KR100237126B1 - 펩티드 유사체의 신속한 합성 및 검색방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 소수의 커플링 단계를 사용하여 생물학적 활성을 나타내는 특정 펩티드를 동정하기 위해 불균질 혼합물로서 상기 펩티드를 검색하는 방법과 통합시킬 수 있는, 다수의 펩티드를 신속하게 합성하는 방법에 관한 것이다.

Description

펩티드 유사체의 신속한 합성 및 검색방법
보다 큰 천연 리간드의 효소 및 세포 수용체에 대한 높은 결합 친화도와 특이성을 모방한 분자를 생성할 목적으로 다수의 작은 펩티드를 신속히 합성하고 검색하기 위한 방법이 개발되어 왔다. 상기 특성을 가진 분자는 많은 용도에 대해 잠재력을 갖는 “유사체(mimetics)”라고 명명하였다. 예를들어, 유사체는 쉽게 합성되는 분자를 대표하기 때문에 치료제로서 관심을 모은다. 본 발명의 공정은, 느리고 어려운 것으로 밝혀진 천연 리간드의 체계적 교체 및, 천연 리간드와 유사한 어떤 알려진 구조도 갖지 않는 화합물을 랜덤하게 검색하려는 낮은 확률의 접근법에 대한 대체 방법을 나타낸다.
본 발명의 공정은 통상의 고체상 합성법에 의해 예전에 이룩되었던 것보다 더 많은 수의 펩티드를 동시에 신속하게 생성케하고, 목적하는 활성을 나타내는 특정한 서열을 용이하게 결정하며 순수한 형태로 합성하는 방법을 제공한다.
본 발명의 공정은 선행기술에 비해 몇가지 중요한 개선점을 제공한다. 비교 가능한 고체상 기술을 이용한 몇몇 보고서에는 동시에 제조된 수개의 펩티드에 실질적으로 한정된 합성법이 제시되어 있지만, 본 발명의 공정은 사실상 무한한 수의 펩티드 합성방법을 제공한다.
최근의 다른 보고서들에는 고체상 기술을 이용하여 짧은 시간에 아주 많은 수의 작은 펩티드 생성을 수행하여 성장 펩티드 쇄에 아미노산 혼합물을 커플링시킨다고 개시되어 있다. 상기 시도는, 생성된 펩티드의 농도를 동일하게 하기 위하여 아미노산의 상이한 상대적 커플링 속도를 고려하여 혼합물중의 아미노산의 농도 조절함을 필요로 한다. 또한, 상기 시도는 목적하는 활성을 제공하는 정확한 서열을 결정하기 위해 다중 분석 기술의 사용을 필요로 한다. 본 발명의 공정은, 아미노산의 커플링 속도를 차이나게 하고 동몰량의 펩티드 생성을 확실하게 할 필요가 없이 각각의 커플링 단계에서 단일 아미노산 또는 아미노산 그룹이 커플링된다는 점에서 다르다. 본 발명의 공정은 또한 화학 분석없이 목적하는 서열을 동정하고 순수한 형태로 잇달아 생성할 수 있게 한다.
또 다른 보고서에는 랜덤하게 합성된 올리고뉴클레오티드를 사상 파아지에 삽입함이 교시되어 있다. 하지만, 이 생합성 방법은 유전적으로 암호화된 아미노산에만 한정되어야 하고 오직 선형 구조만을 가질 수 있는 수백만의 작은 펩티드를 잠재적으로 생성할 수 있다. 본 발명은 D-아미노산 또는 달리 변형된 아미노산을 봉입하고 분지 쇄 서열을 합성할 수 있으나, 이 방법들은 재결합 DNA 방법으로는 불가능하다.
아마도 가장 중요하게는, 선행기술에 교시되어 있는 것과는 대조적으로 본 발명의 공정은 지지 수지의 잠재적인 간섭없이 표적 결합 위치와 상호 작용할 수 있는 펩티드의 능력을 평가할 수 있게 한다. 요약하자면, 본 발명은 상당한 수의 작은 펩티드 생성을 가능하게 하고, 목적하는 활성을 나타내는 특성 펩티드 또는 펩티드들을 용이하게 식별하고 이런 펩티드를 순수한 형태로 생성할 수 있는 능력을 제공한다.
본 발명은 굉장히 많은 수의 작은 펩티드를 신속히 합성하고 검색하는 방법을 개시한다. 본 발명은 작은 펩티드들의 혼합물을 생성시킴으로써 효소와 수용체에 대한 천연 리간드의 높은 결합 친화도 및 특이성을 모방한 분자를 생성하는 능력을 향상시킨다. 본 발명의 특성 때문에, 각각의 위치에서 혼합물 중의 선택된 아미노산 각각의 농도 및 펩티드 각각의 농도는 본 명세서에 기재된 비율에 가깝게 유지된다. 본 발명의 공정은 목적하는 활성을 제공하는 특정 펩티드 또는 펩티드들을 용이하게 동정할 수 있는 능력을 잃지 않으면서, 지지 수지로부터 유리된 채 시험할 수 있는 펩티드 혼합물을 생성할 수 있게 한다. 펩티드 혼합물은 마지막 커플링 위치 및 특별히 선택된 다른 위치에 통상의 아미노산을 함유하는 일련의 펩티드로 구성되어 있다. 그러나, 다른 모든 잔기는 상이한 아미노산을 랜덤하게 선택한 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 본 발명의 공정에 의해 제조된 펩티드 서열은 선형 또는 분지 쇄 구조 중 어느 한 구조를 가질 수 있다.
본 발명은, 제1합성 단계가 아미노산 또는 아미노산 그룹을 개별적으로 고체-지지 수지의 분취량에 완전히 커플링시키는 단계로 이루어져 있으며; 추가의 단계가 수지에 커플링된 아미노산 또는 아미노산 그룹의 분취량을 완전히 혼합하고, 이 혼합물을 동일한 분취량으로 나누며, 아미노산 또는 아미노산 그룹을 개별적으로 각각의 분취량에 완전히 커플링시키고, 경우에 따라 각각의 구성원에 맨 마지막에 커플링된 위치에 공지된 아미노산을 갖는 펩티드 혼합물을 생성시키기 위해 각각의 혼합물 중의 수지로부터 펩티드를 절단하는 단계로 각각 이루어진 합성 단계를 n회 반복함으로써 각각 n개의 아미노산 또는 아미노산 그룹으로 이루어진 펩티드 혼합물의 제1합성을 수행함을 포함하는 펩티드 혼합물의 합성 방법을 포함한다.
생물학적 활성을 갖는 특정 펩티드 또는 펩티드들의 서열을 결정하기 위하여 본 발명의 합성 공정과 생물학적 분석을 통합할 수도 있다. 상기 통합된 공정은 하기 단계들을 포함한다 :
A. 각각의 구성원이 맨 마지막에 커플링된 위치에 공지된 아미노산을 갖는 펩티드 혼합물을 생성시키기 위해, 제1합성단계가 아미노산 또는 아미노산 그룹을 개별적으로 고체-지지 수지의 분취량에 완전히 커플링시키는 단계로 이루어져 있으며; 추가의 단계가 수지에 커플링된 아미노산 또는 아미노산 그룹의 분취량을 완전히 혼합하고, 이 혼합물을 동일한 분취량으로 나누며, 아미노산 또는 아미노산 그룹을 개별적으로 각각의 분취량에 완전히 커플링시키고, 경우에 따라 각각의 혼합물 중의 수지로부터 펩티드를 절단하는 단계로 각각 이루어진 합성 단계를 n회 반복함으로써 각각 n개의 아미노산 또는 아미노산 그룹으로 이루어진 펩티드 혼합물의 제1합성을 수행하고, 각각의 펩티드 혼합물의 생물학적 활성을 제1분석하여 제1합성 사이클을 종결시키며;
B. n-1회 단계까지 제1합성을 반복하고; n회 단계에서, 제1분석에서 생물학적 활성이 입증된 펩티드 혼합물의 말단에 존재하는 아미노산 또는 아미노산 그룹을 각각의 펩티드 혼합물에 완전히 커플링시키고, 경우에 따라 각각의 혼합물중의 수지로부터 펩티드를 절단함으로써 제1합성에서 n회의 커플링 단계 각각에 사용된 것과 동일한 아미노산 또는 아미노산 그룹을 사용하여 펩티드의 제2합성을 수행하고, 각각의 펩티드 혼합물의 생물학적 활성을 제2분석하여 제2합성 사이클을 종결시키며;
C. 완전히 공지된 서열의 펩티드를 합성하기 위해 총 n회의 합성 사이클 단계를 수행함을 포함하는, 고활성 펩티드의 동정방법을 포함한다.
본 발명은 동일하게 신속한 합성 공정에 의해 분지된 펩티드 측쇄를 갖는 펩티드를 제조할 수 있는 능력을 포함한다는 것을 인지해야 한다. 혼합물로 제조된 이들 분지된 분자들의 활성을 분석할 수도 있고, 활성을 갖는 특성 분자 또는 분자들의 서열을 선형 펩티드와 본질적으로 동일한 방법으로 동정할 수도 있다.
본 명세서에 개시되고 특허청구된 바와 같이, 본 발명의 목적을 위한 하기 용어 및 약어는 하기 정의된 바와 같다.
용어 및 약어 :
Ac-아세틸
Bzl-벤질
O-Bzl-벤질 에스테르
Bom-벤질옥시메틸
Tos-토실[4-톨루엔설포닐]
2Cl-Z-2-클로로벤질옥시카보닐
2,6Cl-Z-2,6-디클로로벤질옥시카보닐
2Br-Z-2-브로모벤질옥시카보닐
X-공지되지 않은 아미노 산
L-아미노 산들은 이들의 표준 3 문자 암호중의 첫번째 문자를 대문자화하여 본 명세서에 나타내었고, D-아미노 산들은 이들의 표준 3 문자 암호를 모두 소문자를 사용하여 표시하였다.
본 발명은 펩티드 합성에 통상적으로 사용되는 고체상 합성 절차를 사용하여 실행할 수 있다. 일반적으로, 생성된 펩티드의 C-말단 아미노산 잔기에 궁극적으로 상응될 아미노산은 C-말단 잔기의 카복실 그룹과 결합 위치로서 수지 매트릭스 상에 존재하는 특정 작용기 사이에 형성된 공유 결합에 의해 불용성 지지 수지에 결합시킨다. 이어서 펩티드는 수지에 커플링된 C-말단 아미노산에 개시되어 잇따른 순서로 펩티드의 N-말단 잔기에서 아미노 그룹에 커플링시킴으로써 형성된다. 분지된 구조가 존재하는 경우 하나 이상의 N-말단 잔기가 존재할 수도 있다. 펩티드는 합성 과정 동안 수지에 결합되어 있지만 일단 완전한 펩티드 서열이 짜맞추어지면 수지로부터 절단될 수도 있다.
2 내지 8개의 아미노산 또는 아미노산 그룹을 함유하는 펩티드를 생성하기 위한 공정은 특히 본 발명의 바람직한 태양이다.
신규한 공정은 수지에 커플링된 아미노산 또는 펩티드를 반복하여 혼합하고, 나누며, 커플링시키는 것에 기초를 두고 있다. 제1단계는 고체-지지 수지를 동량의 결합 위치를 갖는 분취량으로 나누어야 함을 필요로 한다. 이어서 개별적으로 선택된 아미노산을 각각의 분취량에 완전히 커플링시키고, 각각의 수지 분취량은 상이한 아미노 산에 커플링시킨다. 결과적으로, 각각의 분취량의 수지는 상이한 아미노산에 커플링된 다른 분취량과 동몰량의 아미노산에 커플링될 것이다. 수지를 충분히 혼합하여 수지에 커플링된 아미노산의 동물의 혼합물을 생성시킨다. 이어서, 혼합물을 동일한 분취량으로 나눈 뒤, 개별적으로 선택된 아미노산을 수지에 커플링된 아미노산에 각각의 분취량으로 커플링시킨다. 반복되는 단계적 혼합, 분리, 및 커플링 단계들은 맨마지막에 커플링된 아미노산 잔기가 펩티드 혼합물 중의 모든 펩티드에 있어서 동일하지만 혼합물 중의 펩티드 각각의 다른 모든 위치에 있는 아미노산 잔기가 특정 커플링 단계에 포함되는 아미노산을 동몰량으로 선택했음을 나타내는 펩티드 혼합물을 생성시킨다.
선택적으로, 단일 아미노산은 합성된 모든 펩티드가 특정 위치에 동일한 아미노산을 갖도록 하기 위하여 임의의 특정 커플링 단계에서 커플링시킬 수도 있다. 커플링이 수행된 경우, 커플링 단계 직전의 분리 단계 및 커플링 단계 직후의 혼합 단계는 무시해도 좋다. 이로써, 전과 같으나, 맨마지막에 커플링된 위치 이외에 특정 위치의 아미노산의 동정이 알려진 펩티드 혼합물이 얻어졌다.
본 발명의 공정은 적은 수의 커플링 단계들을 이용하여 생물학적 분석에 적합한 양으로 매우 많은 수의 펩티드를 생성시킨다. 결과적으로, 선택된 아미노산을 사용하여 제조할 수 있는 모든 가능한 서열이 제조된다. 예를 들어, 25개의 아미노산이 펩티드 합성을 위해 선택된 경우, 625개의 디펩티드가 25회 반응의 2회 연속으로 행해진 단지 50회의 커플링 단계 후에 생성되며; 15,625개의 트리펩티드가 반응들을 3회 행한 75회 커플링 단계 후 생성되고; 390,625개의 독특한 테트라펩티드가 반응들을 4회 행한 단지 100회 커플링 단계 후에 생성된다. 보다 긴 펩티드를 생성하기 위하여 보다 많은 수의 커플링 단계를 사용하면 혼합물 중에는 더욱 더 많은 수의 펩티드가 생성될 것이다.
합성에 사용하기 위해 선택된 아미노산의 수와 유형은, 매회 변할 수도 있고 어떤 아미노산이 가장 적합한가에 대한 어떠한 추정없이도 랜덤하게 선택하는 것을 반영하거나 또는 목적하는 활성에 영향을 준다고 알려진 특징들에 바탕을 둔 특정 아미노산을 특별히 선택함을 포함하기도 한다.
본 발명으로 수행할 수 있는 연속적인 커플링의 수는 펩티드의 고체상 합성을 제한하는 공지된 요인에만 영향을 받는다. 그러나, 혼합물 중의 펩티드의 수가 증가하는 것은 펩티드 전체 농도의 일부분으로서의 펩티드 각각의 양을 감소시킨다는 것을 인지해야 한다. 따라서, 하기 언급한 바와 같이 활성 펩티드의 서열을 결정하기 위하여 펩티드 혼합물의 합성을 생물학적 분석과 통합하는 경우, 실제적으로 행해질 수 있는 커플링의 횟수를 결정함에 있어서 분석 민감도를 반드시 고려해야한다. 즉, 과량의 불활성 혼합물 성분의 “노이즈(noise)”에 대해 단일 펩티드로부터의 활성 시그널을 감지하는 분석 능력은, 활성을 시험하려는 혼합물 중에 포함될 수 있는 펩티드의 수를 제한하는 요인이 될 것이다. 혼합물 중의 펩티드의 용해성 또한 혼합물 중의 펩티드의 활성을 검출하기 위해 분석하는 경우, 합성할 수 있는 펩티드를 실제로 한정짓는 참조 기준에 반영된다.
펩티드 생성을 위한 본 방법을 생물학적 분석과 통합하는 경우, 활성을 갖는 혼합물 중의 펩티드 또는 펩티드들의 특정 서열은 용이하게 동정되고, 계속하여 순수한 형태로 생성될 수 있다. 생물학적 활성에 대해 분석하기 전에 펩티드는 먼저 수지로부터 절단할 수도 있다. 수지로부터 펩티드를 절단하는 것은, 예를 들어 입체 장애와 같은 요인 때문에 펩티드의 활성에 지장을 줄 수 있는 가능성을 제거한다는 것이다. 이어서 펩티드는 혼합물로서 생물학적 분석을 수행한다. 혼합물 중의 각각의 펩티드는 맨 마지막에 커플이된 위치에 공지된 아미노산 잔기를 가지기 때문에, 혼합물이 활성을 가짐을 밝히는 분석을 맨 마지막에 커플링된 위치의 아미노산 잔기를 반드시 동정해야 한다. 펩티드 혼합물을 합성하고 활성에 대해 분석하는 모든 절차를 “합성 사이클”이라고 명령한다.
관찰된 활성을 제공하는 혼합물 중의 펩티드 또는 펩티드들의 특정 서열을 동정하기 위하여, 제1합성 사이클시 분석에 의해 결정된 바와 같이 활성을 갖는 혼합물 중의 모든 펩티드를 동일한 혼합, 분리 및 커플링 절차에 의해 재합성하지만, 제2합성 사이클에서는 펩티드 혼합물을 맨 마지막에서 두번째 커플링한 후에 혼합하지 않는다. 따라서, 맨 마지막에서 두번째로 커플링된 아미노산은 특정 혼합물에서 밝혀진 것이다. 이어서, 이전의 합성 사이클의 생물학적 분석에 의해 동정된 맨 마지막에 커플링된 아미노산을 각각의 혼합물 중의 펩티드에 커플링시켜 2개의 맨 마지막에 커플링된 아미노산 잔기가 특정 펩티드 혼합물내의 모든 펩티드에서 밝혀지게 한다. 혼합물을 다시 생물학적으로 분석하여 활성을 나타내는 혼합물을 동정한다. 결과로써, 관찰된 활성의 원인이 되는 펩티드의 2개의 아미노산의 잔기가 결정되었다. 목적하는 활성을 갖는 펩티드 혼합물을 재합성하고, 이 혼합물을 재분석하는 공정을 반복하여, 혼합물 중에 발견된 활성을 제공하는 펩티드의 서열이 완전히 밝혀질 때까지 각각의 합성 사이클을 사용하여 추가의 아미노산 잔기를 식별한다.
출발 수지는 하기 언급한 바와 같이 생성시킬 수도 있고, 또는 수지에 이미 결합된 아미노 산을 갖는 시판용 원료로부터 구입할 수도 있다. 이미 수지에 커플링된 형태로 구입된 아미노산은 본 발명의 요약에 언급된 제1합성 커플링 단계를 대신한다. 아미노산 그룹은 개개의 아미노산으로부터 펩티드를 생성하는 절차 뿐만 아니라, 임의의 또는 모든 커플링 단계에서도 커플링시킬 수 있다. 아미노 산 그룹은 단순히 본 개시 내용 중에 언급된 바와 같이 커플링될 수 있는 공지된 서열의 펩티드이다. 따라서, 다중 펩티드 합성 및 검색 기술을 이용하여, N-말단, C-말단, 또는 이들 둘다의 말단의 공지된 펩티드 서열을 연장시킴으로써 펩티드 혼합물을 생성시킬 수 있고, 활성을 갖는 생성된 서열을 동정할 수 있다. 또한 이미 언급된 바와 같이, 본 절차에 의해 제조된 펩티드 서열은 분지된 배위를 가질 수도 있다.
펩티드 결합을 형성시키기 위해 아미노산은 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 커플링시킨다. 하나의 방법은 아미노산을 카복시 그룹이 펩티드 절편의 유리 N-말단 아미노산 그룹과 보다 쉽게 반응할 수 있게 하는 유도체로 전환시킴을 포함한다. 예를 들면, 보호된 아미노산을 에틸 클로로포르메이트, 페닐 클로로포르메이트, 2급-부틸 클로로포르메이트, 또는 이소부틸 클로로포르메이트와 반응시킴으로써 아미노산을 혼합된 무수물로 전환시킬 수 있다. 선택적으로, 아미노산은 2,4,5-트리 클로로페닐 에스테르, 펜타클로로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, N-부틸옥시카보닐 에스테르(t-Boc), N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 또는 1-하이드록시벤조트리아졸로부터 형성된 에스테르와 같은 활성 에스테르로 전환시킬 수 있다.
또 다른 커플링 방법은 N,N'-디사이클로헥실-카보디이미드(DCC) 또는 N,N'-디이소프로필카보디이미드(DIC)와 같은 적합한 커플링제의 사용을 포함한다. 다른 적합한 커플링제는 당해 분야에 숙련된 자들에게 잘 알려져 있다[참조 문헌 : Schroder and Lubke, The Peptides, Academic Press, 1965, Chapter III and U.S. Patent 4,259,234].
반응성 알파-아미노 기능기가 관여된 부반응을 방지하기 위하여 펩티드 합성에 사용된 각각의 아미노산의 알파-아미노 그룹을 커플링 반응시 보호해야함을 인지해야 한다. 또한 특정 아미노산은 반응성 측쇄 기능기(예를 들어, 설프히드릴, 엡실론-아미노, 베타-및 감마-카복실, 이미다졸, 구아니디노 및 하이드록시)를 함유하고, 이러한 기능기는 초기 및 후속 커플링 단계시 보호되어야 함을 인지해야 한다. 적합한 보호 그룹은 당해 분야에 공지되어 있다.[참조 : 예, Protectiv Groups in Organic Chemistry, M. McOmie, Ed., Plenum Press, N.Y., 1973 and U.S. Patent 4,617,149]
특별한 보호 그룹을 선택함에 있어서, 특정 조건들을 반드시 준수해야 한다. 알파-아미노 보호 그룹은 커플링 반응에 사용된 조건하에 알파-아미노 기능기를 불활성이 되게 해야 하며, 측쇄 보호 그룹을 제거하지 않으며 펩티드 질편의 구조를 변현시키지 않는 조건하에서 알파-아미노 보호 그룹은 커플링 반응후에 용이하게 제거 가능해야 하며, 알파-아미노 보호 그룹은 커플링 직전의 활성화시 라세미화될 수 있는 가능성을 제거해야만 한다. 측쇄 보호 그룹은 커플링 반응에 사용되는 조건하에 측쇄 기능기를 불활성이 되게 해야 하며, 측쇄 보호 그룹은 알파-아미노 보호 그룹을 제거하는데 사용되는 조건하에 안정해야 하고, 필요한 경우, 측쇄 보호 그룹은 펩티드 쇄의 구조를 변형시키지 않는 조건하에 펩티드의 종결시 용이하게 제거되어야 한다.
펩티드 합성에 유용한 것으로 알려진 보호 그룹들의 반응성이 보호그룹 제거에 사용된 물질들에 대해 각각 다르다는 것은 당해분야에 숙련된 자에게 명백하다. 예를 들어, 트리페닐 메틸 및 2-(p-비페닐릴)이소프로필옥시카보닐과 같은 특정한 보호 그룹은 매우 불안정하여 온화한 조건하에 절단될 수 있다. 기타 보호 그룹, 예를 들면 3급-부틸옥시카보닐, 3급-아밀옥시카보닐, 아다만틸옥시카보닐, 및 p-메톡시벤질옥시카보닐은 덜 불안정해서, 이들 보호 그룹을 제거하기 위해 적당하게 강한 산, 예를 들면 트리플루오로아세트산, 염산, 또는 아세트산중의 삼불화 붕소를 필요로 한다. 또한 다른 보호 그룹, 예를 들면 벤질옥시카보닐, 할로벤질옥시카보닐, p-니트로벤질옥시카보닐, 사이클로알킬옥시카보닐 및 이소프로필옥시카보닐은 보다 덜 불안정해서, 이들 보호 그룹을 제거하기 위해 보다 강한 산, 예를 들면 불화수소(HF), 브롬화수소, 또는 트리플루오로아세트산 중의 붕소 트리플루오로아세테이트를 필요로 한다. 9-플루오로에닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 보호 그룹을 또한 사용할 수도 있고, 이 보호 그룹은 다른 보호 그룹은 본래 그대로 두는 조건하에서 피페리딘에 의해 용이하게 제거된다.
커플링 단계의 종결시, 보호된 펩티드를 수지 지지체로부터 절단시킬 수도 있고, 모든 보호 그룹을 제거할 수도 있다. 보호 그룹의 절단 반응 및 제거는 동시에 또는 단계적으로 수행할 수 있다. 수지 지지체가 클로로메틸화 폴리스티렌 수지인 경우, 펩티드를 수지에 부착시키는 결합은 C-말단 잔기의 유리 카복실 그룹과, 수지 매트릭스 위에 존재하는 많은 클로로메틸 그룹 중에 한개의 그룹 사이에 형성된 에스테르 결합이다. 상기 부착결합은 에스테르 결합을 절단하고 수지 매트릭스를 관통할 수 있는 것으로 알려진 시약에 의해 절단할 수 있음을 인지해야 한다. 특별히 편리한 한 방법은 액상 무수 HF로 처리하는 것이다. 이 시약은 수지로부터 펩티드를 절단할 뿐만 아니라 또한 모든 보호 그룹을 제거할 수도 있다. 따라서, 이 시약을 사용하면 완전히 탈보호된 펩티드를 직접 수득할 수 있을 것이다. 보호 그룹을 제거하지 않고도 펩티드를 절단하고자 하는 경우, 보호된 펩티드-수지를 가메탄올 분해하여 C-말단 카복실 그룹이 메틸화된 보호된 펩티드를 생성시킬 수 있다. 이어서 메틸 에스테르를 온화한 알카리 조건하에 가수분해하여 유리 C-말단 카복실을 생성시킬 수 있다. 이어서, 펩티드 쇄상의 보호 그룹을 액상 HF 같은 강산으로 처리함으로써 제거할 수 있다. 본 발명의 펩티드와 같은 펩티드를 생성시키는데 특히 유용한 기술은 휴 등(Hui, K.Y. et al.)의 문헌 [J. Med. chem 31, 1679-1686](1988)에 기재되어 있다.
보호된 펩티드를 수지로부터 절단하기 위한 또다른 방법은 가암모니아 분해하거나, 또는 히드라진으로 처리하는 것이다. N-말단 알파-아미노 그룹위에 존재하는 보호 그룹은 보호된 펩티드를 수지 지지체로부터 절단함과 동시에 또는 그 전에 제거하는 것이 바람직함을 또한 인지할 것이다.
숙련된 자는 임의의 길이의 펩티드 또는 서열을 생성하기 위해 공지되거나 또는 발전된 임의의 고체상 화학법을 이용하여 아미노산과 유도체의 모든 배합물을 사용하여 본 원에 도입된 도식을 사용할 수 있음을 인지할 것이다. 분지된 분자를 생성시키기 위하여, 아미노산 또는 아미노산의 쇄를 제1쇄의 잔기 위에 존재하는 제2아미노 그룹에 커플링시킬 수도 있다. 예를 들면, 아미노산 또는 아미노산 그룹을 아미노산 위에 존재하는 제2아미노 그룹에 결합할 수 있도록 리신과 같은 아미노산을 성장 펩티드 모두에 통상적인 몇몇의 위치에 커플링 시킬 수 있다. 선택적으로, 아미노산이 분지점 역할을 할 수 있도록 변형된 아미노산을 합성하여 둘 이상의 아미노 그룹을 갖게 할 수도 있다. 이어서 이들 측쇄들을 선형 분자에 대해 언급된 동일한 혼합, 분리 및 커플링에 의해 연장시킬 수 있다. 분지된 분자를 제조하는 경우, 분지 위의 보호 그룹은 제1분지를 만들 때 사용된 보호 그룹과는 다른 것이어야 한다. 예를 들면, 하나의 분지 위의 t-Boc 보호 그룹 및 또다른 분지 위의 Fmoc보호 그룹을 사용하면 상이한 조건 및 탈보호 시약을 사용하여 상이한 분지들을 선택적으로 조작할 수 있다.
천연 및 비천연의 많은 아미노 산은 보호된 및 비보호된 형태로 다양한 원료로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 상업용 원료로부터 구입할 수 없는 다른 아미노산은 합성할 수도 있다. 본 발명을 실행하는 데 필요한 모든 시약 및 물질은 달리 언급하지 않는 한 Advanced ChemTech(PO Box 1403, Louisville, KY)사 또는 Applied Biosystems(850 Lincoln Center Dr., Foster City, CA)사로부터 구입할 수 있다.
본 발명은 생물학적 활성에 대한 임의의 특정 분석에 의존하지 않는다. 펩티드의 임의의 목적하는 활성을 인지할 수 있는 임의의 분석법은 목적하는 활성을 제공하는 펩티드 혼합물 내의 특정 펩티드 또는 펩티드들을 동정하고 생성시키기 위해 본 발명의 일부분으로 사용할 수 있다. 통상의 분석법은 수용체-리간드 결합, 면역학적 반응성, 또는 효소 활성에 대한 효과를 포함한다.
실시예에 게시된 기술 및 공급원은 본 발명을 예시하는 목적으로서 제공하며, 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
[실시예 1]
C-말단 아미드화 펩티드를 RaMPSTM(MA Boston Albany St 549소재의 Dupont) 다중 펩티드 합성 기구를 사용하여 p-메틸벤즈히드릴아민(p-MBHA) 수지상에 합성하였다. 사용한 아미노산은 t-Boc 알파-아미노 보호 그룹을 가지며, 측쇄는 다음과 같이 보호되어 있다. : Asp(O-Bzl), Glu(O-Bzl), Ser(Bzl), His(Bom), Lys(2Cl-Z), D-Tyr(2, 6Cl-Z) 및 Arg(Tos). RaMPSTM기구는 기본적으로 매니폴드 (manifold)이므로 용매 및 가용성 물질, 예를 들면 커플링되지 않은 아미노산을 흡출하기 위해 다수의 폴리프로필렌 반응 용기에 동시에 진공을 가할 수 있다. 카트리지라 불리는 상기 반응 용기들은 흡출시 진공 적용을 조절하기 위한 밸브, 및 카트리지내의 지지 수지와 함께 임의의 커플링된 아미노산 또는 펩티드를 보유한 “폴리볼(polyball)”을 가지며, 따라서 합성의 분리, 세척, 중화 및 탈보호 단계가 용이하다.
수지의 g당 약 0.6mmol의 아민 결합 부위를 갖는 0.2g의 p-MBHA수지를 각각 22개의 카트리지에 넣었다. 아민 결합 부위를 디메틸포름아미드(DMF)중의 10% 디이소프로필에틸아민(DIEA)으로 중화시켰다. 표 1에 목록화된 각각의 t-Boc-아미노산 4당량(4mole/수지아민 mole)을 1ml의 DMF에 용해시켜 카트리지에 가하고, 각각의 카트리지에 상이한 t-Boc-아미노산을 넣었다. DMF중의 0.5M1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt) 4당량을 카트리지에 가한 후 4당량의 디이소프로필카보디이미드(DIC)를 가하였다. 카트리지를 60분 동안 흔들고, 이어서 세척하고, 중화시키며, 동일한 조건 및 농도하에 동일한 아미노산과 재커플링시킨다. 제2커플링은 수지상의 모든 결합 부위를 확실히 커플링시키는 데 필요하다. 다음 아미노산으로 계속되기 전에 닌히드린 분석에 의해 커플링 반응이 종결되었는지에 대해 시험한다. 30분 동안 50% 트리플루오로 아세트산(TFA), 5% 아니솔 및 45% 염화메틸렌으로 처리하여 t-Boc-아미노산을 탈보호시켰다. 커플링된 수지를 각각의 카트리지로부터 제거하고 충분히 혼합하여, 제1위치에 커플링된 각각의 아미노산의 몰량이 동일한 혼합물을 생성시켰다.
수지에 커플링된 아미노산 혼합물을 23개의 카트리지로 공평하게 나누었다. 이어서 표 1에 목록화된 22개의 t-Boc-아미노산+전이상태의 t-Boc-아미노산 스타틴(Sta)을 아미노산 혼합물 분취량에 커플링시키고, 각각의 분취량을 상이한 t-Boc-아미노산과 커플링시킨다. 상기 언급한 바와 같이 수행한 커플링은 23개의 펩티드 혼합물을 생성하였으며, 각각의 혼합물은 N-말단의 아미노산 잔기가 공지된 22개의 상이한 수지에 커플링된 디펩티드를 갖는다. 커플링 반응을 2회 순환하여 506개의 독특한 디펩티드를 생성시켰다. 탈보호전에 종결되었는지에 대해 커플링 반응을 다시 시험하였다. 수지에 커플링된 디펩티드를 카트리지로부터 제거하고, 충분히 혼합하여 각각의 위치에 커플링된 각각의 아미노산의 물량이 동일한 디펩티드 혼합물을 생성시켰다.
수지에 커플링된 디펩티드를 22개의 카트리지로 공평하게 나누었다. 이어서 표1에 목록화된 22개의 t-Boc-아미노산을 디펩티드 혼합물 분취량에 커플링시키고, 각각의 분취량을 상이한 t-Boc-아미노산과 커플링시킨다. 탈보호시 일어날 수도 있는 디케토피페라진 형성을 저해하기 위해 t-Boc-아미노산을 최종적으로 가함을 제외하고는 상기 언급한 바와 같이 수행한 커플링으로 22개의 펩티드 혼합물을 생성시겼으며, 각각의 혼합물은 N-말단의 아미노산 잔기가 공지된 506개의 상이한 수지에 커플링된 트리펩티드를 갖는다. 커플링 반응은 3회 순환하여 11,132개의 독특한 트리펩티드를 생성시켰다. 탈보호전에 종결되었는지에 대해 커플링 반응을 다시 시험하였다. 수지에 커플링된 트리펩티드를 카트리지로부터 제거하고, 충분히 혼합하여 각각의 위치에 커플링된 각각의 아미노산의 몰량이 동일한 트리펩티드 혼합물을 생성시켰다.
수지에 커플링된 트리펩티드 혼합물을 22개의 카트리지로 공평하게 나누었다. 이어서 표 1에 목록화된 22개의 t-Boc-아미노산을 트리펩티드 혼합물 분취량에 커플링시키고, 각각의 분취량을 상이한 t-Boc-아미노산과 커플링시킨다. 제1커플링이 언급한 바와 같이 수행한 커플링은 22개의 펩티드 혼합물을 생성하였으며, 각각의 혼합물은 N-말단의 아미노산 잔기가 공지된 11,132개의 상이한 수지에 커플링 된 테트라펩티드를 갖는다. 커플링 반응을 4회 순환하여 244,904개의 독특한 테트라펩티드를 생성시켰다. 커플링 반응이 종결되었는지에 대해 다시 시험하였다. N-말단 잔기를 아세틸화하기 위해 테트라펩티드를 10 당량의 아세트산, HOBt 및 DIC 내에서 2시간 동안 항온 처리하였다. 수지에 커플링된 아세틸화 테트라펩티드를 카트리지로부터 제거하지만, 상기 단계와는 달리 각각의 카트리지에서 생성된 펩티드 혼합물을 별도로 유지시켰다. 따라서, 보통 카트리지로부터 생성된 모든 테트라펩티드는 N-말단에 커플링된 동일한 아미노산을 가지지만, 쇄의 다른 잔기는 모두 특정 단계에서 커플링된 아미노산 각각을 랜덤하게 동몰량으로 선택하였음을 나타낸다. 따라서, 각각의 카트리지로부터의 테트라펩티드는 N-말단 잔기를 일정하게 유지하면서 선택된 아미노산을 사용하여 생성될 수 있는 모든 가능한 서열의 동몰량 혼합물을 나타낸다.
테트라펩티드를 디클로로메탄으로 세척하고, 실온에서 건조시켰다. 이어서 테트라펩티드를 0℃에서 70분 동안 90% 무수 HF 액체/5% p-티오크레졸/5% m-크레졸내에서 MBHA 수지로부터 절단하였다. 상기와 같이 처리하여 또한 측쇄 보호 그룹을 모두 제거하였다. HF를 증류시키고, 절단된 테트라펩티드를 0℃에서 30분 동안 50ml의 디에틸에테르로 침전시켰다. 소결 유리 깔대기를 사용하여 절단된 테트라펩티드 및 소모된 수지를 수거한 후 테트라펩티드를 침전시키기 위해 4 x 20ml의 디에틸에테르로 세척하였다. 침전된 테트라펩티드를 50% 아세트산/30% 아세토니트릴에 용해시키고, 환저 플라스크에 여과하였다. 진공 증류에 의해 부피의 대략 70%를 제거하고, 잔류 부분을 물로 희석하며, 동결건조시켰다. 회수한 펩티드의 건조 중량을 측정하고, 혼합물을 소량의 분취량으로 나누기 전에 50% 아세트산/30% 아세토니트릴에 재용해시켰다.
[표 1]
[실시예 2]
실시예 1에서 생성된 테트라펩티드 혼합물을, 인간의 면역결핍성 바이러스(HIV-1) 아스파틸 단백 분해 효소의 단백 분해 활성을 억제하는 펩티드의 능력을 측정하기 위해 분석하였다. HIV-1의 복제 사이클에서 중요한 단계는 바이러스 게놈에 의해 암호화된 특정 폴리단백질 생성물을 단백 분해시키는 것이다. 전구 단백질을 절단하여 레트로바이러스 생활 사이클에 필요한 성숙 단백질을 형성시킨다. 따라서 HIV-1 단백분해효소를 저해하기 위해 작용하는 화합물들은 후천성 면역결핍증후군(AIDS) 치료의 치료제로서 중요한 역할을 한다.
테트라펩티드 혼합물을 펩티드 전체 농도가 분석중에 약 15,585 μM이도록 시험전에 디메틸설폭사이드(DMSO) 중에 각각 희석시켰다. 각각의 혼합물중에 11,132개의 독특한 테트라펩티드가 존재하므로, 각각의 개별적인 테트라펩티드는 분석중에 근본적으로 1.4 μM이었다. 결과는, 단백분해효소로 처리되지 않은 절단된 기질 및 처리된 절단된 기질의 대조용 측정물과 비교하여 효소 활성의 억제율로서 보고한다. 표 2에 나타난 바와 같이, 몇몇의 테트라펩티드 혼합물의 단백분해 활성의 중요한 억제능을 나타내었다. N-말단에 Phe 잔기를 갖는 테트라펩티드 혼합물은 단백분해 효소 활성을 103% 억제하였으며, 테트라펩티드 혼합물은 관찰된 활성의 원인인 특정 펩티드 또는 펩티드들의 서열을 완전히 밝히기 위해 재합성 공정에 선택하였다.
N-말단에 Phe 잔기를 갖는 테트라펩티드는 제3커플링 단계후 트리펩티드 혼합물을 함께 혼합하지 않음을 제외하고는 실시예 1에 기재된 동일한 아미노산을 사용하여 동일한 방법으로 재합성하여, 제3커플링 위치의 아미노산이 공지된 트리펩티드 혼합물을 생성시켰다. 이어서 각각의 트리펩티드 혼합물을 Phe와 커플링시켜, N-말단에 공지된 2개의 아미노산을 갖는 22개의 수지에 커플링된 테트라펩티드 혼합물을 생성시켰다. 이 테트라펩티드 혼합물을 절단하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 분석을 위해 제조하였다. 단백 분해효소를 분석하기 전에 테트라펩티드 혼합물을 각각 DMSO 중에 희석하였다. 분석시에 펩티드 전체 농도는 5,060 μM이므로 각각의 혼합물중의 506개의 독특한 테트라펩티드 각각은 10 μM이었다. 표 2는 N-말단에 Phe-Ile를 갖는 테트라펩티드 혼합물이 단백 분해 효소 활성을 68% 억제하였음을 나타냈다.
이어서 N-말단에 Phe-Ile를 갖는 테트라펩티드를 기본적으로 실시예 1에 따라 재합성하지만, N-말단의 3개의 아미노산의 서열이 공지되도록 상기 기재된 바와 같이 변형시켰다. 22개의 독특한 테트라펩티드를 함유한 각각의 23개의 테트라펩티드 혼합물을 상기와 같이 당백 분해 효소에 대해 분석하였다. 분석시에 펩티드 전체 농도는 220 μM이므로 각각의 혼합물중의 22개의 독특한 테트라펩트드 각각은 10 μM이었다. N-말단에 Phe-Ile-Sta를 갖는 테트라펩티드 혼합물은 표 2에 기재된 바와 같이 단백 분해 효소 활성을 83% 억제하였다.
[표 2]
[표 2a]
N-말단에 Phe-Ile-Sta를 갖는 각각의 22개의 테트라펩티드를 실시예 1에 따라 근본적으로 재합성하고, 단백 분해 효소에 대해 분석하였다. 표 2에 나타난 바와 같이, 테트라펩티트 Phe-Ile-Sta-leu는 단백 분해 효소 활성을 68% 억제하는 가장 탁월한 테트라펩티드이다.

Claims (2)

  1. A. 각각의 구성원이 맨 마지막에 커플링된 위치에 공지의 아미노산을 갖는 펩티드 혼합물을 생성시키기 위해, 제1합성 단계가 아미노산 또는 아미노산 그룹을 개별적으로 고체-지지 수지의 분취량에 완전히 커플링시키는 단계로 이루어져 있으며, 추가의 단계가 수지에 커플링된 아미노산 또는 아미노산 그룹의 분취량을 완전히 혼합하고, 이 혼합물을 동일한 분취량으로 나누며, 아미노산 또는 아미노산 그룹을 개별적으로 각각의 분취량에 완전히 커플링시키고, 경우에 따라 각각의 혼합물 중의 수지로부터 펩티드를 절단하는 단계로 각각 이루어진 합성 단계를 n회 반복함으로써 각각 n개의 아미노산 또는 아미노산 그룹으로 이루어진 펩티드 혼합물의 제1합성을 수행하고, 각각의 펩티드 혼합물의 생물학적 활성을 제1분석하여 제1합성 사이클을 종결시키며; B. n-1회 단계까지 제1합성을 반복하고; n회 단계에서, 제1분석에서 생물학적 활성이 입증된 펩티드 혼합물의 말단에 존재하는 아미노산 또는 아미노산 그룹을 각각의 펩티드 혼합물에 완전히 커플링시키고, 경우에 따라 각각의 혼합물중의 수지로부터 펩티드를 절단함으로써 제1합성에서 n회의 커플링 단계 각각에 사용된 것과 동일한 아미노산 또는 아미노산 그룹을 사용하여 펩티드의 제2합성을 수행하고, 각각의 펩티드 혼합물의 생물학적 활성을 제2분석하여 제2합성 사이클을 종결시키며; 그리고 C. 완전히 공지된 서열의 펩티드를 합성하기 위해 총 n회의 합성 사이클 단계를 수행하는 것을 포함하는, 고활성 펩티드의 동정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 생성된 펩티드가 분지된 구조를 갖는 방법.
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