TW304957B - - Google Patents

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Α6 Β6 五、發明説明（） 本發明發展出一棰快速合成及篩檢大量的小分子肽鍵之 方法，其目的在生產一種摹擬對酶與细胞受«具高结合親 合性與專一性之較大天然配基的分子。我們將具此羼性的 分子命名為”摹擬物”其有諸多潛在性的用途。例如•蓽擬 物可用作治癬藥繭，因為其為易於合成的分子。本方法為 一種糸统性地改變天然配位髑之替代策略，已證實改變天 然配位體速度慢且困難，而逢機篩檢化合物的低成功率（ 機率）方法所得之化合物與天然配位«並無相似之结構。 本方法使既可同時快速生產比使用傳统固相合成法合成更 多的肽鏈成為可能，而且提供一種可迅速測量及合成能達 所欲活性之特定序列的純型。1 本方法提供数種較先前技藝重要的改進。數篇使用相對 的固相技術之報告顯示實際上一次合成的量只在数百儸肽 鐽*然而本方法一次合成所攞供的肽鍵實晬上卻無限剌數 曇。 其他最近使用固相技術Μ在短期間内完成合成極大數最 小肽鏈之報告亦揭示了將胺基酸偶合至成長中的肽鍵之方 法。由於胺基酸不同的相對偶合速率.本方法需要調轚混 合物中胺基酸的濃度以讓所產生的肽鍵之濃度相等。此外 ，本方法霈要使用多重分析技術Μ決定具所欲活性之正確 序列。本方法與傅统方法不同霣在每一偶合步驟只偶合犟 一胺基酸或一姐胺基酸，以邂免考慮不同的胺基酸偶合速 率之霱要並確保產生的肽鍵舆耳數最相等。本方法亦使鑑 別所欲的序列及之後生產纯型而無須化學分析。 {請先聞讀背面之注意事項再填窵本頁) -装· •打. •線. 甲 4(210X 297公廣） A6 B6 五、發明説明（κ) 亦有其他報告教示將逢機合成的募核脊酸插入絲狀嗜菌 膘中。此生物合成方法具有可生產上百萬的小肽鍵之潛力 ，然而其必須限制在遺傳上編碼的胺基酸而且亦只能生成 直線结構。本發明卻可包含D —胺基酸或其餘經修飾的胺 基酸之併入及支鏈序列之合成，此二者K重姐DNA方法皆 不可能達成。 也許相對於先前技藝所教示，最重要的是本方法可評估 肽鏈與目檷结合位置相互作用的能力而可免除支持樹脂的 潛在性芊擾現象。簡而言之，本發明可生產大量的小肽鐽 而且提供可迅速鑑別具所欲活性的特定肽或呔鏈並可以生 產其純型。 ’ 本發明揭示一種快速合成與篩檢極大數量的小肽鍵之方 法。本發明藉著生成小肽鍵的混合物以增強生產一種可摹 擬對酶與受雅高结合親合性與專一性的天然配位體之分子 之能力。由於本方法的特性，混合物中毎一位置上所選定 胺基酸的嬅度及因此所生成的每一呔鏈濃度皆保持接近於 所述的比例之内。本方法可使所生產^肽混合物在無支持 樹脂時接受测試，而不喪失其迅速鑑別具所欲活性的特定 肽踺之能力。此頰肽混合物乃由一糸列的肽鍵構成*這些 肽鐽在最後偁合位置皆含一共同胺基，此亦可能位在其他 清楚遘定的位置，但所有其他位置的基皆是不同的胺基酸 的逢機選擇。為本發明的目的，藉本方法所製成的肽鍵序 列可Μ是直鍵或支鏈结構。 本發明包括一種在含有如下的肽鐽混合物時合成播大數 -4 - 甲 4(210Χ 297公廣） ...................................................…^.........................................................爆 (請先閱讀背面之注意事項再填穹本頁) 説 明 發 五 明

A B 成包 合驟 次步 首一 的第 物中 合其 混， 肽成 做構 驟酸 步基 成胺 合群 個η η或 賴個 ; η 法由 方皆 之肽 鍵種 肽| 的每 量， ;或 合酸 偶基 脂胺 樹合 持偁 支脂 態樹 固的 量量 份份 等等 與合 別混 涸全 酸完 基含 胺包 组皆 各驟 或步 »Lr 夕 各另 將各 含而 酸合 基混 胺 - 姐每 各自 或可 種， 各要 將必 ;若 量 ·’ 份應 等反 成成 分完 物以 合量 混份 將等 ; 此 酸至 基合 胺偶 姐別 各個 在 肽 各 中 其 物 合 混 肽 I 產 〇 生酸 Μ * 出胺 切知 上已 脂 -榭具 自置 鐽位 肽合 將偁 ’後 物最 活： 物括 生包 具步 定一 測進 以法 合方 整的 法合 定整 測纆 物此 生。 種列 一 序 與之 以鍵 可肽 法或 方肽 喊定 合特 此的 性 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· (A) 做每一肽混合物的生物活性之首次測定並拜此完成首 次合成循環反應； © 在η個合成步琢中每一個使用與首次合成反應相同之 各種或各姐胺基酸來做第二次肽鍵合成，而其第丨至 第η — 1個步驟則皆是重複首次合成反懕者；而且是 在第η個步驟賴偶合一棰或一姐出現在肱混合物終鑭 而在初次测定時已表現生物活性的胺基酸至每一肽鏈 混合物中Κ完成反應；若必要，可自每一混合物的i 脂中將呔鍵切出；做每一肽鍵混合物的生物活性之第 二次溯I定並«此完成第二個合成循環反應；及 〇 完成總共η次的合成循環反應步驟以便於合成一種已 完全已知序列的呔鍵。 應注意的是本發明包括，Μ相同的快速合成方法來合成 甲 4(210X2971、角) ^ . ,Λ · , b^*i A6 B6 五、發明説明（) 具有肽支鏈的肽鏈之能力。這些具支踺之分子以混合物形 式製成，亦可能用於測定活性以及可以與直鍵肽鏈鑑別方 法買質上相阍的方式來鑑定具活性的特定—或多棰分子之 序列。 為本發明的目的，正如文中所揭示及所讅求’下列用語 及縮寫定義如下。 用語及縮寫：

Ac —乙藤基

B z 1 — ^ S O-Bzl —节基酷

Bom—苄基氧甲基

Tos —苄磺睡（4一苄磺醢基） 2(M-Z-2 -氛苄氧羰基 2.6(Π-Ζ-2，6 -二氛苄氧羰基 2ΒΓ-Ζ-2 -澳苄氧羰基 X-一種未知胺基酸 L -胺基酸在文中係Μ其檷準三個字母编碼而頭一字母大 寫者表示，而D -胺基酸則以三個字母《碣皆小寫來表示 。 本發明可使用例行懕用於肽鍵合成之固相合成程序秦 貫施。通常，一届最终會相當於生成肽鍵的C襯胺基酸基 的胺基酸會箱著C斓殘基的羧基與做為附著位置的樹脂基 質上之特定官能團形成共價連接而因此固定至不可溶的支 持樹脂上。然後此肽鍵自與樹脂偶合的C纗胺基酸開始以 順序連績偶合至Ν纗基的胺基上而完成合成作用。若有支 6 甲 4(210Χ 297 公沒） f ( ......................................................St..............................打..............................痒 ς請先閑讀背面之注意事項再填窝本页) A6 B6 五、發明說明（） 鏈存在則可能有一個以上的N-端。在合成過程中肽鍵依 然附著在樹脂上但一旦完成其肽的序列便可能由樹脂上被 切出。 可生齑含2〜8個或姐胺基酸的肽鐽之方法是本發明較 佳的具體實施例。 本新方法乃根揲重裡的混合，分配及偁合經樹脂偶合的 胺基酸或肽》。第一步箱要將固態支持樹脂分成具相等附 著位置的等份量，然後藉偶合反應以完成將個別選定的胺 基酸偶i至毎一等份量中•每一等份鼉的樹脂皆與不同種 胺基酸偶合。结果，每一等份量中的樹脂皆會與等莫耳數 量的胺基酸偁合，正如其他等备量皆會與不同胺基酸偶合 。樹脂皆完全混合以便生產等荑耳潇度之經樹脂偶合的胺 基酸之混合物。然後將此混合物等量分K，《之Μ進一步 將涸別選定的胺基酸偶合至每一等份量，經樹脂偶合之胺 基酸上。逐步重複混合，分配及偁合步驟而產生肽混合物 ，其中對一特定的混合物的所有呔鍵而言，其最後一個偶 合的胺基酸基皆相同*但混合物中每一肽鍵的其他位置胺 基酸基乃表示等莫耳數的埋擇，其包括在特定的偶合步驟 内之肢基酸。 ' 可做替代方法的是可在住何特定的偶合步驟偶合單一種 胺基酸，因而使得全部合成的呔鍵在特定位置上皆含相同 胺基酸。當採行此法時，分開步驟後立即行偁合步驟，而 偶合步》後立即採行的混合步驟或可取消。埴會造成如前 相同的肽混合物，但除了最後偁合位置外，在一特定位置 (請先聞讀背面之注意事項再填珥本頁) •訂. •綵. 甲 4(210X297公超） A6 __B6_ 五、發明説明（) 的胺基酸本身也是已知的。 本方法生成很大數悬的肽鏈•其數量復以少數的偶合步 驟使可適合做生物測定。结果，可_纆選定使用的胺基酸 中製成每一種可能的序列，例如，若選定25種胺基酸來合 成肽，則在二次速鑛回合的25次反應後，復經50次偶合步 驟便生成625種雙肽；在三回合反應75次偶合步驟後便產 生15625種三肽；而且在四回合反懕只經1〇〇届偶合步驟後 使產生39 0625種獨特的四呔分子。使用較多偶合步驟以生 產較長βί肽會導致混合物中生成更大數量的呔鏈。 合成反應所适I用的胺基酸之數目和型式每一回合可能不 同，而且可反映不存任何預測有Μ那些胺基酸為最適合的 逢機選擇之預設立場或可包括根據已知會影響所欲活性的 特徴之某些胺基酸的特別選擇。 可以本方法完成的連續偶合次數只受制於热知於此藝之 因子且限制肽鍵之固相合成者。然而•應注意的是在一種 混合物中增加肽鏈數目會降低僩別肽鏈所佔總肽鏈濃度部 份之數值。因此•當將肱鍵混合物的合成與生物测定结合 Κ测量如下所述具活性的呔鍵之序列時*若要決定偶合次 數必須考慮測定之靈敏度，這是實際可行的。亦即，用^ 種測定去辨認可能是來自單一肽鍵的具有活性之訊息而免 於受過量的不具活性的混合物姐成分子之”干擾”的能力， 對將被包含於接受活性測定的混合物中的肽鍵之數目會是 一種限制因子。當使用一種分析法Μ檢測一種混合物中肽 鐽的活性時，此種混合物中肽的溶解度亦反映在可Μ被合 8 甲 4(210X 297 公沒） (請先《請背面之注意事項再填辉本頁) ，装. •打· •線· A6 _ B6 五、發明說明（) 成的肽的實際限制之相同考慮上。 當將此種生產肽的方法與生物測定法结合時，具有活性 的混合物中的肽鍵之特定序列很容赛鑑定亦因而可Μ纯型 生產，在分析生物活性前可先將肽鏈由樹脂切出。將呔由 樹脂切出可排除由於某些因子，例如位阻現象干擾肽活性 之可能。然後，將這些肽Μ混合物型式做生物測定，由於 同種混合物中每一呔踺最後偁合位置的胺基酸基皆是已知 ，故一種可表現混合物活性的測定法必須能鑑別最後偶合 位的胺ί酸基。我們將整儸合成肽混合物及活性測定的程 序命名為”合成循環”。 為了鑑定具所親察活性的混合物中的肽鏈之特定序列· 如同首次合成循環的测定法所測定者，所有混合物中具活 性的呔皆以相同的混合，分配及偶合程序重新合成，不過 *第二次合成循環中於倒數第二偶合反應後不將肽混合物 混合。因此，對一特定的混合物其倒數第二偶合的胺基酸 本身是已知的。然後將以先前合成循環的生物測定法鑑定 之最後偁合位置的胺基酸偶合至每一混合物中的肽鍵上， 因此對一種特定肽混合物中之所有肽鐽而言其最後二僩偶 合的胺基酸本身皆是已知的。然後•再將這些混合物做i 物測定Μ鑑定可表現活性的混合物，结果*可決定出具有 所覼察活性的肽之兩個胺基酸基的鑑定。因而，吾人重複 再合成具所欲活性的呔混合物與再測定此混合物之方法， 以鑑定每一合成循環中另一胺基酸基，直至混合物中被發 現的具活性肽鍵之序列完全解出為止。 甲 4(210Χ 297公廣） (請先《讀背面之注意事項再填窵本頁) •装. •打. .線. A6 B6 五、發明說明（） 起始樹脂可以如下方法製成或可自商業瞒得，其為共拥 结合胺基酸者。若是市售的已是樹脂偶合型式的胺基酸可 取代本發明摘要所述的首次合成之涵合步驟。除由届別胺 基酸生產肽鍵之程序外，吾人可在任何或全部偶合步嫌中 偶合一姐胺基酸。若這姐胺基酸反是已知序列的肽鍵，便 可以本發明揭示所述的方法進行偶合。因此，贛著在N- 斓，C —端或二者增長已知的肽序列•那多重狀鍵合成及 篩檢技術便可用來製成肽混合物以及鑑定所產生的具活性 ♦ 序列。另外•正如已提到的•以此程序製成的肽鍵序列可 能具有支鍵構型。 使用熟知於此藝中形成肽鐽的技術偶合胺基酸，這方法 涉及將胺基酸轉化成一種衍生物而使其羧基更易與肽鍵部 份的游離N —端之胺基起反應。例如•藉由經保護的胺基 酸與氯甲酸乙基酯、氣甲酸苯酯、氛甲酸異丁酯、或氯甲 酸第二丁酯反應可將胺基酸轉化成混合酸酐。或者，可將 胺基酸轉換成活性酯類，例如2·, 4,5-三氯苯酯•五氯苯醮 ，五氟苯酯、對硝基苯酯、N — 丁氧基羰基酯（t-Boc) * N -羥基丁二醣亞胺酯或是一種由1-羥基苯駢三吡咯所形 成的酯類。 另一種偶合方法涉及使用諸如Ν,Ν -二環己碳二亞胺 (DCC)或Ν,Η’-二異丙基碳二亞胺（DIC)等合適的偶合劑。 其他班當的偁合劑對熟知此蕕者是很澝楚的。請參見 Sc h.r· oder 與 Lubke,”狀鍵 ”（The Peptides, Academic Press, 1965, Chapter I and U.S. Patent 10 甲 4(210X 297 公沒） (請先閱讀背面之注意事項再填窵本页) .¾. •打· .線. A6 _____B6 _ 五、發明説明（） 4,259,234)第三章與美國專利號碼4,259,234。 應了解在呔合成時所用的每一胺基_之„ 一胺基在偁合 反應時皆必須受到保護以防止反應性α—胺基的功能渉及 之副作用。亦應了解某些胺基酸含有反應性的支鍵官能基 (例如硫氫基，Σ —胺基，；S與γ —羧基，咪唑基，胍基 與羥基）而且此類官能基在起始步驟與其後的偶合步驟中 亦必須受到保護。通合的保護基皆熟知於此藝中。其例可 見，有機化學的保 _ 基（Protective Groups in Organic Chemistry), M. McOmie, Ed., Plenum Press, N.Y., 1973及1].5.卩31^111:(美國専利號碼）4,617,149。 在選擇特別的保護基時，必須注蕙某些情形。一種α-胺基保護基必須使α -胺基在所用的偁合條件下是無活性 的，亦必須在偶合反應後可以很迅速的被移去而不會去除 支鍵保護基而且不改變肽片段之结搆，邐有α-胺基保護 基在偶合前所立即進行的活化反懕中亦必須排除消旋化之 可能。一種支鐽的保護基必須使支鍵f能基在所用的偁合 條件下是無活性的•其在去除α-胺基保護基的條件下亦 必須是穩定的•而且若有需要，其在肽鍵完成合成反應時 必須是可迅速除去而不會改變肽鐽结構的。 已知可在肽鍵合成時做為保護基者，其反應性會因所用 Κ去除他們本身的試劑而有所變化，對那些熟知此藝者是 很明顯。例如，某些保護基，諸如三苯基甲基及2_(對-二 苯基）異丙氧基羰基皆非常不安定，且在溫和條件即會被 切出。其他保護基，諸如第三丁氣基羰基，第三戊氧基羰 -11- 甲 4(210Χ 297公沒) (請先閱讀背面之注意事項再填穹本页) .装· •打· •線· 3u4ii57 A6 _B6 五、發明説明（） 基，金剛烷氧基羰基及對-甲氧基笨氧基羰基皆較不易生 變化而且在去除他們時亦需要例如三氟乙酸，氳氯酸或溶 於乙酸中之三氟化®等中等強度的_。更有其他保護基， 諸如苯氧基羰基，鹵基氧基羰基，對-硝基苯氧基羰基* 環烷氧基羰基及異丙氧基羰基皆為更不易生赛化而且需要 諸如氫氟酸（HF)，氫溴酸或溶於三氟乙酸中之硼三氟乙» 等更強的酸以去除之。保護基9-荛基甲氧基羰基（F hoc)亦 是可使用的，且其可在使其他保護基完整無缺條件下以六 氫吡啶€速的去除。 完成偶合步驟時，可將受保護的肽由樹脂支持物上切出 且可除去全部保護基。可同時完成切除反應及去除保_基 兩件事，亦可依序進行。酋樹脂支持物為氯甲基化聚苯乙 烯樹脂時，則將肽鏈固定在樹脂上之鍵结為C端部分游離 的羧基與樹脂基質上很多氣甲基中的一個所形成的酯連结 。將為人認可的是此做為固定之用的鍵结可被已知能打斷 酯連結與穿透樹脂基質的試劑所切断。一種特別方便的方 法是Μ液態無水HF處理。此試劑不反會將肽自樹脂切出且 亦可去除所有保護基。因此，使用此試劑可直接攞供完全 去保護的肽鏈。當我們想將肽切出而不去除保護基時•可 將經保護的肽鐽-樹脂行甲酵分解作用以生成C -端羧基 烴甲基化之纆保謅的肽。然後可將甲基》在溫和《性條件 水解Μ生成游離C-嬙羧基。然後可Κ諸如液態HF的強酸虜 理，去除肽鏈上的保護基。於Hui, K.Y. et al.，1988, J. Med. Chem. 31, 1679-1686中描述了一種生產類似本 -12 - {請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) •装· -打- .線· 肀 4(210X297 公沒） A6 _ B6 五、發明說明（） 發明的那些肽鏈之特別有用的技術。 另一種自樹脂切出經保護的肽之方法為以氨分解或Μ瞄 (肼）氨處理。吾人亦懕有認識為，位於Ν —纗ot —胺基上 之保護基可在由樹脂支持物上切出經保護的肽鍵之前或同 時優先地去除之。 热諸技藝者亦會了解此處所介紹的計劃可使用任何已知 或已發展的固相化學K全部胺基酸及衍生物之姐合來生產 任何長度或序列之呔鍵。為生產支鏈分子可將胺基酸或成 ♦ 鍵的胺基酸偁合至存在於第一個胺基酸鍵上之第二届肢基 。例如，可將諸如離胺酸之胺基酸偶合至所有生長中的肽 鍵之某些普通點上以致於可以讓一個或一姐胺基酸附著在 胺基酸上的第二涸胺基。或者，可合成具兩涸或更多胺基 之修飾胺基酸使其可充做支點。然後可用對直鐽分子相同 的混合，分配，偶合方法增長此支鏈。當要製造支鐽分子 時，用於支鍵的保護基必須與建造第一條鍵所用的保護基 有所不同。例如，一支鐽以t-Boc為保護基，另一支鏈K Fmoc為保護基可允許不同支鏈使用不同條件及去保護試劑 之埋擇性的播作方法。 我們可由很多的來源購得很多經保護及未經保護形式的 天然產生或非天然產生胺基酸。其他無法購得的胺基酸則 可以合成。買施本發明所需之全部試劑及材料除非特別說 明，否則皆可得自 Advanced Chen Tech(P0 Box 1403, Louisville, KY)或 Applied Biosyste^s(850 Lincoln Center Dr., Foster City, CA)等兩家公司。 -13 - 甲 4(210X297乂沒） (請先閑讀背面之注意事項再填鸾本页) .装. •打· •綠· 3ϋ4957 A6 B6 五、發明説明（ 本發明無裔依賴任何測定生物活性的方法*任何可認識 具所欲活性的肽鍵之測定法皆可用做本方法的部份K鑑定 及生產一種肽混合物其中具所欲活桂之特定肽鍵。普通測 定法可包括受體一配位體结合法、免疫反懕性法，或酵素 活性效應。 貫例中明列之技術及來源乃是提供來說明本發明之手段 而不應誤解為本發明之限制。m_ι_ C —端醮胺化的肽乃是使用RaMPSTM(DuPont, 549 Albany St., Boston, ΜΑ)多重肽鏈合成裝置在對一甲基 二苯甲胺（對-MB ΗΑ)樹脂上合成。所使用胺基酸之α —胺 基具t-Boc保護基，而支鍵之保護如下：天冬胺酸 (0-Β21) * 麩胺酸（0-Β21)，絲胺酸（B21)，姐胺酸（Bom)， 離胺酸（2CI-Z)，D-酪胺酸（2.6CI-Z)及精胺酸（Tos)。 R a ^^51^装置基本上是一種歧管，薄此可將真空同時引用 到一些聚丙烯的反應容器中Μ攢動溶P及諸如未偁合的胺 基酸等試劑。這些反應容器稱為捲筒，包含一控制真空使 用的閥及一種維持支持樹脂且其上具任何未偶合胺基酸或 肽鍵之”多球"裝置，而捲简内部經攪動時會促進分«•淸 洗，中和及去保護等合成反應步驟的進行。 22個捲茼每個分別含0.2克之Ρ-ΜΒΗΑ樹脂•而每克樹脂 約含0.6毫莫耳之胺附著位置。胺附著位以溶於二甲基甲 麵胺（DMF)之10Χ二異丙基乙胺中和之。將列於表1之每一 種t-Boc-胺基酸4涸當量（4荑耳/葜耳樹脂胺）溶於1毫 14 - 14 (請先閱讀背面之注意事項再填W本頁) - •ΛΪΓ- .線. 甲 4(210X297公沒） 五、發明説明（） A6 B6 升DMF並加至捲茼，每一捲简皆接受一種不同的t-B〇c胺基 酸。然後加入溶於DMF4個當量之0.5M1-羥基苯并三唑 (HOBt)於捲茼，随之加入4當量之土異丙基碳二亞胺 (D 1C)。上下倒置搖晃捲茼60分鐘*接著清洗、中和並以 相同條件及濃度之相同胺基酸再偁合。第二次偁合必須保 證樹脂上的全部附著位置皆已偶合。要證實偁合反懕的完 成乃在繼續下届胺基酸前先做m三鬭（箏海特寧）分析。去 除t-Boc胺基酸之保護乃以5055三氟乙酸（TFA)，55；笨甲醚 及45»；二絮甲烷處理30分_即完成。然後將偶合樹脂自每 一捲茼去除且混合完全*因此產生一種混合物其偶合在第 一位置的每一個胺基酸之莫耳含量相同。 將樹脂一偶合的胺基酸平均分配在23個捲筒。然後將列 在表1的22個t-Boc胺基酸加上過渡狀態的t-Boc胺基酸 -StaUne(sta)偶合至此固定份董的胺基酸混合物中，每 —等份量者皆偁合K不同的t-Boc胺基酸。此偶合反應， 進行如上述方法會生成23涸肽混合物，每個皆有22種不同 離子偁合的雙肽而N —端的胺基酸殘基皆是已知的。2回 合的偶合反應可產生506種獨特的雙肽。在去保護前再次 测試Μ證實偶合反應是否完全。然後將樹脂一偶合的雙威 自捲茼去除並完全混合Μ生產在每一位置所偁合的每一胺 基酸之莫耳數量皆相同之雙肽混合物。 將樹脂一偶合的雙肽平均分配至22僩捲筒。然後偁合列 於表1之22種t-Boc胺基酸至每一等份量之雙肽混合物， 每一等份量皆偁合Μ不同的t-Boc胺基酸。此偁合反應如 -15 - (請先《續背面之注意事項再填寫本頁) .装· •打. •緣· 甲4(210X 297W廣) 五、發明説明（>

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上述方法進行以產生22種肽混合物，而每種内有5 0 6個其 N —端胺基酸基為已知之不同樹脂偁合的三肽分子*但其 t-Boc胺基酸則最後才加上以防止在去保護時可能形成二 嗣六氫吡哄。三回合偶合反應產生11132個獨特的三肽分 子。再一次在去保護前測定偁合反應是否完全。然後將樹 脂一偁合的三肽自捲茼去除並完全混合· Μ生產偁合在每 一位置的每一胺基酸之莫耳数量皆相同之三肽混合物。 將樹脂一偶合之三肽混合物平均分配至22個捲苘。然後 將列於ί 1之22種t-B〇c胺基酸偶合至每一等份量之三肽 混合物，每一等份量皆以不同的t-Boc胺基酸偁合。此偁 合反應的進行方法如上述之首次偶合反懕者，生產2 2棰肽 混合物，而每種内有111 32涸獨特的其N —端胺基酸殘基 為已知之樹脂偁合的四肽分子。四回合的偶合反懕產生 244904種獮特的四肽分子。再次在去保護前測定偶合反應 是否完全。然後將這四肽鐽保溫在10當量的乙酸、HDBt及 DIC中Μ將N—端基乙醢化。然後將樹脂一偁合之乙釀化 四肽自捲筒去除•但不像先前步驟每一捲筒中生成之肽混 合物皆予分開。因此，來自共同的捲简之全部四肽鏈其Ν 一端偶合的胺基酸皆相同，但鍵上的其他殘基代表每一特 定步驟偶合之各胺基酸為逢櫬等莫耳數邇擇者。因此，來 自每一捲筒之四肽分子代表可能由選定的胺基酸生產之每 一可能序列之等其耳數混合物，然而，其Ν —端基保挎不 變。 Μ二氣甲烷清洗四肽分子並於室通乾嫌之。然後在0C {請先聞請背面之注意事項再填窩本頁) ( •裝· 訂. •綠· -16- 甲 4(210X 297X^1) A6 _B6_ 五、發明説明（） ,90V液態無水HF/5S1對-硫甲酚/555間一甲酚中70分鐘將四 肽分子由MBHA樹脂切出。此一處理亦會去除全部的支謎保 護基。HFM蒸皤除之，而切除的四跃鐽以50«升乙醚在〇 υ中經30分鐘沈澱出。使用玻璃燒製的漏斗收集切出的23 肽分子並丢棄樹脂，随之以乙醚4X20«升清洗Μ沈澱這 些四肽。將沈教出的四肽溶於50：«乙酸/303!氰甲烷並遴濾 入圓底燒瓶。約有70¾髑積足以冥空蒸器I去除，刺餘部份 以水稀釋並冷凍乾堍。決定此回收的呔分子之乾重並在將 此混合^分配成小等份前再溶於50¾乙酸/30¾氰甲烷中。g_1 (請先Μ讀背面之注意事項再填荈本页) L-胺蓽驗 D-肱某》 精肢酸 丙胺酸 天冬胺酸 天冬胺釀酸 麩胺醯胺 麩胺酸 姐胺酸 白胺酸 異白胺酸 _胺酸 離胺酸 苯丙胺酸 苯丙胺酸 脯胺酸 脯胺酸 色胺酸 甲硫胺酸 酷胺酸 錄胺酸 纈草胺酸 酪胺酸 色胺酸 -17 - *装· •打. .線. 甲 4 (210X297 公沒） A6 _ B6 五、發明説明（） 將例1所生成之四肽混合物做一種測定，Η判嘶肽鏈抑 制人類免疫缺乏病毒（（HIV-1)天冬胺蛋白_水解蛋白活性 之能力。HIV-1複製循環的一個重要步驟為某些由病毒基 因姐所编碼的聚（多）蛋白產物之蛋白水解作用。蛋白質前 騸物經剪切形成反轉錄病毒生命遇期所需的成熟蛋白質。 因此，化合物的行為若是可抑制HIV-1蛋白_者便可能在 控制後天免疫不足症候群（AIDS)時扮演一種做為治療蕖爾 的重要角色。 每一 ί肽混合物测試前皆以二甲亞«(DMSO)稀釋，因而 測定時的總肽濃度約為15585微容《荑耳灌度（《Μ)。由於 每一混合物中皆為11132種獨特肽分子，測定時每一個別 四呔的濃度實質上為1.4微容積荑耳濃度。其结果和經或 未纆蛋白水解_處理之已切出的受質之控制量度做比較後 之抑酵素活性百分比做報告。如表2所示，數種四肽混合 物表現顯著的抑制蛋白_活性之能力。所具Ν —端殘基為 苯丙胺酸之四肽混合物可抑蛋白W活性103Χ，並經用於再 合成方法中，以便完全閜明具有所》察活性的特定肽鍵之 序列。然後以例1所述同姐的胺基酸以相同方法再合成Ν —端為苯丙胺酸之四肽分子，但第三偶合步驟後之三肽混 合物未混在一起因而產生第三偶合位置的胺基酸為已知之 三肽混合物。然後將每一三肽混合物與苯丙胺酸偁合Μ生 產22種其Ν —端丙丁胺基酸本身為已知的樹脂一偁合之四 呔混合物。如例1所述切出逭些四肽混合物並製備以供洒 定。四肽混合物在做蛋白_澜定前皆在DMSO中稀釋《。澜 18 (請先聞請背面之注意事項再填舄本页) .装. •打· ♦ 甲 4(210Χ297Χ 沒) 3ij4do7 A6 B6 五、發明説明（） 定液中缌呔鐽澹度為5, 〇60微容積莫耳瀰度，因此每一混 合物中506個獨特四呔分子的每一個濃度皆為10微容横莫 耳湄度。表2指出N_端為丙苯胺酸一異白胺酸之四肽混 合物可抑制蛋白_的活性68!«。 然後，本質上依照例1方法再合成N —端具苯丙胺酸一 異白胺酸之四肽鍵，但須娌如上之修飾以使N —端之3個 胺基酸序列為已知。將每一種皆含22個獨特的四肽分子之 四肽混合物共23種*每種皆如以前進行蛋白®測定。每種 拥定液之缌肽滬度皆為2 20微容積莫耳灌度，因此每一混 合物中的22種獮特的四肽分子每個澹度皆為10微容積g耳 濃度。如表2所指N —端具有苯丙胺酸一異白胺酸一 Sta 之四肽混合物可抑制蛋白酶的活性83%。 (請先Μ讀背面之注意事項再填窩本页) .装· •打· .綠· -19 - 甲4(210Χ 297乂发） 第3 gty專利申請栗 中文說明書修正頁（84年7月） A7 B7 五、發明説明（）

已知定義的四肽混合物之測定结果 KWN = nn m^i Bm *1--_ tn mff tm 一 d 1 - ! n^n ml I I 兔 i 一务 (請先閱讀背面之注意事項再填芎本頁) 經濟部中央橾準局員工消費合作杜印製 R知的箱某 KWN-X-X-X Phfi-KWN-X-X Phe- 11ρ -KWN-X Phft-Tlp-Sta-KWN 精胺酸 17 0 8 8 D-白胺酸 11 0 6 天冬胺酸 117 0 15 0 麩胺酸胺 58 0 18 0 組胺酸 8 0 21 0 異白胺酸 102 68.0 21 0 D-白胺酸 51 0 18 68 離肢酸 29 0 16 0 D-纈草胺酸 30 28 15 1 D-茏丙胺酸 57 23 15 43 苯丙胺酸 103 7 16 0 脯胺酸 9 0 17 0 83. 3. 10,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） Α7 304957 第Μ 1 045 14號專利申請案 中文說明書修正頁（8 4年7月>Β7 五、發明説明（ 年月曰 84. 7. 2 7 /V. ~Χ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 弄2墉h苜 已知定義的四狀混合物之測定结果 _= 已知的荈苺 K^N-X-X-X Phft-Kyw-x-x Phe-Ilfi-KyN-X Phe~I Ie~i 甲碲胺酸 96 5 19 0 绦胺酸 17 0 18 0 mmm 98 8 4 0 D-色胺酸 65 6 7 19 色胺酸 81 9 1 0 〇-雜胺_ 5 0 0 0 D-脯胺酸 68 0 21 0 D-駱胺酸 78 5 U 0 D-麩胺酸 78 0 15 9 D-天冬蔴胺 27 0 14 St.a 83.0 本® _h依 例子1方 法再合成每 一種N —端為苯丙胺酸 異白胺酸一 St a的22種四呔鐽並再做蛋白酶測定 。如表： 所元，具笼 丙胺酸一 異白P酸一 S 1·, a白胺酸之四 狀分子$ 抑制蛋白酶 活性最強 之四呔，可達68¾。 I {^水 訂 ^-^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐）

Claims (1)

1. 笔8U(U5U號專利由請案 A8 B8 由文由讀專利範圍修正太（86年3月） 六、申諸$·刺簸圍———— 304957 η «修予 86. 3. 0 5補无 公告A 1. 一種合成呔渴合物的方法，包括： (a)將固態支持樹脂分配成等量置於各反應容器内； (h)將各個獨特之胺基酸分別偁合至各容器内之樹脂； ⑵將各等量之偶合樹脂在單一容器内一起混合，則可產 生各個胺基酸之等箅耳混合物； (d)將該混合之樹脂偁合胺基酸分配成等量置於各反懕容 器内； ie>將各個獨特之胺基酸偶合至各容器内之樹脂偁合胺基 酸； *f >依铒要重複步驟（c>、td)及（e>而產生長度為2至δ個胺基 驗:之呔渴合物，該吠在蕞後一個偶合泣置有一其鑑定 性®為已知之胺基酸；以及（s)如箱要，可在每一混合 物中將呔分子自樹脂切出。 2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該產製得之肽之長 度為4。 3. 根撺申請專利範圍第1項之方法，其中該產製得之肽之長 度為5。 4 括 包 法 方 之 吠 性 活 高 定 鑑 種 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 ta)(b)(c) ;脂 内樹 器之 容内 應器 反容 各各 於至 置合 量偶 等別 成分 配酸 分基 脂胺 樹之 持特 支獨 態個 固各 將將 器 容物 | 合 簞混 在耳 脂Μ 樹等 合之0 as 之基 最胺 等個 各各 將生 產 可 y 貝 合 混 起 容 應 反 各 於 置 量 等 成 配 分 酸 基 胺 合 偶 脂 樹 之 合 混; 該内 將器 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS )人4規洛（2I0X297公釐） 304857 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 基 基定 合 是立綦 第 。 胺 胺鑑 的 但在胺 成 肽 合 個其 次 .及之 完 的 偶S8一 首tf)-份 此 知 脂 2有 成 至驟部 因 已 樹 為置 完 §步之 ， 全 之 度位 此 驟之列 定 完 内 長合 因 步開序·，测 列 器 生偶 ， 裡分肽合性 序 容 產@性 重及性偶活 成 各 而一 活 組合活置物 合 至 S 後 物 酸混為位生 於 合 及最 生 基箱定後次 致 偁(d)在；其 胺-不鑑最二 以 酸 、狀酸析 之驟中在第及驟 基(c)該*分 同步瓌物做M步 胺 琢，薛物 相成循合物.，之 之 步物之合 驟合成琨合環環 特 複合知混 步次合狀混循循 獨 重混已肽.，前 一 之各呔成成 0 要呔為一環如後行與一合合 各；箱之筲每循用最進基每次複 將_依驗性對成使在即酸對二* ie)(f)(g)thjluJ) 5. 根捸由請專利範圍第4項之方法，其中該產製得之狀之長 度為4。 6. 根撺申謫專利範圍第4項之方法，其中該產製得之狀之長 度為5。 *'- 「I- II --I 1 —I— H 丨^1 - I. - I —^1 ·1 (请先閲饋背面之注意事項再填寫本f > 經濟部中央標準局β；工消費合作.社印装 本紙張纽ϋ用巾ϋ國家梂準(CNS ) Α術Μ 210X297公釐）