, erikoisesti suoritustavoissa, 5 joissa toivotaan heikkovahvuista immunogeenista sitoutumista.
Koostumukset, jotka sisältävät tässä kuvattuja mo- noklonaalisia vasta-aineita, voidaan valmistaa fuusioimalla ensin jyrsijän pernasolut saman jyrsijälajin myeloo-10 masolujen kanssa, jolloin jyrsijä, joka luovuttaa pernasolut, on immunisoitu herpesviruksen peptidillä, esiasteella tai niille sukua olevilla peptideillä. Käytetty jyrsijälaji on yleensä hiiri, erikoisesti silloin, kun yritetään valmistaa vasta-ainetta kuvion 1 herpesviruksen 15 proteaasia vastaan. Tietysti, kun valmistetaan sellainen proteaasi, joka sisältää rakennevariaatioita, voidaan todennäköisesti onnistuneesti käyttää hybridoomasysteemiä halutulla lajilla.
Lisäksi esitetään menetelmä proteaasien eristämi-20 seksi muista lajeista, jotka proteaasit voivat olla anti-geenisesti ristireagoivia HSV-1-viruksen proteaasin kanssa. Tämä menetelmä sisältää sellaisen immunoadsorboivan materiaalin valmistuksen, johon materiaaliin on kiinnitetty proteaasivasta-aine. Alan asiantuntijat tuntevat lukui-: * 25 siä immunoadsorboivia materiaaleja ja ne sisältävät esi- merkiksi Affi-Gel, Cn-Sepharose, proteiini A - Sepharose -menetelmät ja lukuisat muut hyvin tunnetut immunoadsor-benttimenetelmät. Kaikki sellaiset menetelmät ovat sovellettavissa tässä yhteydessä ja pitäisi osoittautua käyttö-30 kelpoisiksi immunogeenisesti ristireagoivien lajien eris- r tyksessä (täydellisempää luetteloa varten katso teos Mono-clonal Hvbridoma Antibodies: Techniques and Applications. ~
John G. Hurrell, toim., CRC Press, 1982, liitetty tähän viitteeksi). _____ 84 104427
Lisäksi voidaan valmistaa käyttöpakkauksia niin, että biologisessa näytteessä oleva herpesviruksen proteaa-sin ja sille sukua olevien proteaasien kliininen tunnistus tulee mahdolliseksi. Sellaiset käyttöpakkaukset sisältävät 5 polyklonaaliset tai monoklonaaliset vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä proteaasille tai sille sukua olevalle pro-teaasille, yhdessä immunogeenisen tunnistusaineen kanssa. Immunogeenisen tunnistusaineen määritellään olevan mikä tahansa aine, jota käytetään vasta-aine/antigeenikomplek-10 sien muodostumisen tunnistamiseksi tai määrän määrittämiseksi. Tyypilliset immunogeeniset tunnistusaineet sisältävät radioaktiivisesti tai entsymaattisesti leimattujen antigeenien tai vasta-aineiden käytön. Menetelmät, jotka sisältävät leimattujen vasta-aineiden käytön, ovat esimer-15 kiksi RIA (radioimmuunitesti) ja ELISA (entsyymivälittei-nen immuunitesti). Tunnetaan kuitenkin lukuisia muita menetelmiä, joita voidaan käyttää immuunitunnistuskäyttöpak-kauksissa. Patentit, jotka opettavat sopivia menetelmiä, sisältävät esimerkiksi US-patentit 4 446 232, 4 407 943, 4 20 399 299 ja 454 233.
Näin ollen tyypillinen herpesviruksen proteaasin ELISA-menetelmään perustuva tunnistuskäyttöpakkaus voi sisältää monoklonaalisen anti-herpes-proteaasi-vasta-ai-neen tai puhdistetun proteaasiantigeenin (kun yritetään 25 etsiä veressä kiertäviä vasta-aineita) ja toisen "immuuni-tunnistus" -vasta-aineen, joka kykenee spesifisesti immu-nogeenisesti reagoimaan puhdistetun antigeenin tai anti-proteaasi-vasta-aineen kanssa. Toisessa vasta-aineessa voi olla liitettynä väriä muodostava entsymaattinen aktiivi-30 suus, esimerkiksi kiinnitetty peroksidaasimolekyyli. Kun toista "immuunitunnistus"-vasta-ainetta käytetään tässä muodossa, muodostetaan yleensä ensin immuunikompleksi testattavan biologisen näytteen, esimerkiksi seerumin, plasman, virtsan tai kudosnäytteiden, ja vasta-aineen välille. 35 Sellaisen immuunikompleksin muodostuksen jälkeen lisätään 85 104427 immuunitunnistusvasta-ainetta niin, että se reagoi kvantitatiivisesti proteaasiin sitoutuneen vasta-aineen kanssa. Sitten tämä kompleksin muodostuminen kvantitioidaan kolorimetrisellä peroksidaasitestillä.
0 5 Vaihtoehtona yllä kuvatulle kaksois-vasta-aine-me- netelmälle entsyymi tai radioaktiivinen ligandi voidaan sisällyttää suoraan anti-proteaasi-vasta-aineeseen ja määrän määritys voidaan tehdä suoraan käyttäen tätä suoralei-mattua vasta-ainetta.
10 Edellä kuvattu käyttöpakkaustyyppi ja menetelmä on hyvin tunnettu ja voidaan kuvata yleisesti niin, että se sisältää vaiheet, joissa otetaan potilaasta biologinen näyte, saatetaan biologinen näyte kosketukseen monoklonaa-lisen anti-herpes-proteaasi-vasta-aineen kanssa olosuh-15 teissä, jotka edistävät vasta-aine/antigeenikompleksien muodostusta, ja tunnistetaan spesifinen immunologinen reaktio monoklonaalisen vasta-aineen ja näytteen välillä.
On ajateltu myös neutraloivia vasta-aineita, jotka sitoutuessaan proteaasiin tai sen osaan tekevät proteaasin 20 proteolyyttisesti toimimattomaksi.
14. Isäntäsoluviljelmät ja vektorit Yleisesti prokaryootit ovat suositeltavia tässä kuvattujen DNA-sekvenssien alkukloonauksiin ja keksinnössä käyttökelpoisten vektoreiden rakentamiseen. Esimerkiksi E.
Γ 25 coli K12 -kanta 294 (ATCC numero 314460) on erikoisen käyttökelpoinen. Muut mikrobikannat, joita voidaan käyttää, sisältävät sellaiset E. coli -kannat, kuten £. coli B I
ja E. coli X 1776 (ATCC numero 31537). Näiden esimerkkien ¥ on tarkoitettu olevan kuvaavia mieluummin kuin rajoitta- I
30 via. :
Prokaryootteja voidaan käyttää myös ekspressioon. ' * r
Edellä mainittuja kantoja kuin myös E. coli -kantaa W3110 (F-, lambda-, prototrofinen, ATCC numero 273325), Bacil- ' lus-kantoia. kuten Bacillus subtilus. tai muita enterobak- 7 86 104427 teerikantoja, kuten Salmonella tvphimurium tai Serratia marcescens ja eri Pseudomonas-kantoia. voidaan käyttää.
Yleensä sellaisia plasmidivektoreita, jotka sisältävät replikonin ja kontrollisekvenssit, jotka ovat peräi-5 sin isäntäsolun kanssa yhteensopivasta lajista, käytetään yhdessä näiden isäntäsolujen kanssa. Vektori sisältää tavallisesti replikaatiokohdan kuin myös merkkisekvenssit, jotka kykenevät muodostamaan fenotyyppisen selektion transformoiduille soluille. Esimerkiksi £. coli transfor-10 moidaan tyypillisesti käyttäen plasmidia pBR322, joka on peräisin E. coli -kannasta. Plasmidi pBR322 sisältää geenit ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenssille ja näin ollen muodostaa helpon tavan tunnistaa transformoidut solut. Plasmidin pBR tai muiden mikrobi- tai faagiplasmidien 15 täytyy sisältää myös, tai ne pitää modifioida sisältämään, promoottorit, joita mikro-organismi voi käyttää omien pro-teiiniensa ekspressoimiseen.
Yhdistelmä-DNA-rakenteissa yleisimmin käytetyt promoottorit sisältävät B-laktamaasi- (penisillinaasi) ja 20 laktoosipromoottorisysteemit ja tryptofaanipromoottorisys-teemin (trp). Näiden ollessa yleisimmin käytettyjä muitakin mikrobipromoottoreita on löydetty ja käytetty, ja nii- den nukleotidisekvenssejä koskevat yksityiskohtaiset tie dot on julkaistu tehden alan asiantuntijalle mahdolliseksi • 25 ligoida ne toiminnallisesti plasmidivektoreihin.
Prokaryoottien lisäksi voidaan käyttää eukaryoot-tisia mikrobeja, kuten hiivaviljelmiä. Saccharomvces cere-visiae. tai yleinen leipomohiiva, on yleisimmin käytetty eukaryoottisten mikro-organismien joukossa, vaikka lukuisa 30 joukko muita kantoja on yleisesti saatavissa. Ekspressoi-taessa Saccharomvces-hiivassa käytetään yleensä esimerkik-si plasmidia Yrp7. Tämä plasmidi sisältää jo trpl-geenin, joka muodostaa selektiomerkin sellaiselle mutanttihiiva-kannalle, jolta puuttuu kyky kasvaa tryptofäänillä, esi-35 merkiksi kanta ATCC numero 44076 tai PEP4-1. Trpl-vaurion .104427 87 läsnäolo isäntähiivasolun genomissa muodostaa tehokkaan ympäristön transformaation tunnistamiseksi kasvattamalla tryptofäänin poissa ollessa.
Sopivat promoottorisekvenssit hiivavektoreissa si-5 sältävät 3-fosfoglyseraattikinaasin tai muiden glykolyyt- tisten entsyymien, kuten enolaasin, glyseraldehydi-3-fos- ’ faattidehydrogenaasin, heksokinaasin, pyruvaattidekarbok- | sylaasin, fosfofruktokinaasin, glukoosi-6-fosfaatti-isome- j raasin, 3-fosfoglyseraattimutaasin, pyruvaattikinaasin, 10 trioosifosfaatti-isomeraasin, fosfoglukoosi-isomeraasin ja glukokinaasin promoottorin. Rakennettaessa sopivia eks-pressioplasmideja näihin geeneihin liittyneet lopetus-sekvenssit ligoidaan myös ekspressiovektoriin ekspressoi-tavaksi halutun sekvenssin 31-puolelle niin, että muodos-15 tetaan polyadenylaatio mRNA-transkription lopetukselle.
Muut promoottorit, joilla on se lisäetu, että niiden aiheuttama transkriptio on kasvuolosuhteiden säätelemä, ovat alkoholidehydrogenaasi 2:n, isosytokromi C:n, happaman fosfataasin, typpimetaboliaan liittyvien hajotusentsyymien : 20 ja edellä mainitun glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaa- 1 sin ja maltoosin ja galaktoosin käytöstä vastuussa olevien entsyymien promoottorialueet. Mikä tahansa vektori, joka sisältää hiivan kanssa yhteensopivan promoottorin, repli-kaation aloituskohdan ja lopetussekvenssit, on sopiva. : ϊ_ 25 Mikro-organismien lisäksi soluviljelmiä, jotka ovat peräisin monisoluisista organismeista, voidaan myös käyt- !! tää isäntinä. Periaatteessa mikä tahansa sellainen solu- : viljelmä on käyttökelpoinen oli se peräisin sitten selkä- :
, rankaisen tai selkärangattoman eläimen soluviljelmästä. I
30 Mielenkiinto on kuitenkin ollut suurinta selkärankaisten ' soluja kohtaan ja selkärankaisten solujen kasvatuksesta ~ viljelmässä (kudosviljelmä) on tullut rutiinimenetelmä : viime vuosina. Esimerkit sellaisista käyttökelpoisista isäntäsoluista ovat AtT-20-, VERO- ja HeLa-solut, kii-35 nanhamsterin munasarjan solulinja (CHO) ja W138-, BHK-, ΐ 104427 COS-7-, 293- ja MDCK-solulinjat. Ekspressiovektorit näitä soluja varten sisältävät tavallisesti (jos tarpeellista) replikaation aloituskohdan, promoottorin, joka sijaitsee ekspressoitavan geenin edessä, yhdessä kaikkien tarpeel-5 listen ribosomin sitoutumiskohtien, RNA:n silmukointikoh-tien, polyadenylaatiokohtien ja transkription lopetussek-venssien kanssa.
Nisäkässoluissa käytettäessä ekspressiovektoreiden säätelytoiminnat ovat usein peräisin virusmateriaalista. 10 Esimerkiksi yleisesti käytetyt promoottorit ovat peräisin polyomaviruksesta, Adenovirus 2:sta, sytomegaloviruksesta ja useimmiten apinan virus 40:stä (SV40). SV40-viruksen aikaiset ja myöhäiset promoottorit ovat erikoisen käyttökelpoisia, koska molemmat saadaan viruksesta helposti 15 fragmenttina, joka sisältää myös SV40-viruksen replikaation aloituskohdan. Pienempiä tai suurempia SV40-fragmentteja voidaan myös käyttää edellyttäen, että niihin sisältyy noin 250 emäsparin pituinen sekvenssi, joka ulottuu Hindlll-kohdasta Bgll-kohtaan, joka sijaitsee viruksen 20 replikaation aloituskohdassa. Lisäksi on myös mahdollista, ja usein toivottavaa, käyttää promoottoria tai säätelysek-venssejä, jotka tavallisesti ovat liittyneet haluttuun geenisekvenssiin edellyttäen, että sellaiset säätelysek-venssit ovat yhteensopivia isäntäsolusysteemien kanssa.
:· 25 Replikaation aloituskohta voidaan muodostaa niin, että rakennetaan vektori sisältämään ulkopuolinen aloituskohta, kuten sellainen, joka on peräisin SV40- tai muusta viruslähteestä (esim. Polyomavirus, Adenovirus, HSV, BPV, CMV) tai sen voi muodostaa isäntäsolun kro-30 mosomin replikaatiomekanismi. Jos vektori integroituu isäntäsolun kromosomiin, jälkimmäinen on usein riittävä.
89 104427 15. Nukleiinihappohybridisaatio sellaisten sekvenssien tunnistamiseksi, jotka kykenevät koodittaxnaan seriiniproteaaseja, ICP35-proteiineja tai niiden biologisesti toiminnallisia ekvivalentteja 5 Tämän julkaisun esittämä nukleiinihapposekvenssi- informaatio sallii suhteellisen lyhyiden DNA (tai RNA) ’ sekvenssien valmistuksen, joilla sekvensseillä on kyky spesifisesti hybridisoitua sellaisiin geenisekvensseihin, jotka kykenevät koodittamaan ainakin proteaasien prote-10 olyyttistä domeenia tai ICP35-proteiinien katkaisukohtaa.
Näiden näkökantojen mukaisesti sopivan pituiset nukle-iinihappokoettimet valmistetaan perustuen sekvenssiin, joka on esitetty kuviossa 1. Sellaisten nukleiinihappo-koettimien kyky hybridisoitua spesifisesti proteaasin tai 15 ICP35-geenin sekvensseihin tekee niistä erikoisen käyttö- ! kelpoisia eri suoritustavoissa. Tärkein asia on, että koettimia voidaan käyttää eri testeissä tunnistettaessa : annetussa näytteessä olevien komplementaaristen sekvenssien läsnäolo. Muita käyttötapoja on kuviteltu sisältäen 20 sekvenssi-informaation käytön mutanttialukkeiden valmistuksessa tai sellaisten alukkeiden valmistuksessa, joita käytetään valmistettaessa muita geneettisiä rakenteita.
Tiettyjen keksinnön mukaisten etujen muodostamiseksi hybridisaatiotutkimuksissa tai testeissä käytettäväksi • 25 suositeltava nukleiinihapposekvenssi sisältää sekvenssit,
jotka ovat komplementaarisia kuvion 1 sekvenssille ainakin I
14 emäksen pituisten nukleotidijaksojen verran. Ainakin 14 nukleotidin pituus auttaa varmistamaan sen, että fragmentti on riittävän pitkä muodostamaan kaksijuosteinen mole-30 kyyli, joka on sekä stabiili että selektiivinen. Sellaiset Ϊ ·[ fragmentit on helppo valmistaa esimerkiksi suoraan syn- ' tetisoimalla fragmentti kemiallisilla menetelmillä, sovel- : tamalla nukleiinihappojen lisäysmenetelmiä, kuten US-pa- “ tentin 4 603 102 mukaisia PCR-menetelmiä, tai lisäämällä 2
35 valitut sekvenssit rekombinanttivektoreihin niiden tuot- E
90 104427 ' tamiseksi yhdistelmä-DNA-menetelmillä. Alueet, jotka ovat pituudeltaan 18 - 25 emäksestä tai jopa 30 - 40 emäksestä aina niin suuriin fragmentteihin, jotka koodittavat kokonaista geeniä tai geenejä, kuuluvat myös tämän julkaisun 5 piiriin.
Sen mukaisesti nukleotidisekvenssit ovat tärkeitä niiden kyvyn suhteen muodostaa selektiivisesti kaksijuos-teisia molekyylejä geenin komplementaaristen jaksojen kanssa. Riippuen ajatellusta sovellutuksesta voidaan käyt-10 tää vaihtelevia hybridisaatio-olosuhteita niin, että saa daan aikaan vaihteleva koettimen selektiivisyystaso koh-desekvenssin suhteen. Sellaisissa sovellutuksissa, joissa tarvitaan korkea selektiivisyystaso, voidaan käyttää suhteellisen tiukkoja olosuhteita hybridien muodostamiseksi, 15 esimerkiksi valitsemalla suhteellisen matalat suola- ja/tai korkea lämpötila-olosuhteet, kuten 0,02 M - 0,15 M NaCl lämpötiloissa 50 - 70 °C. Nämä olosuhteet ovat erikoisen selektiivisiä ja kestävät vähän, jos yhtään, erilaisuutta koettimen ja templaatin tai kohdejuosteen väli-20 sissä sekvensseissä.
Tietysti joissain sovellutuksissa, esimerkiksi valmistettaessa mutantteja käyttämällä mutanttialuketta, joka hybridisoidaan templaattijuosteeseen tai proteaasia tai ICP35-proteiineja koodittavien sekvenssien eristämiseksi " 25 sukulaislajeista, toiminnallisista ekvivalenteista ja nii den kaltaisista, käytetään vähemmän tiukkoja hybridisaatio-olosuhteita heterogeenisen kaksijuosteisen molekyylin muodostumisen sallimiseksi. Näissä tapauksissa käytettävät olosuhteet voivat olla esimerkiksi 0,15 - 0,9 M suola läm-30 pötiloissa, jotka vaihtelevat 20 - 55 °C. Ristihybridisoi-tuvat lajit voidaan näin ollen helposti tunnistaa positiivisina hybridisaatiosignaaleina kontrollihybridisaatioihin verrattuna. Joka tapauksessa tiedetään yleisesti, että olosuhteet voidaan muodostaa tiukemmiksi lisäämällä kohoa-35 vat määrät formamidia, joka toimii destabiloiden hybridi- 91 104427 soitunutta kaksijuosteista molekyyliä samalla tavalla kuin kohonnut lämpötila. Näin ollen hybridisaatio-olosuhteita voidaan helposti manipuloida ja näin yleensä tehdään riippuen halutuista tuloksista.
5 Tietyissä suoritustavoissa on edullista käyttää kuvattuja nukleiinihapposekvenssejä yhdessä sopivien ai-' neiden, kuten leiman, kanssa hybridisaation määrittämisek si. Alalla tunnetaan paljon erilaisia sopivia tunnistusai-neita sisältäen radioaktiiviset, entsymaattiset tai muut 10 ligandit, kuten avidiini/biotiinin, jotka kykenevät muodostamaan tunnistettavan signaalin. Suositeltavissa diagnostisissa suoritustavoissa entsyymitunnistinta, kuten ureaasia, alkalista fosfataasia tai peroksidaasia, voidaan käyttää radioaktiivisen tai muun ympäristön kannalta epä-15 toivottavan aineen sijalla. Entsyymitunnistimien tapauksessa tunnetaan kolorimetriset tunnistussubstraatit, joita voidaan käyttää aineina, joiden avulla voidaan tunnistaa joko ihmissilmin tai spektrofotometrisesti spesifinen hybridisaatio komplementaarista nukleiinihappoa sisältävien 20 näytteiden kanssa.
Yleisesti on ajateltu, että tässä kuvatut hybridi-saatiokoettimet ovat käyttökelpoisia sekä liuoshybridisaa-tioreagensseina kuin myös kiinteää faasia käyttävissä suoritustavoissa. Suoritustavoissa, joissa käytetään kiinteää ' 25 faasia, testattava DNA (tai RNA) adsorboidaan tai kiinni tetään muuten valittuun matriisiin tai pintaan. Tämä kiinnitetty yksijuosteinen nukleiinihappo altistetaan sitten spesifiselle hybridisaatiolle valittujen koettimien kanssa : halutuissa olosuhteissa. Valitut olosuhteet riippuvat tie- 30 tyistä seikoista, jotka perustuvat tiettyihin tarvittaviin ί ^ kriteereihin (riippuen esimerkiksi G+C-määrästä, kohdenuk- leiinihapon tyypistä, nukleiinihapon lähteestä, hybridi-saatiokoettimen koosta, jne.). Epäspesifisesti sitoutunei- r den koetinmolekyylien poistamiseksi suoritetun hybridissä- : 92 104427 tiopinnan pesun jälkeen tunnistetaan spesifinen hybridisaatio tai jopa määrä määritetään leiman avulla.
Yksi menetelmä solu-uutoksien tunnistamiseen käytettävien molekyylien valmistamiseksi on käyttää fluore-5 soivia koettimia. Fluoresoivat koettimet ovat hyvin alan asiantuntijoiden tuntemia. Esimerkki menetelmästä on sitoa fluoreskeiini-leimattu avidiini (Vector Laboratories, Burlingame, CA) biotiinilla leimattuun proteiiniin. Signaalia voidaan tehostaa.
10 Esillä oleva keksintö on kuvattu erityisten suori tustapojen muodossa, jotka esillä olevat keksijät ovat keksineet tai joita he ovat ehdottaneet esillä olevan keksinnön suositeltavien suoritustapojen sisällöksi. Alan asiantuntijoiden tulee ymmärtää, että useita modifikaa- 15 tioita ja muutoksia voidaan tehdä esimerkkeinä oleviin tiettyihin suoritustapoihin, ilman että poistutaan keksinnön hengestä ja piiristä. Esimerkiksi johtuen kodonin re-generaatiosta voidaan alkuperäiseen DNA-sekvenssiin tehdä muutoksia, ilman että vaikutetaan proteiinisekvenssiin.
20 Lisäksi, johtuen biologisista ekvivalenssiseikoista, muu toksia proteiinirakenteeseen voidaan tehdä ja silti vielä saada aikaan käyttökelpoinen proteaasina tai antigeeninä toimiva osafragmentti. Kaikkien sellaisten modifikaatioiden tarkoitetaan sisältyvän seuraavien patenttivaatimusten \ ' 25 piiriin.
1 · , 93 104427
Viitteet
Alla luetellut viitteet on sisällytetty tähän viitteinä siinä määrin kuin ne lisäävät, selittävät, esittävät taustaa tai opettavat metodologiaa, menetelmiä ja/tai täs-5 sä käytettyjä kokoonpanoja.
Arsenakis, M., Hubenthal-Voss, J., Campadelli-Fiume, G., Pereira, L., and Roizman, B. (1986), ’ Construction and properties of a cell line constitutively expressing the herpes simplex virus glycoprotein B dependent on functional α4 10 protein synthesis. J. Virol. 60:674-682.
Batterson, W. and Roizman, B. (1983),
Characterization of the herpes simplex virion-associated factor responsible for the induction of a genes. J. Virol., 46:371-377.
ig Braun, D.K., Pereira L., Korrild, B., and Roizman, B. (1983), Application of denatured, electrophoretically separated, and immobilized lysates of herpes simplex virus-infected cells for the detection of monoclonal antibodies and for studies of the properties of viral proteins. J. Virol., 46:103-112.
20 Braun, D.K., Roizman, B., and Pereira, L. (1984),
Characterization of post-transnational products of herpes simplex virus gene 35 proteins binding to the surfaces of full capsids but not empty capsids. J. Virol., 49:142-153.
Chee, M.S., Bankier, A.T., Beck, S. et al. (1990), 25 Current Topics in Microbiology and Immunology, 154:127-169.
•
Corey, L. and Spear (1986), PG Infections with herpes simplex viruses. N. Eng. J. Med., 314:686-691.
Davison, A.J. and McGeoch, D.J. (1986), Evolutionary comparisons of the S segments in the genomes of herpes simplex virus type 1 and varicella-zoster virus. J. Gen. Virol., 67:597-611.
Davison, A.J. and McGeoch, D.J. (1986), J. Gen.
Virol., 67:1759-1816.
35 94 104427
Ejercito, P.M., Kieff, E.D., and Roizman, B. (1986), Characterization of herpes simplex virus strains differing in their effect on social behavior of infected cells. «7. Gen. Virol., 5 2:357-364.
4.
Gibson, W., Marcy, A.I., Comolli, J.C., and Lee, J.
(1990), Identification of precursor to cytomegalovirus capsid assembly protein and 10 evidence that processing results in loss of its carboxyl-terminal end. J. Virol., 64:1241:1249.
Gibson, W., and Roizman, B. (1972), Proteins 15 specified by herpes simplex virus VIII.
Characterization and composition of multiple capsid forms of subtypes 1 and 2. J. Virol., 10:1044-1052.
20 Gibson, W., and Roizman, B. (1974), Protein specified by herpes simplex virus. Staining and radiolabeling properties of B capsids and virion proteins in polyacrylamide gels. J.
Virol., 13:155-165.
25
Jenkins et al. (1984) , Characterization of the mRNAs mapping in the BplII N fragment of the herpes simplex virus type 2 genome. J. Virol., 52:99-107.
30
Kraut, J. (1977), Annual Rev. Biochem., 46:331-358.
Kristie, T.M., and Roizman, B. (1984), Separation of sequences defining basal expressing from those 35 conferring a gene recognition within the ; - regulatory domains of herpes simplex virus 1 a genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:4065-4069.
40 Kyte, J., et al. (1982), J. Mol. Biol., 157:105-132.
Liu, F., and Roizman, B. (1991a), The promoter, transcriptional unit, and coding sequence of herpes simplex family 35 proteins are contained 45 within and in frame with the UL26 open reading : frame. J. Virol., 65:206-212.
Liu, F., and Roizman, B. (1991b), J. Virol., 65:5149-5156.
50 95 104427
McGeoch, D.J., Dalrymple, M.A., Davison, A.J.,
Dolan, A., Frame, M.C., McNab, D., Perry, L.J.,
Scott, J.E., and Taylor, P. (1988), The complete DNA sequence of the long unique region , 5 in the genome of herpes simplex virus type l.
J. Gen. Virol., 69:1531-1574.
Morse, L. S., Pereira, L., Roizman, B. et al.
' (1978), Preparation of herpes simplex virus of 10 high titer. J. Virol., 2:83-84.
Neurath, H. (1983), Science., 224:350-357.
Newcomb, W.W., and Brown, J.C. (1991), Structure of 15 the herpes simplex virus capsid effects of extraction with guanidine hydrochloride and partial reconstitution of extracted capsids.
J. Virol., 65:613-620.
20 Newcomb, W.W., Brown, J.C., Booy, F.P., and Steven, A.C. (1989), Nucleocapsid mass and capsomere protein stoichiometry in equine herpes virus 1: scanning transmission electron microscopic study. J. Virol., 63:3777-3783.
25
Post, L.E., Mackem, S. and Roizman, B. (1981), The regulation of o genes of herpes simplex virus: expression of chimeric genes produced by fusion of thymidine kinase with a gene promoters.
30 Cell, 24:555-565.
Preston, V.G., Coates, J.A.V., and Rixon, F.J.
(1983), Identification and characterization of a herpes simplex virus gene product required 35 for encapsodation of virus DNA. J. Virol., 45:1056-1064.
Preston, V.G. (1992), Processing of the herpes simplex virus assembly protein ICP35 near its 40 carboxy terminal end requires the product of the whole of the UL26 reading frame, Virology, y 186:87-98.
Robson, L. and Gibson, w. (1989) , Primate .· 4 5 cytomegalovirus assembly protein: genome localization and nucleotide sequence. J.
Virol., 63:669-676. i
Roizman, B., and Spear, P.ZG. (1968), Preparation of 50 herpes simplex virus of high titer. J. Virol., -
65:1525-1529. I
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Moniatis, T. (1989),
Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratories. r *6 104427
Schenk, P. et ai. (1991), The 45-kilodalton protein of cytomegalovirus (Colburn) B-capsids is an amino-terminal extension form of the assembly protein. J. Virol., 65:1525-1529.
5
Skalka, A.M. (1989), Retroviral Proteases: First glimpses at the anatomy of a processing machine. Cell, 58:911-913.
10 Welch, A.R. et al. (1991), A herpes virus maturational proteinase, assemblin: identification of the gene, putative active site domain, and cleavage site. PNAS, 88:10792-10796.
15 «

Claims (11)

97 1 0 4 4 2 7
1. Menetelmä herpesviruksen proteaasin inhibointiin kykenevän aineen tunnistamiseksi, tunnettu siitä, 5 että se sisältää vaiheet, joissa: (a) valmistetaan puhdistettu HSV-proteaasi, jota • koodittaa vähintään UL26-geenin domeenit II ja III, (b) proteaasi saatetaan kosketukseen proteaasin pilkkomiskohdan sisältävän proteiinisubstraatin kanssa 10 olosuhteissa, joissa substraatin proteolyyttista pilkkomista voi tapahtua, (c) yhdistetään proteaasi inhibiittorikandidaatti-aineen kanssa ja (d) määritetään, onko proteiinisubstraatti pilkkou- 15 tunut.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että domeeneilla II ja III on SEQ ID nro 2:n ryhmien 10-306 aminohapposekvenssi.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, t u n-20 n e t t u siitä, että HSV-proteaasia koodittaa UL26-geeni kokonaisuudessaan.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että HSV-proteaasi on yhdistel- mäent- syymi. ’
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että substraatti on HSV ICP35.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritysvaihe käsittää substraatti-fragmenttien määrittämisen elektroforeesilla. :
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että substraattifragmentit ovat ICP35e I ja ICP35f.
8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteaasi valmistetaan vai- i: 35 heillä, joissa: Ξ • — 104427 98 (a) valmistetaan ekspressiovektori, joka sisältää UL26-geenin, ja (b) viedään ekspressiovektori sopivaan isäntäsoluun olosuhteissa, jotka sallivat koodittavan sekvenssin eks- 5 pressoitumisen.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää vaiheen, jossa (c) proteaasi otetaan talteen isäntäsoluista.
10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että UL26-geeni on eukaryoottisen promoottorin säätelyn alla.
11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on eukaryoottinen isäntäsolu. I " * „ * « « ’ ! 99 104427
FI922271A 1991-05-24 1992-05-19 Menetelmä herpesviruksen proteaasin inhibointiin kykenevän aineen tunnistamiseksi FI104427B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US70581491A 1991-05-24 1991-05-24
US70581491 1991-05-24
US83285592 1992-02-07
US07/832,855 US5478727A (en) 1991-05-24 1992-02-07 Methods and compositions for the preparation and use of a herpes protease

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI922271A0 FI922271A0 (fi) 1992-05-19
FI922271A FI922271A (fi) 1992-11-25
FI104427B true FI104427B (fi) 2000-01-31

Family

ID=27107575

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI922271A FI104427B (fi) 1991-05-24 1992-05-19 Menetelmä herpesviruksen proteaasin inhibointiin kykenevän aineen tunnistamiseksi

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0514830B1 (fi)
JP (1) JP3355202B2 (fi)
AT (1) ATE192494T1 (fi)
AU (1) AU666305B2 (fi)
CA (1) CA2069460C (fi)
DE (2) DE69230984D1 (fi)
ES (1) ES2145742T3 (fi)
FI (1) FI104427B (fi)
HU (1) HU216622B (fi)
IE (1) IE921656A1 (fi)
IL (1) IL101975A (fi)
NO (1) NO303645B1 (fi)
NZ (1) NZ242739A (fi)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6406902B1 (en) 1991-07-05 2002-06-18 Johns Hopkins University Herpes virus proteinase and methods of assaying
US5434074A (en) 1991-07-05 1995-07-18 Gibson; D. Wade Cytomegalovirus proteinase
US5376633A (en) * 1992-09-30 1994-12-27 Lezdey; John Method for deactivating viruses in blood component containers
WO1994029456A2 (en) * 1993-06-08 1994-12-22 Abbott Laboratories Herpes simplex virus type-2 protease
WO1995006055A1 (en) * 1993-08-20 1995-03-02 Smithkline Beecham Corporation Hsv-2 ul26 gene, capsid proteins, immunoassays and protease inhibitors
AU2395095A (en) 1994-04-29 1995-11-29 G.D. Searle & Co. Method of using (h+/k+) atpase inhibitors as antiviral agents
US5506115A (en) * 1994-04-29 1996-04-09 G. D. Searle & Co. Reagent and method for determining activity of herpes protease
US5486470A (en) * 1994-07-21 1996-01-23 Merck & Co., Inc. Purified herpes simplex virus protease and methods of purification
US5618685A (en) * 1995-04-06 1997-04-08 Merck & Co., Inc. Activation of herpes simplex virus protease by kosmotropes
US5985872A (en) * 1995-05-24 1999-11-16 G.D. Searle & Co. 2-amino-benzoxazinones for the treatment of viral infections
CA2222877A1 (en) * 1995-06-01 1996-12-05 Merck & Co., Inc. Herpes simplex type 1 protease mutants and vectors
US6083711A (en) * 1996-05-15 2000-07-04 Smithkline Beecham Corporation Proteases compositions capable of binding to said site, and methods of use thereof
US6756207B1 (en) 1997-02-27 2004-06-29 Cellomics, Inc. System for cell-based screening
DE69903337T2 (de) * 1998-10-30 2003-08-21 Cellomics, Inc. Ein screeningsystem auf zellbasis
WO2001046448A1 (en) * 1999-12-23 2001-06-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Inhibition of cellular proteases

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3800233A1 (de) * 1988-01-07 1989-07-20 Hans Prof Dr Dr Wolf Methoden fuer die gentechnologische produktion einer rekombinanten, enzymatisch aktiven hiv spezifischen protease und der vorlaeufermolekuele der gruppenspezifischen antigene (gag) und der polymerase (pol) und verwendung dieser produkte in ansaetzen zur testung von hiv-protease spezifischen inhibitoren

Also Published As

Publication number Publication date
FI922271A (fi) 1992-11-25
FI922271A0 (fi) 1992-05-19
EP0514830A3 (en) 1993-06-09
IE921656A1 (en) 1992-12-02
JPH05336964A (ja) 1993-12-21
EP0514830A2 (en) 1992-11-25
EP0514830B1 (en) 2000-05-03
HU9201723D0 (en) 1992-08-28
AU1711292A (en) 1992-11-26
HUT65494A (en) 1994-06-28
DE69230984D1 (de) 2000-06-08
DE69230984T2 (de) 2000-11-02
JP3355202B2 (ja) 2002-12-09
NO303645B1 (no) 1998-08-10
ATE192494T1 (de) 2000-05-15
ES2145742T3 (es) 2000-07-16
HU216622B (hu) 1999-07-28
CA2069460A1 (en) 1992-11-25
NO922029D0 (no) 1992-05-22
NO922029L (no) 1992-11-25
CA2069460C (en) 2002-12-31
DE69230984T4 (de) 2001-04-05
IL101975A (en) 1998-08-16
AU666305B2 (en) 1996-02-08
NZ242739A (en) 1994-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI104427B (fi) Menetelmä herpesviruksen proteaasin inhibointiin kykenevän aineen tunnistamiseksi
US7666582B2 (en) IdeS, an IgG-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes
Taguchi Fusion formation by the uncleaved spike protein of murine coronavirus JHMV variant cl-2
KR100245318B1 (ko) 헤르페스 프로테아제 억제제의 동정방법
IE83278B1 (en) Use of a herpes protease
Unal et al. The protease and the assembly protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (human herpesvirus 8)
Teng et al. Suppression of lymphocytic choriomeningitis virus—induced growth hormone deficiency syndrome by disease-negative virus variants
Beaudet-Miller et al. Virus-specific interaction between the human cytomegalovirus major capsid protein and the C terminus of the assembly protein precursor
Robertson et al. Separate functional domains of the herpes simplex virus type 1 protease: evidence for cleavage inside capsids
AU7382796A (en) Glycoprotein b of the rfhv/kshv subfamily of herpes viruses
US4940781A (en) Peptides comprising an immunogenic side of poliovirus and DNAs containing nucleotide sequences coding for these peptides
US6054130A (en) Non-splicing variants of gp350/220
US5925733A (en) DNA polymerase of gamma herpes viruses associated with Kaposi&#39;s sarcoma and retroperitoneal fibromatosis
US20130064844A1 (en) Non-splicing variants of gp350/220
US6033894A (en) Kaposi&#39;s Syndrome Herpesvirus protease and assembly protein compositions and methods
Qiu et al. Genome segment S8 of grass carp hemorrhage virus encodes a virion protein
US7186408B2 (en) Viral CD30 polypeptide
KR20030001163A (ko) 인체 파필로마 바이러스 유사 입자를 생산하는 재조합아데노바이러스 벡터 및 자궁경부암 생백신
RU2041949C1 (ru) Фрагмент днк нс365, полипептид, штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида, обладающего способностью связывать антитела к вирусу гепатита c
Shatkin et al. Translation Regulation by Reovirus Structural Proteins
Horst et al. Residues required for host shutoff activity are located in the “bridge” of the Epstein-Barr virus protein BGLF5
Mori Proteins of HHV-6
Whitehead Proteolytic maturation of Vaccinia virus structural proteins: enzyme and substrate analysis
Krueger et al. Proteins of HHV-6

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired