CN102023220A - 诊断宫颈癌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于检测人样品中病原体感染的试剂和方法。所述检测利用特定蛋白质以探测因病原体感染而导致的病原体蛋白质的存在或人蛋白质的反常表达。这里公开了用于在临床样品中检测致癌的人乳头状瘤病毒E6蛋白的具体方法、组合物和试剂盒。

Description

诊断宫颈癌的方法
交叉参考
本申请要求2003年7月29日提交的美国专利申请No.10/630,590、2003年7月25日提交的美国临时申请No.60/490,094、2003年2月27日提交的美国临时申请No.60/450,464以及2002年9月9日提交的美国临时申请No.60/409,298的权利。
发明领域
本发明涉及诸如在某些人乳头状瘤病毒(HPV)感染中所观察到的来源于致病生物的生物学标记的检测以及运用这样的诊断法以鉴别受到感染并可能导致癌变或其他机能紊乱的样本。所述发明也公开了作为一种肿瘤诊断手段用于在临床样本中检测致癌的HPV E6蛋白的组合物、方法和试剂盒。
发明背景
宫颈癌是妇女中第二位最常见的肿瘤，宫颈癌与目前99.7％的高危险性人乳头状瘤病毒感染有关。现在，每年在美国妇女中诊断出12,000个侵入性宫颈癌新病例，这导致每年5,000人死亡。而且，全球范围内每年约有400,000例的宫颈癌并有近200,000个死亡病例。人乳头状瘤病毒(HPV)是全球性传播疾病的最常见的原因之一。大体上，50-75％的性活跃的男性和女性在其生命的某一时点会招致生殖器HPV感染。仅在美国估计每年有5百50万人感染HPV，目前至少有2千万的感染者。100多个不同的HPV纯病毒株按照其与子宫颈癌或与良性子宫颈损伤或子宫颈发育异常的关系大致分成了高危险性和低危险性亚类。
大量证据指出HPV是宫颈癌的病原物质。1980年的多项研究报道了在子宫颈发育异常、肿瘤以及源自宫颈癌的细胞系中存在HPV变种。进一步的研究表明致癌的HPV 18基因组的E6-E7区域在宫颈癌细胞中被选择性保留，这说明HPV感染可能是引发癌变的原因，而且维持细胞永生化或癌变状态需要E6-E7区域的持续表达。第二年，Sedman等人证实了在培养物中，来自HPV 16的E6-E7基因足以引起人角质化细胞的永生化。Barbosa等人证实，虽然来自高危险性HPV的E6-E7基因能够转化细胞系，来自诸如HPV 6和HPV 11的低危险性或非致癌变种的E6-E7区域不能转化人角质化细胞。最近，Pillai等人对623例处于肿瘤发展不同阶段的子宫颈组织样本通过原位杂交检测了HPV 16和18的感染并通过免疫细胞化学检测了E6蛋白的表达，发现了组织学异常与HPV感染之间的显著相关性。
现行的治疗策略专注于实际的子宫颈发育异常而不是更深层次的HPV感染。医生每年对子宫颈发育异常的妇女进行筛查，并采用包括冷冻手术、激光切除和切除手术在内的表面切除技术进行治疗。随着疾病的发展，治疗手段变得更具侵略性，这包括了部分或完全子宫切除、放射治疗或化学治疗。对致癌的HPV感染的早期准确诊断以及针对引发癌变的HPV感染的治疗，通过疾病进程的早期干预以防止宫颈癌的发展，存在重大的需求。目前已有描述的人乳头状瘤病毒与局限于皮肤上皮层、或口腔、咽喉、呼吸道以及最重要的与肛门和生殖器黏膜损害相关。包括HPV 6和11在内的特殊的人乳头状瘤病毒类型经常引起良性的黏膜损伤，而其他诸如HPV 16和18的病毒类型以及许多其他病毒株主要在高度损害和肿瘤中被发现。感染黏膜表面的个别类型的人乳头状瘤病毒(HPV)被认为可能是引发子宫颈、肛门、阴茎、咽喉和口腔癌变、偶然引发甲周瘤以及良性的肛门与生殖器疣的因素。采用对特殊HPV类型进行鉴定的方法来鉴别具有恶化风险的癌变前损伤的患者。虽然在一些受人乳头状瘤病毒感染的病例中存在可见的肛门和生殖器损伤，大部分受到HPV生殖道感染的个体不具有临床明显病征，但是可以采用子宫颈涂片中存在的细胞形态特征分析来检测HPV感染。巴氏试验(Papanicolaou test)是一种有效的筛查手段，但是由于存在假阳性和假阴性测试结果，这些试验遗漏了高比例的HPV感染人群。此外，由于对检测结果的解读需要训练有素的病理学家，这样的试验不适于全球范围的检测。
包括血清学化验、ELISA夹心检测和细胞培养在内的常规病毒检测方法没有商用现货并/或不适于诊断和跟踪HPV感染。最近，可以采用几种以PCR(聚合酶链式反应)为基础的HPV感染的检测方法。虽然所述检测方法有助于区分致癌性感染和非致癌性感染，这些检测的实行是相当昂贵的，而且需要执行PCR操作的训练有素的技术人员和/或光度计检测。此外，PCR具有天然的假阳性率，可能要借助于进一步的检测和不必要的操作。由于已经表明，HPV的致癌性是建立在蛋白基础上的，HPVDNA或RNA的早期检测可能导致身体免疫系统可以天然解决的不必要的医学步骤。
采用传统方法检测人样本(例如肿瘤样本)中致癌HPV存在许多困难。例如，用抗体检测E6蛋白是困难的，因为人细胞中生成的E6含多种结构改变(如二硫键和磷酸基团)，使得在细菌系统中生产的野生型E6蛋白或化学合成的E6肽不能识别人细胞中的E6蛋白。而且，由于致癌E6蛋白没有共有的将其与非致癌E6蛋白相区别的抗原表位，单一的抗体不能用于所有致癌E6HPV毒株的检测。
疾病的检测和诊断是治疗疾病的先决条件。疾病的许多标记和特征已被鉴定并可用于疾病的诊断。受侵袭的细胞状态的改变先于许多疾病并且是许多疾病的特征。改变可以包括受感染细胞中病原体基因或蛋白的表达、受侵袭细胞中基因或蛋白表达的改变、以及细胞形态的改变。通过准确评估这些改变可以帮助检测、诊断和监测疾病。便宜、快速、早期准确的病原体检测可以为治疗和预防结果介于身体不适到死亡之间的疾病提供可能。
以下是感兴趣的重要出版物：Munger(2002)Front.Biosci.7：641-9；Glaunsinger(2000)Oncogene 19：5270-80；Gardiol(1999)Oncogene 18：5487-96；Pim(1999)Oncogene18：7403-8；Meschede(1998)J.Clin.Microbiol.36：475-80；Kiyono(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：11612-6；以及Lee(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：6670-5。此外，下列是感兴趣的专利和专利申请：Bleul，6,322,794；Cole，6,344,314；Schoolnik，5,415,995；Bleul，5753233；Cole，5,876,723；Cole，5,648,459；Orth，6,391,539；Orth，5,665,535；Schoolnik，4,777,239。
发明概述
这里提供了用于检测在多种细胞类型中(例如子宫颈、肛门、阴茎和咽喉细胞中)可能导致致癌细胞转化或生物学异常的病原体蛋白的方法和组合物。这些方法和组合物可以用于检测包括但不限于导致诸如宫颈癌、阴茎癌、肛门癌和咽喉癌在内的病原体。更具体地说，描述了用于检测临床样本中致癌的HPV E6的方法、组合物和检测试剂盒。
所述发明的一个优点是，与抗体不同，许多PDZ结构域蛋白结合大部分或所有来自人乳状瘤病毒的HPV E6，由此可用于诊断宫颈癌和其它癌症。
附图说明
图1是说明PDZ蛋白能特异性识别来自人乳状瘤病毒的致癌E6蛋白的柱状图。采用ELISA检测方法证实PDZ蛋白(TIP-1)能特异性识别来自致癌病毒株(HPV 18)的全长E6蛋白，但与非致癌病毒株(HPV 11)没有表现出任何反应性。系列1和系列2代表独立实验。E6ab表示检测采用抗HPV18E6抗体而不是PDZ蛋白。
图2是说明PDZ与HPV 18E6PLs结合的度依赖性的线形图。本图采用改进的ELISA检测方法测定TIP-1的PDZ结构域或MAGI-1(结构域2)与对应于来自HPV18的E6蛋白的C-末端20个氨基酸的肽段的结合。图例中的数字代表独立实验。-RT表示结合实验在室温下进行。没有-RT标志的数据系列是在4℃下进行的结合实验。
图3是说明抗HPV 18E6抗体识别GST-HPV 18E6融合蛋白的线形图。检测了用HPV 18E6蛋白免疫的Balb/c小鼠第28天的血清与GST-HPV18E6蛋白或单独GST的反应性。
图4.(A-D)是说明细胞溶解物对来自HPV 16的重组E6蛋白与不同的PDZ结构域结合的影响的4个线形图。
图5.(A-B)是表明多种PDZ结构域能与细胞中致癌E6蛋白结合并共沉淀的放射自显影图像。
图6是证明在SiHa宫颈癌细胞系中检测到内源性HPV16E6蛋白的免疫印迹结果的放射自显影图像。
图7是放射自显影图像说明，通过免疫印迹能在CasKi和SiHa宫颈癌细胞系中检测到HPV16E6蛋白，在存在蛋白酶体抑制剂的条件下进行细胞溶解处理，检测结果得到了加强。
图8是显示SiHa和CasKi子宫颈细胞系中HPV16E6蛋白的ELISA检测的线形图。
图9是细胞溶解物中HPV16E6蛋白的点杂交检测的放射自显影图像。
图10是SiHa和CasKi子宫颈细胞系的细胞溶解物中内源性HPV16E6蛋白的点杂交检测的放射自显影图像。
图11是说明能够在携带HPV16的宫颈肿瘤中检测到E6蛋白的免疫印迹的放射自显影图像。
发明详述
I.定义
这里所使用的“标记物”或“生物学标记”是指生物样本中能够被测量或检测的实体物。标记的例子包括核酸、蛋白或存在于生物样本中的化学物质。存在于人源的生物样本中的病毒或病原体的蛋白或核酸是标记物的一个例子。
这里所使用的术语“分离的”是指多核苷酸、多肽、抗体或宿主细胞处于与其天然存在状态不同的环境中。分离的多核苷酸、多肽、抗体或宿主细胞通常是充分纯化了的。这里所使用的术语“充分纯化”是指将化合物(例如多核苷酸、多肽或抗体)从其自然环境中移出，至少60％、优选的是75％、最优选的是90％与其在天然条件下结合的其他成分分离。因而，例如在总的A+B组合物中至少含85％(重量百分比)的A的情况下，含有A的组合物与B“充分分离”。优选的是，A构成总的组合物A+B重量比的至少约90％，更优选的是，A构成重量比的至少约95％或甚至99％。
术语“生物样本”包括得自生物体的并可以用于诊断或监测的多种类型的样品。这一术语包括血样和其他生物来源的液体样本以及固体组织样本(如活体组织切片样本或组织培养物或源自组织培养物的细胞及其后代)。所述术语包括在其获得后经过任何方式处理过的样本，例如通过试剂处理、溶解或特定组分富集等方式。所述术语包括临床样本，也包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞溶解物、血清、血浆、体液和组织样本。术语“生物样本”必须将临床样本与可能的重组样本或源自重组样本的样本加以区分。
被HPV“感染”的个体是指具有含HPV的细胞的个体。细胞内的HPV可能不表现出任何其他的表型(即HPV感染的细胞不必定是癌细胞)。换言之，HPV感染的细胞可以是癌前细胞(也就是除了可能与病毒感染相关的表型以外，没有表现出任何异常表型的细胞)或癌细胞。
这里所使用的“融合蛋白”或“融合多肽”是指复合的蛋白，也就是由两条(或更多)独立的、异源的、正常情况下没有融合在一条氨基酸序列中的多肽构成的一条邻接的氨基酸序列。因此，一个融合蛋白可以包括含有两条完全不同的氨基酸序列或两条相似或相同的多肽序列的单一的氨基酸序列，前提是假如未发现这些序列在自然界中在正常情况下以所述相同的结构共存于单一的氨基酸序列中。融合蛋白通常可以采用核酸重组方法(就是由编码本发明所述多肽的片段和编码异源蛋白的片段组成的重组基因融合产物的转录和译结果)或本领域所熟知的化学合成方法制备。
这里所使用的“融合蛋白构建物”是指编码融合蛋白的多核苷酸。
“致癌HPV病毒株”是由国家癌症研究所(NCI，2001)确定的已知引起宫颈癌的HPV病毒株。“致癌E6蛋白”是指上述致癌HPV病毒株所编码的E6蛋白。表3列举了致癌病毒株的例子。这里没有特意列举的本领域所知的致癌HPV病毒株可以在国家生物技术信息中心(National Center for biotechnology Information)(NCBI)的万维网网站上获得。
“致癌E6蛋白结合伴侣”可以是与E6蛋白特异结合的任何分子。适宜的致癌E6蛋白结合伴侣包括PDZ结构域(如下所述)、抗致癌E6蛋白的抗体、其他识别致癌E6蛋白的蛋白(如p53、E6-AP或E6-BP)、DNA(即十字形DNA)以及其他如适体或来源于噬菌体展示的单链抗体等的伴侣。在一些实施方案中，希望检测1个以上的致癌E6蛋白(例如，来自HPV病毒株16、18和33的所有致癌E6蛋白或E6蛋白)，由此，致癌E6蛋白结合伴侣可以是与这些蛋白结合的抗体或各自与一种不同蛋白结合的抗体的混合物。如本领域所知的，这样的结合伴侣可以进行标记以便于其检测。通常，结合伴侣与E6结合的亲和力是10-5M或更高，如10-6M或更高、10-7M或更高、10-8M或更高(例如10-9M、10-10、10-11等)。
这里所使用的术语“PDZ结构域”是指小于约90个氨基酸(即约80-90、约70-80、约60-70或约50-60个氨基酸)的蛋白序列(也就是模块式蛋白结构域)，其特征是与大脑突触蛋白PSD-95、果蝇隔膜接头蛋白Discs-Large(DLG)以及上皮紧密接头蛋白ZO1(ZO1)同源。PDZ结构域也称为Discs-Large同源重复序列(DHRs)和GLGF重复序列。PDZ结构域通常可能保持一个核心共同序列(Doyle D.A.，1996，Cell85：1067-76)。
在包括鸟苷酸激酶同源体的MAGUK家族成员、多种蛋白磷酸酶和激酶、神经元一氧化氮合成酶、肿瘤抑制蛋白以及统称为肌养结合蛋白的多种肌养蛋白相关蛋白在内的多种膜相关蛋白中发现了PDZ结构域。
表2和实施例4中展示了示范性的含PDZ结构域的蛋白以及PDZ结构域序列。术语“PDZ结构域”也包括所述序列的变体(如天然存在的变体，多态性变体，保守置换变体等)和来自其他物种(如小鼠、大鼠)的结构域。典型的PDZ结构域与美国专利申请09/724553中所展示的充分相同，例如，在最大对应度的比较和对齐排列时，具有至少约70％、至少约80％或至少约90％氨基酸残基相同性。在本领域中需要认识到，可以对PDZ结构域实行突变以产生能增强或减弱结合并改变特异性的氨基酸改变，但它们保持为PDZ结构域(Schneider等，1998，Nat.Biotech.17：170-5)。除了另有说明以外，提及具体的PDZ结构域(例如MAGI-1结构域2)意味着包括所述具体PDZ结构域及其HPV E6结合变体。换言之，如果涉及具体的PDZ结构域，则也同样涉及如下所述的这一结合HPV致癌E6蛋白PDZ结构域的变体。在这一点上需要指出蛋白中PDZ结构域的编号可以发生改变。例如，如这里所涉及的MAGI-1结构域2，在其他文献中可能作为MAGI-1结构域1被提及。同样的，当本申请中提及一个特定的蛋白PDZ结构域时，这里所提及的应当理解为如这里所述的、尤其是序列列表中的该结构域的序列。插入在权利要求书之前的表9显示了适当情况下多个结构域在序列列表中的序列和名称与Genbank登录号之间的关系。
这里所使用的术语“PDZ蛋白”是指包含PDZ结构域的天然蛋白。示范性的PDZ蛋白包括CASK、MPP1、DLG1、DLG2、PSD95、NeDLG、TIP-33、SYNla、TIP-43、LDP、LIM、LIMK1、LIMK2、MPP2、NOS1、AF6、PTN-4、prIL16、41.8kD、KIAA0559、RGS12、KIAA0316、DVL1、TIP-40、TIAM1、MINT1、MAGI-1、MAGI-2、MAGI-3、KIAA0303、CBP、MINT3、TIP-2、KIAA0561和TIP-1。
这里所用的术语“PDZ结构域多肽”是指含有PDZ结构域的多肽，如包含PDZ结构域序列的融合蛋白、天然存在的PDZ蛋白或分离的PDZ结构域肽段。因此，PDZ结构域多肽的长度可以是约60个氨基酸或更多、约70个氨基酸或更多、约80个氨基酸或更多、约90个氨基酸或更多、约100个氨基酸或更多、约200个氨基酸或更多、约300个氨基酸或更多、约500个氨基酸或更多、约800个氨基酸或更多、约1000个氨基酸或更多、通常达到2000个氨基酸或更多。PDZ结构域肽段通常不大于约100个氨基酸(如50-60个氨基酸、60-70个氨基酸、80-90个氨基酸或90-100个氨基酸)并编码一个PDZ结构域。
这里所使用的术语“PL蛋白”或“PDZ配体蛋白”是指与PDZ结构域形成分子复合物的天然存在的蛋白，或是指当其C末端与全长蛋白分开表达时(例如，象4-25个残基的肽段(如8、10、12、14或16个残基))形成这样的分子复合物的蛋白。所述分子复合物可以用“A检测法”或“G检测法”在体外或体内进行观测。表3和4中列举的示范性的PL蛋白经证实能结合具体PDZ蛋白。所述定义不包括抗PDZ抗体及其他类似物。
这里所使用的“PL序列”是指PL蛋白C末端的氨基酸序列(例如，C末端2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20或25个残基)(“C末端PL序列”)或指已知结合PDZ结构域的内部序列(“内部PL序列”)。
这里所使用的“PL肽“是指具有来自或基于PL蛋白C末端序列的序列的肽段。表3中列举了示范性的PL肽(生物素化的)。
这里所使用的“PL探测分子”是能特异性识别并结合PL序列的蛋白。
这里所使用的“PL融合蛋白”是含有将PL序列作为一个结构域的融合蛋白(通常作为所述融合蛋白C末端结构域)。tat-PL序列融合是PL融合蛋白的一个例子。
这里所使用的“PL抑制肽序列”是指抑制PDZ结构域多肽与PL肽之间相互作用(例如在A检测或G检测中)的PL肽氨基酸序列(以肽或PL融合蛋白的形式)。
这里所使用的“PDZ结构域编码序列”指编码PDZ结构域的多核苷酸片段。在不同实施方案中，所述多核苷酸是单链或双链DNA和RNA。
在用于调节相互结合作用(如PDZ结构域序列与PL序列的结合)的上下文中时，这里所使用的术语“拮抗剂”或“抑制剂”可以交替使用，指降低如PL序列(例如PL肽)与如PDZ结构域序列(如PDZ蛋白、PDZ结构域肽)的结合的物质。
在用于调节相互结合作用(如PDZ结构域序列与PL序列的结合)的上下文中时，这里所使用的术语“激动剂”或“增强子”可以交替使用，指增强如PL序列(例如PL肽)与如PDZ结构域序列(如PDZ蛋白、PDZ结构域肽)的结合的物质。
这里使用的术语“类肽”、“拟肽”和“肽类似物”可以交替使用，是指具有与本发明中的PL抑制肽或PL结合肽充分相同的结构和/或功能特征的合成的化合物。所述的类似物可以是完全由合成的、非天然的氨基酸类似物构成，或是部分天然肽氨基酸和部分非天然的氨基酸类似物组成的嵌合分子。所述类似物也可以包含任何数量的天然氨基酸保守置换，只要这样的置换不足以改变所述类似物的结构和/或抑制或结合活性。对于本发明中多肽的保守变体而言，常规实验能够确定一种类似物是否包括在本发明范围以内，即是否其结构和/或功能发生了充分改变。因而，如果一种模拟组合物能结合PDZ结构域和/或抑制PL-PDZ相互作用，那么该类似物包括在本发明范围以内。
多肽模拟组合物可以包含通常选自下列三种结构基团的非天然结构组分的任意组合：a)与天然酰胺(“肽”)连接不同的残基连接基团；b)替代天然氨基酸残基的非天然残基；或c)促进二级结构模拟(即促进或稳定二级结构(如β转角、γ转角、β折叠、α螺旋及其他构象))的残基。
一条多肽可以具备类似物的特征，如果其全部或一些残基通过与天然肽不同的化学方法结合。单独的拟肽残基可以通过肽、其他化学或偶联方法(诸如例如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺脂、双功能马来酰亚胺、N，N＝-二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N＝-二异丙基碳二亚胺(DIC))结合。除传统的酰胺(“肽”)连接外的连接基团可以包括例如甲叉酮(如针对-C(＝O)-NH-的-C(＝O)-CH2-)、甲叉胺(CH2-NH)、乙烯、烯烃(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑(CN4-)、噻唑、糖苷、硫代酰胺或酯(参见例如Spatola所著(1983)《氨基酸、肽与蛋白的化学与生物化学》一书第7卷267-357页的《肽骨架修饰》章节(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides andProteins，Vol.7，pp 267-357，A Peptide Backbone Modifications，Marcell Dekker，NY))。
通过包含所有或一些取代天然氨基酸残基的非天然残基，一条多肽也可以具备类似物的特征。非天然残基在科技文献和专利文献中有详细描述；以下描述了一些示范性的用作天然氨基酸残基类似物的非天然组合物及其指南。
芳香性氨基酸类似物可以通过用下列残基替代产生，例如D-或L-萘基丙氨酸(naphylalanine)；D-或L-苯基甘氨酸；D-或L-2噻吩酮丙氨酸(thieneylalanine)；D-或L-1，-2，3-，或4-芘丙氨酸(pyreneylalanine)；D-或L-3噻吩酮丙氨酸；D-或L-(2-吡啶)-丙氨酸；D-或L-(3-吡啶)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪)-丙氨酸；D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基丙氨酸；D-p-氟苯丙氨酸；D-或L-p-双苯基苯丙氨酸；K-或L-p-甲氧基双苯基苯丙氨酸；D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸；和D-或L-烷基丙氨酸，其中烷基可以替代为或不替代为甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、2-异己基、异戊基或非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳香环包括例如噻唑基、苯硫基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳香环。
酸性氨基酸类似物可以通过用例如在保持一个负电荷情况下非羧酸化氨基酸、(膦酸基)丙氨酸；硫酸化苏氨酸替代产生。羧基一侧的基团(如天冬氨酰或谷氨酰)也可以通过与诸如例如1-环己基-3(2-吗啉基-(4-乙基))碳二亚胺或1-乙基-3(4-阳离子氮-4，4-二甲氨戊基)碳二亚胺等碳二亚胺(R＝-N-C-N-R＝)反应进行选择性修饰。天冬氨酰基或谷氨酰基也可以通过与铵离子反应转化成天冬酰胺酸和酰胺谷氨酸残基。
碱性氨基酸类似物可以通过用例如(除了赖氨酸和精氨酸以外)氨基酸鸟氨酸、瓜氨酸或(胍基)-乙酸或(胍基)烷基乙酸(烷基见前文定义)等替代产生。腈类衍生物(例如含替代COOH的CN部分)可用于替代天冬酰胺酸或酰胺谷氨酸。天冬氨酸和谷氨酸残基可以脱去氨基形成相应的天冬氨酸和谷氨酸残基。
精氨酸残基类似物可以通过精氨酰与例如一种或多种包括例如苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮或茚三酮在内的常规试剂优选地在碱性条件下反应产生。
酪氨酸残基类似物可以通过酪氨酰与例如芳香性重盐化合物或四硝基甲烷反应产生。N-乙酰咪唑(N-acetylimidizol)和四硝基甲烷可以分别用于形成O-乙酰酪氨酰类化合物和3-硝基衍生物。
半胱氨酸残基类似物可以通过半胱氨酰残基与例如诸如2-氯乙酸或氯乙酰胺的α-环乙酸(haloacetates)和相应的胺反应产生，生成羧甲基或羧胺甲基衍生物。半胱氨酸残基类似物也可以通过半胱氨酰残基与例如溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑)丙酸；磷酸氯乙酸、N-烷基马来酰亚胺、二硫3-硝基-2吡啶；二硫甲基2-吡啶；p-氯汞苯甲酸(p-chloromercuribenzoate)；2-氯汞-4硝基酚；或氯-7-硝基苯并-氧杂-1、3-二唑反应产生。
赖氨酸类似物可以通过赖氨酰与例如琥珀酸的或其他羧酸酐反应产生(氨基末端残基可以改变)。赖氨酸及其他含α氨基的残基类似物也可以通过与诸如甲基吡啶酰胺酯(methyl picolinimidate)、吡哆醛、吡哆醛、硼氢化氯、三硝基苯、O-甲基异脲、2，4戊二等酰亚胺酯反应以及转酰胺基催化的与乙醛反应产生。
甲硫氨类似物可以通过与例如硫氧甲硫氨反应产生。脯氨类似物包括例如哌啶、唑烷二、3-或4-羟脯胺、脱氢脯氨、3-或4-甲基脯氨或3，3，-二甲基脯氨。组氨残基类似物可以通过组氨酰与例如二乙基焦碳酯或对溴苯酰甲基溴反应生成。
其他类似物包括，例如通过脯氨和赖氨羟基化；丝氨或苏氨残基的羟基
化；赖氨、精氨和组氨的α氨基基团甲基化；N末端氨基乙酰化；主链酰胺残基甲基化或由N-甲基氨基替代；或C末端基基团胺基化产生的类似物。
天然多肽(例如PL多肽或PDZ多肽)的成分也可以被具有相反手性的氨基(或类肽残基)所替代。因而，任何以L-构象(取决于所述化学个体的结构，也可以称为R或S构象)存在的天然氨基可以用相同化学结构类型但相反手性(通常称为D-型氨基，不过另外也可以称为R-或S-型)的氨基或类肽替代。
本发明中的类似物还可以包括含结构类似残基，尤其是促进或模拟诸如β转角、β折叠、α旋结构、γ转角及其他类似结构的二级结构的组合物。例如，用D型氨基、N-α-甲基氨基、C-α-甲基氨基或脱氢氨基替代肽内的天然氨基残基，可以促进或稳定β转角、β折叠、α旋结构、γ转角等构形。如在Nagai(1985)Tet.Lett.26：647-650；Feigl(1986)J.Amer.Chem.Soc.108：181-182；Kahn(1988)J.Amer.Chem.Soc.110：1638-1639；Kemp(1988)Tet.Lett.29：5057-5060；Kahn(1988)J.Molec.Recognition 1：75-79等文献中已对β转角类似结构进行了描述。β折叠类似结构在例如Smith(1992)J.Amer.Chem.Soc.114：10672-10674中已有描述。例如，Beusen(1995)在Biopolymers 36：181-200中描述了一种cis氨基化合物替代物1，5-二基取代四氮唑促进VI型β折叠形成。Banerjee(1996)在Biopolymers 39：769-777中描述了合并非手性Ω氨基残基生成作为酰氨替代物的聚亚甲基单元。多肽二级结构可以通过例如高场1H NMR或2D NMR光分析进行分析，参见例如Higgins(1997)J.Pept.Res.50：421-435。也可参见Hruby(1997)Biopolymers 43：219-266和Balaji等人的美国专利No.5,612,895。
这里所使用的术语“肽变体”和“保守氨基替代”是指通过相似性质的氨基残基(基于大小、极性、亲水性及其他性质)的替代使肽区别于参肽(例如，含特定PL蛋白基末端序列的肽)。为此，本发明范围内所包括的化合物根据指定类别的氨基残基进行部分阐述，主要根据氨基侧链的性质，所述氨基通常可以分成三个主要类别：疏水性氨基酸、亲水性氨基酸和半胱氨酸类氨基酸。这些主要类别可以进一步分为亚类。亲水性氨基酸包括具有酸性、碱性或极性侧链的氨基酸，疏水性氨基酸包括具有芳香性或非极性侧链的氨基酸。非极性氨基酸可以进一步细分为包括脂肪族氨基酸及其他。这里所使用的氨基酸类别定义如下：
“疏水性氨基酸”指具有在生理pH值下不带电荷并排斥水溶液的侧链的氨基酶。遗传编码的疏水性氨基酸的例子包括Ile、Leu和Val。非遗传编码的疏水性氨基酸的例子包括t-BuA。
“芳香性氨基酸”指具有含至少一个具备共轭s电子体系的环(芳香环)的侧链的疏水性氨基酸。芳基可以用诸如烷基、烯基、炔基、羟基、磺酰基、硝基和氨基及其他基团进一步替代。遗传编码的芳香性氨基酸的例子包括Phe、Tyr和Trp。通常遇到的非遗传编码芳香性氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、4-氯-苯基丙氨酸、2-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸和4-氟苯基丙氨酸。
“非极性氨基酸”指具有在生理pH值下通常不带电荷并不是极性的侧链的疏水性氨基酸。遗传编码的非极性氨基酸的例子包括Gly、Pro和Met。非编码的非极性氨基酸的例子包括Cha。
“脂肪族氨基酸”指具有饱和的或不饱和的直链、分支的或环状碳氢侧链的非极性氨基酸。遗传编码的脂肪族氨基酸的例子包括Ala、Leu、Val和IIe。非编码的脂肪族氨基酸的例子包括NIe。
“亲水性氨基酸”指具有亲和水溶液的侧链的氨基酸。遗传编码的亲水性氨基酸的例子包括Ser和Lys。非编码的亲水性氨基酸的例子包括Cit和hCys。
“酸性氨基酸”指具有小于7的pK值的侧链的亲水性氨基酸。由于一个氢离子解离，在生理pH值下酸性氨基酸通常带负电。遗传编码的酸性氨基酸的例子包括Asp和Glu。
“碱性氨基酸”指具有大于7的pK值的侧链的亲水性氨基酸。由于与水合氢离子结合，在生理pH值下碱性氨基酸通常带正电。遗传编码的碱性氨基酸的例子包括Arg、Lys和His。非遗传编码的碱性氨基酸的例子包括非环状氨基酸鸟氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
“极性氨基酸”指具有在生理pH值下不带电的侧链，但其包含的通常由两个原子共享的电子对更靠近其中一个原子的亲水性氨基酸。遗传编码的极性氨基酸的例子包括Asx和Glx。非遗传编码的极性氨基酸的例子包括瓜氨酸、N-乙酰赖氨酸和硫氧甲硫氨酸。
“半胱氨酸类氨基酸”指具有能与另一个氨基酸残基形成如二硫的共价连接的侧链的氨基酸。一般而言，半胱氨酸类氨基酸通常具有含至少一个硫醇(SH)基团的侧链。遗传编码的半胱氨酸类氨基酸的例子包括Cys。非遗传编码的半胱氨酸类氨基酸的例子包括高半胱氨酸和青霉胺。
正如精通本领域的人员所认识到的，上述分类不是绝对的-几种氨基酸表现出多种特征性质，因而能够包括在几个类别中。例如，酪氨酸既有芳香环又有极性的羟基。因此，酪氨酸具有双重特性并能同时包含在芳香性和极性类别内。类似的，除了能够形成二硫，半胱氨酸也具有非极性特征。因而，虽然没有严格地将其划分为疏水性或非极性氨基酸，在许多情况下半胱氨酸可以用于使肽具有疏水性。
可以构成本发明中的肽和肽类似物的某些经常使用的非遗传编码的氨基酸包括但不限于：β-丙氨酸(b-Ala)以及其他如3-氨基丙酸(Dap)、2，3-二氨基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸等Ω氨基酸；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；t-丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；环己胺(Cha)；正亮氨酸(Nle)；2-萘基丙氨酸(2-Nal)；4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2噻吩丙氨酸(Thi)；硫氧甲硫氨酸(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰赖氨酸(AcLys)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；2，3-二氨基丁酸(Dbu)；p-氨基苯基丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)以及高丝氨酸(hSer)。这些氨基酸也方便地归入上述的类别中。
下面的表1中总结了上述遗传编码和非编码氨基酸的分类。需要理解的是，表1只是为了说明的目的，而不意味着包括这里所描述的肽和肽类似物的氨基酸残基的完全清单。其他可用于制备这里所描述的肽和肽类似物的氨基酸残基可以参考如Fasman 1989年所著《CRC生物化学与分子生物学实践手册》(CRC Practical Handbookof Biochemistry and Molecular Biology，CRC Press，Inc.，1989)及其引用的参考文献。这里没有特别提及的氨基酸在已知的表现和/或其与明确鉴别的氨基酸相比特别的化学和/或物理性质的基础上，可以方便地归入上述类别。
表1
Figure BSA00000217556800131
在这里所描述的PDZ蛋白的情况中，特定PDZ结构域的“HPV E6结合变体”是保持HPV E6PDZ配体结合活性的PDZ结构域变体。下文对测定PDZ结构域变体是否结合HPV E6的检测方法进行了详细描述，识别特定PDZ结构域中哪个氨基酸的改变使之成为变体的指导可以参见各种原始资料。在一个实例中，例如，可以将一个PDZ结构域与这里所描述的其他PDZ结构域进行比较并可以将相应位置上的氨基酸进行替换。在另一个实例中，一个特定PDZ蛋白的PDZ结构域序列可以与来自另一个物种的等价PDZ蛋白的等价PDZ结构域序列比较。例如，一个人的PDZ蛋白的PDZ结构域序列可以与来自其他物种的(如小鼠、大鼠等)其他已知的等价的PDZ结构域序列比较，任何所述两个序列之间不同的氨基酸可以替换入所述的人PDZ结构域以生成所述PDZ结构域的变体。例如，人MAGI-1PDZ结构域2序列可以与其他物种的(如小鼠，Genbank gi号7513782和28526157或其他同源序列)等价MAGI-1PDZ结构域比较以确定可以替换入人MAGI-1-PDZ结构域的氨基酸从而产生其变体。这样的方法可用于这里所述的任何MAGI-1PDZ结构域。序列编号293-301中提供了最小的MAGI-PDZ结构域2序列。与序列列表中的一条序列相比，具体的变体可以含1个、直到5个、直到约10个、直到约15个、直到约20个或直到约30个或更多，经常达到约50个氨基酸改变。示范性的MAGI-1PDZ变体包括序列编号302-330所表述的序列。在产生变体时，如果PDZ结构域中存在GFG基序，则通常不要改变该基序。
用默认参数通过BLAST2.0检测延伸至整个PDZ结构域的区域，通常，不同的PDZ结构域多肽含与这里所述的变异PDZ结构域多肽至少约70或80％、通常至少约90％、更常见是至少约98％序列相同。
这里所使用的术语“可检测标记”具有本领域内的普通含义，是指能用于检测(例如，由于其物理或化学性质)、指示存在一种分子或能共价结合或以其他连接方式结合另一个分子的原子(例如放射性核)、分子(例如荧光素)或复合物。术语“标记”也指共价结合或以其他方式连接的作用于底物以产生可检测的原子、分子或复合物的分子(例如，诸如酶等生物分子)。适用于本发明的可检测标记包括任何用光谱的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电学的、光学的或化学的手段检测的合成物。本发明中可用的标记包括用于与标记的链霉亲和素偶合物染色的生物素、磁珠(如DynabeadsTM)、荧光染料(如荧光素、得克萨斯红、罗丹明、绿荧光蛋白、增强绿荧光蛋白及其他)、放射性标记(如3H、125I、35S、14C、或32P)、酶(如水解酶，尤其是如碱性磷酸酶的磷酸酶、酯酶和糖苷酶、或氧化还原酶，尤其是如辣根过氧化物酶的过氧化物酶、以及其他ELISA中常用的酶)、底物、辅助因子、抑制剂、化学发光基团、显色试剂、以及如胶体金或有色玻璃或塑胶(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠的比色标记。指导使用这些标记的专利包括美国专利Nos.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。检测这些标记的手段是精通本领域的人员所熟知的。因而，例如，放射性标记和化学发光标记可以用照相底片或闪烁计数器检测，荧光标记可以用探测放射光的光电探测器检测(如在荧光激发细胞分类中)，酶标记通常通过提供底物并检测酶与底物反应生成的反应产物进行检测，比色标记通过简单地观察有色标记物进行检测。因此，标记是可以通过光谱的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电学的、光学的或化学的方法检测的任何化合物。按照本领域所熟知的方法，标记物可以直接或间接与分析方案所希望的成分连接。非放射性标记物经常以间接方法连接。通常，配体分子(如生物素)与该分子共价结合。随后所述配体与一个抗配体(如链霉亲和素)分子结合，后者或是直接可检测的，或是与诸如可检测的酶、荧光化合物、或化学发光化合物等信号生成系统共价相连的。多种配体和抗配体可供使用。在配体具有天然抗配体的情况下(例如生物素、甲状腺素和皮质醇)，它能与标记的天然抗配体联合使用。此外，任何的半抗原或抗原化合物可以与抗体组合使用。所述分子也可以直接与信号生成化合物偶联，例如通过与酶或荧光团偶联。检测标记物的方法是精通本领域的人员所熟知的。因而，例如，当所述标记物是放射性标记物时，检测方法包括闪烁计数器、放射自显影中的照相底片、或存储式磷屏成像。当所述标记物是荧光标记物时，可以通过用适当波长的光激活荧光基团并检测产生的荧光的方式检测。荧光可以通过照相底片、使用如电荷耦合装置(CCD)的电探测器或光电倍增器及其他手段观察。类似的，酶标可以通过提供合适的底物并检测产生的反应产物进行检测。简单的比色标记物也可以通过观测与标记物相连的颜色进行检测。需要认识到，在检测方案中使用一对荧光团时，经常优选具有不同发射光谱的(波长)，这样就能容易地加以区分。
在比较氨基酸序列的上下文中，这里所使用的术语“充分相同”意味着当最符合的对齐排列和比较时，所述序列具有至少约70％、至少约80％、或至少约90％的氨基酸残基一致性。FASTA算法是测定序列一致性和相似性百分比的适宜的算法，在Pearson，W.R.和Lipman，D.J.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.US.，4.85：2444中描述了该算法。也可参考W.R.Pearson，1996，Methods Enzymol.266：227-258。对用于计算一致性百分比的DNA序列的FASTA对齐排列中所用的优选参数进行了优化，BL50矩阵15:-5，K-元组＝2；接缝罚分＝40，最优化＝28；缺口罚分-12，缺口长度罚分＝-2；宽度＝16。
这里所使用的术语“夹心”、“夹心ELISA”、“夹心诊断”和“ELISA捕获法”都是指用两种不同的检测试剂检测生物学多肽的概念。例如，PDZ蛋白可以直接或间接附着于固体支持物。待测样品可以通过固体表面，所述PDZ蛋白能够结合其对应的PL蛋白。随后可以使用标记的抗体或其他检测试剂以测定特定的PL蛋白是否已经与所述PDZ蛋白结合。
“固相支持物”或“载体”是指任何能够结合多肽、抗原或抗体的支持物。熟知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然或修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁。取决于本发明的目的，所述载体的性质可以是一定程度可溶的或不可溶的。所述支持材料事实上可以具有任何可能的结构构造，只要与之连接的分子能够结合PDZ结构域多肽或E6抗体。因而，所述支持物的形状可以是球形的(如在小珠中)、或圆柱形的(如在试管的内表面或杆状物的外表面)。另外，所述表面可以是平坦的，如薄片、培养皿、测试条等。精通本领域的人员会知道多种其他结合抗体、肽或抗原的适宜的载体，或通过常规实验可以确定这样的载体。
这里所使用的术语“待测化合物”或“待测物”可以交替使用，是指可能具有增强子/激动剂或抑制剂/拮抗剂活性(例如抑制或增强如PDZ-PL结合的相互作用)的候选物质。所述候选物质或待测化合物可以是多种化合物中的任意选择，这些化合物可以是天然存在的或合成的、有机的或无机的，包括聚合物(如寡多肽、多肽、寡核苷酸和多核苷酸)、小分子、抗体(如这里广泛定义的)、糖类、脂肪酸、核苷酸和核苷酸类似物、天然结构类似物(如类肽、核酸类似物及其他)以及许多其他化合物。在某些实施方案中，待测物从诸如随机或组合肽库或非肽库的多样性文库中制备。可以使用许多本领域内所知的文库，如化学合成文库、重组(如噬菌体展示文库)、以及基于体外翻译的文库。在Fodor等，1991，Science 251：767-773；Houghten等，1991，Nature 354：84-86；Lam等，1991，Nature 354：82-84；Medynski，1994，Bio Technology12：709-710；Gallop等，1994，J.Medicinal Chemistry 37(9)：1233-1251；Ohlmeyer等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10922-10926；Erb等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422-11426；Houghten等，1992，Biotechniques 13：412；Jayawickreme等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：1614-1618；Salmon等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11708-11712；PCT公开No.WO 93/20242；以及Brenner和Lerner，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5381-5383中描述了化学合成文库的例子。在Scott和Smith，1990，Science 249：386-390；Devlin等，1990，Science，249：404-406；Christian，R.B.等，1992，J.Mol.Biol.227：711-718；Lenstra，1992，J Immunol.Meth.152：149-157；Kay等，1993，Gene 128：59-65；以及1994年8月18日的PCT公开No.WO94/18318中描述了噬菌体展示文库的例子。基于体外翻译的文库包括但不限于在1991年4月18日的PCT公开No.WO 91/05058以及Mattheakis等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9022-9026中所描述的文库。作为非肽类库的例子，可以对苯二氮卓文库(参见例如Bunin等人的1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：4708-4712)进行改进以供使用。也可以使用peptoid类肽文库(Simon等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：9367-9371)。Ostresh等人(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11138-11142)描述了可以使用的另一个文库的例子，该文库中肽的氨基功能基团已被事先甲基化以生成化学改造的组合文库。
术语“特异性结合”指两个分子之间的结合(例如配体与受体之间)，其特征在于一个分子(配体)即便在存在多种其他不同分子的情况下能够与另一个具体分子(受体)结合，也就是在异质分子混合物中一个分子对另一个分子表现出优先的结合能力。通过在存在过量未标记配体情况下可检测的标记配体与受体结合的减弱也可以说明配体与受体的特异性结合(亦即竞争结合检测)。
在一些实施方案中，可以使用“蛋白酶体抑制剂”。这些包括苄氧羰基-leu-leu-1正缬氨酸II(MG 115)或CBZ-LLL的抑制剂可以向化学品供应商购买(如Sigma)。正如精通本领域的技术人员所理解的，蛋白酶体抑制剂不同于蛋白酶抑制剂。
这里所使用的PDZ蛋白(或相应的PDZ结构域或PDZ融合多肽)的复数形式具有通常含义。在一些实施方案中，多种蛋白是至少5种、经常至少25种、至少40种、或至少60种不同的PDZ蛋白。在一些实施方案中，多种蛋白选自表2中列举的PDZ多肽列表。在一些实施方案中，多种不同的PDZ蛋白来源于(也就是表达在)特定的组织或特定种类或类型的细胞。在一些实施方案中，多种不同的PDZ蛋白代表所有已知或认为在组织或细胞中表达的PDZ蛋白(例如已知存在于淋巴细胞或造血细胞中的所有PDZ蛋白)的实质部分(例如，通常至少50％，更常见的是至少80％)。在一些实施方案中，多种PDZ蛋白是指这里所公开的在特定细胞中表达的PDZ蛋白的至少50％、通常至少80％、至少90％或其全部。
当提及PL肽(或相应的蛋白，例如对应于表3或这里其他地方列举的肽的)时，“多种”是指至少5种、至少10种、通常至少16种如这里所具体列举的或属于前文对PDZ结构域所作的分类和百分比的PL肽。
II.综述
本发明的发明人已经鉴别了大量能在多种生理系统中发挥重要生物学功能的PDZ蛋白和PL蛋白之间的相互作用。在一个细胞中，这里所使用的术语“生物学功能”是指通常由细胞实现的可检测的生物学活性，例如诸如细胞增殖(例如肿瘤)、细胞活化、细胞因子释放、脱颗粒、酪氨酸磷酸化、离子(例如钙离子)通量、代谢活动、凋亡、基因表达改变、细胞结构的保持、细胞迁移、附着于基质、信号转导、细胞间相互作用以及其他这里所描述的或本领域已知的细胞活动。
由于参与所述相互作用的蛋白参与多种生理系统(见上述发明背景部分)，这里所提供的方法可广泛或选择性用于对反常细胞表型或病原体感染的诊断。这里也公开了用PDZ：PL蛋白相互作用来测定脊椎动物生物样本中是否存在病原生物体的方法。
正如下面将详细讨论的，为诊断目的而使用PDZ-PL相互作用适用于许多不同的检测形式并且不仅限于这里所作的讨论。对于ELISA检测，诊断检测方式可以是如用于怀孕测试的试纸检测，是可与待测样本孵育的薄膜检测，是可以在上放置样本的基片检测，或其他这样的介质。这样的形式是本领域熟知的，并在美国专利6,180,417；4,703,017；5,591,645中进行了描述。
III.PDZ蛋白和PL蛋白的相互作用
表4列举了本发明的发明人已经鉴定相互结合的PDZ蛋白和PL蛋白。表4的每页包括4栏。每部分中的栏由左向右编号，这样每一部分中最左边的栏是第1栏，每一部分中最右边的是第4栏。每一部分第1栏标为“HPV病毒株”并列举了包含经验证的PDZ配体序列(PL，在圆括号中表示)的不同E6蛋白。这一栏列举了对应于用于所述结合研究的20个氨基酸的肽的C末端的3个氨基酸。所有配体经氨基端生物素化并在表3中展示了部分序列。
与HPV E6-PL肽相互作用的PDZ蛋白列举在标为“PDZ结合伴侣”的第2栏中。这一栏提供了与左边的PDZ配体相互作用的GST-PDZ融合物PDZ部分的基因名。具有多个结构域的含PDZ结构域的蛋白的结构域编号列举在所述PDZ的右侧(就是标为“PDZ结构域”的第4栏)，并从氨基端向羧基端对PDZ结构域进行了编号。所述表格仅列举了较强的相互作用，例如在“G检测方法”中产生‘4’或‘5’级结果的相互作用。“级”是结合水平的量度。具体而言，它提供了表示与PDZ蛋白结合的PL肽数量的450纳米处吸光值。下列数值具有以下含义：‘1’A450nm 0-1；‘2’A450nm 1-2；‘3’A450nm2-3；‘4’-A450nm 3-4；‘5’-A450nm重复2处以上达到4；‘0’-A450nm 0，也就是没有发现相互作用。
表4的第3和第4栏仅是第1、2栏的简单复制，其差别在于检测了不同的E6PL以及以较高亲和力与其结合的PDZ。
表2和表3以及实施例4和5中提供了这些PL蛋白和PDZ蛋白的进一步的信息。尤其是表3提供了所述检测方法中所使用的肽的部分氨基酸序列的清单。从左向右编号时，表示为“HPV病毒株”的第1栏提供了用于检索来自该病毒株的E6蛋白的HPV病毒株编号。表示为“E6C末端序列”的一栏提供了所述E6蛋白羧基端10个氨基酸的预测序列。标记为“是/否PL”的第3栏表示所述E6-PL序列是否包含预测的与PDZ结构域结合的序列元件。标记为“致癌性”的最后一栏表示，这一HPV病毒株经国家癌症研究所(NCI，2001)确认已知能引起宫颈癌。
实施例5列举了为生成GST-PDZ融合蛋白(Pharmacia)而克隆在载体(PGEX-3X载体)上的代表性的PDZ结构域序列。美国专利09/724553中列举了为生成GST-PDZ融合蛋白而克隆在pGEX载体上的PDZ结构域的扩展清单。
正如这里所详细讨论的，表2中列举的PDZ蛋白是天然的包含PDZ结构域的蛋白。该表中只显示了重要相互作用。因而，本发明尤其针对PDZ蛋白与PL蛋白之间相互作用的检测与调控。结合其他病原体的PDZ结构域能以类似的方式用于感染的诊断。表8中包括了适用于诊断的病原体PL蛋白的附加的例子，不过这并不意味着对本发明范围的限制。
在本发明的另一个实施方案中，细胞异常或疾病可以通过检测细胞PDZ蛋白或PL蛋白表达水平的失衡进行诊断。在衍生于“A检测方法”或“G检测方法”的检测中，使用PL蛋白或PDZ蛋白可以测定正常或异常细胞中结合伴侣蛋白表达水平。蛋白表达水平的差异已与许多疾病关联。
在本发明的某些实施方案中，PDZ蛋白用于诊断病原生物体PL蛋白的存在。具有PL序列的病原生物体的例子包括但不限于诸如人乳头状瘤病毒、乙肝病毒、腺病毒、人T细胞白血病毒等病毒、细菌和真菌。
IV.PDZ蛋白或PDZ配体蛋白(PL蛋白)的检测方法
发展了两种互补的、分别称为“A”和“G”的检测PDZ结构域多肽与候选PDZ配体之间结合的方法。在两种不同检测方法的每一种中，检测了具有对应于参与结合1个或多个PDZ结构域的蛋白的C末端序列的肽(即候选PL肽)与PDZ结构域多肽(通常是含PDZ结构域的融合蛋白)之间的结合。在“A检测方法”中，固定化所述候选PL肽并检测可溶的PDZ结构域多肽与所述固定肽的结合(之所以称为“A”检测是由于在一个实施方案中，使用了亲和素表面以固定所述肽)。在“G检测方法”中，固定化所述PDZ结构域多肽并检测可溶性PL肽的结合(之所以称为“G”检测是由于在一个实施方案中使用了GST结合表面以固定所述PDZ结构域多肽)。下文描述了这些检测方法的优选实施方案。然而，一般技术人员需要认识到，这些检测方法可以多种方式进行改良而仍然适用于本发明的目的。
A.含PDZ结构域的融合蛋白的产生
为了用于本发明中的检测方法，制备了GST-PDZ结构域融合蛋白。含编码PDZ结构域(如前文所述)的PCR产物亚克隆在表达载体中以表达含PDZ结构域和异源结构域(即谷胱甘肽-S-转移序列，GST)的融合蛋白。按制造商的建议，用“Sephaglas”割胶系统(Pharmacia)从琼脂胶上回收代表编码PDZ结构域DNA的PCR产物(即DNA片段)。
如上所述，为了便于PCR片段与GST编码序列以正确读框连接在GST基因融合载体(pGEX-3X；Pharmacia，Genbank登录号XXU13852)中，设计了包含限制性内切位点的PCR引物。所述载体含IPTG诱导的lacZ启动子。所述pGEX-3X载体用Bam HI和EcoRI，或在有些情况下用Eco RI和Sma I线性化并脱化。对于大部分克隆手段来说，进行了Bam HI和Eco RI的双切，这样用于克隆的PCR片段的末端是Bam HI和EcoRI。在一些情形下，使用的限制性内切组合是Bgl II和EcoRI、Bam HI和Mfe I、或仅是Eco RI、仅是Sma I、或仅是BamHI。当克隆多个PDZ结构域时，克隆的DNA部分代表所述PDZ结构域和位于单个结构域之间的cDNA部分。美国专利申请(60/360061)中说明了所述方法中所采用的克隆片段的精确定位。取决于采用了上述哪些克隆位点和方法，GST部分与含PDZ结构域的DNA部分之间的DNA连接序列有轻微变化。由此导致GST-PDZ融合蛋白的氨基酸序列在GST与PDZ结构域之间的连接区域上有所不同。对应于不同克隆位点/方法的蛋白连接序列如下所示。连接序列(载体DNA所编码)用粗体表示，含PDZ结构域基因衍生序列用斜体表示。
1)GST-BamHI/BamHI-PDZ结构域插入片段
Gly-Ile-PDZ结构域插入片段
2)GST-BamHI/BglII-PDZ结构域插入片段
Gly-Ile-PDZ结构域插入片段
3)GST-EcoRI/EcoRI-PDZ结构域插入片段
Gly-Ile-Pro-Gly-Asn-PDZ结构域插入片段
4)GST-SmaI/SmaI-PDZ结构域插入片段
Gly-Ile-Pro-PDZ结构域插入片段
乙醇沉淀编码PDZ的PCR片段和线性化pGEX-3X载体并在10微升常规连接缓冲液中重悬。用T4DNA连接酶在7℃下连接4-10小时。需要理解的是，一些获得的构建物包括很短的连接序列，当克隆多个PDZ结构域时，所述构建物包括位于单个PDZ结构域之间的一些DNA。
连接产物转化大肠杆菌DH5α或BL21菌株。通过PCR和序列分析筛选并鉴定克隆的含PDZ结构域DNA以及与编码GST的DNA部分正确融合的菌落。在小规模的GST/PDZ结构域融合蛋白表达检测中检测阳性克隆，如果有表达，随后为大规模制备GST/PDZ融合蛋白而培养这些克隆。
在培养基中添加IPTG过量表达GST-PDZ结构域融合蛋白并对其进行纯化。在《GST基因融合系统》(GST Gene Fusion System)(第二版，第二次修订，Pharmacia)中描述了小规模和大规模融合蛋白表达和纯化的详细过程。简而言之，在适当的抗生素选择压力下(100微克/毫升氨苄青霉素；表示为2xYT-amp)，含具有所述融合蛋白构建物的菌株(DH5α、BL21或JM109)的小体积(50毫升)培养物在37℃下在2XYT培养基中生长过夜。将过夜培养物注入新鲜制备的2XYT-amp(通常是1升)并生长至培养物的光密度(OD)达到0.5至0.9(约2.5小时)。添加终浓度为10mM的IPTG以诱导产生GST融合蛋白，培养物继续生长1小时。以下包括离心在内的所有步骤在冰上或4℃下进行。离心(4500Xg)收集菌体并在缓冲液A-(50mM Tris，pH 8.0，50mM葡萄糖，1mM EDTA，200μM PMSF)中重悬。加入等体积的缓冲液A+(缓冲液A-，4毫克/毫升溶菌酶)并在冰上孵育3分钟以溶解细菌或直到开始溶菌。添加等体积缓冲液B(10mM Tris，pH 8.0，50mM KCl，1mM EDTA.0.5％Tween-20，0.5％NP40(表示为IGEPAL CA-630)，200μM PMSF)并在冰上另外孵育20分钟。离心分离(20,000Xg)细菌溶解物，上清液流经含20毫升Sepharose CL-4B(Pharmacia)“柱分离前珠”(即事先已用3倍床体积PBS洗涤的没有偶联谷胱甘肽的琼脂糖小珠)的层析柱。向事先在1XPBS中膨胀(再水合)并转动孵育30分钟至1小时的谷胱甘肽Sepharose4B(Pharmacia，目录号17-0765-01)添加穿出液。所述上清液-Sepharose悬液注入层析柱并用至少20倍床体积的1XPBS清洗。通过使用0.5-1.0毫升试样量的5mM谷胱甘肽从谷胱甘肽琼脂糖上洗脱GST融合蛋白并以单独组分的形式收集。通过读取280纳米处的吸光度并用吸光度和消光系数计算浓度来测定组份浓度。合并那些含有最高浓度融合蛋白的组份并添加等体积的70％的甘油使其终浓度为35％。融合蛋白的大小及质量通过SDS  胶电泳(PAGE)检测(如Sambrook等人所述)。试样量融合蛋白在-80℃和-20℃保存。
表2：本发明检测方法中所使用的PDZ结构域
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Figure BSA00000217556800221
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Figure BSA00000217556800291
以上表2中所提供的氨基酸序列可以包括源于融合蛋白的氨基酸，例如，引起特别注意的GST-PDZ结构域序列可以比表2中提供的序列短最多20个氨基酸(例如，短5、8、10、12或15个氨基酸)。例如，一个序列可以从羧基端、氨基端或两端缩短最多3、6、9、或12个氨基酸。
B.候选PL蛋白的鉴别以及肽段合成
某些PDZ结构域通过PDZ结合蛋白的羧基端残基结合。为鉴别PL蛋白，表观检查了序列的羧基端以寻找人们可能预测能与含PDZ结构域蛋白结合的序列(参见如Doyle等人所著，1996，Cell 85，1067；Songyang等人所著，1997，Science 275，73)，这些序列包括Arbor Vita公司所鉴定的附加的PL共同序列(美国专利申请60/360061)。表3列举了这些蛋白中的一些并提供了相应的C末端序列。
确定序列(例如，对应于所述蛋白羧基端)的合成肽可以通过任何常规的基于树脂的方法合成(参见，例如美国专利No.4,108,846；也可参考Caruthers等，1980，NucleicAcids Res.Symp.Ser.，215-223；Horn等，1980，Nucleic Acids Res.Symp.Ser.，225-232；Roberge等，1995，Science 269：202)。这里所述的检测中使用的肽是通过FMOC(参见，例如，Guy和Fields，1997，Meth.Enz.289：67-83；Wellings和Atherton，1997，Meth.Enz.289：44-67)制备的。在一些情况下(例如，用于本发明的A和G检测中)，肽在其氨基端通过与4倍过量的生物素甲酯在含催化量碱的二甲亚砜中反应进行了生物素标记。所述肽用含卤化物的酸(如三氟乙酸)在存在适当的抗氧化剂(如乙二硫醇)的条件下与树脂分离，多余的溶剂进行冻干处理。
冻干后，肽可以重新溶解并通过反向高效液相色谱(HPLC)纯化。适当的HPLC溶剂体系包括流速为5毫升/分钟的0.1％三氟乙酸水溶液的基础溶液中线性上升的含0.1％三氟乙酸的乙腈梯度的Vydac C-18半制备型柱。HPLC纯化以后，所述肽的特征通过MALDI阳离子质谱进行了确认。
C.PDZ-PL相互作用检测
本发明的发明人通过发展下文详细描述的新的高通量筛选方法得以部分鉴定了表4中所总结的相互作用。本领域已知的各种已知检测方式可用于选择与特定蛋白特异反应的配体。例如，可以采用固相ELISA免疫检测、免疫沉淀、BIAcore、免疫印迹等检测方法鉴别特异结合PDZ结构域多肽的肽。如前文所述，发展了两种不同的、互补的检测方法以检测PDZ-PL相互作用。在每种检测方法中，固定化一对PDZ-PL中的一个结合伴侣并测定第二个结合伴侣的结合能力。这些下文所述的检测方法可以方便地用于在几小时内筛选成百上千的潜在的PDZ-配体相互作用。因而，这些检测方法可以用于鉴定细胞内更多新的PDZ-PL相互作用。此外，它们可用于鉴定PDZ-PL相互作用的拮抗剂(见下文)。
在多种实施方案中，在本发明的检测方法和装置中使用了融合蛋白。融合蛋白的构建与表达的方法是众所周知的。在前文所述的Ausubel等人的著作、Kroll等，1993，DNA Cell.Biol.12：441，以及Imai等，1997，Cell 91：521-30中对融合蛋白进行了广泛描述。所述融合蛋白通常包括一个便于将所述蛋白固定在固体基质上的结构域(“固定化结构域”)。所述固定化结构域经常包括一个诸如多组氨(Bush等，1991，J BiolChem 266：13811-14)、SEAP(Berger等，1988，Gene 66：1-10)、或M1和M2标记(参见，例如美国专利Nos.5,011,912；4,851,341；4,703,004；4,782,137)的标签表位(即被抗体，通常是单克隆抗体，识别的一段序列)。在一个实施方案中，所述固定化结构域是GST编码区域。需要认识到，除了所述PDZ结构域和特定的与固定化的抗体、蛋白A结合、或以其他方式与表面接触的残基以外，所述蛋白(例如融合蛋白)还包含另外的残基。在一些实施方案中，这些残基是天然与所述PDZ-结构域相连的残基(即位于特定的PDZ蛋白中)，但可以包括合成的(例如，多聚丙氨)或异源的(例如，如10到300个残基组成的间隔序列)残基。
本发明的方法中使用的含PDZ结构域多肽(例如PDZ融合蛋白)通常通过以下步制备：1)构建由编码所需多肽的多核苷序列构成的载体(例如质粒、噬菌体或噬菌粒)；2)将所述载体导入适当的表达系统(例如，原核、昆虫、哺乳动物或无细胞表达系统)；3)表达所述融合蛋白；以及4)非必需地纯化所述融合蛋白。
在一个实施方案中，所述蛋白的表达包括将编码序列插入适当的表达载体(即包含针对所采用的表达系统的所述插入的编码序列的转录和译所需的必要元件，例如包括强子、启动子、转录终止子、复制起始位点、适宜的起始密码子(如甲硫氨)、开放阅读框以及译调控信号(如核体结合位点、终止子和多聚腺苷序列)在内的调控元件)。取决于所采用的载体系统与宿主，包括组成型和诱导型启动子在内的任何数量的适当的转录及译元件均可使用。
如本说明书其他部分所述，所述融合蛋白的编码序列包括一个PDZ结构域和一个固定化结构域。编码所述每个结构域氨基序列的多核苷可以用本领域内所知的多种方法获得；通常所述多核苷通过在实验者测定的、或更常见的是公开的(例如通过GenBank)序列的基础上设计引物，通过克隆质粒、cDNA文库以及通过RNA逆转录产生的cDNA的PCR扩获得。所述引物包含在产生融合构建物中便于克隆和作的接头区域(例如包含限制性位点的序列)。所述对应于PDZ和固定化区域的多核苷以正确的读框连接，从而生成编码所述融合蛋白的序列。
本发明中的融合蛋白可以以分泌蛋白(例如，通过将编码信号序列的DNA包含在融合基因中；参见例如Lui等，1993，PNAS USA，90：8957-61)或非分泌蛋白的形式表达。
在一些实施方案中，所述含PDZ蛋白或PL多肽固定在固体表面。结合所述多肽的基质可以是多种形式中的任意一种，例如微量滴定皿、试管、试纸、微离心管、小珠、可透或半透膜等。合适的材料包括玻璃、塑胶(例如聚乙烯、PVC、聚丙烯、聚苯乙烯等)、蛋白、纸、糖类、脂质单层或具有支撑的脂质双层、薄膜及其他固体支持物。其他可以使用的材料包括陶瓷、金属、非金属、半导体材料、粘固粉等。
在一些实施方案中，所述PDZ和/或PL融合蛋白组成阵列的形式。这里所用的术语“阵列”是指固定化的融合蛋白的有序排列，其中特定的不同的融合蛋白(即含不同的PDZ结构域)位于基质上事先确定的不同的位置。由于特定的融合蛋白在阵列上的位置是已知的，在这一位置上的结合可以与和该位置上的PDZ结构域的结合相关联。将融合蛋白固定在小珠上(个别地或成群地)是另一个特别有用的技术手段。在一个实施方案中，单独的融合蛋白固定在小珠上。在一个实施方案中，使用了可区分的小珠的混合。可区分的小珠是能凭借诸如大小、磁性、颜色(例如通过采用FACS)或亲和标签(例如，通过采用IgG亲和方法可以区分蛋白A包被的小珠和没有蛋白A包被的小珠)等性质相互区分的小珠。可以测定与特定PDZ结构域的结合。
蛋白固定化的方法是已知的，包括共价和非共价方法。抗体介导的固定化是一种适当的固定化方法。按照这一方法，将含PDZ结构域蛋白的“固定化结构域”序列的特异性抗体本身固定在基质上(例如通过吸附)。该方法的优点在于可以将单一的抗体附着在基质上并用于多种多肽(具有相同的固定化结构域)的固定化。例如，由多聚组氨酸构成的固定化结构域(Bush等，1991，J Biol Chem 266：13811-14)可以与抗组氨酸单抗(R&D Systems，Minneapolis，MN)结合；由分泌型碱性磷酸酶(SEAP)构成的固定化结构域(Berger等，1988，Gene 66：1-10)可以与抗SEAP抗体(Sigma，St.Louis，MO)结合；由FLAG表位构成的固定化结构域能与抗FLAG抗体结合。也可以适用其他的配体-抗配体固定化方法，例如，由蛋白A序列(见Harlow和Lane所著，1988，《抗体实验手册》(Antibodies A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory；Sigma，St.Louis，MO)构成的固定化结构域可与IgG结合；由链霉亲和素构成的固定化结构域可与生物素结合(见前文Harlow和Lane所著；Sigma，St.Louis，MO)。在优选的实施方案中，所述固定化结构域是如这里所述的GST部分。
在使用抗体介导的固定化方法的情况下，玻璃和塑胶是特别有用的基质。可以用疏水性(例如特氟纶)掩模印制基质以形成孔。每14.5cm2基片“工作区域”有3、10、21孔的预印的玻璃基质可以从例如SPI Supplies，West Chester，PA获得；也可参见美国专利No.4,011,350。在某些应用中，使用96孔形式的印制的大版式(12.4cm×8.3cm)玻璃基片；这一形式便于使用自动液体处理装置并使用多种类型的96孔板酶标仪(荧光、比色、闪烁)。然而可以使用更高的密度(例如，每平方厘米大于10个或100个多肽)。参见例如MacBeath等，2000，Science 289：1760-63。
通常，抗体通过吸附与基质结合。适宜的吸附条件是本领域内所熟知的，包括0.5-50微克/毫升(如10微克/毫升)单克隆抗体在缓冲液中(4℃的pH 6.5到8的PBS，或50到300mM Tris、MOPS、HEPES、PIPES、乙酸缓冲液)孵育至37℃，孵育时间从1小时至24小时以上。
蛋白可以共价结合或通过非特异结合非共价附着。如果希望融合蛋白与表面之间的共价结合，所述表面通常应是多功能性的或能够多功能化的。表面上可能存在的并用于连接的功能基团包括羧基酸、醛、氨基基团、氰基团、乙烯基团、羟基、巯基等。多种化合物与多种表面的连接方式是熟知的，并在文献中有详细的说明。
以下提供了示范性的检测方法。
采用固定化的PL肽用“A检测方法”检测PDZ-配体的结合
本发明的一个方面提供了一种检测方法，其中生物素化的候选PL肽被固定在亲和素包被的表面上的。随后检测PDZ结构域融合蛋白与该表面的结合。在优选的实施方案中，所述PDZ结构域融合蛋白是GST/PDZ融合蛋白，所述检测方法按照以下步骤进行：
(1)亲和素与表面(例如蛋白结合表面)的结合。在一个实施方案中，通过每孔添加100微升含20微克/毫升亲和素(Pierce)的不含钙离子和镁离子的pH7.4的PBS(GibcoBRL)，并在4℃下孵育12小时，将亲和素结合在聚苯乙烯96孔板上(例如NuncPolysorb，目录号475094)。随后通过每孔添加200微升含2克/100毫升去蛋白酶牛血清白蛋白的PBS(PBS/BSA)并在4℃孵育2小时，处理平板以封闭非特异性的相互作用。重复向每孔添加200微升PBS，然后将平板的内容物倒入废液缸并在干燥表面上轻拍平板，所述平板以此方式用PBS清洗3次。
(2)通过每孔添加50微升含0.4μM肽的PBS/BSA并在4℃下孵育30分钟将生物素化的PL肽(或候选PL肽，例如可参见表3)固定在平板上微孔的表面。通常每种不同的肽添加于至少8个不同的微孔中，这样可以进行多重测量(例如双重检测以及使用不同GST/PDZ结构域融合蛋白和单独GST阴性对照检测)，也制备了其中没有固定化肽的附加阴性对照微孔。所述PL肽固定在表面上以后，平板用PBS洗涤3次。
(3)通过每孔添加50微升含5微克/毫升GST/PDZ结构域融合蛋白的PBS/BSA并在4℃孵育2小时使GST/PDZ结构域融合蛋白(如上述方法制备)与表面反应。作为阴性对照，针对每种固定的肽在特定的微孔中(通常至少2个孔，即双重测量)添加单独的GST(即不是融合蛋白)。反应2小时后，所述平板用PBS洗涤3次以去除未结合的融合蛋白。
(4)采用本领域内所知的多种方法及检测器可以检测GST/PDZ结构域融合蛋白与亲和素-生物素化肽表面的结合。在一个实施方案中，在平板上每孔添加50微升含抗GST抗体(例如2.5微克/毫升多克隆羊抗GST抗体，Pierce)的PBS/BSA并在4℃下反应20分钟。平板用PBS洗涤3次并添加第二种可检测的标记抗体。在一个实施方案中，在平板上每孔添加50微升2.5微克/毫升辣根过氧化物酶(HRP)偶联的多克隆兔抗羊免疫球蛋白抗体并在4℃下反应20分钟。平板用含0.2％Tween 20的50mMTris pH8.0洗涤5次，并通过每孔添加100微升HRP底物溶液(TMB，Dako)并在室温下(RT)反应20分钟显色。通过每孔添加100微升1M硫磺酸终止HRP与其底物的反应并读取450纳米处所述平板每个孔的吸光度(A)。
(5)通过将来自PL肽与PDZ结构域多肽结合的孔中的信号与本底信号比较检测一种PL肽与一种PDZ结构域多肽的特异结合。本底信号是阴性对照中得到的信号。通常特异性或选择性反应结果应至少两倍于本底信号，更典型是比本底高5倍以上，最常见的是比本底信号高10倍以上。此外，具有统计学意义的反应结果应包括所述反应的多重测量的信号与本底的差异至少达到2个标准误差，更典型的达到4个标准误差，最典型的达到6个标准误差以上。相应的，比较信号的重复测量结果与本底的重复测量结果的统计学检验(如T-检验)应得到p值＜0.05，更典型的是p值＜0.01，最典型的是p值＜0.001或更小。
正如所指出的，在“A”检测方法的一个实施方案中，GST/PDZ结构域融合蛋白与没有PL肽遮盖的亲和素表面的结合信号是一种适当的阴性对照(有时称为“B”)。单独的GST多肽(即非融合蛋白)与有PL肽遮盖的亲和素包被表面的结合信号是第二种适当的阴性对照(有时称为“B2”)。由于所有的测量结果是多重的(即至少双重的)，在测定结合时使用了几次测量的算术中项(或等价的平均数)，并在测定结合的测量结果中可能的误差时使用了所述平均数的标准误差。N次测量结果的平均数的标准误差等于以下值的平方根：每次测量值与平均数的差值的平方数之和除以(N)与(N-1)的乘积。因而，在一个实施方案中，PDZ蛋白与和平板结合的PL肽的特异性结合通过针对特定PL-PDZ组合的平均B 1和/或平均B2与信号平均值(“mean S”)及信号标准误差(“SE”)的比较得以确定。
“G检测方法”-使用固定化的PDZ结构域融合多肽检测PDZ-配体的结合
本发明的一个方面提供了一种检测方法，其中GST/PDZ融合蛋白被固定在表面上(“G”检测方法)。随后测量标记的PL肽(例如，如表3中所列举的)与该表面的结合。在一种优选的实施方案中，所述检测方法按以下步骤进行：
(1)PDZ结构域多肽与表面(例如，蛋白结合表面)的结合。在一种优选的实施方案中，含一个或多个PDZ结构域的GST/PDZ融合蛋白结合在聚苯乙烯96孔板上。所述GST/PDZ融合蛋白可以通过多种精通本领域的技术人员所知的常规方法中的任一种结合到所述平板上，然而必须注意，所述融合蛋白与平板的结合过程不会改变PDZ结构域的配体结合性质。在一个实施方案中，所述GST/PDZ融合蛋白通过包被在96孔板上的抗GST抗体结合。通过以下步骤可以达到与平板的充分结合：
a.向聚苯乙烯96孔板(Nunc Polysorb)每孔添加100微升含5微克/毫升羊抗GST多克隆抗体(Pierce)并在4℃下孵育12小时。
b.通过每孔添加200微升PBS/BSA在4℃下封闭平板2小时。
c.用PBS 3次洗涤平板。
d.向平板每孔添加50微升含5微克/毫升GST/PDZ融合蛋白或作为阴性对照的单独的GST多肽(即非融合蛋白)的PBS/BSA并在4℃下孵育2小时。
e.再次用PBS洗涤平板3次。
(2)通过每孔添加50微升含20μM生物素化的肽溶液的PBS/BSA并在4℃下孵育10分钟，随后在25℃下另外孵育20分钟，使生物素化的PL肽与表面反应。用预冷的PBS3次洗涤平板。
(3)使用精通本领域的技术人员所知的多种方法和检测器可以检测生物素化的肽与GST/PDZ融合蛋白表面的结合。在一个实施方案中，每孔添加100微升溶于BSA/PBS的0.5微克/毫升的链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)偶联物并在4℃下反应20分钟。随后平板用含0.2％Tween 20的50mM Tris pH 8.0洗涤5次，通过每孔添加100微升HRP底物溶液(TMD，Dako)并在室温下孵育20分钟显色。每孔添加100微升1M硫磺酸终止HRP与其底物的反应并在450纳米处读取平板每个孔的吸光度。
(4)通过将来自PL肽与PDZ结构域多肽结合的孔中的信号与本底信号比较检测一种PL肽与一种PDZ结构域多肽的特异结合。本底信号是阴性对照中得到的信号。通常特异性或选择性反应结果应至少两倍于本底信号，更典型是比本底高5倍以上，最常见的是比本底信号高10倍以上。此外，具有统计学意义的反应结果应包括所述反应的多重测量的信号于本底的差异至少达到2个标准误差，更典型的达到4个标准误差，最典型的达到6个标准误差以上。相应的，比较信号的重复测量结果与本底的重复测量结果的统计学检验(如T-检验)应得到p值＜0.05，更典型的是p值＜0.01，最典型的是p值＜0.001或更小。正如所指出的，在“G”检测方法的一个实施方案中，一种特定PL肽与固定化的(表面结合的)单独的GST多肽的结合信号是一种适当的阴性对照(有时称为“B1”)。由于所有的测量结果是多重的(即至少双重的)，在测定结合时使用了几次测量的算术中项(或等价的平均数)，并在测定结合的测量结果中可能的误差时使用了所述平均数的标准误差。N次测量结果的平均数的标准误差等于以下值的平方根：每次测量值与平均数的差值的平方数之和除以(N)与(N-1)的乘积。因而，在一个实施方案中，PDZ蛋白与平板结合的肽的特异性结合通过针对特定PL-PDZ组合的平均B1与信号平均值(“mean S”)及信号标准误差(“SE”)的比较得以确定。
“G’检测方法”和“G”检测方法”
上述“G检测方法”特定条件下的两种特定的改进尤其有用。改进的检测方法使用更少量的标记的PL肽，并且与上述具体的检测条件相比，对于检测而言具有稍有不同的生化要求。
为了方便起见，这一章节所描述的检测条件称为“G’检测方法”和“G”检测方法”，而在前面章节中描述的G检测方法的具体检测条件称为“G0检测方法”。除了第2步的肽浓度是10μM而不是20μM以外，“G’检测”与“G0检测”是相同的。这一改变导致低亲和力和/或快解离速度的相互作用的检测灵敏度稍有降低。相应的，稍微提高了具有足够亲和力和半衰期的具有生物学重要性和有用的治疗靶点的相互作用检测的确定性。
除了第2步的肽浓度是1μM而不是20μM以及在25℃下孵育60分钟(而不是例如4℃10分钟随后25℃20分钟)以外，“G”检测”与“G0检测”是相同的。这导致对于低亲和力、快解离速度和/或25℃下亲和力小于4℃下亲和力的相互作用的灵敏度降低。如果(正如我们发现的对于PDZ-配体结合普遍存在的)反应的熵值时负数(即产物的熵值小于反应物的熵值)，相互作用在25℃下具有比4℃时更低的亲和力。相反，由于PDZ-PL复合物能在“G”检测的更长的孵育期间内积累，对于结合及解离速度慢的相互作用来说，“G”检测”和“G0检测”中的PDZ-PL结合信号是相似的。因而，“G”检测”和“G0检测”结果的比较可以用于不同PDZ-PL相互作用的相对熵、焓、动力学。(通过等式ΔG＝RT In(Kd)＝ΔH-TΔS(其中ΔG、H和S分别表示反应的自由能、焓和熵，T是绝对温度，R是气体常数，Kd是平衡解离常数)，熵和焓与结合亲和力相关)。具体而言，只在“G0检测”中检测到的或在“G0检测”中检测到高得多的信号的相互作用通常具有在25℃下快解离速度(t1/2＜10分钟)和负值反应熵，而在“G”检测”中检测到相似强度的相互作用通常具有较慢的解离速度(t1/2＞10分钟)。PDZ-PL相互作用热力学和动力学的粗略估计(如上述通过比较“G0检测”和“G”检测”结果实现)可用于所述相互作用的有效抑制剂的设计。例如，基于与特定PDZ结构域缓慢解离的PL化学结构(如与“G0检测”中相似的“G”检测”的结合所证实的)的小分子抑制剂本身可能缓慢解离从而具有高亲和力。
照这样，“G”检测”中步骤2的温度与持续时间的变化可用于深入洞察所述PDZ-配体结合反应的动力学与热力学以及该反应抑制剂的设计。
检测方法变化形式
如上所述，需要认识到，可以对上述检测方法的许多步骤进行改变，例如，多种基质可以用于结合PL和含PDZ蛋白；可以使用不同类型的含PDZ融合蛋白；可以使用检测PDZ/PL相互作用的不同标记物；以及可以使用不同的检测方法。
所述PDZ/PL检测方法可以使用多种表面以结合PL和/或含PDZ蛋白。例如，表面可以是由对PL蛋白或含PDZ蛋白的附着进行最优化的材料(如聚苯乙烯)形成的“检测平板”。通常，所述检测平板上单独的孔应具有高表面积/体积比，因而合适的形状是平底的孔(其中附着检测蛋白)。其他的表面包括但不限于聚苯乙烯或玻璃珠、聚苯乙烯或玻璃基片、纸、纤维素试纸、塑胶、薄膜等。
例如，所述检测平板可以是“微量滴定”平板。这里所使用的术语“微量滴定平板”是指一种多孔的检测平板，例如具有约30到200个独立的孔，通常是96孔的平板。另外，可以使用高密度阵列。微量滴定平板的独立的孔经常能容纳约250微升的最大体积。通常，所述检测平板是96孔聚苯乙烯平板(如Becton Dickinson Labware，Lincoln Park，N.J.有售)，它支持自动化和高通量筛选。其他的表面包括聚苯乙烯微量滴定ELISA平板(如Nunc Maxisorp，Inter Med，Denmark有售)。通常，检测平板每孔添加约50微升至300微升、更优选的是100微升至200微升由悬浮缓冲液构成的含水试样。
本发明中的可检测标记物可以是与一种分子(如前文所述)直接或间接偶联的任何可检测的化合物或组合物。标记物自身可以被检测(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化底物化合物或组合物的可检测的化学改变。优选的标记物是催化非放射性颜色试剂的颜色改变的酶标记物。
有时，标记物间接与抗体偶联。精通本领域的人员知道多种直接或间接偶联的方法。例如，抗体可以与生物素偶联，而前面提到的任何类别的标记物可以与亲和素偶联，反之亦然(也可参见前文“A”和“G”检测方法)。生物素选择性地与亲和素结合，从而标记物能以这种间接方式与抗体偶联。对包括生物素-亲和素偶联及其他类似方法的综述可以参见前文Ausubel的著作。另外，为实现标记物与抗体的间接偶联，抗体与小的半抗原(如地高辛)偶联而前面提到的不同类型标记物之一与抗半抗原抗体(如抗地高辛抗体)偶联。从而实现标记物与抗体的间接偶联。
检测方法的变化形式可以包括不同的洗涤步骤。“洗涤”是指以得以从中去除没有结合的材料(例如，没有附着的细胞、没有粘附的捕获物、没有结合的配体、受体、受体构建物、细胞溶解物或HRP抗体)的方式将固体相暴露在水溶液(通常是缓冲液或细胞培养基)中。为了降低本底噪音，通常在洗涤溶液中包括去垢剂(例如Triton X)。通常，在洗涤之后将水洗涤溶液从检测平板的孔中轻轻倒出。洗涤可以便利地使用自动清洗装置实现。有些时候，可能要求几个洗涤步骤(例如，约1个到10个洗涤步骤)。
在PDZ-PL检测方法中也可以使用多种缓冲液。例如，为降低检测本底可以使用多种封闭缓冲液。术语“封闭缓冲液”是指pH缓冲的、含至少一种能与未被PL或含PDZ蛋白包被的基质暴露表面结合的封闭化合物的水溶液。封闭化合物通常是如BSA、明胶、酪蛋白或奶粉的蛋白而且不与检测中任何试剂发生交叉反应。所述封闭缓冲液通常提供的pH值在约7到7.5之间，合适的缓冲物包括磷酸盐和TRIS。
多种酶-底物组合也可以用于检测PDZ-PL相互作用。酶-底物组合的例子包括，例如：
(i)以过氧化氢为底物的辣根过氧化物酶(HRP或HRPO)，其中的过氧化氢氧化染料前体(例如原苯二胺[OPD]或氢氯3，3′，5，5′-四甲基对二氨基联苯[TMB])(如前文所述)。
(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为发色底物的对硝基苯磷。
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与发色底物(例如对硝基苯-β-D-半乳糖苷)或荧光底物4-甲基伞形酯-β-D-半乳糖苷。
精通本领域的人员可以使用多种其他酶-底物组合。这些问题的全面综述可以参见通过参考组合在本发明中的美国专利Nos.4,275,149和4,318,980。
进一步需要认识到，虽然为了方便，本说明书的讨论主要涉及PDZ-PL相互作用的检测，PDZ-PL相互作用的激动剂或拮抗剂可以用于细胞异常的诊断。
V.诸如宫颈组织的组织样本的采集
对病原体存在的诊断要求适合于生物体的样本的采集。为检测致癌的HPV E6蛋白，可能需要采用刮取、拭子、活组织切片技术从子宫、阴茎、肛门或咽喉采集用于检测的组织。为诊断如HIV的血源病原体，最适合的是通过常规手段采集血液。为诊断可能已引起皮肤损伤的真菌或病毒感染可能要求采集受影响区域的样本。
本发明不包括取样方法。然而需要指出的是，由于本发明是建立在PDZ或PL蛋白检测基础上的，必须对采集足够量的样本以检测病原体蛋白并保持样本中蛋白的完整性给予适当的关注。对于每次诊断检测所采集的样本量应以经验为主确定。决定因素可以包括但不限于希望检测的疾病阶段、每单位样本的病原体数量、每单位样本诊断用蛋白数量、诊断用抗原表位的可利用性和稳定性。
示范性的采集宫颈组织的方法包括但不限于美国专利6,241,687、6,352,513、6,336,905、6,115,990和6,346,086中所述的方法。这些采集方法可以便于用于诊断致癌的人乳头状瘤病毒的宫颈组织的采集。这些方法主要通过刮取采集宫颈细胞或组织；另外，也可以采用常规活组织切片方法从任何待测组织中采集样本。
虽然本发明申请中公开的诊断方法针对PL蛋白的检测，样本采集不需要限于蛋白的采集。另外可以从组织样本中采集RNA，使用体外翻译试剂盒从所采集的模板生成蛋白，然后使用这里公开的方法检测。以相似的方式，可以从待测样本中采集DNA，可以使用致癌E6蛋白的特异性引物扩增所述DNA(通过使用DNA聚合酶)或将样本转录并翻译成能用这里所公开的方法检测的蛋白。
VI.检测致癌E6蛋白的检测方法
致癌E6蛋白能通过其结合PDZ结构域的能力进行检测。这可以发展出单一检测步骤的方法或更有用的、具有更高灵敏度和特异性的双步骤或“夹心”法。
在单一步骤方法中，可以使用诸如表3和4中公开的特异性识别致癌E6蛋白的PDZ结构域的标记形式直接探测样本中致癌E6蛋白的存在。如前文所指出的，其实例可以是将待测样本固定在固体支持物上(例如，宫颈细胞或组织可以包被在基片上并“固定”(fixed)以使细胞膜具有渗透性)，在适当的条件下将所述样本与标记的“PL探测分子”蛋白(PDZ结构域融合物)共育，洗去未结合的PL探测分子，并检测样本中“标记”的存在。此外，即便没有标记，可以测量PDZ蛋白和与E6蛋白结合的PDZ蛋白的物理性质。可以使用诸如表面等离子体谐振、圆二色和其他技术等直接评蛋白结合的技术来检测致癌E6蛋白的存在。然而应当指出的是，PDZ结构域也可以结合内源的细胞蛋白。因而，结合频率必须与不含E6癌蛋白的对细胞比较或应该修饰“PL探测分子”使其对于致癌E6蛋白具有显著更高的特异性(见第X部分)。
在双步或夹心方法中，PL探测分子的使用与第二种捕获或检测捕获蛋白的方法联结。所述的第二种方法可以使用与E6癌蛋白结合的抗体或第二种能在不降低E6PL可利用性的E6蛋白的区域上与E6癌蛋白结合的化合物或蛋白。这样的蛋白可以包括但不限于p53、E6-AP、E6-BP或设计的结合E6癌蛋白的化合物。另外，由于已知致癌E6蛋白通过使用二价阳离子与某些DNA结构结合，也可以使用DNA结合或Zn2+结合来检测捕获的E6蛋白的存在。另外，由于已知E6能在网状细胞溶
物存在的情况下降DNA和包括p53在内的某些蛋白，可以在活性检测中使用PDZ捕获的E6蛋白。
抗体
许多生物学检测被设计成象“三明治”，其中一种抗体组成三明治的一侧。这一方法能够通过降低本底信号并放大正确信号而提高诊断的信号/噪音比。可以产生特异性识别诊断蛋白的抗体。由于本发明公开了使用PDZ或PL蛋白诊断病原体感染的方法，应当产生不与PDZ-PL相互作用冲突的抗体。
为了生产抗体，可以通过注射肽的方式免疫多种动物宿主(包括但不限于兔、小鼠、大鼠等)。所述肽可以依靠功能基团的侧链或附着在功能基团侧链上的连接物附着在适当的载体上(如BSA或KLH)。取决于宿主物种，多种佐剂可用于强免疫反应，这些佐剂包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全的)、如氢氧化铝的矿物胶体、如溶血卵脂的表面活性剂、聚多元、多聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔虫戚血蓝蛋白、二硝基酚以及如卡介苗(BCG)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)的在有用的人佐剂。
肽的单克隆抗体可以用通过细胞系的连续培养提供抗体分子生产的任何技术进行制备。这些技术包括但不限于最初由Koehler和Milstein，1975，Nature 256：495-497描述的杂交瘤技术，Kosbor等，1983，Immunology Today 4：72和Cote等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：2026-2030所描述的人B细胞杂交瘤技术，以及EBV杂交瘤技术(Cole等，《单克隆抗体与癌症治疗》(Monoclonal Antibodies and CancerTherapy)，1985，77-96页，Alan R.Liss，Inc.。另外，可以使用通过将来自小鼠的适当抗原特异性的抗体分子基因与来自人的适当生物学活性的抗体分子基因拼接生产“嵌合抗体”(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851-6855；Neuberger等，1984，Nature 312：604-608；Takeda等，1985，Nature 314：452-454))而发展出的技术。此外，可以对描述生产单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778)进行改进以适于生产肽特异性单链抗体。
可以通过已知技术产生含特定结合位点删除的抗体片段。例如，这样的片段包括但不限于能通过胃蛋白酶消化抗体分子生产的F(ab’)2片段和能通过减少F(ab’)2片段二硫产生的Fab片段。另外，可以构建Fab表达文库(Huse等，1989，Science 246：1275-1281)以快速简便地鉴别具有针对感兴趣的肽的需要的特异性的单克隆Fab片段。
可以将需要的肽的特异性抗体或抗体片段与例如琼脂糖连接，并在免疫层析中使用所述抗体-琼脂糖复合物纯化本发明中的肽。见1984年Scopes著《蛋白纯化：原则与实践》(Protein Purification：Principles and Practice)，Springer-Verlag New York，Inc.，NY和Livingstone 1974年著《酶学方法：蛋白免疫亲和层析》(Methods Enzymology：Immunoaffinity Chromatography of Proteins)34：723-731。抗体也可以为诊断应用与其他固体支持物连接，或另外用诸如能切割比色底物的酶、荧光团、磁性颗粒或其他可测量的物质组合物的检测手段进行标记。
抗E6蛋白的特异性抗体长期以来难以生产。与前文所述方法结合，可以使用多种技术来提高生产或选择高亲和力抗体的可能性。一个例子是以制备待测组织或细胞样本相同方式制备E6抗原(用以引起抗体产生)。另外，可以用以一种方式制备的E6融合蛋白免疫，并用以不同方式制备的第二种E6蛋白筛选特异性E6抗体。应当选择识别在不同的样本收集和制备过程中保守的E6抗原表位的抗体。在另一个例子中，对E6抗原进行快速变复性，这样选出对制备条件不敏感的抗原表位，可以用这样的E6抗原免疫动物。另一种可以采用的方法是使用对应于通过主要组织相容性复合物(MHC)与T细胞受体(TCR)共有序列结合预测的E6蛋白抗原区域的肽。还有另一种方法能使用便于生产的且已确定其抗体结合区域的E6变体(如前文所述GST-或MBP-HPV18)。这些“抗原”区域可以用另一种类型E6肽的同源片段(例如，另一个免疫表位)调换。这样，所述表位可能在抗体生产中具有更高的正确展示的机会。
一般而言，合适的抗E6抗体可以通过用例如在哺乳动物细胞中生产的E6蛋白(从而具有正确的折叠、二硫键和其他蛋白修饰)、或例如如本领域内已知的用其他氨基酸替换半胱氨酸残基等修饰并在细菌中表达的E6蛋白免疫合适的哺乳动物进行制备。通常，在所述方法中可以使用抗体混合物，其中每种抗体与E6蛋白的不同亚型交叉反应。在某些实施方案中，可以使用一种与多种或全部E6蛋白交叉反应的抗体。通常在所述方法中使用的抗体与E6蛋白结合而无论该E6蛋白是否是致癌的。
2.其他针对捕获的E6蛋白的检测方法
已被PDZ结构域捕获的E6蛋白可以通过几种其他方法检测。已知几种与E6蛋白结合的蛋白。精通本领域的人员可以使用其中任何一种与E6具有适当亲和力的来检测样本中捕获并浓缩的E6蛋白的存在。此外，可能鉴别出结合E6蛋白的新的结合蛋白或适体。第三，可以使用E6特异性的活性检测。
所述检测方法本身也可以用多种方法实行。用PDZ来捕获的常规ELISA可以设置成为一种竞争结合方式，其中所述PDZ结构域用具有比E6蛋白更低亲和力的标记的PL预载。这样，在存在E6的情况下，标记物被取代并观察到对应于E6存在的信号的减弱。也包括使用结合竞争与抑制方式的其他变化形式。一种变化形式甚至可以具有通过连接物与PDZ结构域共价结合的PL，这样该PL不能与其自己的PDZ结构域结合。使用供体淬灭染料，当一种致癌E6蛋白的PL能置换标记的PL时，仅能观察到信号的增强。所有这样的竞争方法必须与评估能与用于评估致癌E6蛋白存在的PDZ结构域结合的内源PL蛋白量的对照相比进行测量。
VII.检测方法灵敏度的测量
本发明的“A”和“G”检测可用于确定PDZ配体肽与PDZ结构域多肽结合的“表观亲和力”。在与第二种分子饱和结合所需的一种分子(例如，配体与受体的结合)的浓度的基础上测定表观亲和力。以下提供了对PDZ-配体结合表观亲和力定量尤其有用的方法。这些方法可用于比较不同PL探测分子构建物的灵敏度和亲和力。了解PDZ对病原体PL的灵敏度是基本要求，因为这有助于确定为获得确定性结果所必须检测的组织或细胞数量。
(1)GST/PDZ融合蛋白以及作为阴性对照的单独的GST与表面(例如，96孔板)结合，并如前文对“G”检测所述的方式对该表面进行封闭和洗涤。
(2)在平板上每孔添加50微升含递增浓度(例如0.1μM，0.33μM，1μM，3.3μM，10μM，33μM及100μM)生物素化的PL肽(例如如表3中所示的)PBS/BSA。在一个实施方案中，所述PL肽与结合的GST/PDZ融合蛋白(以及仅GST的阴性对照)在4℃下反应10分钟，随后在25℃下反应20分钟。所述平板用预冷的PBS洗涤3次以去除未结合的标记肽。
(3)PL肽与固定化的PDZ结构域多肽的结合如前文对“G”检测所描述的方式检测。
(4)对于肽的每种浓度，纯粹的结合信号通过从肽与GST/PDZ融合蛋白结合中减去所述肽与单独的GST结合进行测定。随后将所述纯粹信号作为配体浓度的函数作图并按照以下等式进行拟合处理(例如，通过使用Kaleidagraph软件包曲线拟合算法，Synergy Software)，其中“信号[配体]”是PL肽浓度为“[配体]”时纯粹的结合信号，“Kd”是结合作用的表观亲和力，“饱和结合”是通过对实验数据最优化拟合的曲线拟合算法确定的常数：
信号[配体]＝饱和结合×([配体]/([配体]+Kd))
为了可靠地使用上述等式，实验手段成功检测的最高肽配体浓度必须要大于或至少约等于计算的Kd值(也就是说，观察到的最大结合应该约等于计算的饱和结合)。在证明难以满足上述标准的情况下，可以使用另一种方法(见下文)。
方法2：
(1)在溶液中混合固定浓度的PDZ结构域多肽和递增浓度的标记的PL肽(用例如生物素或荧光素标记的，代表性的肽的氨基酸序列参见表3)并使之反应。在一个实施方案中，优选的肽浓度是0.1μM，1μM，10μM，100μM和1mM。在多种实施方案中，合适的反应时间可以位于10分钟到2天的区间内，温度位于4℃到37℃的区间内。在一些实施方案中，也可以用不含PDZ结构域的蛋白作为对照进行相同的反应(例如，如果PDZ结构域多肽是融合蛋白，可以使用该融合伴侣)。
(2)使用多种本领域内已知的方法，可以将PDZ-配体复合物与未结合的标记肽分离。例如，复合物可以用高效排阻层析(HPSEC或分子筛)(Rabinowitz等，1998，Immunity 9：699)、亲和层析(例如使用谷胱甘肽琼脂糖颗粒)和亲和吸附(例如通过如前文所述的与抗GST抗体包被平板结合)进行分离。
(3)使用精通本领域的人员所知的多种方法和探测器在肽配体上存在标记物的基础上检测PDZ-配体复合物。例如，如果标记物是荧光素并且使用HPSEC实现分离的，可以使用嵌入式的荧光探测器。结合也可以用上述针对“G”检测的方式检测。
(4)PDZ-配体结合信号作为配体浓度的函数绘图，图形按照以下等式拟合(例如通过使用Kaleidagraph软件包的曲线拟合算法)，其中“信号[配体]”是PL肽浓度为”[配体]”时纯粹的结合信号，“Kd”是结合作用的表观亲和力，“饱和结合”是通过对实验数据最优化拟合的曲线拟合算法确定的常数：
信号[配体]＝饱和结合×([配体]/([配体]+Kd))
由于对相互作用亲和力(或表观亲和力)的知识有助于以已知能力相互作用的抑制剂的理性设计，测量标记的肽配体与PDZ结构域多肽结合的亲和力是有用的。抑制剂在抑制中的能力应该与标记肽配体与PDZ结构域结合的表观亲和力相似(即相差在一个数量级以内)。
这样，本发明的一个方面通过将由PDZ结构域和非PDZ结构域组成的多肽固定在表面上，固定的多肽与多个不同浓度的配体接触，确定每个配体浓度下配体与固定化的多肽的结合量，并在此基础上计算这种结合的表观亲和力，提供了确定PDZ结构域和配体之间结合的表观亲和力的方法。通常，由PDZ结构域和非PDZ结构域组成的多肽是一种融合蛋白。在一个实施方案中，融合蛋白是例如GST-PDZ融合蛋白，但也可以使用其他融合蛋白，(例如包括PDZ结构域和多种抗原表位标签中任意一种、生物素化信号等的融合蛋白)只要所述多肽能以不妨碍PDZ结构域的配体结合性质的取向被固定化，例如通过经非PDZ结构域经抗该结构域抗体将所述多肽拴在表面上而保持PDZ结构域作为自由端。已经发现，例如，PDZ-GST融合多肽直接与塑胶平板反应得到了不是最令人满意的结果。结合亲和力的计算本身可以使用任何合适的等式(例如，如前文所示，也可参见Cantor和Schimmel(1980)所著《生物物理化学》(BIOPHYSICAL CHEMISTRY)，WH Freeman & Co.，San Francisco)或软件得以确定。
这样，在一种优选的实施方案中，多肽通过该多肽与固定化的结合非PDZ结构域的免疫球蛋白结合进行固定化(例如，在使用GST-PDZ融合多肽的情况下，抗GST抗体)。在一种优选的实施方案中，配体与PDZ结构域多肽接触这一步骤在前文对“G”检测的描述中所提供条件下进行。需要认识到，结合检测通常在多孔平板(例如，24孔、96孔或384孔板)上进行。
本方法相比其他测量PDZ-PL结合亲和力的方法(通常包括不同浓度的GST-PDZ融合蛋白与配体包被的表面接触)具有显著优点。例如，一些以前描述的测定亲和力的方法(例如，在溶液中使用固定化的配体和GST-PDZ蛋白)没有考虑所使用的融合蛋白的多聚化状态，导致大于一个数量级的潜在误差。
虽然不足以定量测量PDZ-PL结合亲和力，在“G检测”中所观到的信号的绝对值的基础上可以估算不同PDZ-PL对的相对结合强度。这一估算能反映几个因素，包括包含亲和力和离速度在内的相互作用的生物学相关问题。至于不同配体与特定含PDZ结构域蛋白的结合的比较，绝对结合信号的差异可能主要与感兴趣的相互作用的亲和力和/或离速度有关。
IX.检测方法特异性的测量
如前文所述，本发明提供了包括如前文所述“G”检测和亲和力检测的高通量方法在内的PDZ-配体相互作用分析的强大方法。在本发明的一个实施方案中，测定了一种特定配体与多种PDZ蛋白的亲和力。典型的“多种”是至少5种、经常是至少25种或至少40种不同的PDZ蛋白。在一种优选的实施方案中，多种不同的PDZ蛋白来自特定的组织(例如中枢神经系统、脾、心肌、肾)或特定种类或类型的细胞(例如，造血细胞、淋巴细胞、神经细胞)等。在最优选的实施方案中，多种不同的PDZ蛋白代表了所有已知或可能在所述组织或细胞中表达的PDZ蛋白(例如，已知存在于淋巴细胞内的所有PDZ蛋白)的实质性组份(例如，通常是指大部分，更经常是指至少80％)。在一个实施方案中，所述“多种”是指至少50％、通常至少80％、至少90％或这里所公开的造血细胞中表达的所有PDZ蛋白。
在本发明的一个实施方案中，测定了一种配体与多种PDZ蛋白的结合。使用这一方法，能够鉴别以特殊特异性与该配体结合的特定PDZ结构域。结合可以称为“特异的”，如果该配体与所述特定PDZ结构域的亲和力至少2倍于其与多种PDZ结构域(例如，这一细胞类型中存在的)中其他PDZ结构域的结合。结合被认为是“非常特异的”，如果其亲和力比多种PDZ结构域中任何其他PDZ结构域至少高10倍，或另外，比所述多种PDZ结构域中至少90％、更经常的是95％的其他PDZ高至少10倍。类似的，结合被认为是“极其特异的”，如果其至少高100倍。例如，配体可以1μM的亲和力与两种不同的PDZ结合，而不以低于100μM的亲和力与40种PDZ中的其他PDZ结合。这可以认为与所述这两种PDZ特异结合。类似的对特异性的测量用于描述一种PDZ与多种PL的结合。
需要认识到，高特异性的PDZ-PL相互作用代表了对于实现所希望的生物学效果而言在更有价值的靶点。经常希望抑制剂或强子具有以高特异性作用的能力。最特异的PDZ-配体相互作用尤其也是用于该相互作用的特异性检测或瓦一种相互作用的诊断靶点。
这样，在一个实施方案中，通过提供多种不同的固定化多肽，其中每一种所述多肽由一个PDZ结构域和一个非PDZ结构域构成；测定配体与每种所述多肽的亲和力并比较配体与每种所述多肽结合的亲和力，其中当配体以比结合不含所述特定PDZ结构域的固定化多肽高至少两倍的亲和力结合含所述特定PDZ结构域的固定化多肽时，配体与特定PDZ结构域之间的相互作用被认为具有高特异性，本发明提供了一种鉴别特定PDZ结构域与已知的或可能结合至少一种PDZ结构域的配体之间高特异性相互作用的方法。
在相关方面，测定了具体PDZ结构域与多种配体(或可能的配体)结合的亲和力。例如，在一个实施方案中，通过提供由所述PDZ结构域和非PDZ结构域构成的固定化多肽；测定多种配体中的每一种对该多肽的亲和力并比较每种配体与多肽结合的亲和力，其中当配体以比其他待测配体高至少两倍的亲和力结合含所述特定PDZ结构域的固定化多肽时，特定配体与PDZ结构域之间的相互作用被认为具有高特异性，本发明提供了一种鉴别PDZ结构域与已知的或可能结合至少一种PDZ结构域的配体之间的高特异性相互作用的方法。这样，结合可以称为“特异的”，如果PDZ对特定PL的亲和力至少2倍于该PDZ与多种PL(例如，存在于这一细胞类型中的)中其他PL结合的亲和力。结合被认为“非常特异的”，如果该亲和力比与多种PL中任何其他PL的至少高10倍，或另外，比确定的多种PL中至少90％、更常见的是95％其他PL高至少10倍。相似的，结合被认为是“极其特异的”，如果至少高100倍。通常“多种PL”是指至少5种不同的配体，更常见的是至少10种不同配体。
A.使用阵列进行全面预测
本发明发明人的一个发现是与PDZ蛋白和PL蛋白之间的相互作用所起到的重要广泛的作用相关的，尤其是在参与免疫应答的造血细胞和其他细胞的生物学功能中。进一步发现，通过大量PDZ-PL相互作用的分析(例如同时分析)可以探知有价值的信息。在优选的实施方案中，该分析包括了在特定组织(如脾脏)或种类或类别的细胞(例如，造血细胞、神经细胞、淋巴细胞、B细胞、T细胞等)中表达的所有PDZ蛋白。另外，该分析包括至少约5种、或至少约10种、或至少约12种、或至少约15种及经常是至少约50种不同的多肽，直到约60种、约80种、约100种、约150种、约200种、或甚至更多不同的多肽；或已知或可能在所述组织或细胞中表达的所有PDZ蛋白(例如，已知存在于淋巴细胞中的所有PDZ蛋白)的实质性组分(例如，通常是大部分，更常见的是至少80％)。
需要认识到，本发明中的阵列和方法是针对PDZ和PL相互作用的分析的，并包括选择这样的蛋白用于分析。虽然本发明中的技术和方法可以包括或涉及一小部分对照多肽，它们通常不包括显著数量的不含PDZ或PL结构域的蛋白或融合蛋白(例如，通常本发明的方法或技术中至少约90％固定化的或排列的多肽是PDZ或PL序列蛋白，更常见的是至少约95％或至少约99％)。
由本公开显而易见的是，优选的是对相对大量不同的相互作用进行同时分析。在这里的上下文中，“同时”是指在同一时间对几个不同的PDZ-PL相互作用(或待测物质对这样的相互作用的影响)的分析进行评估。通常所述分析以高通量的(例如自动机械)方式进行。这一同时分析的方法的一个优点是允许精确比较多种不同的PDZ-PL相互作用。例如，如在本说明书其他地方详细解释的，同时分析(并使用下文所述的阵列)便于例如直接比较一种物质(例如潜在的相互作用抑制剂)对组织或细胞中PDZ和/或PL的实质性部分之间相互作用的影响。
相应的，本发明的一个方面提供了一种将含PDZ结构域和非PDZ结构域的多肽固定在表面上的阵列。通常，该阵列包括至少约5种、或至少约10种、或至少约12种、或至少约15种以及经常至少约50种不同的多肽。在一种优选的实施方案中，不同的PDZ蛋白来源于一种特定的组织(例如，中枢神经系统、脾脏、心肌、肾脏)或一种特定种类或类别的细胞(例如，造血细胞、淋巴细胞、神经细胞)等。在一种最优选的实施方案中，多种不同的PDZ蛋白代表了在所述组织或细胞中已知或可能表达的所有PDZ蛋白(例如，已知存在于淋巴细胞中的所有PDZ蛋白)的实质性组分(例如，通常是其大部分，更常见的是至少其60％、70％或80％)。
某些实施方案是包括多种(通常至少5种、10种、25种、50种)存在于特定的感兴趣的细胞中的PDZ蛋白的阵列。在这一上下文中，“阵列”是指固定化的多肽的有序的序列，其中每种多肽的身份与其位置相连。在一些实施方案中，所述的多种多肽排列在“公共”区域，这样它们可以同时与溶液(例如，含配体或待测物质)接触。例如，多种多肽可以位于基片上、平板上或类似表面上，这些表面可以是塑胶、玻璃、金属、硅、颗粒或其他能固定化蛋白的表面。在一种不同的实施方案中，不同的固定化的多肽被置于分割的区域内(如24孔板、96孔板、384孔板等多孔平板的不同的孔内)。需要认识到，通过使用串联的多个阵列可以获得类似的优势。
B.PDZ-PL抑制特征分析
本发明的一个方面提供了一种在大量PDZ-配体相互作用(例如，美国专利申请09/724553中描述的多种PDZ-配体相互作用；如前文所述的大部分在特定细胞或组织(如宫颈组织)中鉴定的PDZ-配体等)中测定一种待测化合物是否抑制任何PDZ-配体相互作用的方法。在一个实施方案中，感兴趣的PDZ结构域以GST-PDZ融合蛋白的形式表达并如这里所述的方式固定化。对于每一种PDZ结构域，以已知亲和力与该结构域结合的标记配体以如这里所述的方式进行鉴定。
对于任何已知的或可能的PDZ-PL相互作用的调控剂(例如抑制剂)来说，知道哪种相互作用被抑制(或增强)是有益的。这一信息可以用作针对存在病原体的诊断标志物(例如，致癌HPV病毒株)。被一种特定物质抑制PDZ相互作用的特征被称为该物质的“抑制特征”并在以下进行了详细描述。被一种特定物质强化PDZ相互作用的特征被称为该物质“强化特征”。对于精通本领域的人员来说，在对抑制特征的描述的指导下，如何确定一种物质的强化特征是显而易见的。本发明提供了在单一检测中确定一种物质的PDZ相互作用(抑制/强化)特征的方法。
本发明的一个方面通过以下步骤，提供了测定一种化合物的PDZ-PL抑制特征的方法：提供(i)多种不同的固定化多肽，每种所述的多肽由PDZ结构域和非PDZ结构域构成以及(ii)多种相应的配体，其中每种配体结合至少一种(i)中的PDZ结构域，然后在存在和不存在待测化合物的情况下将每种(i)中所述的多肽与(ii)中所述的相应的配体接触，并测定对于每种多肽-配体对，待测化合物是否抑制所述的固定化多肽和相应配体之间的结合。
通常所述的“多种”是指至少5种、通常是至少25种、或至少40种不同的PDZ蛋白。在一种优选的实施方案中，多种不同的配体和多种不同的PDZ蛋白来自相同的组织或特定种类或类型的细胞，例如，宫颈细胞、阴茎细胞、肛门细胞等。在一种最优选的实施方案中，多种不同的PDZ代表了已知或可能在所述组织或细胞中表达的所有PDZ的实质性部分(例如至少80％)，例如已知存在于淋巴细胞中的所有PDZ(例如，这里所公开的在造血细胞中表达的至少80％、至少90％或所有的PDZ)。
在一个实施方案中，抑制特征测定如下：多种(例如，所有已知的)在一种细胞(例如，宫颈细胞)中表达的PDZ结构域以GST融合蛋白的形式表达并如前文所述以不改变其配体结合性质的方式固定化。对于每种PDZ结构域而言，确定了以已知亲和力与该结构域结合的标记配体。如果在淋巴细胞中表达的PDZ结构域的集合用{P1...Pn}表示，任意给定的PDZ结构域Pi以亲和力Kdi与标记的配体Li结合。为了测定待测物质“化合物X”的抑制特征，可以在如下的行用A-H标记、列用1-12标记的96孔板上进行“G”检测(见前文)。列1用P1包被并洗涤。在列1的每个经过清洗的包被孔中添加含(行B、D、F、H)或不含(行A、C、E、G)浓度约1到1000μM之间的待测化合物X的浓度为0.5Kd1的相应的配体L1。列2用P2包被，添加含或不含抑制剂X的L2(浓度0.5Kd2)。另外的PDZ结构域和配体用相似方式检验。
化合物X被认为抑制Li与Pi的结合，如果列i中含X的孔的平均信号低于该列中同等的不含X的孔的平均信号的一半。这样，在这一单一检测中测定了被化合物X抑制的淋巴细胞PDZ的全部集合。
在一些实施方案中，待测化合物X是一种化合物的混合物，例如如前文所述的组合化学合成产物。在一些实施方案中，待测化合物是已知具有所希望的生物学作用的，所述检测用于确定其作用机制(即该生物学作用是否是由于对PDZ-PL相互作用的调节)。
显而易见的是，一种仅调节一组中(例如，所有已知的淋巴细胞PDZ的组，至少10种、至少20种或至少50种PDZ结构域的组)一种或几种相互作用的的物质比调节多种或大部分相互作用的物质具有更高的特异性。通常，调节一组中小于20％的PDZ结构域的物质被认为是“特异性”抑制剂，小于6％的是“非常特异性”抑制剂，调节单个PDZ结构域的是“最高特异性”抑制剂。
也需要认识到，“化合物X”可以是含化合物混合物的组合物(例如，通过组合化学方法生成的)而不是单一化合物。
预计了这一检测方法的几种变形：
在一些选择性实施方案中，上述检测方法使用变化浓度而不是固定浓度的待测化合物X。这样可以如上述方式测定对于每种PDZ的X的Ki值。
在一种选择性的实施方案中，代替用一种具体的标记配体Li将每种PDZ-PL配对的做法，创建了不同标记配体的混合物，对于每种PDZ而言，该混合物中的至少一种配体与该PDZ充分结合以在“G”检测中检测这一结合。这一混合物随后用于每种PDZ结构域。
在一个实施方案中，已知化合物X具有所希望的生物学作用，但其具有这一作用的化学机制是未知的。可以使用本发明的检测方法以确定化合物X是否通过结合PDZ结构域而具备了其作用。
在一个实施方案中，对含PDZ结构域蛋白按其生物学功能进行分组，例如分成与转录调控相对的调控趋化作用的PDZ蛋白。一种特定功能的理想抑制剂(例如包括但不限于抗趋化剂、抗T细胞活化剂、细胞周期调控、膜泡运输、凋亡等)应该抑制参与该功能(例如趋化作用、激活)的多种PDZ-配体相互作用但不影响其他相互作用。这样，在一个实施方案中该检测用于筛选和设计特异性阻碍一种特定功能的药物。例如，由于在给定浓度下，该物质抑制2种或更多参与化学趋化的PDZ但抑制3种以下其他PDZ，或该物质抑制参与化学趋化的PDZ的Ki值比抑制其他PDZ的高10倍以上，可以对一种设计用来阻断趋化作用的物质进行鉴定。这样，本发明提供了一种鉴定抑制第一批选出的PDZ-PL相互作用或多种相互作用但不抑制第二批选出的PDZ相互作用或多种相互作用的物质的方法。所述两批(或更多)相互作用可以在PDZ蛋白的已知生物学功能、PDZ蛋白的组织特异性或任何其他标准的基础上进行进行选择。而且，所述检测方法可以用于确定引起所希望效果而避免不希望效果的有效剂量(即药物浓度)。
C.PDZ-PL相互作用的激动剂和拮抗剂
如这里所描述的，细胞(如宫颈细胞)中PDZ蛋白和PL蛋白的相互作用可能被病原体的存在而瓦解或抑制。病原体可以通过使用这里所描述的筛选方法进行鉴定。PDZ-病原体PL相互作用或PDZ-细胞PL相互作用的激动剂和拮抗剂在辨别或确认具体的相互作用中是有用的。在一些实施方案中，一种激动剂能提高一种PDZ-病原体PL相互作用的灵敏度。在其他实施方案中，可以使用一种PDZ-病原体PL相互作用的拮抗剂，以检验一种相互作用的特异性。在一个实施方案中，使用这里所公开的基序以设计抑制剂。在一些实施方案中，本发明的拮抗剂具有建立在表3中所列举的PL结构域蛋白C末端残基上的结构(例如肽序列)。在一些实施方案中，本发明的拮抗剂具有建立在这里所公开的或美国专利申请09/724553中所公开的PL基序上的结构(例如肽序列)。
本发明的PDZ/PL拮抗剂和激动剂可以是大量化合物中任意的，可以是天然的或合成的、有机的或无机的，并包括聚合物(例如，寡聚肽、多肽、寡核苷酸和多核苷酸)、小分子、抗体、糖类、脂肪酸、核苷酸及核苷酸类似物、天然结构类似物(例如类肽、核酸类似物等)、以及大量其他化合物。虽然，为了表述方便，本发明的论述主要涉及PDZ-PL相互作用的拮抗剂，需要认识到，PDZ-PL相互作用激动剂也可以在这里所公开的方法中使用。
一个方面，本发明的肽和肽类似物或模拟物包含与感兴趣的细胞中的PDZ结构域结合的氨基酸序列。在一个实施方案中，拮抗剂包括含有对应于表3中所列举的或美国专利申请09/724553中的PL蛋白羧基端序列的序列的肽，例如，表3所列举的肽。通常，所述的肽包括至少PL蛋白C末端的2个、3个或4个残基，并经常所述的抑制肽包括来自PL蛋白C末端的4个以上的残基(例如，至少5、6、7、8、9、10、12或15个残基)。
在一些实施方案中，所述抑制剂是一种肽，具有例如PLC末端蛋白序列的序列。
在一些实施方案中，拮抗剂是一种包含这样一段序列的融合蛋白。含跨膜转运氨基酸序列的融合蛋白尤其有用。
在一些实施方案中，抑制剂是具有抑制活性的PLC末端蛋白序列的保守变体。在一些实施方案中，拮抗剂是PLC末端序列的拟肽。
在一些实施方案中，抑制剂是小分子化合物(即分子量小于1kD的)。
D.肽拮抗剂
在一个实施方案中，拮抗剂由一条具有表3中列举的PL蛋白羧基末端序列的肽构成。所述肽包括PL蛋白的至少2个C末端残基，通常所述抑制肽包括来自PL蛋白C末端2个以上残基(例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、12或15个残基)。所述肽可以是多种长度中的任意一种(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少8个、至少10个或至少20个残基)并可以包含不是来自PL蛋白的附加残基。需要认识到，短的PL肽有时用于具有类似性质的其他小分子的理性设计。
虽然抑制肽与PL蛋白共有的残基最常见的是位于肽的C末端，然而，在一些实施方案中，该序列位于内部。类似的，在有些情况下，抑制肽包括来自PL蛋白C末端附近而不是C末端的PL序列的残基(参见，Gee等，1998，J Biological Chem.273：21980-87)。
在提及所述短序列与PDZ结构域相互作用的能力时，PL蛋白羧基端序列有时被称为“核心PDZ基序序列”。例如，在一个实施方案中，“核心PDZ基序序列”包括最后4个C末端氨基酸。如上所述，PDZ基序序列的这4个氨基酸核心可以在其氨基端包括附加的氨基酸以进一步提高其结合亲和力和/或稳定性。因而，在一个实施方案中，所述PDZ基序序列肽可以由4到15个氨基酸组成。该序列优选的长度是6-10个氨基酸。所述PDZ基序序列更优选地包括8个氨基酸。所述核心序列氨基末端附加的氨基酸可以是得自每种造血细胞表面受体中的天然序列或是合成的连接序列。附加的氨基酸也可以被保守替代。当从C末端开始的第三个残基是S、T或Y时，这一残基可以在使用所述的肽之前被磷酸化。
在一些实施方案中，肽和非肽抑制剂是小分子，例如，如果是肽的话长度小于10个氨基酸残基。据进一步的报道，有限数量的配体氨基酸直接与PDZ结构域接触(通常少于8个氨基酸)(Kozlov等，2000，Biochemistry 39，2572；Doyle等，1996，Cell 85：1067)，象C末端3个氨基酸这样短的肽通常保持了与更多氨基酸(＞15)的肽相似的结合性质(Yanagisawa等，1997，J.Biol.Chem.272：8539)。
E.肽的变体
在对PDZ结合肽和PDZ-PL相互作用抑制序列进行鉴别之后，可以制造这些序列的变体并可以检测所获得的肽变体的PDZ结构域结合或PDZ-PL抑制活性。在实施方案中，所述变体具有与起始肽相同或不同的结合PDZ结构域的活性。通常，这样的氨基酸替换是保守的，即所述氨基酸残基被具有与所取代的残基相似的物理和/或化学性质的其他氨基酸残基所取代。优选的保守氨基酸替代是其中一个氨基酸被属于指定的相同种类中的另一个氨基酸所取代。
F.肽模拟物
在对PDZ结合肽和PDZ-PL相互作用抑制序列进行鉴别之后，可以用常规方法制备肽模拟物，并且可以用本发明的检测方法证实所述模仿物的抑制活性。因而，在一些实施方案中，激动剂或拮抗剂是PLC末端序列的肽模拟物。精通本领域的技术人员应当承认，合并成模拟物的单个的合成的残基和多肽可以用在科技和专利文献(例如，Gilman等人编的《有机合成合集》(Organic Syntheses Collective Volumes)，JohnWiley & Sons，Inc.，NY中充分描述的多种工艺和方法进行合成。合并成模拟物的多肽也可以用如例如Di Marchi等人在美国专利No.5,422,426中所描述的固相合成工艺生成。本发明的模仿物也可以采用组合方法进行合成。多种生成肽库和类肽库的技术是熟知的，并包括，例如多针(multipin)法、茶叶袋(tea-bag)法和分开-结合-混合(split-couple-mix)技术；参见，例如，al-Obeidi(1998)Mol.Biotechnol.9：205-223；Hruby(1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1：114-119；Ostergaard(1997)Mol.Divers.3：17-27；Ostresh(1996)Methods Enzymol.267：220-234。
G.小分子化合物
在一些实施方案中，激动剂或拮抗剂是小分子化合物(即具有小于1kD的分子量)。筛选小分子化合物的方法是本领域内熟知的并包括前文所述的那些方法。
X.最优化PL探测分子的方法
虽然前文所述主要关于鉴别PDZ结构域多肽与PL蛋白之间的相互作用，前文所述的检测方法和其他检测方法也可以用于鉴别其他分子(例如，肽模拟物、小分子化合物等)与PDZ结构域序列的结合。例如，使用这里公开的检测方法，可以针对例如与PDZ结构域特异结合的分子筛选组合文库和其他文库。文库筛选可以通过多种广泛所知的方法中的任一种方法得以实现。参见例如以下公开了的肽库筛选的参考文献：Parmley和Smith，1989，Adv.Exp.Med.Biol.251：215-218；Scott和Smith，1990，Science 249：386-390；Fowlkes等，1992，BioTechniques 13：422-427；Oldenburg等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5393-5397；Yu等，1994，Cell 76：933-945；Staudt等，1988，Science 241：577-580；Bock等，1992，Nature 355：564-566；Tuerk等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6988-6992；Ellington等，1992，Nature 355：850-852；Ladner等人的美国专利No.5,096,815，美国专利No.5,223,409，以及美国专利No.5,198,346；Rebar和Pabo，1993，Science 263：671-673；以及PCT公开No.WO94/18318。
在一种具体的实施方案中可以通过将文库成员与固定在固体支持物(例如，如以上在“G”检测中所述的)上的PDZ结构域多肽接触并收获那些与该蛋白结合的文库成员进行筛选。这样的筛选方法(术语称为“平底锅”(panning)技术)的实例通过Parmley和Smith，1988，Gene 73：305-318；Fowlkes等，1992，BioTechniques 13：422-427；PCT公开No.WO 94/18318；以及在上文所引用的参考文献中的例子进行描述。
在另一个实施方案中，可以使用母中挑选相互作用蛋白的双杂交系统(Fields和Song，1989，Nature 340：245-246；Chien等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9578-9582)来鉴别与含PDZ结构域蛋白特异结合的分子。此外，对经鉴别的分子进一步检测其抑制跨膜受体与PDZ结构域相互作用的能力。
在本发明的一个方面，鉴别了PDZ蛋白和PL蛋白之间相互作用的拮抗剂。在一个实施方案中，使用上文所述“A”检测的一种修正以鉴别拮抗剂。在一个实施方案中，使用上文所述“G”检测的一种修正以鉴别拮抗剂。
在一个实施方案中，使用筛选方法来检测与PDZ结构域特异结合的分子。这样的分子作为PDZ蛋白介导的细胞功能(例如，如T细胞活化的细胞活化、膜泡转运、细胞因子释放、生长因子、转录改变、细胞骨架重构、细胞运动、趋化等)的动剂或拮抗剂是有用的。在一个实施方案中，为了药物开发运用这样的检测方法来筛选白细胞活化抑制剂。本发明从而提供了检测与含PDZ结构域蛋白特异结合的分子的检测方法。例如，可以使用表达编码PDZ结构域的核的重组细胞来生产这些检测方法中的PDZ结构域并筛选与所述结构域结合的分子。分子与所述PDZ结构域(或其片段)在经确定的条件下接触。可以用于实行前述内容的方法是本领域内所知的。
普通技术人员需要意识到，在一个实施方案中，通过在存在和不存在已知的或候选拮抗剂的情况下实施A或G检测，对拮抗剂进行鉴别。当在一种化合物存在的情况下观到结合减弱时，该化合物被确定为一种拮抗剂。在存在一种化合物的情况下结合的提高表示该化合物是一种动剂。
例如在一种检测中，通过在两者能够形成复合物的条件下(除了存在待测化合物的情况)，在存在和不存在待测化合物的情况下PDZ结构域多肽与PL肽的接触，并检测在存在和不存在待测化合物情况下该复合物的形成，可以确定待测化合物是PDZ蛋白与PL蛋白之间结合的抑制剂(拮抗剂)。需要意识到，在存在该待测化合物时的复合物形成少于不存在该化合物时的复合物形成表示该待测化合物是PDZ蛋白-PL蛋白结合的抑制剂。
在一个实施方案中，在一种候选抑制剂存在或不存在的情况下使用“G”检测。在一个实施方案中，在一种候选抑制剂存在或不存在的情况下使用“A”检测。
在一个实施方案中(其中使用了G检测)，如前文所述将一种或多种含PDZ结构域的GST融合蛋白(和包括非融合的GST蛋白在内的适当的对)结合到96孔板的孔的表面。所有融合蛋白结合在多个孔中，这样可以进行适当的对和统计学分析。在孔中添加含待测化合物(通常以多个不同的浓度)的BSA/PBS。随即在每个孔中添加30微升终浓度为例如约2μM到约40μM之间的(通常为5μM、15μM或25μM)已知与相应PDZ结构域结合的(参见例如表4)可检测标记(如生物素化的)肽。然后使该混合物与结合在表面上的PDZ融合蛋白在4℃下反应10分钟，所后在25℃再反应20分钟。从所述表面用冰冷的PBS3次洗脱未结合的肽并在待测化合物存在和不存在的情况下测定所述肽的结合量。通常，对于每组重复的孔(例如一式两份)通过从这些孔中肽结合的原始测量值中减去单独GST本底值对结合水平进行测量。
在另一个实施方案中，在一种待测候选化合物存在和不存在的情况下进行A检测来鉴别PDZ-PL相互作用的抑制剂。
在一个实施方案中，当一种待测化合物的浓度小于或等于1mM(例如，小于或等于：500μM、100μM、10μM、1μM、100nM或1nM)，在存在该待测化合物的情况下PDZ结构域(P)与PL序列(L)的结合低于该待测化合物不存在的情况下两者结合的约50％(在多种实施方案中，低于约25％、低于约10％或低于约1％)时，这一待测化合物被确定为所述PDZ结构域和PL序列结合的特异性抑制剂。优选的，在待测化合物存在的情况下P与L结合的纯粹信号加上存在待测化合物时信号的6倍标准误差小于不存在该待测化合物时的结合信号。
在一个实施方案中，通过使用单一的PDZ蛋白-PL蛋白对(例如，一种PDZ结构域融合蛋白和一种PL肽)对抑制剂进行检测。在一种相关的实施方案中，所述检测通过使用多种蛋白对(诸如表4中列举的多种不同蛋白对)进行。
在一些实施方案中，希望确定在给定浓度下抑制一种PL-PDZ对的结合，但不抑制(或以更弱程度抑制)特定的第二种PL-PDZ对的结合的化合物。这些拮抗剂可以通过进行一系列使用候选抑制剂和不同PL-PDZ对的检测并比较所述检测结果进行鉴别。本发明考虑到了所有这样的配对组合(例如，待测化合物以比抑制PL1与PDZ2的结合或PL2与PDZ2的结合更大程度抑制PL1与PDZ1的结合)。重要的是需要意识到，在表4中所提供的以及这里所公开的数据(以及可以通过使用本说明书所描述的方法生成的其他数据)基础上可以容易地设计具有不同特异性的抑制剂。
例如，按照本发明，可以测定PDZ-PL相互作用的一种抑制剂的Ki值(“能力”)。Ki值是产生一种生物学效果所要求的抑制剂浓度的度量。例如，足以导致细胞内抑制剂浓度达到至少约1倍到100倍Ki值之间的PDZ-PL相互作用的抑制剂量作用预计能够抑制由靶PDZ-PL相互作用介导的生物学反应。在本发明的一个方面，以上述方法测定的PDZ-PL结合的Kd测量法用于测定Ki。
这样，在本发明的一个方面，通过在表面上固定一种由PDZ结构域和非PDZ结构域组成的多肽，将该固定的多肽与配体和抑制剂的多种不同混合物接触(其中所述不同混合物由固定量的配体和不同浓度抑制剂构成)，测定在不同的抑制剂浓度下结合的配体数量并在不同浓度抑制剂下结合的配体数量基础上计算结合的Ki值，提供了一种测定PDZ结构域与配体之间相互作用的抑制剂或可能的抑制剂的能力(Ki值)的方法。在一个实施方案中，所述多肽通过和与非PDZ结构域结合的固定化的免疫球蛋白结合进行固定化。这一基于上述“G”检测的方法尤其适于PDZ-配体相互作用的抑制剂的Ki值的高通量分析。进一步，使用这一方法测量了PDZ-配体相互作用的抑制本身而没有被亲和作用扭曲测量法。
通常，对至少一部分配体进行可检测地标记以便对配体结合的简便定量。
需要认识到，挑选配体浓度和抑制剂浓度以允许对抑制进行有目的的检测。这样，其结合被阻断的配体浓度接近于或小于其结合亲和力(例如，优选的是小于相互作用的5XKd值，更优选的是小于2XKd值，最优选的是小于1XKd)。因而，配体通常以低于2Kd值(例如在约0.01Kd和2Kd之间)的浓度存在，待测抑制剂的浓度通常介于1nM到100μM之间(例如，最高浓度为10μM或1mM的4倍稀释系列)。在一种优选的实施方案中，Kd值通过用前文所公开的检测方法测定。
在不同浓度抑制剂存在下结合的配体数量的基础上，结合的Ki值可以通过本领域内日常使用的多种方法中的任何一种方法进行计算。在一种说明性的实施方案中，例如，将标记配体的结合相对于抑制剂浓度的图示按照以下等式进行拟合：
S抑制剂＝S0*Ki/([I]+Ki)
其中，S抑制剂是浓度为[I]的抑制剂存在时与固定的PDZ结构域结合的标记配体的信号，而S0是不存在抑制剂时的信号(即[I]＝0)。通常[I]用摩尔浓度表示。
在本发明的另一个方面，通过在表面上固定由PDZ结构域和非PDZ结构域构成的多肽，在存在待测物的情况下将固定化多肽与配体结合并测定结合的配体量，以及比较存在所述待测物时结合的配体量和不存在该待测物时与多肽所结合的配体量，对PDZ结构域和配体之间结合的增强子(有时称为激动剂或促进素)进行鉴别。与不存在待测物时相比，存在待测物时的结合至少高两倍(经常至少高5倍)，这表明该待测物是增强PDZ结构域与配体结合的物质。如上文所指出的，增强PDZ-配体相互作用的物质对于干扰(调控紊乱)要求正常PDZ-配体功能的生物学事件(例如，癌细胞分裂和转移以及免疫细胞活化和迁移)来说是有用的。
本发明也提供了测定PDZ-配体相互作用增强子“能力”或“K增强子”的方法。例如，按照本发明，通过例如使用通过上文所述方法测定的PDZ-PL结合的Kd值，可以测定PDZ-PL相互作用增强子的K增强子值。K增强子值是预计具有生物学效果的增强子浓度的度量。例如预计使用足以导致细胞内增强子浓度达到至少约0.1到约100K增强子值之间(例如介于0.5到50K增强子值之间)量的PDZ-PL相互作用的增强子可以干扰由目标PDZ-PL相互作用介导的生物学反应。
这样，本发明的一个方面，通过在表面上固定由PDZ结构域和非PDZ结构域构成的多肽，将固定的多肽与配体和增强子的多种不同的混合物接触(其中所述不同的混合物由至少其中一部分经可检测标记的固定量的配体和不同浓度的增强子构成)，测定不同浓度增强子下结合的配体量并在不同浓度增强子浓度下结合的配体量的基础上从结合计算所述增强子的能力(K增强子值)，提供了一种测定PDZ结构域和配体之间结合的增强子或可能的增强子的能力(K增强子值)。通常，所述配体的至少一部分是经可检测标记的以允许对配体结合进行简便定量。这一基于上述“G”检测的方法尤其适于对PDZ-配体相互作用增强子的K增强子值进行高通量分析。
需要认识到的是，配体浓度和增强子浓度是经挑选的以对增强的结合进行有目的的检测。因而，配体浓度通常介于约0.01Kd到约0.5Kd之间，待测物/增强子浓度通常介于1nM到1mM之间(例如，最高浓度为10μM或1mM的四倍稀释系列)。在优选的实施方案中，Kd值通过使用前文公开的检测方法测定。
结合能力可以通过多种基于不同浓度增强子或促进素下结合的配体量的常规方法测定。例如，可以按以下等式对标记配体结合相对于增强子浓度的图示进行拟合：
S([E])＝S(0)+S(0)*(D增强子-1)*[E]/([E]+K增强子)
其中“K增强子”是增强化合物的能力，“D增强子”是添加饱和量的增强化合物时获得的标记配体结合的提高倍数，[E]是增强子的浓度。需要理解的是，饱和量是指进一步添加不会显著提高结合信号的增强子浓度。由于它描述了能在靶细胞中导致PDZ-PL相互作用的调控紊乱引起的生物学效果的所述增强化合物的浓度，对“K增强子”的认识是有益的。典型的治疗浓度介于约0.1到100K增强子值之间。
对于某些相互结合并已经获得其Kd值的PDZ蛋白和PL蛋白，进行了附加检测以确定某些药物化合物是否能拮抗或增强所述的相互作用。除了50微升10μM生物素化PL肽溶液而不是如检测法步骤(2)所述的20μM溶液与带有PDZ结构域多肽的表面反应以外，存在和不存在待测化合物时的检测均按如上述G’检测进行。
另一种提高PDZ-PL相互作用特异性或灵敏度的方法是通过诱变并选择高亲和力或高特异性的变体。可以应用诸如UV、化学(例如EMS)或生物诱变(例如分子改组(Molecular shuffling)或DNA聚合酶诱变)的方法创建编码PDZ结构域或PL结构域的DNA突变。然后可以由变体生产蛋白并用本说明书所述的多种方法(例如，“A”检测、“G”检测或酵母双杂交)对其进行检测。通常来说，人们可以检测对于其他细胞PL(如第IX部分所述)具有降低的亲和力，在突变的PDZ结构域和待测样本(如致癌的E6PL)之间高亲和力结合的突变体。这些方法是精通本领域的技术人员所知的，本说明书中的例子并不意味着限制。
XI.重组探测分子合成
如在“发明背景”部分所指出的，含PDZ结构域蛋白参与大量生物学功能，这包括但不限于：膜泡运输、肿瘤抑制、蛋白分选、膜极性的建立、凋亡、免疫应答的调节和神经突触形成的组织。通常而言，这一蛋白家族经常作为几个蛋白之间的桥梁或调节其他蛋白的功能，具有促进多蛋白复合物装配的共有功能。此外，也如前文所指出的，这些蛋白基本上在所有细胞类型中都有发现。因此，检测不适当的PDZ-PL相互作或异常的相互作用可以用于诊断大量生物学和生理学状态。尤其是通过使用PDZ结构域可以对来自病原体PL蛋白的检测进行诊断。本发明中的大部分但不是全部实施方案要求向用于检测的PDZ或PL蛋白添加可检测的标记物。下面是给出的实例。
A.化学合成
本发明中的肽或其类似物可以实际上使用任何本领域已知的用于制备肽和肽类似物的技术进行制备。例如，使用常规的溶液或固相肽合成并从树脂上切下随后纯化的工艺(Creighton著，1983，《蛋白结构与分子原则》(Protein Structures And MolecularPrinciples)，W.H.Freeman and Co.，N.Y.)，可以制备线性的肽。这里所述的合成肽的适当的方法是本领域内熟知的。合成肽的成分可以通过氨基酸分析或测序证实(例如，通过Edman降解法和质谱)。
此外，所述肽的类似物和衍生物可以化学合成。本发明中的肽的每个氨基酸之间的连接可以是酰胺、取代的酰胺或酰胺的电子等排物。非经典氨基酸或化学氨基酸类似物可以以取代或添加的形式被引入序列中。非经典氨基酸包括但不限于：普通氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基异丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺丙氨酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟氨基酸、诸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸、以及通常意义上的氨基酸类似物的设计的氨基酸。而且，所述氨基酸可以是D(右旋性的)型或L(左旋性的)型的。
B.重组合成
如果肽完全或部分由基因编码的氨基酸构成，所述肽或其相应的部分也可以用常规重组基因工程技术合成。为实现重组生产，将编码线性肽的多核苷酸序列插入适当的表达传输工具，也就是包含所述插入编码序列所需的转录和翻译元件的载体，或是在RNA病毒载体中包含所需复制和翻译元件的载体。表达载体随后转染能表达所述肽的靶细胞。取决于所使用的表达系统，表达的肽随后通过本领域内所充分确立的工艺进行分离。生产重组蛋白和肽的方法是本领域内所熟知的(参见例如Maniatis等，1989，《分子克隆：实验室手册》(Molecular CloningALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.；以及Ausubel等，1989，《现代分子生物学实验方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Associates and WileyInterscience，N.Y.)。
可以使用多种宿主-表达载体系统来表达本说明书所述的肽。这些系统包括但不限于用含有适当编码序列的重组噬菌体DNA或质粒DNA表达载体转化的诸如细菌的微生物；用含有适当编码序列的重组酵母或真菌表达载体转化的酵母或丝状真菌；用含有适当编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有适当编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜嵌纹病毒(cauliflower mosaic virus)或烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus))感染或用含有适当编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
在一些实施方案中，可以提高PL探测蛋白拷贝数以提高检测的特异性或灵敏度。实施例4提供了一个这样的实例。TIP-TIP-IgG载体产生具有重复拷贝的来自TIP-1的PDZ结构域的融合蛋白，该蛋白本身能在IgG恒定区骨架的基础上二聚化。因此，单一的蛋白包含TIP-1PDZ结构域的2-4个拷贝。以类似的方式可以形成PL探测蛋白的附加串联重复。在一些实施方案中，可以对来自不同蛋白的不同PDZ结构域进行改造使之以单一蛋白的形式表达(例如，可以对TIP-1和MAGI-1的PDZ结构域进行改造以检测致癌的HPV E6蛋白)。以相似的方式，可以使用一种不同的Ig骨架以提高构建物的亲和力。例如，所述IgG恒定区能与其自身二聚化，而IgM恒定区能形成由10个单体组成的复合物。
表达系统的表达元件的强度和特异性各不相同。取决于所使用的宿主/载体系统，在表达载体中可以使用包括组成型和诱导型启动子在内的多种适当的转录和译元件中的任何一种。例如，当在细菌系统中进行克隆时，可以使用诸如λ噬菌体的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-plac杂合启动子)等诱导型启动子；当在昆虫细胞系统中进行克隆时，可以使用诸如杆状病毒多面体启动子等启动子；当在植物细胞系统中进行克隆时，可以使用源自植物细胞基因组的启动子(例如，热休克启动子；核二缩化(RUBISCO)小亚基启动子；叶绿素a/b结合蛋白启动子)或来自植物病毒的启动子(例如，CaMV的35S RNA启动子；TMV衣壳蛋白启动子)；当在哺乳动物细胞系统中进行克隆时，可以使用源自哺乳动物细胞的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)；当产生包含多拷贝表达产物的细胞系时，可以使用含适当选择标记的SV40-、BPV-和EBV-基础上的载体。
在使用植物表达载体的情况下，编码本发明的肽的序列的表达可以由多个启动子中的任何一个驱动。例如，可以使用诸如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子病毒启动子(Brisson等，1984，Nature 310：511-514)，或TMV的衣壳蛋白启动子(Takamatsu等，1987，EMBO J.6：307-311)；此外，可以使用诸如RUBISCO的小亚基启动子(Coruzzi等，1984，EMBO J.3：1671-1680；Broglie等，1984，Science 224：838-843)或例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B等热休克启动子(Gurley等，1986，Mol.Cell.Biol.6：559-565)的启动子。这些构建物可以通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等方式导入植物白细胞。关于这些技术的综述参见例如Weissbach和Weissbach 1988年所著《植物分子生物学方法》(Methods for PlantMolecular Biology)第三部分，421-463页；以及Grierson和Corey 1988年所著《植物分子生物学》(Plant Molecular Biology)，第2版，7-9章。
在一种可以用于产生本发明的肽的昆虫表达系统中，使用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhidrosis virus，AcNPV)作为表达外源基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)中生长。可以将编码序列克隆到病毒的非必需区域(例如多面体基因)并置于AcNPV启动子的控制之下(例如，多面体启动子)。编码序列的成功插入会导致多面体基因的失活并生成非闭合的重组病毒(即缺乏由多面体基因编码的蛋白质衣壳的病毒)。这些重组病毒随后用于感染在其中表达所述插入基因的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(例如，参见Smith等，1983，J.Virol.46：584；Smith的美国专利No.4,215,051)。这一表达系统的更多实例可以参见Ausubel等主编的《分子生物学现代实验方案》(Current Protocols in MolecularBiology)一书第2卷，Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用多种基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，编码序列可以与一种腺病毒转录/译调控复合物(例如，晚期启动子和三重前导序列)连接。这一嵌合基因随后可以通过体外或体内重组插入腺病毒基因组。在病毒基因组非比需区域(例如E1或E3区域)的插入能获得可存活并能在受感染的宿主中表达肽的重组病毒(例如，参见Logan和Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3655-3659)。此外，可以使用牛痘7.5K启动子(参见，例如，Mackett等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：7415-7419；Mackett等，1984，J.Virol.49：857-864；Panicali等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：4927-4931)。
产生本发明的线性肽的其他表达系统对于精通本领域的人员来说应是显而易见的。
C.标签或标记物
标签和标记物经常用于帮助纯化组分或检测生物分子。生物标签的例子包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、免疫球蛋白结构域、内含肽、红血球聚素表位、myc表位等。化学标签的例子包括但不限于生物素、金、顺磁性颗粒或荧光团。这些例子可以用于鉴别与其连接的蛋白或化合物的存在或可以被精通本领域的人员用于从复杂混合物中纯化蛋白质或化合物。
D.肽和肽类似物的纯化
本发明的肽和肽类似物可以通过本领域已知的诸如高效液相色谱、离子交换层析、胶电泳、亲和层析等技术进行纯化。实际用于纯化特定肽或类似物的条件应部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于精通本领域的人员而言是显而易见的。纯化的肽可以通过基于其物理或功能性质的检测方法进行鉴别，这些检测方法包括放射性标记后进行凝胶电泳、放射免疫法、ELISA、生物检测等。
XII.试剂盒
本发明也包括用于实现本发明的方法的试剂盒。所述试剂盒通常包括第一种和第二种致癌的HPV E6结合伴侣。在大部分实施方案中，第一结合伴侣是PDZ结构域多肽，而第二结合伴侣是至少一种E6抗体。在一些实施方案中，第二结合伴侣用可检测的标记物进行标记。在其他实施方案中，包括了诸如可检测标记的二级抗体的二级标记成分。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括了用于从样本中分离致癌的HPVE6的手段(如装置或系统)。试剂盒可以选择性地包含蛋白酶体抑制剂。
如果需要，一种所述试剂盒可以进一步包括一种或多种不同的常规成分，诸如例如含一种或多种缓冲液、检测试剂或抗体的容器。试剂盒也可以包括以插页或标签形式指示所使用的成分数量及其使用指南的印刷的说明书。在本发明公开中需要理解的是，指定的材料和条件在本发明的实施中是重要的，但并不排除未指定的材料和条件，只要它们不妨碍本发明利益的实现。以上对本发明诊断方法的示范性实施方案作了详细描述。
在一种所述试剂盒中，致癌的E6检测反应可以使用水的或固体的基质，其中试剂盒可以包括适用于几种诸如检测条、夹心法等的分离和检测平台的试剂。在试剂条的许多实施方案中，试剂条已结合了特异性结合致癌E6蛋白PL结构域的PDZ结构域多肽并在该固体支持物上捕获致癌E6蛋白。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括一种或多种检测抗体，这些抗体是直接或间接可检测的并与致癌E6蛋白结合以允许其检测。试剂盒还可以包括：用于进行免疫印迹的成分(例如，预制凝胶、膜、转移系统等)；用于进行ELISA检测的成分(例如96孔板)；用于进行免疫共沉淀的成分(例如蛋白质A)；用于从样本中对致癌E6蛋白进行亲和分离或分子大小排阻分离的层析柱，特别是离心柱(例如凝胶过滤柱、PDZ结构域多肽柱、分子排阻柱、膜截流离心柱等)。
所述试剂盒也可以包括含致癌的或不致癌的E6的对照样本，和/或致癌E6的稀释系列，其中所述稀释系列代表了适当的标准品的范围，试剂盒的使用者可以将其结果与标准品比较并估计其样本中致癌E6的水平。这样的稀释系列可以提供对患者体内任何癌症进展的评估。荧光、颜色或放射性自显影底片的结果也可以与试剂盒提供的荧光、颜色或底片密度标准曲线进行比较。
除了上面提到的成分，所述试剂盒通常进一步包括使用试剂盒的所述成分以实践所述方法的说明书。实践所述方法的说明书通常记录在适当的记录用媒介上。例如，说明书可以印刷在基质(如纸或塑胶等)上。同样地，说明书可以以套装插件、试剂盒的容器或其成分的标签的形式(即与包装或分包装相连)存在于试剂盒中。在其他实施方案中，说明书以存放在适当的计算机可读的存储介质(例如CD-ROM、磁盘等)上的电子存储数据文件的形式存在。在还有其他实施方案中，试剂盒中并没有真正的说明书，但提供了例如通过互联网从远距离来源获得说明书的方法。这种实施方案的实例是包含了一个网址，通过该网址能观看说明书并/或下载说明书。与说明书一样，这一获得说明书的方法被记录在适当的基质上。
本发明也提供了包括包含了以上所述规划和说明书的至少一种计算机可读媒介的工具包。说明书可以包括安装指导。说明书可以包括如上所述有选择地或多种选择组合地使用本发明的指导。在某些实施方案中，说明书包括了全部两类信息。
以工具包的形式提供软件和说明书可以适合多种用途。作为一种生产在非兔宿主中比亲代抗体具有更低免疫原性的兔抗体或其核苷酸序列的方式，可以包装并购买所述组合。
说明书通常记录在适当的记录用媒介上。例如，说明书可以印刷在如纸或塑胶等的基质上。同样地，说明书可以以套装插件、试剂盒的容器或其成分的标签的形式(即与包装或分包装相连)存在于试剂盒中。在其他实施方案中，说明书以存放在适当的计算机可读的存储介质(例如CD-ROM、磁盘等，包括其中存放了所述程序的相同媒介)上的电子存储数据文件的形式存在。
测定受检者是否被致癌HPV病毒株感染的方法
本发明提供了检测样本中致癌的HPV E6蛋白的方法并可应用于诊断受检者的HPV感染。在多种实施方案中，从受检者获得生物样本并测定样本中致癌的HPV E6蛋白的存在。样本中可检测量的致癌HPV E6蛋白的存在表示该个体被致癌HPV病毒株感染。在其他实施方案中，测定了生物样本中致癌的HPV E6蛋白的水平，并与样本中对照的量进行比较。样本中致癌的HPV E6蛋白的相对量表示HPV感染的严重程度。
如上所述，所述方法通常包括两种致癌的HPV E6蛋白的结合伴侣，其中之一是PDZ结构域多肽。一般说来，所述方法包括a)使用所述结合伴侣从样本中分离致癌的HPV E6蛋白，和b)用另一种结合伴侣检测致癌的HPV E6蛋白。
分离致癌HPV E6蛋白
一般而言，本发明的方法包括至少部分地将天然致癌HPV E6蛋白与样本中的其他蛋白质分开(即分离)。这一分离通常通过使用致癌HPV E6的第一结合伴侣得以实现。在多种实施方案中，第一结合伴侣是PDZ结构域多肽，或在其他实施方案中，是抗HPV E6抗体或抗体混合物。
在某些实施方案中，一种致癌HPV E6结合伴侣直接或通过连接物与不溶的支持物结合。例如，PDZ结构域多肽可能包含与如这里所述的融合伴侣融合的PDZ结构域，该融合伴侣通过化学键直接地或通过连接物(例如柔性连接物、抗体或其他结合部分)间接地与固体支持物结合。在大部分实施方案中，所述PDZ结构域多肽与固体支持物共价结合。固体支持物是本领域内已知的，包括但不限于颗粒(例如磁珠、聚苯乙烯小珠等)、膜等。在一个非限制性实例中，PDZ结构域多肽与磁珠结合。与磁珠结合的PDZ结构域多肽与样本接触，在所述抗体和任何E6蛋白之间形成复合物之后施加磁场，这样将该复合物从样本中分离。在所述PDZ结构域多肽与如膜等不溶的支持物结合的情况下，与PDZ结构域多肽结合的E6蛋白通过移除膜或通过将样本转移到单独的容器中从样本中分离。在所述PDZ结构域多肽与颗粒结合的情况下，与颗粒结合的E6蛋白通过离心或过滤从样本中分离。预见了使用一种不同E6结合伴侣(例如抗E6抗体)的这样的实施方案。
一般而言，使用了与进行分离的适当平台相一致的适当的分离手段。例如，在通过与PDZ结构域多肽结合的方式分离致癌的HPV E6的情况下，分离通过包括但不限于亲和色谱、毛细管作用或层析试剂条、免疫共沉淀等的多种平台中的任何一种进行。
在多种实施方案中，通过将样本置于检测试剂条的一端并通过毛细管作用或层析使蛋白质迁移，将致癌的HPV E6同样本中其他蛋白质分离。层析分离、检测和定量的方法和装置是本领域内已知的。参见，例如，美国专利Nos.5,569,608；6,297,020和6,403,383。在这些实施方案中，检测试剂条由近及远由上样区和含致癌E6蛋白结合伴侣的检测区(例如含PDZ结构域多肽的区域或在其他实施方案中含抗E6抗体的区域)构成。样本加样于上样区，并将试剂条的近端置于缓冲液中。致癌E6蛋白被第一个检测区中结合的抗体所捕获。捕获的致癌E6蛋白如以下所述进行检测。例如，通过使用针对所有致癌E6蛋白共有的E6蛋白表位的特异的可检测标记的抗体或能够共同与所有致癌E6蛋白结合的抗体混合物对捕获的E6蛋白进行检测。在此外的实施方案中，检测区中可以存在E6抗体，对与所述E6抗体结合的致癌E6的检测使用标记的PDZ结构域多肽。
检测并定量致癌E6蛋白
一旦致癌E6蛋白与样本中的其他蛋白质分离，对致癌E6蛋白进行检测并/或测定(例如测量)致癌E6蛋白的水平或量。如上所述，致癌E6蛋白通常使用结合伴侣(例如E6特异性的一种或多种抗体，或PDZ结构域多肽)进行检测。
通过使用熟知的方法用特异性抗体进行检测。一般而言，所述结合伴侣是经直接或间接可检测标记过的。直接标记包括放射性同位素(例如125I；35S等)；其产物是可检测的酶(例如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶等)；荧光标记(例如异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白等)；通过象EDTA的金属螯合基团与抗体连接的荧光发射金属(如152Eu或其他稀土元素)；化学发光化合物(例如鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯盐等)；生物发光化合物(例如荧光素、荧光蛋白等)。荧光蛋白包括但不限于绿荧光蛋白(GFP)以及如例如Matz等人在(1999)Nature Biotechnol.17：969-973中所述的多种来自珊瑚纲种属(Anthozoan species)的荧光和有色蛋白质中的任何一种等。其中绿荧光蛋白包括但不限于：“人源化”形式的绿荧光蛋白(例如对其中天然核苷酸序列密码子进行变更使之更符合人密码子偏爱)；源自维多利亚水母(Aequoria victoria)的GFP或其衍生物(例如购自Clontech，Inc.的增强型GFP的GFP“人源化”衍生物)；象例如WO 99/49019和Peelle等人在(2001)J Protein Chem.20：507-519中所述的来自其他物种(如Renilla reniformis、Renilla mulleri或Ptilosarcus guernyi)的GFP；“人源化”重组GFP(hrGFP)(Stratagene)。
间接标记包括E6特异性抗体的特异性二级抗体，其中所述二级抗体如上所述进行标记；和特定的结合对(例如生物素-亲和素等)。
在一些实施方案中，对致癌E6的水平进行了定量。定量可以通过使用任何已知的方法进行，这些方法包括但不限于：酶联免疫吸附(ELISA)、放射免疫检测(RIA)等。一般而言，定量通过将样本中检测到的表达水平与标准曲线比较得以实现。
在一些实施方案中，致癌的HPV E6蛋白如上所述在检测试剂条上分离。在这些实施方案中，通过使用结合致癌HPV E6的经可检测标记的结合伴侣进行检测。可以使用例如反射分光光度计或肉眼对致癌的HPV E6进行定量。
生物样本
使用本发明的方法进行分析的生物样本取自任何哺乳动物(例如，取自人或非人的HPV动物模型)。在多种实施方案中，生物样本取自活体。
在一些实施方案中，从中获得样本的受检者表面上是康的，在这种情况下所述分析作为常规筛查的一部分进行。在其他实施方案中，受检者是HPV易感的(例如，通过家族史或暴于某些环境因素等确定的)。在其他实施方案中，受检者具有HPV症状(例如宫颈瘤等)。在其他实施方案中，受检者已被临时诊断为具有HPV感染(例如由基于如PCR的其他检测所确定的)。
生物样本可以来自受检者的任何组织、器官或细胞群。在一些实施方案中，从受检者获得宫颈刮取物、活组织切片或洗物。
在一些实施方案中，使用本领域内常规的方法对生物样本进行了处理，以去除例如某些干扰本发明的检测方法的成分。在一些实施方案中，例如通过盐沉淀等方法对生物样本进行处理以集蛋白质。在某些实施方案中，在存在蛋白体抑制剂的情况下处理生物样本，以抑制E6蛋白的降。
在本发明的检测方法中，在一些实施方案中，样本中E6的水平可以进行定量并/或与对比较。适当的对样本取自已知康的个体(例如已知未受HPV感染)。对
样本可以来自与受检者遗传相关的个体，但也可以来自遗传不相关的个体。适当的对样本也包括比获取待测样本时间点更早的时间点从该个体获取的样本，例如在表现出可能的HPV症状之前取自该个体的生物样本。
应用
本发明的方法可用于多种诊断分析。所述方法可用于诊断个体中HPV致癌病毒株的感染；用于确定产生癌症的可能性；用于确定患者对HPV治疗的反应；用于确定个体中HPV感染的严重程度；以及用于监测个体中HPV的发展进程。
所述方法通常可以用于来自活体的生物样本。本发明的一个显著有利的特征是所述方法可以在一个反应中同时检测所有已知的HPV致癌病毒株。
实施例1
HPV E6蛋白的序列分析以确定致癌潜能
已知PDZ蛋白与某些蛋白质的基末端序列(PL)结合。与PDZ结构域结合的PL序列是可预测的，并在美国专利申请09/710059、09/724553和09/688017中以对其作了详细描述。一组以-X-(S/T)-X-(V/I/L)序列结尾的蛋白是PL基序的重要类别之一。我们已经检查了来自多个HPV病毒株的E6蛋白的C末端序列。由国家癌症研究所确定的所有致癌病毒株具有共同的PDZ结合序列。来自乳头状瘤病毒株的那些非致癌E6蛋白没有被预测为能与PDZ结构域结合的序列，因而意味着与PDZ蛋白的相互作用是其在人体内引起癌症的先决条件。在检查的序列中(表3A)，PL的存在与引发癌症之间具有100％的相关性。理论上，用来自前文列举的专利中公开的PL共同序列，可以评估HPV新变种结合PDZ蛋白的能力并可以在是否存在PL的基础上预测其致癌性。今年早些时候，对5株新的人乳头状瘤病毒致癌病毒株进行了鉴别并测定了其E6蛋白序列。正如所预计的，这些蛋白都包含PL共同序列(表3B)。
表3A：E6PDZ-配体和致癌性的相关性
Figure BSA00000217556800661
表3A：E6C末端序列和致癌性。左边列举了HPV变体。序列从GenBank序列记录中确定。“是否PL”通过是否与Songyang等人在Arbor Vita确定的-X-(S/T)-X-(V/I/L)共有序列相符合进行定义。致癌性数据收集自国家癌症研究所。*只在与其他致癌蛋白共转染的致癌病毒株中发现。
表3B：近期鉴定的致癌E6蛋白的相关性
Figure BSA00000217556800671
表3B：E6C末端序列和致癌性。左边列举了HPV变体。序列从GenBank序列记录中确定。“是否PL”通过是否与Songyang等人在Arbor Vita确定的-X-(S/T)-X-(V/I/L)共有序列相符合进行定义。新病毒株的致癌性数据收集自N Engl J Med 2003，348：518-527。
这些表格提供了基于HPV基因组编码的E6蛋白C末端4个氨基酸序列的HPV病毒株的分类。所述21个HPV致癌病毒株属于10类病毒株之一，没有在以上特意列举的HPV病毒株可能也属于这些类别。由此，值得对来自所有10类的HPV病毒株进行检测：所述的方法提供了这样的检测。
实施例2
与致癌E6蛋白C末端相互作用的PDZ结构域的鉴别
为了确定能在诊断检测中用于检测致癌E6蛋白的PDZ结构域，使用了‘G检测’(前文所述)来鉴别E6PL和PDZ结构域之间的相互作用。按照来自人乳头状瘤病毒致癌病毒株的E6蛋白C末端氨基酸序列合成肽。使用上文所述的G检测和由美国专利申请09/710059、09/724553和09/688017中详述的表达构建物合成的PDZ结构域对这些肽结合PDZ结构域的能力进行了评定。下面的表4中列举了表现出高结合亲和力的这些检测的结果。
正如我们在下面会看到的，存在大量结合一些致癌E6蛋白的PDZ结构域。然而，看来只有MAGI-1的第二个PDZ结构域与所有检测的致癌E6PL结合。TIP-1的PDZ结构域结合除了一个以外的所有检测的致癌致癌E6PL，并可以与MAGI-1结构域2组合用于检测致癌E6蛋白的存在。
以相似的方式，用G检测对对应于几个非致癌E6蛋白C末端的肽进行了测试。这些肽都没有表现出任何结合PDZ结构域的亲和力。
表4：HPV E6PL与PDZ结构域之间较高亲和力的相互作用
Figure BSA00000217556800681
表4：几种HPV变体E6C末端与人PDZ结构域之间的相互作用。HPV病毒株表示从中获得E6C末端肽序列信息的病毒株。检测中使用的肽的长度介于18到20个氨基酸之间，末端3个残基表示在圆括号中。每种HPV E6变体右侧的名称表示G检测中与E6肽饱和结合的人PDZ结构域(具有多个PDZ结构域的蛋白在圆括号中表明结构域数目)。*表示由于材料限制，hDlg1的PDZ结构域没有对这些蛋白进行测试，虽然文献中两者都被证明与hDlg1结合。
实施例3
携带编码HPV E6基因或HPV E6基因一部分的DNA片段的真核表达载体的产生
本实施例描述了如何将HPV E6基因或HPV E6基因的一部分克隆到与多种蛋白标签融合的真核表达载体上，蛋白标签包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、增强型绿荧光蛋白(EGFP)或红血球集素(HA)。
A.策略
使用随机(寡核苷酸)引物(Invitrogen，目录号48190011)，cDNA片段通过对HPV细胞系(宫颈表皮样瘤，对于HPV E616和18，ATCC#分别是CRL-1550和CRL-1595)来源的RNA进行RT-PCR产生。使用以上纯化的cDNA片段和特异性引物(见表5)，对应于HPV E6的DNA片段通过常规PCR产生。所用的引物被设计成能在PCR产物的末端创建限制性核酸酶识别位点，使这些片段能被克隆到适当的表达载体中。完成PCR以后，对DNA样品进行琼脂糖胶电泳。切下对应于预期大小的条带。使用Sephaglas Band Prep Kit(Amersham Pharmacia目录号27-9285-01)提取DNA并用适当的限制性核酸内切酶消化。消化的DNA样品通过胶电泳再次纯化(依照前面所使用的相同的实验方案)。沉淀纯化的DNA片段并与适当的线性化载体连接。转化大肠杆菌(E.coli)以后，通过菌落PCR和限制性消化针对插入片段的存在及其正确取向对菌落进行筛选。阳性克隆接种在液体培养物中以进行大规模DNA纯化。对纯化的质粒DNA上的插入片段和侧翼载体位点进行测序以确保片段及载体与融合蛋白之间连接处序列的正确性。
B.载体：
克隆载体是pGEX-3X(Amersham Pharmacia目录号27-4803-01)、MIE(含IRES和EGFP的MSCV衍生物，通过重组DNA技术产生)、pmKit、pcDNA3.1(Invitrogen，改进以在克隆位点上游包含HA标签)和pMAL(New England Biolabs目录号N8076S，多克隆位点内经改造包含BamHl和EcoRl位点)。
将含有HPV E6的ATG起始密码子和TAG终止密码子的DNA片段克隆到pGEX3x。使用纯化的HPV E6-pGEX3x融合质粒作为PCR模板并使用上述相同的纯化方案，将HPV E6基因以及3’端缺失的变体(ΔPL)相继克隆到MIE(MSCV-IRES-EGFP)、pcDNA-HA载体和pmKit载体。HPV E6的缺失变体具有插入在-3位置的氨基酸之后的终止密码子，这样就从基因编码区中删除了最后三个氨基酸。
C.构建物：
表5中列出了用于通过PCR产生DNA片段的引物。下面列出了PCR引物组合和插入的限制性位点及载体。
表5.将HPV E6克隆到典型的表达载体所使用的引物。
Figure BSA00000217556800701
Figure BSA00000217556800711
1.人乳头瘤状病毒(HPV)E616
Acc#：-----------
GI#：4927719
·构建物：HPV E616WT-pGEX-3X
引物：2542&2543
载体克隆位点(5′/3′)：Bam Hl/EcoRl
插入片段克隆位点(5′/3′)：Bam Hl/EcoRl
pGEX-3X在克隆位点的5’末端之前(上游)含GST
·构建物：HPV E616WT-MIE
引物：2560&2561
载体克隆位点(5′/3′)：EcoRl/BamHl
插入片段克隆位点(5′/3′)：EcoRl/BamHl
MIE在克隆位点的3’末端之后(下游)含IRES和EGFP
·构建物：HPV E616ΔPL-MIE
引物：2560&2562
载体克隆位点(5′/3′)：EcoRl/BamHl
插入片段克隆位点(5′/3′)：EcoRl/BamHl
MIE在克隆位点的3’末端之后(下游)含IRES和EGFP
·构建物：HPV E616WT-pcDNA3.1-HA
引物：2603&2604
载体克隆位点(5′/3′)：Hind III/Hind III
插入片段克隆位点(5′/3′)：Hind III/Hind III
pcDNA3.1(改进的)在克隆位点的5’末端之前(上游)含HA
·构建物：HPV E616ΔPL-pcDNA3.1-HA
引物：2603&2605
载体克隆位点(5′/3′)：Hind III/Hind III
插入片段克隆位点(5′/3′)：Hind III/Hind III
pcDNA3.1(改进的)在克隆位点的5’末端之前(上游)含HA
·构建物：HPV E616WT-pmKit
引物：2606&2607
载体克隆位点(5′/3′)：Sal I/Xho I
插入片段克隆位点(5′/3′)：Sal I/Xho I
·构建物：HPV E616ΔPL-pmKit
引物：2606&2608
载体克隆位点(5′/3′)：Sal I/Xho I
插入片段克隆位点(5′/3′)：Sal I/Xho I
2.人乳头状瘤病毒(HPV)E618
Acc#：-----------------
GI#：------------------
·构建物：HPV E618WT-pGEX-3X
引物：2548&2549
载体克隆位点(5′/3′)：BamHI/EcoRI
插入片段克隆位点(5′/3′)：Bgl II/EcoRI
pGEX-3X在克隆位点的5’末端之前(上游)含GST
·构建物：HPV E618WT-MIE
引物：2563&2564
载体克隆位点(5′/3′)：EcoRl/BamHl
插入片段克隆位点(5′/3′)：EcoRl/Bgl II
MIE在克隆位点的3’末端之后(下游)含IRES和EGFP
·构建物：HPV E618ΔPL-MIE
引物：2563&2565
载体克隆位点(5′/3′)：EcoRl/BamHl
插入片段克隆位点(5′/3′)：EcoRl/Bgl II
MIE在克隆位点的3’末端之后(下游)含IRES和EGFP
·构建物：HPV E618WT-pcDNA3.1-HA
引物：2615&2616
载体克隆位点(5′/3′)：Hind III/Hind III
插入片段克隆位点(5′/3′)：Hind III/Hind III
pcDNA3.1(改进的)在克隆位点的5’末端之前(上游)含HA
·构建物：HPV E618ΔPL-pcDNA3.1-HA
引物：2615&2617
载体克隆位点(5′/3′)：Hind III/Hind III
插入片段克隆位点(5′/3′)：Hind III/Hind III
pcDNA3.1(改进的)在克隆位点的5’末端之前(上游)含HA
·构建物：HPV E618WT-pmKit
引物：2612&2613
载体克隆位点(5′/3′)：Sal I/Xho I
插入片段克隆位点(5′/3′)：Sal I/Xho I
·构建物：HPV E618ΔPL-pmKit
引物：2612&2614
载体克隆位点(5′/3′)：Sal I/Xho I
插入片段克隆位点(5′/3′)：Sal I/Xho I
D.GST融合蛋白的生产与纯化
按Pharmacia Biotech公司《GST融合系统》(第2版第2次修订本)(GST FusionSystem，Second Edition，Revision 2)中所述的方案，使用pGEX-3X表达载体的构建物被用于制造融合蛋白。并针对1L规模的生产与纯化，对方法II进行了优化。
纯化的DNA转化大肠杆菌并生长至OD600达到0.4-0.8(600λ)。通过向细胞培养物添加IPTG诱导蛋白表达1-2小时。收集并溶细胞。收集细胞溶物并添加GS4B树脂(Pharmacia目录号17-0756-01)以结合GST融合蛋白。分离树脂并用GEB II洗脱GST融合蛋白。纯化的蛋白-80℃保存在GEB II中。
纯化的蛋白用于以ELISA为基础的检测和抗体生产。
实施例4
携带编码含PDZ结构域基因或含PDZ结构域基因一部分的DNA片段的真核表达构建物的产生
本实施例描述了如何将含PDZ结构域的基因或含PDZ结构域的基因的一部分克隆到与多种蛋白标签融合的真核表达载体上，蛋白标签包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、增强型绿荧光蛋白(EGFP)或红血球凝集素(HA)。
A.策略：
使用随机引物(Invitrogen目录号48190011)，对应于含PDZ结构域基因的cDNA片段通过RT-PCR从来自单独细胞系(CLONTECH目录号K4000-1)来源的RNA文库的RNA生成。使用上述纯化的cDNA片段和特异性引物(见表6)，通过常规PCR产生对应于含PDZ结构域基因或其部分的DNA片段。所使用的引物设计成能在PCR片段末端创建限制性核酸酶识别位点，使这些片段能克隆到适当的表达载体上。PCR之后，对DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳。切下对应于预期大小的条带。使用SephaglasBand Prep Kit(Amersham Pharmacia目录号27-9285-01)提取DNA并用适当的限制性核酸内切酶消化。消化的DNA样品通过凝胶电泳再次纯化(依照前面所使用的相同的实验方案)。沉淀纯化的DNA片段并与适当的线性化载体连接。转化大肠杆菌(E.coli)以后，通过菌落PCR和限制性消化针对插入片段的存在及其正确取向对菌落进行筛选。阳性克隆接种在液体培养物中以进行大规模DNA纯化。对纯化的质粒DNA上的插入片段和侧翼载体位点进行测序以确保片段及载体与融合蛋白之间连接处序列的正确性。
B.载体：
所有含PDZ结构域的基因克隆到含tac启动子、GST、Xa因子、β-内酰胺酶和lac抑制子的pGEX-3X载体上(Amersham Pharmacia目录号27-4803-01，GenemedAcc#U13852，GI#595717)。
下面列出了包括GST、Xa因子和多克隆位点的pGEX-3X编码区的氨基酸序列。注意克隆的插入片段和GST-Xa因子之间的连接序列随着克隆所使用的限制性核酸内切酶而有所不同。下面翻译区中可能随插入片段而改变的氨基酸用小写字母表示，并以改变后的形式被包括在(C)中所列举的构建物序列中。
aa1-aa 232：
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEF
PNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRY
GVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFML
YDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGW
QATFGGGDHPPKSDLIEGRgipgnss(序列编号：272)
除此之外，完整的或部分TAX相互作用蛋白1(TIP1)克隆在许多其他表达载体上，所述载体包括但不限于CD5γ、PEAK10(两者均由哈佛大学Brian Seed博士的实验室提供并通过重组DNA技术产生，包含一个IgG区域)和MIN(MSCV衍生物，包含IRES和NGFR，通过重组DNA技术生成)。
C.构建物：
表6列举了用于通过PCR产生DNA片段的引物。下面列出了PCR引物组合和插入片段及载体的限制性位点，以及插入片段和限制性位点的氨基酸译。非天然的氨基酸序列用小写字母表示。
表6.将DLG1(3个中的结构域2)、MAGI 1(6个中的结构域2)和TIP1克隆到典型的表达载体上所使用的引物。
Figure BSA00000217556800761
Figure BSA00000217556800771
1.DLG1，3个PDZ结构域中的第二个结构域：
Acc#：U13897
GI#：558437
·构建物：DLG1，PDZ结构域2-pGEX-3X
引物：1928&1929
载体克隆位点(5’/3’)：BamHl/EcoRl
插入片段克隆位点(5’/3’)：BamHl/EcoRl
aa1-aa88
giqLIKGPKGLGFSIAGGVGNQHIPGDNSIYVTKIIEGGAAHKDGKLQIG
DKLLAVNNVCLEEVTHEEAVTALKNTSDFVYLKVAnss(序列编号287)
2.MAGI1，6个PDZ结构域中的第二个结构域
Acc#：AB010894
GI#：3370997
·构建物：MAGI 1，PDZ结构域2-pGEX-3X
引物：1453&1454
载体克隆位点(5’/3’)：BamHl/EcoRl
插入片段克隆位点(5’/3’)：BamHl/EcoRl
aa 1-aa 108
giPSELKGKFIHTKLRKSSRGFGFTVVGGDEPDEFLQIKSLVLD
GPAALDGKMETGDVIVSVNDTCVLGHTHAQVVKIFQSIPIGA
SVDLELCRGYPLPFDPDgihrd(序列编号288)
3.TAX相互作用蛋白1(TIP1)：
Acc#：AF028823.2
GI#：11908159
·构建物：TIP1，PDZ结构域1-pGEX-3X
引物：399&400
载体克隆位点(5’/3’)：BamHl/EcoRl
插入片段克隆位点(5’/3’)：BamHl/EcoRl
aa1-aa107
giQRVEIHKLRQGENLILGFSIGGGIDQDPSQNPFSEDKTDKGIY
VTRVSEGGPAEIAGLQIGDKmQVNGWDMTMVTHDQARKRL
TKRSEEWRLLVTRQSLQnss(序列编号289)
·构建物：TIP1-pGEX-3X
引物：1319&1320
载体克隆位点(5’/3’)：BamHl/EcoRl
插入片段克隆位点(5’/3’)：BamHl/EcoRl
aa1-aa128
giqMSYIPGQPVTAVVQRVEIHKLRQGENLILGFSIGGGIDQDPSQNPFS
EDKTDKGIYVTRVSEGGPAEIAGLQIGDKIMQVNGWDMTMVTHDQA
RKRLTKRSEEWRLLVTRQSLQKAVQQSMnss(序列编号290)
·构建物：TIP1-MIN
引物：2753&2762
载体克隆位点(5’/3’)：Eco RI/Eco Rl
插入片段克隆位点(5’/3’)：Eco RI/Eco Rl
aa1-aa129
agilEMSYIPGQPVTAVVQRVEIHKLRQGENLILGFSIGGGIDQD
PSQNPFSEDKTDKGIYVTRVSEGGPAEIAGLQIGDKIMQVNG
WDMTMVTHDQARKRLTKRSEEVVRLLVTRQSLQKAVQQSM
LS(序列编号291)
·构建物：TIP1-CD5γ
引物：2584&2585
载体克隆位点(5’/3’)：Bam HI/Bam HI
插入片段克隆位点(5’/3’)：Bam HI/Bam HI
aa 1-aa 122
adPGQPVTAVVQRVEIHKLRQGENLILGFSIGGGIDQDPSQNPF
SEDKTDKGIYVTRVSEGGPAEIAGLQIGDKIMQVNGWDMTM
VTHDQARKRLTKRSEEVVRLLVTRQSLQKAVQQSdpe
(序列编号292)
D.GST融合蛋白的生产与纯化
按照Pharmacia Biotech公司《GST融合系统》(第2版第2次修订本)(GST FusionSystem，Second Edition，Revision 2)中所述的方案，使用pGEX-3X表达载体的构建物被用于制造融合蛋白。并针对1L规模的生产与纯化，对方法II进行了优化。
纯化的DNA转化大肠杆菌并生长至OD600达到0.4-0.8(600λ)。通过向细胞培养物添加IPTG诱导蛋白表达1-2小时。收集并溶细胞。收集细胞溶物并添加GS4B树脂(Pharmacia目录号17-0756-01)以结合GST融合蛋白。分离树脂并用GEB II洗脱GST融合蛋白。纯化的蛋白-80℃保存在GEB II中。
纯化的蛋白用于以ELISA为基础的检测和抗体生产。
E.IgG融合蛋白的生产与纯化
采用CD5γ或PEAK10IgG表达载体的构建物被用于生产融合蛋白。在常规生长条件下(DMEM+10％FCS)，按每一百万个细胞1微克载体DNA的比例，使用常规的钙沉淀法(Sambrook，Fritsch和Maniatis所著，冷泉港出版社(Cold Spring HarborPress))用纯化的DNA载体转染293EBNA T细胞。这一载体导致生成分泌到培养基中的融合蛋白。检测时转染细胞的最高表达情况，并在这一最高值时(通常1-2天)收集含融合蛋白的培养基。融合蛋白或采用蛋白质A色法纯化，或不经附加步直接在培养基中冷冻。
实施例5
TIP-1特异结合致癌E6蛋白
A.摘要
进行实验以证明或证实所述PDZ结构域只能识别全长致癌HPV E6蛋白而不是非致癌E6变体的C末端。这证实了通过考使用全长E6融合蛋白能否重现PDZ结合来使用代表E6蛋白PL序列的肽的方法。
简而言之，按HPV 18(致癌的)和HPV 11(不致癌的)的E6全长蛋白序列如实施例3所述构建了GST-E6融合蛋白。通过使用改进的ELISA检测，对TIP-TIP-IgG融合蛋白(两个拷贝TIP-1PDZ结构域与hIgG恒定区融合，实施例4中部分描述了融合蛋白的纯化)与这两种E6变体的结合进行了评定。
随后的实验也表明使用GST-Tip或GST-Magi融合蛋白对与E6结合的检测并不明显受4℃或室育的响。
B.改进的ELISA检测法
试剂及材料
●Nunc Polysorb 96孔酶标板(Nunc目录号62409-005)(Maxisorp酶标板经证实具有更高的本底信号)
●pH 7.4的PBS(Gibco BRL目录号16777-148)或AVC磷酸缓冲盐溶液，8毫克NaCl、0.29毫克KCl、1.44毫克Na2HPO4、0.24毫克KH2PO4，加H2O至1升，pH 7.4；0.2微米滤器过滤
●500毫升PBS中含2％BSA/PBS(10克组分V牛血清白蛋白(ICN Biomedicals目录号IC15142983))
●5毫克/毫升的羊抗GST单克隆抗体储存液，4℃保存(Amersham Pharmacia，目录号27-4577-01)，按1∶1000稀释于PBS，终浓度5微克/毫升
●清洗缓冲液，含0.2％Tween 20的50mM Tris，pH 8.0
●备用的TMB(Dako，目录号S1600)
●1M H2SO4
●12通道排枪
●50毫升试剂瓶
●15毫升聚丙烯圆锥形试管
●抗E6HPV18抗体(OEM Sciences)
●抗hIgG抗体-辣根过氧化物酶(Biomeda)
实验方案
1)在4℃下用5微克/毫升GST-E6融合蛋白包板过夜
2)倒出蛋白并轻轻拍干
3)封闭-每孔加200微升2％BSA/PBS，4℃孵育2小时
4)制备PDZ蛋白(TIP-TIP-IgG转染上清液和2％BSA/PBS按50∶50比例混合)
5)用预冷的PBS清洗3次
6)添加第4步制备的PDZ蛋白或含1微克/毫升抗E6抗体的2％BSA/PBS(或作为对照的抗GST抗体)
7)用预冷的PBS清洗3次
8)在冰上每孔添加100微升适当浓度的酶联检测抗体(抗hIgG抗体-辣根过氧化物酶、抗山羊抗体-辣根过氧化物酶、或抗小鼠抗体-辣根过氧化物酶)，4℃孵育20分钟
9)启动酶标仪并准备文档
10)用Tween清洗缓冲液清洗5次，避免产生泡沫
11)使用手套，每孔添加100微升TMB
-室温下暗室孵育
-定期检查平板(5、10、20分钟)
-如果需要，在650纳米处(蓝光)获取早期读数
-30分钟后用100微升1M H2PO4终止反应
-在450纳米处(黄光)读取最终读数
C.结合实验结果
TIP-1(一种典型的结合大多数致癌E6PL(实施例2)的PDZ结构域)能特异识别来自全长致癌E6变体(HPV18-E6)的PL而不与非致癌变体(HPV11-E6；图1)结合。此外，纯化的TIP-TIP-IgG甚至能以与产生的抗HPV18-E6抗体同等的水平识别GST-HPV18E6融合蛋白。使用抗GST抗体以证实GST-HPV18E6和GST-HPV11E6包被平板的均一性(未公开数据)。
此外，所述检测方法是耐用的，并且其偏离率足够稳定，因而可以在4℃下或室温下进行所述检测方法的孵育步骤。对于GST-Magi或GST-TIP1与E6结合而言，所述两个温度之间几乎观察不到差异(图2)。
E6活性可以进一步通过其结合DNA的能力、或在细胞溶解物存在的条件下使p53降解、Zn2+结合等进行检测。
实施例6
PDZ结构域与HPV16E6相互作用的EC50测定
使用上述的G-检测，检测了几种GST-PDZ结构域融合蛋白以测定其与HPV16E6蛋白PL的相对结合强度。用对应于HPV16E6的PL的肽相对恒定量的GST-PDZ结构域融合蛋白进行滴定，其结果如下所示。这些结果证明，虽然多种PDZ结构域能结合HPV16的E6蛋白，MAGI1的第一个功能结构域(本说明书中的结构域2)结合最紧密，使之最适于用于诊断目的。出乎意料的是，特别是与MAGI1协同是唯一被证明与所有已确定的致癌E6蛋白种类结合的含PDZ结构域蛋白。这些都证明对于致癌HPV感染来说，MAGI1是有益的捕获/检测物质。
表7：HPV16E6蛋白与多种PDZ结构域的EC50值
  PDZ基因   EC50a[μM] RNA表达(子宫颈细胞系)
  Magi1C(PDZ2)   0.056 ++
  Magi3(PDZ1)   0.31 阴性
  SAAT1KIAA   0.58 阴性
  TIP1   0.75 +++
  VARTUL   0.94 +
  DLG1(PDZ2)   未测 ++++
  PSD95(PDZ1-3)   1.0 未测
  SAST2   1.2 未测
  DLG2(PDZ3)   1.6 未测
  DLG3(PDZ1-2)   3.8 未测
  PSD95(PDZ2)   6.8 未测
  SIP1(PDZ1)   7.5 未测
实施例7
抗纯化的HPV18E6融合蛋白抗体的生产
为了实现对致癌HPV感染的基于夹心ELISA的诊断的附加利益，应当获得E6蛋白的高亲和力特异性抗体。理想的是，用于诊断的单克隆抗体可以从那些具有不断更新的来源的动物中产生。
以5天为间隔，用25微克细菌来源纯化的GST-HPV18E6注射Balb/c小鼠(JosmanLabs)。每次注射抗原3天以后采集这些小鼠的血清并检测其与GST-HPV18E6(免疫原)或在抗GST抗体去除后与单独GST的反应性(按照Pharmacia实验方案)。使用第28天采集的血清的结果显示在图3中。来自小鼠的血清与细菌来源纯化的GST-HPV18E6蛋白反应而不与单独GST反应。所述动物是通过常规方法从中产生单克隆抗体的良好候选对象。
实施例8
病原体PL蛋白
使用针对PDZ:PL相互作用检测的蛋白质或化合物可以对病原体的许多其他蛋白质进行检测。表8包含了一些能通过使用这里所公开的技术进行检测的示范性的蛋白质，但这并不意味着任何形式的限制。
表8：可以按照PDZ:PL诊断法处理的的示例性病原体
 病原体  蛋白   GI或ACC号   PL/PDZ
 腺病毒  E4   19263371   PL
 乙肝病毒  蛋白质X   1175046   PL
 人T细胞白血病病毒  TAX   6983836   PL
 疱疹病毒  DNA聚合酶   18307584   PL
 疱疹病毒  US2   9629443   PL
实施例9
HPV16感染细胞中内源性E6蛋白的定量
A)摘要
设计并进行了实验以测定HPV16感染的宫颈癌细胞系中内源性E6蛋白数量。结果表明HPV16感染的宫颈癌细胞系含有10,000到100,000数量级的E6蛋白。由这一发现推断，E6蛋白可以用作针对细胞HPV感染的诊断或预后标志。蛋白质降解途径抑制剂的使用可以有助于这样的检测。
B)方法：
E6蛋白的免疫共沉淀
HPV16感染的宫颈癌细胞系SiHa和CasKi用预冷的PBS清洗并以2×107细胞/毫升的浓度在HEPES细胞溶解缓冲液(50mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，10％甘油，0.5％triton X-100，1mg/ml BSA，1粒蛋白酶抑制剂混合剂(Roche)和1mMPMSF)中重悬。细胞溶解在冰浴中进行30分钟。溶解物通过4℃下14,000g离心5分钟进行清洁。E6蛋白与小鼠抗E6抗体(克隆6F4)和蛋白质G小珠(Pharmacia，Piscataway，NJ)免疫共沉淀。4℃下转动孵育2小时以后，小珠用清洗缓冲液(50mMHEPES pH 7.4，150mM NaCl，10％甘油，0.1％Triton X-100，蛋白酶抑制剂混合剂(CALBIOCHEM)，1mM PMSF)洗涤3次。沉淀在SDS-PAGE上样缓冲液中重悬并用6F4抗E6抗体以及抗小鼠IgG抗体-辣根过氧化物酶偶联物(Jackson ImmunoResearch)通过免疫印迹进行分析。
通过免疫印迹检测宫颈癌细胞溶解物中的E6蛋白
SiHa和CasKi宫颈癌细胞系以2×107细胞/毫升的浓度在溶解缓冲液中冰浴溶解30分钟。随即将对应于约106个细胞的溶解物在12％SDS-PAGE  胶上进行分离，然后转移到PVDF膜。E6蛋白用6F4抗HPV16E6抗体以及抗小鼠IgG抗体-辣根过氧化物酶偶联物(Jackson Immuno Research)进行检测。
C)结果
为了测定遭HPV16感染的宫颈癌细胞中存在的内源性E6蛋白的表观分子量以及为了确保PAGE上看到的抗E6单克隆抗体特异性条带代表了病毒E6蛋白，用表达HPV16的无标签E6蛋白的构建物转染293EBNA T细胞。制备这些细胞以及HPV感染的SiHa宫颈癌细胞的细胞溶解物。通过抗E6特异性单克隆抗体的使用，对上述两种细胞(转染的和HPV感染的)溶解物中的E6蛋白进行免疫共沉淀。使用PAGE技术对两种细胞溶解物并排进行分析(图6)。所得的针对转染的E6的E6特异性条带以与SiHa宫颈癌细胞系中的抗E6抗体特异性条带相同的水平在PAGE凝胶中迁移，从而最强有力地提示，与抗E6特异性单克隆抗体发生免疫共沉淀的产物代表了病毒E6蛋白。使用特异性的E6单克隆抗体，在HPV16感染的宫颈癌细胞系CasKi中检测到了相同大小的条带(图7)。
在一种不同的实验步骤中，对HPV感染的宫颈癌细胞系SiHa和CasKi的内源性病毒E6蛋白从其细胞溶解物中直接进行了检测(图7)。依赖于E6特异性单克隆抗体的条带以与用E6编码载体转染的细胞的条带相同的方式迁移。
为检测体内E6的稳定性能否通过选择性阻碍参与蛋白降解的蛋白酶体得以提高，一些样品的细胞溶解物用蛋白酶体抑制剂MG132进行了处理。在这些样品中，E6特异性条带强度提高了约2-3倍。这说明，添加适当的蛋白降解途径抑制剂混合物能够被用于通过临时增加其在细胞内积累而增强E6蛋白的特异性信号。
通过将PAGE凝胶上E6特异性信号与得自加载于相同凝胶上的MBP-E6(HPV16)融合蛋白的信号进行比较，测量了细胞溶解物中E6蛋白的数量。在有些情况下，MBP-E6融合蛋白用X因子消化以释放单纯的E6部分。信号强度比较研究证明，注入HPV16的宫颈癌来源的细胞系(SiHa、CasKi)包含浓度为0.3到3纳克每1×106个细胞的E6。由此推断，E6的数量和稳定性对于通过E6特异性检测方法(ELISA)检测是切实可行的。
实施例10
致癌E6-PL探测分子选择性结合存在于细胞溶解物中的内源性HPV16-E6蛋白并可用于将内源性E6蛋白同存在于细胞溶解物中的其他成分分离
A)摘要
进行实验以检测致癌E6-PL探测分子是否能选择性结合用E6编码载体转染的细胞的内源性E6。此外，检测了结合之后所述致癌E6-PL探测分子能否用于将E6与细胞溶解物中其他分子分离。研究发现证明致癌E6-PL探测分子具有选择性并能用于将E6蛋白从细胞溶解物分子的复杂混合物中分离。
B)方法
E6蛋白与重组PDZ蛋白的下拉实验(pull down)
在下拉实验中检测了GST-PDZ融合蛋白(即Magi1PDZ结构域1、Syn2bp、Magi3PDZ结构域1、Tip1、PSD-95PDZ结构域2以及SAST1)。简而言之，在4℃下将10微克重组GST-PDZ蛋白与30微升谷胱甘肽琼脂糖小珠在1毫升缓冲液中(50mMHEPES pH 7.4，150mM NaCl，10％甘油，0.1％Triton X-100，蛋白酶抑制剂混合剂，1mM PMSF)转动孵育1小时。随后，在4℃下将107个用pMKit-HA-HPV16-E6或单独pMKit-HA载体瞬时转染的293细胞的溶解物与所述结合了PDZ蛋白的小珠转动孵育3小时。清洗小珠并通过12％SDS-PAGE凝胶电泳和随后的免疫印迹进行分析。用生物素偶联的抗HA抗体(克隆3F10或12CA5，Boehringer Mannheim)和辣根过氧化物酶-链霉亲和素(Zymed)对膜进行检测。
另外，用pmKit-HA、pmkit-HPV 16-HA-E6或pmKit-HA-HPV 16E6-ΔPL瞬时转染的293细胞的细胞溶解物与重组GST-Magi1-PDZ结构域1孵育并固定在谷胱甘肽-琼脂糖小珠上，结合的组分用抗HA抗体进行免疫印迹分析。平行地，用抗HA抗体对细胞溶解物进行免疫共沉淀和检测。
C)结果
PDZ-E6-PL结合的G检测研究以及E6-PDZ相互作用的实验结合亲和力的测定提示了为设计致癌E6-PL探测分子所要检测的候选PDZ结构域。在“下拉”实验中，检测了5种不同PDZ结构域(Tipl、Magi1结构域1、Sast2、Psd95结构域2、突触泡磷酸酶-2结合蛋白)对细胞溶解物中内源性过表达E6的下拉。HA标记的E6HPV16转染的细胞溶解物与代表上述PDZ结构域的与琼脂糖小珠相连的GST-PDZ融合蛋白孵育(图5)。对照细胞样品用HA表达构建物转染。用抗HA单克隆抗体检测证明，通过由作为致癌E6-PL探测分子的所有5种检测的GST-PDZ蛋白(Tipl、Magi1结构域1、Sast2、Psd95结构域2、突触泡磷酸酶-2结合蛋白)代表的PDZ结构域，E6选择性地从细胞溶解物中被拉出。图5B中所示的结果表明，Magi1-PDZ结构域1与HA-E6而不与HA-E6ΔPL(缺失了3个C末端氨基酸)结合。这一方法能用于确定特定的PDZ结构域是否具有特异性结合E6的能力。得出结论，细胞溶解物的复杂混合物所代表的潜在PDZ结合蛋白和E6之间对结合PDZ的竞争能够通过对组成致癌E6-PL探测分子的具体PDZ结构域的适当选择向选择性结合E6倾斜。
实施例11
HPV感染的宫颈癌细胞系的内源性E6蛋白能够通过致癌E6-PL探测分子在夹心ELISA(SANDWICH ELISA)检测中进行检测
A)摘要
对实验进行了描述，其中致癌E6-PL探测分子用以通过夹心ELISA法选择性检测HPV感染细胞中E6蛋白的存在。特异性捕获致癌E6而不是非致癌E6说明，基于PDZ的致癌E6-PL探测分子能被用于以E6检测为基础的HPV感染的诊断测试和/或宫颈癌测试。
B)方法：
1型夹心ELISA法：PBS中浓度为5微克/毫升的抗E6抗体以每孔100微升的量在4℃下包被96孔ELISA平板(Polysorb或Maxisorp)过夜。平板用PBS清洗并用200微升含2％BSA的PBS在4℃下封闭2小时。添加稀释在含2％BSA的PBS中的细胞溶解物并在室温下孵育1小时。用PBS清洗3次以后，添加100微升含5微克/毫升致癌E6探测分子(例如Magi1-Magi1-IgG或GST-Magi1-PDZ1)的PBS/2％BSA，平板室温孵育45分钟。随后用PBS清洗平板3次并用含适当浓度抗hIgG-HRP(Jackson Immuno Research)或抗GST-HRP(Pharmacia)的PBS/2％BSA室温孵育45分钟。用50mM Tris/0.2％Tween-20清洗5次以后，平板与每孔100微升TMB底物(DakoIndustries)孵育。在适当时间(通常20分钟以后)通过添加100微升0.1M H2SO4终止比色反应并用ELISA酶标仪在450纳米处读取平板读数。
在1型ELISA法的一种形式中，在添加到抗E6抗体包被的平板上之前，细胞溶解物先以2.5-5微克/毫升的终浓度在4℃下与致癌E6探测分子孵育1-2小时。
2型夹心ELISA法：在2型夹心法中，基本按照1型夹心法中所使用的试剂和步骤。与1型夹心法不同的是，100微升致癌E6探测分子包被在ELISA平板上并且使用抗E6抗体检测与致癌探测分子结合的E6，随后通过抗小鼠IgG-HRP(Jackson ImmunoResearch)检测。在2型夹心法的一种改进方式中，可使用生物素化的试剂(抗E6抗体或致癌探测分子)，随后通过链霉亲和素-HRP进一步降低本底并提高灵敏度。
C)结果：
设计了两种不同形式的ELISA夹心法。在1型ELISA夹心法中，存在于细胞溶解物中的E6蛋白被E6特异性单克隆抗体捕获，特定致癌变体的检测通过致癌E6-PL探测分子实现。在2型ELISA夹心法中，致癌E6蛋白通过致癌E6-PL探测分子捕获到固相支持物并通过特异性E6抗体或其他特异性E6结合物质(如基于核酸的结合化合物、结合E6的化学试剂、E6结合蛋白或这些化合物的组合)实现E6的检测。细胞直接在组织培养皿上溶解，溶解物先通过离心去除不溶成分。细菌溶解物与致癌E6-PL探测分子(GST与Magi1PDZ结构域1组成的融合蛋白)先在4℃下孵育。随后，细胞溶解物加载于E6特异性抗体包被的ELISA平板上。通过添加HRP偶联的GST特异性抗体和在不同孵育步骤之间适当的清洗步骤之后添加HRP底物TMB实现检测。检测信号由使用450纳米处吸光率测量值量化的颜色变化构成。
对得自1型ELISA检测的结果进行说明。检测了过表达E6的转染的293EBNA T细胞和HPV16感染的宫颈癌来源细胞系的HPV16-E6。对于HPV感染细胞来说，检测极限是约250,000个细胞(图8)。预计降低本底、增强检测信号和增强E6：PDZ结合可以将灵敏度提高到25,000个细胞或更低。降低本底可以通过优化系统中所有成分的选择和浓度，以及通过额外的成分存化或增加尺寸排阻或过滤步骤实现。检测信号可以通过使用更灵敏的检测系统(例如基于化学发光的技术)得以提高。E6:PDZ结合可以通过改进致癌E6-PL探测分子的PDZ基础，以及通过用磷酸酶处理含E6的细菌溶解物(这样去除了所有E6-PL位点上任何磷酸根，后者可能干扰、降低或阻断E6-PL与致癌E6-PL探测分子的特异性结合)得以增强。
实施例12
HPV感染的宫颈癌细胞系的内源性E6蛋白可以通过与膜结合的致癌E6-PL探测分子检测。基于膜的检测可用以提高以致癌E6-PL探测分子为基础的检测方法的灵敏度。
A)摘要：
通过实验证明可以用基于膜的形式进行宫颈癌的1型和2型ELISA检测。在膜形式的宫颈癌诊断试剂盒中，保持了传统1型和2型ELISA夹心法的原则，特别是关于致癌形式E6的专有性捕获或检测。发现相对于传统ELISA，在基于膜的检测法中灵敏度得到了极大提高。
B)方法：
用2毫升PBS/2％BSA先行封闭12孔的Corning平板(有盖的组织培养平板，聚苯乙烯材质，孔径22毫米)，随后用2毫升PBS冲洗3次。
使用2微升移液器用2微升GST-Magi1结构域1溶液(88.6，0.17毫克/毫升)在硝酸纤维素膜上点样(在1×1.5厘米的膜上一式两份点样，转印，转移介质，支持的硝酸纤维素膜(目录号162-0097(0.2uM)，Lot号8943)。风干约5-10分钟。
在平板上用1毫升PBS将膜水合几分钟。
室温下在每个孔中用1毫升PBS/2％BSA对膜进行封闭30分钟，同时保持振荡。
用PBS清洗3次，每次1毫升约5-10分钟，直接吸出第一次清洗液。可以在室温下清洗。
室温下膜与细胞溶解物(约300微升共3百万个细胞)孵育30分钟。同样在PBS/2％BSA中进行1∶10倍稀释(3百万、30万、3万、3千)(33.33微升样品和300微升PBS/2％BSA)。
在4℃下用PBS清洗3次，每次1毫升约3-5分钟
膜与抗E6抗体(6F4)4℃孵育30分钟(1∶5000稀释，或将1∶100稀释液按1∶50稀释于PBS/2％BSA)(需要0.4毫升每孔，36孔需要16毫升(320微升1∶1006F4，15.68毫升PBS/2％BSA))。
用PBS在4℃下清洗3次，每次约5-10分钟。
与HRP-抗小鼠抗体(1∶1000)4℃孵育30分钟，同时保持振荡(HRP-抗小鼠免疫球蛋白，辣根过氧化物酶与绵羊的完整抗体相连，Amersham，NA931V，lot 213295。每孔使用400微升，36孔需要16微升HRP-抗小鼠抗体，16毫升PBS/2％BSA)。
在4℃下用PBS清洗5次，每次振荡约5-10分钟，最后一次清洗10分钟。然后吸出最后的清洗液并每孔添加1毫升新鲜的PBS。
用ECL+系统在皮氏平皿中显影并在柯达胶片上曝光。
C)结果：
在一种2型夹心法方案中，将GST-Magi1致癌E6-PL探测分子点加在膜上并添加递减量的HPV11和HPV16MBP-E6融合蛋白与之结合。用E6特异抗体检测清楚地表明了对致癌(HPV16)E6而不是对非致癌(HPV11)E6信号的特异性。通过更长曝光时间(5分钟)，可以容易地检测总量0.1纳克的HPV16MBP-E6(图9，最上面部分)。
在相同的实验中，将HPV16-E6转染细胞和模仿转染细胞的溶解物用于基于膜的2型夹心法测试。仅对E6表达细胞而不是模仿转染细胞得到了E6特异信号(图9，下面部分)。这些结果清楚地表明，所述基于膜的宫颈癌测试可以用以膜为基础的形式实行。
在随后的实验中，测试了HPV感染细胞的细胞溶解物(图10)。明显地，只有表达HPV16-E6的细胞产生信号(SiHa和CasKi)，而不是HPV阴性但宫颈癌阳性的细胞系C33。E6特异信号得自300,000个细胞，这表明所述测试的优化形式可能检测充分更低细胞数量的HPV-E6蛋白。
实施例13
宫颈癌肿瘤中HPV16E6致癌蛋白的检测
从石蜡包埋的肿瘤上取下一小块组织并分成两半。一份用于基于RT-PCR的HPV分型，第二份用于蛋白提取。
使用TRIZOL试剂盒(invitrogen)抽提RNA用于分型。简言之，一小块组织转移到1毫升TRIZOL溶液中并使用Dounce匀浆器悬浮并溶解细胞。抽提RNA并用2-丙醇沉淀，并通过260纳米光的消光对其定量。1微克RNA用以生成cDNA。引物是随机六聚体，Superscript II(Invitrogen)用于逆转录。HPV 16、HPV 18和HPV45的E6基因的特异性引物用于对cDNA模板的PCR扩增。用HPV16E6特异引物而不是HPV18或45的特异引物得到了预期大小的条带。因而，检查的肿瘤由HPV16感染的细胞构成。
为了蛋白提取，将一块组织直接在1毫升溶解缓冲液(50mM Hepes pH7.5、150mMNaCl、lmM EDTA、10％甘油、1％Triton、10mM氟化钠、1mM原钒酸钠、1mMPMSF、1∶100稀释的Calbiochem蛋白酶抑制剂)中溶解，用3毫升的Dounce匀浆器破碎细胞膜。总蛋白浓度通过Bradford蛋白浓度检测法测定，对应约1,000,000个细胞的蛋白量在12％PAGE凝胶上分离。来自非HPV16感染的肿瘤的细胞溶解物作为阴性对照加样。
凝胶通过使用抗HPV16-E6的特异性单克隆抗体的免疫印迹技术分析。在HPV16感染的肿瘤来源的溶解物中而不是在HPV16阴性对照肿瘤来源的溶解物中显示出了一条对应HPV16-E6蛋白正确大小的条带。条带强度与用1,000,000个HPV16特异性SiHa细胞测得的E6特异性条带相当。C33-HPV E6阴性的子宫颈细胞系；MBP-E6-麦芽糖结合蛋白-HPV16E6融合蛋白；HPV E6过表达-来自用表达全长HPV16E6蛋白的构建物转化的HEK 293细胞的溶解物。这些结果显示在图11中。
实施例14
使用快速免疫检测技术和荧光检测对人的样本中宫颈癌的检测
A)摘要：
对实验进行了描述，其中出于宫颈癌诊断的目的，通过使用快速免疫检测法(RIA)，致癌E6-PL探测分子被用于选择性检测人样本中致癌E6蛋白的存在。
B)方法：
宫颈细胞通过使用常规的宫颈刷(如CULTURETTE DIRECT(Becton Dickinson))收集并在样品稀释液中重悬。细胞通过离心收集，细胞沉淀在200微升预冷的溶解缓冲液(50mM Hepes pH7.5、150mM NaCl、1mM EDTA、10％甘油、1％Triton、10mM氟化钠、1mM原钒酸钠、1mM PMSF、1∶100稀释的Calbiochem蛋白酶抑制剂)中重悬，冷却到5℃，并轻轻振荡以促进细胞溶解。此时的样品可以运输。75微升细胞溶解物稀释在PBS/2％BSA中，随后在适用于荧光酶标仪的已用含5微克/毫升重组Magi1结构域2(这里称为结构域2，但在大部分公开文献中称为结构域1)融合蛋白的PBS包被并用白蛋白或明胶封闭了非特异位点的平板上添加150微升(或约一半孔体积)所述稀释的细胞溶解物。稀释的细胞溶解物在室温下孵育30分钟。用PBS洗涤3次后，添加100微升含0.5微克/毫升FITC标记的抗致癌E6抗体混合物(其共同识别所有普通HPV类型的E6蛋白)的PBS/2％BSA，平板在室温下孵育25分钟。然后平板用PBS洗涤3次并测量荧光值。
C)结果：
通过与标准品和对照比较荧光强度值，确定癌症阶段的诊断。
实施例15
在使用比色检测的层流试剂条测试中使用快速免疫检测技术检测来自人样品的宫颈癌
A)摘要：
对实验进行了描述，其中出于宫颈癌诊断的目的，通过使用试剂条形式的(或层流形式的)快速免疫检测法(RIA)，致癌E6-PL探测分子被用于选择性检测人样本中致癌E6蛋白的存在。这一检测法类似于大部分家用一步hCG怀孕检验。
B)方法：
宫颈细胞通过使用常规的宫颈刷(如CULTURETTE DIRECT(Becton Dickinson))收集并在样品稀释液中重悬。细胞通过离心收集，细胞沉淀在200微升预冷的溶解缓冲液(50mM Hepes pH7.5、150mM NaCl、lmM EDTA、10％甘油、1％Triton、10mM氟化钠、1mM原钒酸钠、1mM PMSF、1∶100稀释的Calbiochem蛋白酶抑制剂)中重悬，冷却到5℃，并轻轻振荡以促进细胞溶解。此时的样品可以运输。细胞溶解物用PBS/2％BSA稀释到500微升并在检验装置中应用。所述检验装置包括与有色基团偶联的抗E6单克隆抗体混合物以及包被在膜上检测区的重组Magi1PDZ2融合蛋白。通过毛细管作用，溶解的细胞样品在检测区上移动并与浸透的试剂反应，在检测窗口形成可见的有色条带。样品中致癌E6蛋白的存在会导致在检测区形成明显的有色条带，从而表示对致癌E6蛋白的阳性结果。相反地，如果检测区没有条带出现，测试为阴性。
C)结果：
通过对检测区中检测线颜色与阳性和阴性对照之间的比较来校验正确的检验功能，确定对癌症的诊断。
本发明的范围不受举例说明的实施例的限制，这些实施例是作为本发明单独方面的说明，并且任何功能上等同的序列包括在本发明的范围以内。当然，除了这里所展示和描述的那些改变以外，本发明的多种改变对于精通本领域的人员来说，通过前面的的描述和附图会是显而易见的。这意味着这样的改变属于附属的权利要求的范围。
这里引用的所有出版物和在申请者日期页中引用的优先权文件通过参考全面完整地结合在本申请中。
表9
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Claims (16)

1.PDZ结构域多肽用于检测样品中致癌人乳头状瘤病毒(HPV)E6蛋白的存在的应用，所述PDZ结构域多肽包括MAGI-I PDZ结构域2的氨基酸序列，其中所述样品被怀疑含有致癌HPV E6蛋白；其中所述致癌HPV E6蛋白结合HPV E6结合伴侣；并且其中所述致癌HPV E6蛋白与所述PDZ结构域多肽的结合表明所述致癌HPV E6蛋白在所述样品中的存在。
2.包括MAGI-I PDZ结构域2的氨基酸序列的PDZ结构域多肽用于在体外测试中确定受检人是否被人乳头状瘤病毒(HPV)的致癌病毒株感染的应用。
3.如权利要求1或2所述的应用，其中所述PDZ结构域多肽长度为60-1000个氨基酸。
4.如权利要求1或2所述的应用，其中所述PDZ结构域多肽长度少于500个氨基酸。
5.如权利要求1或2所述的应用，其中所述PDZ结构域多肽长度少于200个氨基酸。
6.如权利要求1或2所述的应用，其中所述致癌HPV的毒株选自由HPV毒株16、18、26、30、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、69、73和82组成的组。
7.如权利要求1或2所述的应用，其中所述致癌HPV的毒株选自由HPV毒株16、18和45组成的组。
8.如权利要求1或2所述的应用，其中所述PDZ结构域多肽直接或间接结合于固体支持物上。
9.如权利要求2所述的应用，其中所述致癌人乳头状瘤病毒E6蛋白结合HPV E6蛋白结合伴侣。
10.如权利要求1或9所述的应用，其中所述HPV E6蛋白结合伴侣是与所述致癌HPV E6多肽结合的标记的抗体。
11.如权利要求1-10任一项所述的应用，其中所述样品是子宫颈刮取物、活组织切片或灌洗物。
12.如权利要求1-11任一项所述的应用，其中所述PDZ结构域多肽用作检测宫颈癌的测试的一部分，所述检测宫颈癌的测试与所述样品的组织学分析联合进行。
13.如权利要求1-12任一项所述的应用，其中所述PDZ结构域多肽用于ELISA检测法或夹心检测法。
14.如权利要求1-13任一项所述的应用，其中所述PDZ结构域多肽与异源结构域融合。
15.如权利要求1-14任一项所述的应用，其中所述应用进一步包括：
a.洗涤步骤；
b.加入封闭缓冲液；或
c.将在所述样品中所述致癌HPV E6蛋白的结合和不含有E6癌蛋白的对照样品进行比较。
16.PDZ结构域多肽用于检测样品中致癌人乳头状瘤病毒(HPV)E6蛋白的存在的应用，所述PDZ结构域多肽包括选自以下的PDZ结构域多肽的氨基酸序列：萎缩蛋白-1相互作用蛋白，Lim-Ri1，FJL11215，MUPP-1，KIAA 1095，PTN-4，INADL，Vartul，肌养蛋白结合蛋白-1α，肌养蛋白结合蛋白γ-1，TAX IP2，KIAA 0807，KIAA 1634，DLG1，DLG2，NeDLG，Sim.大鼠外膜，PSD 95，或TIP-1，
其中所述样品被怀疑含有致癌HPV E6蛋白；其中所述致癌HPV E6蛋白结合HPV E6结合伴侣；并且其中所述致癌HPV E6蛋白与所述PDZ结构域多肽的结合表明所述致癌HPV E6蛋白在所述样品中的存在。
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