CZ287710B6 - Způsob přípravy peptidů s vysokou účinností - Google Patents

Abstract

Způsob rychlé přípravy velmi značného počtu peptidů, který se může spojit s vytříděním těchto peptidů jakožto heterogenní směsi k identifikaci specifických peptidů, které vykazují biologickou účinnost, za použití malého počtu kopulačních stupňů.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu rychlé přípravy a vytřídění velkého množství malých peptidů se záměrem produkce molekuly, která napodobuje vysokou afinitu vázání a vysokou specificitu větších přírodních ligandů pro enzymy a celulámí receptory. Takové molekuly se označují jako mimetika a může se jich používat pro nejrůznější účely. Například jsou lákavými terapeutickými činidly, jelikož představují snadno syntetizovatelné molekuly. Běžný proces představuje alternativní přístup k systematickému měnění přírodních ligand, což se ukázalo jako malý a obtížný a velmi málo pravděpodobný přístup ke statistickému vytřídění sloučenin, které nemají žádnou známou strukturální podobnost k přírodnímu ligandu. Vynález se týká způsobu, kteiý umožňuje rychlou současnou syntézu peptidů ve větším počtu, než se dosud dosáhlo běžným způsobem přípravy v pevné fázi a představuje způsob snadného stanovení a syntézy v čisté formě specifických sekvencí, které jsou spojeny s žádanou účinností.

Dosavadní stav techniky

Způsob podle vynálezu má četné přednosti ve srovnání se známými způsoby. Známé postupy, založen na srovnatelných způsobech s pevnou fází, vedou k prakticky omezenému počtu několika set současně připravených peptidů, zatímco se podle vynálezu mohou připravovat peptidy ve skutečně neomezeném počtu.

Podle jiných způsobuje možná příprava vysokého počtu malých peptidů v krátké době za použití technologie s pevnou fází kopulací směsi aminokyselin na rostoucí peptidové řetězce. Tento přístup vyžaduje regulaci koncentrace aminokyselin ve směsi na úkor rozlišení relativních kopulačních rychlostí aminokyselin, aby koncentrace vznikajících peptidů byla stejná. Kromě toho vyžaduje tento způsob četné analytické techniky ke stanovení přesné sekvence, která je zodpovědná za žádanou účinnost. Nynější způsob se liší tím, že se jednotlivá aminokyselina nebo skupiny aminokyselin kopulují při každém kopulačním stupni za vyloučení potřeby brát v úvahu různé kopulační rychlosti aminokyselin a zajišťovat produkci peptidů v ekvimolámích množstvích. Nynější způsob také umožňuje identifikaci žádané sekvence a následující produkci v čisté formě bez chemické analýzy.

Je také známo včleňovat statisticky syntetizované oligonukleotidy do vláknitého fágu. Tento biosyntetický způsob umožňuje výrobu milionů malých peptidů, které však musí být limitovány na geneticky zakódované aminokyseliny a které mohou mít toliko lineární konfiguraci. Způsob podle vynálezu umožňuje inkluzi D-aminokyselin nebo jinak modifikovaných aminokyselin a syntézu rozvětvených řetězových sekvencí, což nebylo možné za použití rekombinantních DNA způsobů.

Podstata vynálezu

Podstata způsobu přípravy peptidových směsí spočívá podle vynálezu v tom, že se nejdříve připravují peptidové směsi z až n aminokyselin nebo skupin aminokyselin n syntetickými stupni, přičemž první syntetický stupeň je založen na kopulaci ke kompletaci aminokyselin nebo skupin aminokyselin jednotlivě na alikvoty pevné nosičové pryskyřice a na přídavných stupních, z nichž každý sestává z důkladného promíšení alikvotů pryskyřice kopulované s aminokyselinami nebo se skupinami aminokyselin, na rozdělení směsi na stejné podíly, na kopulaci ke kompletaci aminokyselin nebo skupin aminokyselin jednotlivě na každý z alikvotů a popřípadě na odštěpení peptidů z pryskyřic v každé směsi, takže se připraví peptidové směsi, z nichž každá má známou aminokyselinu na poslední kopulované pozici.

-1 CZ 287710 B6

Pravděpodobně je nejdůležitější, že na rozdíl od známého stavu techniky umožňuje způsob podle vynálezu hodnotit schopnost peptidu vzájemně reagovat s vázacím místem štítu (terče) bez možné interference s nosičovou pryskyřicí. Vynález tedy umožňuje výrobu velkého počtu malých peptidu a snadnou identifikaci specifického peptidu nebo peptidů, což demonstruje jejich žádanou účinnost a jejich produkci v Čisté formě.

Vynález se týká způsobu rychlé přípravy a vytřídění velkého množství malých peptidů. Vynález podporuje možnost vyrábět molekuly, které napodobují vysokou vázací afinitu a specifícitu přírodních ligandů pro enzymy a receptory generováním směsí malých peptidů. Z povahy způsobu vyplývá, že koncentrace každé volené aminokyseliny v každé poloze směsi a tím koncentrace každého peptidu se udržují úzce v předem stanovených mezích. Způsob umožňuje přípravu peptidových směsí, které se mohou zkoušet ve stavu prostém nosiče bez ztráty schopnosti snadné identifikace specifického peptidu nebo specifických peptidů, které jsou zodpovědný za žádnou účinnost. Peptidové směsi se připravují ze řady peptidů, které obsahují běžnou aminokyselinu na posledním kopulačním místě a pravděpodobně na jiných expresivně volených místech, přičemž však všechny ostatní zbytky jsou statisticky voleny z odlišných aminokyselin. Pro účely vynálezu peptidových sled, vytvořený způsobem podle vynálezu, může vykazovat buď lineární nebo rozvětvenou strukturu řetězce.

Vynález se týká způsobu přípravy velkého počtu peptidů v peptidové směsi jak shora uvedeno. Tento způsob může být spojen s biologickou zkouškou ke stanovení sekvence určitého peptidu nebo určitých peptidů, které mají biologickou účinnost.

Tento integrovaný způsob dále zahrnuje:

A. provedení první zkoušky každé peptidové směsi se zřetelem na biologickou účinnost, čímž se doplňuje první syntetický cyklus.

B. provedení druhé syntézy peptidů za použití stejných aminokyselin nebo skupin aminokyselin jako v prvním stupni přípravy v každém z n kopulačních stupňů opakováním první syntézy v n-1 stupních a ve stupni n kopulování koncové skupiny nebo aminokyseliny, které se nachází v koncové poloze v peptidové směsi, která vykazuje biologickou účinnost při první zkoušce v případě každé peptidové směsi a popřípadě odštěpení peptidů od pryskyřic v každé směsi; provedení druhé zkoušky každé peptidové směsi se zřetelem na biologickou účinnost, čímž se doplňuje druhé kolo přípravy a

C. další opakování syntézy celkem n-krát, takže se připraví peptid s plně známou sekvencí.

Je třeba poznamenat, že vynález umožňuje připravovat peptidy s rozvětvenými postranními peptidovými řetězci stejně rychlým způsobem přípravy. Tyto rozvětvené molekuly, připravované jako směsi, se rovněž mohou zkoušet se zřetelem na účinnost a sekvenci specifické molekuly nebo molekul majících účinnost, která se může identifikovat v podstatě stejným způsobem, jako případě lineárních peptidů

V textu se používá následujících výrazů a zkratek:

Ac	- acetyl
Bzl	- benzyl
O-Bzl	- benzylester
Bom	- benzyloxymethyl
Tos	- tosyl[4-toluensulfonyl]
2C1-Z	- 2-chlorbenzyloxykarbonyl
2,6C1-Z	- 2,6-dichlorbenzyloxykarbonyl
2Br-Z	- 2-brombenzyloxykarbonyl
X	- aminokyselina, jejíž identita není známá

-2CZ 287710 B6

L-Aminokyseliny jsou zde indikovány velkými písmeny prvních písmen jejich standardního třípísmenového kódu a D-aminokyseliny jsou označovány malými písmeny jejich s standardního třípísmenového kódu.

Způsob podle předloženého vynálezu se provádí, jak je známo v peptidové syntéze za použití syntézy pevné fáze. Obecně aminokyselina, která odpovídá C-koncovému aminokyselinovému zbytku rezultujícího peptidu, je zakotvena na nerozpustné nosičové pryskyřici kovalentní vazbou, vytvořenou mezi karbonylovou skupinou C-koncového zbytku a specifickou funkční skupinou na pryskyřičné matici jakožto poloze vázání. Pak vytvořený peptid, počínající na C-koncové aminokyselině kopulované na pryskyřici, kopulací na aminokyselinu na N-koncovém zbytku peptidu je postupného řádu. Může být více než jeden koncový zbytek v případě rozvětvené struktury. Peptid zůstává vázán na pryskyřici v průběhu syntézy, může se však od pryskyřice odštěpit, jakmile se dosáhne kompletní peptidové sekvence.

Podle obzvlášť výhodného provedení vynálezu se připravují peptidy obsahující 2 až přibližně 8 aminokyselin nebo skupin aminokyselin.

Způsob podle vynálezu je založen na opakovaném míchání, dělení a kopulaci pryskyřice kopulované s aminokyselinami nebo peptidy. První stupeň vyžaduje dělení pevného pryskyřičného nosiče na alikvoty, mající stejný počet míst k vázání. Pak následuje kopulace ke kompletaci individuálně volených aminokyselin na každý alikvot, přičemž se každý alikvot pryskyřice kopuluje na odlišnou aminokyselinu. Pak je pryskyřice v každém alikvotu kopulovaná na stejné molámí množství aminokyseliny jako jiné alikvoty, které jsou kopulovány na odlišné aminokyseliny. Pryskyřice se důkladně promísí za vzniku ekvimolámí směsi aminokyselin kopulovaných na pryskyřici. Směs se pak rozdělí na stejné alikvoty, načež následuje další kopulace jednotlivě volených aminokyselin za vzniku pryskyřice kopulované s aminokyselinami v případě každého alikvotu. Postupným opakováním míšení, dělení a kopulace se získá směs peptidů, kde poslední aminokyselinový kopulovaný zbytek je stejný v případě všech peptidů v dané směsi, avšak aminokyselinové zbytky ve všech ostatních místech každého peptidu ve směsi představují ekvimolámí selekci aminokyselin, které jsou začleněny vdaném kopulačním stupni.

Při obměněném způsobu se může jednotlivá aminokyselina kopulovat v každém daném kopulačním stupni, takže všechny syntetizované peptidy mají tutéž aminokyselinu v dané poloze. V takovém případě se stupeň dělení bezprostředně předcházející kopulaci a stupeň míšení, bezprostředně následující po kopulaci, mohou vynechat. Tak se získá peptidová směs, jak shora uvedeno, která má však identitu aminokyseliny v dané poloze, kromě rovněž známé aminokyseliny v poslední poloze.

Tímto způsobem je možno připravit velké množství peptidů ve vhodných množstvích pro biologickou zkoušku za použití malých množství kopulačních stupňů. Proto se mohou připravit všechny možné připravitelné sekvence z použitých zvolených aminokyselin. Jestliže se například pro přípravu peptidů zvolí 25 aminokyselin, připraví se 625 dipeptidů po pouze 50 kopulačních stupních ve dvou postupných sledech 25 reakcí; 15 625 tripeptidů se připraví po 75 kopulačních stupních ve třech sledech reakcí a 390 625 jedinečných tetrapeptidů se připraví po pouze 100 kopulačních stupních ve čtyřech sledech reakcí. Za použití většího počtu kopulačních stupňů pro výrobu delších peptidů, bude výsledkem i větší počet peptidů ve směsi.

Počet a typ aminokyselin, zvolených pro použití při syntéze se může měnit od jednoho sledu ke druhému a může odrážet statistickou volbu bez jakékoliv presumpce o tom, která aminokyselina je nejvhodnější nebo může zahrnovat zvláštní volbu aminokyselin na základě jejich známých charakteristik k dosažení žádané účinnosti.

-3CZ 287710 B6

Počet následných kopulací, které je možno provádět při způsobu podle vynálezu je dán toliko známými faktory v oboru, souvisejícími s mezemi syntézy peptidů v pevné fázi. Připomíná se však, že vzrůstající počet peptidů ve směsi snižuje množství každého peptidu jakožto frakce celkové koncentrace peptidu. Jestliže je proto syntéza peptidové směsi integrována s biologickou zkouškou ke stanovení sekvence aktivního peptidu, jak dále popsáno, je třeba uvažovat citlivost zkoušky při rozhodování o počtu kopulací, které lze provést. To znamená, že schopnost zkoušky poznat signál účinnosti třeba jednotlivého peptidu v „šumu“ velkého nadbytku neúčinných složek směsi je omezujícím faktorem počtu peptidů, které mohou být obsaženy ve směsi, která se zkouší se zřetelem na účinnost. Rozpustnost peptidů ve směsi rovněž naráží na stejnou úvahu praktického omezení peptidů, které se mohou syntetizovat, jestliže se používá zkoušky zjišťování účinnosti peptidů ve směsi.

Jestliže se způsob přípravy peptidů kombinuje s biologickou zkouškou, identifikuje se snadno specifická sekvence peptidu nebo peptidů ve směsi mající účinnost a následně se produkuje v čisté formě. Peptidy se mohou nejdříve odštěpit od pryskyřice a pak se zkouší jejich biologická účinnost. Odštěpení peptidů od pryskyřice vylučuje možnost interference s účinností peptidů v důsledku takových faktorů, jako je například sterická zábrana. Peptidy se pak jakožto směsi podrobují biologické zkoušce. Jelikož každý peptid ve směsi má známý aminokyselinový zbytek v poslední kopulované poloze, zkouška, která odhalí směs mající účinnost, nutně identifikuje aminokyselinový zbytek na poslední kopulované poloze. Celý postup syntetizování peptidové směsi a zkoušení účinnosti se označuje jako „syntetický cyklus“ („synthetic cycle“).

Pro identifikaci specifické sekvence peptidu nebo peptidů ve směsi, které jsou nositeli pozorované účinnosti, se všechny peptidy směsi mající účinnost, stanovenou zkouškou při? prvním syntetickém cyklu, znova syntetizují stejným míšením, dělením a kopulací, avšak při tomto druhém syntetickém cyklu se peptidové směsi nemísí po předposlední kopulaci. Pak je: známa identita předposlední kopulované aminokyseliny pro danou směs. Identifikuje se poslední kopulovaná aminokyselina biologickou zkouškou předešlého syntetického cyklu se pak kopuluje na peptidy každé směsi, takže je známa identita posledních dvou aminokyselinových zbytků pro všechny peptidy dané peptidové směsi. Směsi se opět biologicky zkouší pro zjištění směsi, která má účinnost. Je tedy známa identita dvou aminokyselinových zbytků peptidu, který má zjištěnou; účinnost. Způsob opětné syntézy peptidové směsi mající žádanou účinnost a zkoušení směsi se opakují, čímž se identifikuje další aminokyselinový zbytek v každém syntetickém cyklu až do plného objasnění sekvence peptidu, který má ve směsi zjištěnou účinnost.

Výchozí pryskyřice se mohou připravovat, jak dále popsáno, nebo se mohou získat z obchodních zdrojů již s konjugovanými aminokyselinami. Aminokyseliny, které se kupují ve formě již kopulované s pryskyřicí, nahrazují první kopulační stupeň způsobu podle vynálezu. Vedle způsobu pro výrobu peptidů z jednotlivých aminokyselin se může skupina aminokyselin kopulovat ve kterémkoliv nebo ve všech kopulačních stupních. Skupina aminokyselin je jednoduše peptid známé sekvence, který se může kopulovat způsobem podle vynálezu. Proto se může používat mnohočetné peptidové syntézy a techniky třídění pro přípravu peptidových směsí prodlužováním známých peptidových sekvencí na koncovém dusíku nebo na koncovém uhlíku nebo jak na koncovém dusíku tak na koncovém uhlíku a může se identifikovat získaná sekvence, která vykazuje účinnost. Kromě toho, jak shora uvedeno, mohou mít sekvence, připravené tímto způsobem, rozvětvenou konfiguraci.

Aminokyseliny se kopulují o sobě známými způsoby pro vytváření peptidových vazeb. Jeden způsob je založen na převádění aminokyseliny na derivát, jehož karboxylová skupina je mnohem citlivější na reakci s volnou N-koncovou aminoskupinou peptidového fragmentu. Například se může aminokyselina převádět na směsný anhydrid reakcí chráněné aminokyseliny s ethylchlorformátem, fenylchlorformátem, se sek.-butylchlorformátem nebo s isobutylchlorformátem. Nebo se aminokyselina může převádět na aktivní ester, jako je například 2,4, 5-trichlorfenylester, pentachlorfenylester, pentafluorfenylester, p-nitrofenylester, N-butyloxykarbonylester (t-Boc), N-hydroxysukcinimidester a ester vytvořený z 1-hydroxybenzotriazolu.

-4CZ 287710 B6

Jiný kopulační způsob je založen na použití vhodného kopulačního činidla, jako je například Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimid (DCC) a Ν,Ν'-diisopropylkarbodiimid (DIC). Pracovníci v oboru znají další vhodná kopulační činidla (Schroder a Lubke, The Peptides, Academie Press, 1965, kapitola III a americký patentový spis číslo 4 249234).

Je známo, že každá α-aminoskupina každé použité aminokyseliny, používané při syntéze peptidů, musí být při kopulační reakci chráněna, aby se předešlo vedlejším reakcím reaktivní α-aminokyselinové skupiny. Je také známo, že určité aminokyseliny obsahují reaktivní vedlejší funkční skupiny (jako je například skupina sulfhydrylová, epsilon-aminoskupina, β- a γ-karboxylová skupina, imidazolová skupina, guanidinoskupina a hydroxylová skupina) a že takové funkční skupiny musejí být rovněž chráněny v průběhu počátečních a následných kopulačních stupňů. Takové vhodné chránící skupiny jsou v oboru známy (například Protective Groups in Organic Chemistry - „Chránící skupiny v organické chemii“ - M. McOmie, vyd., Plenům Press, N.Y., 1973 a americký patentový spis číslo 4 617149).

Při volbě určité chránící skupiny je třeba dbát na určité podmínky. Skupina, chránící a-aminoskupinu jí musí dodávat netečnost za podmínek při kopulační reakci, taková chránící skupina musí být snadno odstranitelná po kopulační reakci za podmínek, při kterých se neodstraní chránící skupiny z vedlejšího řetězce a za kterých se nemění struktura peptidového fragmentu a skupina, chránící α-aminoskupinu musí eliminovat možnost racemizace po aktivaci bezprostředně před kopulací. Skupina, chránící vedlejší řetězec, musí zajišťovat netečnost vedlejšího řetězce za podmínek kopulační reakce, musí být stálá za podmínek odstraňování chránící skupiny z α-aminoskupiny a musí být popřípadě snadno odstranitelná po kompletaci peptidu za podmínek, které nemění strukturu peptidového řetězce.

Pracovníkům v oboru je známo, že známé chránící skupiny, použitelné pro syntézu peptidů, mají různou reaktivitu k činidlům, používaným k jejich odštěpení. Například určité chránící skupiny, jako skupina trifenylmethylová a 2-(p-bifenyl)-isopropyloxykarbonylová, jsou velmi labilní a lze je odštěpit za mírných podmínek. Jiné chránící skupiny, jako je skupina terc.-butyloxykarbonylová, ter.-amyloxykarbonylová, adaman-tyloxykarbonylová a p-methoxybenzyloxykarbonylová, jsou méně labilní a vyžadují středně silné kyseliny, jako je kyselina trifluoroctová, chlorovodíková, trifluorid boru v kyselině octová, pro své odstranění. Opět jiné chránící skupiny, jako je například skupina benzyloxykarbonylová, halogenbenzyloxykarbonylová, p-nitrobenzyloxykarbonylová, cykloalkyloxykarbonylová a isopropyloxykarbonylová skupina, jsou ještě méně labilní a vyžadují silnější kyseliny, jako je například fluorovodíková kyselina, kyselina bromovodíková a trifluoracetát v trifluoroctové kyselině, pro své odstranění. Rovněž se mohou použít jako skupiny chránící skupina 9-fluorethylmethyloxykarbonylová (Fmoc) skupina, která se snadno odstraňuje piperidinem za podmínek, které ponechávají ostatní chránící skupiny nedotčené.

Po ukončení kopulačních stupňů se chráněný peptid může odštěpit od pryskyřičného nosiče a všechny chránící skupiny se mohou odstranit. Reakce odštěpení a odstranění chránících skupin se mohou provádět současně nebo postupně. Pokud je pryskyřičným nosičem chlormethylovaná polystyrénová pryskyřice, vazba zakotvující peptid na pryskyřicí je esterovou vazbou, vytvořenou mezi volnou karboxylovou skupinou C-koncového podílu a jednou z četných chlormethylových skupin pryskyřičné matrice. Je známo, že se zakotvující vazba může rozštěpit činidly, o kterých je známo, že štěpí esterovou vazbu a penetrují do pryskyřičné matrice. Obzvláště vhodným způsobem je zpracování kapalným bezvodým fluorovodíkem. Toto reakční činidlo nejen odštěpí peptid od pryskyřice ale odstraní také všechny chránící skupiny. Proto je použití tohoto činidla přímo žádoucí pro přípravu peptidu plně prostého chránících skupin. Pokud je žádoucí odštěpit peptid bez odstranění chránících skupin, může se systém chráněný peptidpryskyřice podrobovat methanolyze, čímž se získá chráněný peptid, ve kterém je C-koncová karboxylová skupina methylována. Methylester se pak může hydrolyzovat za mírných, alkalických podmínek, čímž se získá volná C-koncová karboxylová skupina. Chrániči skupiny na

-5CZ 287710 B6 peptidovém řetězci se pak mohou odstranit zpracováním silnou kyselinou, jako je například kapalný fluorovodík. Obzvláště užitečný způsob pro přípravu peptidů, podobných jako podle vynálezu, popsal Hui K. Y. a kol., 1988, J. Med. Chem. 31, str. 1679 až 1686.

Jiný způsob pro oddělení chráněného peptidu od pryskyřice je amonolýza nebo zpracování hydrazinem. Je také známo, že chránící skupina na N-koncové α-aminokyselinové skupině se může odstranit výhodně před oddělením nebo současně s oddělením chráněného peptidu od pryskyřičného nosiče.

Pracovníkům v oboru je jasné, že se zde uvedeného schéma může použít v případě jakékoliv chemie pevné fáze známé nebo vyvinuté se všemi kombinacemi aminokyselin a deriváty pro výrobu peptidů jakékoliv délky nebo sekvence. Pro vytvoření rozvětvených molekul se mohou aminokyseliny nebo řetězce aminokyselin kopulovat na druhou aminoskupinu, která je na zbytku prvního řetězce. Například aminokyseliny, jako lysin, se mohou kopulovat v některém bodu společném pro všechny rostoucí peptidy tak, aby aminokyselina nebo skupina aminokyselin mohly být vázány na sekundární aminoskupinu, která je na aminokyselině.

Nebo se mohou syntetizovat modifikované aminokyseliny, aby měly dvě nebo několik aminoskupin, takže aminokyselina může sloužit jako bod větvení. Toto postranní větvení se pak může prodlužovat stejným míšením, dělením a kopulací, jako je popsáno pro lineární molekuly. Jestliže se připravují větvené molekuly, musí být chránící skupiny postranních skupin jiné než chránící skupiny, použité pro výstavbu první větve. Například použití t-Boc chránících skupin na jedné větvi a Fmoc chránících skupin na jiné větvi umožňuje selektivní manipulaci s odlišnými větvemi za použití různých podmínek a činidel odstraňujících chránící skupiny.

Mnohé přírodně se vyskytující a přírodně se nevyskytující aminokyseliny jsou obchodně dostupné, jak ve chráněné, tak v nechráněné formě, z nejrůznějších zdrojů. Jiné aminokyseliny, které nemusí být obchodně dostupné, se mohou syntetizovat. Všechna činidla a materiály nutné pro provádění způsobu podle vynálezu jsou dostupné u společnosti Advanced ChemTech (P.O. Box 1403, Louisville, KY) nebo Applied Biosystems (850 Lincoln Center Dr., Foster City CA), pokud není jinak uvedeno.

Vynález není vázán na žádnou specifickou zkoušku biologické účinnosti. Může se použít jakékoliv zkoušky vhodné pro rozpoznání jakékoliv žádané účinnosti peptidů, jakožto součásti procesu identifikace a přípravy specifického peptidu nebo peptidů v peptidové směsi, který je nositelem žádané účinnosti. Běžné zkoušky mohou zahrnovat vázání receptor-ligand, imunologickou reaktivitu nebo vliv na účinnost enzymu.

Následující příklady praktického provedení vynález objasňují, nijak jej však neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntetizují se C-koncové amidatované peptidy na p-methyl-benzhydrylaminové (p-MBHA) pryskyřici za použití aparatury RaMPS™ (DuPont, 549 Albany St., Boston, MA) pro syntézu mnohačlenného peptidu. Použité aminokyseliny mají α-aminoskupiny chráněné t-Boc a postranní řetězce jsou chráněny následujícím způsobem: Asp (O-Bzl), Glu (O-Bzl), Ser (Bzl), His (Bom), Lys (2C1-Z), D-Tyr (2,6C1-Z) a Arg (Tos). Aparatura RaMPS™ je v zásadě upravena tak, že se vakuum může současně aplikovat pro četné reakční polypropylenové nádoby k nasávání rozpouštědel a rozpustných reagencií, jako jsou nekopulované aminokyseliny. Tyto reakční nádoby ukončené zásobníky, mají ventil pro řízení aplikace vakua a „polyball“, ve kterém je nosičová pryskyřice spolu s každou kopulovanou aminokyselinou nebo s každým

-6CZ 287710 B6 peptidem v zásobníku po nasátí, čímž se usnadňuje oddělování, promývání, neutralizace a odstraňování chránících skupin při syntéze.

Dvacet dva zásobníků obsahuje vždy 0,2 g p-MBHA pryskyřice mající přibližně 0,6 mmol poloh k vázání aminu na 1 g pryskyřice. Polohy k vázání aminu se neutralizují 10% diisopropylethylaminem (DIEA) v dimethylformamidu (DMF). Rozpustí se 4 ekvivalenty (4 mol/m piyskyřičného aminu) každé t-Boc-aminokyseliny podle tabulky Iv 1 ml dimethylformamidu a vnesou se do zásobníku, přičemž každý zásobník obsahuje odlišnou t-Boc-aminokyselinu. Pak se přidají 4 ekvivalenty 0,5 M 1-hydroxybenzotriazolu (HOBt) v dimethylformamidu do zásobníků a pak 4 ekvivalenty diisopropylkarbodiimidu (DIC). Zásobníky se kolébají konec nad koncem po dobu 60 minut, pak následuje promytí, neutralizace a rekuplování s toutéž aminokyselinou za stejných podmínek a zkoncentrování. Tato druhá kopulace je nutná, aby se zajistilo, že všechny polohy pryskyřice jsou kopulovány. Úplnost proběhnutí kopulační reakce se zkouší ninhydrinovou analýzou před pokračováním s další aminokyselinou. t-Boc-aminokyseliny se zbavují chránících skupin 30 minutovým zpracováním systémem 50 % kyseliny trifluoroctové (TFA), 5 % anisolu a 45 % methylenchloridu. Kopulované pryskyřice se vyjmou z každého zásobníku a důkladně se promísí, čímž se získá směs, kde molámí množství každé kopulované aminokyseliny v první poloze je stejné.

Směs pryskyřice-kopulovaná aminokyselina se rozdělí rovnoměrně do 23 zásobníků. Pak se kopuluje 22 t-Boc-aminokyselin podle tabulky I plus přechodový stav t-Boc-aminokyseliny statin (Sta) na alikvoty aminokyselinové směsi, přičemž se každý alikvot kopuluje s odlišnou t-Boc-aminokyselinou. Touto kopulací, prováděnou jak shora uvedeno, se získají směsi 23 peptidů, z nichž každá má 22 různých systémů pryskyřice-kopulované dipeptidy, přičemž N-koncový aminokyselinový zbytek je znám. Dvěma cykly kopulačních reakcí se získá 506 jedinečných dipeptidů. Před odstraněním chránících skupin se pak zkouší dokonalost proběhnutí kopulačních reakcí. Systémy pryskyřice-kopulované dipeptidy se pak vyjmou ze zásobníků a důkladně se promísí, čímž se získají směsi dipeptidů, přičemž molámí množství každé kopulované aminokyseliny v každé poloze je stejné.

Systém pryskyřice-kopulovaný dipeptid se rovnoměrně rozdělí do 22 zásobníků. Pak se kopuluje 22 t-Boc-aminokyselin, uvedených v tabulce I na alikvoty dipeptidové směsi,přičemž se každý alikvot kopuluje s odlišnou t-Boc-aminokyselinou. Tato kopulace, prováděná jak shora popsáno s tou výjimkou, že se t-Boc-aminokyselina přidává naposled k předcházení vzniku diketopiperazinu, k čemuž může dojít po odstranění chránící skupiny, vede k 22 peptidovým směsím, z nichž každá má 506 odlišných systémů piyskyřice-tripeptid, přičemž N-koncový aminokyselinový zbytek je znám. Tři cykly kopulační reakce vedou k 11 132 jedinečným tripeptidům. Před odstraněním chránící skupiny se opět zkouší dokonalost proběhnutí kopulační reakce. Systém pryskyřice-tripeptidy se vyjme ze zásobníků a důkladně se promísí, čímž se získají tripeptidové směsi, kde molámí množství každé aminokyseliny kopulované v každé poloze, je stejné.

Směs systému pryskyřice-kopulovaný tripeptid se rozdělí rovnoměrně do 22 zásobníků. Na alikvoty tripeptidové směsi se pak kopuluje 22 t-Boc-aminokyselin podle tabulky I, přičemž se každý alikvot kopuluje na odlišnou t-Boc-aminokyselinu. Touto kopulací, prováděnou stejně jako první kopulace, se získá 22 peptidových směsí, z nichž každá zahrnuje 11 132 odlišných systémů pryskyřice-kopulovaný tetrapeptid, kde je N-koncový aminokyselinový zbytek znám. Čtyři cykly kopulačních reakcí se získá 244 904 jedinečných tetrapeptidů. Přezkouší se dokonalost proběhnutí kopulačních reakcí. Tetrapeptidy se inkubují po dobu dvou hodin v 10 ekvivalentech kyseliny octové, HOBt a DIC k acetylaci N-koncového zbytku. Na pryskyřici kopulované acetylované tetrapeptidy se vyjmou ze zásobníků avšak, na rozdíl od předešlých stupňů, se směsi, produkované v každém zásobníku, zdržují odděleně. Proto mají všechny tetrapeptidy ze společného zásobníku stejnou N-koncovou kopulovanou aminokyselinu avšak všechny ostatní zbytky řetězce představují statické ekvimolámí selekce každé z aminokyselin kopulovaných v daném stupni. Tak představují tetrapeptidy z každého zásobníku ekvimolámí

-7 CZ 287710 B6 směs každé možné sekvence, která se mohla vyrobit se zvolenými aminokyselinami za konstantního N-koncového zbytku.

Tetrapeptidy se promyjí dichlormethanem a vysuší se při teplotě místnosti. Tetrapeptidy se pak odštěpí od MBHA pryskyřice v systému 90 % kapalného bezvodého fluorovodíku, 5 % p-thiokresolu a 5 % m-kresolu při teplotě 0 °C v průběhu 70 minut. Toto zpracování také odstraní všechny chránící skupiny vedlejších řetězců. Fluorovodík se oddestiluje a odštěpené tetrapeptidy se vysrážejí 50 ml diethyletheru v průběhu 30 minut při teplotě 0 °C. Použije se nálevky ze slinutého skla ke shromáždění odštěpených tetrapeptidů a odpadní pryskyřice, promyje se 4 ^x 20 ml diethyletheru k vysrážení tetrapeptidů. Vysrážené tetrapeptidy se rozpustí v systému 50 % kyseliny octové/30 % acetonitrilu a roztok se zfiltruje do baňky s kulatým dnem. Odstraní se přibližně 70 % objemu vakuovou destilací a zbylý podíl se zředí vodou a lyofilizuje se. Stanoví se suchá hmotnost získaného peptidu a směsi se opět rozpustí v systému 50 % kyseliny octové/30 % acetonitrilu před rozdělením na malé alikvoty.

Tabulka I

L-aminikyseliny	D-aminokyseliny
arginin	alanin
asparagová kyselin	asparagin
glutamin	glutamová kyselina
histidin	leucin
isoleucin	lysin
lysin	fenylalanin
fenylalanin	prolin
prolin	tryptofan
methionin	tyrosin
serin	valin
tyrosin
tryptofan

Příklad 2

Tetrapeptidová směs, připravená způsobem podle příkladu 1, se zkouší se zřetelem na schopnost peptidů inhibovat proteolytickou účinnost viru lidské imunodeficience (HIV-1) asparagylové proteázy. Kritickým stupněm replikačního cyklu HIV-1 je proteolytické zpracování určitých polyproteinových produktů, které jsou zakódovány virovým genome. Prekursorové bílkoviny se štěpí za vzniku zralých bílkovin nutných pro retrovirální životní cyklus. Proto sloučeniny, které inhibují HIV-1 proteázu, mohou mít významný úkol jakožto terapeutické prostředky při ošetřování získaného syndromu imunodeficience (AIDS).

Terapeutické směsi se vždy zředí dimethylsulfoxidem (DMSO) před zkouškou, takže při zkoušce je celková koncentrace peptidu přibližně 15 585 μΜ. Jelikož každá směs obsahuje 11 132 jedinečných tetrapeptidů, podílí se na zkoušce 1,4 μΜ každého jednotlivého tetrapeptidů. Výsledky se uvádějí jakožto procento inhibice enzymové aktivity ve srovnání s kontrolním měřením odštěpeného substrátu a neošetřeného proteolytickým enzymem. Jak je zřejmé z tabulky II, některé směsi tetrapeptidů vykazují významnou schopnost inhibovat proteolytickou účinnost. Tetrapeptidová směs, která má N-koncový zbytek Phe, inhibuje proteázovou aktivitu 103 % a volí se pro proces opětné syntézy k plnému objasnění sekvence specifického peptidu nebo specifických peptidů, které jsou zodpovědné za pozorovaný účinek.

Tetrapeptidy, které mají N-koncový Phe zbytek se pak znova syntetizují stejným způsobem a za použití stejného sledu aminokyselin, jako popsáno v příkladu 1 s tou výjimkou, že po třetím

-8CZ 287710 B6 kopulačním stupni se tripeptidové směsi navzájem nesmísí, za vzniku tripeptidových směsí, kde identita aminokyseliny v třetí kopulované poloze je známa. Každá tripeptidová směs se pak kopuluje s Phe za vzniku 22 směsí pryskyřice-kopulovaný tripeptid, který má dvě aminokyseliny na N-konci, jejichž identita je známa. Tyto tetrapeptidové směse se pak odštěpí a připraví se pro zkoušku, popsanou v příkladu 1. Tetrapeptidová směs se zředí vždy v dimethylsulfoxidu před zkouškou na proteázu. Celková koncentrace peptidu je 5060 μΜ při zkoušce, takže každý z 506 jedinečných tetrapeptidů je obsažen ve směsi 10 μΜ. V tabulce II se uvádí, že tetrapeptidová směs, mající N-koncový Ple-Ile vykazuje inhibiční činnost 68 %.

Tetrapeptidy, které mají N-koncový Phe-Ile se pak znova syntetizují v podstatě stejně jako podle příkladu 1 za modifikace, jak shora popsáno, takže je známa sekvence tří koncových aminokyselin. Každá ze 23 tetrapeptidových směsí, obsahující vždy 22 jedinečných tetrapeptidů, se pak opět zkouší na proteázu, jak shora popsáno. Celková koncentrace peptidu při zkoušce je 220 μΜ, takže každý z 22 jedinečných tetrapeptidů je v každé směsi obsažen ve množství 10 μΜ. Jak je zřejmé z tabulky II, inhibují tetrapeptidové směsi s N-koncovým Phe-Ile-Sta proteazovou aktivitu 83 %.

Tabulka II

Výsledky zkoušek definovaných tetrapeptidových směsí
KWN = známý zbytek	KWN-X-X-X	Phe-KWN-X-X	Phe-Ile-KWN-X	Phe-Ile-Sta-KWN
Arg	17	0	8	8
Ala	11	0		6
Asp	117	0	15	0
Gin	58	0	18	0
His	8	0	21	0
Ile	102	68,0	21	0
Leu	51	0	18	68
Lys	29	0	16	0
Val	30	28	15	1
Phe	57	23	15	43
Phe	103	7	16	0
Pro	9	0	17	0
Met	96	5	19	0
Ser	17	0	18	0
Tyr	98	8	4	0
Trp	65	6	7	19
Trp	81	9	1	0
Lys	5	0	0	0
Pro	9	0	21	0
Tyr	68	5	14	0
Glu	78	0	15	9
Asn	27	0	17
Sta			83,0

Každý z 22 tetrapeptidů s N-koncovým Phe-Ile-Sta se znova syntetizuje v podstatě v podstatě stejně jako podle příkladu 1 a znova se zkouší na proteázu. Jak je zřejmé z tabulky II, tetrapeptid Phe-Ile-Sta-leu je nejúčinnějším tetrapeptidem, inhibujícím proteázovou účinnost 68 %.

-9CZ 287710 B6

Průmyslová využitelnost

Způsob rychlé syntézy velkého množství peptidů, který se může spojit s vytříděním těchto peptidů jakožto heterogenních směsí k identifikaci specifických peptidů, které mají biologickou účinnost za použití malého počtu kopulačních stupňů.

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob přípravy peptidů s vysokou účinností, vyznačující se tím, že sestává z následujících kroků

   A. provádí se první syntéza směsi peptidů, z nichž každý je tvořen až n aminokyselinami nebo skupinami aminokyselin, n syntetickými stupni, z nichž prvním syntetickým stupněm je kopulace ke kompletaci aminokyselin nebo skupin aminokyselin individuálně na alikvoty pryskyřičného pevného nosiče a dalšími stupni je důkladné promísení alikvotů systému pryskyřice-kopulované aminokyseliny nebo skupiny aminokyselin, rozdělení směsi na stejné alikvoty, kopulace ke kompletaci aminokyselin nebo skupin aminokyselin individuálně na každý z alikvotů a popřípadě odštěpení peptidů od pryskyřice v každé směsi, takže se připravují peptidové směsi, jejichž každý člen má známou aminokyselinu v poslední kopulované poloze, a provádí se první zkouška každé peptidové směsi se zřetelem na biologickou účinnost, čímž se ukončí první syntetický cyklus;

   B. provádí se druhá syntéza peptidů za použití stejných aminokyselin nebo skupili aminokyselin, kterých se použilo při první syntéze v každém zn kopulačních stupňů; opakováním první syntézy v n-1 stupních a ve stupni n se na každou z peptidových směsí’ provádí kopulace ke kompletaci aminokyseliny nebo skupiny aminokyselin vyskytující se nar konci peptidové směsi, která vykazovala biologickou účinnost při první zkoušce, popřípadě se provede odštěpení peptidů od pryskyřice v každé směsi a pak se provádí druhá zkouška každé peptidové směsi se zřetelem na biologickou účinnost, čímž se ukončí druhý syntetický cyklus;

   C. provádí se stupně syntetických cyklů rukrát, takže se syntetizuje peptid s plně známou sekvencí.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený syntetizovaný peptid je definován výhradně svou biologickou aktivitou a uvedená zkouška biologické účinnosti kvantifikuje uvedenou aktivitu syntetizovaného proteinu.
3. 3. Způsob podle nároků
4. 4. Způsob podle nároků
5. 5. Způsob podle nároků
6. 6. Způsob podle nároků

   1-2,vyznačující se

   1-2, vy z n a č u j í c í se

   1-2,vyznačující se

   1-2,vyznačující se tím, že n znamená 2 až 8.

   tím, že n znamená 4.

   tím, že n znamená 5.

   tím, že n znamená 6.
7. 7. Způsob podle nároků 1, vyznačující se tím, že se použije odpovídajících aminokyselin pro přípravu peptidů s rozvětvenou strukturou.