CN1069735A - 肽模拟物的快速合成和筛选 - Google Patents

Abstract

公开了一种运用少量连接步骤快速合成极大量 肽类的方法，该方法可结合将这些异类混合物肽类进 行筛选的技术，以鉴别具有生物活性的特定肽类。

Description

建立了一种有关大量小分子肽的快速合成和筛选方法，其目的是获得一种模拟较大天然配体对酶和细胞受体的高键合亲和性和专一性的分子。具有这些特性的分子已被称作“模拟物”，有多种应用潜力。例如，模拟物作为治疗剂颇具吸引力，因为它们代表容易合成的分子。本方法给出了一种天然配体的系统性替代法的另一方法，该原替代法已证明既慢又困难，而且随机筛选与自然配体没有任何已知结构相似性的可能性很低。本方法能迅速同时生产比用传统固相合成方法所得到的数量多的肽类，也提供了一种易于测定和合成纯的具所希望活性的特定序列的方法。

本方法比先有技术有几点重要突破。运用相应的固相技术的几篇报道显示该原合成法实际上仅限于一次制造几百个肽，而本方法实际上提供了无数肽的合成方法。

近期其它运用固相技术在一个短时间内完成很大数量小分子肽的生产的报道公开了将氨基酸混合物连接到生长肽链上的方法，该方法需要调节混合物中氨基酸的浓度以解决氨基酸的不同相关连接比率问题，以便产生的肽类浓度相等。此外，该方法需要应用多种分析技术，用于测定具所期望活性的精确序列。本方法不同点在于在每一个连接步骤中仅以单个氨基酸或氨基酸组连接，消除了需解决不同氨基酸连接比率的问题，也保证了肽类以等摩尔数产生。本方法还可不经化学分析辨别纯的所需序列和后来的产品。

还有其它报道述及将随机合成的低聚核苷酸插入丝状噬菌体中。这种生物合成方法有产生百万小分子肽的潜力，然而只限于生产基因编码的氨基酸，所产生的肽类也只能是线性构型。本发明的方法生产的氨基酸包括D-氨基酸或其它被修饰的氨基酸和合成的支链序列，它们是重组DNA方法不可能得到的。

与先有技术相比，本方法最重要的也许是能估价肽类在没有基质树脂的干扰下与靶连接位点相互作用的能力。简言之，本发明能生产大量小分子肽类，也能容易地辨别具有所需活性的特定肽或肽类并生产这些纯的肽或肽类。

本发明公开了一种快速合成和筛选大量小分子肽类的方法。本发明用生产小分子肽混合物的方法提高了生产模仿天然配体对酶和受体具高键合亲和性和专一性的分子的能力。在自然过程中，在混合物中每一个位置上的每一种指定氨基酸的浓度及其每一种肽的浓度被保持接近于指定比例之内。本方法能生产肽类混合物，这些肽类混合物能在没有树脂基质存在下被试验，不失去快速鉴别具所需活性的特定肽或肽类的能力。肽类混合物由一系列在最后连接位置或在其它所述选定位置包含相同氨基酸的肽类组成，而所述肽类的其余位置是随机的不同氨基酸。为了本发明的目的，用本方法所制得的肽序列可以是线性的或支链的结构。

本发明包括一种合成大量混合物肽类的方法，包括：进行肽混合物的第一合成法，这些肽混合物中的每一个由n个氨基酸（或氨基酸组）组成，它是由n步合成所得到的，其中第一步包括分别将氨基酸或氨基酸组和固体支持树脂的等分试样连接，使达到完善程度，接下来的步骤各自包括充分混合连有氨基酸或氨基酸组的树脂等分试样，将该混合物等分，分别将每一氨基酸和氨基酸组与每一等分试样连接，使达到完善程度，如果需要，将每种混和物肽从树脂上切下，以得到在最后连接位置有已知氨基酸的各种肽混合物。

这种合成方法可与生物试验结合，以测定具有生物活性的特定肽或肽类的序列。这种结合的方法进一步包括：

A.进行每一肽混合物的生物活性的第一试验，由此完成第一合成周期。

B.使用与第一合成法中使用的相同的氨基酸或氨基酸组进行肽类的第二合成法，在n步连接步骤中，重复第一合成法的n-1步，在第n步，将第一试验中显示的具生物活性的肽混合物末端的氨基酸或氨基酸组与每一肽混合物连接使达到完善程度，如果需要，将每一混合物的肽类从树脂上切下，进行每一肽混合物生物活性的第二试验，以完成第二合成周期;以及

C.完成总共n次合成周期步骤以合成完全已知序列的肽。

应注意本发明包括能用相同的快速合成方法制造具有支链肽的肽类。以混合物形式制造出的这些支链分子也可进行活性试验，具有活性的特定单个分子或多个分子序列可由实际上与线性肽类相同的方式加以鉴定。

本发明中，说明书和权利要求中使用的术语和缩写词定义如下。

术语和缩写词：

AC-乙酰基

Bzl-苄基

o-Bzl-苄基酯

Bom-苄氧甲基

Tos-甲苯磺酰基（4-甲苯磺酰）

2Cl-z-2-氯苄氧羰基

2，6Cl-z-2，6-二氯苄氧羰基

2Br-z-2-溴苄氧羰基

X-一种未知氨基酸

这里L-氨基酸用三字母码表示其中第一字母大写，而D-氨基酸用均小写的标准三字母码表示。

本发明可用肽合成中常规使用的固相合成方法来进行。总的来说，最终相应于所生成肽的C-端氨基酸残基的氨基酸靠C-端残基的羧基和树脂基质上作为连接位点的特异功能基之间的共价键固定在一种不溶的支持树脂上。然后从连接在树脂上的C端氨基酸开始，通过连续连接到肽的N-端残基的氨基上的方法形成肽。如果有支链结构存在，则可能存在一个以上N-端残基。整个合成中，肽保持连接在树脂上，但一旦完整的肽序列形成，则可以从树脂上分开。

生产含有从2个到8个氨基酸或氨基酸组的肽类的方法是本发明优选的实施方案。

这种新方法基于反复混合、分开和连于树脂上的氨基酸或肽类的的连接。第一步需要将固体支持树脂分成具有相等数量连接位点的等分试样。接着分别将选定的氨基酸连接到每一等分试样上，使达到完善程度，每一等分树脂连接到不同的氨基酸上。结果每一等分试样树脂连接的氨基酸的摩尔数与其它连接不同的氨基酸的试样连接的摩尔数都是相等的。这些树脂被充分混合以获得连接在树脂上的氨基酸的等摩尔混合物。然后混合物再分成等分试样，接着进一步分别将选定的氨基酸连接到在每一等分试样中的连接在树脂上的氨基酸上。重复混合、隔分和连接各步骤，形成肽混合物，这里最后连接的氨基酸残基在给定混合物中的所有肽中均相同，但混合物中每一种肽其它位置的氨基酸残基代表了一种包括在给定连接步骤中的等摩尔选择氨基酸。

此外，单独一种氨基酸可在任一给定连接步骤中被连接，以使所有的合成肽在某一给定位置具有相同的氨基酸。此时，紧接连接步骤之前的隔分步骤和紧接连接步骤之后的混合步骤可以消除。这种方法产生如前的肽混合物，但其中最后连接位置和某一给定位置的氨基酸均是已知的。

该方法采用少数连接步骤产生适于进行生物学试验的极大量的肽类。其结果是可通过选定的氨基酸来制造各种可能的序列。例如，如果选用25种氨基酸进行肽类的合成，仅25步反应的两个连续周期的50个连接步骤之后就产生625种二肽;在三个反应周期的75个连接步骤之后产生15，625种三肽，在四个反应周期的100个连接步骤之后产生390，625种四肽，运用较大数量的连接步骤来生产较长的肽类将得到更大量的混合物肽类。

选定用来合成的氨基酸数量和种类从一个周期到下一个周期可以不同;可以不设想哪一个属最适宜的氨基酸来进行随机选择，也可以根据已知影响所需活性的特性选择某些特定氨基酸。

可用本方法完成的连接连接的数量仅受到本领域公知的肽的固相合成限制因素的影响。然而，须注意到在一个混合物中若增加肽的数目便减少了作为全部肽一部分的单个肽的含量。因此，当肽混合物的合成与如下所述的测定活性肽序列的生物学试验结合时，必须考虑试验灵敏度将由实际可进行的连接的数量所决定。这就是说，从或许大量过剩非活性混合成分的噪音上识别单个肽信号的检测能力将是一种对包含在混合物内的待试活性肽数量的限制因素。当一种检测法用于测定混合物中肽类活性时，在混合物中的肽类的溶解性也实际同样起到对可合成的肽的限制作用。

当生产肽类的方法与生物学试验结合时，可容易地鉴别混合物中具有活性的肽或肽类特定序列，接着以纯的形式生产。肽类在进行生物活性试验之前，可先从树脂上切下。从树脂上切下肽类消除了例如空间位阻之类的因素干扰肽类活性的可能性。然后肽类的混合物形式用于生物学检测试验。因为混合物中的每一种肽含有一个已知的氨基酸残基在最后连接位置，因此揭示混合物具有活性的检测方法必须要能识别该最后连接点的氨基酸残基。整个合成肽混合物和试验活性的过程被称作一个“合成周期”。

为了鉴别混合物中具明显活性的肽或肽类的特定序列，第一合成周期中被试验鉴定的混合物中的具有活性的所有肽被用相同的混合、隔分和连接步骤再合成，但在这第二合成周期中，在倒数第二步连接后肽类混合物不被混合。这样，对一个给定混合物来说，倒数第二步连接的氨基酸是已知的。然后将由前面合成周期的生物学活性试验鉴别的最后连接的氨基酸连接到每一混合物的肽上，以便在一个给定肽混合物中所有肽最后连接的二个氨基酸残基都是已知的。混合物再一次交付生物学试验，以鉴别显示活性的混合物。结果，测定出具明显活性的肽的两个氨基酸残基。再合成具有所希望活性肽混合物和再将混合物交付试验的方法被重复，从而鉴别每一合成周期的其它氨基酸残基，直到在混合物中发现的具活性的肽的序列被完全确定。

带有已连接在其上的氨基酸的起始树脂可由下述方法产生，也可从市场上购得。购得的已连接在树脂上的氨基酸代替了本发明概述中描述的第一合成连接步骤。除以单个氨基酸产生肽的方法外，以氨基酸组也能在任何或所有的连接步骤中连接。一个氨基酸组是一个已知序列的简单肽，能用本说明书中描述的方法进行连接。这样，多肽合成和筛选技术能被用于通过在N-端、C-端或这两端延长已知的肽序列的方法产生肽混合物，也能被用于鉴别所产生的具有活性的序列。此外，如已经提到的，用本方法制造的肽序列可以有支链构型。

用本领域公知的技术连接氨基酸以形成肽键。一种方法包括将氨基酸转化为衍生物，该衍生物带有羧基，使易于与肽片断的游离氨基反应。例如，可由保护的氨基酸与氯甲酸乙酯、氯甲酸苯酯、氯甲酸仲丁酯、氯甲酸异丁酯反应将氨基酸转化为混合酐。也可以将氨基酸转化为活性酯例如一种2，4，5，-三氯苯基酯、一种五氯苯基酯、一种五氟苯基酯、一种对硝基苯基酯、一种N-丁氧羰基酯（t-Boc），一种N-羟基琥珀酰亚胺酯或一种从1-羟基苯并三唑形成的酯。

另一种连接方法包括应用一种合适的连接试剂，例如N，N′-二环己基碳化二亚胺（DCC）或N，N′-二异丙基碳化二亚胺（DIC）。其它合适的连接试剂对本专业技术人员来说是显而易见的。参见Schroder和Lubke所著的“The  Peptides”第三章（Academic  Press，1965）和美国专利4，259，234。

必须认识到，在连接反应过程中每一种用于肽合成的氨基酸的α-氨基必须加以保护，以阻止与活性α氨基功能有关的付反应。也必须注意到，某些氨基酸含有活泼的侧链官能团（例如：巯基、ε-氨基、β-和γ-羧基、咪唑、胍基和羟基）;这些官能团在开始和后续的连接步骤中也必须保护起来。合适的保护基团是本领域熟知的。例如参见“Protective  Groups  in  Organic  CHemistry，”M.Mcomie，Ed.，Plenum  Press，N.Y.，1973和美国专利4，617，149。

选择一具体保护基团必须注意一定条件，一种α氨基保护基团必须使得α氨基在连接反应的条件下为隋性，在连接反应后必须易于除去，在所述除去条件下将不会除去侧链保护基，也不会改变肽片断的结构，当在紧接连接之前活化时该α-氨基保护基必须没有外消旋化的可能性。一个侧链保护基必须使得侧链官能团在连接反应的条件下为隋性，在除去α-氨基保护基的条件下必须稳定，如果必要在将不改变肽链的结构的条件下，一旦肽连接完时它必需易于除去。

肽合成中已知的有用的保护基团对除去它们的试剂的活性是不同的，这一点是本专业技术人员熟知的。例如，一些保护基团，象三苯甲基和2-（对二苯基基）异丙基氧羰基非常不稳定，能在温和条件下除去，其它保护基，象叔丁氧羰基，特戊氧羰基，金刚烷（adamantyl）氧羰基和对甲氧基苯甲氧羰基就不那么不稳定，需要中强酸象三氟乙酸、盐酸或乙酸中的三氟化硼才能除去。而其它保护基团象苯甲氧羰基、卤苯甲氧羰基、对硝基苯甲氧羰基、环烷氧基羰基和异丙氧羰基就更稳定，需要强酸如氢氟酸（HF）、氢溴酸或在三氟乙酸中的三氟乙酸硼才能除去。9-Fluoroenyl甲氧羰基（Fmoc）保护基也可使用，它易于被哌啶除去，在一定条件下不损害其它保护基。

一旦连接步骤完成，含保护基的肽可以从树脂基体上分离，所有保护基可被除去。分离反应和保护基团的除去可以同时完成也可分步完成。当树脂支持体是一种氯甲基化聚苯乙烯树脂时，将肽固定在树脂上的键是由C端部分的游离羧基和树脂基质上的许多氯甲基中的一个所形成的酯键。将会看到连接键能被这样的试剂断开，这些试剂已知具有断裂酯链和浸透树脂基体的能力。一种特别方便的方法是以液态的无水HF处理。这种试剂不仅从树脂上分离肽类，也可以除去所有保护基团。因此应用这种试剂将直接得到完全去保护的肽。当需要切下肽但不除去保护基时，含保护基的肽-树脂可进行甲醇解以给出含保护基的肽，其中C-端羧基被甲基化。该甲酯能在温和的，碱性条件下水解给出游离的C-端羧基。肽链上的保护基团能以强酸，象液体HF处理除去。与本发明类似的一种产生肽类特别有用的技术在Hui，K.Y.et  al.，1988，J.Med.Chem.31，1679-1686中被描述。

另一种从树脂上分离含有保护基的肽类的方法是进行氨解或以联氨处理。也将看到N-端α-氨基上的保护基可以优选在从树脂基体上分离含保护基团的肽类之前或同时除去。

熟练的技术人员会认识到，这里引入的方案可与任何已知固相化学技术一起使用或以氨基酸和衍生物进行各种组合来加以改进，生产任何长度和任何序列的肽，为了产生支链分子，氨基酸或氨基酸链可连接到主链上的一个残基存在的第二个氨基上。例如，象赖氨酸这类氨基酸能被连接到所有增长肽的某些普通位点上，以便一种氨基酸或氨基酸组可以连接到该氨基酸的第二个氨基上。此外，可合成具有两个或多个氨基的改性氨基酸以用作支链点。这些侧链能用合成线性分子所述相同的混合、隔分和连接的方法来延长。支链分子形成后，侧链保护基与用于制造第一侧链的那些保护基必定不同。例如，用t-Boc保护基在一条支链上。Fmoc保护基则在另一条支链上就能运用不同的条件和去保护试剂选择性控制不同支链。

许多自然产生的和非自然产生的氨基酸可以购得，它们有保护的和未经保护的两种形式，来源广泛。其它从市场上不能购得的氨基酸可以合成。所有本发明必须的试剂和材料除非特别指明，都是从Advanced  ChemTech（PO  Box  1403，Louisville，KY）或Applied  Biosystems（850  Lincoln  Center  Dr.，Foster  City，CA）获得。

本发明不依赖于任何检测生物活性的特定试验。能够识别肽类的任何所需活性的任何试验均能用作本方法的一部分，用来辨别和产生在混合物中的具所需活性的特定肽和肽类。普通试验可以包括受体一配体键合、免疫学反应性或酶活性作用。

实施例中所描述的技术和来源用作说明本发明的一种方式，而不构成对本发明的任何限制。

实施例1

C-端酰胺化的肽类运用一种RaMPS^TM（Dupont，549 Albany st.，Boston，MA）多肽合成装置在对甲基二苯甲胺（P-MBHA）树脂上被合成。所用氨基酸有t-Boc α-氨基保护基，侧链以下列方式保护：ASp（o-Bzl），Glu（o-Bzl），Ser（Bzl），His（Bom），Lys（2Cl-z），D-Tyr（2，6Cl-z），和Arg（Tos）。RaMPS^TM装置基本上是多功能的，这样一种真空装置能与大量聚丙烯反应容器同时连用，用于吸出溶剂和未连接的氨基酸之类的可溶性试剂。这些反应容器被称作弹壳，有一个控制真空装置应用的阀门和一个“聚弹丸（polyball）”，以便在处于吸出状况的弹壳中能使支持体树脂与任何相连的氨基酸和肽保持在一起，因而利于合成中的分离，洗涤、中和、去保护步骤。

22个弹壳中每一个装有0.2g  P-MBHA树脂，每克该树脂有约0.6mmols的胺连接位点。这些胺连接位点用在二甲基甲酰胺（DMF）中的10%的二异丙基乙胺（DIEA）中和。将列在表1中的每一种t-Boc-氨基酸四当量（4moles/mol树脂胺）溶解在1ml  DMF中，加入弹壳中，使每一弹壳装入一种不同的t-Boc-氨基酸。加入DMF中的0.5M  1-羟基苯并三唑（HOBt）四当量，接着加入四当量的二异丙基碳化二亚胺（DIC）到弹壳。将弹壳来回振摇60分钟，接着洗涤、中和、在相同的条件和浓度下再连接相同氨基酸。这第二步连接是必要的，以保证所有树脂上的连接位点都被连接。在用下一种氨基酸继续之前以茚三酮分析法检验连接反应的完全程度。以50%三氟乙酸（TFA）、5%茴香醚、45%二氯甲烷处理30分钟将t-Boc-氨基酸去保护。已连接的树脂从每一个弹壳除去，充分混合，产生一种混合物，该混合物连接在第一位置的氨基酸的摩尔数均相同，将该连接氨基酸的树脂混合物平分到23个弹壳中，列在表1中的22种t-Boc氨基酸加上转变态的t-Boc-氨基酸statine（Sta）被连接到该氨基酸混合物等分样中，即每等分样被一种不同的t-Boc-氨基酸连接。如前所述方法进行的这种连接产生23种肽混合物，其中每一种有22种不同的连接树脂的二肽，它们的N-端氨基酸残基是已知的。连接反应的二个周期产生506种单一二肽。在去保护之前再一次检验连接反应的完全程度。连接树脂的二肽从弹壳里移去，充分混合以产生二肽混合物，其中连接在每一位置上的每一氨基酸的摩尔数是相同的。

连接在树脂上的二肽平分到22个弹壳中，列在表1中的22种t-Boc-氨基酸被连接到二肽混合物等分样上，每一等分样连接一种不同的t-Boc氨基酸。除最后加入t-Boc-氨基酸以阻止可在去保护时发生的二酮基哌嗪的形成外，用前述方法进行的这种连接产生22种肽混合物，每一种有506种不同的连接树脂的三肽，其中的N-端氨基酸残基是已知的。连接反应的三个周期产生11，132种单一三肽。在去保护之前，再一次检验连接反应的完全程度。连接树脂的三肽从弹壳中移去，充分混合以产生三肽混合物，其中连接在每一位置上的每氨基酸的摩尔数是相同的。

该连接在树脂上的三肽混合物平分到22个弹壳中，将列在表1中的22种t-Boc-氨基酸连接到三肽混合物等分样上，每一等分样连接一种不同的t-Boc-氨基酸。按第一连接步骤所述的方法进行的这种连接产生22种肽混合物，其中每一种含有11，132种不同的连接树脂的四肽，它们的N-端氨基酸残基是已知的。连接反应的四周期产生244，904种单一的四肽。再次检验连接反应完全程度。这些四肽放入10当量乙酸、HOBt和DIC中保温2小时进行N-端残基的乙酰化。连有树脂的四肽从弹壳移去，不象前面的步骤一样，而是将这些在每一弹壳产生的肽混合物保持分离。因此，所有来自同一弹壳的四肽在N-端具有相同的氨基酸，但链中的所有其它残基则表示在给定步骤中连接的每一种等摩尔随机选择的氨基酸。因而，来自每一弹壳的四肽代表着每一可能序列的等摩尔混合物。这种可能序列由选择氨基酸来产生，同时保持N-端残基一致。

该四肽以二氯甲烷洗涤，室温干燥。在90%液态无水HF/5%对硫代甲酚/5%间甲酚中于0℃下处理70分钟将四肽从MBHA树脂上分离。这种处理也除去了所有侧链保护基。蒸馏除去HF，分离出的四肽在0℃下用50ml乙醚沉淀30分钟。用玻璃烧结漏斗收集分离出的四肽和失去效能的树脂，接着用乙醚4×20ml洗涤以沉淀出四肽。沉淀出的四肽溶解在50%乙酸/30%乙腈中，并过滤到园底烧瓶中。真空蒸馏除去约70%的体积，剩余的部分以水稀释，冷冻干燥。称量回收肽的干重，该混合物在分成小份等分样之前重新溶解在50%乙酸/30%乙腈中。

表1

L－氨基酸          D－氨基酸

精氨酸              丙氨酸

天冬氨酸            天冬酰胺

谷酰胺              谷氨酸

组氨酸              亮氨酸

异亮氨酸            赖氨酸

赖氯酸              苯丙氨酸

苯丙氨酸            脯氨酸

脯氨酸              色氨酸

蛋氨酸              酪氨酸

丝氨酸              缬氨酸

酪氨酸

色氨酸

实施例2

将实施例1中产生的四肽混合物加以分析以测定这些肽抑制人免疫缺损病毒（HIV-1）天冬氨酰基蛋白酶的蛋白水解活性的能力。HIV-1复制过程的关键一步是由病毒基因组编码的某些多蛋白产品的蛋白水解过程。前体蛋白被水解分裂，以形成逆转录病毒生命循环所必须的成熟蛋白。因此，那些可抑制HIV-1蛋白酶的化合物可在用作控制获得性免疫缺损综合症（AIDS）的治疗试剂上扮演重要角色。

试验之前，每一个四肽混合物在二甲亚砜（DMSO）中稀释，以使试验中总的肽浓度为约15，585μM。因为在每一混合物中有11，132个单一四肽，所以每一个单一的四肽在试验中的浓度实际上是1.4μM。结果用与蛋白水解酶处理过的或未处理过的裂解底物的空白测量相比的酶活性百分抑制率表示。如表2所示，几个四肽混合物显示了明显抑制蛋白水解活性的能力。N-端具有phe残基的四肽混合物能抑制蛋白酶活性103%，被选择来用于再合成过程，以便完全确定具明显活性的特定肽或肽类的序列。

除第三连接步骤后的三肽混合物不混合在一起以使三肽混合物中第三连接位置的氨基酸成分属已知外，用例1中所述的相同的方式和一套相同的氨基酸再合成在N-端具有phe残基的四肽，然后每一种三肽混合物与phe连接以产生22种连有树脂的四肽混合物，这些混合物在N端具有两个已知的氨基酸。这些四肽混合物用实施例1中所述的方法切下和配制以用于检测试验。在进行蛋白酶试验之前，这些四肽混合物每一个在DMSO中稀释。试验中肽的总浓度为5，060μM，以使混合物中的506种单一四肽的每一种的浓度为10μM。表2显示，在N-端具有phe-Ile的四肽混合物抑制68%的蛋白酶活性。

然后N-端具有phe-Ile的四肽基本上按照实施例1中的方法被再合成，但按上述的方法加以修改，以使在N-端的三种氨基酸序列已知。23种四肽混合物的每一种含有22种单一的四肽，每一种按前面的方法再进行蛋白酶试验。试验中肽的总浓度为220μM以使每种混合物中22种单一四肽的每一种的浓度为10μM。如表2所示，在N-端具有phe-Ile-Sta的四肽混合物抑制蛋白酶活性83%。

在N-端具有phe-Ile-Sta的22种四肽的每一种基本上按照实施例1的方法被再合成，并再进行蛋白酶试验。如表2所示，四肽phe-Ile-Sta-Leu是最有效的四肽，抑制蛋白酶活性68%。

Claims (10)

1、一种合成肽混合物的方法，包括：

进行肽混合物的第一合成法，其中每一种混合物由n个氨基酸或氨基酸组所组成，通过n步合成，其中的第一步包括将氨基酸或氨基酸组分别连接到固体支持树脂的等分样上，使达到完善程度；接下来的其它各个步骤包括充分混合连有树脂的氨基酸或氨基酸组各等分；将该混合物隔分成等量等分样，将氨基酸或氨基酸组分别连接到每个等分样上使达到完善程度，如果需要，将每一混合物肽从树脂上切下，以产生其每一成员的最后连接位置氨基酸均已知的肽混合物。

2、如权利要求1的方法，其中的n是2到8。

3、如权利要求1的方法，其中的n是4。

4、如权利要求1的方法，其中的n是5。

5、一种鉴别高活性肽的方法，包括：

A.进行肽混合物的第一合成法，其中每一种混合物由n个氨基酸或氨基酸组所组成，通过n步合成，其中的第一步包括将氨基酸或氨基酸组分别连接到固体支持树脂的等分样上使达到完善程度;接下来的其它各步合成包括充分混合连有树脂的氨基酸或氨基酸组等分样;将该混合物隔分成等量等分样，将氨基酸或氨基酸组分别连接到各等分样上使达到完善程度，如果需要，将每一种混合物肽从树脂上切开，以产生其每一成员的最后连接位置氨基酸已知的肽混合物;进行每一肽混合物的生物学活性第一试验，由此完成第一合成周期;

B.进行肽的第二合成法，用于第一合成法中n连接步骤每一步相同的氨基酸或氨基酸组，重复第一合成法的n-1步，而在第n步，将在第一试验中获知的肽混合物末端显示出生物活性的氨基酸或氨基酸组连接到每一种肽混合物上;如果需要，将每种混合物中的肽从树脂上切开;进行每一肽混合物生物学活性第二试验，由此完成第二合成周期;

C.完成合成周期各步骤共n次，以合成序列完全已知的肽。

6、如权利要求5的方法，其中的n是2到8。

7、如权利要求5的方法，其中的n是4。

8、如权利要求5的方法，其中的n是5。

9、如权利要求5的方法，其中的n是6。

10、如权利要求1的方法，其中产生的肽具有支链结构。